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JP7393351B2 - ポリヌクレオチドの合成法、システム、およびキット - Google Patents

ポリヌクレオチドの合成法、システム、およびキット Download PDF

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Description

本発明は、所定のヌクレオチド配列に従ってポリヌクレオチド分子を合成するための新たな方法に関する。本発明はまた、合成後の合成ポリヌクレオチドのアセンブリ方法、ならびに合成および／またはアセンブリ方法を行うためのシステムおよびキットに関する。
ポリヌクレオチド分子、特にＤＮＡの合成およびアセンブリのための２つの主な方法が存在する。
ホスホルアミダイト化学は、化学的に活性化されたＴ、Ｃ、Ａ、またはＧのモノマーを段階的なプロセスによって長さ約１００／１５０塩基のオリゴヌクレオチドにアセンブリする合成手法である。化学反応工程は高度に感受性であり、条件は完全に無水の（水が完全に存在しない）、水性の酸化的と酸性との間で変わる（Ｒｏｙ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１３，１８，１４２６８－１４２８４）。前の反応工程からの試薬が完全に除去されていない場合、これは将来の合成工程にとって有害となるであろう。したがって、この合成方法は、長さ約１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドの生成に限定されている。
ポリメラーゼ合成手法は、Ｔ、Ｃ、Ａ、およびＧ三リン酸を使用してＤＮＡ鋳型に対する相補鎖を合成するためにポリメラーゼを使用する。反応条件は水性かつ温和であり、この手法は、長さが数千塩基のＤＮＡポリヌクレオチドを合成するのに使用することができる。この方法の主な欠点は、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡをこの方法ではデノボ合成することができず、それから複製が作られるＤＮＡ鋳型を必要とすることである。（Ｋｏｓｕｒｉ ａｎｄ Ｃｈｕｒｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１４，１１，４９９－５０７）。
したがって、以前の方法は、複製される既存の鋳型分子の助けなしには二本鎖ＤＮＡをデノボ合成するために使用することができない。
本発明者らは、既存の鋳型分子を複製する必要なく、一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチド分子を段階的にデノボ合成することができる新たな方法論を開発した。そのような方法はまた、ホスホルアミダイト化学技術に関連する極端な条件を回避し、対照的に、中性ｐＨ付近の温和な水性条件下で実施される。このような方法はまた、合成生物学の広範囲の適用可能性を提供し、完全なゲノムの＞１００ｍｅｒのヌクレオチド長を有する現在の合成方法に対する電位１０８改善による一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド分子のデノボ合成を可能にする。
本発明は、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドをインビトロで合成する方法を提供し、方法は、合成サイクルを行うことを含み、各サイクルが、二本鎖ポリヌクレオチドを切断すること、およびヌクレオチド対を組み込むことによって切断された二本鎖ポリヌクレオチドを伸長することを含み、切断された二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖の末端が、所定の配列のヌクレオチドの付加によって伸長され、第１の鎖にハイブリダイズされる切断された二本鎖ポリヌクレオチドの第２の鎖の末端が、パートナーヌクレオチドの付加によって伸長され、それにより第１の鎖の組み込まれたヌクレオチドとヌクレオチド対を形成する。好ましくは、本方法は、ＤＮＡを合成するためのものである。
本明細書に記載される本発明の方法のうちのいずれにおいても、方法は、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチド分子の合成に続いて、二本鎖ポリヌクレオチド分子の一方の鎖が除去、または複製および／もしくは増幅される一本鎖ポリヌクレオチド分子の合成を提供し得る。
本明細書に記載される本発明の方法のうちのいずれにおいても、方法は、二本鎖または一本鎖オリゴヌクレオチドの合成を提供し得る。したがって、本発明の方法のうちのいずれかを使用した二本鎖または一本鎖ポリヌクレオチドの合成に関する本明細書における全ての参照は、必要な変更を加えて二本鎖または一本鎖オリゴヌクレオチドの合成に適用される。
上に記載される本発明の方法において、各サイクルは、所定の配列のヌクレオチドを、付着した可逆的ブロッキング基と一緒に付加することによって第１の鎖を伸長し、続いて第２の鎖を伸長することを含み得、可逆的ブロッキング基は、第２の鎖が伸長される前または後に除去される。いかなるそのような方法においても、各サイクルにおいて、ヌクレオチドは、切断された足場ポリヌクレオチドに組み込まれ得る。
本発明は、上記および本明細書に記載される方法を提供し、各サイクルは、
（１）足場ポリヌクレオチドを提供することと、
（２）足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することと、
（３）所定の配列のヌクレオチドを、ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用によって切断された足場ポリヌクレオチドに付加することであって、ヌクレオチドが、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、付加することと、
（４）所定の配列のヌクレオチドから可逆的ターミネーター基を除去することと、
（５）連結ポリヌクレオチドを切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、連結ポリヌクレオチドが、所定の配列のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドを含み、連結時に、所定の配列のヌクレオチドが、パートナーヌクレオチドと対合する、連結することと、を含む。
足場ポリヌクレオチドを伴う方法では、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドが提供され得、合成鎖は、プライマー鎖部分およびヘルパー鎖部分を含む。いかなるそのような方法においても、ヘルパー鎖部分は、任意の１つ以上または全ての工程の前に、足場ポリヌクレオチドから除去され得る。
足場ポリヌクレオチドを伴ういかなるそのような方法においても、合成鎖は、第１の鎖であり得、支持鎖は、第２の鎖であり得る。
いかなるそのような方法においても、支持鎖は、連結ポリヌクレオチドを支持鎖に連結することによって伸長され得、各合成サイクルにおいて、連結ポリヌクレオチドは、そのサイクルにおいて第１の鎖に組み込まれた所定のヌクレオチドとヌクレオチド対を形成するヌクレオチドを含む。
連結ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり得る。好ましくは、連結ポリヌクレオチドは、二本鎖である。
連結ポリヌクレオチドが二本鎖である方法では、連結ポリヌクレオチドは、好ましくは、支持鎖およびヘルパー鎖を含み得る。ヘルパー鎖は、次の合成サイクルにおいて切断工程の前に足場ポリヌクレオチドから除去され得、そのような方法では、ヘルパー鎖は、連結工程の後に除去される。
本発明は、上に記載されるような方法を提供し、工程（１）は、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することを含み、合成鎖は、プライマー鎖部分を含み、支持鎖は、ユニバーサルヌクレオチドを含み、工程（２）は、足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することを含み、部位は、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義され、切断は、支持鎖を切断すること、および足場ポリヌクレオチドからユニバーサルヌクレオチドを除去することを含み、工程（５）において、連結ポリヌクレオチドは、パートナーヌクレオチドおよび次のサイクルで使用するための切断部位を定義するユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖を含み、連結ポリヌクレオチドは、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖に連結され、それによりヌクレオチド対を形成する。
本発明は、上に記載されるような方法を提供し、
（１）合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することであって、合成鎖が、プライマー鎖部分および一本鎖切断によって分離されたヘルパー鎖部分を含み、支持鎖が、ユニバーサルヌクレオチドを含む、提供することと、
（２）足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、部位が、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義され、切断が、支持鎖を切断すること、および足場ポリヌクレオチドからユニバーサルヌクレオチドを除去して、支持鎖と、プライマー鎖部分を含む合成鎖とを含む切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することを含む、切断することと、
（３）ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用によって、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分の末端を、所定の配列の第１のヌクレオチドで伸長することであって、第１のヌクレオチドが、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、伸長することと、
（４）第１のヌクレオチドからターミネーター基を除去することと、
（５）二本鎖連結ポリヌクレオチドを、切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、連結ポリヌクレオチドが、支持鎖とそれにハイブリダイズされたヘルパー鎖とを含み、相補的連結末端をさらに含み、連結末端が、
（ｉ）支持鎖において、ユニバーサルヌクレオチドおよび第１のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドであって、第１のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドが、ヘルパー鎖に突出している、ユニバーサルヌクレオチドおよび第１のヌクレオチドのパートナーヌクレオチド、および
（ｉｉ）ヘルパー鎖において、リン酸基を欠く末端ヌクレオチドを含み、
支持鎖の連結時に、第１のヌクレオチドが、パートナーヌクレオチドと対合する、連結することと、
（６）足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、部位が、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義され、切断が、支持鎖を切断すること、および足場ポリヌクレオチドからユニバーサルヌクレオチドを除去して、支持鎖と、プライマー鎖部分を含む合成鎖とを含む切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することを含む、切断することと、
（７）ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用によって、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分の末端を、所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドで伸長することであって、隣のヌクレオチドが、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、伸長することと、
（８）隣のヌクレオチドからターミネーター基を除去することと、
（９）二本鎖連結ポリヌクレオチドを、切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、連結ポリヌクレオチドが、支持鎖とそれにハイブリダイズされたヘルパー鎖とを含み、相補的連結末端をさらに含み、連結末端が、
（ｉ）支持鎖において、ユニバーサルヌクレオチドおよび隣のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドであって、隣のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドが、ヘルパー鎖に突出している、ユニバーサルヌクレオチドおよび次のヌクレオチドのパートナーヌクレオチド、および
（ｉｉ）ヘルパー鎖において、リン酸基を欠く末端ヌクレオチドを含み、
支持鎖の連結時に、隣のヌクレオチドが、パートナーヌクレオチドと対合する、連結することと、
（１０）工程６～９を複数回繰り返して、所定のヌクレオチド配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを提供することと、を含む。
上に記載されるような任意のそのような方法は、本発明で指定された合成方法のバージョン１の方法に従って行うことができ、
ａ）第１のサイクルの切断工程（工程２）の前およびその時点で、ユニバーサルヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドの支持鎖における位置ｎを占め、位置ｎは、そのサイクルにおいてプライマー鎖部分の末端へのその付加時に、所定の配列の第１のヌクレオチドによって占められる合成鎖における位置と反対である支持鎖におけるヌクレオチド位置であり、支持鎖における位置ｎのヌクレオチドは、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと反対であり、かつそれと対合しており、
ｂ）第１のサイクルの切断工程（工程２）において、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎとｎ－１との間で切断され、位置ｎ－１は、ヘルパー鎖に対する遠位方向／プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する支持鎖における隣のヌクレオチド位置であり、
ｃ）第１サイクルの連結工程（工程５）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端は、所定の配列の第１ヌクレオチドのパートナーヌクレオチドが支持鎖の末端ヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、ユニバーサルヌクレオチドは、支持鎖における位置ｎ＋１を占め、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと対合しており、位置ｎは、工程５での切断された足場ポリヌクレオチドへの連結ポリヌクレオチドの連結時に、所定の配列の第１のヌクレオチドと反対であるヌクレオチド位置であり、
ｄ）第２のサイクルの切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、
ｉ．ユニバーサルヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドの支持鎖における位置ｎを占め、位置ｎは、そのサイクルにおいてプライマー鎖部分の末端へのその付加時に、所定の配列の第１の隣のヌクレオチドによって占められる合成鎖における位置と反対である支持鎖におけるヌクレオチド位置であり、
ｉｉ．足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎとｎ－１との間で切断され、ｎ－１は、ヘルパー鎖に対する遠位方向／プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する支持鎖における隣のヌクレオチド位置であり、
ｅ）第２サイクルの連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端は、そのサイクルにおける所定の配列の隣のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドが支持鎖の末端ヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、ユニバーサルヌクレオチドは、支持鎖における位置ｎ＋１を占め、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと対合しており、位置ｎは、切断された足場ポリヌクレオチドへの連結ポリヌクレオチドの連結時に、そのサイクル（工程７）において組み込まれた所定の配列の隣のヌクレオチドと反対であるヌクレオチド位置である。
あるいは、上に記載されるような任意のそのような方法は、本発明で指定された合成方法のバージョン２の方法に従って行うことができ、
ａ）第１のサイクルの切断工程（工程２）の前およびその時点で、ユニバーサルヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドの支持鎖における位置ｎ＋１を占め、位置ｎは、そのサイクルにおいてプライマー鎖部分の末端へのその付加時に、所定の配列の第１のヌクレオチドによって占められる合成鎖における位置と反対である支持鎖におけるヌクレオチド位置であり、支持鎖における位置ｎのヌクレオチドは、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと反対であり、かつそれと対合しており、ｎ＋１は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における隣のヌクレオチド位置であり、
ｂ）第１のサイクルの切断工程（工程２）において、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎとｎ－１との間で切断され、位置ｎ－１は、ヘルパー鎖に対する遠位方向／プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する支持鎖における隣のヌクレオチド位置であり、
ｃ）第１サイクルの連結工程（工程５）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端は、所定の配列の第１ヌクレオチドのパートナーヌクレオチドが支持鎖の末端ヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、ユニバーサルヌクレオチドは、支持鎖における位置ｎ＋２を占め、ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合しており、位置ｎは、工程５での切断された足場ポリヌクレオチドへの連結ポリヌクレオチドの連結時に、所定の配列の第１のヌクレオチドと反対であるヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋２は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における第２の位置であり、
ｄ）第２のサイクルの切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、
ｉ．ユニバーサルヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドの支持鎖における位置ｎ＋１を占め、位置ｎは、そのサイクルにおいてプライマー鎖部分の末端へのその付加時に、所定の配列の第１の隣のヌクレオチドによって占められる合成鎖における位置と反対である支持鎖におけるヌクレオチド位置であり、ｎ＋１は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における隣のヌクレオチド位置であり、
ｉｉ．足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎとｎ－１との間で切断され、ｎ－１は、ヘルパー鎖に対する遠位方向／プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する支持鎖における隣のヌクレオチド位置であり、
ｅ）第２サイクルの連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端は、そのサイクルにおける所定の配列の隣のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドが支持鎖の末端ヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、ユニバーサルヌクレオチドは、支持鎖における位置ｎ＋２を占め、ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合しており、位置ｎは、切断された足場ポリヌクレオチドへの連結ポリヌクレオチドの連結時に、そのサイクル（工程７）において組み込まれた所定の配列の隣のヌクレオチドと反対であるヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋２は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における第２の位置である。
あるいは、上に記載されるような任意のそのような方法は、本発明で指定された合成方法のバージョン３の方法に従って行うことができ、
ａ）第１のサイクルの切断工程（工程２）の前およびその時点で、ユニバーサルヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドの支持鎖における位置ｎを占め、位置ｎは、そのサイクルにおいてプライマー鎖部分の末端へのその付加時に、所定の配列の第１のヌクレオチドによって占められる合成鎖における位置と反対である支持鎖におけるヌクレオチド位置であり、支持鎖における位置ｎのヌクレオチドは、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと反対であり、かつそれと対合しており、
ｂ）第１のサイクルの切断工程（工程２）において、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎ－１とｎ－２との間で切断され、位置ｎ－１およびｎ－２は、それぞれ、ヘルパー鎖に対する遠位方向／プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する支持鎖における隣のヌクレオチドおよび後続のヌクレオチド位置であり、
ｃ）第１サイクルの連結工程（工程５）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端は、所定の配列の第１ヌクレオチドのパートナーヌクレオチドが支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、ユニバーサルヌクレオチドは、支持鎖における位置ｎ＋１を占め、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと対合しており、位置ｎは、工程５での切断された足場ポリヌクレオチドへの連結ポリヌクレオチドの連結時に、所定の配列の第１のヌクレオチドと反対であるヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋１は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における隣のヌクレオチド位置であり、
ｄ）第２のサイクルの切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、
ｉ．ユニバーサルヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドの支持鎖における位置ｎを占め、位置ｎは、そのサイクルにおいてプライマー鎖部分の末端へのその付加時に、所定の配列の第１の隣のヌクレオチドによって占められる合成鎖における位置と反対である支持鎖におけるヌクレオチド位置であり、
ｉｉ．足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎ－１とｎ－２との間で切断され、位置ｎ－１およびｎ－２は、それぞれ、ヘルパー鎖に対する遠位方向／プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する支持鎖における隣のヌクレオチドおよび後続のヌクレオチド位置であり、
ｅ）第２サイクルの連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端は、そのサイクルにおける所定の配列の隣のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドが支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、ユニバーサルヌクレオチドは、支持鎖における位置ｎ＋１を占め、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと対合しており、位置ｎは、切断された足場ポリヌクレオチドへの連結ポリヌクレオチドの連結時に、そのサイクル（工程７）において組み込まれた所定の配列の隣のヌクレオチドと反対であるヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋１は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における隣のヌクレオチド位置である。
あるいは、上に記載されるような任意のそのような方法は、本発明で指定された合成方法のバージョン４の方法に従って行うことができ、
ａ）第１のサイクルの切断工程（工程２）の前およびその時点で、ユニバーサルヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドの支持鎖における位置ｎ＋２を占め、位置ｎは、そのサイクルにおいてプライマー鎖部分の末端へのその付加時に、所定の配列の第１のヌクレオチドによって占められる合成鎖における位置と反対である支持鎖におけるヌクレオチド位置であり、支持鎖における位置ｎのヌクレオチドは、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと反対であり、かつそれと対合しており、ｎ＋２は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における第２のヌクレオチド位置であり、
ｂ）第１のサイクルの切断工程（工程２）において、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎとｎ－１との間で切断され、位置ｎ－１は、ヘルパー鎖に対する遠位方向／プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する支持鎖における隣のヌクレオチド位置であり、
ｃ）第１サイクルの連結工程（工程５）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端は、所定の配列の第１ヌクレオチドのパートナーヌクレオチドが支持鎖の末端ヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、ユニバーサルヌクレオチドは、支持鎖における位置ｎ＋３を占め、プライマー鎖部分に対する遠位方向において、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドから除去された２つの位置であるヌクレオチドと対合しており、位置ｎは、工程５での切断された足場ポリヌクレオチドへの連結ポリヌクレオチドの連結時に、所定の配列の第１のヌクレオチドと反対であるヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋３は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における第３の位置であり、
ｄ）第２のサイクルの切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、
ｉ．ユニバーサルヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドの支持鎖における位置ｎ＋２を占め、位置ｎは、そのサイクルにおいてプライマー鎖部分の末端へのその付加時に、所定の配列の第１の隣のヌクレオチドによって占められる合成鎖における位置と反対である支持鎖におけるヌクレオチド位置であり、ｎ＋２は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における第２のヌクレオチド位置であり、
ｉｉ．足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎとｎ－１との間で切断され、位置ｎ－１は、ヘルパー鎖に対する遠位方向／プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する支持鎖における隣のヌクレオチド位置であり、
ｅ）第２サイクルの連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端は、そのサイクルにおける所定の配列の隣のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドが支持鎖の末端ヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、ユニバーサルヌクレオチドは、支持鎖における位置ｎ＋３を占め、プライマー鎖部分に対する遠位方向において、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドから２つの位置が除去されたヌクレオチドと対合しており、位置ｎは、切断された足場ポリヌクレオチドへの連結ポリヌクレオチドの連結時に、そのサイクル（工程７）において組み込まれた所定の配列の隣のヌクレオチドと反対であるヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋３は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における第３の位置である。
任意のそのような方法は、合成方法のバージョン４の変形例である本発明の方法に従って行うことができ、
（ｉ）第１サイクルの切断工程（工程２）において、ユニバーサルヌクレオチドは代わりに、足場ポリヌクレオチドの支持鎖における位置ｎ＋３を占め、ｎ＋３は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における第３のヌクレオチド位置であり、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎとｎ－１との間で切断され、
（ｉｉ）第１のサイクルの連結工程（工程５）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端は、ユニバーサルヌクレオチドは代わりに、支持鎖における位置ｎ＋４を占め、相補的連結末端でヘルパー鎖の末端ヌクレオチドから除去された３つの位置であるヌクレオチドと対合するように構造化され、位置ｎ＋４は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対して支持鎖における位置４であり、
（ｉｉｉ）第２のサイクルの切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、ユニバーサルヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドの支持鎖の位置ｎ＋３を占め、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎとｎ－１との間で切断され、
（ｉｖ）第２のサイクルの連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端は、ユニバーサルヌクレオチドは、支持鎖における位置ｎ＋４を占め、相補的連結末端でヘルパー鎖の末端ヌクレオチドから２つの位置が除去されたヌクレオチドと対合するように構造化される。
任意のそのような方法は、合成方法のバージョン４のさらなる変形例である本発明の方法に従って行うことができ、
（ｉ）第１サイクルの切断工程（工程２）において、ユニバーサルヌクレオチドは代わりに、足場ポリヌクレオチドの支持鎖における位置ｎ＋３＋ｘを占め、ｎ＋３は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における第３のヌクレオチド位置であり、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎとｎ－１との間で切断され、
（ｉｉ）第１のサイクルの連結工程（工程５）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端は、ユニバーサルヌクレオチドは代わりに、支持鎖における位置ｎ＋４＋ｘを占め、相補的連結末端でヘルパー鎖の末端ヌクレオチドから除去された３＋ｘ個の位置であるヌクレオチドと対合するように構造化され、位置ｎ＋４は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対して支持鎖における位置４であり、
（ｉｉｉ）第２のサイクルの切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、ユニバーサルヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドの支持鎖の位置ｎ＋３＋ｘを占め、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎとｎ－１との間で切断され、
（ｉｖ）第２のサイクルの連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端は、ユニバーサルヌクレオチドが、支持鎖における位置ｎ＋４＋ｘを占め、相補的連結末端でヘルパー鎖の末端ヌクレオチドから除去された２＋ｘ個の位置であるヌクレオチドと対合するように構造化され、
（ｖ）ｘは、１～１０以上の間の整数であり、ｘは、工程（２）、（５）、（６）、および（９）で同じ整数である。
あるいは、上に記載されるような任意のそのような方法は、本発明で指定された合成方法のバージョン５の方法に従って行うことができ、
ａ）第１のサイクルの切断工程（工程２）の前およびその時点で、ユニバーサルヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドの支持鎖における位置ｎ＋１を占め、位置ｎは、そのサイクルにおいてプライマー鎖部分の末端へのその付加時に、所定の配列の第１のヌクレオチドによって占められる合成鎖における位置と反対である支持鎖におけるヌクレオチド位置であり、支持鎖における位置ｎのヌクレオチドは、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと反対であり、かつそれと対合しており、ｎ＋１は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における隣のヌクレオチド位置であり、
ｂ）第１のサイクルの切断工程（工程２）において、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎ－１とｎ－２との間で切断され、位置ｎ－１およびｎ－２は、それぞれ、ヘルパー鎖に対する遠位方向／プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する支持鎖における隣のヌクレオチドおよび後続のヌクレオチド位置であり、
ｃ）第１サイクルの連結工程（工程５）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端は、所定の配列の第１ヌクレオチドのパートナーヌクレオチドが支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、ユニバーサルヌクレオチドは、支持鎖における位置ｎ＋２を占め、ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合しており、位置ｎが、切断された足場ポリヌクレオチドへの連結ポリヌクレオチドの連結時に、所定の配列の第１のヌクレオチドと反対であるヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋２は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における第２のヌクレオチド位置であり、
ｄ）第２のサイクルの前記切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、
ｉ．ユニバーサルヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドの支持鎖における位置ｎ＋１を占め、位置ｎは、そのサイクルにおいてプライマー鎖部分の末端へのその付加時に、所定の配列の第１の隣のヌクレオチドによって占められる合成鎖における位置と反対である支持鎖におけるヌクレオチド位置であり、ｎ＋１は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における隣のヌクレオチド位置であり、
ｉｉ．足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎ－１とｎ－２との間で切断され、位置ｎ－１およびｎ－２は、それぞれ、ヘルパー鎖に対する遠位方向／プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する支持鎖における隣のヌクレオチドおよび後続のヌクレオチド位置であり、
ｅ）第２サイクルの連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端は、そのサイクルにおける所定の配列の隣のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドが支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、ユニバーサルヌクレオチドは、支持鎖における位置ｎ＋２を占め、ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合しており、位置ｎは、切断された足場ポリヌクレオチドへの連結ポリヌクレオチドの連結時に、そのサイクル（工程７）において組み込まれた所定の配列の隣のヌクレオチドと反対であるヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋２は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における第２のヌクレオチド位置である。
任意のそのような方法は、合成方法のバージョン５の変形例である本発明の方法に従って行うことができ、
（ｉ）第１サイクルの切断工程（工程２）において、ユニバーサルヌクレオチドは代わりに、足場ポリヌクレオチドの支持鎖における位置ｎ＋２を占め、ｎ＋２は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における第２のヌクレオチド位置であり、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎとｎ－１との間で切断され、
（ｉｉ）第１のサイクルの連結工程（工程５）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端は、ユニバーサルヌクレオチドが代わりに、支持鎖における位置ｎ＋３を占め、相補的連結末端でヘルパー鎖の末端ヌクレオチドから２つの位置が除去されたヌクレオチドと対合するように構造化され、位置ｎ＋３は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対して支持鎖における位置３であり、
（ｉｉｉ）第２のサイクルの切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、ユニバーサルヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドの支持鎖の位置ｎ＋２を占め、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎとｎ－１との間で切断され、
（ｉｖ）第２のサイクルの連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端は、ユニバーサルヌクレオチドが、支持鎖における位置ｎ＋３を占め、相補的連結末端でヘルパー鎖の末端ヌクレオチドから２つの位置が除去されたヌクレオチドと対合するように構造化される。
任意のそのような方法は、合成方法のバージョン５のさらなる変形例である本発明の方法に従って行うことができ、
（ｉ）第１サイクルの切断工程（工程２）において、ユニバーサルヌクレオチドは代わりに、足場ポリヌクレオチドの支持鎖における位置ｎ＋２＋ｘを占め、ｎ＋２は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における第２のヌクレオチド位置であり、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎとｎ－１との間で切断され、
（ｉｉ）第１のサイクルの連結工程（工程５）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端は、ユニバーサルヌクレオチドが代わりに、支持鎖における位置ｎ＋３＋ｘを占め、相補的連結末端でヘルパー鎖の末端ヌクレオチドから除去された２＋ｘ個の位置であるヌクレオチドと対合するように構造化され、位置ｎ＋３は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対して支持鎖における位置３であり、
（ｉｉｉ）第２のサイクルの切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、ユニバーサルヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドの支持鎖の位置ｎ＋２＋ｘを占め、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎとｎ－１との間で切断され、
（ｉｖ）第２のサイクルの連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端は、ユニバーサルヌクレオチドが、支持鎖における位置ｎ＋３＋ｘを占め、相補的連結末端でヘルパー鎖の末端ヌクレオチドから除去された２＋ｘ個の位置であるヌクレオチドと対合するように構造化され、
（ｖ）ｘは、１～１０以上の間の整数であり、ｘは、工程（２）、（５）、（６）、および（９）で同じ整数である。
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいて、所定の配列の第１／隣のヌクレオチドと対合するパートナーヌクレオチドは、第１／隣のヌクレオチドと相補的な、好ましくは天然に相補的なヌクレオチドであり得る。
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、工程（２）および／または（６）の前に、任意の１つ以上の合成サイクルにおいて、または全ての合成サイクルにおいて、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドが提供され得、合成鎖は、ヘルパー鎖なしで提供される。工程（２）および／または（６）の前に、任意の１つ以上の合成サイクルにおいて、または全ての合成サイクルにおいて、合成鎖は、足場ポリヌクレオチドから除去され得る。
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、任意の１つ以上の合成サイクルにおいて、または全ての合成サイクルにおいて、二本鎖連結ポリヌクレオチドを切断された足場ポリヌクレオチドに連結する工程の後で、かつ隣のものを所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドを足場ポリヌクレオチドの合成鎖に組み込む工程の前に、合成鎖のヘルパー鎖部分は、足場ポリヌクレオチドから除去され得る。いかなるそのような方法においても、合成鎖のヘルパー鎖部分は、（ｉ）足場ポリヌクレオチドを約８０℃～約９５℃の温度に加熱し、足場ヌクレオチドからヘルパー鎖部分を分離すること、（ｉｉ）足場ポリヌクレオチドを８Ｍ尿素などの尿素溶液で処理し、足場ポリヌクレオチドからヘルパー鎖部分を分離すること、（ｉｉｉ）足場ポリヌクレオチドをホルムアミドまたは１００％ホルムアミドなどのホルムアミド溶液で処理し、足場ポリヌクレオチドからヘルパー鎖部分を分離すること、または（ｉｖ）足場ポリヌクレオチドを、ヘルパー鎖部分の配列と相補的であるヌクレオチド配列の領域を含む一本鎖ポリヌクレオチド分子と接触させ、それによってヘルパー鎖部分の足場ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを競合的に阻害することによって、足場ポリヌクレオチドから除去することができる。
ユニバーサルヌクレオチドが位置ｎを占め、足場ポリヌクレオチドの支持鎖が位置ｎとｎ－１との間で切断される上記および本明細書に記載されるいかなるそのような方法においても、各切断工程は、２工程切断プロセスを含み得、各切断工程は、ユニバーサルヌクレオチドを除去し、それによって脱塩基部位を形成することを含む第１の工程と、支持鎖を脱塩基部位で切断することを含む第２の工程と、を含み得る。いかなるそのような方法においても、第１の工程は、ヌクレオチド除去酵素を用いて行われ得る。ヌクレオチド除去酵素は、３－メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ酵素であり得る。ヌクレオチド除去酵素は、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）またはウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）であり得る。いかなるそのような方法においても、第２の工程は、塩基である化学物質を用いて行われ得る。塩基はＮａＯＨであり得る。いかなるそのような方法においても、第２の工程は、脱塩基部位切断活性を有する有機化学物質を用いて行われ得る。有機化学物質は、Ｎ，Ｎ’－ジメチルエチレンジアミンであり得る。いかなるそのような方法においても、第２の工程は、ＡＰエンドヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼＩＩＩ（Ｎｔｈ）、またはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩなどの脱塩基部位リアーゼ活性を有する酵素を用いて行われ得る。
ユニバーサルヌクレオチドが位置ｎを占め、足場ポリヌクレオチドの支持鎖が位置ｎとｎ－１との間で切断される上記および本明細書に記載されるいかなるそのような方法においても、各切断工程は、ユニバーサルヌクレオチドを切断酵素で除去することを含む１工程切断プロセスを含み得、酵素は、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）、または８－オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＯＧＧ１）である。
ユニバーサルヌクレオチドが位置ｎ＋１を占め、足場ポリヌクレオチドの支持鎖が位置ｎとｎ－１との間で切断される上記および本明細書に記載されるいかなるそのような方法においても、またはユニバーサルヌクレオチドが位置ｎを占め、足場ポリヌクレオチドの支持鎖が位置ｎ－１とｎ－２との間で切断されるそのような方法のうちのいずれにおいても、切断工程は、酵素で支持鎖を切断することを含み得る。酵素は、プライマー鎖部分に対する近位方向においてユニバーサルヌクレオチドの隣のヌクレオチドの後で支持鎖を切断し、それによって第１／隣のヌクレオチドを含む合成鎖中に突出末端を作成し得る。そのような酵素はエンドヌクレアーゼＶであり得る。
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、合成二本鎖ポリヌクレオチドの両方の鎖は、ＤＮＡ鎖であり得る。合成鎖および支持鎖はＤＮＡ鎖であり得る。そのような場合、組み込まれたヌクレオチドは、好ましくはｄＮＴＰ、好ましくは可逆的ターミネーター基を含むｄＮＴＰである。いかなるそのような方法においても、可逆的ターミネーター基を含む組み込まれたヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上または全てが、３’－Ｏ－アリル－ｄＮＴＰまたは３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＮＴＰを含み得る。
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、合成二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖はＤＮＡ鎖であり得、合成二本鎖ポリヌクレオチドの第２の鎖はＲＮＡ鎖であり得る。合成鎖はＲＮＡ鎖であり得、支持鎖はＤＮＡ鎖であり得る。そのような場合、組み込まれたヌクレオチドは、好ましくはＮＴＰ、好ましくは可逆的ターミネーター基を含むＮＴＰである。いかなるそのような方法においても、可逆的ターミネーター基を含む組み込まれたヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上または全てが、３’－Ｏ－アリル－ＮＴＰまたは３’－Ｏ－アジドメチル－ＮＴＰであり得る。
ＤＮＡを含む合成鎖へのヌクレオチドの組み込み、例えば、１つ以上のｄＮＴＰの組み込みを伴う上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、酵素は、ポリメラーゼ、好ましくはＤＮＡポリメラーゼ、より好ましくは非修飾ポリメラーゼと比較して、可逆的ターミネーター基を含むｄＮＴＰを組み込む能力が増強された修飾ＤＮＡポリメラーゼであり得る。ポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種９°Ｎ、好ましくは種９°Ｎ－７由来の天然ＤＮＡポリメラーゼのバリアントであり得る。
ＲＮＡを含む合成鎖へのヌクレオチドの組み込み、例えば、１つ以上のＮＴＰの組み込みを伴う上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、酵素は、ポリメラーゼ、好ましくはＴ３またはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼ、より好ましくは非修飾ポリメラーゼと比較して、可逆的ターミネーター基を含むＮＴＰを組み込む能力が増強された修飾ＲＮＡポリメラーゼであり得る。
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、合成二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖はＤＮＡ鎖であり得、合成二本鎖ポリヌクレオチドの第２の鎖はＲＮＡ鎖であり得る。代替的に、合成二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖はＲＮＡ鎖であり得、合成二本鎖ポリヌクレオチドの第２の鎖はＤＮＡ鎖であり得る。
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、酵素は、末端トランスフェラーゼ活性を有し、任意に、酵素が、末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、ｐｏｌラムダ、ｐｏｌマイクロ、またはΦ２９ＤＮＡポリメラーゼである。
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、第１／隣のヌクレオチドから可逆的ターミネーター基を除去する工程は、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いて行われ得る。
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、二本鎖連結ポリヌクレオチドを切断された足場ポリヌクレオチドに連結する工程は、好ましくはリガーゼ酵素を用いて行われる。リガーゼ酵素は、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼまたはＴ４ ＤＮＡリガーゼであり得る。
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、工程（１）、（５）、および／または（９）において、ヘルパー鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが、ヘアピンループによって接続され得る。
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、工程（１）において、プライマー鎖部分とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが、ヘアピンループによって接続され得る。
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、工程（１）、（５）、および／または（９）において、
ａ）ヘルパー鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが、ヘアピンループによって接続され得、
ｂ）プライマー鎖部分を含む合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが、ヘアピンループによって接続され得る。
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、連結ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つまたは全ては、相補的連結末端と反対の末端で、支持鎖およびヘルパー鎖を接続するヘアピンループを含む単一分子として提供され得る。上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、各合成サイクルの連結ポリヌクレオチドは、相補的連結末端と反対の末端で、支持鎖およびヘルパー鎖を接続するヘアピンループをそれぞれ含む単一分子として提供され得る。
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、工程（１）において、プライマー鎖部分とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが、共通の表面に繋留され得る。プライマー鎖部分とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とがそれぞれ、切断可能なリンカーを含み得、リンカーは、合成後に表面から二本鎖ポリヌクレオチドを切り離すために切断され得る。
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、工程（１）において、合成鎖のプライマー鎖部分とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とがヘアピンループによって接続され、ヘアピンループは、表面に繋留されている。
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、ヘアピンループは、切断可能なリンカーを介して表面に繋留され得、リンカーは、合成後に表面から二本鎖ポリヌクレオチドを切り離すために切断され得る。切断可能なリンカーは、ＵＶ切断可能なリンカーであり得る。
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、ポリヌクレオチドが付着している表面は、微粒子の表面または平坦な表面であり得る。
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、ポリヌクレオチドが付着している表面は、ゲルを含み得る。表面は、約２％のポリアクリルアミドなどのポリアクリルアミド表面を含み、好ましくは、ポリアクリルアミド表面は、ガラスなどの固体支持体に結合されている。
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、プライマー鎖部分を含む合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが、１つ以上の共有結合を介して共通の表面に繋留され得る。１つ以上の共有結合は、共通の表面上の官能基と足場分子上の官能基との間に形成され得、足場分子上の官能基は、アミン基、チオール基、チオリン酸基、またはチオアミド基であり得る。共通の表面上の官能基は、ブロモアセチル基であり得、任意に、ブロモアセチル基は、Ｎ－（５－ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用して得られるポリアクリルアミド表面上に提供される。
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、所定の配列のヌクレオチドから可逆的ターミネーター基を除去する工程は、切断工程の前、または連結工程の前に行われ得る。
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、上記および本明細書に記載される合成サイクルのうちのいずれかに関する反応は、微小流体システム内の液滴中で行われ得る。微小流体システムは、エレクトロウェッティングシステムであり得る。微小流体システムは、エレクトロウェッティングオン誘電体システム（ＥＷＯＤ）であり得る。
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、合成後、二本鎖ポリヌクレオチドの鎖を分離して、所定の配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを得ることができる。
上記および本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、合成後、二本鎖ポリヌクレオチドまたはその領域は、好ましくはＰＣＲによって増幅される。
本発明はまた、所定の配列を有するポリヌクレオチドをアセンブリする方法を提供し、方法は、所定の配列を有する第１のポリヌクレオチドと所定の配列を有する１つ以上の追加のポリヌクレオチドとを合成するために、上記および本明細書に記載される合成方法のうちのいずれかを行うことと、第１および１つ以上の追加のポリヌクレオチドを一緒に接合することと、を含む。第１および１つ以上の追加のポリヌクレオチドは、好ましくは異なる所定の配列を含み得る。第１のポリヌクレオチドおよび１つ以上の追加のポリヌクレオチドは、二本鎖であり得るか、または一本鎖であり得る。第１のポリヌクレオチドおよび１つ以上の追加のポリヌクレオチドを最初に切断して、適合する末端を作成し、次に、例えば、連結によって一緒に接合することができる。第１のポリヌクレオチドおよび１つ以上の追加のポリヌクレオチドは、切断部位で制限酵素によって切断されて、適合する末端を作成することができる。
上記および本明細書に記載されるような所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドをインビトロで合成するための方法のうちのいずれか、ならびに／または上記および本明細書に記載されるような所定の配列を有するポリヌクレオチドをインビトロでアセンブリする方法のうちのいずれかは、微小流体システム内の液滴中で行われ得る。いかなるそのような方法においても、アセンブリ方法は、所定の配列を有する第１の合成ポリヌクレオチドを含む第１の液滴と、所定の配列を有する追加の１つ以上の合成ポリヌクレオチドを含む第２の液滴とを提供することを含むアセンブリ工程を含み得、液滴は、互いに接触し、合成ポリヌクレオチドは、一緒に接合され、それにより第１のポリヌクレオチドおよび追加の１つ以上のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドをアセンブリする。いかなるそのような方法おいても、合成工程は、各液滴が合成サイクルの工程に対応する反応試薬を含む、複数の液滴を提供することと、合成サイクルの工程に従って足場ポリヌクレオチドに液滴を順次送達することと、によって行われ得る。いかなるそのような方法においても、液滴の送達後かつ次の液滴の送達前に、過剰の反応試薬を除去するために洗浄工程が実施され得る。いかなるそのような方法においても、微小流体システムは、エレクトロウェッティングシステムであり得る。いかなるそのような方法においても、微小流体システムは、エレクトロウェッティングオン誘電体システム（ＥＷＯＤ）であり得る。いかなるそのような方法においても、合成工程およびアセンブリ工程は、同じシステム内で行われ得る。
関連する態様では、本発明は、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドをインビトロで合成する方法におけるユニバーサルヌクレオチドの使用をさらに提供し、ユニバーサルヌクレオチドを使用して、各合成サイクル中にポリヌクレオチド切断部位を作成し、各合成サイクルにおいて、当該使用は、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することであって、合成鎖が、プライマー鎖部分および任意に一本鎖切断によってプライマー鎖部分から分離されたプライマー鎖部分からヘルパー鎖部分を含み、ユニバーサルヌクレオチドが支持鎖中に提供されて、切断部位を提供する、提供することと、足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、そのときにユニバーサルヌクレオチドが足場ポリヌクレオチドから除去され、切断末端が足場ポリヌクレオチド中に作成される、切断することと、可逆的ターミネーター基を含む所定の配列の新たなヌクレオチドを、ポリメラーゼまたはトランスフェラーゼ酵素によって足場ポリヌクレオチドの切断末端で合成鎖の末端に付加することと、支持鎖とそれにハイブリダイズされたヘルパー鎖とを有する連結ポリヌクレオチドを、足場ポリヌクレオチドの切断末端に連結することと、を含み、支持鎖は、足場ポリヌクレオチドの合成鎖中の新たなヌクレオチドと対合するためのヌクレオチドを含み、かつ次の合成サイクルで使用するための新たなポリヌクレオチド切断部位を作成することにおいて使用するための新たなユニバーサルヌクレオチドをさらに含み、可逆的ターミネーター基は、切断または連結工程後に新たなヌクレオチドから除去され、任意にヘルパー鎖は、連結工程後および次のサイクルの切断工程前に除去される。所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成する方法におけるユニバーサルヌクレオチドのそのような使用は、上記および本明細書に定義および記載されたる特定の方法のうちのいずれかを使用して実施され得る。
関連する態様では、本発明はさらに、所定のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドの合成鎖をインビトロで伸長する方法をさらに提供し、方法は、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することであって、合成鎖が、プライマー鎖部分、および任意に一本鎖切断によってプライマー鎖部分から分離されたヘルパー鎖部分を含み、ユニバーサルヌクレオチドが支持鎖中に提供される、ポリヌクレオチド切断部位を定義する、提供することと、足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、そのときにユニバーサルヌクレオチドが足場ポリヌクレオチドから除去され、切断末端が足場ポリヌクレオチド中に作成される、切断することと、可逆的ターミネーター基を含む所定の配列の新たなヌクレオチドを、ポリメラーゼまたはトランスフェラーゼ酵素によって足場ポリヌクレオチドの切断末端で合成鎖の末端に付加することと、を含み、足場ポリヌクレオチドの切断末端は、支持鎖とそれにハイブリダイズされたヘルパー鎖とを有する連結ポリヌクレオチドの連結アクセプター部位として作用し、支持鎖は、足場ポリヌクレオチドの合成鎖中の所定のヌクレオチドと対合するためのヌクレオチドを含み、かつ次の合成サイクルで使用するための新たなポリヌクレオチド切断部位を作成することにおいて使用するための新たなユニバーサルヌクレオチドをさらに含み、可逆的ターミネーター基は、切断または連結工程後に新たなヌクレオチドから除去され、任意にヘルパー鎖は、連結工程後および次のサイクルの切断工程前に除去される。ポリヌクレオチド分子の合成鎖を所定のヌクレオチドで伸長させるいかなるそのような方法においても、本方法は、上記および本明細書に定義および記載される任意の特定の方法のうちのいずれかを使用して実施され得る。
関連する態様では、本発明は、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドをインビトロで合成する方法をさらに提供し、方法は、合成のサイクルを含み、各合成サイクルは、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖を含む足場ポリヌクレオチドを提供することであって、合成鎖が、プライマー鎖部分および任意に一本鎖切断によってプライマー鎖部分から分離されたヘルパー鎖部分を含み、ユニバーサルヌクレオチドが、支持鎖中に提供され、かつポリヌクレオチド切断部位を定義する、提供することと、足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、そのときにユニバーサルヌクレオチドが足場ポリヌクレオチドから除去され、切断末端が足場ポリヌクレオチド中に作成される、切断することと、可逆的ターミネーター基を含む所定の配列の新たなヌクレオチドを、ポリメラーゼまたはトランスフェラーゼ酵素によって足場ポリヌクレオチドの切断末端で合成鎖の末端に付加すること、支持鎖とそれにハイブリダイズされたヘルパー鎖とを有する連結ポリヌクレオチドを、足場ポリヌクレオチドの切断末端に連結することであって、支持鎖が、足場ポリヌクレオチドの合成鎖中の新たなヌクレオチドと対合するためのヌクレオチドを含み、かつ次の合成サイクルで使用するための新たなポリヌクレオチド切断部位を作成することにおいて使用するための新たなユニバーサルヌクレオチドをさらに含む、付加および連結することと、可逆的ターミネーター基を、切断または連結工程後に新たなヌクレオチドから除去することと、任意に、ヘルパー鎖を、連結工程後および次のサイクルの切断工程前に除去することと、を含む。所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成するいかなるそのような方法においても、本方法は、上記および本明細書に定義および記載される特定の方法のうちのいずれかを使用して実施され得る。
関連する態様では、本発明は、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成するサイクル中に、ユニバーサルヌクレオチドを含む連結ポリヌクレオチドを二本鎖ポリヌクレオチドにインビトロで連結する方法をさらに提供し、合成サイクル中に、二本鎖ポリヌクレオチドは、所定のヌクレオチドおよびそのパートナーで伸長され、方法は、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖を含む足場ポリヌクレオチドを提供することであって、合成鎖が、プライマー鎖部分および任意に一本鎖切断によってプライマー鎖部分から分離されたヘルパー鎖部分を含み、ユニバーサルヌクレオチドが、支持鎖中に提供され、かつポリヌクレオチド切断部位を定義する、提供することと、足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、そのときにユニバーサルヌクレオチドが足場ポリヌクレオチドから除去され、切断末端が足場ポリヌクレオチド中に作成される、切断することと、可逆的ターミネーター基を含む所定の配列の新たなヌクレオチドを、ポリメラーゼまたはトランスフェラーゼ酵素によって足場ポリヌクレオチドの切断末端で合成鎖の末端に付加すること、支持鎖とそれにハイブリダイズされたヘルパー鎖とを有する連結ポリヌクレオチドを、足場ポリヌクレオチドの切断末端に連結することであって、支持鎖が、足場ポリヌクレオチドの合成鎖中の新たなヌクレオチドと対合するためのヌクレオチドを含み、かつ次の合成サイクルで使用するための新たなポリヌクレオチド切断部位を作成することにおいて使用するための新たなユニバーサルヌクレオチドをさらに含む、付加および連結することと、それにより、次の合成サイクルで使用するための新たな足場ポリヌクレオチドを作成することと、可逆的ターミネーター基を、切断または連結工程後に新たなヌクレオチドから除去することと、任意に、ヘルパー鎖を、連結工程後および次のサイクルの切断工程前に除去することと、を含む。所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成するサイクル中に、ユニバーサルヌクレオチドを含む連結ポリヌクレオチドを二本鎖ポリヌクレオチドに連結するいかなるそのような方法においても、方法は、上記および本明細書に定義および記載される特定の方法のうちのいずれかを使用して実施され得る。
本発明は追加的に、上記および本明細書に記載される合成および／またはアセンブリ方法のうちのいずれかを実施するためのポリヌクレオチド合成システムを提供し、（ａ）各反応領域が少なくとも１つの足場ポリヌクレオチドを含む、反応領域のアレイと、（ｂ）反応試薬を反応領域に送達するための手段と、任意に（ｃ）足場ポリヌクレオチドからの合成二本鎖ポリヌクレオチドを切断するための手段と、を含む。そのようなシステムは、反応試薬を液滴で提供するための手段と、合成サイクルに従って足場ポリヌクレオチドに液滴を送達するための手段と、をさらに含み得る。
本発明は、上記および本明細書に記載されるシステムのうちのいずれかと共に使用するため、ならびに上記および本明細書に記載される合成方法のうちのいずれかを実施するためのキットをさらに提供し、キットは、合成サイクルの工程に対応する反応試薬の容量を含む。
本発明はまた、ポリヌクレオチドマイクロアレイを作成する方法を提供し、マイクロアレイは、複数の反応領域を含み、各領域は、所定の配列を有する１つ以上のポリヌクレオチドを含み、方法は、
ａ）複数の反応領域を含む表面を提供することであって、各領域が１つ以上の二本鎖アンカーまたは足場ポリヌクレオチドを含む、提供することと、
ｂ）各反応領域で上記および本明細書に記載される方法のいずれかに従って合成サイクルを行い、それにより所定の配列を有する１つ以上の二本鎖ポリヌクレオチドを各領域で合成することと、を含む。
そのような方法では、合成後、二本鎖ポリヌクレオチドの鎖を分離して、マイクロアレイを提供することができ、各領域は、所定の配列を有する１つ以上の一本鎖ポリヌクレオチドを含む。
本明細書に提示され、以下に記載される関連図は、本発明の方法を含む方法を使用する合成サイクルの工程のうちのいくつかまたは全て、ならびにオリゴヌクレオチド、表面、表面付着化学、リンカーなどの方法の態様を行うための手段を示す。これらの図ならびにその全ての説明および全ての関連方法、試薬、およびプロトコルは、例示のみのために掲示され、限定するものとして解釈されるべきではない。
例えば、図６、７、８、９、１０、１３ａ、１４ａ、１５ａ等の関連図は、ヌクレオチド（例えば、可逆的ターミネーター基を含むヌクレオチド）の組み込み、切断（例えば、足場ポリヌクレオチドを第１の部分と第２の部分とに切断し、第１の部分はユニバーサルヌクレオチドを含み、第２の部分は組み込まれたヌクレオチドを含む）、連結（例えば、一本鎖部分を含むポリヌクレオチド構築物を、組み込まれたヌクレオチドを含む切断された足場ポリヌクレオチドの第２の部分に連結し、一本鎖部分は、組み込まれたヌクレオチドに相補的なパートナーヌクレオチドを含む）、および脱保護（例えば、組み込まれたヌクレオチドからの可逆的ターミネーター基の除去）を含む合成サイクルの工程のうちのいくつかまたは全てを示す。これらの方法は、例示的な支持のためにのみ提供されており、特許請求される発明の範囲内ではない。図１～５に示される方法スキームは、本発明の方法である。図５１に示されるデータは、実施例１３に記載されるように、本明細書に記載される図１、２、および４に示される合成方法のバージョン１、２、および４と一致する本発明の方法に関する。
本発明の例示的な方法のバージョン１のスキーム。 本発明の例示的な方法のバージョン１による第１の合成サイクルを示すスキーム。方法は、足場ポリヌクレオチドの提供、切断、組み込み、脱保護、および連結のサイクルを含む。スキームは、ポリヌクレオチド切断部位を定義する支持鎖にユニバーサルヌクレオチドを含み、合成鎖に一本鎖切断（「ニック」）を含む足場ポリヌクレオチド（１０１）の提供を示している。このスキームは、支持鎖（１０２）に一本鎖切断を作成し、続いて足場ポリヌクレオチド（１０３）の切断末端で合成鎖の末端にチミンヌクレオチドを付加することによる支持鎖の切断、および保護工程（１０４）中の可逆的ブロッキング基の除去を示す。切断された足場ポリヌクレオチド（１０５）への連結ポリヌクレオチドの連結に続いて、新たに組み込まれたチミンヌクレオチドは、そのパートナーヌクレオチドアデニン（１０４）の反対で対合される。連結工程に続いて、再構築された足場ポリヌクレオチドは、次の合成サイクルで使用するために、新たに組み込まれたヌクレオチドの対（１０６）と共に提供される。このＡ－Ｔ対は、例示の目的のみのために示されており、限定するものではなく、必要とされる所定の配列に応じた任意の対であり得る。位置Ｈ－Ｉのヌクレオチド対は、任意の対であり得る。ヌクレオチドＸは、任意のヌクレオチドであり得る。図はまた、第２の合成サイクルに対応する参照符号を示す。 本発明の例示的な方法のバージョン２のスキーム。 本発明の例示的な方法のバージョン２による第１の合成サイクルを示すスキーム。方法は、足場ポリヌクレオチドの提供、切断、組み込み、脱保護、および連結のサイクルを含む。スキームは、ポリヌクレオチド切断部位を定義する支持鎖にユニバーサルヌクレオチドを含み、合成鎖に一本鎖切断（「ニック」）を含む足場ポリヌクレオチド（１０１）の提供を示している。このスキームは、支持鎖（１０２）に一本鎖切断を作成し、続いて足場ポリヌクレオチド（１０３）の切断末端で合成鎖の末端にチミンヌクレオチドを付加することによる支持鎖の切断、および保護工程（１０４）中の可逆的ブロッキング基の除去を示す。切断された足場ポリヌクレオチド（１０５）への連結ポリヌクレオチドの連結に続いて、新たに組み込まれたチミンヌクレオチドは、そのパートナーヌクレオチドアデニン（１０４）の反対で対合される。連結工程に続いて、再構築された足場ポリヌクレオチドは、次の合成サイクルで使用するために、新たに組み込まれたヌクレオチドの対（１０６）と共に提供される。このＡ－Ｔ対は、例示の目的のみのために示されており、限定するものではなく、必要とされる所定の配列に応じた任意の対であり得る。位置Ｈ－ＩおよびＪ－Ｋのヌクレオチド対は、任意の対であり得る。ヌクレオチドＸは、任意のヌクレオチドであり得る。図はまた、第２の合成サイクルに対応する参照符号を示す。 本発明の例示的な方法のバージョン３のスキーム。 本発明の例示的な方法のバージョン３による第１の合成サイクルを示すスキーム。方法は、足場ポリヌクレオチドの提供、切断、組み込み、脱保護、および連結のサイクルを含む。スキームは、ポリヌクレオチド切断部位を定義する支持鎖にユニバーサルヌクレオチドを含み、合成鎖に一本鎖切断（「ニック」）を含む足場ポリヌクレオチド（１０１）の提供を示している。このスキームは、支持鎖（１０２）に一本鎖切断を作成し、続いて足場ポリヌクレオチド（１０３）の切断末端で合成鎖の末端にチミンヌクレオチドを付加することによる支持鎖の切断、および保護工程（１０４）中の可逆的ブロッキング基の除去を示す。切断された足場ポリヌクレオチド（１０５）への連結ポリヌクレオチドの連結に続いて、新たに組み込まれたチミンヌクレオチドは、そのパートナーヌクレオチドアデニン（１０４）の反対で対合される。連結工程に続いて、再構築された足場ポリヌクレオチドは、次の合成サイクルで使用するために、新たに組み込まれたヌクレオチドの対（１０６）と共に提供される。このＡ－Ｔ対は、例示の目的のみのために示されており、限定するものではなく、必要とされる所定の配列に応じた任意の対であり得る。位置Ｈ－ＩおよびＪ－Ｋのヌクレオチド対は、任意の対であり得る。ヌクレオチドＸは、任意のヌクレオチドであり得る。図はまた、第２の合成サイクルに対応する参照符号を示す。 本発明の例示的な方法のバージョン４のスキーム。 本発明の例示的な方法のバージョン４による第１の合成サイクルを示すスキーム。方法は、足場ポリヌクレオチドの提供、切断、組み込み、脱保護、および連結のサイクルを含む。スキームは、ポリヌクレオチド切断部位を定義する支持鎖にユニバーサルヌクレオチドを含み、合成鎖に一本鎖切断（「ニック」）を含む足場ポリヌクレオチド（１０１）の提供を示している。このスキームは、支持鎖（１０２）に一本鎖切断を作成し、続いて足場ポリヌクレオチド（１０３）の切断末端で合成鎖の末端にチミンヌクレオチドを付加することによる支持鎖の切断、および保護工程（１０４）中の可逆的ブロッキング基の除去を示す。切断された足場ポリヌクレオチド（１０５）への連結ポリヌクレオチドの連結に続いて、新たに組み込まれたチミンヌクレオチドは、そのパートナーヌクレオチドアデニン（１０４）の反対で対合される。連結工程に続いて、再構築された足場ポリヌクレオチドは、次の合成サイクルで使用するために、新たに組み込まれたヌクレオチドの対（１０６）と共に提供される。このＡ－Ｔ対は、例示の目的のみのために示されており、限定するものではなく、必要とされる所定の配列に応じた任意の対であり得る。位置Ｈ－Ｉ、Ｊ－Ｋ、およびＬ－Ｍのヌクレオチド対は、任意の対であり得る。ヌクレオチドＸは、任意のヌクレオチドであり得る。図はまた、第２の合成サイクルに対応する参照符号を示す。 本発明の例示的な方法のバージョン５のスキーム。 スキームは、ポリヌクレオチド切断部位を定義する支持鎖にユニバーサルヌクレオチドを含み、合成鎖に一本鎖切断（「ニック」）を含む足場ポリヌクレオチド（１０１）の提供を示している。このスキームは、支持鎖（１０２）に一本鎖切断を作成し、続いて足場ポリヌクレオチド（１０３）の切断末端で合成鎖の末端にチミンヌクレオチドを付加することによる支持鎖の切断、および保護工程（１０４）中の可逆的ブロッキング基の除去を示す。切断された足場ポリヌクレオチド（１０５）への連結ポリヌクレオチドの連結に続いて、新たに組み込まれたチミンヌクレオチドは、そのパートナーヌクレオチドアデニン（１０４）の反対で対合される。連結工程に続いて、再構築された足場ポリヌクレオチドは、次の合成サイクルで使用するために、新たに組み込まれたヌクレオチドの対（１０６）と共に提供される。このＡ－Ｔ対は、例示の目的のみのために示されており、限定するものではなく、必要とされる所定の配列に応じた任意の対であり得る。位置Ｈ－Ｉ、Ｊ－Ｋ、およびＬ－Ｍのヌクレオチド対は、任意の対であり得る。ヌクレオチドＸは、任意のヌクレオチドであり得る。図はまた、第２の合成サイクルに対応する参照符号を示す。 例示的な方法のバージョン１のスキーム。 実施例部分の例示的な方法のバージョン１による第１の合成サイクルを示すスキーム。この方法は、例示的な支持のためにのみ提供されており、特許請求される発明の範囲内ではない。方法は、足場ポリヌクレオチドの提供、組み込み、切断、連結、および脱保護のサイクルを含む。スキームは、第１の合成サイクル（１０１、１０２）におけるチミンヌクレオチドの組み込み、およびパートナーアデニンヌクレオチド（１０４）と反対のその対合、ならびに次の合成サイクルで使用するための足場ポリヌクレオチド（１０６）の提供を示す。この対は、例示の目的のみのために示されており、限定するものではなく、必要とされる所定の配列に応じた任意の対であり得る。ヌクレオチドＺは、任意のヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドＸは、任意の適切なヌクレオチドであり得る。図はまた、第２の合成サイクルに対応する参照符号を示す。 例示的な方法のバージョン２のスキーム。 実施例部分の例示的な方法のバージョン２による第１の合成サイクルを示すスキーム。この方法は、例示的な支持のためにのみ提供されており、特許請求される発明の範囲内ではない。方法は、足場ポリヌクレオチドの提供、組み込み、切断、連結、および脱保護のサイクルを含む。このスキームは、第１のサイクル（２０１、２０２）におけるチミンヌクレオチドおよびパートナーアデニンヌクレオチド（２０４）と反対のその対合の組み込み、ならびに次の合成サイクルにおいてシトシンと対合するためのグアニンを含む足場ポリヌクレオチド（２０６）の提供を示す。これらの対は、例示の目的のみのために示されており、限定するものではなく、必要とされる所定の配列に応じた任意の対であり得る。ヌクレオチドＺは、任意のヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドＸは、任意の適切なヌクレオチドであり得る。図はまた、第２の合成サイクルに対応する参照符号を示す。 例示的な方法のバージョン３のスキーム。 実施例部分の例示的な方法のバージョン３による第１の合成サイクルを示すスキーム。この方法は、例示的な支持のためにのみ提供されており、特許請求される発明の範囲内ではない。方法は、足場ポリヌクレオチドの提供、組み込み、切断、連結、および脱保護のサイクルを含む。スキームは、第１のサイクル（３０１、３０２）におけるチミンヌクレオチドおよびパートナーアデニンヌクレオチド（３０４）と反対のその対合の組み込み、ならびに次の合成サイクルで使用するための足場ポリヌクレオチド（３０６）の提供を示す。この対は、例示の目的のみのために示されており、限定するものではなく、必要とされる所定の配列に応じた任意の対であり得る。スキームはまた、足場ポリヌクレオチドの構成成分としてのシトシン－グアニン対を示し、これは所定の配列の一部ではない。この対はまた、例示の目的のみのために示されており、限定するものではなく、任意の対であり得る。ヌクレオチドＺは、任意のヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドＸは、任意の適切なヌクレオチドであり得る。 例示的な方法のバージョン４のスキーム。 実施例部分の例示的な方法のバージョン４による第１の合成サイクルを示すスキーム。この方法は、例示的な支持のためにのみ提供されており、特許請求される発明の範囲内ではない。方法は、足場ポリヌクレオチドの提供、組み込み、切断、連結、および脱保護のサイクルを含む。スキームは、第１のサイクル（４０１、４０２）におけるチミンヌクレオチドおよびパートナーユニバーサルヌクレオチド（４０４）と反対のその対合の組み込み、ならびに次の合成サイクルにおいてシトシンと対合するためのグアニンを含む足場ポリヌクレオチド（４０６）の提供を示す。これらの対は、例示の目的のみのために示されており、限定するものではなく、必要とされる所定の配列に応じた任意の対であり得る。ヌクレオチドＸ、Ｙ、およびＺは、任意のヌクレオチドであり得る。 例示的な方法のバージョン５のスキーム。 実施例部分の例示的な方法のバージョン５による第１の合成サイクルを示すスキーム。この方法は、例示的な支持のためにのみ提供されており、特許請求される発明の範囲内ではない。方法は、足場ポリヌクレオチドの提供、組み込み、切断、連結、および脱保護のサイクルを含む。スキームは、第１のサイクル（５０１、５０２）におけるチミンヌクレオチドおよびパートナーアデニンヌクレオチド（５０４）と反対のその対合の組み込み、ならびに次の合成サイクルにおいてシトシンと対合するためのグアニンを含む足場ポリヌクレオチド（５０６）の提供を示す。スキームはまた、足場ポリヌクレオチドの構成成分としてのシトシン－グアニン対（位置ｎ－２）を示し、これは所定の配列の一部ではない。これらの対は、例示の目的のみのために示されており、限定するものではなく、必要とされる所定の配列に応じた任意の対であり得る。ヌクレオチドＸ、Ｙ、およびＺは、任意のヌクレオチドであり得る。 足場ポリヌクレオチドの表面固定化を示すスキーム。 スキームは、足場ポリヌクレオチドの可能な例示的なヘアピンループ構成およびそれらの表面への固定化を示す（ａ～ｈ）。 スキーム（ｉおよびｊ）は、ポリヌクレオチドを表面に付着させるための表面化学の例を示す。実施例は、両方の鎖がヘアピンを介して接続されている二本鎖の実施形態を示しているが、非接続二本鎖ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を付着させるために同じ化学を使用することができる。 ヘルパー鎖の不在－組み込み。 ａ）破線枠で強調表示されている組み込み工程を示すスキーム。 ｂ）イノシンと反対の３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰの組み込みについてのＤＮＡポリメラーゼの評価。図は、５０℃のＭｎ２＋イオンの存在下での様々なＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（エキソ）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩおよびＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ）による３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲルを示する。レーン１：Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを使用した３’－Ｏ－アリル－ｄＴＴＰの組み込み。レーン２：Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを使用した３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰの組み込み。レーン３：Ｄｅｅｐ ｖｅｎｔ（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼを使用した３’－Ｏ－アリル－ｄＴＴＰの組み込み。レーン４：Ｄｅｅｐ ｖｅｎｔ（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼを使用した３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰの組み込み。レーン５：Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｉ ＤＮＡポリメラーゼを使用した３’－Ｏ－アリル－ｄＴＴＰの組み込み。レーン６：Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｉ ＤＮＡポリメラーゼを使用した３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰの組み込み。レーン７：Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼを使用した３’－Ｏ－アリル－ｄＴＴＰの組み込み。レーン８：Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼを使用した３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰの組み込み。 ｃ）イノシンと反対の３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰの組み込みについてのＤＮＡポリメラーゼの評価。様々なＤＮＡポリメラーゼを使用した組み込みの結果。 ｄ）Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼを使用した組み込みについての温度の評価。図は、様々な温度でＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼを使用したＭｎ２＋イオンの存在下でのイノシンと反対の３’－修飾－ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲルを示す。レーン１：３７℃での３’－Ｏ－アリル－ｄＴＴＰの組み込み。レーン２：３７℃での３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰの組み込み。レーン３：５０℃での３’－Ｏ－アリル－ｄＴＴＰの組み込み。レーン４：５０℃での３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰの組み込み。レーン５：６５℃での３’－Ｏ－アリル－ｄＴＴＰの組み込み。レーン６：６５℃での３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰの組み込み。 ｅ）Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼを使用した組み込みについての温度の評価。異なる温度で行われた組み込みの結果。 ｆ）Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼを使用した組み込みについてのＭｎ２＋の存在の評価。図は、６５℃でのイノシンと反対の３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲルを示す。レーンＳ：標準。レーン１：Ｍｎ２＋イオンを含まない３’－Ｏ－アリル－ｄＴＴＰの組み込み。レーン２：Ｍｎ２＋イオンを含まない３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰの組み込み。レーン３：Ｍｎ２＋イオンの存在下での３’－Ｏ－アリル－ｄＴＴＰの組み込み。レーン４：Ｍｎ２＋イオンの存在下での３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰの組み込み。 ｇ）Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼを使用した組み込みについてのＭｎ２＋の存在の評価。Ｍｎ２＋イオンの存在下および不在下での組み込みの結果。 ｈ）組み込み工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。 ヘルパー鎖の不在－切断。 ａ）ヘルパー鎖の不在下でのハイブリダイズされたポリヌクレオチド鎖の切断を示すスキーム。切断工程は、破線枠で強調表示されている。 ｂ）３７℃および室温２４℃でのそれぞれｈＡＡＧおよび０．２Ｍ ＮａＯＨ（強塩基）によるオリゴヌクレオチドの切断を示すゲル。レーン１．開始オリゴヌクレオチド。両方の全長鎖を含んだ陽性対照であったレーン２は、９０％：１０％の切断対未切断ＤＮＡ比のより高い収率を示した。ヘルパー鎖によらない切断反応を含んだレーン３は、１０％：９０％の切断対未切断ＤＮＡ比の低い収率パーセンテージを示した。 ｃ）３７℃でのｈＡＡＧおよびＥｎｄｏ ＶＩＩＩによるオリゴヌクレオチドの切断を示すゲル。両方の全長鎖を含んだ陽性対照であったレーン２は、約９０％：１０％の切断対未切断ＤＮＡ比のより高い収率を示した。ヘルパー鎖によらない切断反応を含んだレーン３は、約７％：９３％の切断対未切断ＤＮＡ比の低い収率パーセンテージを示した。 ｄ）ｈＡＡＧ／Ｅｎｄｏ ＶＩＩＩおよびｈＡＡＧ／化学塩基によるオリゴヌクレオチドの切断の要約。 ｅ）切断工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。 ヘルパー鎖の不在－連結。 ａ）ヘルパー鎖の不在下でのハイブリダイズされたポリヌクレオチド鎖の連結を示すスキーム。破線枠で強調表示されている連結工程。 ｂ）ヘルパー鎖の不在下で室温（２４℃）でのＱｕｉｃｋ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによるオリゴヌクレオチドの連結を示すゲル。レーン１は、３６ｍｅｒのＴＡＭＲＡ一本鎖オリゴと１８ｍｅｒのＴＡＭＲＡ一本鎖オリゴとの混合物を含んだ。これらのオリゴは参照バンドを提供した。 ｃ）切断工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。 ヘルパー鎖によるバージョン１化学－組み込み。 ａ）破線枠で強調表示されている組み込み工程を示すスキーム。 ｂ）組み込み工程の研究に適用可能なオリゴヌクレオチド。 ヘルパー鎖によるバージョン１化学－切断。 ａ）ヘルパー鎖の不在下でのハイブリダイズされたポリヌクレオチド鎖の切断を示すスキーム。切断工程は、破線枠で強調表示されている。 ｂ）３７℃および室温２４℃でのそれぞれｈＡＡＧおよび０．２Ｍ ＮａＯＨ（強塩基）によるオリゴヌクレオチドの切断を示すゲル。レーン１．開始オリゴヌクレオチド。両方の全長鎖を含んだ陽性対照であったレーン２は、９０％：１０％の切断対未切断ＤＮＡ比のより高い収率を示した。ヘルパー鎖によらない切断反応を含んだレーン３は、１０％：９０％の切断対未切断ＤＮＡ比の低い収率パーセンテージを示した。ヘルパー鎖による切断反応を含んだレーン４は、５０％：５０％の切断対未切断ＤＮＡ比の等しい収率パーセンテージを示した。 ｃ）脱塩基部位の切断についてのエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの評価。ゲルは、３７℃でのｈＡＡＧおよびＥｎｄｏ ＶＩＩＩによるオリゴヌクレオチドの切断を示す。両方の全長鎖を含んだ陽性対照であったレーン２は、約９０％：１０％の切断対未切断ＤＮＡ比のより高い収率を示した。ヘルパー鎖によらない切断反応を含んだレーン３は、約７％：９３％の切断対未切断ＤＮＡ比の低い収率パーセンテージを示した。ヘルパー鎖による切断反応を含んだレーン４は、１０％：９０％の切断対未切断ＤＮＡ比の低い収率パーセンテージを示した。 ｄ）脱塩基部位の切断についてのＮ，Ｎ’－ジメチルエチレンジアミンの評価。ゲルは、３７℃でのｈＡＡＧおよび１００ｍＭのＮ，Ｎ’－ジメチルエチレンジアミンによるオリゴヌクレオチドの切断を示す。レーン１．開始オリゴヌクレオチド。両方の全長鎖を含んだ陽性対照であるレーン２は、１００％の切断ＤＮＡを示した。ヘルパー鎖による切断反応を含んだレーン３は、９０％：１０％の切断対未切断ＤＮＡ比のより高い収率パーセンテージを示した。 ｅ）ｈＡＡＧ／Ｅｎｄｏ ＶＩＩＩ、ｈＡＡＧ／化学塩基およびｈＡＡＧ／代替化学塩基によるオリゴヌクレオチドの切断の要約。 ｆ）切断工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。 ヘルパー鎖によるバージョン１化学－連結。 ａ）ヘルパー鎖の存在下でハイブリダイズされたポリヌクレオチド鎖の連結を示すスキーム。破線枠で強調表示されている連結工程。 ｂ）ヘルパー鎖の存在下での室温（２４℃）でのＱｕｉｃｋ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによるオリゴヌクレオチドの連結を示すゲル。レーン１は、３６ｍｅｒのＴＡＭＲＡ一本鎖オリゴと１８ｍｅｒのＴＡＭＲＡ一本鎖オリゴとの混合物を含んだ。これらのオリゴは参照バンドを提供した。レーン２では、２０分後に予想されるバンドサイズ３６ｍｅｒの観察可能な連結生産物があった。 ｃ）ヘルパー鎖の存在下で一晩インキュベートした後の、室温（２４℃）でのＱｕｉｃｋ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによるオリゴヌクレオチドの連結を示すゲル。レーン１は、３６ｍｅｒのＴＡＭＲＡ一本鎖オリゴと１８ｍｅｒのＴＡＭＲＡ一本鎖オリゴとの混合物を含んだ。これらのオリゴは参照バンドとして機能した。レーン２では、３６ｍｅｒの予想されるバンドサイズの観察可能な完全連結生産物があった。 ｄ）切断工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。 ヘルパー鎖によるバージョン２化学－組み込み。 ａ）オレンジ色の破線枠で強調表示されている組み込み工程を示すスキーム ｂ）２７℃でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼによる３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲル。レーン１：開始材料。レーン２：１分後の組み込み、転化率５％。レーン３：２分後の組み込み、転化率１０％。レーン４：５分後の組み込み、転化率２０％。レーン５：１０分後の組み込み、転化率３０％。レーン６：２０分後の組み込み、転化率３５％。 ｃ）図は、３７℃でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼによる３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲルを図示する。レーン１：開始材料。レーン２：１分後の組み込み、転化率３０％。レーン３：２分後の組み込み、転化率６０％。レーン４：５分後の組み込み、転化率９０％。レーン５：１０分後の組み込み、転化率９０％。レーン６：２０分後の組み込み、転化率９０％。 ｄ）４７℃でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼによる３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲル。レーン１：開始材料。レーン２：１分後の組み込み、転化率３０％。レーン３：２分後の組み込み、転化率６５％。レーン４：５分後の組み込み、転化率９０％。レーン５：１０分後の組み込み、転化率９０％。レーン６：２０分後の組み込み、転化率９０％。 ｅ）２７℃でＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼによる３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲル。レーン１：開始材料。レーン２：１分後の組み込み、転換率７０％。レーン３：２分後の組み込み、転化率８５％。レーン４：５分後の組み込み、転化率９２％。レーン５：１０分後の組み込み、転化率９６％。レーン６：２０分後の組み込み、転化率９６％。 ｆ）３７℃でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼによる３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲル。レーン１：開始材料。レーン２：１分後の組み込み、転化率８５％。レーン３：２分後の組み込み、転化率９５％。レーン４：５分後の組み込み、転化率９６％。レーン５：１０分後の組み込み、転化率９６％。レーン６：２０分後の組み込み、転化率９６％。 ｇ）４７℃でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼによる３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲル。レーン１：開始材料。レーン２：１分後の組み込み、転化率８５％。レーン３：２分後の組み込み、転化率９０％。レーン４：５分後の組み込み、転化率９６％。レーン５：１０分後の組み込み、転化率９６％。レーン６：２０分後の組み込み、転化率９６％。 ｈ）様々な温度での３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰの組み込みおよびＭｎ２＋イオンの存在の要約。 ｉ）３７℃でのＭｎ２＋の存在下でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼによる相補的塩基と反対の３’－Ｏ－修飾－ｄＮＴＰの組み込みの結果を示すゲル。レーン１：開始材料。レーン２：５分間の３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰの組み込み。レーン３：５分間の３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰの組み込み。レーン４：５分間の３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＣＴＰの組み込み。レーン５：５分間の３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＧＴＰの組み込み。 ｊ）組み込み工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。 ヘルパー鎖によるバージョン２化学－切断。 ａ）ヘルパー鎖の存在下でのハイブリダイズされたポリヌクレオチド鎖の切断を示すスキーム。切断工程はオレンジ色の破線枠で強調表示されている。 ｂ）ゲルは、３７℃でのＥｎｄｏ Ｖによるオリゴヌクレオチドの切断を示す。レーン１．開始オリゴヌクレオチド。両方の全長鎖を含んだ陽性対照であったレーン２は、８０％：２０％の切断対未切断ＤＮＡ比の収率を示した。ヘルパー鎖によらない切断反応を含むレーン３は、＞９９％の切断ＤＮＡのはるかに高い収率を示した。ヘルパー鎖による切断反応を含むレーン４も、＞９９％のＤＮＡ切断収率を示した。 ｃ）エンドヌクレアーゼＶによる切断研究の要約。 ｄ）切断工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。 ヘルパー鎖によるバージョン２化学－連結。 ａ）ヘルパー鎖の不在下でのハイブリダイズされたポリヌクレオチド鎖の連結を示すスキーム。オレンジ色の破線枠で強調表示されている連結工程。 ｂ）切断工程の研究のためのオリゴヌクレオチド。 ヘルパー鎖によるバージョン２化学－脱保護。 ａ）オレンジ色の破線枠で強調表示されている脱保護工程を示すスキーム。 ｂ）図は、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰの組み込み後の５０ｍＭのＴＣＥＰによる３’－Ｏ－アジドメチル基の脱保護の結果を示すゲルを図示する。レーン１：開始プライマーレーン２：Ｍｎ２＋の存在下での３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰの組み込み。レーン３：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン２の生産物の伸長。レーン４：５０ｍＭのＴＣＥＰによるレーン２の生産物（０．５μＭ）の脱保護。レーン５：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン４の生産物の伸長。 ｃ）図は、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰの組み込み後の３００ｍＭのＴＣＥＰによる３’－Ｏ－アジドメチル基の脱保護の結果を示すゲルを図示する。レーン１：開始プライマー。レーン２：Ｍｎ２＋の存在下での３－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰの組み込み。レーン３：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン２の生産物の伸長。レーン４：３００ｍＭのＴＣＥＰによるレーン２の生産物（０．５μＭ）の脱保護。レーン５：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン４の生産物の伸長。 ｄ）図は、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＣＴＰの組み込み後の５０ｍＭのＴＣＥＰによる３’－Ｏ－アジドメチル基の脱保護の結果を示すゲルを図示する。レーン１：開始プライマー。レーン２：Ｍｎ２＋の存在下での３－Ｏ－アジドメチル－ｄＣＴＰの組み込み。レーン３：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン２の生産物の伸長。レーン４：３００ｍＭのＴＣＥＰによるレーン２の生産物（０．５μＭ）の脱保護。レーン５：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン４の生産物の伸長。 ｅ）図は、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＣＴＰの組み込み後の３００ｍＭのＴＣＥＰによる３’－Ｏ－アジドメチル基の脱保護の結果を示すゲルを図示する。レーン１：開始プライマーレーン２：Ｍｎ２＋の存在下での３－Ｏ－アジドメチル－ｄＣＴＰの組み込み。レーン３：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン１の生産物の伸長。レーン４：３００ｍＭのＴＣＥＰによるレーン１の生産物（０．５μＭ）の脱保護。レーン５：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン３の生産物の伸長。 ｆ）．図は、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰの組み込み後の３００ｍＭのＴＣＥＰによる３’－Ｏ－アジドメチル基の脱保護の結果を示すゲルを図示する。 レーン１：開始プライマー レーン２：Ｍｎ２＋の存在下での３－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰの組み込み。レーン３：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン２の生産物の伸長。レーン４：３００ｍＭのＴＣＥＰによるレーン２の生産物（０．５μＭ）の脱保護。レーン５：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン４の生産物の伸長。 ｇ）図は、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＧＴＰの組み込み後の３００ｍＭのＴＣＥＰによる３’－Ｏ－アジドメチル基の脱保護の結果を示すゲルを図示する。レーン１：開始プライマー。レーン２：Ｍｎ２＋の存在下での３－Ｏ－アジドメチル－ｄＧＴＰの組み込み。レーン３：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン２の生産物の伸長。レーン４：３００ｍＭのＴＣＥＰによるレーン２の生産物（０．５μＭ）の脱保護。レーン５：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン４の生産物の伸長。 ｈ）０．２μＭのＤＮＡに対するＴＣＥＰによる脱保護の効率。 ｉ）切断工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。 二重ヘアピンモデルによるバージョン２化学－組み込み。 ａ）破線枠で強調表示されている組み込み工程を示すスキーム。 ｂ）その天然対応物と反対の３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰの組み込みについてのＤＮＡポリメラーゼの評価。図は、３７℃でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼによる３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲルを図示する。レーン１：開始材料。レーン２：天然ｄＮＴＰ混合物の組み込み。レーン３：Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼによる３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰの組み込み。レーン４：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン３の生産物の伸長。 ｃ）その天然対応物と反対の３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰの組み込みについてのＤＮＡポリメラーゼの評価。組み込み工程の研究に適用可能なオリゴヌクレオチド。 二重ヘアピンモデルによるバージョン２化学－切断。 ａ）ヘアピンオリゴヌクレオチドの切断を示すスキーム。切断工程は破線枠で強調表示されている。 ｂ）３７℃でのＥｎｄｏ Ｖによるヘアピンオリゴヌクレオチドの切断を示すゲル。レーン１．開始ヘアピンオリゴヌクレオチド。５分後に切断されたヘアピンオリゴヌクレオチドであるレーン２は、約９８％の割合で高収率の消化ＤＮＡを示した。１０分後に切断されたヘアピンオリゴヌクレオチドであるレーン３は、約９９％の割合で高収率の消化ＤＮＡを示した。３０分後に切断されたヘアピンオリゴヌクレオチドであるレーン４は、約９９％の割合で高収率の消化ＤＮＡを示し、１時間後に切断されたヘアピンオリゴヌクレオチドであるレーン５は、約９９％の割合で高収率の消化ＤＮＡを示した。 ｃ）切断工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。 二重ヘアピンモデルによるバージョン２化学－連結。 ａ）ハイブリダイズされたヘアピンの連結を示すスキーム。破線枠で強調表示されている連結工程。 ｂ）ヘルパー鎖の存在下での室温（２４℃）での平滑／ＴＡ ＤＮＡリガーゼによるヘアピンオリゴヌクレオチドの連結を示すゲル。レーン１は開始ヘアピンオリゴヌクレオチドを含んでいた。１分後の連結されたヘアピンオリゴヌクレオチドであるレーン２は、約８５％の割合で高収率の連結ＤＮＡ生産物を示した。２分後の連結されたヘアピンオリゴヌクレオチドであるレーン３は、約８５％の割合で高収率の消化ＤＮＡを示した。３分後の連結されたヘアピンオリゴヌクレオチドであるレーン４は、約８５％の割合で高収率の連結ＤＮＡ生産物を示した。４分後の連結されたヘアピンオリゴヌクレオチドであるレーン５は、＞約８５％の割合で高収率の連結ＤＮＡ生産物を示した。 ｃ）連結工程の研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。 バージョン２化学－二重ヘアピンモデルについての完全サイクル。 ａ）酵素的組み込み、切断、連結、および脱保護工程を伴う完全サイクルを示すスキーム。 ｂ）その天然対応物と反対の３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰの組み込みについてのＤＮＡポリメラーゼの評価。図は、３７℃でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼによる３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰの組み込みの結果を示すゲルを図示する。レーン１：開始材料。レーン２：Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼによる３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰの組み込み。レーン３：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン２の生産物の伸長。レーン４：エンドヌクレアーゼＶによるレーン２の生産物の切断。レーン５：平滑ＴＡリガーゼキットによるレーン４の生産物の連結。 ｃ）組み込み工程の研究に適用可能なオリゴヌクレオチド。 バージョン２化学－ヘルパー鎖を使用した単一ヘアピンモデルについての完全サイクル。 ａ）酵素的組み込み、切断、連結、および脱保護工程を伴う完全サイクルを示すスキーム。 ｂ）組み込み工程の研究に適用可能なオリゴヌクレオチド。 バージョン３化学－二重ヘアピンモデルについての完全サイクル。 ａ）酵素的組み込み、切断、連結、および脱保護工程を伴う完全サイクルを示すスキーム。 ｂ）組み込み工程の研究に適用可能なオリゴヌクレオチド。 バージョン２化学－二重ヘアピンモデルについての完全２サイクル。 ａ）酵素的組み込み、脱保護、切断、および連結工程を伴う第１の完全サイクルを示すスキーム。 ｂ）酵素的組み込み、脱保護、切断、および連結工程を伴う第１の完全サイクルに続く第２の完全サイクルを示すスキーム。 ｃ）図は、組み込み、脱保護、切断、および連結工程を含む完全２サイクル実験を示すゲルを図示する。レーン１．開始材料。レーン２．天然ｄＮＴＰによる開始材料の伸長。レーン３．Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼによる３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰの組み込み。レーン４．全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン３の生産物の伸長。レーン５．ＴＣＥＰによるレーン３の生産物の脱保護。レーン６．全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン５の生産物の伸長。レーン７．エンドヌクレアーゼＶによるレーン５の生産物の切断。レーン８．平滑ＴＡリガーゼキットによるレーン７の生産物の連結。レーン９．ラムダエキソヌクレアーゼによるレーン８の生産物の切断。レーン１０．第２のサイクルのための開始材料－レーン９と同じ材料。レーン１１．Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼによる３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰの組み込み。レーン１２．全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン１１の生産物の伸長。レーン１３．ＴＣＥＰによるレーン１１の生産物の脱保護。レーン１４．全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン１３の生産物の伸長。レーン１５．エンドヌクレアーゼＶによるレーン１３の生産物の切断。レーン１６．平滑ＴＡリガーゼキットによるレーン１５の生産物の連結。 ｄ）研究のために使用されるオリゴヌクレオチド。 本明細書に記載される方法により合成されるような所定の配列のポリヌクレオチドの足場ヌクレオチドからの放出の機構を示す例。 本発明によるＲＮＡの合成のための例示的な方法の概略図。例示的な方法は、ヘルパー鎖の不在下での合成を示す。 本発明によるＲＮＡの合成のための例示的な方法の概略図。例示的な方法は、ヘルパー鎖の存在下での合成を示す。 本発明によるＲＮＡの合成のための例示的な方法の概略図。例示的な方法は、ヘルパー鎖の存在下での合成を示す。 組み込み工程の前にヘルパー鎖を変性する工程を伴う、単一ヘアピンモデルによる合成方法のバージョン２によるＤＮＡ合成のための例示的な方法の第１の完全サイクルの概略図。 組み込み工程の前にヘルパー鎖を変性する工程を伴う、単一ヘアピンモデルによる合成方法のバージョン２によるＤＮＡ合成のための例示的な方法の第２の完全サイクルの概略図。 組み込み工程の前にヘルパー鎖を変性する工程を伴う、単一ヘアピンモデルによる合成方法のバージョン２によるＤＮＡ合成のための例示的な方法の第３の完全サイクルの概略図。 実施例９に詳述される実験に使用されるオリゴヌクレオチド。 実施例９に詳述されるような完全３サイクル実験に対応する反応生産物を示すゲル。 図は、組み込み、脱ブロック、切断、および連結工程を含む完全３サイクル実験の結果を示すゲルを図示する。レーン１：開始材料。レーン２．天然ｄＮＴＰによる開始材料の伸長レーン３：Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｘ ＤＮＡポリメラーゼによる３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰの組み込み。レーン４：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン３の生産物の伸長。レーン５：ＴＣＥＰによるレーン３の生産物の脱ブロックレーン６：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン５の生産物の伸長。レーン７：エンドヌクレアーゼＶによるレーン５の生産物の切断。レーン８：Ｔ３ ＤＮＡリガーゼによるレーン７の生産物の連結レーン９：第２のサイクルの開始材料－レーン９と同じ材料レーン１０：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン９の生産物の伸長。レーン１１：Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｘ ＤＮＡポリメラーゼによる３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰの組み込み。レーン１２：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン１１の生産物の伸長。レーン１３：ＴＣＥＰによるレーン１１の生産物の脱ブロックレーン１４：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン１３の生産物の伸長。レーン１５：エンドヌクレアーゼＶによるレーン１３の生産物の切断レーン１６：Ｔ３ ＤＮＡリガーゼによるレーン１５の生産物の連結レーン１７：第３のサイクルのための開始材料－レーン１６と同じ材料レーン１８：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン１７の生産物の伸長。レーン１９：Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｘ ＤＮＡポリメラーゼによる３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰの組み込み。レーン２０：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン１９の生産物の伸長。レーン２１：ＴＣＥＰによるレーン１９の生産物の脱ブロックレーン２２：全ての天然ｄＮＴＰの付加によるレーン２１の生産物の伸長。レーン２３：エンドヌクレアーゼＶによるレーン２１の生産物の切断レーン２４：Ｔ３ ＤＮＡリガーゼによるレーン２３の生産物の連結 ＦＩＴＣ－ＰＥＧ－ＳＨおよびＦＩＴＣ－ＰＥＧ－ＣＯＯＨに曝露された異なる量のＢＲＡＰＡを添加したポリアクリルアミドゲル表面からの蛍光シグナル。 ＦＩＴＣ－ＰＥＧ－ＳＨおよびＦＩＴＣ－ＰＥＧ－ＣＯＯＨに曝露された異なる量のＢＲＡＰＡを添加したポリアクリルアミドゲル表面上のフルオレセインチャネルから測定された蛍光シグナル。 （ａ）異なる試料に固定化されたリンカーを有しないヘアピンＤＮＡの配列を示す。 （ｂ）異なる試料に固定化されたリンカーを有するヘアピンＤＮＡの配列を示す。 ブロモアセチル官能化ポリアクリルアミド表面に固定化されたリンカーを有するおよび有しないヘアピンＤＮＡオリゴマーからの蛍光シグナル。 ブロモアセチル官能化ポリアクリルアミド表面に固定化されたリンカーを有するおよび有しないヘアピンＤＮＡオリゴマーから測定された蛍光。 三リン酸の組み込み後のブロモアセチル官能化ポリアクリルアミド表面に固定化されたリンカーを有するおよび有しないヘアピンＤＮＡオリゴマーからの蛍光シグナル。 三リン酸の組み込み後のブロモアセチル官能化ポリアクリルアミド表面に固定化されたリンカーを有するおよび有しないヘアピンＤＮＡオリゴマーから測定された蛍光。 （ａ）実施例１２に詳述されるような各反応工程についての実験的概観および結果。 （ｂ）実施例１２に詳述される実験に使用されるオリゴヌクレオチド。 切断反応の前および後のヘアピンＤＮＡオリゴマーからの蛍光シグナルを示す（実施例１２）。 切断反応の前および後のヘアピンＤＮＡオリゴマーから測定された蛍光シグナルを示す（実施例１２）。 連結反応のためのイノシン含有鎖および相補的「ヘルパー」鎖のための配列を示す（実施例１２）。 連結反応のモニタリングに対応するヘアピンＤＮＡオリゴマーからの蛍光シグナルに関する結果（実施例１２）。 連結反応のモニタリングに対応するヘアピンＤＮＡオリゴマーから測定された蛍光に関する結果（実施例１２）。 本発明の方法、例えば、本発明の合成方法のバージョン１、２、および４（それぞれ図１、２、および４ならびに実施例１３）による組み込み工程を使用した、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｘ ＤＮＡポリメラーゼによる３’－Ｏ修飾－ｄＮＴＰの組み込みに関する結果。 図５１ａは、プライマー鎖（合成鎖のプライマー鎖部分；配列番号６８）およびテンプレート鎖（支持鎖；配列番号６９）の核酸配列を提供する。 図５１ｂは、３７℃のＭｎ２＋イオンの存在下でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｘ ＤＮＡポリメラーゼによる３’－Ｏ修飾－ｄＮＴＰの組み込みの結果を示すゲルを示す。 レーン１：開始オリゴヌクレオチド。 レーン２：３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰの組み込み（効率＞９９％） レーン３：３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰの組み込み（効率＞９９％）。 レーン４：３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＣＴＰの組み込み（効率＞９０％）。 レーン５：３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＧＴＰの組み込み（効率＞９９％）。
付加すると、新たに付加された３’－Ｏ－修飾－ｄＮＴＰはプライマー鎖部分の位置ｎを占める。したがって、プライマー鎖部分の隣のヌクレオチド位置は、例えば、それぞれ図１、２、および４に示されるように、本発明の方法バージョンの１、２、および４の工程３に従って、ｎ－１と指定される。
図の解釈。
図１１、１２ａ、１３ａ、１４ａ、１５ａ、１６ａ、１７ａ、１８ａ、１９ａ、２０ａ、２１ａ、２２ａ、２３ａ、２４ａ、２５ａ、２６ａ、２７ａ、２８ａ、２８ｂ、２９、３０、３１、３２、３３、３４、および３５に示される構造は、図６、７、８、９、および１０に示されるものと一貫して解釈されるべきである。したがって、これらの図では、二本鎖足場ポリヌクレオチド分子の各左手鎖は、支持鎖（図６～１０の鎖「ａ」に対応する）に関し、二本鎖足場ポリヌクレオチド分子の各右手鎖は、合成鎖（図６～１０の鎖「ｂ」に対応する）に関し、全ての足場ポリヌクレオチド分子は、プライマー鎖部分（図６～１０の鎖「ｂ」の実線および点線に対応する）を含む鎖に対応するより低い合成鎖を含み、ヘルパー鎖部分（図６～１０の鎖「ｂ」の破線に対応する）を含む鎖に対応する上部合成鎖を有する、新たなヌクレオチドの組み込みの前のある特定の足場ポリヌクレオチド分子（例えば、図１５ａおよび２３ａ）が示され、ヘルパー鎖部分（図６～１０の鎖「ｂ」の破線の欠如に対応する）を含まない、ある特定の足場ヌクレオチド分子（例えば、図１２ａ、１３ａ、および１４ａの）が示され、ヘルパー鎖部分（図６～１０の鎖「ｂ」の破線に対応する）を含む鎖に対応する上部合成鎖を有する、連結工程後のある特定の足場ポリヌクレオチド分子（例えば、図３３、３４、および３５の）が示され、ヘルパー鎖部分は、次の合成サイクルにおいて新たなヌクレオチドの組み込みの前に除去される。
加えて、これらの図では、関連する場合、各新たなヌクレオチドは、ｒｔＮＴＰと標識され、かつ小さな円形構造（図６～１０の小さな三角形構造に対応する）として示される、可逆的ターミネーター基と一緒に組み込まれるように示され、末端リン酸基は、「ｐ」と標識され、小さな楕円形構造として示される。
図１１ｃ、１１ｄ、１１ｇ、１１ｈ、２２ａ、２３ａ、２４ａ、２５ａ、２７ａ、２８ａ、２８ｂ、および２９は、ヘルパー鎖部分を含む鎖と支持鎖とがヘアピンループによって接続されている足場ポリヌクレオチド分子を示す。図１１ｂ、２２ａ、２３ａ、２４ａ、２５ａ、２６ａ、２７ａ、２８ａ、２８ｂ、２９、３３、３４、および３５は、ヘルパー鎖部分を含む鎖と支持鎖とがヘアピンループによって接続されている足場ポリヌクレオチド分子を示す。
図２７ａおよび２８ａなどの図は、ヘルパー鎖部分を含む鎖（右上の鎖）と支持鎖（左上の鎖）とがヘアピンループによって接続されている足場ポリヌクレオチド分子を示し、同じ分子において、プライマー鎖部分を含む鎖（右下の鎖）と支持鎖（左下の鎖）とが、ヘアピンループによって接続されている。
図５１に示されるデータは、例えば、本発明の合成方法バージョンの１、２、および４（それぞれ図１、２、および４）と一致する、本発明の方法による組み込み工程を含むものとして解釈されるべきである。
本発明は、所定のヌクレオチド配列によるポリヌクレオチド分子のデノボ合成のための方法を提供する。合成されるポリヌクレオチドは、好ましくはＤＮＡであり、好ましくは二本鎖ポリヌクレオチド分子である。本発明は、既存の合成方法と比較して利点を提供する。例えば、全ての反応工程を穏やかなｐＨの水性条件で行うことができ、広範囲の保護および脱保護手順は必要ではない。さらに、合成は、所定のヌクレオチド配列を含む既存の鋳型鎖の複製に依存しない。
本発明者らは、本明細書に定義されるようなユニバーサルヌクレオチドの使用が、各合成サイクル中に新たに組み込まれたヌクレオチドがその所望のパートナーヌクレオチドと正しく対合されることを可能にすると判定した。ユニバーサルヌクレオチドの使用は、切断および繰り返しの合成サイクルを促進する合成された領域内の切断部位の作成を可能にする。本発明は、ポリヌクレオチドを合成するための、およびそのような合成されたポリヌクレオチドを含む大きな断片をアセンブリするための多用途の方法を提供する。
本発明の合成方法のある特定の実施形態は、本発明の５つの例示的な方法のバージョン（図１～５）およびある特定の変形例を含む例示的な方法を参照することによって、本明細書により一般的に詳細に記載されるであろう。本発明の５つの例示的な方法のバージョンを含む全ての例示的な方法が、本発明を限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。本発明は、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチド分子をインビトロで合成する方法を提供し、方法は、合成サイクルを行うことを含み、各サイクルにおいて、第１のポリヌクレオチド鎖は、所定の配列のヌクレオチドの組み込みによって伸長され、次に、第１の鎖にハイブリダイズされる第２のポリヌクレオチド鎖は、ヌクレオチドの組み込みによって伸長され、それにより第１の鎖の組み込まれたヌクレオチドとヌクレオチド対を形成する。好ましくは、方法は、ＤＮＡを合成するためのものである。本明細書に記載される特定の方法は、本発明の実施形態として提供される。
反応条件
一態様では、本発明は、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成するための方法を提供する。
いくつかの実施形態では、合成は、二本鎖ポリヌクレオチド内のヌクレオチドのハイブリダイゼーションに好適な条件下で実施される。ポリヌクレオチドは、典型的には、ヌクレオチドの相補的ヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で試薬と接触される。ハイブリダイゼーションを可能にする条件は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５））。
ポリヌクレオチドへのヌクレオチドの組み込みは、例えば、好適な緩衝溶液の存在下で、好適な温度（例えば、約６５℃）で修飾ヌクレオチド（例えば、３’－Ｏ－修飾－ｄＮＴＰ）を組み込むために、ポリメラーゼ（例えば、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸポリメラーゼ）または末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素またはその機能的バリアントを使用して、好適な条件下で実施され得る。一実施形態では、緩衝溶液は、２ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｍＭのＫＣｌ、０．２ｍＭのＭｇＳＯ４、および０．０１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００を含み得る。
ポリヌクレオチドの切断は、例えば、好適な緩衝溶液の存在下で、酵素と適合する温度（例えば、３７℃）でポリヌクレオチド切断酵素（例えば、エンドヌクレアーゼ）を使用して、好適な条件下で実施され得る。一実施形態では、緩衝溶液は、５ｍＭの酢酸カリウム、２ｍＭのトリス－酢酸、１ｍＭの酢酸マグネシウム、および０．１ｍＭのＤＴＴを含み得る。
ポリヌクレオチドの連結は、例えば、好適な緩衝溶液の存在下で、酵素と適合する温度（例えば、室温）でリガーゼ（例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ）を使用して、好適な条件下で実施され得る。一実施形態では、緩衝溶液は、４．４ｍＭのトリス－ＨＣｌ、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．７ｍＭのジチオスレイトール、０．７ｍＭのＡＴＰ、５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）を含み得る。
脱保護は、例えば還元剤（例えば、ＴＣＥＰ）を使用して、好適な条件下で実施され得る。例えば、脱保護は、トリス緩衝液中のＴＣＥＰを使用して（例えば、最終濃度３００ｍＭで）行われ得る。
アンカーポリヌクレオチドおよび足場ポリヌクレオチド
所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドは、本明細書で足場ポリヌクレオチドと呼ばれる、本明細書に記載されるような表面に付着し得るか、または付着することができる、既存のポリヌクレオチドへの所定のヌクレオチドの組み込みによる本発明の方法によって合成される。本明細書により詳細に記載されるように、足場ポリヌクレオチドは、新たに合成されたポリヌクレオチドを収容するための支持構造を形成し、本明細書の記載から明らかになるように、従来の合成方法におけるように複製される既存の鋳型鎖を含まない。足場ポリヌクレオチドが表面に付着している場合、足場ポリヌクレオチドは、アンカーポリヌクレオチドと呼ばれることがある。足場ポリヌクレオチドを表面に付着させてアンカーポリヌクレオチドを形成するための表面付着化学は、本明細書により詳細に記載されている。
一実施形態では、足場ポリヌクレオチドは、相補的支持鎖にハイブリダイズされた合成鎖を含む。合成鎖は、プライマー鎖部分および任意に一本鎖切断または「ニック」（例えば、図１～５）によって分離されたヘルパー鎖部分を含む。合成鎖のプライマー鎖部分とヘルパー鎖部分との両方が、相補的支持鎖にハイブリダイズされて提供され得る。代替的に、合成鎖のヘルパー鎖部分は別々に提供され得る。合成鎖のヘルパー鎖部分が最初に提供され得、続いて支持鎖およびヘルパー鎖が提供され得る。代替的に、足場ポリヌクレオチドの成分は別々に提供され得る。例えば、支持鎖が最初に提供され得、続いて合成鎖のプライマー鎖部分、次に、ヘルパー鎖が提供され得る。支持鎖が最初に提供され得、続いて合成鎖のヘルパー鎖部分、次に、プライマー鎖が提供され得る。合成鎖のヘルパー鎖部分は、切断工程の前に提供され得る。ヘルパー鎖部分は、新たな所定のヌクレオチドの切断および組み込みの前に足場ポリヌクレオチドから削除され得る。ヘルパー鎖部分は、本明細書により詳細に記載されるように、新たな所定のヌクレオチドの切断および組み込みの前に、例えば、変性によって足場ポリヌクレオチドから除去され得る。好適な条件下で成分を混合すると、足場ポリヌクレオチドが別々の成分のハイブリダイゼーション時に形成される。
新たな合成は、一本鎖切断部位でポリメラーゼまたはトランスフェラーゼ酵素によって開始される。したがって、ポリメラーゼまたはトランスフェラーゼ酵素は、一本鎖切断部位でプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドを伸長させるように作用するであろう。合成鎖のヘルパー鎖部分と合成鎖のプライマー鎖部分との間の一本鎖切断または「ニック」は、典型的には、最初に支持鎖とのハイブリダイゼーション後に整列することになる別々の分子として合成鎖の両方の部分を提供することによって達成される。一本鎖切断部位におけるヘルパー鎖の（５’）末端ヌクレオチドは、典型的には、リン酸基を欠いて提供される。末端リン酸基の欠如は、ヘルパー鎖部分の末端ヌクレオチドが一本鎖切断部位におけるプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドと連結するのを防止し、よって一本鎖切断を維持する。一本鎖切断の作成および維持は他の手段によっても達成され得る。例えば、ヘルパー鎖部分の末端ヌクレオチドには、プライマー鎖部分との連結を防止する好適なブロッキング基が提供され得る。好ましくは、ヘルパー鎖は、一本鎖切断部位において末端リン酸基を欠いて提供される。
足場ポリヌクレオチドには、隣接する末端で接続されていない支持鎖および合成鎖のそれぞれが提供され得る。足場ポリヌクレオチドには、足場ヌクレオチドの両方の末端でヘアピンループなどを介して、隣接する末端で接続されている支持鎖および合成鎖の両方が提供され得る。足場ポリヌクレオチドには、足場ヌクレオチドの一方の末端または任意の他の好適なリンカーでヘアピンループなどを介して、隣接する末端で接続されている支持鎖および合成鎖の両方が提供され得る。
ヘアピンを有するまたは有しない足場ポリヌクレオチドは、本明細書により詳細に記載されるような固体支持体または表面に固定化され得る（図１１を参照されたい）。
「ヘアピン」または「ヘアピンループ」という用語は、現在の技術分野において一般的に使用されている。「ヘアピンループ」という用語は、「ステムループ」とも呼ばれることが多い。そのような用語は、ポリヌクレオチド分子の一方の鎖が分子内塩基対合のために同じ鎖の別の区分にハイブリダイズしたときに形成される、不対合核酸塩基のループを含むポリヌクレオチド中の二次構造の領域を指す。したがって、ヘアピンはＵ字型の構造に似ている場合がある。そのような構造の例を図１１に示す。
ヌクレオチドおよびユニバーサルヌクレオチド
本明細書に記載される方法のうちのいずれかによって合成ポリヌクレオチドに組み込まれ得るヌクレオチドは、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、および修飾ヌクレオチドであり得る。
本明細書に定義および記載される本発明の合成方法のうちのいずれにおいても、ヌクレオチドは、好ましくは、本明細書に記載されるような可逆的ターミネーター基を含むヌクレオチドとして組み込まれる。
ヌクレオチドは、天然核酸塩基または非天然核酸塩基を含み得る。ヌクレオチドは、天然核酸塩基、糖、およびリン酸基を含み得る。天然核酸塩基は、アデノシン（Ａ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）を含む。ヌクレオチドの成分のうちの１つは、さらに修飾され得る。
ヌクレオチド類似体は、塩基、糖、もしくはリン酸、またはそれらの組み合わせのいずれかにおいて構造的に修飾され、オリゴヌクレオチド鎖への組み込みのための基質としてのポリメラーゼ酵素になお許容可能なヌクレオチドである。
非天然核酸塩基は、標的ポリヌクレオチド中の核酸塩基のうちの全てにある程度結合する、例えば、水素結合するものであり得る。非天然核酸塩基は、好ましくは、ヌクレオシドアデノシン（Ａ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）を含むヌクレオチドにある程度結合する、例えば水素結合するものである。
非天然ヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびアンロックド核酸（ＵＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）またはモルホリノ、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートであり得る。
非天然ヌクレオチドは、修飾糖および／または修飾核酸塩基を含み得る。修飾糖としては、２’－Ｏ－メチルリボース糖が挙げられるが、これに限定されない。修飾核酸塩基としては、メチル化核酸塩基が挙げられるが、これに限定されない。核酸塩基のメチル化は、遺伝子およびマイクロＲＮＡなどの他の要素の発現を改変させる能力を有する認識された形態のエピジェネティック修飾である。核酸塩基のメチル化は、主にＣｐＧモチーフからなるジヌクレオチドである別々の遺伝子座で起こるが、ＣＨＨモチーフ（ＨはＡ、Ｃ、またはＴである）でも起こり得る。典型的には、メチル化中に、メチル基がシトシン塩基の第５の炭素に付加されてメチルシトシンを作成する。したがって、修飾核酸塩基としては、５－メチルシトシンが挙げられるが、これに限定されない。
所定の配列のヌクレオチドは、ヌクレオチド対を形成するために反対のパートナーヌクレオチドに組み込まれ得る。パートナーヌクレオチドは相補的ヌクレオチドであり得る。相補的ヌクレオチドは、所定の配列のヌクレオチドにある程度結合する、例えば水素結合することができるヌクレオチドである。
典型的には、所定の配列のヌクレオチドは、天然に相補的なパートナー核酸塩基と反対のポリヌクレオチドに組み込まれる。したがって、アデノシンは、チミンとは反対に組み込まれ得、逆もまた同様である。グアニンは、シトシンとは反対に組み込まれ得、逆もまた同様である。代替的に、所定の配列のヌクレオチドは、それがある程度結合する、例えば水素結合する、パートナー核酸塩基とは反対に組み込まれ得る。
代替的に、パートナーヌクレオチドは、非相補的ヌクレオチドであり得る。非相補的ヌクレオチドは、所定の配列のヌクレオチドに結合する、例えば水素結合することができないヌクレオチドである。したがって、合成されたポリヌクレオチドが全体として二本鎖であり、かつ第１の鎖がハイブリダイゼーションによって第２の鎖に付着しているという条件で、所定の配列のヌクレオチドがパートナーヌクレオチドと反対に組み込まれて、ミスマッチを形成する場合がある。
「反対の」という用語は、核酸生化学の分野におけるこの用語の通常の使用、具体的には従来のワトソン－クリック塩基対合に関するものとして理解されるべきである。したがって、配列５’－ＡＣＧＡ－３’の第１の核酸分子は、配列５’－ＴＣＧＴ－３’の第２の核酸分子と二本鎖を形成することができ、第１の分子のＧは、第２のＣと反対に位置付けられ、それと水素結合するであろう。配列５’－ＡＴＧＡ－３’の第１の核酸分子は、配列５’－ＴＣＧＴ－３’の第２の核酸分子と二本鎖を形成し得、第１の分子のＴは、第２の分子のＧとミスマッチであるが、それでもなおそれと反対に位置付けられ、パートナーヌクレオチドとして作用するであろう。この原理は、ユニバーサルヌクレオチドを含むパートナー対を含む、本明細書に開示される任意のヌクレオチドパートナー対関係に当てはまる。
本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、支持鎖における位置および合成鎖における反対の位置は、位置番号「ｎ」を割り当てられる。この位置は、任意の所与の合成サイクルにおいて、工程（３）でのサイクルまたはその後のサイクルの組み込み工程でのプライマー鎖部分の末端へのその付加時に、所与の配列の第１／隣のヌクレオチドによって占められるか、または占められることになる合成鎖中のヌクレオチド位置の反対である足場ポリヌクレオチドの支持鎖中のヌクレオチドの位置を指す。位置「ｎ」はまた、連結工程（５）またはその後のサイクルの連結工程における連結ポリヌクレオチドの支持鎖における位置を指し、この位置は、第１のサイクルの工程（５）またはその後のサイクルの連結工程での切断された足場ポリヌクレオチドへの連結ポリヌクレオチドの連結時に、所定の配列の第１／その後のヌクレオチドと反対となるヌクレオチド位置である。
支持鎖における位置および合成鎖における反対の位置の両方が、ポジトンｎと呼ばれ得る。
位置「ｎ」の定義に関するさらなる詳細は、図１～５、および本明細書でより詳細に記載される５つの例示的な合成方法のバージョン１～５に関連するその説明を参照して提供される。
ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体は、好ましくは、ヌクレオシド三リン酸として提供され得る。したがって、ＤＮＡポリヌクレオチドを合成するための本発明の方法のうちのいずれにおいても、ヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ酵素の作用を介して、または例えば、デオキシヌクレオチジル末端トランスフェラーゼ活性を有する酵素の作用を介して、２’－デオキシリボヌクレオシド－５’－Ｏ－三リン酸（ｄＮＴＰ）から組み込まれ得る。ＲＮＡポリヌクレオチドを合成するための本発明の方法のうちのいずれにおいても、ヌクレオチドは、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ酵素の作用を介して、または例えば、ヌクレオチジル末端トランスフェラーゼ活性を有する酵素の作用を介して、リボヌクレオシド－５’－Ｏ－三リン酸（ＮＴＰ）から組み込まれ得る。三リン酸は、四リン酸または五リン酸（一般的には、オリゴリン酸）で置換することができる。これらのオリゴリン酸は、他のアルキル基またはアシル基で置換することができる。
本発明の方法は、ユニバーサルヌクレオチドを使用することができる。ユニバーサルヌクレオチドを足場分子の支持鎖の構成成分として使用して、各合成サイクル中に新たに組み込まれたヌクレオチドがその所望のパートナーヌクレオチドと正しく対合されることを促進することができる。必要に応じて、ユニバーサルヌクレオチドも、所定のヌクレオチド配列の成分として合成鎖に組み込まれ得る。
ユニバーサルヌクレオチドは、核酸塩基が所定の配列の任意のヌクレオチドの核酸塩基にある程度結合する、すなわち水素結合するものである。ユニバーサルヌクレオチドは、好ましくは、ヌクレオシドアデノシン（Ａ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）を含むヌクレオチドにある程度結合する、例えば水素結合するものである。ユニバーサルヌクレオチドは、他のヌクレオチドよりもいくつかのヌクレオチドにより強く結合し得る。例えば、ヌクレオシド、２’－デオキシイノシンを含むユニバーサルヌクレオチド（Ｉ）は、Ｉ－Ｃ＞Ｉ－Ａ＞Ｉ－Ｇの優先的な対合順序がおよそ＝Ｉ－Ｔであることを示すであろう。
可能なユニバーサルヌクレオチドの例は、イノシンまたはニトロインドールである。ユニバーサルヌクレオチドは、好ましくは、以下の核酸塩基、ヒポキサンチン、４－ニトロインドール、５－ニトロインドール、６－ニトロインドール、３－ニトロピロール、ニトロイミダゾール、４－ニトロピラゾール、４－ニトロベンゾイミダゾール、５－ニトロインダゾール、４－アミノベンゾイミダゾール、またはフェニル（Ｃ６芳香族環のうちの１つを含む。ユニバーサルヌクレオチドは、より好ましくは、以下のヌクレオシド：２’－デオキシイノシン、イノシン、７－デアザ－２’－デオキシイノシン、７－デアザ－イノシン、２－アザ－デオキシイノシン、２－アザ－イノシン、４－ニトロインドール２’－デオキシリボヌクレオシド、４－ニトロインドールリボヌクレオシド、５－ニトロインドール２’デオキシリボヌクレオシド、５－ニトロインドールリボヌクレオシド、６－ニトロインドール２’デオキシリボヌクレオシド、６－ニトロインドールリボヌクレオシド、３－ニトロピロール２’デオキシリボヌクレオシド、３－ニトロピロールリボヌクレオシド、ヒポキサンチンの非環状糖類似体、ニトロイミダゾール２’デオキシリボヌクレオシド、ニトロイミダゾールリボヌクレオシド、４－ニトロピラゾール２’デオキシリボヌクレオシド、４－ニトロピラゾールリボヌクレオシド、４－ニトロベンゾイミダゾール２’デオキシリボヌクレオシド、４－ニトロベンゾイミダゾールリボヌクレオシド、５－ニトロインダゾール２’デオキシリボヌクレオシド、５－ニトロインダゾールリボヌクレオシド、４－アミノベンゾイミダゾール２’デオキシリボヌクレオシド、４－アミノベンゾイミダゾールリボヌクレオシド、フェニルＣ－リボヌクレオシド、またはフェニルＣ－２’－デオキシリボシルヌクレオシドのうちの１つを含む。
ユニバーサル塩基のいくつかの例を以下に示す。
光切断可能な塩基および酵素切断可能な塩基を含む切断可能な塩基を組み込むユニバーサルヌクレオチドも使用することができ、それらのいくつかの例を以下に示す。
光切断可能な塩基：
エンドヌクレアーゼＩＩＩにより切断可能な塩基類似体：
ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）によって切断可能な塩基類似体：

８－オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＯＧＧ１）によって切断可能な塩基類似体：
ｈＮｅｉｌ１によって切断可能な塩基類似体：
チミンＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧ）によって切断可能な塩基類似体：
ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）によって切断可能な塩基類似体：
ウラシルＤＮＡグリコシラーゼによって切断可能な塩基：
ヒト一本鎖選択的単官能性ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＳＭＵＧ１）によって切断可能な塩基
５－メチルシトシンＤＮＡグリコシラーゼ（ＲＯＳ１）によって切断可能な塩基：
（Ｓ．Ｓ．Ｄａｖｉｄ，Ｓ．Ｄ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ １９９８，９８，１２２１－１２６２およびＭ．Ｉ．Ｐｏｎｆｅｒｒａｄａ－Ｍａｒｉｎ，Ｔ．Ｒｏｌｄａｎ－Ａｒｊｏｎａ，Ｒ．Ｒ．Ａｒｉｚａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００９，３７，４２６４－４２７４を参照されたい）。
足場ポリヌクレオチドを伴う方法のうちのいずれにおいても、ユニバーサルヌクレオチドは、最も好ましくは２’－デオキシイノシンを含む。
本明細書に記載される合成方法のうちのいずれかを使用して組み込むことができるエピジェネティック塩基の例には、以下のものが含まれる。
本明細書に記載される合成方法のうちのいずれかを使用して組み込むことができる修飾塩基の例には、以下のものが含まれる。
本明細書に記載される合成方法のうちのいずれかを使用して組み込むことができるハロゲン化塩基の例には、以下のものが含まれる。

Ｒ１＝Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、アルキル、アリール、蛍光標識、アミノプロパルギル、アミノアリルである。
本明細書に記載される合成方法のうちのいずれかを使用して組み込むことができる、例えば付着／リンカー化学において有用であり得るアミノ修飾塩基の例には、以下のものが含まれる。
塩基＝アルキンまたはアルケンリンカーを有するＡ、Ｔ、Ｇ、またはＣである。
本明細書に記載される合成方法のうちのいずれかを使用して組み込むことができる、例えばクリック化学において有用であり得る修飾塩基の例には、以下のものが含まれる。
本明細書に記載される合成方法のうちのいずれかを使用して組み込むことができるビオチン修飾塩基の例には、以下のものが含まれる。

塩基＝アルキンまたはアルケンリンカーを有するＡ、Ｔ、Ｇ、またはＣである。
本明細書に記載される合成方法のうちのいずれかを使用して組み込むことができるフルオロフォアおよびクエンチャーを担持する塩基の例には、以下のものが含まれる。
ヌクレオチド組み込み酵素
ヌクレオチドの付加により、二本鎖ポリヌクレオチド分子の一本鎖ポリヌクレオチド部分を伸長することができる、かつ／または平滑末端二本鎖ポリヌクレオチド分子の一本鎖を伸長することができる酵素が利用可能である。これには、鋳型非依存性ポリメラーゼまたは鋳型非依存性トランスフェラーゼ活性など、鋳型非依存性酵素活性を有する酵素が含まれる。
したがって、本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、例えば、足場ポリヌクレオチドの合成鎖の末端への、所定の配列のヌクレオチドの付加に使用される酵素は、鋳型非依存性ポリメラーゼまたは鋳型非依存性トランスフェラーゼ活性などの鋳型非依存性酵素活性を有する。
本明細書に記載される方法を使用して、所定のヌクレオチドを付加するために任意の好適な酵素を用いることができる。したがって、ポリメラーゼまたはトランスフェラーゼ酵素の使用に関して本明細書に定義および記載される全ての方法において、ポリメラーゼまたはトランスフェラーゼ酵素は、本発明の方法の文脈においてポリメラーゼまたはトランスフェラーゼ酵素と同じ機能を果たすことができる別の酵素と置換され得る。
ポリメラーゼ酵素を、本明細書に記載される方法に用いることができる。ポリメラーゼ酵素は、本明細書に記載されるように、修飾ヌクレオチド、具体的には、付着した可逆的ターミネーター基を有するヌクレオチドを組み込むそれらの能力に基づいて選択され得る。本明細書に記載される例示的な方法において、ＤＮＡに作用する全てのポリメラーゼは、３’～５’のエキソヌクレアーゼ活性を有してはならない。ポリメラーゼは、鎖置換活性を有し得る。
したがって、好ましくは、ポリメラーゼは、未修飾ポリメラーゼと比較して、可逆的ターミネーター基を含むヌクレオチドを組み込む能力が増強された修飾ポリメラーゼである。ポリメラーゼは、より好ましくは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種９°Ｎ、好ましくは種９°Ｎ－７由来の天然ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子操作されたバリアントである。修飾されたポリメラーゼの例は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓから入手可能なＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｘ ＤＮＡポリメラーゼである。この酵素は、３’－Ｏ修飾ｄＮＴＰを組み込む能力が向上している。
本発明の方法のうちのいずれにおいても可逆的ターミネーターｄＮＴＰの組み込みに使用することができる他のポリメラーゼの例は、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（エキソ）、Ｖｅｎｔ（エキソ）、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｘ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ断片（エキソ）、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩ、およびＴａｑポリメラーゼである。
本発明の方法のうちのいずれにおいても可逆的ターミネーターＮＴＰの組み込みに使用することができる他のポリメラーゼの例は、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ｐｏｌラムダ、ｐｏｌマイクロ、またはΦ２９ＤＮＡポリメラーゼである。
ＤＮＡを含むそのようなポリヌクレオチド合成分子の伸長のために、ＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。任意の好適なＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。
ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ全長、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ大（Ｋｌｅｎｏｗ）断片、Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写酵素、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩＶ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、および逆転写酵素活性を有する酵素、例えば、Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写酵素であり得る。
ＤＮＡポリメラーゼは、３’～５’のエキソヌクレアーゼ活性を欠いている場合がある。任意のそのような好適なポリメラーゼ酵素を使用することができる。そのようなＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ全長、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼ大断片、ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ大（クレノウ）断片（３’→５’エキソ）、Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写酵素、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩＶ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼであり得る。
ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を保有し得る。任意のそのような好適なポリメラーゼ酵素を使用することができる。そのようなＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼ大断片、ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ大（Ｋｌｅｎｏｗ）断片（３’→５’エキソ）、Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写酵素、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼであり得る。
ＤＮＡポリメラーゼは、３’～５’のエキソヌクレアーゼ活性を欠いている場合があり、鎖置換活性を保有し得る。任意のそのような好適なポリメラーゼ酵素を使用することができる。そのようなＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ大（Ｋｌｅｎｏｗ）断片、Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写酵素であり得る。
ＤＮＡポリメラーゼは、５’～３’のエキソヌクレアーゼ活性を欠いている場合がある。任意のそのような好適なポリメラーゼ酵素を使用することができる。このようなＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼ大断片、ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ大（Ｋｌｅｎｏｗ）断片、ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ大（Ｋｌｅｎｏｗ）断片（３’→５’エキソ）、Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写酵素、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩＶ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼであり得る。
ＤＮＡポリメラーゼは、３’～５’および５’～３’の両方のエキソヌクレアーゼ活性を欠いている場合があり、鎖置換活性を保有し得る。任意のそのような好適なポリメラーゼ酵素を使用することができる。そのようなＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ大断片、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼ大断片、ＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ大（Ｋｌｅｎｏｗ）断片（３’→５’エキソ）、Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写酵素であり得る。
ＤＮＡポリメラーゼはまた、遺伝子操作されたバリアントであり得る。例えば、ＤＮＡポリメラーゼは、種９°Ｎ－７などのＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種９°Ｎ由来の天然ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子操作されたバリアントであり得る。そのような修飾ポリメラーゼの一例は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓから入手可能なＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼまたはＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｘ ＤＮＡポリメラーゼである。他の操作またはバリアントＤＮＡポリメラーゼには、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（エキソ）、Ｖｅｎｔ（エキソ）、９ｏＮ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ断片（エキソ）、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩ、およびＴａｑポリメラーゼが含まれる。
ＲＮＡを含むそのようなポリヌクレオチド合成分子の伸長のために、任意の好適な酵素を使用することができる。例えば、ＲＮＡポリメラーゼを使用することができる。任意の好適なＲＮＡポリメラーゼを使用することができる。
ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素であり得る。
酵素は、末端トランスフェラーゼ活性を有し得、例えば、酵素は、末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、または末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼであり得、ポリヌクレオチド合成分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡを含むポリヌクレオチド分子を形成するように伸長される。これらの酵素のうちのいずれも、ポリヌクレオチド合成分子の伸長が必要とされる本発明の方法で使用され得る。
そのような酵素の１つは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）などの末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素である（例えば、Ｍｏｔｅａ ｅｔ ａｌ，２０１０；Ｍｉｎｈａｚ Ｕｄ－Ｄｅａｎ，Ｓｙｓｔ．Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．，２００８，２（３－４），６７－７３を参照されたい）。ＴｄＴは、ヌクレオシド三リン酸基質（ＮＴＰまたはｄＮＴＰ）からのヌクレオチド分子（ヌクレオシド一リン酸）のポリヌクレオチド合成分子への付加を触媒することができる。ＴｄＴは、天然および非天然ヌクレオチドの付加を触媒することができる。また、ヌクレオチド類似体の付加を触媒することもできる（Ｍｏｔｅａ ｅｔ ａｌ，２０１０）。Φ２９ＤＮＡポリメラーゼと同様に、ＰｏｌラムダおよびＰｏｌマイクロ酵素も使用することができる（Ｒａｍａｄａｎ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００４，３３９（２），３９５－４０４）。
末端トランスフェラーゼ酵素（例えば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ；ＴｄＴ）の作用による鋳型の非存在下での一本鎖ポリヌクレオチド分子（ＤＮＡおよびＲＮＡの両方）を伸長して、人工的に合成された一本鎖ポリヌクレオチド分子を作成するための技術は、当該技術分野で広く議論されている。そのような技術は、例えば、特許出願公開ＷＯ２０１６／０３４８０７、ＷＯ２０１６／１２８７３１、ＷＯ２０１６／１３９４７７、およびＷＯ２０１７／００９６６３、ならびにＵＳ２０１４／０３６３８５２、ＵＳ２０１６／００４６９７３、ＵＳ２０１６／０１０８３８２、およびＵＳ２０１６／０１６８６１１に開示されている。これらの文書は、人工的に合成された一本鎖ポリヌクレオチド分子を作成するためのＴｄＴの作用による一本鎖ポリヌクレオチド合成分子の制御された伸長を記載している。そのような酵素を使用する天然および非天然／人工ヌクレオチドによる伸長は、修飾ヌクレオチド、例えば、ブロッキング基を組み込んだヌクレオチドによる伸長と同様に記載されている。これらの文書に開示されている末端トランスフェラーゼ酵素のうちのいずれも、その任意の酵素断片、誘導体、類似体、または機能的等価物と同様に、末端トランスフェラーゼ機能が酵素に保存されているという条件で、本発明の方法に適用することができる。
指向進化技術、従来のスクリーニング、合理的または半合理的な工学／突然変異誘発法または任意の他の適切な方法を使用して、必要な機能を提供および／または最適化するために任意のそのような酵素を変更することができる。鋳型を使用せずに、ヌクレオチドを用いて、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む分子などの一本鎖ポリヌクレオチド分子部分を伸長することができる任意の他の酵素を使用することができる。
したがって、本明細書で定義される方法のうちのいずれにおいても、ＤＮＡを含む一本鎖ポリヌクレオチド合成分子部分、またはＤＮＡを含む平滑末端二本鎖ポリヌクレオチドは、鋳型非依存性ポリメラーゼまたはトランスフェラーゼ活性などの鋳型非依存性酵素活性を有する酵素によって伸長され得る。酵素は、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素活性、例えば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）などのデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素、またはその酵素断片、誘導体、類似体、もしくは機能的等価物を有し得る。そのような酵素の作用によって伸長されたポリヌクレオチド合成分子は、ＤＮＡを含む。
本明細書で定義される方法のうちのいずれにおいても、ＲＮＡを含むポリヌクレオチド合成分子の一本鎖部分、またはＲＮＡを含む平滑末端二本鎖ポリヌクレオチドは、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素（例えば、ＴｄＴを含む）を有する酵素、またはその酵素断片、誘導体、類似体、もしくは機能的等価物によって伸長され得る。そのような酵素の作用によって伸長されたポリヌクレオチド合成分子は、ＲＮＡを含み得る。ＲＮＡを含む一本鎖ポリヌクレオチド合成分子、またはＲＮＡを含むポリヌクレオチド合成分子の一本鎖部分の合成には、任意の好適なヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を使用することができる。ポリ（Ｕ）ポリメラーゼおよびポリ（Ａ）ポリメラーゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来）などのヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素は、ポリヌクレオチド合成分子へのヌクレオシド一リン酸ユニットの鋳型非依存性付加が可能である。これらの酵素のうちのいずれも、その任意の酵素断片、誘導体、類似体、または機能的等価物と同様に、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ機能が酵素に保存されているという条件で、本発明の方法に適用することができる。指向進化技術、従来のスクリーニング、合理的または半合理的な工学／突然変異誘発法または任意の他の適切な方法を使用して、必要な機能を提供および／または最適化するために任意のそのような酵素を変更することができる。
可逆的ブロッキング基
本明細書に定義および記載される全ての方法は、可逆的ブロッキング基または可逆的ターミネーター基を指す。そのような基は、所与の合成サイクルにおいて酵素によるさらなる伸長を防止するように作用し、その結果、所定の配列のヌクレオチドのみが合成鎖を伸長させるために制御可能に使用され得、したがって非特異的ヌクレオチドの組み込みが防止される。この効果を達成する任意の機能性は、本明細書に定義および記載される方法のうちのいずれにおいても使用され得る。ヌクレオチドに付着した可逆的ブロッキング基／可逆的ターミネーター基および脱ブロッキング工程は、この効果を達成するための好ましい手段である。しかしながら、この効果は、必要に応じて代替的な手段によっても達成され得る。
所与のサイクルにおけるヌクレオチドの組み込み後の酵素によるさらなる伸長を防止し、サイクル当たり１つのヌクレオチドへの組み込みを制限するために、任意の好適な可逆的ブロッキング基がヌクレオチドに付着し得る。本発明のうちのいずれの方法においても、可逆的ブロッキング基は、好ましくは、ポリメラーゼ酵素によるさらなる伸長を防止するように作用する可逆的ターミネーター基である。可逆的ターミネーターの例を以下に提供する。
プロパルギル可逆的ターミネーター：
アリル可逆的ターミネーター：
シクロオクテン可逆的ターミネーター：
シアノエチル可逆的ターミネーター：
ニトロベンジル可逆的ターミネーター：
ジスルフィド可逆的ターミネーター：
アジドメチル可逆的ターミネーター：
アミノアルコキシ可逆的ターミネーター：
塩基に付着したかさ高い基を有するヌクレオシド三リン酸は、３’－ヒドロキシ基上の可逆的ターミネーター基の代替物として機能し得、さらなる組み込みをブロックすることができる。この基は、ＴＣＥＰまたはＤＴＴ生産天然ヌクレオチドによって脱保護することができる。
本発明の方法のうちのいずれかに従ってＤＮＡポリヌクレオチドを合成するために、好ましい修飾ヌクレオシドは、３’－Ｏ－修飾－２’－デオキシリボヌクレオシド－５’－Ｏ－三リン酸である。本発明の方法のうちのいずれかに従ってＲＮＡポリヌクレオチドを合成するために好ましい修飾ヌクレオシドは、３’－Ｏ－修飾リボヌクレオシド－５’－Ｏ－三リン酸である。
好ましい修飾ｄＮＴＰは、３’－Ｏ－アリル－ｄＮＴＰおよび３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＮＴＰである修飾ｄＮＴＰである。
３’－Ｏ－アリル－ｄＮＴＰを以下に示す。
３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＮＴＰを以下に示す。
本明細書に記載および定義される本発明の方法は、脱保護または脱ブロッキング工程を指す場合がある。そのような工程は、任意の好適な手段による可逆的ブロッキング基（例えば、可逆的ターミネーター基）の除去、または別様に、酵素／ポリメラーゼによるさらなる伸長を阻害するためにブロッキング基／ターミネーター基の機能性を逆転させることを伴う。
脱保護工程において、任意の好適な試薬を使用して可逆的ターミネーター基を除去することができる。
好ましい脱保護剤は、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である。ＴＣＥＰを使用して、組み込み後に（Ｐｄ０と共に）３’－Ｏ－アリル－ヌクレオチドおよび３’－Ｏ－アジドメチル－ヌクレオチドから可逆的ターミネーター基を除去することができる。
脱保護試薬の例を以下に提供する。
プロパルギル可逆的ターミネーター：
Ｐｄ触媒による処理－Ｎａ２ＰｄＣｌ４、ＰｄＣｌ２。
リガンド、例えば、トリフェニルホスフィン－３，３’，３’’－トリスルホン酸三ナトリウム塩を使用することができる。
アリル可逆的ターミネーター：
Ｐｄ触媒による処理－Ｎａ２ＰｄＣｌ４、ＰｄＣｌ２。
リガンド、例えば、トリフェニルホスフィン－３，３’，３’’－トリスルホン酸三ナトリウム塩を使用することができる。
アジドメチル可逆的ターミネーター：
チオール（メルカプトエタノールまたはジチオトレイトール）、またはトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン－ＴＣＥＰによる処理。
シアノエチル可逆的ターミネーター：
フッ化物－フッ化アンモニウム、フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）による処理。
ニトロベンジル可逆的ターミネーター：
ＵＶ光への曝露
ジスルフィド可逆的ターミネーター：
チオール（メルカプトエタノールまたはジチオトレイトール）、またはトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン－ＴＣＥＰによる処理。
アミノアルコキシ可逆的ターミネーター：
亜硝酸塩（ＮＯ２ －、ＨＮＯ２）による処理ｐＨ＝５．５
可逆的ブロッキング基（例えば、可逆的ターミネーター基）は、可逆的ターミネーター基の除去後のさらなる組み込みを防止するために組み込み工程からの不要な試薬が除去されるという条件で、組み込み工程の直後に、かつ切断工程の前に行われる工程によって除去することができる。可逆的ブロッキング基（例えば、可逆的ターミネーター基）は、切断工程の直後に、かつ連結工程の前に行われる工程によって除去することができる。可逆的ブロッキング基（例えば、可逆的ターミネーター基）は、連結工程の直後に行われる工程によって除去することができる。
合成ポリヌクレオチド
本明細書に記載される方法に従って合成された所定の配列を有するポリヌクレオチドは二本鎖である。合成されたポリヌクレオチドは全体として二本鎖であり、第１の鎖は、ハイブリダイゼーションによって第２の鎖に付着している。第１の鎖が全体としてハイブリダイゼーションによって第２の鎖に付着しているという条件で、非ハイブリダイゼーションのミスマッチおよび領域は許容され得る。
ハイブリダイゼーションは、中程度にストリンジェントまたはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件によって定義され得る。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件では、５倍塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、約５０％ホルムアミドのハイブリダイゼーション緩衝液、６倍ＳＳＣ、および５５℃のハイブリダイゼーション温度（または、約５０％ホルムアミドを含み、ハイブリダイゼーション温度が４２℃のような他の同様のハイブリダイゼーション溶液）を含む事前洗浄溶液、ならびに０．５倍ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで、６０℃の洗浄条件を使用する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４５℃で、６ｘＳＳＣでハイブリダイズし、続いて６８℃で、０．１ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで１回以上洗浄する。
本明細書に記載される方法に従って合成された所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドは、二本鎖ポリヌクレオチドとして保持され得る。代替的に、二本鎖ポリヌクレオチドの二本鎖を分離して、所定の配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを得ることができる。二本鎖ポリヌクレオチドの２つの鎖の分離（溶解）を可能にする条件は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５））。
本明細書に記載される方法に従って合成された所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドは、合成後に増幅され得る。二本鎖ポリヌクレオチドのいかなる領域も増幅され得る。二本鎖ポリヌクレオチドの全体またはいかなる領域も、足場ポリヌクレオチドの全体またはいかなる領域と一緒に増幅され得る。二本鎖ポリヌクレオチドの増幅を可能にする条件は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５））。したがって、本明細書に記載される合成方法のうちのいずれも、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドまたはその任意の領域が上記に記載されるように増幅される増幅工程をさらに含み得る。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼらせん反応（ＰＳＲ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、自立配列複製（３ＳＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、多重置換増幅（ＭＤＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、分岐増幅法（ＲＡＭ）などの任意の好適な方法によって行われ得る。好ましくは、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われる。
本明細書に記載される方法に従って合成された所定の配列を有する二本鎖または一本鎖ポリヌクレオチドは、任意の長さであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、少なくとも１０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも１５０個、少なくとも２００個、少なくとも２５０個、少なくとも３００個、少なくとも３５０個、少なくとも４００個、少なくとも４５０個、または少なくとも５００個のヌクレオチドまたはヌクレオチド対の長さであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、約１０～約１００個のヌクレオチドまたはヌクレオチド対、約１０～約２００個のヌクレオチドまたはヌクレオチド対、約１０～約３００個のヌクレオチドまたはヌクレオチド対、約１０～約４００個のヌクレオチドまたはヌクレオチド対、および約１０～約５００個のヌクレオチドまたはヌクレオチド対の長さであり得る。ポリヌクレオチドは、最大１０００個以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド対、最大５０００個以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド対の長さ、または約１０００００以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド対の長さであり得る。
足場ポリヌクレオチドの切断
足場ポリヌクレオチドの存在および連結前の切断工程を必要とする方法において、切断工程を行うための試薬の選択は、用いられる具体的な方法に依存するであろう。切断部位は、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドの特定の位置、および一旦切断された平滑末端足場ポリヌクレオチドの必要性または一旦切断された足場ポリヌクレオチド中の突出の必要性によって定義される。したがって、本明細書に記載される例示的な方法を参照することによって容易に明らかになるように、所望の切断部位の構成および適切な切断試薬の選択は、その方法で用いられる特定の化学に依存するであろう。
修飾塩基を認識するＤＮＡ切断酵素のいくつかの例を以下の表に示す。
連結ポリヌクレオチド
足場ポリヌクレオチドの存在および切断後の連結工程を必要とする方法において、連結ポリヌクレオチドの構成および構造の選択はまた、用いられる具体的な方法に依存するであろう。連結ポリヌクレオチドは、一般に、本明細書に記載される支持鎖および本明細書に記載されるヘルパー鎖を含む。連結ポリヌクレオチドにおいて使用される支持鎖およびヘルパー鎖は、最初の足場ポリヌクレオチド構築物において使用されるものと同じでもまたは異なっていてもよい。例えば、連結ポリヌクレオチドの連結端の支持鎖における一重塩基突出または二塩基突出の必要性は、用いられる方法に依存するであろう。適切な構造は、本明細書に記載される例示的な方法を参照することによって容易に達成することができる。
連結ポリヌクレオチドの相補性連結末端には、典型的に、突出に隣接するヘルパー鎖中に非リン酸化末端ヌクレオチドが提供される。これにより、合成鎖のヘルパー鎖部分と合成鎖のプライマー鎖部分との連結が防止され、よって合成鎖中の一本鎖切断が維持される。合成鎖における連結を防止するための代替的な手段を使用することもできる。例えば、ブロッキング部分は、ヘルパー鎖中の末端ヌクレオチドに付着し得る。さらに、本明細書にさらに記載されるように、ヘルパー鎖は、次の合成サイクルにおける隣の所定のヌクレオチドの切断および組み込みの前に、例えば、変性によって足場分子から除去され得る。
連結
連結工程を伴う本発明の方法において、連結は、任意の好適な手段を使用して達成され得る。好ましくは、連結工程は、リガーゼ酵素によって行われるであろう。リガーゼは、一塩基突出基質に対する活性が増強された修飾リガーゼであり得る。リガーゼは、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼまたはＴ４ ＤＮＡリガーゼであり得る。リガーゼは平滑ＴＡリガーゼであり得る。例えば、平滑ＴＡリガーゼは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ）から入手可能である。これは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼと、連結エンハンサーと、平滑末端および一塩基突出基質の両方の連結および形質転換を改善するために特別に調製された最適化反応緩衝液との、すぐに使用できるマスターミックス溶液である。一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドを連結（接合）するための分子、酵素、化学物質、および方法は、当業者に周知である。
固相合成
本発明の合成方法に従って生産された合成ポリヌクレオチドは、好ましくは固相または可逆的固相技術を使用して合成することができる。様々なそのような技術が当該技術分野において知られており、また、使用され得る。所定の配列の新たな二本鎖ポリヌクレオチドの合成を開始する前に、足場ポリヌクレオチドを表面、例えば、ガラスなどの平坦な表面、ゲル系材料、またはビーズもしくは官能化量子ドットなどの微粒子の表面に固定化し得る。表面を構成する材料自体が基質に結合され得る。例えば、足場ポリヌクレオチドは、例えばポリアクリルアミドなどのゲル系材料に固定化され得、ゲル系材料は、ガラスなどの支持基質に結合されている。
ポリヌクレオチドは、直接または間接的に表面に固定化または繋留され得る。例えば、それらは化学結合によって表面に直接取り付けられ得る。それらは、以下に記載されるように、例えば、ＳＰＲＩにおけるような、またはエレクトロウェッティングシステムにおけるような、微粒子もしくはビーズの表面などの中間表面を介して表面に間接的に繋留され得る。次に、新たに合成されたポリヌクレオチドを組み込んでいる足場ポリヌクレオチドが固定化されている間に、合成サイクルを開始し、完了させることができる。
そのような方法において、二本鎖足場ポリヌクレオチドは、所定の配列の第１のヌクレオチドの組み込みの前に表面に固定化され得る。したがって、そのような固定化された二本鎖足場ポリヌクレオチドは、合成中および合成後に、所定の配列の二本鎖ポリヌクレオチドを表面に繋留するためのアンカーとして作用し得る。
そのような二本鎖アンカー／足場ポリヌクレオチドの一方の鎖のみが、分子の同じ末端の表面に固定化され得る。代替的に、二本鎖アンカー／足場ポリヌクレオチドの両方の鎖が、それぞれ分子の同じ末端で表面に固定化され得る。二本鎖アンカー／足場ポリヌクレオチドには、新たな合成の開始部位と反対の末端のヘアピンループなどを介して、隣接する末端で接続された各鎖が提供され得、接続された末端は、表面上に固定化され得る（例えば、図１１に概略的に示されるように）。
足場ポリヌクレオチドを伴う方法において、本明細書に記載されるように、足場ポリヌクレオチドは、所定の配列における第１のヌクレオチドの組み込みの前に表面に付着し得る。したがって、図１１（ａ）および（ｃ）に示されるように、プライマー鎖部分を含む合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とを、両方とも別々に表面に付着させることができる。図１１（ｂ）および（ｄ）に示されるように、プライマー鎖部分を含む合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが、ヘアピンループなどを介して、隣接する末端で、例えば、新たな合成の開始部位と反対の末端で接続され得、接続された末端は表面に繋留され得る。図１１（ｅ）～（ｈ）に示されるように、プライマー鎖部分を含む合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分との一方または他方を、別々に表面に付着させることができる。好ましくは、プライマー鎖部分を含む合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが表面に付着している。
平坦な表面上での固相合成
所定の配列の新たな二本鎖ポリヌクレオチドの合成を開始する前に、合成アンカー／足場ポリヌクレオチドを、本明細書に記載されるものを含む当該技術分野で既知の方法によって合成し、表面に繋留させることができる。
予め形成されたポリヌクレオチドを、平坦な表面に付着した核酸マイクロアレイを作成するために一般的に用いられる方法によって表面に繋留させることができる。例えば、アンカー／足場ポリヌクレオチドを作成し、次に、平坦な表面上にスポットまたは印刷することができる。アンカー／足場ポリヌクレオチドは、接触印刷技術を使用して表面上に堆積させることができる。例えば、中実または中空のチップまたはピンを、予め形成された足場ポリヌクレオチドを含む溶液に浸漬し、平坦な表面と接触させることができる。代替的に、オリゴヌクレオチドをマイクロスタンプ上に吸着させ、次に、物理的接触によって平坦な表面に転写することができる。非接触印刷技術としては、サーマル印刷または圧電印刷が挙げられ、予め形成された足場ポリヌクレオチドを含むサブナノリットルサイズの微小液滴を、インクジェットおよびバブルジェット印刷に使用される方法と同様の方法を使用して印刷チップから射出することができる。
一本鎖オリゴヌクレオチドは、マイクロアレイを作成するために用いられる、いわゆる「オンチップ」方法を使用するなど、平坦な表面上で直接合成することができる。次に、そのような一本鎖オリゴヌクレオチドは、予め形成されたアンカー／足場ポリヌクレオチドを固定化するための付着部位として作用し得る。
一本鎖オリゴヌクレオチドを生成するためのオンチップ技術は、保護されたヌクレオチドを選択的に活性化して、その後の新たな保護されたヌクレオチドの組み込みを可能にするためのフォトリソグラフィマスクを通して向けられるＵＶ光の使用を伴うフォトリソグラフィを含む。ＵＶ媒介脱保護および予め判定されたヌクレオチドの結合のサイクルは、所望の配列を有するオリゴヌクレオチドのインサイチュ生成を可能にする。フォトリソグラフィマスクの使用に対する代替物として、インクジェット印刷技術を使用した核酸塩基の逐次堆積、ならびに所望の配列を有するオリゴヌクレオチドを生成するための結合、酸化、および脱保護のサイクルの使用によって、オリゴヌクレオチドを平坦な表面上に作成し得る（レビューのために、Ｋｏｓｕｒｉ ａｎｄ Ｃｈｕｒｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１４，１１，４９９－５０７を参照されたい）。
以下に記載されるような可逆的固定化を伴う方法を含む、本明細書に記載される合成方法のうちのいずれにおいても、表面は任意の好適な材料で作成され得る。典型的には、表面は、シリコン、ガラス、またはポリマー材料を含み得る。表面は、約２％のポリアクリルアミドなどのポリアクリルアミド表面、任意にＮ－（５－ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用して得られるポリアクリルアミド表面などのゲル表面を含むことができ、好ましくはポリアクリルアミド表面は、ガラスなどの固体支持体に結合されている。
可逆的固定化
所定の配列を有する合成ポリヌクレオチドは、可逆的固定化を促進する、微粒子およびビーズなどの結合表面および結合構造を使用して本発明に従って合成することができる。固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）方法または改良された方法が、当該技術分野において既知であり、用いることができる（例えば、ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３（２２）：４７４２－４７４３を参照されたい）。
表面は、常磁性ビーズなどの微粒子の形態で提供され得る。常磁性ビーズは磁場の影響下で凝集する場合がある。例えば、常磁性表面には、化学基、例えばカルボキシル基が提供され得、これは、以下により詳細に記載されるように、適切な付着条件下で、核酸に対する結合部分として作用するであろう。核酸は、そのような表面から適切な溶出条件下で溶出され得る。微粒子およびビーズの表面には、ＵＶ感受性ポリカーボネートが提供され得る。核酸は、好適な固定化緩衝液の存在下で活性化表面に結合され得る。
微粒子およびビーズを反応溶液内で自由に移動させ、次に、例えば、ビーズを表面にエッチングしたマイクロウェルまたはピット内に保持することによって可逆的に固定化することができる。ビーズは、例えば、ビーズに付着した固有の核酸「バーコード」の使用によって、または色分けの使用によって、アレイの一部として局在化され得る。
したがって、所定の配列の新たな二本鎖ポリヌクレオチドの合成を開始する前に、本発明によるアンカー／足場ポリヌクレオチドを合成し、次に、そのような結合表面に可逆的に固定化することができる。本発明の方法によって合成されたポリヌクレオチドは、そのような結合表面に可逆的に固定化される間に合成することができる。
微小流体技術およびシステム
表面は、エレクトロウェッティングオン誘電体システム（ＥＷＯＤ）であり得る。ＥＷＯＤシステムは、微小液滴の形態での非常に小さい液体容量の微小流体操作を促進する誘電体被覆表面を提供する（例えば、Ｃｈｏｕ，Ｗ－Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｓ，６：１２４９－１２７１）。液滴容量は、エレクトロウェッティング技術によってチップ上でプログラム可能に作成、移動、区分化、および組み合わせることができる。したがって、エレクトロウェッティングシステムは、合成中および合成後にポリヌクレオチドを可逆的に固定化するための代替的な手段を提供する。
所定の配列を有するポリヌクレオチドは、本明細書に記載される方法によって固相で合成することができ、ポリヌクレオチドは、ＥＷＯＤ表面上に固定化され、各サイクルにおける必要な工程はエレクトロウェッティング技術によって促進される。例えば、足場ポリヌクレオチドを伴い、組み込み、切断、連結、および脱保護工程を必要とする方法において、各工程に必要な試薬、ならびに使用済みかつ不要な試薬を除去するために必要な任意の洗浄工程に必要な試薬は、エレクトロウェッティング技術を介した電場の影響下で輸送される微小液滴の形態で提供され得る。
本発明の合成方法において使用され得る他の微小流体プラットフォームが利用可能である。例えば、核酸操作のために一般的に用いられているエマルジョンベースの微小液滴技術を使用することができる。そのようなシステムでは、微小液滴は、２つの不混和性流体、典型的には水と油との混合によって作成されるエマルジョン中に形成される。エマルジョン微小液滴は、微小流体網内でプログラム可能に作成、移動、区分化、および組み合わせることができる。ヒドロゲル系もまた利用可能である。本明細書に記載される合成方法のうちのいずれにおいても、微小液滴は、上記に記載されるＥＷＯＤシステムおよび他の微小流体システム、例えば、エラストマー材料を含む成分に基づくアーキテクチャを含む微小流体システムなどの任意の好適な適合システムで操作することができる。
微小液滴は、それらが本明細書の合成方法と適合するという条件で、任意の好適なサイズのものであり得る。微小液滴のサイズは、用いられる具体的なシステムおよびシステムの関連するアーキテクチャに応じて変化するであろう。したがって、サイズは必要に応じて適応され得る。本明細書に記載される合成方法のうちのいずれにおいても、液滴直径は、約１５０ｎｍ～約５ｍｍの範囲であり得る。１μｍ未満の液滴直径は、例えば、Ｇａｎａｎ－Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｈｙｓｉｃｓ，２００７，３，ｐｐ７３７－７４２）に記載されているような、キャピラリージェット法を伴う技術などによって、当該技術分野において既知の手段によって検証することができる。
中間または最終合成生産物の配列決定。
合成もしくはアセンブリの中間生産物、または最終的なポリヌクレオチド合成生産物は、所望のポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドが正しく合成またはアセンブリされているかどうかを決定するための品質管理チェックとして配列決定され得る。目的のポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドを、固相合成プラットフォームから除去し、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄによって販売されているＭｉｎＩＯＮ（商標）デバイスを使用したナノポアシーケンシングなど、いくつかの既知の市販の配列決定技術のうちのいずれか１つによって配列決定することができる。特定の実施例では、配列決定は、固相プラットフォーム自体で実施され得、ポリヌクレオチドを別の合成デバイスに移す必要がなくなる。配列決定は、合成に使用されるＥＷＯＤデバイスなどの同じエレクトロウェッティングデバイス上で都合よく実施することができ、それにより、合成デバイスは、１つ以上の測定電極対を含む。目的のポリヌクレオチドを含む液滴は、電極対の電極のうちの１つと接触することができ、液滴は、電極対の第２の電極と接触する第２の液滴と液滴界面二重層を形成し、液滴二重層界面は、両親媒性膜中にナノポアを含む。ポリヌクレオチドは、例えば、酵素制御下でナノポアを移動させることができ、ナノポアを通るイオン電流の流れは、ポリヌクレオチドがナノポアを通過する間の電極対間の電位差の下で測定することができる。経時的なイオン電流測定値を記録し、ポリヌクレオチド配列を決定するために使用することができる。配列決定の前に、ポリヌクレオチドは、特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５０１４０号に開示されるような配列決定のためにそれを最適化するために、１つ以上の試料調製工程に供され得る。好適に用いられ得る酵素、両親媒性膜、およびナノポアの例は、特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５２７６７およびＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３６に開示されている。ポリヌクレオチド、ナノポア、両親媒性膜などの試料調製に必要な試薬は、試料注入口を介してＥＷＯＤデバイスに供給することができる。試料注入口は、試薬チャンバーに接続され得る。
表面付着化学
オリゴヌクレオチドは典型的には化学的に付着するが、それらはまた、親和性相互作用などを介して間接的な手段によって表面に付着し得る。例えば、オリゴヌクレオチドをビオチンで官能化し、アビジンまたはストレプトアビジンで被覆された表面に結合させることができる。
ポリヌクレオチドを表面（例えば、平坦な表面）、微粒子、およびビーズなどに固定化するために、様々な表面付着方法および化学が利用可能である。付着を促進するために、表面を官能化または誘導体化することができる。そのような官能化は、当該技術分野において知られている。例えば、表面は、ポリヒスチジンタグ（ヘキサヒスチジン－タグ、６×Ｈｉｓ－タグ、Ｈｉｓ６タグ、またはＨｉｓ－タグ（登録商標））、Ｎｉ－ＮＴＡ、ストレプトアビジン、ビオチン、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡ、またはＬＮＡなど）、カルボキシル基、第４級アミン基、チオール基、アジド基、アルキン基、ＤＩＢＯ、脂質、ＦＬＡＧタグ（ＦＬＡＧオクタペプチド）、ポリヌクレオチド結合タンパク質、ペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片で官能化され得る。表面は、アンカー／足場ポリヌクレオチドに特異的に結合する分子または基で官能化され得る。
ポリヌクレオチドを表面に付着させるのに好適な化学のいくつかの例を、図１１ｉおよび図１１ｊに示す。
本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、プライマー鎖部分を含む合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とを含む足場ポリヌクレオチドは、１つ以上の共有結合を介して共通の表面に繋留され得る。１つ以上の共有結合は、共通の表面上の官能基と足場分子上の官能基との間に形成され得る。足場分子上の官能基は、例えば、アミン基、チオール基、チオリン酸基、またはチオアミド基であり得る。共通の表面上の官能基は、ブロモアセチル基であり得、任意に、ブロモアセチル基は、Ｎ－（５－ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用して得られるポリアクリルアミド表面上に提供される。
本発明の方法のうちのいずれにおいても、足場ポリヌクレオチドは、リンカーを介して直接または間接的のいずれかで表面に付着し得る。生体適合性および親水性の性質を有する任意の好適なリンカーを使用することができる。
リンカーは、直鎖状リンカーであってもまたは分岐状リンカーであってもよい。
リンカーは炭化水素鎖を含み得る。炭化水素鎖は、２～約２０００個以上の炭素原子を含み得る。炭化水素鎖は、アルキレン基、例えば、Ｃ２～約２０００個以上のアルキレン基を含み得る。炭化水素鎖は、－（ＣＨ２）ｎ－の一般式を有し得、式中、ｎは２～２０００以上である。炭化水素鎖は、１つ以上のエステル基（すなわち、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－）または１つ以上のアミド基（すなわち、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－）によって任意に中断され得る。
ＰＥＧ、ポリアクリルアミド、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ－２－メチル－２－オキサゾリン（ＰＭＯＸＡ）、双性イオンポリマー、例えばポリ（メタクリル酸カルボキシベタイン）（ＰＣＢＭＡ）、ポリ［Ｎ－（３－スルホプロピル）－Ｎ－メタクリロキシエチル－Ｎ、Ｎ－ジメチルアンモニウムベタイン］（ＰＳＢＭＡ）、グリコポリマー、およびポリペプチドを含む群から選択される任意のリンカーを使用することができる。
リンカーは、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－の一般式を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み得、式中、ｎは１～約６００以上である。
リンカーは、－［（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＰＯ２ －－Ｏ］ｍ－の一般式を有するオリゴエチレングリコール－リン酸単位を含み得、式中、ｎは１～約６００以上であり、ｍは１～２００以上であり得る。
上記に記載されるリンカーのうちのいずれも、リンカーの一末端で本明細書に記載される足場分子に付着することができ、リンカーの他方の末端で第１の官能基に付着することができ、第１の官能基は、表面に共有結合を提供し得る。第１の官能基は、本明細書にさらに記載されるように、例えば、アミン基、チオール基、チオリン酸基、またはチオアミド基であり得る。表面をさらなる官能基で官能化して、第１の官能基と共有結合を提供し得る。さらなる官能基は、本明細書にさらに記載されるように、例えば、２－ブロモアセトアミド基であり得る。任意に、ブロモアセチル基は、Ｎ－（５－ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用して得られるポリアクリルアミド表面上に提供される。表面上のさらなる官能基は、ブロモアセチル基であり得、任意に、ブロモアセチル基は、Ｎ－（５－ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用して得られるポリアクリルアミド表面上に提供され、第１の官能基は、必要に応じて、例えば、アミン基、チオール基、チオリン酸基、またはチオアミド基であり得る。ポリヌクレオチドが付着している表面は、ゲルを含み得る。表面は、約２％のポリアクリルアミドなどのポリアクリルアミド表面を含み、好ましくはポリアクリルアミド表面は、ガラスなどの固体支持体に結合されている。
本発明の方法のうちのいずれにおいても、足場ポリヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドに組み込まれた分岐ヌクレオチドを介してリンカーに任意に付着し得る。任意の好適な分岐ヌクレオチドを、任意の好適な適合するリンカーと共に使用することができる。
本発明の合成サイクルを開始する前に、足場ポリヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドに組み込まれた１つ以上の分岐ヌクレオチドを用いて合成することができる。１つ以上の分岐ヌクレオチドが足場ポリヌクレオチドに組み込まれる正確な位置、したがってリンカーが付着し得る正確な位置は変化してもよく、所望に応じて選択され得る。位置は、例えば、支持鎖および／または合成鎖の末端にあり得るか、または例えば、ヘアピンループを含む実施形態では、支持鎖を合成鎖に接続するループ領域内にあり得る。
足場ポリヌクレオチドの合成中に、１つ以上の分岐ヌクレオチドは、分岐部分の反応基をブロックするブロッキング基と共に足場ポリヌクレオチドに組み込まれ得る。次に、ブロッキング基は、リンカーの分岐部分、またはリンカーが複数の単位を含む場合はリンカーの第１の単位（分子）への結合の前に除去（脱ブロック）され得る。
足場ポリヌクレオチドの合成中に、１つ以上の分岐ヌクレオチドを、その後の「クリック化学」反応において使用するのに好適な基で足場ポリヌクレオチドに組み込んで、リンカー、またはリンカーが複数の単位を含む場合にはリンカーの第１の単位を分岐部分に結合することができる。そのような基の例はアセチレン基である。
いくつかの非限定的で例示的な分岐ヌクレオチドを以下に示す。
リンカーは、任意に、例えば、Ｓｐ９スペーサーなどの１つ以上のスペーサー分子（単位）を含み得、第１のスペーサー単位は、分岐ヌクレオチドに付着している。
リンカーは、第１のスペーサー基に付着した１つ以上のさらなるスペーサー基を含み得る。例えば、リンカーは、複数の、例えばＳｐ９スペーサー基を含み得る。第１のスペーサー基は分岐部分に付着し、次に、１つ以上のさらなるスペーサー基が、順次付加されて、それらの間にリン酸基で接続されている複数のスペーサー単位を含むスペーサー鎖を伸長させる。
分岐ヌクレオチドに付着した第１のスペーサー単位、または分岐鎖に既に付着した既存のスペーサー単位に付着するさらなるスペーサー単位を含むことができるスペーサー単位（Ｓｐ３、Ｓｐ９、およびＳｐ１３）のいくつかの非限定的な例を以下に示す。
リンカーは、１つ以上のエチレングリコール単位を含み得る。
リンカーは、複数の単位がヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを含み得る。
上記に図示される構造では、５’’という用語は、分岐部分が付着しているヌクレオチドの５’末端と示差するために使用され、５’は当該技術分野におけるその通常の意味を有する。５’’とは、そこからリンカーが伸長され得るヌクレオチド上の位置を意味することが意図される。５’’位置は異なる場合がある。５’’位置は、典型的には、ヌクレオチドの核酸塩基における位置である。核酸塩基中の５’’位置は、上記の構造に図示されるように、所望の分岐部分の性質に応じて変化し得る。
マイクロアレイ
本明細書に記載されるポリヌクレオチド合成方法のうちのいずれかを使用して、ポリヌクレオチドマイクロアレイを製造することができる（Ｔｒｅｖｉｎｏ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２００７ １３，ｐｐ５２７－５４１）。したがって、アンカーまたは足場ポリヌクレオチドは、表面上の複数の個々にアドレス可能な反応部位に繋留され得、所定の配列を有するポリヌクレオチドは、マイクロアレイ上にインサイチュで合成され得る。
合成後、各反応領域において、所定の配列のポリヌクレオチドに、固有の配列を付与することができる。アンカーまたは足場ポリヌクレオチドに、同定を促進するためのバーコード配列が提供され得る。
所定の配列のポリヌクレオチドを合成する方法以外に、本明細書に記載される技術を含む、この技術分野で一般的に使用される技術を使用して、マイクロアレイ製造を行うことができる。例えば、アンカーまたは足場ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるものを含む既知の表面付着方法および化学を使用して表面に繋留され得る。
所定の配列のポリヌクレオチドの合成後に、非繋留末端からあらゆる望ましくないポリヌクレオチド配列を除去するための最終切断工程が提供され得る。
所定の配列のポリヌクレオチドは、二本鎖形態で反応部位に提供され得る。代替的に、合成後に、二本鎖ポリヌクレオチドを分離し、一本鎖を除去して、反応部位に一本鎖ポリヌクレオチドを残してもよい。このプロセスを促進するために、鎖の選択的繋留が提供され得る。例えば、足場ポリヌクレオチドを伴う方法において、合成鎖は表面に繋留され得、支持鎖は繋留されない場合があるか、またはその逆でもよい。合成鎖に、切断不能なリンカーが提供され得、支持鎖に、切断可能なリンカーが提供され得るか、またはその逆でもよい。鎖の分離は、熱処理などの従来の方法によって行われ得る。
合成ポリヌクレオチドのアセンブリ
本明細書に記載される方法によって合成され、任意に本明細書に記載される方法によって増幅される所定の配列を有するポリヌクレオチドは、より大きな合成ポリヌクレオチドを作成するために１つ以上の他のそのようなポリヌクレオチドに接合され得る。
複数のポリヌクレオチドの接合は、当該技術分野において一般的に知られている技術によって達成することができる。本明細書に記載される方法によって合成された第１のポリヌクレオチドおよび１つ以上の追加のポリヌクレオチドを切断して適合する末端を作成し、次に、ポリヌクレオチドを連結によって一緒に接合することができる。切断は任意の好適な手段によって達成することができる。典型的には、制限酵素切断部位をポリヌクレオチド中に作成し得、次に、制限酵素を使用して切断工程を行い、それにより合成されたポリヌクレオチドを任意のアンカー／足場ポリヌクレオチドから放出し得る。切断部位は、アンカー／足場ポリヌクレオチドの一部として設計され得る。代替的に、切断部位は、所定のヌクレオチド配列の一部として、新たに合成されたポリヌクレオチド内に作成され得る。
ポリヌクレオチドのアセンブリは、好ましくは固相法を使用して行われる。例えば、合成後、第１のポリヌクレオチドは、表面固定化部位に対して遠位の好適な位置で単一の切断に供され得る。したがって、第１のポリヌクレオチドは表面に固定化されたままであり、単一の切断は別のポリヌクレオチドへの接合に対して適合する末端を生成するであろう。追加のポリヌクレオチドを２つの好適な位置で切断に供して、他のポリヌクレオチドに結合するための適合する末端を各末端に生成し得、同時に追加のポリヌクレオチドを表面固定化から放出し得る。追加のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドと適合的に接合され得、したがって、所定の配列を有し、さらに別の追加のポリヌクレオチドへの接合に適合する末端を有する、より大きな固定化ポリヌクレオチドを作成し得る。したがって、予め選択された切断合成ポリヌクレオチドの接合の反復サイクルが、はるかに長い合成ポリヌクレオチド分子を作成し得る。追加のポリヌクレオチドの接合の順序は、必要な所定の配列によって決定されるだろう。
したがって、本発明のアセンブリ方法は、１つ以上のＭｂ程度の長さを有する合成ポリヌクレオチド分子の作成を可能にし得る。
本発明のアセンブリおよび／または合成方法は、当該技術分野において知られている装置を使用して行うことができる。上記に記載されるように、非常に少量の試薬を、典型的にはエレクトロウェッティングオン誘電体（ＥＷＯＤ）などの液滴エレクトロウェッティング技術の形態で、アレイの異なる場所で他の容量と選択的に移動、区分化、および組み合わせることを可能にする技術および装置を用いることができる。液滴を操作することができる、本発明に用いられ得る好適なエレクトロウェッティング技術およびシステムは、例えば、ＵＳ８６５３８３２、ＵＳ８８２８３３６、ＵＳ２０１４／０１９７０２８、およびＵＳ２０１４／０２０２８６３に開示されている。
固相からの切断は、プライマー鎖部分とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分との一方または両方で切断可能なリンカーを提供することによって達成され得る。切断可能なリンカーは、例えば、ＵＶ切断可能なリンカーであり得る。
酵素的切断を伴う切断方法の例を図２９に示す。概略図は、（黒菱形構造を介して）表面に付着し、所定の配列のポリヌクレオチドを含む足場ポリヌクレオチドを示す。足場ポリヌクレオチドは上部ヘアピンおよび下部ヘアピンを含む。いずれの場合も、上部ヘアピンは、ユニバーサルヌクレオチドを利用して切断部位を定義する切断工程を使用して切断することができる。下部ヘアピンは、足場ポリヌクレオチドに操作されるか、または所定の配列の新たに合成されたポリヌクレオチドに操作される部位を介して制限エンドヌクレアーゼによって除去することができる。
したがって、上記に記載されるように、所定の配列を有するポリヌクレオチドは、エレクトロウェッティング表面に固定化されながら合成され得る。合成されたポリヌクレオチドは、エレクトロウェッティング表面から切断され得、液滴の形態で電場の影響下で移動され得る。液滴は、それらが他の切断合成ポリヌクレオチドとの連結のための切断された合成ポリヌクレオチドを送達することができる表面上の特定の反応部位で組み合わせることができる。次に、ポリヌクレオチドを、例えば連結によって接合することができる。そのような技術を使用して、所望の所定の配列に従って順番に異なるポリヌクレオチドの集団を合成し、付着させることができる。そのようなシステムを使用して、完全自動化ポリヌクレオチド合成およびアセンブリシステムを設計することができる。このシステムは、所望の所定の配列に従って、所望の配列を受け取り、試薬を供給し、合成サイクルを行い、続いて所望のポリヌクレオチドをアセンブリするようにプログラムすることができる。
システムおよびキット
本発明はまた、本明細書に記載および定義される合成方法のうちのいずれか、ならびに本明細書に記載および定義されるその後の増幅およびアセンブリ工程のうちのいずれかを実施するためのポリヌクレオチド合成システムも提供する。
典型的には、合成サイクル反応は、本明細書に記載および定義される手段によって表面に繋留されている足場ポリヌクレオチド分子に所定の配列のヌクレオチドを組み込むことによって実施されるであろう。表面は、本明細書に記載および定義されるような任意の好適な表面であり得る。
一実施形態では、所定の配列のヌクレオチドを足場ポリヌクレオチド分子に組み込むための反応は、反応領域内の足場ポリヌクレオチドに対して合成方法のうちのいずれかを行うことを伴う。
反応領域は、足場ポリヌクレオチド分子が付着しており、合成方法を行うための試薬を送達することができる好適な基質の任意の領域である。
一実施形態では、反応領域は、一本鎖足場ポリヌクレオチド分子を含む表面の単一の領域であり得、一本鎖足場ポリヌクレオチド分子は試薬でアドレス指定され得る。
別の実施形態では、反応領域は、複数の足場ポリヌクレオチド分子を含む表面の単一の領域であり得、足場ポリヌクレオチド分子は、互いに単離して試薬で個別にアドレス指定することはできない。したがって、そのような実施形態では、反応領域内の複数の足場ポリヌクレオチド分子は同じ試薬および条件に曝露され、したがって、同じまたは実質的に同じヌクレオチド配列を有する合成ポリヌクレオチド分子を生じさせることができる。
一実施形態では、本明細書に記載および定義される合成方法のうちのいずれかを実施するための合成システムは、複数の反応領域を含み得、各反応領域は１つ以上の付着した足場ポリヌクレオチドを含み、各反応領域は、他の反応領域のそれぞれから単離して試薬で個別にアドレス指定することができる。そのようなシステムは、例えば反応領域が基質、典型的には平坦な基質上に形成される場合には、例えばアレイの形態で構成され得る。
単一の反応領域を含むか、または複数の反応領域を含む基質を有するシステムは、例えば、ＥＷＯＤシステムもしくは微小流体システム内に含まれ得、システムは、試薬を反応部位に送達するように構成され得る。ＥＷＯＤおよび微小流体システムは、本明細書により詳細に記載されている。例えば、ＥＷＯＤシステムは、電気的制御下で試薬を反応部位（複数可）に送達するように構成され得る。例えばエラストマー材料もしくは同様の材料から形成される微細加工アーキテクチャを含むような微小流体システムは、流体圧力および／もしくは吸引制御下で、または機械的手段によって試薬を反応部位（複数可）に送達するように構成され得る。試薬は、例えば試薬送達用の導管として作用するカーボンナノチューブを介して、任意の好適な手段によって送達され得る。任意の好適なシステムが想定され得る。
ＥＷＯＤ、微小流体システムおよび他のシステムは、合成後に足場ポリヌクレオチドから合成二本鎖ポリヌクレオチドを切断するための酵素、および／または基質から足場ポリヌクレオチド全体を放出するためにリンカーを切断するための試薬、および／または合成後のポリヌクレオチド分子またはその任意の領域もしくは部分を増幅するための試薬、および／または本発明の合成方法に従って合成されたより小さなポリヌクレオチド分子からより大きなポリヌクレオチド分子をアセンブリするための試薬などの任意の他の所望の試薬を反応部位に送達するように構成され得る。
本発明はまた、本明細書に記載および定義される合成方法のうちのいずれかを実施するためのキットも提供する。キットは、本明細書に記載および定義される本発明の合成および／またはアセンブリ方法のうちのいずれかを行うための試薬の任意の所望の組み合わせを含み得る。例えば、キットは、足場ポリヌクレオチドを含む任意の１つ以上の容量（複数可）の反応試薬、本明細書に記載および定義される合成サイクルの任意の１つ以上の工程に対応する容量（複数可）の反応試薬、可逆的ブロッキング基もしくは可逆的ターミネーター基を含むヌクレオチドを含む容量（複数可）の反応試薬、合成後の１つ以上のポリヌクレオチド分子またはその任意の領域もしくは部分を増幅するための容量（複数可）の反応試薬、本発明の合成方法に従って合成されたより小さいポリヌクレオチド分子からより大きいポリヌクレオチド分子をアセンブリするための容量（複数可）の反応試薬、合成後に足場ポリヌクレオチドから合成二本鎖ポリヌクレオチドを切断するための容量（複数可）の反応試薬、および１つ以上のリンカーを切断して基質から足場ポリヌクレオチド全体を放出するための容量（複数可）の反応試薬を含み得る。
合成鎖
これらに限定されないが、図１～５およびさらに本明細書に記載されるような本発明の方法の合成方法バージョンの１～５を含む、本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを合成する方法において、足場ポリヌクレオチドには、合成鎖が提供される。合成サイクル中に、所定の配列の各新たなヌクレオチドが合成鎖に組み込まれる。ポリメラーゼ酵素または末端トランスフェラーゼ活性を有する酵素などの酵素を使用して、各新たなヌクレオチド、ヌクレオチド類似体／誘導体、または非ヌクレオチドの組み込み／付加を触媒することができる。合成鎖はプライマー鎖部分を含み、好ましくはヘルパー鎖部分を含む。
ヘルパー鎖
切断工程で切断酵素（複数可）の結合を促進するために、足場ポリヌクレオチドにヘルパー鎖が提供され得る。ヘルパー鎖は、連結工程で切断された足場ポリヌクレオチドへの連結ポリヌクレオチドの連結を容易にするために、連結ポリヌクレオチドに提供され得る。必要に応じて、切断工程での切断酵素（複数可）の結合を確実にし、連結工程での連結を確実にするために代替的な手段が提供されるという条件で、ヘルパー鎖が削除され得る。本発明の好ましい方法において、合成鎖にヘルパー鎖が提供される。好ましくは、連結ポリヌクレオチドには、ヘルパー鎖が提供され、ヘルパー鎖は、図１～５に示されるように、切断工程で足場ポリヌクレオチドに保持される。
ヘルパー鎖が切断工程における切断酵素（複数可）の結合を促進するのに好適であるという条件で、ヘルパー鎖の長さ、配列、および構造のパラメーターに関する特別な要件はない。
ヘルパー鎖は、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体／誘導体および／または非ヌクレオチドを含み得る。
好ましくは、ヘルパー鎖の配列の領域内で、支持鎖とのミスマッチは回避されるべきであり、ＧＣおよびＡＴに富む領域は回避されるべきであり、加えて、ヘアピンまたはバルジなどの二次構造の領域は回避されるべきである。
ヘルパー鎖の長さは１０塩基以上であり得る。任意に、ヘルパー鎖の長さは、１５塩基以上、好ましくは３０塩基以上であり得る。しかしながら、ヘルパー鎖が切断および／または連結を促進することができるという条件で、ヘルパー鎖の長さは変化し得る。
ヘルパー鎖は支持鎖の対応する領域にハイブリダイズされなければならない。ヘルパー鎖が切断工程における切断酵素（複数可）の結合および／または連結工程におけるリガーゼ酵素の結合を促進することができるという条件で、ヘルパー鎖の全体が支持鎖の対応する領域にハイブリダイズされることは必須ではない。したがって、ヘルパー鎖と支持鎖の対応する領域との間のミスマッチは許容され得る。ヘルパー鎖は支持鎖の対応する領域よりも長い場合がある。支持鎖は、プライマー鎖に対して遠位方向において、ヘルパー鎖に対応する領域を越えて伸長し得る。ヘルパー鎖は、例えばヘアピンを介して、支持鎖の対応する領域に接続され得る。
ヘルパー鎖は、好ましくは、ニックの部位のヘルパー鎖の末端ヌクレオチドがニックの部位のプライマー鎖の末端ヌクレオチドに対して合成鎖中の隣の連続したヌクレオチド位置を占めるように支持鎖にハイブリダイズされる。したがって、この構成では、ヘルパー鎖とプライマー鎖との間にヌクレオチド位置ずれはない。それにもかかわらず、ヘルパー鎖およびプライマー鎖は、一本鎖の切断またはニックの存在のために物理的に分離されるであろう。好ましくは、ニックの部位におけるヘルパー鎖の末端核酸塩基は、支持鎖中のそのパートナーヌクレオチドにハイブリダイズされる。
ユニバーサルヌクレオチドと対合するヘルパー鎖中のヌクレオチドは、任意の好適なヌクレオチドであり得る。好ましくは、分子のらせん構造を歪める可能性がある対合は回避されるべきである。好ましくは、シトシンはユニバーサルヌクレオチドに対するパートナーとして作用する。特に好ましい実施形態では、ユニバーサルヌクレオチドは、イノシン、またはその類似体、バリアント、もしくは誘導体であり、ヘルパー鎖中のユニバーサルヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドはシトシンである。
ヘルパー鎖の除去
合成工程中にヘルパー鎖が保持されることが好ましいが、例示的な方法のバージョン１～５を含む、本明細書に記載される本発明の合成方法のうちのいずれにおいても、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供する工程（１）（すなわち、第１のサイクルにおいて）（１０１、２０１、３０１、４０１、５０１）において、合成鎖は、ヘルパー鎖なしで提供され得る。
さらに、任意の１つ以上の合成サイクルにおいて、または全ての合成サイクルにおいて、二本鎖連結ポリヌクレオチドを切断された足場ポリヌクレオチドに連結する工程の後、および足場ヌクレオチドの切断の工程の前に（１０６、２０６、３０６、４０６、５０６）、合成鎖のヘルパー鎖部分は、足場ポリヌクレオチドから除去され得る。
合成鎖のヘルパー鎖部分は、これらに限定されないが、（ｉ）足場ポリヌクレオチドを約８０℃～約９５℃の温度に加熱し、足場ポリヌクレオチドからヘルパー鎖部分を分離すること、（ｉｉ）足場ポリヌクレオチドを８Ｍ尿素などの尿素溶液で処理し、足場ポリヌクレオチドからヘルパー鎖部分を分離すること、（ｉｉｉ）足場ポリヌクレオチドを１００％ホルムアミドなどのホルムアミドまたはホルムアミド溶液で処理し、足場ポリヌクレオチドからヘルパー鎖部分を分離すること、または（ｉｖ）足場ポリヌクレオチドを、ヘルパー鎖部分の配列と相補的であるヌクレオチド配列の領域を含む一本鎖ポリヌクレオチド分子と接触させて、それによりヘルパー鎖部分と足場ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを競合的に阻害することを含む任意の手段によって、足場ポリヌクレオチドから除去され得る。
二本鎖連結ポリヌクレオチドを切断された足場ポリヌクレオチドに連結する工程の後、および足場ポリヌクレオチドの切断の工程の前に、ヘルパー鎖部分を足場ポリヌクレオチドから除去する方法において、切断工程は、ヘルパー鎖によって提供される二本鎖領域の不在下で支持鎖を切断することを含むであろう。本明細書に開示される任意の好適な酵素から選択されるものなど、任意の好適な酵素を、そのような切断工程を行うために選択することができる。
プライマー鎖
プライマー鎖部分は、ポリメラーゼ酵素または末端トランスフェラーゼ活性を有する酵素などの酵素が合成を開始できるようにする、すなわち、ニックの部位でのプライマー鎖の末端での新たなヌクレオチドの付加を触媒するのに好適であるべきである。
プライマー鎖は、新たなポリヌクレオチド合成を開始するように作用し得る（例えば、図１～５の各々に示される構造において点線で示されるような）配列の領域を含み得る。プライマー鎖は、新たなポリヌクレオチド合成を開始するように作用し得る配列の領域からなる場合があり、したがって、プライマー鎖の全体は、本明細書に記載されるような新たなポリヌクレオチド合成を開始するように作用し得る配列であり得る。
プライマー鎖が新たなポリヌクレオチド合成を開始するのに好適であるという条件で、プライマー鎖の長さ、配列、および構造のパラメーターについて特別な要件はない。
プライマー鎖は、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体／誘導体および／または非ヌクレオチドを含み得る。
当業者は、新たなポリヌクレオチド合成を開始することができるプライマー鎖を容易に構築することができる。したがって、新たなポリヌクレオチド合成を開始するように作用し得るプライマー鎖の配列領域内では、支持鎖とのミスマッチは回避されるべきであり、ＧＣおよびＡＴに富む領域は回避されるべきであり、加えて、ヘアピンまたはバルジなどの二次構造の領域は回避されるべきである。
新たなポリヌクレオチド合成を開始するように作用し得るプライマー鎖の配列領域の長さは、好みおよび使用されるポリメラーゼ酵素に応じて当業者が選択することができる。この領域の長さは、７塩基以上、８塩基以上、９塩基以上、または１０塩基以上であり得る。任意に、この領域の長さは、１５塩基以上、好ましくは３０塩基以上であろう。
プライマー鎖は支持鎖の対応する領域にハイブリダイズされなければならない。プライマー鎖が新たなポリヌクレオチド合成を開始することができるという条件で、プライマー鎖の全体が支持鎖の対応する領域にハイブリダイズされることは必須ではない。したがって、ヘルパー鎖と支持鎖の対応する領域との間のミスマッチは、ある程度許容され得る。好ましくは、新たなポリヌクレオチド合成を開始するように作用し得るプライマー鎖の配列領域は、支持鎖中の対応する核酸塩基に相補的な核酸塩基を含むべきである。
プライマー鎖は支持鎖の対応する領域よりも長い場合がある。支持鎖は、ヘルパー鎖に対して遠位方向において、プライマー鎖に対応する領域を越えて伸長し得る。ヘルパー鎖は、例えばヘアピンを介して、支持鎖の対応する領域に接続され得る。
支持鎖
これらに限定されないが、本発明の合成方法のバージョン１～５を含む本発明の方法では、上に記載されるように、足場ポリヌクレオチドに支持鎖が提供される。支持鎖は合成鎖にハイブリダイズされる。上記に記載されるように、支持鎖がプライマー鎖部分と適合し、含まれる場合、合成鎖のヘルパー鎖部分と適合するという条件で、支持鎖の長さ、配列、および構造のパラメーターについて特別な要件はない。
ＲＮＡ合成
ＤＮＡ合成について記載される方法はＲＮＡの合成に適応され得る。１つの適応において、本発明の合成方法のバージョン１～５について記載された合成工程が適応され得る。したがって、合成方法のバージョン１～５の各々において、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、上に記載されるように、ＤＮＡ鎖である。足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分はＲＮＡ鎖である。ヘルパー鎖は、存在する場合、好ましくはＲＮＡ鎖である。ヘルパー鎖は、存在する場合、ＤＮＡ鎖であり得る。
ヌクレオチドは、上記に記載されるように、可逆的ターミネーター基を含むように修飾され得るリボヌクレオシド－５’－Ｏ－三リン酸（ＮＴＰ）から組み込まれ得る。好ましくは３’－Ｏ－修飾リボヌクレオシド－５’－Ｏ－三リン酸が使用される。修飾ヌクレオチドはＲＮＡポリメラーゼの作用によって組み込まれる。
したがって、本発明の合成方法のバージョン１～５に関する説明は、ＲＮＡ合成に必要な変更を加えて適用することができるが、説明されるように適応され得る。
図３１および３２は、それぞれ図６および７に示されるような実施例のＤＮＡ合成法のバージョン１、２の適応であるＲＮＡ合成のための反応スキームを説明する。図１～５にそれぞれ示されるように、本発明の方法のバージョン１～５は、同じ方法で適応され得る。
ＲＮＡ合成のために適応される方法のうちのいずれにおいても、支持鎖、プライマー鎖、ヘルパー鎖、連結ポリヌクレオチド、およびユニバーサルヌクレオチドの上記の記載は、必要な変更を加えて適用することができるが、記載されるように適応され得る。ユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖はＤＮＡ鎖であるため、以前に記載されるような切断工程および切断位置は、必要な変更を加えて適用することができる。好ましい実施形態では、ＳｐｌｉｎｔＲ ＤＮＡリガーゼが連結工程において使用される。
例示的な方法
本発明によるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド分子を合成する例示的な方法は、添付の特許請求の範囲を含む本明細書に記載されている。
本発明に従ってポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド分子を合成する以下の５つの例示的な方法において、合成方法のバージョン１、２、３、４、および５への言及は、それぞれ図１、２、３、４、および５に示される反応の概略図に従って解釈されるべきであり、図６～１０のうちのいずれかに示される反応の概略図、または実施例の部分における同じ説明には従わない。図６～１０のうちのいずれかに示される反応の概略図および以下の実施例部分における同じ説明は、本発明の方法と比較して修正された反応スキームに基づく本発明の方法の例示的な支持を提供する。以下の文中の参照符号は、図１～５のものと対応している。
以下に記載される各例示的な方法において、各工程に記載される構造は、必要に応じて参照符号の助けを借りて特定の図を参照することによって参照され得る。しかしながら、そのような参照は、図に示される構造に限定されることを意図しておらず、関連する構造の記載は、これらに限定されないが、例示されているものも含めて、その全体が本明細書に提供されるようなその記載に対応している。
５つの非限定的で例示的な方法、方法のバージョン１～５を以下に記載する（例えば、それぞれ図１～５を参照されたい）。これらの例示的な方法の各々の工程（１）において、相補的支持鎖（図１～５の各々の工程１に示される構造において「ａ」と標識された鎖を参照されたい）にハイブリダイズされた合成鎖（図１～５の各々の工程１に示される構造において「ｂ」と標識された鎖を参照されたい）を含む足場ポリヌクレオチド（図１～５の各々の工程１に示される構造を参照されたい）が提供される（１０１、２０１、３０１、４０１、５０１）。
足場ポリヌクレオチドは二本鎖であり、デノボ合成されるので合成ポリヌクレオチドの領域を収容するための支持構造を提供する。足場ポリヌクレオチドは、一本鎖切断または「ニック」によって分離された、プライマー鎖部分鎖（図１～５の各々の工程１に示される構造において「ｂ」と標識された鎖の点線部分を参照されたい）およびヘルパー鎖部分（図１～５の各々の工程１に示される構造において「ｂ」と標識された鎖の破線部分を参照されたい）を含む合成鎖を含む。本明細書により詳細に記載されるように、本明細書に記載される特定の例示的な方法のバージョン１～５およびその変形例において、ヘルパー鎖は、切断工程（２）の前に、例えば、変性によって除去され得る。
プライマー鎖部分および合成鎖のヘルパー鎖部分の両方が、相補的支持鎖にハイブリダイズされて提供される。
５つの方法の各々において、ユニバーサルヌクレオチド（図１～５の各々に示される構造において「Ｕｎ」と標識される）が支持鎖中に提供され、これは足場ポリヌクレオチドの切断を促進する（１０２、２０２、３０２、４０２、５０２）。ユニバーサルヌクレオチドの役割は、以下の各方法の詳細な説明から明らかになるであろう。
足場ポリヌクレオチドの切断（工程２）は、切断の直前に存在する場合、ヘルパー鎖の喪失、およびユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖の喪失をもたらす。切断は、切断部位に、切断前のニック部位を含んだ合成鎖の支持鎖の切断された末端およびプライマー鎖部分の末端を含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを所定の位置に残す。
合成鎖のプライマー鎖部分の末端は、トランスフェラーゼ活性を有する酵素による合成の開始に使用するためのプライマー部位を提供する。したがって、酵素は、プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドを伸長するように作用するであろう。したがって、この末端ヌクレオチドは、典型的には、例えば、５’～３’方向の伸長を触媒するポリメラーゼまたはトランスフェラーゼ酵素による伸長を可能にするために、プライマー鎖部分の３’末端を定義するであろう。プライマー鎖部分を含む合成鎖と反対の末端は、結果的に典型的には、合成鎖の５’末端を定義し、合成鎖の５’末端に隣接する支持鎖の末端ヌクレオチドは、結果的に典型的には、支持鎖の３’末端を定義するであろう。
一本鎖切断の部位に位置付けられた合成鎖のヘルパー鎖部分の末端ヌクレオチドは、典型的には、ヘルパー鎖部分の５’末端を定義し、結果的に、合成鎖のヘルパー鎖部分と反対の末端が、典型的には合成鎖の３’末端を定義するであろう。
合成鎖のヘルパー鎖部分とプライマー鎖部分との間の一本鎖切断または「ニック」は、典型的には、連結工程でプライマー鎖への連結からそれを防止するような形態で、ヘルパー鎖の（５’）末端ヌクレオチドを提供することによって達成される。これは、典型的には、リン酸基を含まないヘルパー鎖の（５’）末端ヌクレオチドを提供することによって達成され得る。切断は、典型的には、（ｉ）支持鎖、（ｉｉ）典型的には非リン酸化を（５’）末端ヌクレオチドを有する合成鎖のヘルパー鎖部分、および（ｉｉｉ）プライマー鎖部分を含む合成鎖部分を含む別々の構成成分から足場ヌクレオチドをアセンブリすることによって達成される。好適な条件下で成分を混合すると、足場ポリヌクレオチドが別々の成分のハイブリダイゼーション時に形成される。
本明細書に記載されるある特定の方法において、ヘルパー鎖は、例えば、それが以前にハイブリダイズされた支持鎖からの変性および放出によって、切断の工程の前に足場ポリヌクレオチドから任意に除去され得る。
切断により、切断の直前に存在する場合、ユニバーサルヌクレオチドと支持鎖にハイブリダイズされたヘルパー鎖とを含む支持鎖の除去がもたらされる。
方法の工程（３）において、所定のヌクレオチド配列中の第１のヌクレオチドは、ポリメラーゼまたは末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素などのトランスフェラーゼ活性を有する酵素の作用によって合成鎖に組み込まれる（１０２、２０２、３０２、４０２、５０２）。第１のヌクレオチドには、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基（図１～５の各々の工程３において組み込まれたヌクレオチドの小さな三角形として示される）が提供される。したがって、工程（３）において、一塩基のみが組み込まれる。
任意の好適な可逆的ターミネーター基を含むヌクレオチドを使用することができる。可逆的ターミネーター基を有する好ましいヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、３’－Ｏ－アリル－ｄＮＴＰおよび／または３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＮＴＰである。
方法の工程（４）において、脱保護工程が行われ、所定のヌクレオチド配列の組み込まれた第１のヌクレオチドから可逆的ターミネーター基が除去される（１０４、２０４、３０４、４０４、５０４）。あるいは、脱保護ステップは、以下に記載される連結工程（５）の後に行われ得る。
方法の工程（５）において、連結工程が行われ（１０５、２０５、３０５、４０５、５０５）、連結ポリヌクレオチドは、所定のヌクレオチド配列の第１のヌクレオチドを含む切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドに連結される。連結ポリヌクレオチドは、支持鎖と支持鎖にハイブリダイズされたヘルパー鎖とを含む。連結ポリヌクレオチドは、第１のヌクレオチドを含む切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドの切断された末端と相補的である相補的連結末端を含む。連結ポリヌクレオチドの支持鎖は、相補的連結末端において所定のヌクレオチド配列の第１のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドを含み、連結時に、パートナーヌクレオチドは、所定のヌクレオチド配列の第１のヌクレオチドの反対に位置付けられ、ヌクレオチド対を形成する。連結ポリヌクレオチドの支持鎖はまた、次の合成サイクルにおける切断を容易にするであろう相補的連結末端にユニバーサルヌクレオチドを含む。相補的連結末端の連結ポリヌクレオチドのヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、ヘルパー鎖がプライマー鎖に連結され得ないように提供される。これは、典型的には、リン酸基を含まないヘルパー鎖の末端ヌクレオチドを提供することによって達成される。したがって、連結ポリヌクレオチドの支持鎖および切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドの支持鎖の連結時に、一本鎖切断または「ニック」が、プライマー鎖部分とヘルパー鎖との間の合成鎖に提供される。
連結ポリヌクレオチドを切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドに連結すると、次の合成サイクルにおいて切断を促進するのに使用するために、新たに組み込まれたヌクレオチド対およびユニバーサルヌクレオチドを含む無傷の二本鎖足場ポリヌクレオチドが再形成される。
合成ポリヌクレオチドを生成するために、上に記載されるのと同じ工程を含む合成の反復サイクルが行われる。
特定の方法を、以下でより詳細に説明する。
合成方法のバージョン１
本発明の合成方法の第１の例示的なバージョンでは、支持鎖中に位置付けられたユニバーサルヌクレオチドを含む、二本鎖足場ポリヌクレオチドが提供される（図１の工程１；１０１）。各合成サイクルにおいて、足場ポリヌクレオチドは、ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される切断部位で切断される（図１の工程２；１０２、１０７）。
足場ポリヌクレオチドの切断（工程２）は、切断の直前に存在する場合、ヘルパー鎖の喪失、およびユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖の喪失をもたらす。切断は、切断部位に、切断前のニック部位を含んだ合成鎖の支持鎖の切断された末端およびプライマー鎖部分の末端を含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを所定の位置に残す。切断は、突出のない、切断部位での平滑末端で切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドをもたらす。
方法の工程（３）において、所定のヌクレオチド配列中の第１のヌクレオチドは、ポリメラーゼまたは末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素などのトランスフェラーゼ活性を有する酵素の作用によって合成鎖のプライマー鎖部分の末端に付加される（１０３）。第１のヌクレオチドには、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基が提供される。したがって、工程（３）において、一塩基のみが組み込まれる。
方法の工程（４）において、脱保護工程が行われ、新たに組み込まれたヌクレオチドからターミネーター基が除去される。原則として、脱保護工程は、連結工程（５）の後に行われ得る。工程（４）としての脱保護工程の実施が好ましい。
方法の工程（５）において、連結ポリヌクレオチド（図１の上部の左上に示される構造を参照されたい）は、切断された足場ポリヌクレオチドに連結される。連結は、パートナーヌクレオチドを足場ポリヌクレオチドへ組み込み、新たに組み込まれたヌクレオチドがパートナーヌクレオチドと対合することを可能にし（図１の工程５；１０５）、これにより合成サイクルを完了させる。
本発明の合成方法の第１の例示的なバージョンでは、足場ポリヌクレオチドは、上に記載されるように工程（１）で提供される（１０１）。この方法では、足場ポリヌクレオチドの支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、一本鎖切断部位でヘルパー鎖の末端ヌクレオチド（図１の構造中に「Ｘ」と標識される）と反対に位置付けられ、それと対合される（図１の工程１に図示される構造を参照されたい）。
方法の工程（２）において、足場ポリヌクレオチドは、切断部位で切断される（１０２）。切断部位は、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される。切断は足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断（工程２）は、切断の直前に存在する場合、ヘルパー鎖の喪失、およびユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖の喪失をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断は、切断部位に、切断前のニック部位を含んだ合成鎖の支持鎖の切断された末端およびプライマー鎖部分の末端を含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを所定の位置に残す。
この例示的な方法では、合成鎖にすでに一本鎖切断または「ニック」が提供されており、したがって足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断を提供するためには支持鎖の切断のみが必要である。
この例示的な方法のバージョンでは、切断により、合成鎖または支持鎖のいずれにも突出のない、平滑末端で切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドが生成される。
この方法では、ユニバーサルヌクレオチドは、切断工程の前に支持鎖における位置「ｎ」を占める。ユニバーサルヌクレオチドが支持鎖における位置「ｎ」を占めるときにそのような平滑末端で切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを得るために、支持鎖は、ユニバーサルヌクレオチドに対して特定の位置で切断される。足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎとｎ－１との間で切断される。
「ｎ」とは、その合成サイクルにおける切断された合成鎖の末端へのその付加時に、所定の配列のヌクレオチドによって占められるであろう合成鎖における位置と反対である支持鎖におけるヌクレオチド位置を意味する。「ｎ」とはまた、その合成サイクルにおける合成鎖のプライマー鎖部分の末端へのその付加時に、所定の配列のヌクレオチドによって占められるであろう合成鎖におけるヌクレオチド位置を意味する。したがって、切断工程では、支持鎖の位置ｎのユニバーサルヌクレオチドは、その合成サイクルに組み込まれた所定の配列のヌクレオチドによって占められるであろう位置の反対にある。工程（１）および（２）で、その合成サイクルに組み込まれた所定の配列のヌクレオチドによって占められるであろう位置は、合成鎖のヘルパー鎖部分の末端ヌクレオチドに対応する（図１で「Ｘ」として示される）。
「ｎ－１」とは、ヘルパー鎖に対する遠位方向／プライマー鎖に対する近位方向において、ユニバーサルヌクレオチドによって占められるか、または占められている位置に対する支持鎖における隣のヌクレオチド位置を意味する（図１の工程（１）および（２）に概略的に示されるように、位置ｎ－１で「Ｈ」と標識されたヌクレオチド）。ｎ－１はまた、合成鎖における対応する位置を指し得る。したがって、切断工程では、支持鎖における位置ｎ－１は、合成鎖のプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドによって占められる位置と反対である（すなわち、図１の工程（２）に概略的に示されるように、位置ｎ－１で「Ｉ」と標識されたヌクレオチド）。バージョン１による方法では、位置ＨおよびＩを占めるヌクレオチド対は、任意のヌクレオチド対であり得る。
ヌクレオチド位置ｎとｎ－１の間の支持鎖の切断時に、ユニバーサルヌクレオチド、切断の直前に存在する場合、ヘルパー鎖、およびヘルパー鎖とハイブリダイズされるまたはハイブリダイズされた支持鎖の部分は、残りの切断された足場ポリヌクレオチドから除去される（図１の上部の右上に示される構造を参照されたい）。
リン酸基は、切断部位で切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドに付着し続けるべきである（図１の下部の中央に示される構造に示されるように）。これにより、連結工程において、連結ポリヌクレオチドの支持鎖を切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖に確実に連結することができる。
したがって、方法のバージョン１では、ユニバーサルヌクレオチドは、工程（１）および（２）で支持鎖における位置ｎを占め、支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎとｎ－１との間で切断される。
好ましくは、支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎとｎ－１との間のホスホジエステル結合（ヘルパー鎖に対する遠位方向／プライマー鎖に対する近位方向において、ユニバーサルヌクレオチドの位置に対する支持鎖の第１のホスホジエステル結合）の切断によって切断される。
支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎとｎ－１との間のホスホジエステル結合の一方のエステル結合の切断によって切断され得る。
好ましくは、支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎに対する第１のエステル結合の切断によって切断される。これは、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖上の切断位置で末端リン酸基を保持する効果を有するであろう。
ユニバーサルヌクレオチドが位置ｎを占める場合、任意の好適な機構を用いて、ヌクレオチド位置ｎとｎ－１の間の支持鎖の切断をもたらし得る。
上記に記載されるようなヌクレオチド位置ｎとｎ－１との間の支持鎖の切断は、酵素の作用によって行われ得る。
上に記載されるようなヌクレオチド位置ｎとｎ－１との間の支持鎖の切断は、２工程プロセスとして行われ得る。
２工程切断プロセスの第１の切断工程は、支持鎖からユニバーサルヌクレオチドを除去し、それによって位置ｎに脱塩基部位を形成することを含み得、第２の切断工程は、位置ｎとｎ－１との間の脱塩基部位で支持鎖を切断することを含み得る。
支持鎖における位置ｎを占めるユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される切断部位で支持鎖を切断する１つの機構は、実施例２に記載されている。実施例２に記載される切断機構は例示的なものであり、上に記載される平滑末端で切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドが達成されるという条件で、他の機構を用いることができる。
２工程切断プロセスの第１の切断工程では、糖－リン酸足場を無傷のままにしながら、ユニバーサルヌクレオチドが支持鎖から除去される。これは、二本鎖ポリヌクレオチドから一本鎖ユニバーサルヌクレオチドを特異的に除去ことができる酵素の作用によって達成することができる。例示された切断方法では、ユニバーサルヌクレオチドは、イノシンであり、イノシンは、酵素の作用によって支持鎖から除去され、よって脱塩基部位を形成する。例示された切断方法では、酵素は、３－メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ酵素、具体的にはヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）である。無塩基部位が形成されるという条件で、他の酵素、分子、または化学物質を使用することができる。ヌクレオチド除去酵素は、ＵＤＧ ＤＮＡグリコシラーゼであり得る。
２工程切断プロセスの第２の切断工程では、支持鎖は、一本鎖切断を作成することによって脱塩基部位で切断される。例示された方法では、支持鎖は、ＮａＯＨなどの塩基である化学物質の作用によって切断される。代替的に、Ｎ，Ｎ’－ジメチルエチレンジアミンなどの有機化学物質を使用してもよい。あるいは、ＡＰエンドヌクレアーゼ１、エンドヌクレアーゼＩＩＩ（Ｎｔｈ）、またはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩなどの脱塩基部位リアーゼ活性を有する酵素を使用してもよい。記載されるような脱塩基部位で支持鎖が切断されるという条件で、他の酵素、分子、または化学物質を使用することができる。
したがって、ユニバーサルヌクレオチドが工程（１）および（２）で支持鎖の位置ｎにあり、支持鎖が位置ｎとｎ－１との間で切断される実施形態では、第１の切断工程は、ヌクレオチド除去酵素を用いて行われ得る。そのような酵素の例は、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）などの３－メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ酵素である。第２の切断工程は、ＮａＯＨなどの塩基である化学物質を用いて行われ得る。第２の工程は、Ｎ，Ｎ’－ジメチルエチレンジアミンなどの脱塩基部位切断活性を有する有機化学物質を用いて行われ得る。第２の工程は、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩなどの脱塩基部位リアーゼ活性を有する酵素を用いて行われ得る。
上に記載されるようなヌクレオチド位置ｎとｎ－１との間の支持鎖の切断はまた、１工程切断プロセスとして行われ得る。そのようなプロセスで使用され得る酵素の例には、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）、および８－オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＯＧＧ１）が含まれる。
本発明のこの例示的な方法のバージョンでは、全てのバージョンと同様に、隣のヌクレオチドを次の合成サイクルに組み込むことを可能にするために、可逆的ターミネーター基を第１のヌクレオチドから除去しなければならない（脱保護工程；１０４）。これは、第１のサイクルの様々な段階で行われ得る。典型的には、かつ好ましくは、それは、図１の工程４に示されるように、連結工程（５）の前に、方法の工程（４）として行われるであろう（１０４）。しかしながら、脱保護工程は、連結工程（５）の後など、新たなヌクレオチドの組み込み後の任意の工程で行われ得る。どの段階で脱保護工程が行われるかにかかわらず、第１のヌクレオチドの多重組み込みを防止するために、酵素および残りの組み込まれていない第１のヌクレオチドが最初に除去されるべきである。酵素および組み込まれていない第１のヌクレオチドは、好ましくは、連結工程（工程（５））の前に除去される。
第１のヌクレオチドからの可逆的ターミネーター基の除去は、任意の好適な手段によって行われ得る。例えば、除去は、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの化学物質の使用によって行われ得る。
方法の工程（５）において、二本鎖連結ポリヌクレオチドは、切断された足場ポリヌクレオチドに連結される（１０５）。連結ポリヌクレオチドは、支持鎖およびヘルパー鎖を含む。連結ポリヌクレオチドは、ユニバーサルヌクレオチドと、所定の配列の第１のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであるヘルパー鎖の末端ヌクレオチドを突出する単一の突出ヌクレオチドとを支持鎖中に含む相補的連結末端をさらに含む。連結ポリヌクレオチドは、突出に隣接するヘルパー鎖中に別のポリヌクレオチド鎖に連結することができないように構成された末端ヌクレオチドをさらに含む（図１の上部の左上に示される構造において「Ｘ」と標識された位置）。典型的には、この末端ヌクレオチドは、リン酸基を欠いているであろう。典型的には、上に記載されるように、ヘルパー鎖のこの非リン酸化末端ヌクレオチドは、ヘルパー鎖の５’末端を定義するであろう。
相補的連結末端は、好適な連結条件に供されたときに、それが組み込み工程（３）後に切断された足場ポリヌクレオチド生産物の突出末端と適合的に接合するように構成される。支持鎖の連結時に、第１のヌクレオチドはそのパートナーヌクレオチドと対合される。
支持鎖の連結は、任意の好適な手段によって行われ得る。連結は、合成鎖中、すなわちプライマー鎖部分中の第１のヌクレオチドと、第１のヌクレオチドに隣接するヘルパー鎖の末端ヌクレオチドとの間の一本鎖切断を維持しながら、支持鎖のみの接合をもたらすであろう。
連結は、典型的には、リガーゼ活性を有する酵素によって行われ得る。例えば、連結は、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼまたはＴ４ ＤＮＡリガーゼまたはその機能的バリアントもしくは等価物を用いて行われ得る。ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、例えば、末端リン酸基がないために、リガーゼに対する基質として作用することができないように提供されるため、そのような酵素の使用は、合成鎖における一本鎖切断の維持をもたらすであろう。
切断された足場ポリヌクレオチドへの連結ポリヌクレオチドの連結は、第１の合成サイクルを完了し、そのときに、所定のヌクレオチド配列の第１のヌクレオチドがそのパートナーヌクレオチドと反対の足場ポリヌクレオチドに組み込まれることを除いて、工程（１）の足場ポリヌクレオチドが効果的に再構築される。
この例示的な方法（１０５）の工程（５）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端では、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと反対に位置付けられ、それと対合される。連結ポリヌクレオチドの文脈において、ユニバーサルヌクレオチドは、位置ｎ＋１、および支持鎖の末端ヌクレオチドの隣の位置（位置ｎ）に位置付けられることに留意されたい。連結ポリヌクレオチドの文脈における位置ｎは、工程（１）および（２）での足場ポリヌクレオチドの文脈において上に記載されるのと同じ意味を有する。したがって、工程（５）において、「ｎ」とは、連結後、その合成サイクルにおける合成鎖のプライマー鎖部分の末端へのその付加後に、所定の配列のヌクレオチドによってここで占められる合成鎖における位置と反対である支持鎖におけるヌクレオチド位置を意味する。「ｎ」とはまた、連結後、その合成サイクルにおける合成鎖のプライマー鎖部分の末端へのその付加後に、所定の配列のヌクレオチドによってここで占められる合成鎖におけるヌクレオチド位置を意味する。
工程（１）および（２）（図１の１０１および１０２）の間、ユニバーサルヌクレオチドが足場ポリヌクレオチドの位置ｎを占めるのに対し、ユニバーサルヌクレオチドは、同じ合成サイクル（図１の１０５）において連結ポリヌクレオチドの位置ｎ＋１を占めることに留意されたい。これは、工程（５）で、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドに、その合成サイクルでのその付加に続いて、所定の配列のヌクレオチドがここで提供され、連結ポリヌクレオチドに、所定の配列のヌクレオチドとパートナーを組むヌクレオチドが提供されるためであり、さらに、本明細書で定義されるように、「ｎ」は常に、そのサイクルに組み込まれる所定の配列のヌクレオチドによって占められる（または占められることになる）合成鎖のヌクレオチド位置を指すか、または支持鎖におけるその反対のヌクレオチド位置を指すためである。したがって、任意の所与の合成サイクルの終了時に、連結工程（５）の直後に、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置は、ｎ＋１となり、ｎから移動し、工程（１）でユニバーサルヌクレオチドが占める位置となる。連結工程（５）の生産物（図１で「連結生産物」と標識された構造）は、次の合成サイクルで使用するための足場ポリヌクレオチドとなる。連結生産物が次の合成サイクル（１０６）で使用するための足場ポリヌクレオチドと見なされる場合、次の合成サイクル（１０６）でのユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置が、次のサイクル（１０８）において切断された合成鎖の末端へのその付加時に、所定の配列の隣のヌクレオチドによって占められる合成鎖における位置と反対である支持鎖におけるヌクレオチド位置となるため、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置は、ｎ＋１（１０５）ではなく、ここでも位置ｎ（１０６）と呼ばれることが理解されるべきである。したがって、方法のバージョン１では、任意の所与の合成サイクル（１０１、１０６など）の開始時にユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置は、常に位置ｎと呼ばれ、そのサイクルに新たに組み込まれるヌクレオチドは、常に位置ｎと呼ばれる位置を占める。
第１の合成サイクルの完了後、第２のサイクルおよびその後のサイクルは、同じ方法の工程を使用して行われる。
方法のバージョン１の第１の合成サイクルの工程（２）と同様に、工程（６）では、足場ポリヌクレオチドは、切断部位で切断される（１０７）。切断部位は、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される。切断は足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断は、切断部位に、切断前のニック部位を含んだ合成鎖の支持鎖の切断された末端およびプライマー鎖部分の末端を含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを所定の位置に残す。切断により、切断の直前に存在する場合、ユニバーサルヌクレオチドと支持鎖にハイブリダイズされたヘルパー鎖とを含む支持鎖の除去がもたらされる。
切断工程は、第１のサイクルの工程（２）について上に記載されるように行われ得る。
工程（７）では、隣のヌクレオチドは、第１のサイクルの工程（３）のように、合成鎖の切断されたプライマー鎖部分の末端に付加される。
工程（８）では、可逆的ターミネーター基は、隣のヌクレオチドから除去される（脱保護ステップ；１０９）。第１のサイクルについて上に記載されるように、これは様々な段階で行われ得る。典型的には、かつ好ましくは、それは、連結工程（９）の前に、方法の工程（８）として行われるであろう。しかしながら、脱保護工程は、連結工程（９）の後など、新たなヌクレオチドの組み込み後の任意の工程で行われ得る。
次のサイクル（１０９）およびその後のサイクルにおける可逆的ターミネーター基の脱保護は、第１の合成サイクルに関して上に記載されるように行われ得る。
次のサイクルの工程（９）において、二本鎖連結ポリヌクレオチドは、切断された足場ポリヌクレオチドに連結される（１１０）。次の合成サイクルおよびその後の合成サイクルの工程（９）の連結ポリヌクレオチドが構成される場合があり、連結工程は、第１の合成サイクルの工程（５）について上に記載されるように行われ得る。
合成サイクルは、上に記載されるように、所定のヌクレオチド配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成するのに必要な回数だけ繰り返される。
合成方法のバージョン２
本発明の合成方法の第２の例示的なバージョンは、所与の合成サイクルにおいて組み込まれる新たなヌクレオチドによって占められる位置に対する、かつニックおよび切断部位に対するユニバーサルヌクレオチドの位置付けのための修飾された構造配置を除いて、第１のバージョンと類似の内容で行われる。
したがって、バージョン１のように、バージョン２では、足場ポリヌクレオチドの切断（工程２、２０２）は、切断の直前に存在する場合、ヘルパー鎖の喪失、およびユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖の喪失をもたらす。切断は、切断部位に、切断前のニック部位を含んだ合成鎖の支持鎖の切断された末端およびプライマー鎖部分の末端を含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを所定の位置に残す。切断は、突出のない、切断部位での平滑末端で切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドをもたらす。
方法の工程（３）において、所定のヌクレオチド配列中の第１のヌクレオチドは、ポリメラーゼまたは末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素などのトランスフェラーゼ活性を有する酵素の作用によって合成鎖のプライマー鎖部分の末端に付加される（２０３）。第１のヌクレオチドには、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基が提供される。したがって、工程（３）において、一塩基のみが組み込まれる。
方法の工程（４）において、脱保護工程が行われ（２０４）、新たに組み込まれたヌクレオチドからターミネーター基が除去される。原則として、脱保護工程は、連結工程（５）の後に行われ得る。工程（４）としての脱保護工程の実施が好ましい。
方法の工程（５）において、連結ポリヌクレオチド（図２の上部の左上に示される構造を参照されたい）は、切断された足場ポリヌクレオチドに連結される。連結は、パートナーヌクレオチドを足場ポリヌクレオチドへ組み込み、新たに組み込まれたヌクレオチドがパートナーヌクレオチドと対合することを可能にし（図２の工程５；２０５）、これにより合成サイクルを完了させる。
本発明の合成方法の第２の例示的なバージョンでは、足場ポリヌクレオチドは、上に記載されるように工程（１）で提供される（２０１）。この方法では、足場ポリヌクレオチドの支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、一本鎖切断部位に隣接するヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと反対の位置であり（図２の構造中に「Ｘ」と標識される）、それと対合される（図２の工程１に示される構造を参照されたい）。
方法の工程（２）において、足場ポリヌクレオチドは、切断部位で切断される（２０２）。切断部位は、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される。切断は足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断（工程２）は、切断の直前に存在する場合、ヘルパー鎖の喪失、およびユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖の喪失をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断は、切断部位に、切断前のニック部位を含んだ合成鎖の支持鎖の切断された末端およびプライマー鎖部分の末端を含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを所定の位置に残す。
この例示的な方法では、合成鎖にすでに一本鎖切断または「ニック」が提供されており、したがって足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断を提供するためには支持鎖の切断のみが必要である。
この例示的な方法のバージョンでは、切断により、合成鎖または支持鎖のいずれにも突出のない、平滑末端で切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドが生成される。
この方法では、ユニバーサルヌクレオチドは、切断工程の前に支持鎖における位置「ｎ＋１」を占める。ユニバーサルヌクレオチドが支持鎖における位置ｎ＋１を占めるときにそのような平滑末端で切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを得るために、支持鎖は、ユニバーサルヌクレオチドに対して特定の位置で切断される。足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎとｎ－１との間で切断される。
「ｎ」とは、その合成サイクルにおける切断された合成鎖の末端へのその付加時に、所定の配列のヌクレオチドによって占められるであろう合成鎖における位置と反対である支持鎖におけるヌクレオチド位置を意味する。「ｎ」とはまた、その合成サイクルにおける合成鎖のプライマー鎖部分の末端へのその付加時に、所定の配列のヌクレオチドによって占められるであろう合成鎖におけるヌクレオチド位置を意味する。したがって、切断工程では、ユニバーサルヌクレオチドは、支持鎖における位置ｎ＋１にあり、これはニック部位に隣接するヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドによって占められる位置と反対である（図２の位置「Ｘ」に示される）。
工程（１）および（２）で、その合成サイクルに組み込まれた所定の配列のヌクレオチドによって占められるであろう位置は、合成鎖のヘルパー鎖部分の末端ヌクレオチドに対応する（図２で位置「Ｉ」として示される）。
「ｎ＋１」とは、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における隣のヌクレオチド位置を意味する（図２の工程（１）および（２）で概略的に示されるように、プライマー鎖に対する遠位方向において、位置ｎで「Ｈ」と標識された位置の隣の位置を占める、位置ｎ＋１で「Ｕｎ」と標識されたヌクレオチド）。ｎ＋１はまた、合成鎖における対応する位置を指し得る（図２の工程（１）および（２）で、位置ｎ＋１で「Ｘ」と標識される）。したがって、切断工程では、支持鎖における位置ｎ＋１は、ニック部位に隣接するヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドによって占められる位置の反対にある。
「ｎ－１」とは、ヘルパー鎖に対する遠位方向／プライマー鎖に対する近位方向において、位置ｎに対する支持鎖における隣のヌクレオチド位置を意味する（図２の工程（１）および（２）に概略的に示されるように、位置ｎ－１で「Ｊ」と標識された位置）。ｎ－１はまた、合成鎖における対応する位置を指し得る（すなわち、図２の工程（２）に概略的に示されるように、位置ｎ－１で「Ｋ」と標識された位置）。したがって、切断工程では、支持鎖における位置ｎ－１は、合成鎖のプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドによって占められている位置と反対である。
バージョン２による方法では、位置ＨおよびＩ、ならびにＪおよびＫを占めるヌクレオチド対は、任意のヌクレオチド対であり得る。
ヌクレオチド位置ｎとｎ－１の間の支持鎖の切断時に、ユニバーサルヌクレオチド、ヘルパー鎖（存在する場合）、およびヘルパー鎖とハイブリダイズされるまたはハイブリダイズされた支持鎖の部分は、残りの切断された足場ポリヌクレオチドから除去される（図２の上部の右上に示される構造を参照されたい）。
リン酸基は、切断部位で切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドに付着し続けるべきである（図２の下部の中央に示される構造に示されるように）。これにより、連結工程において、連結ポリヌクレオチドの支持鎖を切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖に確実に連結することができる。
したがって、方法のバージョン２では、ユニバーサルヌクレオチドは、工程（１）および（２）で支持鎖における位置ｎ＋１を占め、支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎとｎ－１との間で切断される。
好ましくは、支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎとｎ－１との間のホスホジエステル結合（ヘルパー鎖に対する遠位方向／プライマー鎖に対する近位方向において、ユニバーサルヌクレオチドの位置に対する支持鎖の第２のホスホジエステル結合）の切断によって切断される。
支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎとｎ－１との間のホスホジエステル結合の一方のエステル結合の切断によって切断され得る。
好ましくは、支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎに対する第１のエステル結合の切断によって切断される。これは、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖上の切断位置で末端リン酸基を保持する効果を有するであろう。
ユニバーサルヌクレオチドが位置ｎ＋１を占める場合、任意の好適な機構を用いて、ヌクレオチド位置ｎとｎ－１の間の支持鎖の切断をもたらし得る。
上記に記載されるようなヌクレオチド位置ｎとｎ－１との間の支持鎖の切断は、酵素の作用によって行われ得る。
上に記載されるように、ユニバーサルヌクレオチドが支持鎖における位置ｎ＋１を占めるときの、ヌクレオチド位置ｎとｎ－１との間の支持鎖の切断は、エンドヌクレアーゼＶなどの酵素の作用によって行われ得る。
支持鎖における位置ｎ＋１を占めるユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される切断部位で、ヌクレオチド位置ｎとｎ－１との間で支持鎖を切断する１つの機構は、実施例３に類似の方法で記載されている。記載される機構は例示的であり、上に記載される切断配置が達成されるという条件で、他の機構を用いることができる。
この例示的な機構では、エンドヌクレアーゼ酵素が用いられる。例示された方法では、酵素は、エンドヌクレアーゼＶである。ユニバーサルヌクレオチドが、支持鎖における位置ｎ＋１を占めるときに支持鎖がヌクレオチド位置ｎとｎ－１との間で切断されるという条件で、他の酵素、分子、または化学物質を使用することができる。
本発明のこの例示的な方法のバージョンでは、全てのバージョンと同様に、隣のヌクレオチドを次の合成サイクルに組み込むことを可能にするために、可逆的ターミネーター基を第１のヌクレオチドから除去しなければならない（脱保護工程；２０４）。これは、第１のサイクルの様々な段階で行われ得る。典型的には、かつ好ましくは、それは、図２の工程４に示されるように、連結工程（５）の前に、方法の工程（４）として行われるであろう（２０４）。しかしながら、脱保護工程は、連結工程（５）の後など、新たなヌクレオチドの組み込み後の任意の工程で行われ得る。どの段階で脱保護工程が行われるかにかかわらず、第１のヌクレオチドの多重組み込みを防止するために、酵素および残りの組み込まれていない第１のヌクレオチドが最初に除去されるべきである。酵素および組み込まれていない第１のヌクレオチドは、好ましくは、連結工程（工程（５））の前に除去される。
第１のヌクレオチドからの可逆的ターミネーター基の除去は、任意の好適な手段によって行われ得る。例えば、除去は、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの化学物質の使用によって行われ得る。
方法の工程（５）において、二本鎖連結ポリヌクレオチドは、切断された足場ポリヌクレオチドに連結される（２０５）。連結ポリヌクレオチドは、支持鎖およびヘルパー鎖を含む。連結ポリヌクレオチドはさらに、ユニバーサルヌクレオチドと、所定の配列の第１のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドである単一の突出ヌクレオチドとを支持鎖中に含む相補的連結末端を含む。連結ポリヌクレオチドは、突出に隣接するヘルパー鎖中に別のポリヌクレオチド鎖に連結することができないように構成された末端ヌクレオチドをさらに含む（図２の上部の左上に示される構造において「Ｉ」と標識された位置）。典型的には、この末端ヌクレオチドは、リン酸基を欠いているであろう。典型的には、上に記載されるように、ヘルパー鎖のこの非リン酸化末端ヌクレオチドは、ヘルパー鎖の５’末端を定義するであろう。
連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端では、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと反対に位置付けられ（図２の工程（５）で「Ｘ」と標識された位置）、それと対合される。ヘルパー鎖の末端ヌクレオチド（位置ｎ＋１で、図２の工程（５）で「Ｉ」と標識された位置）は、位置ｎ＋２でのユニバーサルヌクレオチドと位置ｎでのパートナーヌクレオチドとの間にある位置（位置ｎ＋１で、図２の工程（５）で「Ｈ」と標識された位置）を占める支持鎖におけるヌクレオチドと対合される。
相補的連結末端は、好適な連結条件に供されたときに、それが組み込み工程（３）後に切断された足場ポリヌクレオチド生産物の突出末端と適合的に接合するように構成される。支持鎖の連結時に、第１のヌクレオチドはそのパートナーヌクレオチドと対合される。
支持鎖の連結は、任意の好適な手段によって行われ得る。連結は、合成鎖中、すなわちプライマー鎖部分中の第１のヌクレオチドと、第１のヌクレオチドに隣接するヘルパー鎖の末端ヌクレオチドとの間の一本鎖切断を維持しながら、支持鎖のみの接合をもたらすであろう。
連結は、典型的には、リガーゼ活性を有する酵素によって行われ得る。例えば、連結は、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼまたはＴ４ ＤＮＡリガーゼまたはその機能的バリアントもしくは等価物を用いて行われ得る。ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、例えば、末端リン酸基がないために、リガーゼに対する基質として作用することができないように提供されるため、そのような酵素の使用は、合成鎖における一本鎖切断の維持をもたらすであろう。
切断された足場ポリヌクレオチドへの連結ポリヌクレオチドの連結は、第１の合成サイクルを完了し、そのときに、所定のヌクレオチド配列の第１のヌクレオチドがそのパートナーヌクレオチドと反対の足場ポリヌクレオチドに組み込まれることを除いて、工程（１）の足場ポリヌクレオチドが効果的に再構築される。
この例示的な方法（２０５）の工程（５）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端では、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと反対に位置付けられ（「Ｘ」と標識された位置）、それと対合される。連結ポリヌクレオチドの文脈において、ユニバーサルヌクレオチドは、位置ｎ＋２、すなわち支持鎖の末端ヌクレオチドから除去される２つの位置（位置ｎ）に位置付けられることに留意されたい。連結ポリヌクレオチドの文脈における位置ｎは、工程（１）および（２）での足場ポリヌクレオチドの文脈において上に記載されるのと同じ意味を有する。したがって、工程（５）において、「ｎ」とは、連結後、その合成サイクルにおける合成鎖のプライマー鎖部分の末端へのその付加後に、所定の配列のヌクレオチドによってここで占められる合成鎖における位置と反対である支持鎖におけるヌクレオチド位置を意味する。「ｎ」とはまた、連結後、その合成サイクルにおける合成鎖のプライマー鎖部分の末端へのその付加後に、所定の配列のヌクレオチドによってここで占められる合成鎖におけるヌクレオチド位置を意味する。
工程（１）および（２）（図２の２０１および２０２）の間、ユニバーサルヌクレオチドが足場ポリヌクレオチドの位置ｎ＋１を占めるのに対し、ユニバーサルヌクレオチドは、同じ合成サイクル（図２の２０５）において連結ポリヌクレオチドの位置ｎ＋２を占めることに留意されたい。これは、工程（５）で、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドに、その合成サイクルでのその付加に続いて、所定の配列のヌクレオチドがここで提供され、連結ポリヌクレオチドに、所定の配列のヌクレオチドとパートナーを組むヌクレオチドが提供されるためであり、さらに、本明細書で定義されるように、「ｎ」は常に、そのサイクルに組み込まれる所定の配列のヌクレオチドによって占められる（または占められることになる）合成鎖のヌクレオチド位置を指すか、または支持鎖におけるその反対のヌクレオチド位置を指すためである。したがって、任意の所与の合成サイクルの終了時に、連結工程（５）の直後に、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置は、ｎ＋２となり、ｎ＋１から移動し、工程（１）でユニバーサルヌクレオチドが占める位置となる。連結工程（５）の生産物（図２で「連結生産物」と標識された構造）は、次の合成サイクルで使用するための足場ポリヌクレオチドとなる。連結生産物が次の合成サイクル（２０６）で使用するための足場ポリヌクレオチドと見なされる場合、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置は、ｎ＋２（２０５）ではなく、ここでも位置ｎ＋１（２０６）と呼ばれることが理解されるべきである。したがって、方法のバージョン２では、任意の所与の合成サイクル（２０１、２０６など）の開始時にユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置は、常に位置ｎ＋１と呼ばれ、そのサイクルに新たに組み込まれるヌクレオチドは、常に位置ｎと呼ばれる位置を占める。
第１の合成サイクルの完了後、第２のサイクルおよびその後のサイクルは、同じ方法の工程を使用して行われる。
方法のバージョン２の第１の合成サイクルの工程（２）と同様に、工程（６）では、足場ポリヌクレオチドは、切断部位で切断される（２０７）。切断部位は、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される。切断は足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断は、切断部位に、切断前のニック部位を含んだ合成鎖の支持鎖の切断された末端およびプライマー鎖部分の末端を含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを所定の位置に残す。切断により、切断の直前に存在する場合、ユニバーサルヌクレオチドと支持鎖にハイブリダイズされたヘルパー鎖とを含む支持鎖の除去がもたらされる。
切断工程は、第１のサイクルの工程（２）について上に記載されるように行われ得る。
工程（７）では、隣のヌクレオチドは、第１のサイクルの工程（３）のように、合成鎖の切断されたプライマー鎖部分の末端に付加される。
工程（８）では、可逆的ターミネーター基は、隣のヌクレオチドから除去される（脱保護ステップ；２０９）。第１のサイクルについて上に記載されるように、これは様々な段階で行われ得る。典型的には、かつ好ましくは、それは、連結工程（９）の前に、方法の工程（８）として行われるであろう。しかしながら、脱保護工程は、連結工程（９）の後など、新たなヌクレオチドの組み込み後の任意の工程で行われ得る。
次のサイクル（２０９）およびその後のサイクルにおける可逆的ターミネーター基の脱保護は、第１の合成サイクルに関して上に記載されるように行われ得る。
次のサイクルの工程（９）において、二本鎖連結ポリヌクレオチドは、切断された足場ポリヌクレオチドに連結される（２１０）。次の合成サイクルおよびその後の合成サイクルの工程（９）の連結ポリヌクレオチドが構成される場合があり、連結工程は、第１の合成サイクルの工程（５）について上に記載されるように行われ得る。
合成サイクルは、上に記載されるように、所定のヌクレオチド配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成するのに必要な回数だけ繰り返される。
合成方法のバージョン３
本発明の合成方法の第３の例示的なバージョンは、切断部位に対するユニバーサルヌクレオチドの位置付けのための修飾された構造的配置を除いて、第１のバージョンと類似の内容で行われる。
したがって、バージョン１のように、バージョン３では、足場ポリヌクレオチドの切断（工程２、３０２）は、切断の直前に存在する場合、ヘルパー鎖の喪失、およびユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖の喪失をもたらす。切断は、切断部位に、切断前のニック部位を含んだ合成鎖の支持鎖の切断された末端およびプライマー鎖部分の末端を含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを所定の位置に残す。切断は、切断部位で一塩基突出を有する切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドをもたらす。
方法の工程（３）において、所定のヌクレオチド配列中の第１のヌクレオチドは、ポリメラーゼまたは末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素などのトランスフェラーゼ活性を有する酵素の作用によって合成鎖のプライマー鎖部分の末端に付加される（３０３）。第１のヌクレオチドには、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基が提供される。したがって、工程（３）において、一塩基のみが組み込まれる。
方法の工程（４）において、脱保護工程が行われ（３０４）、新たに組み込まれたヌクレオチドからターミネーター基が除去される。原則として、脱保護工程は、連結工程（５）の後に行われ得る。工程（４）としての脱保護工程の実施が好ましい。
方法の工程（５）において、連結ポリヌクレオチド（図３の上部の左上に示される構造を参照されたい）は、切断された足場ポリヌクレオチドに連結される。連結は、パートナーヌクレオチドを足場ポリヌクレオチドへ組み込み、新たに組み込まれたヌクレオチドがパートナーヌクレオチドと対合することを可能にし（図３の工程５；３０５）、これにより合成サイクルを完了させる。
本発明の合成方法の第３の例示的なバージョンでは、足場ポリヌクレオチドは、上に記載されるように工程（１）で提供される（３０１）。この方法では、足場ポリヌクレオチドの支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、一本鎖切断部位に隣接するヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと反対の位置であり（図３の構造中に「Ｘ」と標識される）、それと対合される（図３の工程１に示される構造を参照されたい）。
方法の工程（２）において、足場ポリヌクレオチドは、切断部位で切断される（３０２）。切断部位は、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される。切断は足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断（工程２）は、切断の直前に存在する場合、ヘルパー鎖の喪失、およびユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖の喪失をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断は、切断部位に、切断前のニック部位を含んだ合成鎖の支持鎖の切断された末端およびプライマー鎖部分の末端を含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを所定の位置に残す。
この例示的な方法では、合成鎖にすでに一本鎖切断または「ニック」が提供されており、したがって足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断を提供するためには支持鎖の切断のみが必要である。
この例示的な方法のバージョンでは、切断により、一塩基突出を有する切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドが生成される。したがって、合成鎖のプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドは、支持鎖の末端ヌクレオチドに突出する。
この方法では、ユニバーサルヌクレオチドは、切断工程の前に支持鎖における位置「ｎ」を占める。ユニバーサルヌクレオチドが支持鎖における位置ｎを占めるときに、合成鎖のプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドが、支持鎖の末端ヌクレオチドに突出する、そのような切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを得るために、支持鎖は、ユニバーサルヌクレオチドおよびニック部位に対する特定の位置で切断される。足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎ－１とｎ－２との間で切断される。
「ｎ」とは、その合成サイクルにおける切断された合成鎖の末端へのその付加時に、所定の配列のヌクレオチドによって占められるであろう合成鎖における位置と反対である支持鎖におけるヌクレオチド位置を意味する。「ｎ」とはまた、その合成サイクルにおける合成鎖のプライマー鎖部分の末端へのその付加時に、所定の配列のヌクレオチドによって占められるであろう合成鎖におけるヌクレオチド位置を意味する。したがって、切断工程では、ユニバーサルヌクレオチドは、支持鎖における位置ｎにあり、これはニック部位に隣接するヘルパー鎖の末端ヌクレオチドによって占められる位置と反対である（図３の位置「Ｘ」に示される）。
工程（１）および（２）で、その合成サイクルに組み込まれた所定の配列のヌクレオチドによって占められるであろう位置は、合成鎖のヘルパー鎖部分の末端ヌクレオチドに対応する（図３で位置「Ｘ」として示される）。
「ｎ－１」とは、ヘルパー鎖に対する遠位方向／プライマー鎖に対する近位方向において、位置ｎに対する支持鎖における隣のヌクレオチド位置を意味する（図３の工程（１）および（２）に概略的に示されるように、位置ｎ－１で「Ｈ」と標識された位置）。ｎ－１はまた、合成鎖における対応する位置を指し得る（すなわち、図３の工程（２）に概略的に示されるように、位置ｎ－１で「Ｉ」と標識された位置）。したがって、切断工程では、支持鎖における位置ｎ－１は、合成鎖のプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドによって占められている位置と反対である。したがって、図３の工程（１）および（２）では、位置「Ｊ」および「Ｋ」のヌクレオチドが位置ｎ－２を占める。
バージョン３による方法では、位置ＨおよびＩ、ならびにＪおよびＫを占めるヌクレオチド対は、任意のヌクレオチド対であり得る。
ヌクレオチド位置ｎ－１とｎ－２との間の支持鎖の切断時に、ユニバーサルヌクレオチド、ヘルパー鎖（存在する場合）、およびヘルパー鎖とハイブリダイズされるまたはハイブリダイズされた支持鎖の部分は、残りの切断された足場ポリヌクレオチドから除去される（図３の上部の右上に示される構造を参照されたい）。
リン酸基は、切断部位で切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドに付着し続けるべきである（図３の下部の中央に示される構造に示されるように）。これにより、連結工程において、連結ポリヌクレオチドの支持鎖を切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖に確実に連結することができる。
したがって、方法のバージョン３では、ユニバーサルヌクレオチドは、工程（１）および（２）で支持鎖における位置ｎを占め、支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎ－１とｎ－２との間で切断される。
好ましくは、支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎ－１とｎ－２との間のホスホジエステル結合（ヘルパー鎖に対する遠位方向／プライマー鎖に対する近位方向において、ユニバーサルヌクレオチドの位置に対する支持鎖の第２のホスホジエステル結合）の切断によって切断される。
支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎ－１とｎ－２との間のホスホジエステル結合の一方のエステル結合の切断によって切断され得る。
好ましくは、支持鎖はヌクレオチド位置ｎ－１に対する第１のエステル結合の切断により切断される。これは、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖上の切断位置で末端リン酸基を保持する効果を有するであろう。
ユニバーサルヌクレオチドが位置ｎを占める場合、任意の好適な機構を用いて、ヌクレオチド位置ｎ－１とｎ－２との間の支持鎖の切断をもたらし得る。
上に記載されるようなヌクレオチド位置ｎ－１とｎ－２との間の支持鎖の切断は、酵素の作用によって行われ得る。
上に記載されるように、ユニバーサルヌクレオチドが支持鎖における位置ｎを占めるときの、ヌクレオチド位置ｎ－１とｎ－２との間の支持鎖の切断は、エンドヌクレアーゼＶなどの酵素の作用によって行われ得る。
支持鎖における位置ｎを占めるユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される切断部位で、ヌクレオチド位置ｎ－１とｎ－２との間で支持鎖を切断する１つの機構は、実施例３に類似の方法で記載されている。記載される機構は例示的であり、上に記載される切断配置および一塩基突出が達成されるという条件で、他の機構を用いることができる。
この例示的な機構では、エンドヌクレアーゼ酵素が用いられる。例示された方法では、酵素は、エンドヌクレアーゼＶである。ユニバーサルヌクレオチドが、支持鎖における位置ｎを占めるときに支持鎖がヌクレオチド位置ｎ－１とｎ－２との間で切断されるという条件で、他の酵素、分子、または化学物質を使用することができる。
本発明のこの例示的な方法のバージョンでは、全てのバージョンと同様に、隣のヌクレオチドを次の合成サイクルに組み込むことを可能にするために、可逆的ターミネーター基を第１のヌクレオチドから除去しなければならない（脱保護工程；３０４）。これは、第１のサイクルの様々な段階で行われ得る。典型的には、かつ好ましくは、それは、図３の工程４に示されるように、連結工程（５）の前に、方法の工程（４）として行われるであろう（３０４）。しかしながら、脱保護工程は、連結工程（５）の後など、新たなヌクレオチドの組み込み後の任意の工程で行われ得る。どの段階で脱保護工程が行われるかにかかわらず、第１のヌクレオチドの多重組み込みを防止するために、酵素および残りの組み込まれていない第１のヌクレオチドが最初に除去されるべきである。酵素および組み込まれていない第１のヌクレオチドは、好ましくは、連結工程（工程（５））の前に除去される。
第１のヌクレオチドからの可逆的ターミネーター基の除去は、任意の好適な手段によって行われ得る。例えば、除去は、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの化学物質の使用によって行われ得る。
方法の工程（５）において、二本鎖連結ポリヌクレオチドは、切断された足場ポリヌクレオチドに連結される（３０５）。連結ポリヌクレオチドは、支持鎖およびヘルパー鎖を含む。連結ポリヌクレオチドは、支持鎖にユニバーサルヌクレオチドと、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドを突出する２つの突出ヌクレオチドとを含む相補的連結末端をさらに含む。相補的連結末端の連結ポリヌクレオチドの支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドは、所定の配列の第１のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドである。連結ポリヌクレオチドは、突出に隣接するヘルパー鎖中に別のポリヌクレオチド鎖に連結することができないように構成された末端ヌクレオチドをさらに含む（図３の上部の左上に示される構造において「Ｘ」と標識された位置）。典型的には、この末端ヌクレオチドは、リン酸基を欠いているであろう。典型的には、上に記載されるように、ヘルパー鎖のこの非リン酸化末端ヌクレオチドは、ヘルパー鎖の５’末端を定義するであろう。
連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端では、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと反対に位置付けられ（ｎ＋１）（図３の工程（５）で「Ｘ」と標識された位置）、それと対合される。所定の配列の第１のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドは、ヘルパー鎖に対する遠位方向において、ユニバーサルヌクレオチドに対して隣のヌクレオチド位置を占め（位置ｎ）、ユニバーサルヌクレオチドと、連結ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドとの間に位置付けられる（位置ｎ－１で、図３の工程（５）で「Ｈ」と標識された位置）。
相補的連結末端は、好適な連結条件に供されたときに、それが組み込み工程（３）後に切断された足場ポリヌクレオチド生産物の突出末端と適合的に接合するように構成される。支持鎖の連結時に、第１のヌクレオチドはそのパートナーヌクレオチドと対合される。
支持鎖の連結は、任意の好適な手段によって行われ得る。連結は、合成鎖中、すなわちプライマー鎖部分中の第１のヌクレオチドと、第１のヌクレオチドに隣接するヘルパー鎖の末端ヌクレオチドとの間の一本鎖切断を維持しながら、支持鎖のみの接合をもたらすであろう。
連結は、典型的には、リガーゼ活性を有する酵素によって行われ得る。例えば、連結は、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼまたはＴ４ ＤＮＡリガーゼまたはその機能的バリアントもしくは等価物を用いて行われ得る。ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、例えば、末端リン酸基がないために、リガーゼに対する基質として作用することができないように提供されるため、そのような酵素の使用は、合成鎖における一本鎖切断の維持をもたらすであろう。
切断された足場ポリヌクレオチドへの連結ポリヌクレオチドの連結は、第１の合成サイクルを完了し、そのときに、所定のヌクレオチド配列の第１のヌクレオチドがそのパートナーヌクレオチドと反対の足場ポリヌクレオチドに組み込まれることを除いて、工程（１）の足場ポリヌクレオチドが効果的に再構築される。
この例示的な方法（３０５）の工程（５）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端では、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと反対に位置付けられ（「Ｘ」と標識された位置）、それと対合される。連結ポリヌクレオチドの文脈において、ユニバーサルヌクレオチドは、位置ｎ＋１、および支持鎖の末端ヌクレオチドから除去される２つの位置（位置ｎ－１）に位置付けられることに留意されたい。連結ポリヌクレオチドの文脈における位置ｎは、工程（１）および（２）での足場ポリヌクレオチドの文脈において上に記載されるのと同じ意味を有する。したがって、工程（５）において、「ｎ」とは、連結後、その合成サイクルにおける合成鎖のプライマー鎖部分の末端へのその付加後に、所定の配列のヌクレオチドによってここで占められる合成鎖における位置と反対である支持鎖におけるヌクレオチド位置を意味する。「ｎ」とはまた、連結後、その合成サイクルにおける合成鎖のプライマー鎖部分の末端へのその付加後に、所定の配列のヌクレオチドによってここで占められる合成鎖におけるヌクレオチド位置を意味する。
工程（１）および（２）（図３の３０１および３０２）の間、ユニバーサルヌクレオチドが足場ポリヌクレオチドの位置ｎを占めるのに対し、ユニバーサルヌクレオチドは、同じ合成サイクル（図３の３０５）において連結ポリヌクレオチドの位置ｎ＋１を占めることに留意されたい。これは、工程（５）で、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドに、その合成サイクルでのその付加に続いて、所定の配列のヌクレオチドがここで提供され、連結ポリヌクレオチドに、所定の配列のヌクレオチドとパートナーを組むヌクレオチドが提供されるためであり、さらに、本明細書で定義されるように、「ｎ」は常に、そのサイクルに組み込まれる所定の配列のヌクレオチドによって占められる（または占められることになる）合成鎖のヌクレオチド位置を指すか、または支持鎖におけるその反対のヌクレオチド位置を指すためである。したがって、任意の所与の合成サイクルの終了時に、連結工程（５）の直後に、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置は、ｎ＋１となり、ｎから移動し、工程（１）でユニバーサルヌクレオチドが占める位置となる。連結工程（５）の生産物（図３で「連結生産物」と標識された構造）は、次の合成サイクルで使用するための足場ポリヌクレオチドとなる。連結生産物が次の合成サイクル（３０６）で使用するための足場ポリヌクレオチドと見なされる場合、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置は、ｎ＋１（３０５）ではなく、ここでも位置ｎ（３０６）と呼ばれることが理解されるべきである。したがって、方法のバージョン３では、任意の所与の合成サイクル（３０１、３０６など）の開始時にユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置は、常に位置ｎと呼ばれ、そのサイクルに新たに組み込まれるヌクレオチドは、常に位置ｎと呼ばれる位置を占める。
第１の合成サイクルの完了後、第２のサイクルおよびその後のサイクルは、同じ方法の工程を使用して行われる。
方法のバージョン３の第１の合成サイクルの工程（２）と同様に、工程（６）では、足場ポリヌクレオチドは、切断部位で切断される（３０７）。切断部位は、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される。切断は足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断は、切断部位に、切断前のニック部位を含んだ合成鎖の支持鎖の切断された末端およびプライマー鎖部分の末端を含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを所定の位置に残す。切断により、切断の直前に存在する場合、ユニバーサルヌクレオチドと支持鎖にハイブリダイズされたヘルパー鎖とを含む支持鎖の除去がもたらされる。
切断工程は、第１のサイクルの工程（２）について上に記載されるように行われ得る。
工程（７）では、隣のヌクレオチドは、第１のサイクルの工程（３）のように、合成鎖の切断されたプライマー鎖部分の末端に付加される。
工程（８）では、可逆的ターミネーター基は、隣のヌクレオチドから除去される（脱保護ステップ；３０９）。第１のサイクルについて上に記載されるように、これは様々な段階で行われ得る。典型的には、かつ好ましくは、それは、連結工程（９）の前に、方法の工程（８）として行われるであろう。しかしながら、脱保護工程は、連結工程（９）の後など、新たなヌクレオチドの組み込み後の任意の工程で行われ得る。
次のサイクル（３０９）およびその後のサイクルにおける可逆的ターミネーター基の脱保護は、第１の合成サイクルに関して上に記載されるように行われ得る。
次のサイクルの工程（９）において、二本鎖連結ポリヌクレオチドは、切断された足場ポリヌクレオチドに連結される（３１０）。次の合成サイクルおよびその後の合成サイクルの工程（９）の連結ポリヌクレオチドが構成される場合があり、連結工程は、第１の合成サイクルの工程（５）について上に記載されるように行われ得る。
合成サイクルは、上に記載されるように、所定のヌクレオチド配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成するのに必要な回数だけ繰り返される。
合成方法のバージョン４
本発明の合成方法の第４の例示的なバージョンは、所与の合成サイクルにおいて組み込まれる新たなヌクレオチドによって占められる位置に対する、かつニックおよび切断部位に対するユニバーサルヌクレオチドの位置付けのための修飾された構造配置を除いて、第１のバージョンと類似の内容で行われる。
したがって、バージョン１のように、バージョン４では、足場ポリヌクレオチドの切断（工程２、４０２）は、切断の直前に存在する場合、ヘルパー鎖の喪失、およびユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖の喪失をもたらす。切断は、切断部位に、切断前のニック部位を含んだ合成鎖の支持鎖の切断された末端およびプライマー鎖部分の末端を含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを所定の位置に残す。切断は、突出のない、切断部位での平滑末端で切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドをもたらす。
方法の工程（３）において、所定のヌクレオチド配列中の第１のヌクレオチドは、ポリメラーゼまたは末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素などのトランスフェラーゼ活性を有する酵素の作用によって合成鎖のプライマー鎖部分の末端に付加される（４０３）。第１のヌクレオチドには、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基が提供される。したがって、工程（３）において、一塩基のみが組み込まれる。
方法の工程（４）において、脱保護工程が行われ（４０４）、新たに組み込まれたヌクレオチドからターミネーター基が除去される。原則として、脱保護工程は、連結工程（５）の後に行われ得る。工程（４）としての脱保護工程の実施が好ましい。
方法の工程（５）において、連結ポリヌクレオチド（図４の上部の左上に示される構造を参照されたい）は、切断された足場ポリヌクレオチドに連結される。連結は、パートナーヌクレオチドを足場ポリヌクレオチドへ組み込み、新たに組み込まれたヌクレオチドがパートナーヌクレオチドと対合することを可能にし（図４の工程５；４０５）、これにより合成サイクルを完了させる。
本発明の合成方法の第４の例示的なバージョンでは、足場ポリヌクレオチドは、上に記載されるように工程（１）で提供される（４０１）。この方法では、足場ポリヌクレオチドの支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、一本鎖切断部位に隣接するヘルパー鎖の末端ヌクレオチドから除去される２つの位置（図４の工程（１）に示される構造中に「Ｋ」と標識される）であるヌクレオチドと反対に位置付けられ（図４の構造中に「Ｘ」と標識される）、それと対合される。
方法の工程（２）において、足場ポリヌクレオチドは、切断部位で切断される（４０２）。切断部位は、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される。切断は足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断（工程２）は、切断の直前に存在する場合、ヘルパー鎖の喪失、およびユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖の喪失をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断は、切断部位に、切断前のニック部位を含んだ合成鎖の支持鎖の切断された末端およびプライマー鎖部分の末端を含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを所定の位置に残す。
この例示的な方法では、合成鎖にすでに一本鎖切断または「ニック」が提供されており、したがって足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断を提供するためには支持鎖の切断のみが必要である。
この例示的な方法のバージョンでは、切断により、突出のない平滑末端で切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドが生成される。
この方法では、ユニバーサルヌクレオチドは、切断工程の前に支持鎖における位置「ｎ＋２」を占める。ユニバーサルヌクレオチドが支持鎖における位置ｎ＋２を占めるときにそのような平滑末端で切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを得るために、支持鎖は、ユニバーサルヌクレオチドに対して、かつニック部位に対して特定の位置で切断される。足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎとｎ－１との間で切断される。
「ｎ」とは、その合成サイクルにおける切断された合成鎖の末端へのその付加時に、所定の配列のヌクレオチドによって占められるであろう合成鎖における位置と反対である支持鎖におけるヌクレオチド位置を意味する。「ｎ」とはまた、その合成サイクルにおける合成鎖のプライマー鎖部分の末端へのその付加時に、所定の配列のヌクレオチドによって占められるであろう合成鎖におけるヌクレオチド位置を意味する。したがって、切断工程では、ユニバーサルヌクレオチドは、支持鎖における位置ｎ＋２にあり、これは一本鎖切断部位に隣接するヘルパー鎖の末端ヌクレオチドから２つの位置が除去されたヌクレオチドと反対である（図４の工程（２）で位置「Ｘ」と示される）。
工程（１）および（２）で、その合成サイクルに組み込まれた所定の配列のヌクレオチドによって占められるであろう位置は、一本鎖切断部位に隣接するヘルパー鎖の末端ヌクレオチドから２つの位置が除去されたヌクレオチドに対応する（図４の工程（２）で、位置「Ｘ」で示される）。
「ｎ＋１」とは、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における隣のヌクレオチド位置を意味する（図４の工程（１）および（２）で概略的に示されるように、プライマー鎖に対する遠位方向において、位置ｎで「Ｊ」と標識された位置の隣の位置を占める、位置ｎ＋１で「Ｈ」と標識されたヌクレオチド）。ｎ＋１はまた、合成鎖における対応する位置を指し得る（図４の工程（１）および（２）で、位置ｎ＋１で「Ｉ」と標識される）。したがって、切断工程では、支持鎖における位置ｎ＋１は、ニック部位に隣接するヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドによって占められる位置の反対にある。
「ｎ－１」とは、ヘルパー鎖に対する遠位方向／プライマー鎖に対する近位方向において、位置ｎに対する支持鎖における隣のヌクレオチド位置を意味する（図４の工程（１）および（２）に概略的に示されるように、位置ｎ－１で「Ｌ」と標識された位置）。ｎ－１はまた、合成鎖における対応する位置を指し得る（すなわち、図４の工程（１）および（２）に概略的に示されるように、位置ｎ－１で「Ｍ」と標識された位置）。したがって、切断工程では、支持鎖における位置ｎ－１は、合成鎖のプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドによって占められている位置と反対である。したがって、図４の工程（１）および（２）では、位置「Ｊ」および「Ｋ」のヌクレオチドが位置ｎを占める。
バージョン４による方法では、位置ＨおよびＩ、ＪおよびＫ、ならびにＬおよびＭを占めるヌクレオチド対は、任意のヌクレオチド対であり得る。
ヌクレオチド位置ｎとｎ－１の間の支持鎖の切断時に、ユニバーサルヌクレオチド、ヘルパー鎖（存在する場合）、およびヘルパー鎖とハイブリダイズされるまたはハイブリダイズされた支持鎖の部分は、残りの切断された足場ポリヌクレオチドから除去される（図４の上部の右上に示される構造を参照されたい）。
リン酸基は、切断部位で切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドに付着し続けるべきである（図４の下部の中央に示される構造に示されるように）。これにより、連結工程において、連結ポリヌクレオチドの支持鎖を切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖に確実に連結することができる。
したがって、方法のバージョン４では、ユニバーサルヌクレオチドは、工程（１）および（２）で支持鎖における位置ｎ＋２を占め、支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎとｎ－１との間で切断される。
好ましくは、支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎとｎ－１との間のホスホジエステル結合（ヘルパー鎖に対する遠位方向／プライマー鎖に対する近位方向において、ユニバーサルヌクレオチドの位置に対する支持鎖の第３のホスホジエステル結合）の切断によって切断される。
支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎとｎ－１との間のホスホジエステル結合の一方のエステル結合の切断によって切断され得る。
好ましくは、支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎに対する第１のエステル結合の切断によって切断される。これは、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖上の切断位置で末端リン酸基を保持する効果を有するであろう。
ユニバーサルヌクレオチドが位置ｎ＋２を占める場合、任意の好適な機構を用いて、ヌクレオチド位置ｎとｎ－１の間の支持鎖の切断をもたらし得る。
上記に記載されるようなヌクレオチド位置ｎとｎ－１との間の支持鎖の切断は、酵素の作用によって行われ得る。
本発明のこの例示的な方法のバージョンでは、全てのバージョンと同様に、隣のヌクレオチドを次の合成サイクルに組み込むことを可能にするために、可逆的ターミネーター基を第１のヌクレオチドから除去しなければならない（脱保護工程；４０４）。これは、第１のサイクルの様々な段階で行われ得る。典型的には、かつ好ましくは、それは、図４の工程４に示されるように、連結工程（５）の前に、方法の工程（４）として行われるであろう（４０４）。しかしながら、脱保護工程は、連結工程（５）の後など、新たなヌクレオチドの組み込み後の任意の工程で行われ得る。どの段階で脱保護工程が行われるかにかかわらず、第１のヌクレオチドの多重組み込みを防止するために、酵素および残りの組み込まれていない第１のヌクレオチドが最初に除去されるべきである。酵素および組み込まれていない第１のヌクレオチドは、好ましくは、連結工程（工程（５））の前に除去される。
第１のヌクレオチドからの可逆的ターミネーター基の除去は、任意の好適な手段によって行われ得る。例えば、除去は、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの化学物質の使用によって行われ得る。
方法の工程（５）において、二本鎖連結ポリヌクレオチドは、切断された足場ポリヌクレオチドに連結される（４０５）。連結ポリヌクレオチドは、支持鎖およびヘルパー鎖を含む。連結ポリヌクレオチドは、支持鎖にユニバーサルヌクレオチドと、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドを突出する単一の突出ヌクレオチドとを含む相補的連結末端をさらに含む。突出ヌクレオチドは、所定の配列の第１のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドである。連結ポリヌクレオチドは、突出に隣接するヘルパー鎖中に別のポリヌクレオチド鎖に連結することができないように構成された末端ヌクレオチドをさらに含む（図４の上部の左上に示される構造において「Ｋ」と標識された位置）。典型的には、この末端ヌクレオチドは、リン酸基を欠いているであろう。典型的には、上に記載されるように、ヘルパー鎖のこの非リン酸化末端ヌクレオチドは、ヘルパー鎖の５’末端を定義するであろう。
連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端では、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドから２つの位置が除去されたヌクレオチドと反対に位置付けられ（ｎ＋３）（図４の工程（５）で「Ｘ」と標識された位置）、それと対合される。所定の配列の第１のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドは、連結ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドとしての位置（位置ｎ）を占める。連結ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドから１つの位置が除去されたヌクレオチドは、位置ｎ＋１で、図４の工程（５）で「Ｊ」と標識される。連結ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドから２つの位置が除去されたヌクレオチドは、位置ｎ＋２で、図４の工程（５）で「Ｈ」と標識される。
相補的連結末端は、好適な連結条件に供されたときに、それが組み込み工程（３）後に切断された足場ポリヌクレオチド生産物の突出末端と適合的に接合するように構成される。支持鎖の連結時に、第１のヌクレオチドはそのパートナーヌクレオチドと対合される。
支持鎖の連結は、任意の好適な手段によって行われ得る。連結は、合成鎖中、すなわちプライマー鎖部分中の第１のヌクレオチドと、第１のヌクレオチドに隣接するヘルパー鎖の末端ヌクレオチドとの間の一本鎖切断を維持しながら、支持鎖のみの接合をもたらすであろう。
連結は、典型的には、リガーゼ活性を有する酵素によって行われ得る。例えば、連結は、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼまたはＴ４ ＤＮＡリガーゼまたはその機能的バリアントもしくは等価物を用いて行われ得る。ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、例えば、末端リン酸基がないために、リガーゼに対する基質として作用することができないように提供されるため、そのような酵素の使用は、合成鎖における一本鎖切断の維持をもたらすであろう。
切断された足場ポリヌクレオチドへの連結ポリヌクレオチドの連結は、第１の合成サイクルを完了し、そのときに、所定のヌクレオチド配列の第１のヌクレオチドがそのパートナーヌクレオチドと反対の足場ポリヌクレオチドに組み込まれることを除いて、工程（１）の足場ポリヌクレオチドが効果的に再構築される。
この例示的な方法（３０５）の工程（５）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端では、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、一本鎖切断部位に隣接するヘルパー鎖の末端ヌクレオチドから２つの位置が除去されたヌクレオチドと反対に位置付けられる（図４の工程（５）で、位置「Ｘ」で示される）。連結ポリヌクレオチドの文脈において、ユニバーサルヌクレオチドは、位置ｎ＋３、および支持鎖の末端ヌクレオチドから除去される３つの位置（位置ｎ）に位置付けられることに留意されたい。連結ポリヌクレオチドの文脈における位置ｎは、工程（１）および（２）での足場ポリヌクレオチドの文脈において上に記載されるのと同じ意味を有する。したがって、工程（５）において、「ｎ」とは、連結後、その合成サイクルにおける合成鎖のプライマー鎖部分の末端へのその付加後に、所定の配列のヌクレオチドによってここで占められる合成鎖における位置と反対である支持鎖におけるヌクレオチド位置を意味する。「ｎ」とはまた、連結後、その合成サイクルにおける合成鎖のプライマー鎖部分の末端へのその付加後に、所定の配列のヌクレオチドによってここで占められる合成鎖におけるヌクレオチド位置を意味する。
工程（１）および（２）（図４の４０１および４０２）の間、ユニバーサルヌクレオチドが足場ポリヌクレオチドにおける位置ｎ＋２を占めるのに対し、ユニバーサルヌクレオチドは、同じ合成サイクル（図４の４０５）において連結ポリヌクレオチドの位置ｎ＋３を占めることに留意されたい。これは、工程（５）で、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドに、その合成サイクルでのその付加に続いて、所定の配列のヌクレオチドがここで提供され、連結ポリヌクレオチドに、所定の配列のヌクレオチドとパートナーを組むヌクレオチドが提供されるためであり、さらに、本明細書で定義されるように、「ｎ」は常に、そのサイクルに組み込まれる所定の配列のヌクレオチドによって占められる（または占められることになる）合成鎖のヌクレオチド位置を指すか、または支持鎖におけるその反対のヌクレオチド位置を指すためである。したがって、任意の所与の合成サイクルの終了時に、連結工程（５）の直後に、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置は、ｎ＋３となり、ｎ＋２から移動し、工程（１）でユニバーサルヌクレオチドが占める位置となる。連結工程（５）の生産物（図４で「連結生産物」と標識された構造）は、次の合成サイクルで使用するための足場ポリヌクレオチドとなる。連結生産物が次の合成サイクル（４０６）で使用するための足場ポリヌクレオチドと見なされる場合、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置は、ｎ＋３（４０５）ではなく、ここでも位置ｎ＋２（４０６）と呼ばれることが理解されるべきである。したがって、方法のバージョン４では、任意の所与の合成サイクル（４０１、４０６など）の開始時にユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置は、常に位置ｎ＋２と呼ばれ、そのサイクルに新たに組み込まれるヌクレオチドは、常に位置ｎと呼ばれる位置を占める。
第１の合成サイクルの完了後、第２のサイクルおよびその後のサイクルは、同じ方法の工程を使用して行われる。
方法のバージョン４の第１の合成サイクルの工程（２）と同様に、工程（６）では、足場ポリヌクレオチドは、切断部位で切断される（４０７）。切断部位は、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される。切断は足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断は、切断部位に、切断前のニック部位を含んだ合成鎖の支持鎖の切断された末端およびプライマー鎖部分の末端を含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを所定の位置に残す。切断により、切断の直前に存在する場合、ユニバーサルヌクレオチドと支持鎖にハイブリダイズされたヘルパー鎖とを含む支持鎖の除去がもたらされる。
切断工程は、第１のサイクルの工程（２）について上に記載されるように行われ得る。
工程（７）では、隣のヌクレオチドは、第１のサイクルの工程（３）のように、合成鎖の切断されたプライマー鎖部分の末端に付加される。
工程（８）では、可逆的ターミネーター基は、隣のヌクレオチドから除去される（脱保護ステップ；４０９）。第１のサイクルについて上に記載されるように、これは様々な段階で行われ得る。典型的には、かつ好ましくは、それは、連結工程（９）の前に、方法の工程（８）として行われるであろう。しかしながら、脱保護工程は、連結工程（９）の後など、新たなヌクレオチドの組み込み後の任意の工程で行われ得る。
次のサイクル（４０９）およびその後のサイクルにおける可逆的ターミネーター基の脱保護は、第１の合成サイクルに関して上に記載されるように行われ得る。
次のサイクルの工程（９）において、二本鎖連結ポリヌクレオチドは、切断された足場ポリヌクレオチドに連結される（４１０）。次の合成サイクルおよびその後の合成サイクルの工程（９）の連結ポリヌクレオチドが構成される場合があり、連結工程は、第１の合成サイクルの工程（５）について上に記載されるように行われ得る。
合成サイクルは、上に記載されるように、所定のヌクレオチド配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成するのに必要な回数だけ繰り返される。
合成方法のバージョン４に基づく変形例の方法
合成方法のバージョン４は、合成方法のバージョン２の変形例であることが理解される。両方の方法は、位置ｎとｎ－１との間の足場ポリヌクレオチドの支持鎖の切断を必要とする。第１および第２のサイクルの切断工程（工程２および６）の前およびその切断工程でのバージョン２において、ユニバーサルヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドの支持鎖における位置ｎ＋１を占める。第１および第２のサイクルの切断工程（工程２および６）の前およびその切断工程でのバージョン４とは対照的に、ユニバーサルヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドの支持鎖における位置ｎ＋２を占める。したがって、合成方法のバージョン４は、合成方法のバージョン４において、ユニバーサルヌクレオチドが、プライマー鎖部分に対する遠位方向において位置ｎからさらに除去された１つの位置を占めることを除いて、合成方法のバージョン２と同じである。
合成方法のバージョン４のさらなる変形例が想定され、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎとｎ－１との間で切断され、各さらなる変形例の方法において、ユニバーサルヌクレオチドは、プライマー鎖部分に対する遠位方向において位置ｎからさらに除去された１つの位置を徐々に占め、位置ｎ＋３で始まり、式ｎ＋３＋ｘに従って徐々に増加し、ｘは１～１０以上の整数である。
したがって、合成方法のバージョン４の「ｎ＋３」の変形例が提供され、方法は、以下の変形例を除いて、上に記載される合成方法のバージョン４と同じ方法で行われる。
第１サイクルの切断工程（工程１および２）の前およびその切断工程において、ユニバーサルヌクレオチドは代わりに、足場ポリヌクレオチドの支持鎖における位置ｎ＋３を占め、ｎ＋３は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における第３のヌクレオチド位置であり、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎとｎ－１との間で切断される。
第１のサイクルの連結工程（工程５）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端は、ユニバーサルヌクレオチドが代わりに、支持鎖における位置ｎ＋４を占め、相補的連結末端でヘルパー鎖の末端ヌクレオチドから除去された３つの位置であるヌクレオチドと対合するように構造化され、位置ｎ＋４は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対して支持鎖における位置４である。
第２のサイクルの切断工程（工程５および６）の前およびその切断工程において、ならびに全てのその後のサイクルの切断工程において、ユニバーサルヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドの支持鎖の位置ｎ＋３を占め、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎとｎ－１との間で切断される。
最後に、第２のサイクルの連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端は、ユニバーサルヌクレオチドは、支持鎖における位置ｎ＋４を占め、相補的連結末端でヘルパー鎖の末端ヌクレオチドから２つの位置が除去されたヌクレオチドと対合するように構造化される。
上に記載される「ｎ＋３」の方法に加えて、合成方法のバージョン４の「ｎ＋３＋ｘ」の変形例が提供され、方法は、以下の変形例を除いて、上に記載される合成方法のバージョン４と同じ方法で行われる。
第１サイクルの切断工程（工程１および２）の前およびその切断工程において、ユニバーサルヌクレオチドは代わりに、足場ポリヌクレオチドの支持鎖における位置ｎ＋３＋ｘを占め、ｎ＋３は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における第３のヌクレオチド位置であり、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎとｎ－１との間で切断される。
第１のサイクルの連結工程（工程５）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端は、ユニバーサルヌクレオチドが代わりに、支持鎖における位置ｎ＋４＋ｘを占め、相補的連結末端でヘルパー鎖の末端ヌクレオチドから除去された３＋ｘ個の位置であるヌクレオチドと対合するように構造化され、位置ｎ＋４は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対して支持鎖における位置４である。
第２のサイクルの切断工程（工程６）の前およびその切断工程において、ならびに全てのその後のサイクルの切断工程において、ユニバーサルヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドの支持鎖の位置ｎ＋３＋ｘを占め、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎとｎ－１との間で切断され、
最後に、第２のサイクルの連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端は、ユニバーサルヌクレオチドが、支持鎖における位置ｎ＋４＋ｘを占め、相補的連結末端でヘルパー鎖の末端ヌクレオチドから除去された２＋ｘ個の位置であるヌクレオチドと対合するように構造化される。
これらの方法の全てにおいて、ｘは、１～１０以上の間の整数であり、ｘは、工程（１）、（２）、（５）、（６）、および（９）で同じ整数である。
合成方法のバージョン４と同様に、バージョン４に基づく変形例の方法では、ユニバーサルヌクレオチドが工程（１）および（２）の間、足場ポリヌクレオチドにおける位置ｎ＋３（または特定の変形例の方法によってはｎ＋３＋ｘ）を占めるのに対し、ユニバーサルヌクレオチドは、同じ合成サイクルにおいて連結ポリヌクレオチドにおける位置ｎ＋４（または特定の変形例の方法によってはｎ＋４＋ｘ）を占める。これは、工程（５）で、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドに、その合成サイクルでのその付加に続いて、所定の配列のヌクレオチドがここで提供され、連結ポリヌクレオチドに、所定の配列のヌクレオチドとパートナーを組むヌクレオチドが提供されるためであり、さらに、本明細書で定義されるように、「ｎ」は常に、そのサイクルに組み込まれる所定の配列のヌクレオチドによって占められる（または占められることになる）合成鎖のヌクレオチド位置を指すか、または支持鎖におけるその反対のヌクレオチド位置を指すためである。したがって、任意の所与の合成サイクルの終了時に、連結工程（５）の直後に、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置は、ｎ＋４（またはｎ＋４＋ｘ）となり、ｎ＋３（または相応して、ｎ＋３＋ｘから）から移動し、工程（１）でユニバーサルヌクレオチドが占める位置となる。連結工程（５）の生産物（図４で「連結生産物」と標識された構造に対応する）は、次の合成サイクルで使用するための足場ポリヌクレオチドとなる。連結生産物が次の合成サイクルで使用するための足場ポリヌクレオチドと見なされる場合、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置は、ｎ＋４（またはｎ＋４＋ｘ）（４０５を参照されたい）ではなく、ここでも位置ｎ＋３（またはｎ＋３＋ｘ）（４０６を参照されたい）と呼ばれる。したがって、合成方法のバージョン４の変形例では、任意の所与の合成サイクルの開始時にユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置（４０１、４０６などを参照されたい）は、常に位置ｎ＋３（またはｘが１～１０以上の整数である、特定の変形例の方法に応じてｎ＋３＋ｘ）であり、そのサイクルで新たに組み込まれるヌクレオチドは、常にｎと呼ばれる位置を占める。
合成方法のバージョン５
本発明の合成方法の第５の例示的なバージョンは、所与の合成サイクルにおいて組み込まれる新たなヌクレオチドによって占められる位置に対する、かつニックおよび切断部位に対するユニバーサルヌクレオチドの位置付けのための修飾された構造配置を除いて、第１のバージョンと類似の内容で行われる。
したがって、バージョン１のように、バージョン５では、足場ポリヌクレオチドの切断（工程２、５０２）は、切断の直前に存在する場合、ヘルパー鎖の喪失、およびユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖の喪失をもたらす。切断は、切断部位に、切断前のニック部位を含んだ合成鎖の支持鎖の切断された末端およびプライマー鎖部分の末端を含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを所定の位置に残す。切断は、切断部位で一塩基突出を有する切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドをもたらす。
方法の工程（３）において、所定のヌクレオチド配列中の第１のヌクレオチドは、ポリメラーゼまたは末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素などのトランスフェラーゼ活性を有する酵素の作用によって合成鎖のプライマー鎖部分の末端に付加される（５０３）。第１のヌクレオチドには、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基が提供される。したがって、工程（３）において、一塩基のみが組み込まれる。
方法の工程（４）において、脱保護工程が行われ（５０４）、新たに組み込まれたヌクレオチドからターミネーター基が除去される。原則として、脱保護工程は、連結工程（５）の後に行われ得る。工程（４）としての脱保護工程の実施が好ましい。
方法の工程（５）において、連結ポリヌクレオチド（図５の上部の左上に示される構造を参照されたい）は、切断された足場ポリヌクレオチドに連結される。連結は、パートナーヌクレオチドを足場ポリヌクレオチドへ組み込み、新たに組み込まれたヌクレオチドがパートナーヌクレオチドと対合することを可能にし（図５の工程５；５０５）、これにより合成サイクルを完了させる。
本発明の合成方法の第５の例示的なバージョンでは、足場ポリヌクレオチドは、上に記載されるように工程（１）で提供される（５０１）。この方法では、足場ポリヌクレオチドの支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、反対に位置付けられ、一本鎖切断部位に隣接するヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドであるヌクレオチド（図５の工程（１）の構造中に「Ｘ」と標識される）と対合される。
方法の工程（２）において、足場ポリヌクレオチドは、切断部位で切断される（５０２）。切断部位は、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される。切断は、足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断（工程２）は、切断の直前に存在する場合、ヘルパー鎖の喪失、およびユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖の喪失をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断は、切断部位に、切断前のニック部位を含んだ合成鎖の支持鎖の切断された末端およびプライマー鎖部分の末端を含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを所定の位置に残す。
この例示的な方法では、合成鎖にすでに一本鎖切断または「ニック」が提供されており、したがって足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断を提供するためには支持鎖の切断のみが必要である。
この例示的な方法のバージョンでは、切断により、一塩基突出を有する切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドが生成される。したがって、合成鎖のプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドは、支持鎖の末端ヌクレオチドに突出する。
この方法では、ユニバーサルヌクレオチドは、切断工程の前に支持鎖における位置「ｎ＋１」を占める。ユニバーサルヌクレオチドが支持鎖における位置ｎ＋１を占めるときに、合成鎖のプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドが、支持鎖の末端ヌクレオチドに突出する、そのような切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを得るために、支持鎖は、ユニバーサルヌクレオチドおよびニック部位に対する特定の位置で切断される。足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎ－１とｎ－２との間で切断される。
「ｎ」とは、その合成サイクルにおける切断された合成鎖の末端へのその付加時に、所定の配列のヌクレオチドによって占められるであろう合成鎖における位置と反対である支持鎖におけるヌクレオチド位置を意味する。「ｎ」とはまた、その合成サイクルにおける合成鎖のプライマー鎖部分の末端へのその付加時に、所定の配列のヌクレオチドによって占められるであろう合成鎖におけるヌクレオチド位置を意味する。したがって、切断工程では、ユニバーサルヌクレオチドは、支持鎖における位置ｎ＋１にあり、これは一本鎖切断部位に隣接するヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと反対である（図５の工程（２）で、位置「Ｘ」で示される）。
工程（１）および（２）で、その合成サイクルに組み込まれた所定の配列のヌクレオチドによって占められるであろう位置は、一本鎖切断部位に隣接するヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドに対応する（図５の工程（２）で、位置「Ｘ」で示される）。
「ｎ＋１」とは、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における隣のヌクレオチド位置を意味する（図５の工程（１）および（２）で概略的に示されるように、プライマー鎖に対する遠位方向において、位置ｎで「Ｈ」と標識された位置の隣の位置を占める、位置ｎ＋１で「Ｕｎ」と標識されたヌクレオチド）。ｎ＋１はまた、合成鎖における対応する位置を指し得る（図５の工程（１）および（２）で、位置ｎ＋１で「Ｘ」と標識される）。したがって、切断工程では、支持鎖における位置ｎ＋１は、ニック部位に隣接するヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドによって占められる位置の反対にある。
「ｎ－１」とは、ヘルパー鎖に対する遠位方向／プライマー鎖に対する近位方向において、位置ｎに対する支持鎖における隣のヌクレオチド位置を意味する（図５の工程（１）および（２）に概略的に示されるように、位置ｎ－１で「Ｊ」と標識された位置）。ｎ－１はまた、合成鎖における対応する位置を指し得る（すなわち、図５の工程（１）および（２）に概略的に示されるように、位置ｎ－１で「Ｋ」と標識された位置）。したがって、切断工程では、支持鎖における位置ｎ－１は、合成鎖のプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドによって占められている位置と反対である。したがって、図５の工程（１）および（２）では、位置「Ｌ」および「Ｍ」のヌクレオチドが位置ｎ－２を占める。
バージョン５による方法では、位置ＨおよびＩ、ＪおよびＫ、ならびにＬおよびＭを占めるヌクレオチド対は、任意のヌクレオチド対であり得る。
ヌクレオチド位置ｎ－１とｎ－２との間の支持鎖の切断時に、ユニバーサルヌクレオチド、ヘルパー鎖（存在する場合）、およびヘルパー鎖とハイブリダイズされるまたはハイブリダイズされた支持鎖の部分は、残りの切断された足場ポリヌクレオチドから除去される（図５の上部の右上に示される構造を参照されたい）。
リン酸基は、切断部位で切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドに付着し続けるべきである（図５の下部の中央に示される構造に示されるように）。これにより、連結工程において、連結ポリヌクレオチドの支持鎖を切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖に確実に連結することができる。
したがって、方法のバージョン５では、ユニバーサルヌクレオチドは、工程（１）および（２）で支持鎖における位置ｎ＋１を占め、支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎ－１とｎ－２との間で切断される。
好ましくは、支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎ－１とｎ－２との間のホスホジエステル結合（ヘルパー鎖に対する遠位方向／プライマー鎖に対する近位方向において、ユニバーサルヌクレオチドの位置に対する支持鎖の第３のホスホジエステル結合）の切断によって切断される。
支持鎖は、ヌクレオチド位置ｎ－１とｎ－２との間のホスホジエステル結合の一方のエステル結合の切断によって切断され得る。
好ましくは、支持鎖はヌクレオチド位置ｎ－１に対する第１のエステル結合の切断により切断される。これは、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖上の切断位置で末端リン酸基を保持する効果を有するであろう。
ユニバーサルヌクレオチドが位置ｎ＋１を占める場合、任意の好適な機構を用いて、ヌクレオチド位置ｎ－１とｎ－２との間の支持鎖の切断をもたらし得る。
上に記載されるようなヌクレオチド位置ｎ－１とｎ－２との間の支持鎖の切断は、酵素の作用によって行われ得る。
本発明のこの例示的な方法のバージョンでは、全てのバージョンと同様に、隣のヌクレオチドを次の合成サイクルに組み込むことを可能にするために、可逆的ターミネーター基を第１のヌクレオチドから除去しなければならない（脱保護工程；５０４）。これは、第１のサイクルの様々な段階で行われ得る。典型的には、かつ好ましくは、それは、図５の工程４に示されるように、連結工程（５）の前に、方法の工程（４）として行われるであろう（５０４）。しかしながら、脱保護工程は、連結工程（５）の後など、新たなヌクレオチドの組み込み後の任意の工程で行われ得る。どの段階で脱保護工程が行われるかにかかわらず、第１のヌクレオチドの多重組み込みを防止するために、酵素および残りの組み込まれていない第１のヌクレオチドが最初に除去されるべきである。酵素および組み込まれていない第１のヌクレオチドは、好ましくは、連結工程（工程（５））の前に除去される。
第１のヌクレオチドからの可逆的ターミネーター基の除去は、任意の好適な手段によって行われ得る。例えば、除去は、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの化学物質の使用によって行われ得る。
方法の工程（５）において、二本鎖連結ポリヌクレオチドは、切断された足場ポリヌクレオチドに連結される（５０５）。連結ポリヌクレオチドは、支持鎖およびヘルパー鎖を含む。連結ポリヌクレオチドは、支持鎖にユニバーサルヌクレオチドと、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドを突出する２つの突出ヌクレオチドとを含む相補的連結末端をさらに含む。相補的連結末端の連結ポリヌクレオチドの支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドは、所定の配列の第１のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドである。連結ポリヌクレオチドは、突出に隣接するヘルパー鎖中に別のポリヌクレオチド鎖に連結することができないように構成された末端ヌクレオチドをさらに含む（図５の上部の左上に示される構造において「Ｉ」と標識された位置）。典型的には、この末端ヌクレオチドは、リン酸基を欠いているであろう。典型的には、上に記載されるように、ヘルパー鎖のこの非リン酸化末端ヌクレオチドは、ヘルパー鎖の５’末端を定義するであろう。
連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端では、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドであるヌクレオチドと反対に位置付けられ（ｎ＋２）（図５の工程（５）で「Ｘ」と標識された位置）、それと対合される。ヘルパー鎖の末端ヌクレオチド（図５の工程（５）で「Ｉ」と標識された位置）は、位置ｎ＋１を占め、支持鎖における「Ｈ」と標識された位置でヌクレオチドと対合されて示され、またそれは位置ｎ＋１である。所定の配列の第１のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドは、位置ｎで、連結ポリヌクレオチドの支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドとしての位置を占める。最後に、連結ポリヌクレオチドの支持鎖の末端ヌクレオチドは、位置ｎ－１で、図５の工程（５）で「Ｊ」と標識される。
相補的連結末端は、好適な連結条件に供されたときに、それが組み込み工程（３）後に切断された足場ポリヌクレオチド生産物の突出末端と適合的に接合するように構成される。支持鎖の連結時に、第１のヌクレオチドはそのパートナーヌクレオチドと対合される。
支持鎖の連結は、任意の好適な手段によって行われ得る。連結は、合成鎖中、すなわちプライマー鎖部分中の第１のヌクレオチドと、第１のヌクレオチドに隣接するヘルパー鎖の末端ヌクレオチドとの間の一本鎖切断を維持しながら、支持鎖のみの接合をもたらすであろう。
連結は、典型的には、リガーゼ活性を有する酵素によって行われ得る。例えば、連結は、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼまたはＴ４ ＤＮＡリガーゼまたはその機能的バリアントもしくは等価物を用いて行われ得る。ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドは、例えば、末端リン酸基がないために、リガーゼに対する基質として作用することができないように提供されるため、そのような酵素の使用は、合成鎖における一本鎖切断の維持をもたらすであろう。
切断された足場ポリヌクレオチドへの連結ポリヌクレオチドの連結は、第１の合成サイクルを完了し、そのときに、所定のヌクレオチド配列の第１のヌクレオチドがそのパートナーヌクレオチドと反対の足場ポリヌクレオチドに組み込まれることを除いて、工程（１）の足場ポリヌクレオチドが効果的に再構築される。
この例示的な方法（５０５）の工程（５）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端では、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、一本鎖切断部位に隣接するヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドであるヌクレオチドと反対に位置付けられる（図５の工程（５）で、位置「Ｘ」で示される）。連結ポリヌクレオチドの文脈において、ユニバーサルヌクレオチドは、位置ｎ＋２、および支持鎖の末端ヌクレオチドから除去される３つの位置（位置ｎ－１）に位置付けられることに留意されたい。連結ポリヌクレオチドの文脈における位置ｎは、工程（１）および（２）での足場ポリヌクレオチドの文脈において上に記載されるのと同じ意味を有する。したがって、工程（５）において、「ｎ」とは、連結後、その合成サイクルにおける合成鎖のプライマー鎖部分の末端へのその付加後に、所定の配列のヌクレオチドによってここで占められる合成鎖における位置と反対である支持鎖におけるヌクレオチド位置を意味する。「ｎ」とはまた、連結後、その合成サイクルにおける合成鎖のプライマー鎖部分の末端へのその付加後に、所定の配列のヌクレオチドによってここで占められる合成鎖におけるヌクレオチド位置を意味する。
工程（１）および（２）（図５の５０１および５０２）の間、ユニバーサルヌクレオチドは足場ポリヌクレオチドの位置ｎ＋１を占めるのに対し、ユニバーサルヌクレオチドは、同じ合成サイクル（図５の５０５）において連結ポリヌクレオチドの位置ｎ＋２を占めることに留意されたい。これは、工程（５）で、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドに、その合成サイクルでのその付加に続いて、所定の配列のヌクレオチドがここで提供され、連結ポリヌクレオチドに、所定の配列のヌクレオチドとパートナーを組むヌクレオチドが提供されるためであり、さらに、本明細書で定義されるように、「ｎ」は常に、そのサイクルに組み込まれる所定の配列のヌクレオチドによって占められる（または占められることになる）合成鎖のヌクレオチド位置を指すか、または支持鎖におけるその反対のヌクレオチド位置を指すためである。したがって、任意の所与の合成サイクルの終了時に、連結工程（５）の直後に、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置は、ｎ＋２となり、ｎ＋１から移動し、工程（１）でユニバーサルヌクレオチドが占める位置となる。連結工程（５）の生産物（図５で「連結生産物」と標識された構造）は、次の合成サイクルで使用するための足場ポリヌクレオチドとなる。連結生産物が次の合成サイクル（５０６）で使用するための足場ポリヌクレオチドと見なされる場合、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置は、ｎ＋２（５０５）ではなく、ここでも位置ｎ＋１（５０６）と呼ばれることが理解されるべきである。したがって、方法のバージョン５では、任意の所与の合成サイクル（５０１、５０６など）の開始時にユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置は、常に位置ｎ＋１と呼ばれ、そのサイクルに新たに組み込まれるヌクレオチドは、常に位置ｎと呼ばれる位置を占める。
第１の合成サイクルの完了後、第２のサイクルおよびその後のサイクルは、同じ方法の工程を使用して行われる。
方法のバージョン５の第１の合成サイクルの工程（２）と同様に、工程（６）では、足場ポリヌクレオチドは、切断部位で切断される（５０７）。切断部位は、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される。切断は足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断は、切断部位に、切断前のニック部位を含んだ合成鎖の支持鎖の切断された末端およびプライマー鎖部分の末端を含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを所定の位置に残す。切断により、切断の直前に存在する場合、ユニバーサルヌクレオチドと支持鎖にハイブリダイズされたヘルパー鎖とを含む支持鎖の除去がもたらされる。
切断工程は、第１のサイクルの工程（２）について上に記載されるように行われ得る。
工程（７）では、隣のヌクレオチドは、第１のサイクルの工程（３）のように、合成鎖の切断されたプライマー鎖部分の末端に付加される。
工程（８）では、可逆的ターミネーター基は、隣のヌクレオチドから除去される（脱保護ステップ；５０９）。第１のサイクルについて上に記載されるように、これは様々な段階で行われ得る。典型的には、かつ好ましくは、それは、連結工程（９）の前に、方法の工程（８）として行われるであろう。しかしながら、脱保護工程は、連結工程（９）の後など、新たなヌクレオチドの組み込み後の任意の工程で行われ得る。
次のサイクル（５０９）およびその後のサイクルにおける可逆的ターミネーター基の脱保護は、第１の合成サイクルに関して上に記載されるように行われ得る。
次のサイクルの工程（９）において、二本鎖連結ポリヌクレオチドは、切断された足場ポリヌクレオチドに連結される（５１０）。次の合成サイクルおよびその後の合成サイクルの工程（９）の連結ポリヌクレオチドが構成される場合があり、連結工程は、第１の合成サイクルの工程（５）について上に記載されるように行われ得る。
合成サイクルは、上に記載されるように、所定のヌクレオチド配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成するのに必要な回数だけ繰り返される。
合成法のバージョン５に基づく変形例の方法
合成方法のバージョン５は、合成方法のバージョン３の変形例であることが理解される。両方の方法は、位置ｎ－１とｎ－２との間の足場ポリヌクレオチドの支持鎖の切断を必要とする。第１および第２のサイクルの切断工程（工程２および６）の前およびその切断工程でのバージョン３において、ユニバーサルヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドの支持鎖における位置ｎを占める。第１および第２のサイクルの切断工程（工程２および６）の前およびその切断工程でのバージョン５とは対照的に、ユニバーサルヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドの支持鎖における位置ｎ＋１を占める。したがって、合成方法のバージョン５は、合成方法のバージョン５において、ユニバーサルヌクレオチドが、プライマー鎖部分に対する遠位方向において位置ｎからさらに除去されら１つの位置を占めることを除いて、合成方法のバージョン３と同じである。
合成方法のバージョン５のさらなる変形例が想定され、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎ－１とｎ－２との間で切断され、各さらなる変形例の方法において、ユニバーサルヌクレオチドは、プライマー鎖部分に対する遠位方向において位置ｎからさらに除去された１つの位置を徐々に占め、位置ｎ＋２で始まり、式ｎ＋２＋ｘに従って徐々に増加し、ｘは１～１０以上の整数である。
したがって、合成方法のバージョン５の「ｎ＋２」の変形例が提供され、方法は、以下の変形例を除いて、上に記載される合成方法のバージョン５と同じ方法で行われる。
第１サイクルの切断工程（工程２）において、ユニバーサルヌクレオチドは代わりに、足場ポリヌクレオチドの支持鎖における位置ｎ＋２を占め、ｎ＋２は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における第２のヌクレオチド位置であり、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎとｎ－１との間で切断される。
第１のサイクルの連結工程（工程５）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端は、ユニバーサルヌクレオチドが代わりに、支持鎖における位置ｎ＋３を占め、相補的連結末端でヘルパー鎖の末端ヌクレオチドから２つの位置が除去されたヌクレオチドと対合するように構造化され、位置ｎ＋３は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対して支持鎖における位置３である。
第２のサイクルの切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、ユニバーサルヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドの支持鎖の位置ｎ＋２を占め、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎとｎ－１との間で切断される。
最後に、第２のサイクルの連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端は、ユニバーサルヌクレオチドが、支持鎖における位置ｎ＋３を占め、相補的連結末端でヘルパー鎖の末端ヌクレオチドから２つの位置が除去されたヌクレオチドと対合するように構造化される。
上に記載される方法に加えて、合成方法のバージョン５の「ｎ＋２＋ｘ」の変形例が提供され、方法は、以下の変形例を除いて、上に記載される合成方法のバージョン５と同じ方法で行われる。
第１サイクルの切断工程（工程２）において、ユニバーサルヌクレオチドは代わりに、足場ポリヌクレオチドの支持鎖における位置ｎ＋２＋ｘを占め、ｎ＋２は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する支持鎖における第２のヌクレオチド位置であり、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎとｎ－１との間で切断される。
第１のサイクルの連結工程（工程５）において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端は、ユニバーサルヌクレオチドが代わりに、支持鎖における位置ｎ＋３＋ｘを占め、相補的連結末端でヘルパー鎖の末端ヌクレオチドから除去された２＋ｘ個の位置であるヌクレオチドと対合するように構造化され、位置ｎ＋３は、ヘルパー鎖に対する近位方向／プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対して支持鎖における位置３である。
第２のサイクルの切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、ユニバーサルヌクレオチドは、足場ポリヌクレオチドの支持鎖の位置ｎ＋２＋ｘを占め、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、位置ｎとｎ－１との間で切断される。
最後に、第２のサイクルの連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端は、ユニバーサルヌクレオチドが、支持鎖における位置ｎ＋３＋ｘを占め、相補的連結末端でヘルパー鎖の末端ヌクレオチドから除去された２＋ｘ個の位置であるヌクレオチドと対合するように構造化される。
これらの方法の全てにおいて、ｘは、１～１０以上の間の整数であり、ｘは、工程（２）、（５）、（６）、および（９）で同じ整数である。
合成方法のバージョン５と同様に、バージョン５に基づく変形例の方法では、ユニバーサルヌクレオチドが工程（１）および（２）の間、足場ポリヌクレオチドにおける位置ｎ＋２（または特定の変形例の方法によってはｎ＋２＋ｘ）を占めるのに対し、ユニバーサルヌクレオチドは、同じ合成サイクルにおいて連結ポリヌクレオチドにおける位置ｎ＋３（または特定の変形例の方法によってはｎ＋３＋ｘ）を占める。これは、工程（５）で、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドに、その合成サイクルでのその付加に続いて、所定の配列のヌクレオチドがここで提供され、連結ポリヌクレオチドに、所定の配列のヌクレオチドとパートナーを組むヌクレオチドが提供されるためであり、さらに、本明細書で定義されるように、「ｎ」は常に、そのサイクルに組み込まれる所定の配列のヌクレオチドによって占められる（または占められることになる）合成鎖のヌクレオチド位置を指すか、または支持鎖におけるその反対のヌクレオチド位置を指すためである。したがって、任意の所与の合成サイクルの終了時に、連結工程（５）の直後に、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置は、ｎ＋３（またはｎ＋３＋ｘ）となり、ｎ＋２（または相応して、ｎ＋２＋ｘから）から移動し、工程（１）でユニバーサルヌクレオチドが占める位置となる。連結工程（５）の生産物（図５で「連結生産物」と標識された構造に対応する）は、次の合成サイクルで使用するための足場ポリヌクレオチドとなる。連結生産物が次の合成サイクルで使用するための足場ポリヌクレオチドと見なされる場合、ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置は、ｎ＋３（またはｎ＋３＋ｘ）（５０５を参照されたい）ではなく、ここでも位置ｎ＋２（またはｎ＋２＋ｘ）（５０６を参照されたい）と呼ばれる。したがって、合成方法のバージョン５の変形例では、任意の所与の合成サイクルの開始時にユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置（５０１、５０６などを参照されたい）は、常に位置ｎ＋２（またはｘが１～１０以上の整数である、特定の変形例の方法に応じてｎ＋２＋ｘ）であり、そのサイクルで新たに組み込まれるヌクレオチドは、常にｎと呼ばれる位置を占める。
以下の実施例は、本発明によるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを合成するための方法、ならびにその方法において使用される例示的な構築物の支持を提供する。実施例は本発明を限定しない。
実施例１３以外に、以下の実施例は、本発明による合成方法に関連するが、その範囲内にない反応スキームによる合成方法を説明する。
実施例は、足場ポリヌクレオチドの合成鎖への所定の配列のヌクレオチドの付加、ユニバーサルヌクレオチドによって定義される切断部位での足場ポリヌクレオチドの切断、ならびに所定の配列の付加されたヌクレオチドのパートナーヌクレオチド、および次の合成サイクルで使用するための切断部位の作成に使用するための新たなユニバーサルヌクレオチドを含む連結ポリヌクレオチドの連結の工程を含む合成反応を行う能力を示す。本発明の方法は、これらの工程を修正された内容で組み込む。したがって、実施例１３以外に、以下の実施例は、本明細書で定義される本発明の方法の例示的な支持を提供する。実施例１３は、本発明の方法、例えば、本発明の合成方法のバージョン１、２、および４（それぞれ図１、２、および４）による組み込み工程を使用した、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｘ ＤＮＡポリメラーゼによる３’－Ｏ修飾－ｄＮＴＰの組み込みに関するデータを提供する。
以下の実施例および対応する図１２～５０では、合成方法の「バージョン１、２、および３」または「バージョン１、２、または３の化学」などへの言及は、それぞれ図６、７、および８に記載される反応の概略図に従って解釈されるべきであり、図１～５のうちのいずれかに示される反応の概略図または本明細書の同じ説明には従わない。実施例１３および図５１は、本発明の合成方法に従って解釈されるべきである。特に、本発明１、２、および４の合成方法ならびに図１、２、および４に示される関連する反応の概略図、より具体的には、そのような方法の組み込み工程３による。
実施例１．ヘルパー鎖の不在下での合成。
この実施例は、４つの工程：部分二本鎖ＤＮＡ上への３’－Ｏ－修飾ｄＮＴＰの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第１の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシンと反対で起こる。
工程１：組み込み
第１の工程は、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素的組み込みによるオリゴヌクレオチドへの３’－Ｏ－保護一塩基の制御された付加を記載する（図１２ａ）。
材料および方法
材料
１．Ｊｉａｎ Ｗｕ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８のＰｈＤ論文に記載されるプロトコルに従って、３’－Ｏ－修飾ｄＮＴＰを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開：Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊｕｌｉｅｓｔａ Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｅｍｐｌａｔｅ－Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｏｒ Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ＵＳ２０１６／０１０８３８２Ａ１にも記載されている。
２．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（図１２ｈ）。原液を１００μＭの濃度で調製した。
３．３－Ｏ－修飾ｄＮＴＰを組み込む能力が増強された、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼを使用した。しかしながら、修飾ｄＮＴＰを組み込むことができる任意のＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。
２種類の可逆的ターミネーターを試験した。
方法
１．２μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１２．２５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）と混合した。
２．０．５μｌの１０μＭプライマー（合成鎖）（５ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号１、図１２ｈ）および０．７５μｌの１０μＭ鋳型（支持鎖）（６ｐｍｏｌ、１．５当量）（配列番号２、図１２ｈ）を反応混合物に加えた。
３．３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。しかしながら、修飾ｄＮＴＰを組み込むことができる任意のＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。
５．反応物を６５℃で２０分間インキュベートした。
６．ＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を停止させた。
７．反応物を、ＴＢＥ緩衝液を含むポリアクリルアミドゲル（１５％）上で分離し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌの反応混合物を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の５μｌのＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）に加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して５分間９５℃まで加熱した。
２．次に、５μｌの試料を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含んだ１５％のＴＢＥ－尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ－ｃｅｌｌ ｓｕｒｅ ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
４．ゲルを、Ｃｙ３ ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ ｌａｂ ２．０プラットフォーム上で実施した。
結果
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ製のカスタマイズされて操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼは、ユニバーサルヌクレオチド、例えばノシンと反対に３’－Ｏ－修飾－ｄＮＴＰを組み込むことができる効率的なＤＮＡポリメラーゼである（図１２ｂ～ｃ）。
イノシンと反対の効率的な組み込みは、６５℃の温度で起こった（図１２ｄ～ｅ）。
イノシンと反対の３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰの組み込みは、Ｍｎ２＋イオンの存在を必要とする（図１２ｆ～ｇ）。成功した転化は、図１２ｃ、ｅ、ｇ、およびｈにおいて太字でマークされている。
結論
イノシンと反対の３－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰの組み込みは、Ｍｎ２＋イオンの存在下で６５℃の温度で、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ製のカスタマイズされて操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼを使用して特に高い効率で達成され得る。
工程２：切断
第２の工程は、ｈＡＡＧ／Ｅｎｄｏ ＶＩＩＩまたはｈＡＡＧ／化学塩基のいずれかによるポリヌクレオチドの２工程切断を記載する（図１３ａ）。
材料および方法
材料
１．実施例１で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した（配列については図１３（ｅ）の表を参照されたい）。
２．滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
方法
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の切断反応を実施した。
１．ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、４１μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。
２．次に、５μｌの１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ（登録商標）反応緩衝液ＮＥＢ（２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ８．８）を同じエッペンドルフチューブに加えた。
３．各１μｌのオリゴヌクレオチド（図１３ｅ）、鋳型（配列番号３）または任意の蛍光タグ付きの長オリゴ鎖、Ｔを有するプライマー（配列番号４）、および対照（配列番号５）を全て５ｐｍｏｌで同じチューブに加えた。
４．１μｌのヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）ＮＥＢ（１０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
５．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。
６．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
周囲条件下での精製試料混合物を以下に概説されたプロトコルを使用して精製した。
１．５００μｌの緩衝液ＰＮＩ ＱＩＡＧＥＮ（５Ｍの塩化グアニジニウム）を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
２．混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
３．遠心分離後、フロースルーを廃棄し、７５０μｌの緩衝液ＰＥ ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５および８０％のエタノール）をスピンカラムに加え、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
４．フロースルーを廃棄し、スピンカラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して、残留ＰＥ緩衝液を除去した。
５．次に、スピンカラムを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。
６．ＤＮＡ溶出について、５０μｌの緩衝液ＥＢ ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）をカラム膜の中央に加え、室温で１分間放置した。
７．次に、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。溶出したＤＮＡ濃度を測定し、その後の使用のために－２０℃で保存した。
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
３．２μｌの緩衝液ＥＢ ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
生成された脱塩基部位の切断を以下の手順を使用して実施した。
１．２μｌ（１０～１００ｎｇ／μｌ）のＤＮＡを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加えた。
２．４０μｌ（０．２Ｍ）のＮａＯＨまたは１．５μｌのＥｎｄｏ ＶＩＩＩ ＮＥＢ（１０単位／μｌ）および５μｌの１０×反応緩衝液ＮＥＢ（１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、７５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２５℃でｐＨ８）も同じチューブに加え、再懸濁して１３０００ｒｐｍで５秒間遠心分離することによって穏やかに混合した。
３．得られた混合物をＮａＯＨ処理試料について室温で５分間インキュベートし、その間にＥｎｄｏ ＶＩＩＩ反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。
４．インキュベーション時間が経過した後、上記に概説されるような精製プロトコルの工程１～７を使用して、反応混合物を精製した。
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌのＤＮＡおよびＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモブロック（エッペンドルフ）を使用して２分間９５℃まで加熱した。
２．次に、ＤＮＡ混合物を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含んだ１５％のＴＢＥ－尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ－ｃｅｌｌ ｓｕｒｅ ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
４．ゲル中のＤＮＡの検出および可視化は、Ｃｙ３ ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）で実施した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ ｌａｂ ２．０プラットフォーム上で実施した。
結果および結論
ヘルパー鎖によらない切断反応は、約７％：９３％の切断対未切断ＤＮＡ比の低い収率パーセンテージを示した（図１３ｂ～ｄ）。
切断結果は、この特定の実施例において、使用された特定の試薬に基づいて、陽性対照と比較して、ヘルパー鎖の不在下で低い収率の切断ＤＮＡが得られることを示した。加えて、脱塩基部位の切断のための化学塩基の使用は、ＥｎｄｏＶＩＩＩ切断と比較して時間がかからなかった。
工程３：連結
第３の工程は、ヘルパー鎖の不在下でのＤＮＡリガーゼとのポリヌクレオチドの連結を記載する。概略図を図１４に示す。
材料および方法
材料
１．実施例１で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した（配列については図１４ｃの表を参照されたい）。
２．滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
方法
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の連結反応を実施した。
１．ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、１６μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。
２．次に、１０μｌの２×Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ緩衝液ＮＥＢ（１３２ｍＭのトリス－ＨＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのジチオトレイトール、２ｍＭのＡＴＰ、１５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）および２５℃でｐＨ７．６）を同じエッペンドルフチューブに加えた。
３．各１μｌのオリゴヌクレオチド（図１４ｃ）、ＴＡＭＲＡまたは任意の蛍光タグ付きリン酸鎖（配列番号７）、Ｔを有するプライマー（配列番号８）、およびイノシン鎖（配列番号９）を全て５ｐｍｏｌで同じチューブに加えた。
４．１μｌのＱｕｉｃｋ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（４００単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
５．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することにより穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、室温で２０分間インキュベートした。
６．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、ＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を終了させた。
７．上記に記載されるような精製工程１～７に概説されるプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
３．２μｌの緩衝液ＥＢ ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ ｏｎｅをブランクにし、次に、ブランキングの後に工程２を繰り返した。
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
５．精製されたＤＮＡをポリアクリルアミドゲルに流し、上記に記載される工程５～８の手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
結果および結論
この特定の実施例において、使用される特定の試薬に基づいて、ヘルパー鎖の不在下で室温（２４℃）でのＤＮＡリガーゼ、この特定の場合はクイックＴ４ ＤＮＡリガーゼとのオリゴヌクレオチドの連結は、低減された量の連結生産物をもたらす（図１４ｂ）。
実施例２．ヘルパー鎖によるバージョン１の化学。
この実施例は、４つの工程：ニック部位からの３’－Ｏ－修飾ｄＮＴＰの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第１の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシンと反対で起こる。方法は、連結および切断工程の効率を改善するヘルパー鎖を使用する。
工程１：組み込み
第１の工程は、ＤＮＡポリメラーゼを使用した酵素的組み込みによるオリゴヌクレオチドへの３’－Ｏ－保護一塩基の制御された付加を記載する（１５ａ）。
材料および方法
材料
１．Ｊｉａｎ Ｗｕ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８のＰｈＤ論文に記載されるプロトコルに従って、３’－Ｏ－修飾ｄＮＴＰを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開：Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊｕｌｉｅｓｔａ Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｅｍｐｌａｔｅ－Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｏｒ Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ＵＳ２０１６／０１０８３８２Ａ１にも記載されている。
２．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。原液を１００μＭの濃度で調製した。オリゴヌクレオチドを図１５ｂに示す。
３．３－Ｏ－修飾ｄＮＴＰを組み込む能力が増強された、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼを使用した。
２種類の可逆的ターミネーターを試験した。
方法
１．２μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４を、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１０．２５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）と混合した。
２．０．５μｌの１０μＭプライマー（５ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号１０、図１５（ｂ）の表）、０．７５μｌの１０μＭ鋳型（６ｐｍｏｌ、１．５当量）（配列番号１１、図１５（ｂ）の表）、２μｌの１０μＭのヘルパー鎖（配列番号１２、図１５（ｂ）の表）を反応混合物に加えた。
３．３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
５．反応物を６５℃で２０分間インキュベートした。
６．ＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を停止させた。
７．反応物をポリアクリルアミドゲル（１５％）ＴＢＥ緩衝液上で分離し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌの反応混合物を、滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の５μｌのＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）に加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して５分間９５℃まで加熱した。
２．次に、５μｌの試料を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含んだ１５％のＴＢＥ－尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ－ｃｅｌｌ ｓｕｒｅ ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
４．ゲルを、Ｃｙ３ ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ ｌａｂ ２．０プラットフォーム上で実施した。
組み込み工程は、上記に記載されるプロトコルに従って研究することができる。
工程２：切断
第２の工程は、ｈＡＡＧ／Ｅｎｄｏ ＶＩＩＩまたはｈＡＡＧ／化学塩基（×２）のいずれかによるポリヌクレオチドの２工程切断を記載する（図１６ａ）。
材料および方法
材料
１．実施例２で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した（配列については図１６ｆを参照されたい）。
２．滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
方法
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の切断反応を実施した。
１．ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、４１μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。
２．５μｌの１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ（登録商標）反応緩衝液ＮＥＢ（２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ８．８）を同じエッペンドルフチューブに加えた。
３．各１μｌのオリゴヌクレオチド（図１６ｆ）、鋳型（配列番号１３）または任意の蛍光タグ付き長オリゴ鎖、Ｔを有するプライマー（配列番号１４）、対照（配列番号１５）、およびヘルパー鎖（配列番号１６）を全て５ｐｍｏｌで同じチューブに加えた。
４．１μｌのヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）ＮＥＢ（１０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
５．代替塩基を使用する反応では、１μｌのヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）ＮＥＢ（１００単位／μｌ）を加えた。
６．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。
７．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
周囲条件下での精製試料混合物を以下に概説されたプロトコルを使用して精製した。
１．５００μｌの緩衝液ＰＮＩ ＱＩＡＧＥＮ（５Ｍの塩化グアニジニウム）を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
２．混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
３．遠心分離後、フロースルーを廃棄し、７５０μｌの緩衝液ＰＥ ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５および８０％のエタノール）をスピンカラムに加え、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
４．フロースルーを廃棄し、スピンカラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して、残留ＰＥ緩衝液を除去した。
５．次に、スピンカラムを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。
６．ＤＮＡ溶出のために、５０μｌの緩衝液ＥＢ ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）をカラム膜の中央に加え、室温で１分間放置した。
７．次に、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。溶出したＤＮＡ濃度を測定し、その後の使用のために－２０℃で保存した。
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
３．２μｌの緩衝液ＥＢ ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
以下の手順を使用して、生成された脱塩基部位の切断を実施した。
１．２μｌ（１０～１００ｎｇ／μｌ）のＤＮＡを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加えた。
２．４０μｌ（０．２Ｍ）のＮａＯＨまたは１．５μｌのＥｎｄｏ ＶＩＩＩ ＮＥＢ（１０単位／μｌ）および５μｌの１０×反応緩衝液ＮＥＢ（１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、７５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２５℃でｐＨ８）も同じチューブに加え、再懸濁して１３０００ｒｐｍで５秒間遠心分離することによって穏やかに混合した。
３．得られた混合物を、０．２ＭのＮａＯＨ処理試料について室温で５分間インキュベートし、その間にＥｎｄｏ ＶＩＩＩ反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。
４．インキュベーション時間が経過した後、反応混合物を上述の精製プロトコルの工程１～７を使用して精製した。
以下の手順を使用して、代替の塩基性化学物質を使用して生成された脱塩基部位の切断を実施した。
１．１μｌ（１０～１００ｎｇ／μｌ）のＤＮＡを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加えた。次に、酢酸溶液シグマ（９９．８％）で、室温でｐＨ７．４に緩衝化された２μｌのＮ，Ｎ’ジメチルエチレンジアミンシグマ（１００ｍＭ）を同じチューブに加えた。
２．２０μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）をチューブに加え、再懸濁して１３０００ｒｐｍで５秒間の遠心分離することによって穏やかに混合した。
３．得られた試料を３７℃で２０分間インキュベートした。
４．インキュベーション時間が経過した後、反応混合物を上述の精製プロトコルの工程１～７を使用して精製した。
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌのＤＮＡおよびＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモブロック（エッペンドルフ）を使用して２分間９５℃まで加熱した。
２．次に、ＤＮＡ混合物を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含んだ１５％のＴＢＥ－尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ－ｃｅｌｌ ｓｕｒｅ ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
４．ゲル中のＤＮＡの検出および可視化は、Ｃｙ３ ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）で実施した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ ｌａｂ ２．０プラットフォーム上で実施した。
結果
ｈＡＡＧ ＤＮＡグリコシラーゼによるユニバーサルヌクレオチド、この場合はイノシンを含む切断部位での切断効率は、ヘルパー鎖の不在下での１０％からヘルパー鎖の存在下での５０％まで有意に増加した（図１６ｂ）。ｈＡＡＧおよびエンドヌクレアーゼＶＩＩＩは、ｈＡＡＧおよびＮａＯＨ（５０％）よりも低い効率（１０％）でイノシンを切断する。ニックの入ったＤＮＡを使用した記載されるシステムでは、０．２ＭのＮａＯＨを使用した化学的切断が、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩよりもＡＰ部位の切断に好ましいことが示された（図１６ｃ）。中性ｐＨでの穏やかなＮ，Ｎ’－ジメチルエチレンジアミンは、０．２ＭのＮａＯＨのような脱塩基部位を切断するのに高い効率を有し、それゆえ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩおよびＮａＯＨと比較して好ましい（図１６ｄ～ｅ）。
結論
イノシンを含むＤＮＡの切断について、３つの方法を評価した。１つの完全酵素法－ｈＡＡＧ／エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ならびに化学的および酵素的切断を組み合わせた２つの方法－ｈＡＡＧ／ＮａＯＨおよびｈＡＡＧ／ジメチルエチルアミンを、実施例２においてＤＮＡ切断について研究した。
ｈＡＡＧ／ＮａＯＨの結果は、ヘルパー鎖の不在下（１０％）と比較して、ヘルパー鎖の存在下で切断ＤＮＡのはるかに高い収率（５０％）を示した。これらの特定の実施例では、使用される特定の試薬に基づいて、ヘルパー鎖はＤＮＡ切断の収率を増加させる。
ＮａＯＨに対する代替物としてエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを使用した酵素的切断は、ヘルパー鎖の存在下でのＮａＯＨ（５０％）と比較して、効率が悪かった（１０％）。
代替の穏やかな化学塩基Ｎ，Ｎ’－ジメチルエチレンジアミンを含めると、ＮａＯＨと同じくらい効率的にＡＰ部位の高い切断効率が得られ、１０×ｈＡＡＧ酵素の付加と一緒に、切断ＤＮＡが有意に増加した（図１６ｅを参照されたい）。
工程３：連結
第３の工程は、ヘルパー鎖の存在下でのポリヌクレオチドとＤＮＡリガーゼとの連結を記載する。概略図を図１７ａに示す。
材料および方法
材料
１．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した（配列については図１７ｄを参照されたい）。
２．滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
方法
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の連結反応を実施した。
１．ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、１６μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。
２．次に、１０μｌの２×Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ緩衝液ＮＥＢ（１３２ｍＭのトリス－ＨＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのジチオトレイトール、２ｍＭのＡＴＰ、１５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）および２５℃でｐＨ７．６）を同じエッペンドルフチューブに加えた。
３．各１μｌのオリゴヌクレオチド（図１７ｄ）、ＴＡＭＲＡまたは任意の蛍光タグ付きリン酸鎖（配列番号１８）、Ｔを有するプライマー（配列番号１９）およびイノシン鎖（配列番号２０）およびヘルパー鎖（配列番号２１）を全て５ｐｍｏｌで同じチューブに加えた。
４．１μｌのＱｕｉｃｋ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（４００単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
５．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、２０分間室温でインキュベートした。
６．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、ＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を終了させた。
７．上記に記載されるような精製工程１～７に概説されるプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
３．２μｌの緩衝液ＥＢ ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
５．精製されたＤＮＡをポリアクリルアミドゲルに流し、上記の工程５～８の手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
結果および結論
この特定の実施例では、使用される特定の試薬に基づいて、ヘルパー鎖の不在下では連結活性の低下が観察され（図１７ｂ）、ヘルパー鎖の存在下では連結が高い効率で進行し（図１７ｃ）、生産物が高効率で形成された。
実施例３．ヘルパー鎖によるバージョン２化学
この実施例は、４つの工程：部分二本鎖ＤＮＡ上への３’－Ｏ－修飾ｄＮＴＰの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、組み込みの第１の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシンに隣接して支持鎖中に位置付けられた天然に相補的なヌクレオチドと反対で起こる。
工程１：組み込み
材料および方法
材料
第１の工程は、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素的組み込みによるオリゴヌクレオチドへの３’－Ｏ－保護一塩基の制御された付加を記載する（図１８ａ）。
１．Ｊｉａｎ Ｗｕ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８のＰｈＤ論文に記載されるプロトコルに従って、３’－Ｏ－修飾ｄＮＴＰを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開：Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊｕｌｉｅｓｔａ Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｅｍｐｌａｔｅ－Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｏｒ Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ＵＳ２０１６／０１０８３８２Ａ１にも記載されている。
２．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（図１８ｊ）。原液を１００μＭの濃度で調製する。
３．３－Ｏ－修飾ｄＮＴＰを組み込む能力が増強された、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼを使用した。
全てのｄＮＴＰの３’－Ｏ－アジドメチル可逆的ターミネーターを、組み込みについて独立して試験した。
方法
１．２μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１２．２５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）と混合した。
２．０．５μｌの１０μＭプライマー（５ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号２２、図１８ｊ）および０．７５μｌの１０μＭ鋳型－Ａ／Ｇ／Ｔ／Ｃ（６ｐｍｏｌ、１．５当量）（配列番号２３～２６、図１８ｊ）および１μＬの１０μＭのヘルパー鎖Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ（１０ｐｍｏｌ、２当量）（配列番号２７～３０、図１８ｊ）を反応混合物に加えた。
３．３’－Ｏ修飾－ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＡＴＰ／ｄＧＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
５．反応物を６５℃で２０分間インキュベートした。
６．ＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を停止させた。
７．反応物をポリアクリルアミドゲル（１５％）ＴＢＥ緩衝液上で分離し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌの反応混合物を、滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の５μｌのＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）に加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して５分間９５℃まで加熱した。
２．次に、５μｌの試料を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含んだ１５％のＴＢＥ－尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ－ｃｅｌｌ ｓｕｒｅ ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
４．ゲルを、Ｃｙ３ ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ ｌａｂ ２．０プラットフォーム上で実施した。
結果および結論
Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼを使用した３－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰの組み込み時の温度の評価に関して、結果は、連結のためのヘルパー鎖の存在下での３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰの組み込みが５分後に９０％に達することを示す。３７℃および４７℃で２０分後には、１０％のプライマーが未伸長のままである。
２ｍＭのＭｎ２＋イオンおよび３７℃の温度でのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼは、ヘルパー鎖（前のサイクルによる連結工程からの）の存在下で高い効率でＤＮＡ中の相補的塩基と反対に３’－Ｏ－修飾－ｄＮＴＰを組み込むための良好な条件を提供する。
工程２：切断
第２の工程は、エンドヌクレアーゼＶによるポリヌクレオチドの１工程切断を記載する（図１９ａ）。
材料および方法
材料
１．実施例３で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した（配列については図１９ｄの表を参照されたい）。
２．滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
方法
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の切断反応を実施した。
１．ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、４１μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。
２．次に、５μｌの１０×Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）ＮＥＢ（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス－酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）を同じエッペンドルフチューブに加えた。
３．各１μｌのオリゴヌクレオチド（図１９ｄ）、鋳型（配列番号３１）または任意の蛍光タグ付き長オリゴ鎖、Ｔを有するプライマー（配列番号３２）および対照（配列番号３３）およびヘルパー鎖（配列番号３４）を全て５ｐｍｏｌで同じチューブに加えた。
４．１μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ Ｖ）ＮＥＢ（１０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
５．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。
６．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
試料混合物を以下に概説されたプロトコルを使用して精製した。
１．５００μｌの緩衝液ＰＮＩ ＱＩＡＧＥＮ（５Ｍの塩化グアニジニウム）を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
２．混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
３．遠心分離後、フロースルーを廃棄し、７５０μｌの緩衝液ＰＥ ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５および８０％のエタノール）をスピンカラムに加え、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
４．フロースルーを廃棄し、スピンカラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して、残留ＰＥ緩衝液を除去した。
５．次に、スピンカラムを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。
６．ＤＮＡ溶出のために、５０μｌの緩衝液ＥＢ ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）をカラム膜の中央に加え、室温で１分間放置した。
７．次に、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。溶出したＤＮＡ濃度を測定し、その後の使用のために－２０℃で保存した。
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
３．２μｌの緩衝液ＥＢ ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌのＤＮＡおよびＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモブロック（エッペンドルフ）を使用して２分間９５℃まで加熱した。
２．次に、ＤＮＡ混合物を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含んだ１５％のＴＢＥ－尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ－ｃｅｌｌ ｓｕｒｅ ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
４．ゲル中のＤＮＡの検出および可視化は、Ｃｙ３ ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉｄｏｃ ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）で実施した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ ｌａｂ ２．０プラットフォーム上で実施した。
結果および結論
実施例３からの切断結果は、ヘルパー鎖の存在下または不在下でエンドヌクレアーゼＶを用いて有意に高収率の切断ＤＮＡを得ることができることを示した（図１９ｃ）。
工程３：連結
第３の工程は、ヘルパー鎖の存在下でのポリヌクレオチドとＤＮＡリガーゼとの連結を記載する。概略図を図２０ａに示す。
材料および方法
材料
１．実施例３で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した（配列については図２０ｂの表を参照されたい）。
２．滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
方法
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の連結反応を実施した。
１．ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、１６μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。
２．次に、１０μｌの２×Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ緩衝液ＮＥＢ（１３２ｍＭのトリス－ＨＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのジチオスレイトール、２ｍＭのＡＴＰ、１５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）、２５℃でｐＨ７．６）を同じエッペンドルフチューブに加えた。
３．各１μｌのオリゴヌクレオチド（図２０ｂ）、ＴＡＭＲＡまたは任意の蛍光タグ付きリン酸鎖（配列番号３５）、Ｔを有するプライマー（配列番号３６）およびイノシン鎖（配列番号３７）およびヘルパー鎖（配列番号３８）を全て５ｐｍｏｌの量を有して同じチューブに加えた。
４．１μｌのＱｕｉｃｋ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（４００単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
５．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、室温で２０分間インキュベートした。
６．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、ＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を終了させた。
７．上記に記載されるような精製工程１～７に概説されるプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
３．２μｌの緩衝液ＥＢ ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
５．精製されたＤＮＡをポリアクリルアミドゲルに流し、上記に記載される工程５～８の手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌのＤＮＡおよびＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモブロック（エッペンドルフ）を使用して２分間９５℃まで加熱した。
２．次に、ＤＮＡ混合物を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含んだ１５％のＴＢＥ－尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ－ｃｅｌｌ ｓｕｒｅ ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
４．ゲル中のＤＮＡの検出および可視化は、Ｃｙ３ ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）で実施した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ ｌａｂ ２．０プラットフォーム上で実施した。
工程４：脱保護
Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼによる３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＮＴＰの組み込みによってＤＮＡに導入された３’－Ｏ－アジドメチル基を担持するＤＮＡモデルについて、脱保護工程（図２１ａ）を研究した。脱保護をトリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）によって実施し、全ての天然ｄＮＴＰの混合物を精製された脱保護ＤＮＡの溶液に加えたときの伸長反応によってモニタリングした。
材料および方法
材料
１．実施例３で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した（配列については図２１ｉを参照されたい）。
２．滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
３．酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓから購入した。
方法
１．２μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１２．２５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）と混合した。
２．１μｌの１０μＭプライマー（１０ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号３９、図２１ｉ）および１．５μｌのいずれかの１０μＭ鋳型－Ａ／Ｇ／Ｔ／Ｃ（１５ｐｍｏｌ、１．５当量）（配列番号４０～４３、図２１ｉ）を反応混合物に加えた。
３．３’－Ｏ修飾－ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＡＴＰ／ｄＧＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
５．反応物を３７℃で５分間インキュベートした。
６．４μＬの試料を取り出し、０．５μｌの５ｍＭのｄＮＴＰ混合物と混合し、制御反応のために１０分間反応させた。
７．ｐＨ７．４の１Ｍのトリス緩衝液中の４０μＬの５００ｍＭのＴＣＥＰを反応混合物に加え、３７℃で１０分間反応させた。
８．２０μＬの１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液によって溶出するＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
９．１μＬの５ｍＭのｄＮＴＰ混合物および１μＬのＤｅｅｐＶｅｎｔ（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼを精製された反応混合物に加え、１０分間反応させた。
１０．ＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を停止させた。
１１．反応物をポリアクリルアミドゲル（１５％）ＴＢＥ緩衝液上で分離し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
結果および結論
５０ｍＭのＴＣＥＰは、０．２μＭのＤＮＡモデル上で３’－Ｏ－アジドメチル基を高い効率で切断するのに十分ではなかった（図２１ｈ）。対照的に、３００ｍＭのＴＣＥＰは、０．２μＭのＤＮＡモデル上で３’－Ｏ－アジドメチル基を９５％の効率で首尾よく切断した（図２１ｈ）。
実施例４．二重ヘアピンモデルによるバージョン２化学
この実施例は、２つのヘアピンモデル上での４つの工程：ニック部位からの３’－Ｏ－修飾ｄＮＴＰの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第１の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシンに隣接する支持鎖中に位置付けられた天然に相補的なヌクレオチドと反対で起こる。
工程１：組み込み
第１の工程は、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素的組み込みによるオリゴヌクレオチドへの３’－Ｏ－保護一塩基の制御された付加を記載する（図２２ａ）。
材料および方法
材料
１．Ｊｉａｎ Ｗｕ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８のＰｈＤ論文に記載されるプロトコルに従って、３’－Ｏ－修飾ｄＮＴＰを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開：Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊｕｌｉｅｓｔａ Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｅｍｐｌａｔｅ－Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｏｒ Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ＵＳ２０１６／０１０８３８２Ａ１にも記載されている。
２．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（図２２ｃ）。原液を１００μＭの濃度で調製した。
３．３－Ｏ－修飾ｄＮＴＰを組み込む能力が増強された、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼを使用した。
３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰを組み込みについて試験した。
方法
１．２μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４を、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１０．２５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）と混合した。
２．０．５μｌの１０μＭヘアピンオリゴヌクレオチド（５ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号４４、図２２ｃ）を反応混合物に加えた。
３．３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
５．反応物を６５℃で２０分間インキュベートした。
６．ＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を停止させた。
７．反応物をポリアクリルアミドゲル（１５％）ＴＢＥ緩衝液上で分離し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌの反応混合物を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の５μｌのＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）に加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して５分間９５℃まで加熱した。
２．次に、５μｌの試料を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含んだ１５％のＴＢＥ－尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ－ｃｅｌｌ ｓｕｒｅ ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
４．ゲルを、Ｃｙ３ ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ ｌａｂ ２．０プラットフォーム上で実施した。
結果
ＤＮＡポリメラーゼは、ヘアピン構築物中のその天然に相補的な塩基と反対に３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰを組み込む。
工程２：切断
第２の工程は、この特定の場合におけるエンドヌクレアーゼＶによるヘアピンモデルの１工程切断を記載する（図２３ａ）。
材料および方法
材料
１．実施例４で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した（配列については図２３ｃを参照されたい）。
２．滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
方法
以下の手順を使用して、ヘアピンオリゴヌクレオチド上の切断反応を実施した。
１．ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、４３μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。
２．次に、５μｌの１０×Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）ＮＥＢ（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス－酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）を同じエッペンドルフチューブに加えた。
３．５ｐｍｏｌの量を有する１μｌのヘアピンオリゴヌクレオチド（配列番号４５、図２３ｃ）を同じチューブに加えた。
４．１μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ Ｖ）ＮＥＢ（３０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
５．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。
６．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
試料混合物を以下に概説されたプロトコルを使用して精製した。
１．５００μｌの緩衝液ＰＮＩ ＱＩＡＧＥＮ（５Ｍの塩化グアニジニウム）を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
２．混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
３．遠心分離後、フロースルーを廃棄し、７５０μｌの緩衝液ＰＥ ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５および８０％のエタノール）をスピンカラムに加え、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
４．フロースルーを廃棄し、スピンカラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して、残留ＰＥ緩衝液を除去した。
５．次に、スピンカラムを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。
６．ＤＮＡ溶出のために、５０μｌの緩衝液ＥＢ ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）をカラム膜の中央に加え、室温で１分間放置した。
７．次に、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。溶出したＤＮＡ濃度を測定し、その後の使用のために－２０℃で保存した。
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
３．２μｌの緩衝液ＥＢ ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌのＤＮＡおよびＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して２分間９５℃まで加熱した。
２．次に、ＤＮＡ混合物を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含んだ１５％のＴＢＥ－尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ－ｃｅｌｌ ｓｕｒｅ ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
４．ゲル中のＤＮＡの検出および可視化は、Ｃｙ３ ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）で実施した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ ｌａｂ ２．０プラットフォーム上で実施した。
結果および結論
実施例４からの切断結果は、エンドヌクレアーゼＶを用いて３７℃で著しく高収率の消化されたヘアピンＤＮＡが得られることを示した（図２３ｂ）。
工程３：連結
第３の工程は、ヘアピンモデルとＤＮＡリガーゼとの連結を記載する。概略図を図２４ａに示す。
材料および方法
材料
１．実施例４で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈによって合成した（配列については図２４ｃを参照されたい）。
２ 滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを１００μＭのストック濃度に希釈した。
方法
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の連結反応を実施した。
１．ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して、１μｌ（５ｐｍｏｌ）のＴＡＭＲＡまたは任意の蛍光タグ付きリン酸ヘアピンオリゴ（配列番号４６）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。
２．次に、１５μｌ（１００ｐｍｏｌ）のイノシン含有ヘアピン構築物（配列番号４７）を同じチューブに加え、ピペットで３秒間再懸濁することによって穏やかに混合した。
３．４０μｌの平滑／ＴＡ ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（１８０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
４．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、室温で２０分間インキュベートした。
５．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、ＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を終了させた。
６．上記の精製工程１～７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
３．２μｌの緩衝液ＥＢ ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
５．精製されたＤＮＡをポリアクリルアミドゲルに流し、上記に記載されるような工程５～８の手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌのＤＮＡおよびＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して２分間９５℃まで加熱した。
２．次に、ＤＮＡ混合物を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含んだ１５％のＴＢＥ－尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ－ｃｅｌｌ ｓｕｒｅ ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
４．ゲル中のＤＮＡの検出および可視化は、Ｃｙ３ ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）で実施した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ ｌａｂ ２．０プラットフォーム上で実施した。
結果
ヘルパー鎖の存在下で室温（２４℃）での平滑／ＴＡ ＤＮＡリガーゼとヘアピンオリゴヌクレオチドとの連結は、高収率の連結生産物をもたらした。１分後の連結ヘアピンオリゴヌクレオチドは、約８５％の比率で、高収率の連結ＤＮＡ生産物を示した。２分後の連結ヘアピンオリゴヌクレオチドは、約８５％の比率で、高収率の連結ＤＮＡ生産物を示した。３分後の連結ヘアピンオリゴヌクレオチドは、約８５％の比率で、高収率の連結ＤＮＡ生産物を示した。４分後の連結ヘアピンオリゴヌクレオチドは、約＞８５％の比率で、高収率の連結ＤＮＡ生産物を示した（図２４ｂ）。
実施例５．バージョン２化学－二重ヘアピンモデルの完全サイクル。
この実施例は、二重ヘアピンモデル上での４つの工程：ニック部位からの３’－Ｏ－修飾ｄＮＴＰの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第１の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシンに隣接して支持鎖中に位置付けられた天然に相補的なヌクレオチドと反対で起こる。ヘアピンの一端は付着アンカーとして機能する。
方法は、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素的組み込み、その後のイノシン切断、連結、および脱保護によるオリゴヌクレオチドへの３’－Ｏ－保護一塩基の制御された付加によって開始する（図２５ａ）。
材料および方法
材料
１．Ｊｉａｎ Ｗｕ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８のＰｈＤ論文に記載されるプロトコルに従って、３’－Ｏ－修飾ｄＮＴＰを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開：Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊｕｌｉｅｓｔａ Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｅｍｐｌａｔｅ－Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｏｒ Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ＵＳ２０１６／０１０８３８２Ａ１にも記載されている。
２．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（図２５ｃ）。原液を１００μＭの濃度で調製する。
３．３－Ｏ－修飾ｄＮＴＰを組み込む能力が増強された、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼを使用した。
３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰを組み込みについて試験した。
方法
１．２μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１２．５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）と混合した。
２．２μｌの１０μＭの二重ヘアピンモデルオリゴヌクレオチド（２０ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号４８、図２５ｃ）を反応混合物に加えた。
３．３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
５．反応物を３７℃で１０分間インキュベートした。
６．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物を加え、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
７．精製工程１～７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
８．２０μｌのＮＥＢ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス－酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
９．１μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ Ｖ）ＮＥＢ（３０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
１０．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。
１１．インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
１２．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、ＴＢＥ緩衝液を使用してポリアクリルアミドゲル（１５％）上で分析し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
１３．上記の精製工程１～７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
１４．２０μｌのＮＥＢ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス－酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
１５．１０μｌの連結のための１００μＭの鎖（１ｎｍｏｌ）（配列番号４９、図２５ｃ）を反応混合物に加えた。
１６．４０μｌの平滑／ＴＡ ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（１８０単位／μｌ）を精製されたＤＮＡ試料に加えた。
１７．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、室温で２０分間インキュベートした。
１８．ｐＨ７．４の１Ｍのトリス緩衝液中の４０μＬの５００ｍＭのＴＣＥＰを反応混合物に加え、３７℃で１０分間反応させた。
１９．２０μＬの１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液によって溶出するＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌの反応混合物を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の５μｌのＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）に加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して５分間９５℃まで加熱した。
２．次に、５μｌの試料を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含んだ１５％のＴＢＥ－尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ－ｃｅｌｌ ｓｕｒｅ ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
４．ゲルを、Ｃｙ３ ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ ｌａｂ ２．０プラットフォーム上で実施した。
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
３．２μｌの緩衝液ＥＢ ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
５．精製されたＤＮＡをポリアクリルアミドゲルに流し、第２節の工程５～８の手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
以下に概説されたプロトコルを使用した各工程後に、試料混合物を精製した。
１．５００μｌの緩衝液ＰＮＩ ＱＩＡＧＥＮ（５Ｍの塩化グアニジニウム）を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
２．混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
３．遠心分離後、フロースルーを廃棄し、７５０μｌの緩衝液ＰＥ ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５および８０％のエタノール）をスピンカラムに加え、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
４．フロースルーを廃棄し、スピンカラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して、残留ＰＥ緩衝液を除去した。
５．次に、スピンカラムを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。
６．ＤＮＡ溶出のために、反応のための２０μｌの適切な緩衝液をカラム膜の中心に加え、室温で１分間放置した。
７．次に、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。溶出したＤＮＡ濃度を測定し、その後の使用のために－２０℃で保存した。
結果
ＤＮＡポリメラーゼは、二重ヘアピン構築物中のその天然に相補的な塩基と反対に３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰを組み込む（図２５ｂ）。
実施例６バージョン２化学－ヘルパー鎖を使用した単一ヘアピンモデルの完全サイクル
この実施例は、単一ヘアピンモデル上での４つの工程：ニック部位からの３’－Ｏ－修飾ｄＮＴＰの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第１の工程は、天然に相補的な塩基と反対で起こる。ＤＮＡ合成は、その過程においてヘルパー鎖を使用する。
方法は、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素的組み込み、その後のイノシン切断、連結、および脱保護によるオリゴヌクレオチドへの３’－Ｏ－保護一塩基の制御された付加によって開始する（図２６ａ）。
材料および方法
材料
１．Ｊｉａｎ Ｗｕ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８のＰｈＤ論文に記載されるプロトコルに従って、３’－Ｏ－修飾ｄＮＴＰを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開：Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊｕｌｉｅｓｔａ Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｅｍｐｌａｔｅ－Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｏｒ Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ＵＳ２０１６／０１０８３８２Ａ１にも記載されている。
２．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（図２６ｂ）。原液を１００μＭの濃度で調製する。
３．３－Ｏ－修飾ｄＮＴＰを組み込む能力が増強された、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼを使用した。
３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰを組み込みについて試験した。
方法
１．２μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１２．５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）と混合した。
２．２μＬの１０μＭの単一ヘアピンモデルオリゴヌクレオチド（２０ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号５０、図２６ｂ）およびヘルパー鎖（３０ｐｍｏｌ、１．５当量）（配列番号５１、図２６ｂ）を反応混合物に加えた。
３．３’－Ｏ修飾－ｄＴＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
５．反応物を３７℃で１０分間インキュベートした。
６．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物を加え、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
７．上記の精製工程１～７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
８．２０μｌのＮＥＢ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス－酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
９．１μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ Ｖ）ＮＥＢ（３０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
１０．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。
１１．インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
１２．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、ＴＢＥ緩衝液を使用してポリアクリルアミドゲル（１５％）上で分析し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
１３．上記の精製工程１～７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
１４．２０μｌのＮＥＢ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス－酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
１５．１０μｌの連結のための１００μＭの鎖（１ｎｍｏｌ）（配列番号５２、図２６ｂ）および１０μｌの連結のための１００μＭのヘルパー鎖（１ｎｍｏｌ）（配列番号５３、図２６ｂ）を反応混合物に加えた。
１６．４０μｌの平滑／ＴＡ ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（１８０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
１７．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、室温で２０分間インキュベートした。
１８．ｐＨ７．４の１Ｍのトリス緩衝液中の４０μＬの５００ｍＭのＴＣＥＰを反応混合物に加え、３７℃で１０分間反応させた。
１９．２０μＬの１×ＮＥＢ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液によって溶出するＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
２０．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、ＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を終了させた。
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌの反応混合物を、滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の５μｌのＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）に加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して５分間９５℃まで加熱した。
２．次に、５μｌの試料を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含む１５％のＴＢＥ－尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ－ｃｅｌｌ ｓｕｒｅ ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
４．ゲルを、Ｃｙ３ ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ ｌａｂ ２．０プラットフォーム上で実施した。
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
３．２μｌの緩衝液ＥＢ ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
５．精製されたＤＮＡをポリアクリルアミドゲルに流し、工程５～８において上記した手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
以下に概説されたプロトコルを使用した各工程後に、試料混合物を精製した。
１．５００μｌの緩衝液ＰＮＩ ＱＩＡＧＥＮ（５Ｍの塩化グアニジニウム）を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
２．混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
３．遠心分離後、フロースルーを廃棄し、７５０μｌの緩衝液ＰＥ ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５および８０％のエタノール）をスピンカラムに加え、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
４．フロースルーを廃棄し、スピンカラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して、残留ＰＥ緩衝液を除去した。
５．次に、スピンカラムを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。
６．ＤＮＡ溶出のために、反応のための２０μｌの適切な緩衝液をカラム膜の中央に加え、室温で１分間放置した。
７．次に、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。溶出したＤＮＡ濃度を測定し、その後の使用のために－２０℃で保存した。
実施例７．バージョン３化学－二重ヘアピンモデルの完全サイクル。
この実施例は、二重ヘアピン構築物モデルについての４つの工程：ニック部位からの３’－Ｏ－修飾ｄＮＴＰの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第１の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシン塩基と反対で起こる。
方法は、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素的組み込み、その後のイノシン切断、連結、および脱保護によるオリゴヌクレオチドへの３’－Ｏ－保護一塩基の制御された付加によって開始する（図２７ａ）。
材料および方法
材料
１．Ｊｉａｎ Ｗｕ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８のＰｈＤ論文に記載されるプロトコルに従って、３’－Ｏ－修飾ｄＮＴＰを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開：Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊｕｌｉｅｓｔａ Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｅｍｐｌａｔｅ－Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｏｒ Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ＵＳ２０１６／０１０８３８２Ａ１にも記載されている。
２．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（図２７ｂ）。原液を１００μＭの濃度で調製する。
３．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼは、３－Ｏ－修飾ｄＮＴＰを組み込む能力を高めた。
３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰを組み込みについて試験した。
方法
１．２μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１２．５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）と混合した。
２．２μｌの１０μＭの二重ヘアピンモデルオリゴヌクレオチド（２０ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号５４、図２７ｂ）を反応混合物に加えた。
３．３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
５．反応物を３７℃で１０分間インキュベートした。
６．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物を加え、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
７．精製工程１～７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
８．２０μｌのＮＥＢ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス－酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
９．１μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ Ｖ）ＮＥＢ（３０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
１０．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。
１１．インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
１２．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、ＴＢＥ緩衝液を使用してポリアクリルアミドゲル（１５％）上で分析し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
１３．上記の精製工程１～７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
１４．２０μｌのＮＥＢ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス－酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
１５．１０μｌの連結のための１００μＭの鎖（１ｎｍｏｌ）（配列番号５５、図２７ｂ）を反応混合物に加えた。
１６．４０μｌの平滑／ＴＡ ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（１８０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
１７．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、室温で２０分間インキュベートした。
１８．ｐＨ７．４の１Ｍのトリス緩衝液中の４０μＬの５００ｍＭのＴＣＥＰを反応混合物に加え、３７℃で１０分間反応させた。
１９．２０μＬの１×ＮＥＢ Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液によって溶出するＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
２０．典型的には、インキュベーション時間が経過した後、ＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を終了させた。
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌの反応混合物を滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の５μｌのＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）に加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して５分間９５℃まで加熱した。
２．次に、５μｌの試料を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含んだ１５％のＴＢＥ－尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ－ｃｅｌｌ ｓｕｒｅ ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａで電気泳動を行った。
４．ゲルを、Ｃｙ３ ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ ｌａｂ ２．０プラットフォーム上で実施した。
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
３．２μｌの緩衝液ＥＢ ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅをブランクにした。次に、ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
５．精製されたＤＮＡをポリアクリルアミドゲルに流し、第２節の工程５～８の手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
以下に概説されたプロトコルを使用した各工程後に、試料混合物を精製した。
１．５００μｌの緩衝液ＰＮＩ ＱＩＡＧＥＮ（５Ｍの塩化グアニジニウム）を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
２．混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
３．遠心分離後、フロースルーを廃棄し、７５０μｌの緩衝液ＰＥ ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５および８０％のエタノール）をスピンカラムに加え、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
４．フロースルーを廃棄し、スピンカラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して、残留ＰＥ緩衝液を除去した。
５．次に、スピンカラムを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。
６．ＤＮＡ溶出のために、反応のための２０μｌの適切な緩衝液をカラム膜の中心に加え、室温で１分間放置した。
７．次に、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。溶出したＤＮＡ濃度を測定し、その後の使用のために－２０℃で保存した。
実施例８バージョン２化学－二重ヘアピンモデルについての完全な２サイクル実験
この実施例は、二重ヘアピンモデル上で４つの工程：ニック部位からの３’－Ｏ－修飾ｄＮＴＰの組み込み、脱保護、切断、および連結を使用したポリヌクレオチドの合成のための完全な２サイクル実験を記載しており、第１の工程は、相補的塩基と反対で起こる。
方法は、図２８ａに示される第１のサイクルの反応の概略図に示されるように、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素的組み込み、その後の脱保護、イノシン切断、および連結によるオリゴヌクレオチドへの３’－Ｏ－保護一塩基の制御された付加によって開始する。図２８ｂは、第２のサイクルの反応の概略図を示す。
材料および方法
材料
１．Ｊｉａｎ Ｗｕ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８のＰｈＤ論文に記載されるプロトコルに従って、３’－Ｏ－修飾ｄＮＴＰを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開：Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊｕｌｉｅｓｔａ Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｅｍｐｌａｔｅ－Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｏｒ Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ＵＳ２０１６／０１０８３８２Ａ１にも記載されている。
２．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（図２８ｄ）。原液を１００μＭの濃度で調製する。
３．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼは、３’－Ｏ－修飾ｄＮＴＰを組み込む能力を高めた。
３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰおよび３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＣＴＰを組み込みのために使用した。
方法
第１のサイクル：
１．２μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１２．５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）と混合した。
２．２μｌの１０μＭの二重ヘアピンモデルオリゴヌクレオチド（２０ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号５６、図２８ｄ）を反応混合物に加えた。
３．３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
５．反応物を３７℃で１０分間インキュベートした。
６．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物を加え、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
７．ｐＨ＝７．４の１Ｍのトリス緩衝液中の４０μｌの５００ｍＭのＴＣＥＰを反応混合物に加え、３７℃で１０分間反応させた。
８．精製工程１～７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
９．２０μｌのＮＥＢ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス－酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
１０．１μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ Ｖ）ＮＥＢ（３０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
１１．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。
１２．インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
１３．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、ＴＢＥ緩衝液を使用してポリアクリルアミドゲル（１５％）上で分析し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
１４．精製工程１～７に概説されたプロトコルを使用して、ＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットによって、反応混合物を精製した。
１５．２０μｌのＮＥＢ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス－酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
１６．１０μｌの連結のための１００μＭの鎖（１ｎｍｏｌ）（配列番号５７、図２８ｄ）を反応混合物に加えた。
１７．４０μｌの平滑／ＴＡ ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（１８０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
１８．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、室温で２０分間インキュベートした。
１９．精製工程１～５に概説されたプロトコルを使用して、ストレプトアビジン磁気ビーズキットによって、反応混合物を精製した。
２０．非連結オリゴヌクレオチドをラムダエキソヌクレアーゼによって消化した。
２１．精製工程１～７に概説されたプロトコルを使用して、ＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットによって、反応混合物を精製した。
２２．２０μｌのＮＥＢ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス－酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
第２のサイクル：
２３．３’－Ｏ－修飾－ｄＣＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（１μｌの４０ｍＭ）を加えた。
２４．次に、１．５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＸ ＤＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
２５．反応物を３７℃で１０分間インキュベートした。
２６．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物を加え、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
２７．ｐＨ＝７．４の１Ｍのトリス緩衝液中の４０μｌの５００ｍＭのＴＣＥＰを反応混合物に加え、３７℃で１０分間反応させた。
２８．精製工程１～７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
２９．２０μｌのＮＥＢ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス－酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
３０．１μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ Ｖ）ＮＥＢ（３０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
３１．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、３７℃で１時間インキュベートした。
３２．インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
３３．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、ＴＢＥ緩衝液を使用してポリアクリルアミドゲル（１５％）上で分析し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
３４．精製工程１～７に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
３５．２０μｌのＮＥＢ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス－酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
３６．１０μｌの連結のための１００μＭの鎖（１ｎｍｏｌ）（配列番号５８、図２８ｄ）を反応混合物に加えた。
３７．４０μｌの平滑／ＴＡ ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（１８０単位／μｌ）を同じチューブに加えた。
３８．次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、５秒間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、室温で１０分間インキュベートした。
３９．インキュベーション時間が経過した後、ＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を終了させた。
ゲル電気泳動およびＤＮＡの可視化
１．５μｌの反応混合物を、滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の５μｌのＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）に加え、熱サーモミキサー（エッペンドルフ）を使用して５分間９５℃まで加熱した。
２．次に、５μｌの試料を、予熱した１×ＴＢＥ緩衝液Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（８９ｍＭのトリス、８９ｍＭのホウ酸、および２ｍＭのＥＤＴＡ）を含んだ１５％のＴＢＥ－尿素ゲル１．０ｍｍ×１０ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のウェルに入れた。
３．Ｘ－ｃｅｌｌ ｓｕｒｅ ｌｏｃｋモジュール（Ｎｏｖｅｘ）を適所に固定し、以下の条件、室温で４０分間、２６０Ｖ、９０Ａを適用することによって、電気泳動に供した。
４．ゲルを、Ｃｙ３ ＬＥＤを使用してＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。可視化および分析は、Ｉｍａｇｅ ｌａｂ ２．０プラットフォーム上で実施した。
以下のプロトコルを使用して、精製されたＤＮＡ濃度の測定値を判定した。
１．２μｌの滅菌蒸留水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）を台座に加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を平衡化した。
２．平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、水をやさしく拭き取った。
３．２μｌの緩衝液ＥＢ ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス．ＣＬ、ｐＨ８．５）を加えることによって、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅをブランクにした。ブランキングの後に、工程２を繰り返した。
４．２μｌの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、ＤＮＡ濃度を測定した。
以下に概説されたプロトコルを使用して、ＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットによって、試料混合物を精製した。
１．５００μｌの緩衝液ＰＮＩ ＱＩＡＧＥＮ（５Ｍの塩化グアニジニウム）を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
２．混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
３．遠心分離後、フロースルーを廃棄し、７５０μｌの緩衝液ＰＥ ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５および８０％のエタノール）をスピンカラムに加え、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
４．フロースルーを廃棄し、スピンカラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して、残留ＰＥ緩衝液を除去した。
５．次に、スピンカラムを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。
６．ＤＮＡ溶出のために、反応のための２０μｌの適切な緩衝液をカラム膜の中心に加え、室温で１分間放置した。
７．次に、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
連結工程の後に、ストレプトアビジン磁気ビーズを使用して、以下に概説されたプロトコルを介して、試料混合物を精製した。
１．２００μｌの結合緩衝液（２０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）によって、１００μｌのストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を３回洗浄した。
２．連結工程後の反応混合物を１０容量の結合緩衝液（２０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）と混合し、ストレプトアビジン磁気ビーズと共に２０℃で１５分間インキュベートする。
３．２００μｌの結合緩衝液（２０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）によって、ストレプトアビジン磁気ビーズを３回洗浄した。
４．脱イオン水によって、ストレプトアビジン磁気ビーズを３回洗浄した。
５．９５℃で３分間加熱することによる４０μｌの脱イオン水によって、オリゴヌクレオチドを溶出した。
図２８ｃに示される結果は、本発明の例示的な方法を使用した２つの完全な合成サイクルの実行を示す。
実施例９．バージョン２化学－単一ヘアピンモデル上での完全な３サイクル実験。
この実施例は、二重ヘアピンモデル上での５つの工程：ニック部位からの３’－Ｏ－修飾ｄＮＴＰの組み込み、脱保護、切断、連結、および変性工程を使用したポリヌクレオチドの合成のための完全な３サイクル実験を記載しており、第１の工程は、相補的塩基と反対で起こる。
方法の例示的な概略図を図３３、３４、および３５に示す。
方法は、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素的組み込み、その後の脱保護、切断、連結、およびヘルパー鎖の変性によるオリゴヌクレオチドへの３’－Ｏ－保護一塩基の制御された付加によって開始する。図３３は、酵素的組み込み、脱保護、切断、連結、および変性工程を伴う第１の完全サイクルを示す。この実施例では、オリゴヌクレオチドはＴヌクレオチドによって伸長される。図３４は、酵素的組み込み、脱保護、切断、連結工程、および変性工程を伴う第１のサイクルに続く第２の完全サイクルを示す。この実施例では、オリゴヌクレオチドはＴヌクレオチドだけ伸長されている。図３５は、酵素的組み込み、脱保護、切断、連結、および変性工程を伴う第２のサイクルに続く第３の完全サイクルを示す。この実施例では、オリゴヌクレオチドはＴヌクレオチドによって伸長される。
材料および方法
材料
１．Ｊｉａｎ Ｗｕ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００８のＰｈＤ論文に記載されるプロトコルに従って、３’－Ｏ－修飾ｄＮＴＰを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開：Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊｕｌｉｅｓｔａ Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｅｍｐｌａｔｅ－Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｏｒ Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ＵＳ２０１６／０１０８３８２Ａ１にも記載されている。
２．オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（図３６）。原液を１００μＭの濃度で調製する。
３．３－Ｏ－修飾ｄＮＴＰを組み込む能力が増強された、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを使用した。代替的に、任意のＤＮＡポリメラーゼまたは修飾ｄＮＴＰを組み込むことができる他の酵素を使用することができる。
３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰを組み込みのために使用した。
方法
第１のサイクル：
１．２０μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）およびＭｎＣｌ２溶液（１０μｌの４０ｍＭ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１３９μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）と混合した。
２．２０μｌの１００μＭの単一ヘアピンモデルオリゴヌクレオチド（２ｎｍｏｌ、１当量）（配列番号５９、図３６）を反応混合物に加えた。
３．アリコート（４μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物（４ｍＭ）および０．５μｌのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼならびに０．５μｌのＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩＶを追加し、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
４．３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰ（１０μｌの２ｍＭ）を加えた。
５．次に、５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｘ ＤＮＡポリメラーゼ（５０Ｕ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。しかしながら、修飾ｄＮＴＰを組み込むことができる任意のＤＮＡポリメラーゼまたは他の酵素を使用することができる。
６．反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。
７．精製工程６６～７２に概説されたＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
８．２００μｌのＴＥ緩衝液によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
９．アリコート（４μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物（４ｍＭ）および０．５μｌのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼならびに０．５μｌのＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩＶを追加し、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
１０．４００μＬの５００ｍＭのＴＣＥＰを反応混合物に加え、３７℃で１０分間反応させた。
１１．精製工程６６～７２に概説されたＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
１２．１５０μｌのＮＥＢ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス－酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
１３．アリコート（４μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物（４ｍＭ）および０．５μｌのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼならびに０．５μｌのＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩＶを追加し、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
１４．５μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ Ｖ）ＮＥＢ（３０単位／μｌ）を溶出液に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。任意の好適な代替エンドヌクレアーゼを使用することができる。
１５．インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
１６．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、ポリアクリルアミドゲル上で分析した。
１７．精製工程６６～７２に概説されたプロトコルを使用して、ＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットによって、反応混合物を精製した。
１８．１００μｌのＴ３ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（２倍濃縮）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
１９．２０μｌの連結のための１００μＭのイノシン鎖（２ｎｍｏｌ）および２０μｌの連結のための１００μＭのヘルパー鎖（２ｎｍｏｌ）（配列番号６０、５１、図３６）、ならびに４０μｌの水を反応物に加えた。
２０．２０μｌのＴ３ ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（３０００単位／μｌ）を同じチューブに加え（これは任意のＤＮＡ連結酵素を含み得る）、室温で３０分間インキュベートした。
精製工程７３～７８に概説された変性工程を含むストレプトアビジン磁気ビーズキットのためのプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
２１．精製工程６６～７２に概説されたＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットのためのプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
２２．１００μｌのＴＥ緩衝液によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
第２のサイクル：
２３．１５μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、ＭｎＣｌ２溶液（７．５μｌの４０ｍＭ）、および１９μｌの脱イオン水を加えた。
２４．アリコート（４μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物（４ｍＭ）および０．５μｌのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼならびに０．５μｌのＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩＶを追加し、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
２５．３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰ（７．５μｌの２ｍＭ）を加えた。
２６．次に、５μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｘ ＤＮＡポリメラーゼ（５０Ｕ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。修飾ｄＮＴＰを組み込むことができる任意のＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。
２７．反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。
２８．精製工程６６～７２に概説されたＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
２９．１００μｌのＴＥ緩衝液によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
３０．アリコート（４μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物（４ｍＭ）および０．５μｌのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼならびに０．５μｌのＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩＶを追加し、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
３１．２００μＬの５００ｍＭのＴＣＥＰを反応混合物に加え、３７℃で１０分間反応させた。
３２．精製工程６６～７２に概説されたＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
３３．１００μｌのＮＥＢ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス－酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
３４．アリコート（４μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物（４ｍＭ）および０．５μｌのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼならびに０．５μｌのＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩＶを追加し、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
３５．５μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ Ｖ）ＮＥＢ（３０単位／μｌ）を溶出液に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。任意の好適な代替エンドヌクレアーゼを使用することができる。
３６．インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
３７．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、ポリアクリルアミドゲル上で分析した。
３８．精製工程６６～７２に概説されたプロトコルを使用して、ＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットによって、反応混合物を精製した。
３９．６０μｌのＴ３ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（２倍濃縮）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
４０．２０μｌの連結のための１００μＭのイノシン鎖（２ｎｍｏｌ）および２０μｌの連結のための１００μＭのヘルパー鎖（２ｎｍｏｌ）（配列番号６０、５１、図３６）、ならびに１０μｌの脱イオン水を反応混合物に加えた。
４１．１０μｌのＴ３ ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（３０００単位／μｌ）を同じチューブに加え、室温で３０分間インキュベートした。任意の好適なＤＮＡリガーゼを使用することができる。
４２．精製工程７３～７８に概説された変性工程を含むストレプトアビジン磁気ビーズキットのためのプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
４３．精製工程６６～７２に概説されたＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットのためのプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
４４．４６μｌのＴＥ緩衝液によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
第３のサイクル：
４５．６μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、ＭｎＣｌ２溶液（３μｌの４０ｍＭ）を加えた。
４６．アリコート（４μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物（４ｍＭ）および０．５μｌのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼならびに０．５μｌのＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩＶを追加し、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
４７．３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰ（６μｌの２００μＭ）を加えた。
４８．次に、３μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｘ ＤＮＡポリメラーゼ（３０Ｕ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。修飾ｄＮＴＰを組み込むことができる任意のＤＮＡポリメラーゼまたは他の好適な酵素を使用することができる。
４９．反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。
５０．精製工程６６～７２に概説されたＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
５１．５０μｌのＴＥ緩衝液によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
５２．アリコート（４μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物（４ｍＭ）および０．５μｌのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼならびに０．５μｌのＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩＶを追加し、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
５３．１００μＬの５００ｍＭのＴＣＥＰを反応混合物に加え、３７℃で１０分間反応させた。
５４．精製工程６６～７２に概説されたＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
５５．４９μｌのＮＥＢ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（登録商標）（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス－酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
５６．アリコート（４μｌ）を反応混合物から取り出し、０．５μｌの天然ｄＮＴＰ混合物（４ｍＭ）および０．５μｌのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼならびに０．５μｌのＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩＶを追加し、１０分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
５７．５μｌのヒトエンドヌクレアーゼＶ（Ｅｎｄｏ Ｖ）ＮＥＢ（３０単位／μｌ）を溶出液に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。代替的に、任意の好適なエンドヌクレアーゼを使用することができる。
５８．インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化（すなわち、６５℃で２０分間）によって反応を終了させた。
５９．アリコート（５μｌ）を反応混合物から取り出し、ポリアクリルアミドゲル上で分析した。
６０．精製工程６６～７２に概説されたプロトコルを使用して、ＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットによって、反応混合物を精製した。
６１．３０μｌのＴ３ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（２倍濃縮）によって、ＤＮＡ試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
６２．１０μｌの連結のための１００μＭのイノシン鎖（２ｎｍｏｌ）、１０μｌの連結のための１００μＭのヘルパー鎖（２ｎｍｏｌ）（配列番号６０、５１、図３６）、および５μｌの水を反応混合物に加えた。
６３．５μｌのＴ３ ＤＮＡリガーゼＮＥＢ（３０００単位／μｌ）を同じチューブに加えた。（これは任意のＤＮＡ連結酵素を含み得）、室温で３０分間インキュベートした。
６４．ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
以下に概説されたプロトコルを使用した、組み込み、脱ブロック、および切断工程の後のＱＩＡＧＥＮヌクレオチド除去キットによる反応混合物の精製。
６５．１０容量の緩衝液ＰＮＩ ＱＩＡＧＥＮ（５Ｍの塩化グアニジニウム）を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
６６．混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）に移し、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
６７．遠心分離後、フロースルーを廃棄し、７５０μｌの緩衝液ＰＥ ＱＩＡＧＥＮ（１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５および８０％のエタノール）をスピンカラムに加え、６０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
６８．フロースルーを廃棄し、スピンカラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して、残留ＰＥ緩衝液を除去した。
６９．次に、スピンカラムを滅菌１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。
７０．ＤＮＡ溶出のために、反応のための２０～２００μｌの適切な緩衝液をカラム膜の中心に加え、室温で１分間放置した。
７１．次に、チューブを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
変性工程を伴うストレプトアビジン磁気ビーズを使用した連結工程後の反応物の精製を、以下に概説されたプロトコルを介して行った。
７２．２００μｌの結合緩衝液（２０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）によって、１００μｌのストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を３回洗浄した。
７３．連結工程後の反応混合物を１０容量の結合緩衝液（２０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）と混合し、ストレプトアビジン磁気ビーズと共に２０℃で１５分間インキュベートさせた。
７４．２００μｌの結合緩衝液（２０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）によって、ストレプトアビジン磁気ビーズを３回洗浄した。
７５．ヘルパー鎖を除去するために、ストレプトアビジン磁気ビーズを２００μｌの結合緩衝液（２０ｍＭのトリス、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）中で８０℃まで加熱し、磁石にかけ、上清を迅速に廃棄した。
７６．脱イオン水を用いて、ストレプトアビジン磁気ビーズを３回洗浄した。
７７．９５℃で３分間加熱することによる５０～１００μｌの脱イオン水によって、オリゴヌクレオチドを溶出した。
結果および結論
図３７は、組み込み、脱ブロック、切断、および連結工程を含む完全３サイクル実験に対応する反応生産物を示すゲルを示す。示されている結果は、本発明の例示的な方法を使用した３つの完全合成サイクルの実行を実証している。
実施例１０．ポリアクリルアミド表面の誘導体化およびその後の分子の固定化
この実施例は、Ｎ－（５－ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用したポリアクリルアミド表面上のブロモアセチル基の提示、およびその後のブロモアセチル基へのそれらの共有結合によるチオール化分子の表面固定化を記載する。
材料および方法
顕微鏡用スライドガラスおよびカバーガラスを、アセトン、エタノール、および水中でそれぞれ１０分間ずつ順次超音波処理することによって洗浄し、アルゴンで乾燥させた。清浄なガラス製のカバーガラスを、ポリスチレン製ペトリ皿中で、気相でトリクロロ（１Ｈ、１Ｈ、２Ｈ、２Ｈ－ペルフルオロオクチル）シランでシラン化し、エタノール中で２回超音波処理し、Ａｒで乾燥させた（以後、「フッ素化カバーガラス」）。顕微鏡用スライドガラス上で、４％アクリルアミド／Ｎ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミド（１９：１）溶液を、１００μｌの１０％（ｗ／ｖ）過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、１０μｌのテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）と混合し、０、０．１、０．２、および０．３％（ｗ／ｖ）でＮ－（５－ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を添加し、直径４ｍｍのゴム製ガスケットに素早く分配し、続いてアクリルアミド溶液に向かって面するフッ素化側を含むフッ素化カバーガラスで挟み、１０分間重合した。１０分後、表面を脱イオン水に浸し、合計４時間浸したままにし、その間にフッ素化カバーガラスを注意深く取り除いた。重合されたポリアクリルアミド表面をアルゴンで乾燥させた。
続いてポリアクリルアミド表面を、リン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８）中の陰性対照として、チオール化ポリエチレングリコール（１ｋＤａ）フルオレセイン（ＦＩＴＣ－ＰＥＧ－ＳＨ）、およびカルボキシル化ポリエチレングリコール（１ｋＤａ）フルオレセイン（ＦＩＴＣ－ＰＥＧ－ＣＯＯＨ）に１時間曝露し、続いてリン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７）および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／０．５ＭのＮａＣｌを含む同じ緩衝液で順次洗浄して、非特異的に吸着されたチオール化およびカルボキシル化フルオロフォアを除去した。続いて表面を、フルオレセインチャネルのＣｈｅｍｉＤｏｃ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって撮像した。
結果および結論
図３８は蛍光シグナルを示し、図３９は、ＦＩＴＣ－ＰＥＧ－ＳＨおよびＦＩＴＣ－ＰＥＧ－ＣＯＯＨに曝露された異なる量のＢＲＡＰＡを添加したポリアクリルアミドゲル表面からの測定された蛍光を示す。フルオレセインの固定化は、カルボキシル化フルオレセインのゼロに近い非特異的吸着を伴って、ＢＲＡＰＡおよびチオール化フルオレセインのみを添加したポリアクリルアミド表面でのみ成功した。
ＢＲＡＰＡを含まないポリアクリルアミド表面（ＢＲＡＰＡ ０％）ならびにＢＲＡＰＡおよびカルボキシル化分子（ＦＩＴＣ－ＰＥＧ－ＣＯＯＨ）を含むポリアクリルアミド表面と比較して、ＢＲＡＰＡを含むポリアクリルアミド表面（ＢＲＡＰＡ ０．１、０．２、および０．３％）、およびチオール化分子（ＦＩＴＣ－ＰＥＧ－ＳＨ）のみから、有意に高い陽性蛍光シグナルが得られた。結果は、表面からのブロモアセチル部分とフルオレセインタグ付き分子からのチオール部分との間に、特異的共有結合が起こったことを示す。
結果は、本発明の方法で使用するための支持鎖および合成鎖を含む分子などの分子が、本明細書に記載されるポリヌクレオチド合成反応に適合する表面基質上に容易に固定化され得ることを実証する。
実施例１１．ヘアピンＤＮＡオリゴマーの表面固定化、およびその後の蛍光標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸の組み込み。
この実施例は以下を記載する。
（１）薄いポリアクリルアミド表面上にブロモアセチル基を提示する方法、
（２）チオリン酸官能化ヘアピンＤＮＡのリンカーを有するか、または有しない共有結合を介したヘアピンＤＮＡのその後の固定化、および
（３）ヘアピンＤＮＡへの２’－デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の組み込み。
本方法は、実質的にあらゆる種類の材料表面（例えば、金属、ポリマーなど）と適合する。
（１）：ブロモアセチル官能化された薄いポリアクリルアミド表面の加工
材料および方法
最初に、顕微鏡用スライドガラスを、純粋なＤｅｃｏｎ ９０（３０分）、水（３０分）、１ＭのＮａＯＨ（１５分）、水（３０分）、０．１ＭのＨＣｌ（１５分）、水（３０分）中で超音波処理によって洗浄し、最後にアルゴンで乾燥させた。
最初に、２％（ｗ／ｖ）のアクリルアミドモノマー溶液を、１ｇのアクリルアミドモノマーを５０ｍｌの水に溶解することによって作成した。アクリルアミドモノマー溶液をボルテックスし、アルゴン中で１５分間脱気した。Ｎ－（５－ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ、８２．５ｍｇ）を、８２５μｌのＤＭＦに溶解し、アクリルアミドモノマー溶液に加え、さらにボルテックスした。最後に、１ｍｌの５％（ｗ／ｖ）過硫酸カリウム（ＫＰＳ）および１１５μｌの純粋なテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を、アクリルアミド溶液に加え、ボルテックスし、清浄な顕微鏡用スライドガラスを、このアクリルアミド重合混合物に９０分間曝露した。９０分後、表面を脱イオン水で洗浄し、アルゴンで乾燥させた。これらの表面は、この実施例では、以後「ＢＲＡＰＡ修飾表面」と呼ぶことにする。陰性対照として、ＢＲＡＰＡを含まないポリアクリルアミド表面もまた、アクリルアミドモノマー溶液へのＢＲＡＰＡ溶液の添加を除外することによって、上記に記載されるものと同様の方法で作成した。これらの表面は、この実施例では、以後「ＢＲＡＰＡ制御表面」と呼ぶことにする。
（２）：ポリアクリルアミド表面へのチオリン酸官能化ヘアピンＤＮＡの共有結合
材料および方法
直径４ｍｍの円形開口部を有するゴム製ガスケットを、ＢＲＡＰＡ修飾表面およびＢＲＡＰＡ制御表面上に置いて固定した。最初に、表面をリン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７）で１０分間下塗りした。続いて緩衝液を除去し、表面を、それぞれ１μＭの濃度の６個の単一のチオリン酸で修飾されたリンカーを含み、かつ含まない５’－蛍光標識された（Ａｌｅｘａ ６４７）ヘアピンＤＮＡオリゴマーに曝露し、暗所で１時間インキュベートした。対照として、リンカーを有するおよび有しないが、チオリン酸を有しないＤＮＡオリゴマーと共に、ＢＲＡＰＡ修飾表面をインキュベートした（この実施例では、以後「オリゴマー制御表面」と呼ばれる）。インキュベーション後、リン酸ナトリウム（１００ｍＭ、ｐＨ７）、続いてトリス－ＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８）で表面をすすぎ、最後に水ですすいだ。任意の非特異的に吸着されたＤＮＡオリゴマーを除去するために、続いて１Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含む水で表面を洗浄し、水で洗浄し、アルゴンで乾燥させた。Ａｌｅｘａ ６４７チャネルのＣｈｅｍｉＤｏｃ撮像装置上で表面をスキャンした。
図４０ａは、リンカーが異なる試料に固定化されていないヘアピンＤＮＡの配列を示す。図４０ｂは、リンカーが異なる試料に固定化されたヘアピンＤＮＡの配列を示す。
結果
結果を図４１および４２に示す。図４１は、ブロモアセチル官能化ポリアクリルアミド表面に固定化されたリンカーを有するおよび有しないヘアピンＤＮＡオリゴマーから生じるが、ＢＲＡＰＡまたはオリゴマー対照からは生じない蛍光シグナルを示す。
図４２は、ポリアクリルアミド表面へのＤＮＡ固定化の後に測定された蛍光強度を示す。この図は、様々なポリアクリルアミド表面から得られた表面蛍光シグナルを示し、ブロモアセチル官能化ポリアクリルアミド表面へのＤＮＡの共有結合固定化の成功のために、（（２）に記載されるような）ＢＲＡＰＡおよびオリゴマー制御表面と比較して、有意に高いシグナルが、ＢＲＡＰＡ修飾表面に固定化されたヘアピンＤＮＡオリゴマーから得られたことを示す。
結論
ＤＮＡからの蛍光シグナルは、ＢＲＡＰＡを添加したＢＲＡＰＡ修飾表面からのみ顕著に存在し、チオリン酸官能基を介した表面へのＤＮＡの共有結合の成功を示している。リンカーを有しないＤＮＡと比較して、リンカーを有するＤＮＡから、均一かつより高いシグナルが得られた。
（３）：リンカーを有するヘアピンＤＮＡオリゴマーへの三リン酸の組み込み
材料および方法
直径９ｍｍの円形開口部を有するゴム製ガスケットを、リンカーを有するＤＮＡオリゴマーで固定化されたＢＲＡＰＡ修飾表面上に置き、組み込み緩衝液（５０ｍＭのトリス、ｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ、６ｍＭのＭｇＳＯ４、０．０５％のｔｗｅｅｎ２０、および２ｍＭのＭｎＣｌ２）で１０分間下塗りした。続いて表面を、ＤＮＡポリメラーゼ（０．５Ｕ／μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｘ ＤＮＡポリメラーゼ）および三リン酸（２０μＭのＡｌｅｘａ ４８８標識ｄＵＴＰ）を含む組み込み緩衝液に曝露し、１時間インキュベートした（この実施例では、以後「ポリメラーゼ表面」と呼ばれる）。陰性対照として、追加の表面の組も、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを含まない組み込み緩衝液に１時間曝露した（この実施例では、以後「陰性表面」と呼ばれる）。１時間後、両方の種類の試料を水中で洗浄し、続いて１Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含む水に曝露し、再び水で洗浄した。表面からの蛍光シグナルを、Ａｌｅｘａ ６４７およびＡｌｅｘａ ４８８チャネルのＣｈｅｍｉＤｏｃを使用して測定し、ヘアピンＤＮＡの存在（Ａｌｅｘａ ６４７）およびｄＵＴＰの組み込み（Ａｌｅｘａ ４８８）の両方をモニタリングした。
結果
図４３は、Ａｌｅｘａ ４８８標識ｄＵＴＰの組み込み前および後のＡｌｅｘａ ６４７およびＡｌｅｘａ ４８８チャネルから検出された蛍光シグナルを示す。組み込み前および後のＡｌｅｘａ ６４７からの不変の陽性シグナルは、表面固定化ヘアピンＤＮＡが組み込み反応中に安定的であることを示し、Ａｌｅｘａ ４８８からの陽性シグナルは、ポリメラーゼの存在によってのみ、ｄＵＴＰの組み込みの成功を示す、組み込み反応後のポリメラーゼ表面からのみ観察された。
図４４は、（３）に記載されるようなＡｌｅｘａ ４８８標識ｄＵＴＰの組み込み前および後の「ポリメラーゼ表面」および「陰性表面」から得られたＡｌｅｘａ ６４７（ヘアピンＤＮＡ）およびＡｌｅｘａ ４８８（ｄＵＴＰ）チャネルにおいて測定された測定蛍光シグナルを示す。組み込みが成功した結果、ポリメラーゼ表面からの組み込み反応後に、Ａｌｅｘａ ４８８蛍光シグナルの有意な増加が得られたが、陰性表面からのシグナルは、ポリメラーゼの不在のために、組み込み反応後も同じままであった。Ａｌｅｘａ ６４７チャネルの蛍光シグナルは、組み込み反応後に実質的に変化しないままであり、これは表面上のヘアピンＤＮＡの存在を示している。蛍光シグナルのわずかな減少は、２回目の露光による光退色の効果によるものと思われる。
結論
結果は、本発明の方法において使用するための支持鎖および合成鎖を含む分子が、本明細書に記載されるポリヌクレオチド合成反応と適合する表面基質上に容易に固定化され得ることを実証する。結果はさらに、そのような分子が、合成鎖を伸長させるために新たなｄＮＴＰの組み込みを許容し得ると同時に、分子が安定的で、基質に付着したままであることを実証する。
実施例１２．リンカーおよびチオリン酸共有結合を介して誘導体化表面に固定化されたヘアピンＤＮＡオリゴマーの切断および連結。
この実施例は、リンカーを有するチオリン酸官能化ヘアピンＤＮＡの誘導体化表面への共有結合、その後の切断および連結反応を記載する。基質調製およびヘアピンＤＮＡの結合を、実施例１１に記載されるように実施した。
（１）：リンカーを有する固定化ヘアピンＤＮＡオリゴマーの切断
材料および方法
実施例１１に記載されるような表面ＢＲＡＰＡ修飾表面上に、ヘアピンＤＮＡを固定化した。切断および連結反応のための全ての実験対照を含む４組の三重表面を調製した。実験条件を図４５ａに記載する。図４５ｂは、異なる試料に固定化されたヘアピンＤＮＡの配列を示す。
ＤＮＡ固定化工程の後に、直径９ｍｍの円形開口部を有するゴム製ガスケットを、５’末端でＡｌｅｘａ ６４７で標識されたＤＮＡで固定化された全ての表面上に置き、１×ＮＥ緩衝液４（５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス－酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．９）で１０分間下塗りした。試料Ｄについては、固定化ヘアピンＤＮＡはイノシンを含まず、イノシンはグアニンによって置換されることに留意されたい。続いて全ての試料を、１．５Ｕ／μｌのエンドヌクレアーゼＶを含むＮＥＢｕｆｆｅｒ ４（試料Ａ、Ｂ、およびＤ）またはエンドヌクレアーゼＶを含まないＮＥＢｕｆｆｅｒ ４（試料Ｃ）のいずれかに１時間曝露した。続いて全ての試料を、１×Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（６６ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＡＴＰ、７．５％のＰＥＧ６０００、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．６）、１Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０５％の（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ緩衝液で洗浄し、１×Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ緩衝液で再び洗浄し、Ａｌｅｘａ ６４７チャネルのＣｈｅｍｉＤｏｃ撮像装置上でスキャンした。
結果
図４６は、切断反応前および後のヘアピンＤＮＡオリゴマーからの蛍光シグナルを示す。
図４７は、上に記載されるようなＤＮＡ固定化表面から得られた切断反応の前および後に測定された蛍光シグナルを示す。切断反応の成功は、試料ＡおよびＢからのみ観察されたが、エンドヌクレアーゼＶ（試料Ｃ）または配列中のイノシン（試料Ｄ）のいずれも存在しないため、蛍光シグナル強度は、試料ＣおよびＤについて略同じままであった。
エンドヌクレアーゼＶの存在を伴うＤＮＡ鎖内のイノシン部位での成功した切断反応の結果として、試料ＡおよびＢから蛍光シグナルの有意な低減が観察された。試料ＣおよびＤについて、ＤＮＡ中のエンドヌクレアーゼＶの不在およびイノシンの欠如は、それぞれ蛍光シグナルをもたらし、ＤＮＡ固定化後に得られた初期シグナルとほぼ同じレベルを維持した。
（２）：連結反応
材料および方法
（１）に記載されるような切断反応の後、試料ＡおよびＢ（図４５ａに記載されるような）を、試料ＡについてはＴ３ ＤＮＡリガーゼ（２５０Ｕ／μｌ）を用い、試料Ｂについては陰性対照としてＴ３ ＤＮＡリガーゼを用いずに、ＭｎＣｌ２を含む１×Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（２ｍＭ）、５′末端でＡｌｅｘａ ６４７で標識されたイノシン鎖（１６μＭ）、および相補的「ヘルパー」鎖（１６μＭ）（配列を以下の図４８に示す）に曝露した。試料を、それぞれの溶液中で１時間インキュベートした。１時間後、表面を水中で洗浄し、続いて１Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含む水に曝露し、再び水で洗浄した。Ａｌｅｘａ ６４７チャネルのＣｈｅｍｉＤｏｃを使用して、表面からの蛍光シグナルを測定した。図４８は、連結反応のためのイノシン含有鎖および相補的「ヘルパー」鎖についての配列を示す。
結果
図４９は、連結反応のモニタリングに関する結果を示す。連結反応の前および後に、Ａｌｅｘａ ６４７チャネルから検出された蛍光シグナル。連結後のＡｌｅｘａ ６４７チャネルにおける蛍光シグナルの増加は、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼを有する試料Ａからのみ得られたが、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼの不在のため、試料Ｂについては連結反応後、蛍光シグナルは同じレベルのままであった。
図５０は、連結の成功の結果として試料Ａからの連結反応後に、Ａｌｅｘａ ６４７蛍光シグナルの有意な増加が得られたことを示し、ここで、シグナルレベルは、ＤＮＡ固定化の後、および図４７に示されるような切断反応の前に、初期シグナルレベルに回復する。試料Ｂからの蛍光シグナルは、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼの不在のため、連結反応後も同じままであった。
結論
この実施例の結果は、本発明の方法で使用するための支持鎖および合成鎖を含む分子が、本明細書に記載されるポリヌクレオチド合成反応に適合する表面基質上に容易に固定化でき、同時に安定的で基質に付着したままでありながら、切断および連結に曝露され得ることを実証する。
実施例１３．平滑末端ＤＮＡの３’末端への３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＮＴＰの組み込み。
この実施例は、平滑末端二本鎖ＤＮＡの３’末端への３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＮＴＰの組み込みを記載する。
以下の工程は、ＤＮＡポリメラーゼによる酵素的組み込みによる平滑末端二本鎖オリゴヌクレオチドへの３’－Ｏ－保護一塩基の制御された付加を示す。これらの工程は、図１および２（１０３、１０８、２０３、２０８）の各々に示されるように組み込み工程３に従う。
材料および方法
材料
１．社内で合成された３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＮＴＰ。
２．３－Ｏ－修飾ｄＮＴＰを組み込む増強された能力を有する、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓによって操作されたＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｘ ＤＮＡポリメラーゼ。
３．平滑末端二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド。
４種類の可逆的ターミネーターを試験した。
方法
１．５μｌの１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ（登録商標）緩衝液（２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ８．８、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の３３．５μｌの滅菌脱イオン水（ＥＬＧＡ ＶＥＯＬＩＡ）と混合した。
２．２μｌの２０μＭプライマー（４０ｐｍｏｌ、１当量）（配列番号６８、図５１ａ）および３μｌの２０μＭ鋳型（６０ｐｍｏｌ、１．５当量）（配列番号６９、図５１ａ）を反応混合物に加えた。
３．３’－Ｏ－修飾－ｄＴＴＰ（２μｌの１００μＭ）およびＭｎＣｌ２（２．５μｌの４０ｍＭ）を加えた。
４．次に、２μｌのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｘ ＤＮＡポリメラーゼ（２０Ｕ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。
５．反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。
６．ＴＢＥ－尿素試料緩衝液（Ｎｏｖｅｘ）を加えて反応を停止させた。
７．反応物をポリアクリルアミドゲル（１５％）ＴＢＥ緩衝液上で分離し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ撮像システム（ＢｉｏＲａｄ）によって可視化した。
結果
図５１ｂは、３７℃でＭｎ２＋イオンの存在下で、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｘ ＤＮＡポリメラーゼによる３’－Ｏ－修飾－ｄＮＴＰの組み込みの結果を示すゲルを示す。データは、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｘ ＤＮＡポリメラーゼが、３’－Ｏ－修飾－ｄＮＴＰを平滑末端ＤＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端に首尾よく組み込んで単一塩基突出を作成できたことを示す。
上記の実施例では、配列番号１～６９に提示される全てのオリゴヌクレオチドは、３’末端にヒドロキシル基を有する。配列番号１～６９に提示される全てのオリゴヌクレオチドは、配列番号７、配列番号１８、および配列番号３５を除いて、５’末端でリン酸基を欠いている。
開示される方法および生産物の異なる適用が、当該技術分野における特定の必要性に合わせられ得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は、本発明の特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、限定的であることは意図されないことも理解されたい。
さらに、この明細書および添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明確に示さない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば、「連結ポリヌクレオチド」への言及は、２つ以上のそのようなポリヌクレオチドを含み、「足場ポリヌクレオチド」への言及は、２つ以上のそのような足場ポリヌクレオチドを含むなどである。
本明細書に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、それらの全体において
参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドをインビトロで合成する方法であって、前記方法が、合成サイクルを行うことを含み、各サイクルが、二本鎖ポリヌクレオチドを切断すること、およびヌクレオチド対を組み込むことによって前記切断された二本鎖ポリヌクレオチドを伸長することを含み、前記切断された二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖の末端が、前記所定の配列のヌクレオチドの付加によって伸長され、前記第１の鎖にハイブリダイズされる前記切断された二本鎖ポリヌクレオチドの前記第２の鎖の末端が、パートナーヌクレオチドの付加によって伸長され、それにより前記第１の鎖の前記組み込まれたヌクレオチドとヌクレオチド対を形成する、方法。
２．各サイクルが、前記所定の配列の前記ヌクレオチドを、付着した可逆的ブロッキング基と一緒に付加することによって前記第１の鎖を伸長し、続いて前記第２の鎖を伸長することを含み、前記可逆的ブロッキング基が、前記第２の鎖が伸長される前または後に除去される、上記１に記載の方法。
３．各サイクルにおいて、前記ヌクレオチドが、切断された足場ポリヌクレオチドに組み込まれる、上記１または上記２に記載の方法。
４．各サイクルが、
（１）足場ポリヌクレオチドを提供することと、
（２）前記足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することと、
（３）前記所定の配列のヌクレオチドを、ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用によって前記切断された足場ポリヌクレオチドに付加することであって、前記ヌクレオチドが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、付加することと、
（４）前記所定の配列の前記ヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去することと、
（５）連結ポリヌクレオチドを前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記連結ポリヌクレオチドが、前記所定の配列の前記ヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドを含み、連結時に、前記所定の配列の前記ヌクレオチドが、前記パートナーヌクレオチドと対合する、連結することと、を含む、上記３に記載の方法。
５．工程（１）が、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することを含み、前記合成鎖が、プライマー鎖部分を含み、前記支持鎖が、ユニバーサルヌクレオチドを含み、工程（２）が、前記足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することを含み、前記部位が、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義され、切断が、前記支持鎖を切断すること、および前記足場ポリヌクレオチドから前記ユニバーサルヌクレオチドを除去することを含み、工程（５）において、前記連結ポリヌクレオチドが、前記パートナーヌクレオチドおよび次のサイクルで使用するための切断部位を定義するユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖を含み、前記連結ポリヌクレオチドが、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖に連結され、それにより前記ヌクレオチド対を形成する、上記４に記載の方法。
６．前記方法が、
（１）合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することであって、前記合成鎖が、プライマー鎖部分および一本鎖切断によって分離されたヘルパー鎖部分を含み、前記支持鎖が、ユニバーサルヌクレオチドを含む、提供することと、
（２）前記足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、前記部位が、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義され、切断が、前記支持鎖を切断すること、および前記足場ポリヌクレオチドから前記ユニバーサルヌクレオチドを除去して、支持鎖と、前記プライマー鎖部分を含む合成鎖とを含む切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することを含む、切断することと、
（３）ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用によって、前記切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の末端を、前記所定の配列の第１のヌクレオチドで伸長することであって、前記第１のヌクレオチドが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、伸長することと、
（４）前記第１のヌクレオチドから前記ターミネーター基を除去することと、
（５）二本鎖連結ポリヌクレオチドを、前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記連結ポリヌクレオチドが、支持鎖とそれにハイブリダイズされたヘルパー鎖とを含み、相補的連結末端をさらに含み、前記連結末端が、
（ｉ）前記支持鎖において、ユニバーサルヌクレオチドおよび第１のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドであって、前記第１のヌクレオチドの前記パートナーヌクレオチドが、前記ヘルパー鎖に突出している、ユニバーサルヌクレオチドおよび第１のヌクレオチドのパートナーヌクレオチド、および
（ｉｉ）前記ヘルパー鎖において、リン酸基を欠く末端ヌクレオチドを含み、
前記支持鎖の連結時に、前記第１のヌクレオチドが、前記パートナーヌクレオチドと対合する、連結することと、
（６）前記足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、前記部位が、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義され、切断が、前記支持鎖を切断すること、および前記足場ポリヌクレオチドから前記ユニバーサルヌクレオチドを除去して、支持鎖と、プライマー鎖部分を含む合成鎖とを含む切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することを含む、切断することと、
（７）ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用によって、前記切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の末端を、前記所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドで伸長することであって、前記隣のヌクレオチドが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、伸長することと、
（８）前記隣のヌクレオチドから前記ターミネーター基を除去することと、
（９）二本鎖連結ポリヌクレオチドを、前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記連結ポリヌクレオチドが、支持鎖とそれにハイブリダイズされたヘルパー鎖とを含み、相補的連結末端をさらに含み、前記連結末端が、
（ｉ）前記支持鎖において、ユニバーサルヌクレオチドおよび隣のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドであって、前記隣のヌクレオチドの前記パートナーヌクレオチドが、前記ヘルパー鎖に突出している、ユニバーサルヌクレオチドおよび次のヌクレオチドのパートナーヌクレオチド、および
（ｉｉ）前記ヘルパー鎖において、リン酸基を欠く末端ヌクレオチドを含み、
前記支持鎖の連結時に、前記隣のヌクレオチドが、前記パートナーヌクレオチドと対合する、連結することと、
（１０）工程６～９を複数回繰り返して、所定のヌクレオチド配列を有する前記二本鎖ポリヌクレオチドを提供することと、を含む、上記４または上記５に記載の方法。
７．ａ）前記第１のサイクルの前記切断工程（工程２）の前およびその時点で、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎを占め、位置ｎが、そのサイクルにおいて前記プライマー鎖部分の前記末端へのその付加時に、前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドによって占められる前記合成鎖における位置と反対である前記支持鎖における前記ヌクレオチド位置であり、前記支持鎖における位置ｎの前記ヌクレオチドが、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと反対であり、かつそれと対合しており、
ｂ）前記第１のサイクルの前記切断工程（工程２）において、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、位置ｎ－１が、前記ヘルパー鎖に対する遠位方向／前記プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチド位置であり、
ｃ）前記第１サイクルの連結工程（工程５）において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、前記所定の配列の前記第１ヌクレオチドの前記パートナーヌクレオチドが前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋１を占め、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと対合しており、位置ｎが、工程５での前記切断された足場ポリヌクレオチドへの前記連結ポリヌクレオチドの連結時に、前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドと反対である前記ヌクレオチド位置であり、
ｄ）第２のサイクルの前記切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、
ｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎを占め、位置ｎが、そのサイクルにおいて前記プライマー鎖部分の前記末端へのその付加時に、前記所定の配列の前記第１の前記隣のヌクレオチドによって占められる前記合成鎖における位置と反対である前記支持鎖における前記ヌクレオチド位置であり、
ｉｉ．前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、ｎ－１が、前記ヘルパー鎖に対する遠位方向／前記プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチド位置であり、
ｅ）前記第２サイクルの連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、そのサイクルにおける前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドの前記パートナーヌクレオチドが前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋１を占め、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと対合しており、位置ｎが、前記切断された足場ポリヌクレオチドへの前記連結ポリヌクレオチドの連結時に、そのサイクル（工程７）において組み込まれた前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドと反対である前記ヌクレオチド位置である、上記６に記載の方法。
８．ａ）前記第１のサイクルの前記切断工程（工程２）の前およびその時点で、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎ＋１を占め、位置ｎが、そのサイクルにおいて前記プライマー鎖部分の前記末端へのその付加時に、前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドによって占められる前記合成鎖における位置と反対である前記支持鎖における前記ヌクレオチド位置であり、前記支持鎖における位置ｎの前記ヌクレオチドが、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと反対であり、かつそれと対合しており、ｎ＋１が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチド位置であり、
ｂ）前記第１のサイクルの前記切断工程（工程２）において、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、位置ｎ－１が、前記ヘルパー鎖に対する遠位方向／前記プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチド位置であり、
ｃ）前記第１サイクルの連結工程（工程５）において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、前記所定の配列の前記第１ヌクレオチドの前記パートナーヌクレオチドが前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋２を占め、前記ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合しており、位置ｎが、工程５での前記切断された足場ポリヌクレオチドへの前記連結ポリヌクレオチドの連結時に、前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドと反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋２が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における第２の位置であり、
ｄ）第２のサイクルの前記切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、
ｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎ＋１を占め、位置ｎが、そのサイクルにおいて前記プライマー鎖部分の前記末端へのその付加時に、前記所定の配列の前記第１の前記隣のヌクレオチドによって占められる前記合成鎖における位置と反対である前記支持鎖における前記ヌクレオチド位置であり、ｎ＋１が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチド位置であり、
ｉｉ．前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、ｎ－１が、前記ヘルパー鎖に対する遠位方向／前記プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチド位置であり、
ｅ）前記第２サイクルの連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、そのサイクルにおける前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドの前記パートナーヌクレオチドが前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋２を占め、前記ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合しており、位置ｎが、前記切断された足場ポリヌクレオチドへの前記連結ポリヌクレオチドの連結時に、そのサイクル（工程７）において組み込まれた前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドと反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋２が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における第２の位置である、上記６に記載の方法。
９．ａ）前記第１のサイクルの前記切断工程（工程２）の前およびその時点で、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎを占め、位置ｎが、そのサイクルにおいて前記プライマー鎖部分の前記末端へのその付加時に、前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドによって占められる前記合成鎖における位置と反対である前記支持鎖における前記ヌクレオチド位置であり、前記支持鎖における位置ｎの前記ヌクレオチドが、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと反対であり、かつそれと対合しており、
ｂ）前記第１のサイクルの前記切断工程（工程２）において、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎ－１とｎ－２との間で切断され、位置ｎ－１およびｎ－２が、それぞれ、前記ヘルパー鎖に対する遠位方向／前記プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチドおよび後続のヌクレオチド位置であり、
ｃ）前記第１サイクルの連結工程（工程５）において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、前記所定の配列の前記第１ヌクレオチドの前記パートナーヌクレオチドが前記支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋１を占め、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと対合しており、位置ｎが、工程５での前記切断された足場ポリヌクレオチドへの前記連結ポリヌクレオチドの連結時に、前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドと反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋１が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチド位置であり、
ｄ）第２のサイクルの前記切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、
ｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎを占め、位置ｎが、そのサイクルにおいて前記プライマー鎖部分の前記末端へのその付加時に、前記所定の配列の前記第１の前記隣のヌクレオチドによって占められる前記合成鎖における位置と反対である前記支持鎖における前記ヌクレオチド位置であり、
ｉｉ．前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎ－１とｎ－２との間で切断され、位置ｎ－１およびｎ－２が、それぞれ、前記ヘルパー鎖に対する遠位方向／前記プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチドおよび後続のヌクレオチド位置であり、
ｅ）前記第２サイクルの連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、そのサイクルにおける前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドの前記パートナーヌクレオチドが前記支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋１を占め、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと対合しており、位置ｎが、前記切断された足場ポリヌクレオチドへの前記連結ポリヌクレオチドの連結時に、そのサイクル（工程７）において組み込まれた前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドと反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋１が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチド位置である、上記６に記載の方法。
１０．ａ）前記第１のサイクルの前記切断工程（工程２）の前およびその時点で、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎ＋２を占め、位置ｎが、そのサイクルにおいて前記プライマー鎖部分の前記末端へのその付加時に、前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドによって占められる前記合成鎖における位置と反対である前記支持鎖における前記ヌクレオチド位置であり、前記支持鎖における位置ｎの前記ヌクレオチドが、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと反対であり、かつそれと対合しており、ｎ＋２が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記第２のヌクレオチド位置であり、
ｂ）前記第１のサイクルの前記切断工程（工程２）において、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、位置ｎ－１が、前記ヘルパー鎖に対する遠位方向／前記プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチド位置であり、
ｃ）前記第１サイクルの連結工程（工程５）において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、前記所定の配列の前記第１ヌクレオチドの前記パートナーヌクレオチドが前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋３を占め、前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドから２つの位置が除去された前記ヌクレオチドと対合しており、位置ｎが、工程５での前記切断された足場ポリヌクレオチドへの前記連結ポリヌクレオチドの連結時に、前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドと反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋３が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における第３の位置であり、
ｄ）第２のサイクルの前記切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、
ｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎ＋２を占め、位置ｎが、そのサイクルにおいて前記プライマー鎖部分の前記末端へのその付加時に、前記所定の配列の前記第１の前記隣のヌクレオチドによって占められる前記合成鎖における位置と反対である前記支持鎖における前記ヌクレオチド位置であり、ｎ＋２が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記第２のヌクレオチド位置であり、
ｉｉ．前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、位置ｎ－１が、前記ヘルパー鎖に対する遠位方向／前記プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチド位置であり、
ｅ）前記第２サイクルの連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、そのサイクルにおける前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドの前記パートナーヌクレオチドが前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋３を占め、前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドから２つの位置が除去された前記ヌクレオチドと対合しており、位置ｎが、前記切断された足場ポリヌクレオチドへの前記連結ポリヌクレオチドの連結時に、そのサイクル（工程７）において組み込まれた前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドと反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋３が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記第３の位置である、上記６に記載の方法。
１１．（ｉ）前記第１サイクルの前記切断工程（工程２）において、前記ユニバーサルヌクレオチドが代わりに、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎ＋３を占め、ｎ＋３が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記第３のヌクレオチド位置であり、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、
（ｉｉ）前記第１のサイクルの前記連結工程（工程５）において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、前記ユニバーサルヌクレオチドが代わりに、前記支持鎖における位置ｎ＋４を占め、前記相補的連結末端で前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドから除去された３つの位置である前記ヌクレオチドと対合するように構造化され、位置ｎ＋４が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対して前記支持鎖における位置４であり、
（ｉｉｉ）前記第２のサイクルの前記切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の位置ｎ＋３を占め、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、
（ｉｖ）前記第２のサイクルの前記連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋４を占め、前記相補的連結末端で前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドから２つの位置が除去された前記ヌクレオチドと対合するように構造化される、上記１０に記載の方法。
１２．（ｉ）前記第１サイクルの前記切断工程（工程２）において、前記ユニバーサルヌクレオチドが代わりに、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎ＋３＋ｘを占め、ｎ＋３が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記第３のヌクレオチド位置であり、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、
（ｉｉ）前記第１のサイクルの前記連結工程（工程５）において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、前記ユニバーサルヌクレオチドが代わりに、前記支持鎖における位置ｎ＋４＋ｘを占め、前記相補的連結末端で前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドから除去された３＋ｘ個の位置である前記ヌクレオチドと対合するように構造化され、位置ｎ＋４が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対して前記支持鎖における位置４であり、
（ｉｉｉ）前記第２のサイクルの前記切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の位置ｎ＋３＋ｘを占め、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、
（ｉｖ）前記第２のサイクルの前記連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋４＋ｘを占め、前記相補的連結末端で前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドから除去された２＋ｘ個の位置である前記ヌクレオチドと対合するように構造化され、
（ｖ）ｘが、１～１０以上の間の整数であり、ｘが、工程（２）、（５）、（６）、および（９）で同じ整数である、上記１０に記載の方法。
１３．ａ）前記第１のサイクルの前記切断工程（工程２）の前およびその時点で、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎ＋１を占め、位置ｎが、そのサイクルにおいて前記プライマー鎖部分の前記末端へのその付加時に、前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドによって占められる前記合成鎖における位置と反対である前記支持鎖における前記ヌクレオチド位置であり、前記支持鎖における位置ｎの前記ヌクレオチドが、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと反対であり、かつそれと対合しており、ｎ＋１が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチド位置であり、
ｂ）前記第１のサイクルの前記切断工程（工程２）において、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎ－１とｎ－２との間で切断され、位置ｎ－１およびｎ－２が、それぞれ、前記ヘルパー鎖に対する遠位方向／前記プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチドおよび後続のヌクレオチド位置であり、
ｃ）前記第１サイクルの連結工程（工程５）において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、前記所定の配列の前記第１ヌクレオチドの前記パートナーヌクレオチドが前記支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋２を占め、前記ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合しており、位置ｎが、前記切断された足場ポリヌクレオチドへの前記連結ポリヌクレオチドの連結時に、前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドと反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋２が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記第２のヌクレオチド位置であり、
ｄ）第２のサイクルの前記切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、
ｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎ＋１を占め、位置ｎが、そのサイクルにおいて前記プライマー鎖部分の前記末端へのその付加時に、前記所定の配列の前記第１の前記隣のヌクレオチドによって占められる前記合成鎖における位置と反対である前記支持鎖における前記ヌクレオチド位置であり、ｎ＋１が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチド位置であり、
ｉｉ．前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎ－１とｎ－２との間で切断され、位置ｎ－１およびｎ－２が、それぞれ、前記ヘルパー鎖に対する遠位方向／前記プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチドおよび後続のヌクレオチド位置であり、
ｅ）前記第２サイクルの連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、そのサイクルにおける前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドの前記パートナーヌクレオチドが前記支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋２を占め、前記ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合しており、位置ｎが、前記切断された足場ポリヌクレオチドへの前記連結ポリヌクレオチドの連結時に、そのサイクル（工程７）において組み込まれた前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドと反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋２が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記第２のヌクレオチド位置である、上記６に記載の方法。
１４．（ｉ）前記第１サイクルの前記切断工程（工程２）において、前記ユニバーサルヌクレオチドが代わりに、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎ＋２を占め、ｎ＋２が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記第２のヌクレオチド位置であり、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、
（ｉｉ）前記第１のサイクルの前記連結工程（工程５）において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、前記ユニバーサルヌクレオチドが代わりに、前記支持鎖における位置ｎ＋３を占め、前記相補的連結末端で前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドから２つの位置が除去された前記ヌクレオチドと対合するように構造化され、位置ｎ＋３が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対して前記支持鎖における位置３であり、
（ｉｉｉ）前記第２のサイクルの前記切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の位置ｎ＋２を占め、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、
（ｉｖ）前記第２のサイクルの前記連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋３を占め、前記相補的連結末端で前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドから２つの位置が除去された前記ヌクレオチドと対合するように構造化される、上記１３に記載の方法。
１５．（ｉ）前記第１サイクルの前記切断工程（工程２）において、前記ユニバーサルヌクレオチドが代わりに、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎ＋２＋ｘを占め、ｎ＋２が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記第２のヌクレオチド位置であり、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、
（ｉｉ）前記第１のサイクルの前記連結工程（工程５）において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、前記ユニバーサルヌクレオチドが代わりに、前記支持鎖における位置ｎ＋３＋ｘを占め、前記相補的連結末端で前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドから除去された２＋ｘ個の位置である前記ヌクレオチドと対合するように構造化され、位置ｎ＋３が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対して前記支持鎖における位置３であり、
（ｉｉｉ）前記第２のサイクルの前記切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の位置ｎ＋２＋ｘを占め、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、
（ｉｖ）前記第２のサイクルの前記連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋３＋ｘを占め、前記相補的連結末端で前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドから除去された２＋ｘ個の位置である前記ヌクレオチドと対合するように構造化され、
（ｖ）ｘが、１～１０以上の間の整数であり、ｘが、工程（２）、（５）、（６）、および（９）で同じ整数である、上記１３に記載の方法。
１６．前記所定の配列の第１の／隣のヌクレオチドと対合するパートナーヌクレオチドが、前記第１の／隣のヌクレオチドと相補的な、好ましくは天然に相補的なヌクレオチドである、上記１～１５のいずれかに記載の方法。
１７．工程（２）および／または（６）の前に、任意の１つ以上の合成サイクルにおいて、または全ての合成サイクルにおいて、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む前記足場ポリヌクレオチドが提供され、前記合成鎖が、ヘルパー鎖なしで提供される、上記６～１６のいずれかに記載の方法。
１８．工程（２）および／または（６）の前に、任意の１つ以上の合成サイクルにおいて、または全ての合成サイクルにおいて、前記合成鎖が、前記足場ポリヌクレオチドから除去される、上記６～１７のいずれかに記載の方法。
１９．前記合成鎖の前記ヘルパー鎖部分が、（ｉ）前記足場ポリヌクレオチドを約８０℃～約９５℃の温度に加熱し、前記足場ポリヌクレオチドから前記ヘルパー鎖部分を分離すること、（ｉｉ）前記足場ポリヌクレオチドを８Ｍ尿素などの尿素溶液で処理し、前記足場ポリヌクレオチドから前記ヘルパー鎖部分を分離すること、（ｉｉｉ）前記足場ポリヌクレオチドを１００％ホルムアミドなどのホルムアミドまたはホルムアミド溶液で処理し、前記足場ポリヌクレオチドから前記ヘルパー鎖部分を分離すること、または（ｉｖ）前記足場ポリヌクレオチドを、前記ヘルパー鎖部分の配列と相補的であるヌクレオチド配列の領域を含む一本鎖ポリヌクレオチド分子と接触させて、それにより前記ヘルパー鎖部分と前記足場ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを競合的に阻害することによって、前記足場ポリヌクレオチドから除去される、上記１８に記載の方法。
２０．各切断工程が、２工程切断プロセスを含み、各切断工程が、前記ユニバーサルヌクレオチドを除去し、よって脱塩基部位を形成することを含む第１の工程と、前記支持鎖を前記脱塩基部位で切断することを含む第２の工程と、を含む、上記４～７および上記１６～１９のいずれかに記載の方法。
２１．前記第１の工程が、ヌクレオチド除去酵素を用いて行われる、上記２０に記載の方法。
２２．前記ヌクレオチド除去酵素が、３－メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ酵素である、上記２１に記載の方法。
２３．前記ヌクレオチド除去酵素が、
ｉ．ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）、または
ｉｉ．ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）である、上記２２に記載の方法。
２４．前記第２の工程が、塩基である化学物質を用いて行われる、上記２０～２３のいずれかに記載の方法。
２５．前記塩基が、ＮａＯＨである、上記２４に記載の方法。
２６．前記第２の工程が、脱塩基部位切断活性を有する有機化学物質を用いて行われる、上記２０～２３のいずれかに記載の方法。
２７．前記有機化学物質が、Ｎ，Ｎ’－ジメチルエチレンジアミンである、上記２６に記載の方法。
２８．前記第２の工程が、脱塩基部位リアーゼ活性を有する酵素を用いて行われ、任意に、脱塩基部位リアーゼ活性を有する前記酵素が、
（ｉ）ＡＰエンドヌクレアーゼ１、
（ｉｉ）エンドヌクレアーゼＩＩＩ（Ｎ番目）、または
（ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼＶＩＩＩである、上記２０～２３のいずれかに記載の方法。
２９．各切断ステップが、切断酵素を用いてユニバーサルヌクレオチドを除去することを含む１工程切断プロセスを含み、前記酵素が
（ｉ）エンドヌクレアーゼＩＩＩ、
（ｉｉ）エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、
（ｉｉｉ）ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）、または
（ｉｖ）８－オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＯＧＧ１）である、上記４～７および上記１６～１９のいずれかに記載の方法。
３０．前記切断工程が、前記支持鎖を酵素で切断することを含む、上記４～６、上記８および上記９のいずれかに記載の方法。
３１．前記酵素が、前記ユニバーサルヌクレオチドの隣にある前記ヌクレオチドの後の前記支持鎖を切断し、それにより前記合成鎖中に突出端を作成する、上記３０に記載の方法。
３２．前記酵素が、エンドヌクレアーゼＶである、上記３０または上記３１に記載の方法。
３３．前記切断工程が、前記支持鎖を酵素で切断することを含む、上記４～６、上記８および上記９のいずれかに記載の方法。
３４．前記酵素が、前記ユニバーサルヌクレオチドの隣にある前記ヌクレオチドの後の前記支持鎖を切断し、それにより前記合成鎖中に突出端を作成する、上記３３に記載の方法。
３５．前記酵素が、エンドヌクレアーゼＶである、上記３３または上記３４に記載の方法。
３６．前記合成二本鎖ポリヌクレオチドの両方の鎖が、ＤＮＡ鎖である、上記１～３５のいずれかに記載の方法。
３７．前記合成鎖および前記支持鎖が、ＤＮＡ鎖である、上記５～３６のいずれかに記載の方法。
３８．組み込まれたヌクレオチドが、ｄＮＴＰである、上記３６または上記３７に記載の方法。
３９．組み込まれたヌクレオチドが、可逆的ターミネーター基を含むｄＮＴＰである、上記３８に記載の方法。
４０．可逆的ターミネーター基を含む前記組み込まれたヌクレオチドのうちの１つ以上が、３’－Ｏ－アリル－ｄＮＴＰである、上記３９に記載の方法。
４１．可逆的ターミネーター基を含む前記組み込まれたヌクレオチドのうちの１つ以上が、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＮＴＰである、上記３９に記載の方法。
４２．前記合成二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖が、ＤＮＡ鎖であり、前記合成二本鎖ポリヌクレオチドの前記第２の鎖が、ＲＮＡ鎖である、上記１～３５のいずれかに記載の方法。
４３．前記合成鎖が、ＲＮＡ鎖であり、前記支持鎖が、ＤＮＡ鎖である、上記１～３５および上記４２のいずれかに記載の方法。
４４．組み込まれたヌクレオチドが、ＮＴＰである、上記４３に記載の方法。
４５．組み込まれたヌクレオチドが、可逆的ターミネーター基を含むＮＴＰである、上記４４に記載の方法。
４６．可逆的ターミネーター基を含む組み込まれたヌクレオチドが、３’－Ｏ－アリル－ＮＴＰである、上記４５に記載の方法。
４７．可逆的ターミネーター基を含む組み込まれたヌクレオチドが、３’－Ｏ－アジドメチル－ＮＴＰである、上記４５に記載の方法。
４８．前記酵素が、ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは未修飾ポリメラーゼと比較して可逆的ターミネーター基を含むｄＮＴＰを組み込む増強された能力を有する修飾ＤＮＡポリメラーゼである、上記１～４１のいずれかに記載の方法。
４９．前記ポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種９°Ｎ、好ましくは種９°Ｎ－７由来の天然ＤＮＡポリメラーゼのバリアントである、上記４８に記載の方法。
５０．前記酵素が、Ｔ３またはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼ、任意に、未修飾ポリメラーゼと比較して可逆的ターミネーター基を含むＮＴＰを組み込む増強された能力を有する修飾ＲＮＡポリメラーゼである、上記１～３２および４２～４７のいずれかに記載の方法。
５１．前記酵素が、末端トランスフェラーゼ活性を有し、任意に、前記酵素が、末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、ｐｏｌラムダ、ｐｏｌマイクロ、またはΦ２９ＤＮＡポリメラーゼである、上記１～４７のいずれかに記載の方法。
５２．前記第１／隣のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去する前記工程が、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いて行われる、上記４～５０のいずれかに記載の方法。
５３．二本鎖連結ポリヌクレオチドを前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結する前記工程が、リガーゼ酵素を用いて行われる、上記４～５１のいずれかに記載の方法。
５４．前記リガーゼ酵素が、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼまたはＴ４ ＤＮＡリガーゼである、上記５３に記載の方法。
５５．工程（１）、（５）および／または（９）において、前記ヘルパー鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、ヘアピンループによって接続されている、上記６～５４のいずれかに記載の方法。
５６．工程（１）において、前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、ヘアピンループによって接続されている、上記４～５４のいずれかに記載の方法。
５７．工程（１）、（５）、および／または（９）において、
ａ）前記ヘルパー鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、ヘアピンループによって接続されており、
ｂ）前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、ヘアピンループによって接続されている、上記６～５４のいずれかに記載の方法。
５８．前記連結ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、前記相補的連結末端と反対の末端で、前記支持鎖および前記ヘルパー鎖を接続するヘアピンループを含む単一分子として提供される、上記６～５７のいずれかに記載の方法。
５９．各合成サイクルの前記連結ポリヌクレオチドが、前記相補的連結末端と反対の末端で、前記支持鎖および前記ヘルパー鎖を接続するヘアピンループをそれぞれ含む単一分子として提供される、上記６～５８のいずれかに記載の方法。
６０．工程（１）において、前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、共通の表面に繋留されている、上記６～５９のいずれかに記載の方法。
６１．前記プライマー鎖部分とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とがそれぞれ、切断可能なリンカーを含み、前記リンカーが、合成後に前記表面から前記二本鎖ポリヌクレオチドを切り離すために切断され得る、上記６０に記載の方法。
６２．工程（１）において、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分とそれにハイブリダイズされた前記合成鎖の前記部分とが、ヘアピンループによって接続されており、前記ヘアピンループが、表面に繋留されている、上記４～５９のいずれかに記載の方法。
６３．前記ヘアピンループが、切断可能なリンカーを介して表面に繋留され、前記リンカーが、合成後に前記表面から前記二本鎖ポリヌクレオチドを切り離すために切断され得る、上記６２に記載の方法。
６４．前記切断可能なリンカーが、ＵＶ切断可能なリンカーである、上記６１または６３に記載の方法。
６５．前記表面が、微粒子である、上記６０～６４のいずれかに記載の方法。
６６．前記表面が、平坦な表面である、上記６０～６４のいずれかに記載の方法。
６７．前記表面が、ゲルを含む、上記６６に記載の方法。
６８．前記表面が、約２％のポリアクリルアミドなどのポリアクリルアミド表面を含み、好ましくは、前記ポリアクリルアミド表面が、ガラスなどの固体支持体に結合されている、上記６７に記載の方法。
６９．前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、１つ以上の共有結合を介して前記共通の表面に繋留されている、上記６０～６８のいずれかに記載の方法。
７０．前記１つ以上の共有結合が、前記共通の表面上の官能基と足場分子上の官能基との間に形成され、前記足場分子上の前記官能基が、アミン基、チオール基、チオリン酸基、またはチオアミド基である、上記６９に記載の方法。
７１．前記共通の表面上の前記官能基が、ブロモアセチル基であり、任意に、前記ブロモアセチル基が、Ｎ－（５－ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用して得られるポリアクリルアミド表面上に提供される、上記７０に記載の方法。
７２．前記所定の配列のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去する前記工程が、前記連結工程の前または後に行われる、上記４～７１のいずれかに記載の方法。
７３．合成サイクルが、微小流体システム内の液滴中で行われる、上記１～７２のいずれかに記載の方法。
７４．前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングシステムである、上記７３に記載の方法。
７５．前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングオン誘電体システム（ＥＷＯＤ）である、上記７４に記載の方法。
７６．合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記鎖が分離されて、所定の配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを提供する、上記１～７５のいずれかに記載の方法。
７７．合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドまたはその領域が、好ましくはＰＣＲによって増幅される、上記１～７６のいずれかに記載の方法。
７８．所定の配列を有するポリヌクレオチドをアセンブリする方法であって、所定の配列を有する第１のポリヌクレオチドおよび所定の配列を有する１つ以上の追加のポリヌクレオチドを合成するために、上記１～７７のいずれかに記載の方法を行うことと、前記第１および１つ以上の追加のポリヌクレオチドを一緒に接合することと、を含む、方法。
７９．前記第１のポリヌクレオチドおよび前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドが、二本鎖である、上記７８に記載の方法。
８０．前記第１のポリヌクレオチドおよび前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドが、一本鎖である、上記７８に記載の方法。
８１．前記第１のポリヌクレオチドおよび前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドが、適合する末端を作成するために切断され、好ましくは連結によって一緒に接合される、上記７８～８０のいずれかに記載の方法。
８２．前記第１のポリヌクレオチドおよび前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドが、切断部位で制限酵素によって切断される、上記８１に記載の方法。
８３．前記合成および／またはアセンブリ工程が、微小流体システム内の液滴中で行われる、上記７４～８２のいずれかに記載の方法。
８４．前記アセンブリ工程が、所定の配列を有する第１の合成ポリヌクレオチドを含む第１の液滴と、所定の配列を有する追加の１つ以上の合成ポリヌクレオチドを含む第２の液滴と、を提供することを含み、前記液滴が、互いに接触し、前記合成ポリヌクレオチドが、一緒に接合され、それにより前記第１および追加の１つ以上のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドをアセンブリする、上記８３に記載の方法。
８５．前記合成工程が、各液滴が前記合成サイクルの工程に対応する反応試薬を含む、複数の液滴を提供することと、前記合成サイクルの前記工程に従って前記足場ポリヌクレオチドに前記液滴を順次送達することと、によって行われる、上記８４に記載の方法。
８６．液滴の送達後かつ次の液滴の送達の前に、過剰の反応試薬を除去するために洗浄工程が実施される、上記８５に記載の方法。
８７．前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングシステムである、上記８５および８６に記載の方法。
８８．前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングオン誘電体システム（ＥＷＯＤ）である、上記８７に記載の方法。
８９．合成工程およびアセンブリ工程が、同じシステム内で行われる、上記８５～８８のいずれかに記載の方法。
９０．上記１～８９のいずれかに記載の方法を実施するためのポリヌクレオチド合成システムであって、（ａ）各反応領域が少なくとも１つの足場ポリヌクレオチドを含む、反応領域のアレイと、（ｂ）前記反応試薬を前記反応領域に送達するための手段と、任意に（ｃ）前記足場ポリヌクレオチドからの前記合成二本鎖ポリヌクレオチドを切断するための手段と、を含む、ポリヌクレオチド合成システム。
９１．前記反応試薬を液滴で提供するための手段と、前記合成サイクルに従って前記足場ポリヌクレオチドに前記液滴を送達するための手段と、をさらに含む、上記９０に記載のシステム。
９２．上記９０または９１に記載のシステムと共に使用するため、かつ上記１～８９のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、前記合成サイクルの前記工程に対応する反応試薬の容量を含む、キット。
９３．ポリヌクレオチドマイクロアレイを作成する方法であって、前記マイクロアレイが、複数の反応領域を含み、各領域が、所定の配列を有する１つ以上のポリヌクレオチドを含み、前記方法が、
ａ）複数の反応領域を含む表面を提供することであって、各領域が１つ以上の二本鎖アンカーまたは足場ポリヌクレオチドを含む、提供することと、
ｂ）各反応領域で上記１～７５のいずれかに記載の方法に従って合成サイクルを行い、それにより各領域で所定の配列を有する１つ以上の二本鎖ポリヌクレオチドを合成することと、を含む、方法。
９４．合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記鎖が分離されて、マイクロアレイを提供し、各領域が、所定の配列を有する１つ以上の一本鎖ポリヌクレオチドを含む、上記９３に記載の方法。

Claims (34)

  1. 所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドをインビトロで合成する方法であって、前記方法が、合成サイクルを行うことを含み、各サイクルが、二本鎖ポリヌクレオチドを切断すること、およびヌクレオチド対を組み込むことによって前記切断された二本鎖ポリヌクレオチドを伸長することを含み、前記切断された二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖の末端が、前記所定の配列のヌクレオチドの付加によって伸長され、前記第１の鎖にハイブリダイズされる前記切断された二本鎖ポリヌクレオチドの第２の鎖の末端が、パートナーヌクレオチドの付加によって伸長され、それにより前記第１の鎖の前記組み込まれたヌクレオチドとヌクレオチド対を形成する、方法。
  2. （ｉ）各サイクルが、前記所定の配列の前記ヌクレオチドを、付着した可逆的ブロッキング基と一緒に付加することによって前記第１の鎖を伸長し、続いて前記第２の鎖を伸長することを含み、前記可逆的ブロッキング基が、前記第２の鎖が伸長される前または後に除去される、および／または
    （ｉｉ）各サイクルにおいて、前記ヌクレオチドが、切断された足場ポリヌクレオチドに組み込まれる、請求項１に記載の方法。
  3. 各サイクルが、
    （１）足場ポリヌクレオチドを提供することと、
    （２）前記足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することと、
    （３）前記所定の配列のヌクレオチドを、ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用によって前記切断された足場ポリヌクレオチドに付加することであって、前記ヌクレオチドが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、付加することと、
    （４）前記所定の配列の前記ヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去する除去工程と、
    （５）連結ポリヌクレオチドを前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結する連結工程であって、前記連結ポリヌクレオチドが、前記所定の配列の前記ヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドを含み、連結時に、前記所定の配列の前記ヌクレオチドが、前記パートナーヌクレオチドと対合する、連結工程と、を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 工程（１）が、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することを含み、前記合成鎖が、プライマー鎖部分を含み、前記支持鎖が、ユニバーサルヌクレオチドを含み、工程（２）が、前記足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断する切断工程を含み、前記部位が、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義され、前記切断工程が、前記支持鎖を切断すること、および前記足場ポリヌクレオチドから前記ユニバーサルヌクレオチドを除去することを含み、工程（５）において、前記連結ポリヌクレオチドが、前記パートナーヌクレオチドおよび次のサイクルで使用するための切断部位を定義するユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖を含み、前記連結ポリヌクレオチドが、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖に連結され、それにより前記ヌクレオチド対を形成する、請求項３に記載の方法。
  5. 前記方法が、第１のサイクル、第２のサイクル、及び繰り返し工程を含み、
    前記第１のサイクルが、
    （１）合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することであって、前記合成鎖が、プライマー鎖部分および一本鎖切断によって分離されたヘルパー鎖部分を含み、前記支持鎖が、ユニバーサルヌクレオチドを含む、提供することと、
    （２）前記足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断する切断工程であって、前記部位が、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義され、切断が、前記支持鎖を切断すること、および前記足場ポリヌクレオチドから前記ユニバーサルヌクレオチドを除去して、支持鎖と、前記プライマー鎖部分を含む合成鎖とを含む切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することを含む、切断工程と、
    （３）ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用によって、前記切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の末端を、前記所定の配列の第１のヌクレオチドで伸長することであって、前記第１のヌクレオチドが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、伸長することと、
    （４）前記第１のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去する除去工程と、
    （５）二本鎖連結ポリヌクレオチドを、前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結する連結工程であって、前記連結ポリヌクレオチドが、支持鎖とそれにハイブリダイズされたヘルパー鎖とを含み、相補的連結末端をさらに含み、前記相補的連結末端が、
    （ｉ）前記支持鎖において、ユニバーサルヌクレオチドおよび第１のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドであって、前記第１のヌクレオチドの前記パートナーヌクレオチドが、前記ヘルパー鎖に突出している、ユニバーサルヌクレオチドおよび第１のヌクレオチドのパートナーヌクレオチド、および前記ヘルパー鎖において、リン酸基を欠く末端ヌクレオチドを含み、
    （ｉｉ）前記支持鎖の連結時に、前記第１のヌクレオチドが、前記パートナーヌクレオチドと対合する、連結工程と、
    を含み、前記第２のサイクルが、
    （６）前記足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断する切断工程であって、前記部位が、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義され、切断が、前記支持鎖を切断すること、および前記足場ポリヌクレオチドから前記ユニバーサルヌクレオチドを除去して、支持鎖と、プライマー鎖部分を含む合成鎖とを含む切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することを含む、切断工程と、
    （７）ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用によって、前記切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の末端を、前記所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドで伸長することであって、前記隣のヌクレオチドが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、伸長することと、
    （８）前記隣のヌクレオチドから前記ターミネーター基を除去する除去工程と、
    （９）二本鎖連結ポリヌクレオチドを、前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結する連結工程であって、前記連結ポリヌクレオチドが、支持鎖とそれにハイブリダイズされたヘルパー鎖とを含み、相補的連結末端をさらに含み、前記相補的連結末端が、
    （ｉ）前記支持鎖において、ユニバーサルヌクレオチドおよび隣のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドであって、前記隣のヌクレオチドの前記パートナーヌクレオチドが、前記ヘルパー鎖に突出している、ユニバーサルヌクレオチドおよび次のヌクレオチドのパートナーヌクレオチド、および前記ヘルパー鎖において、リン酸基を欠く末端ヌクレオチドを含み、
    （ｉｉ）前記支持鎖の連結時に、前記隣のヌクレオチドが、前記パートナーヌクレオチドと対合する、連結工程と、
    を含み、前記繰り返し工程が、
    （１０）工程６～９を複数回繰り返して、所定のヌクレオチド配列を有する前記二本鎖ポリヌクレオチドを提供すること
    を含む、請求項３または請求項４に記載の方法。
  6. （Ｉ）ａ）前記第１のサイクルの前記切断工程（工程２）の前およびその時点で、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎを占め、位置ｎが、そのサイクルにおいて前記プライマー鎖部分の前記末端へのその付加時に、前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドによって占められる前記合成鎖における位置と反対である前記支持鎖における前記ヌクレオチド位置であり、前記支持鎖における位置ｎの前記ヌクレオチドが、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと反対であり、かつそれと対合しており、
    ｂ）前記第１のサイクルの前記切断工程（工程２）において、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、位置ｎ－１が、前記ヘルパー鎖に対する遠位方向／前記プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチド位置であり、
    ｃ）前記第１サイクルの連結工程（工程５）において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドの前記パートナーヌクレオチドが前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋１を占め、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと対合しており、位置ｎが、工程５での前記切断された足場ポリヌクレオチドへの前記連結ポリヌクレオチドの連結時に、前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドと反対である前記ヌクレオチド位置であり、
    ｄ）第２のサイクルの前記切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、
    ｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎを占め、位置ｎが、そのサイクルにおいて前記プライマー鎖部分の前記末端へのその付加時に、前記所定の配列の前記第１の前記隣のヌクレオチドによって占められる前記合成鎖における位置と反対である前記支持鎖における前記ヌクレオチド位置であり、
    ｉｉ．前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、ｎ－１が、前記ヘルパー鎖に対する遠位方向／前記プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチド位置であり、
    ｅ）前記第２サイクルの連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、そのサイクルにおける前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドの前記パートナーヌクレオチドが前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋１を占め、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと対合しており、位置ｎが、前記切断された足場ポリヌクレオチドへの前記連結ポリヌクレオチドの連結時に、そのサイクル（工程７）において組み込まれた前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドと反対である前記ヌクレオチド位置であるか、または
    （ＩＩ）ａ）前記第１のサイクルの前記切断工程（工程２）の前およびその時点で、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎ＋１を占め、位置ｎが、そのサイクルにおいて前記プライマー鎖部分の前記末端へのその付加時に、前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドによって占められる前記合成鎖における位置と反対である前記支持鎖における前記ヌクレオチド位置であり、前記支持鎖における位置ｎの前記ヌクレオチドが、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと反対であり、かつそれと対合しており、ｎ＋１が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチド位置であり、
    ｂ）前記第１のサイクルの前記切断工程（工程２）において、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、位置ｎ－１が、前記ヘルパー鎖に対する遠位方向／前記プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチド位置であり、
    ｃ）前記第１サイクルの連結工程（工程５）において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドの前記パートナーヌクレオチドが前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋２を占め、前記ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合しており、位置ｎが、工程５での前記切断された足場ポリヌクレオチドへの前記連結ポリヌクレオチドの連結時に、前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドと反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋２が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における第２の位置であり、
    ｄ）第２のサイクルの前記切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、
    ｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎ＋１を占め、位置ｎが、そのサイクルにおいて前記プライマー鎖部分の前記末端へのその付加時に、前記所定の配列の前記第１の前記隣のヌクレオチドによって占められる前記合成鎖における位置と反対である前記支持鎖における前記ヌクレオチド位置であり、ｎ＋１が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチド位置であり、
    ｉｉ．前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、ｎ－１が、前記ヘルパー鎖に対する遠位方向／前記プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチド位置であり、
    ｅ）前記第２サイクルの連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、そのサイクルにおける前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドの前記パートナーヌクレオチドが前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋２を占め、前記ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合しており、位置ｎが、前記切断された足場ポリヌクレオチドへの前記連結ポリヌクレオチドの連結時に、そのサイクル（工程７）において組み込まれた前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドと反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋２が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における第２の位置であるか、または
    （ＩＩＩ）ａ）前記第１のサイクルの前記切断工程（工程２）の前およびその時点で、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎを占め、位置ｎが、そのサイクルにおいて前記プライマー鎖部分の前記末端へのその付加時に、前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドによって占められる前記合成鎖における位置と反対である前記支持鎖における前記ヌクレオチド位置であり、前記支持鎖における位置ｎの前記ヌクレオチドが、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと反対であり、かつそれと対合しており、
    ｂ）前記第１のサイクルの前記切断工程（工程２）において、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎ－１とｎ－２との間で切断され、位置ｎ－１およびｎ－２が、それぞれ、前記ヘルパー鎖に対する遠位方向／前記プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチドおよび後続のヌクレオチド位置であり、
    ｃ）前記第１サイクルの連結工程（工程５）において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドの前記パートナーヌクレオチドが前記支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋１を占め、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと対合しており、位置ｎが、工程５での前記切断された足場ポリヌクレオチドへの前記連結ポリヌクレオチドの連結時に、前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドと反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋１が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチド位置であり、
    ｄ）第２のサイクルの前記切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、
    ｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎを占め、位置ｎが、そのサイクルにおいて前記プライマー鎖部分の前記末端へのその付加時に、前記所定の配列の前記第１の前記隣のヌクレオチドによって占められる前記合成鎖における位置と反対である前記支持鎖における前記ヌクレオチド位置であり、
    ｉｉ．前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎ－１とｎ－２との間で切断され、位置ｎ－１およびｎ－２が、それぞれ、前記ヘルパー鎖に対する遠位方向／前記プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチドおよび後続のヌクレオチド位置であり、
    ｅ）前記第２サイクルの連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、そのサイクルにおける前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドの前記パートナーヌクレオチドが前記支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋１を占め、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと対合しており、位置ｎが、前記切断された足場ポリヌクレオチドへの前記連結ポリヌクレオチドの連結時に、そのサイクル（工程７）において組み込まれた前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドと反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋１が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチド位置であるか、または
    （ＩＶ）ａ）前記第１のサイクルの前記切断工程（工程２）の前およびその時点で、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎ＋２を占め、位置ｎが、そのサイクルにおいて前記プライマー鎖部分の前記末端へのその付加時に、前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドによって占められる前記合成鎖における位置と反対である前記支持鎖における前記ヌクレオチド位置であり、前記支持鎖における位置ｎの前記ヌクレオチドが、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと反対であり、かつそれと対合しており、ｎ＋２が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における第２のヌクレオチド位置であり、
    ｂ）前記第１のサイクルの前記切断工程（工程２）において、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、位置ｎ－１が、前記ヘルパー鎖に対する遠位方向／前記プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチド位置であり、
    ｃ）前記第１サイクルの連結工程（工程５）において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドの前記パートナーヌクレオチドが前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋３を占め、前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドから２つの位置が除去された前記ヌクレオチドと対合しており、位置ｎが、工程５での前記切断された足場ポリヌクレオチドへの前記連結ポリヌクレオチドの連結時に、前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドと反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋３が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における第３の位置であり、
    ｄ）第２のサイクルの前記切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、
    ｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎ＋２を占め、位置ｎが、そのサイクルにおいて前記プライマー鎖部分の前記末端へのその付加時に、前記所定の配列の前記第１の前記隣のヌクレオチドによって占められる前記合成鎖における位置と反対である前記支持鎖における前記ヌクレオチド位置であり、ｎ＋２が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における第２のヌクレオチド位置であり、
    ｉｉ．前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、位置ｎ－１が、前記ヘルパー鎖に対する遠位方向／前記プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチド位置であり、
    ｅ）前記第２サイクルの連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、そのサイクルにおける前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドの前記パートナーヌクレオチドが前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋３を占め、前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドから２つの位置が除去された前記ヌクレオチドと対合しており、位置ｎが、前記切断された足場ポリヌクレオチドへの前記連結ポリヌクレオチドの連結時に、そのサイクル（工程７）において組み込まれた前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドと反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋３が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記第３の位置である、
    請求項５に記載の方法。
  7. （ｉ）ａ）前記第１サイクルの前記切断工程（工程２）において、前記ユニバーサルヌクレオチドが代わりに、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎ＋３を占め、ｎ＋３が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における第３のヌクレオチド位置であり、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、
    ｂ）前記第１のサイクルの前記連結工程（工程５）において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、前記ユニバーサルヌクレオチドが代わりに、前記支持鎖における位置ｎ＋４を占め、前記相補的連結末端で前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドから除去された３つの位置である前記ヌクレオチドと対合するように構造化され、位置ｎ＋４が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対して前記支持鎖における位置４であり、
    ｃ）前記第２のサイクルの前記切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の位置ｎ＋３を占め、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、
    ｄ）前記第２のサイクルの前記連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋４を占め、前記相補的連結末端で前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドから２つの位置が除去された前記ヌクレオチドと対合するように構造化されるか、または
    （ｉｉ）ａ）前記第１サイクルの前記切断工程（工程２）において、前記ユニバーサルヌクレオチドが代わりに、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎ＋３＋ｘを占め、ｎ＋３が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における第３のヌクレオチド位置であり、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、
    ｂ）前記第１のサイクルの前記連結工程（工程５）において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、前記ユニバーサルヌクレオチドが代わりに、前記支持鎖における位置ｎ＋４＋ｘを占め、前記相補的連結末端で前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドから除去された３＋ｘ個の位置である前記ヌクレオチドと対合するように構造化され、位置ｎ＋４が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対して前記支持鎖における位置４であり、
    ｃ）前記第２のサイクルの前記切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の位置ｎ＋３＋ｘを占め、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、
    ｄ）前記第２のサイクルの前記連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋４＋ｘを占め、前記相補的連結末端で前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドから除去された２＋ｘ個の位置である前記ヌクレオチドと対合するように構造化され、
    ｅ）ｘが、１～１０以上の間の整数であり、ｘが、工程（２）、（５）、（６）、および（９）で同じ整数である、請求項６（ｉｖ）に記載の方法。
  8. ａ）前記第１のサイクルの前記切断工程（工程２）の前およびその時点で、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎ＋１を占め、位置ｎが、そのサイクルにおいて前記プライマー鎖部分の前記末端へのその付加時に、前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドによって占められる前記合成鎖における位置と反対である前記支持鎖における前記ヌクレオチド位置であり、前記支持鎖における位置ｎの前記ヌクレオチドが、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと反対であり、かつそれと対合しており、ｎ＋１が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチド位置であり、
    ｂ）前記第１のサイクルの前記切断工程（工程２）において、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎ－１とｎ－２との間で切断され、位置ｎ－１およびｎ－２が、それぞれ、前記ヘルパー鎖に対する遠位方向／前記プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチドおよび後続のヌクレオチド位置であり、
    ｃ）前記第１サイクルの連結工程（工程５）において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドの前記パートナーヌクレオチドが前記支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋２を占め、前記ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合しており、位置ｎが、前記切断された足場ポリヌクレオチドへの前記連結ポリヌクレオチドの連結時に、前記所定の配列の前記第１のヌクレオチドと反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋２が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における第２のヌクレオチド位置であり、
    ｄ）第２のサイクルの前記切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、
    ｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎ＋１を占め、位置ｎが、そのサイクルにおいて前記プライマー鎖部分の前記末端へのその付加時に、前記所定の配列の前記第１の前記隣のヌクレオチドによって占められる前記合成鎖における位置と反対である前記支持鎖における前記ヌクレオチド位置であり、ｎ＋１が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチド位置であり、
    ｉｉ．前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎ－１とｎ－２との間で切断され、位置ｎ－１およびｎ－２が、それぞれ、前記ヘルパー鎖に対する遠位方向／前記プライマー鎖部分に対する近位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における前記隣のヌクレオチドおよび後続のヌクレオチド位置であり、
    ｅ）前記第２サイクルの連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、そのサイクルにおける前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドの前記パートナーヌクレオチドが前記支持鎖の最後から２番目のヌクレオチドであり、位置ｎを占めるように構造化され、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋２を占め、前記ヘルパー鎖の最後から２番目のヌクレオチドと対合しており、位置ｎが、前記切断された足場ポリヌクレオチドへの前記連結ポリヌクレオチドの連結時に、そのサイクル（工程７）において組み込まれた前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドと反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋２が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における第２のヌクレオチド位置である、請求項５に記載の方法。
  9. （ｉ）ａ）前記第１サイクルの前記切断工程（工程２）において、前記ユニバーサルヌクレオチドが代わりに、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎ＋２を占め、ｎ＋２が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における第２のヌクレオチド位置であり、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、
    ｂ）前記第１のサイクルの前記連結工程（工程５）において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、前記ユニバーサルヌクレオチドが代わりに、前記支持鎖における位置ｎ＋３を占め、前記相補的連結末端で前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドから２つの位置が除去された前記ヌクレオチドと対合するように構造化され、位置ｎ＋３が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対して前記支持鎖における位置３であり、
    ｃ）前記第２のサイクルの前記切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の位置ｎ＋２を占め、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、
    ｄ）前記第２のサイクルの前記連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋３を占め、前記相補的連結末端で前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドから２つの位置が除去された前記ヌクレオチドと対合するように構造化されるか、または
    （ｉｉ）ａ）前記第１サイクルの前記切断工程（工程２）において、前記ユニバーサルヌクレオチドが代わりに、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖における位置ｎ＋２＋ｘを占め、ｎ＋２が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対する前記支持鎖における第２のヌクレオチド位置であり、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、
    ｂ）前記第１のサイクルの前記連結工程（工程５）において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、前記ユニバーサルヌクレオチドが代わりに、前記支持鎖における位置ｎ＋３＋ｘを占め、前記相補的連結末端で前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドから除去された２＋ｘ個の位置である前記ヌクレオチドと対合するように構造化され、位置ｎ＋３が、前記ヘルパー鎖に対する近位方向／前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置ｎに対して前記支持鎖における位置３であり、
    ｃ）前記第２のサイクルの前記切断工程（工程６）および全てのその後のサイクルの切断工程において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の位置ｎ＋２＋ｘを占め、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置ｎとｎ－１との間で切断され、
    ｄ）前記第２のサイクルの前記連結工程（工程９）および全てのその後のサイクルの連結工程において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖における位置ｎ＋３＋ｘを占め、前記相補的連結末端で前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドから除去された２＋ｘ個の位置である前記ヌクレオチドと対合するように構造化され、
    ｅ）ｘが、１～１０以上の間の整数であり、ｘが、工程（２）、（５）、（６）、および（９）で同じ整数である、請求項５に記載の方法。
  10. （ｉ）工程（２）および／または（６）の前に、任意の１つ以上の合成サイクルにおいて、または全ての合成サイクルにおいて、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む前記足場ポリヌクレオチドが提供され、前記合成鎖が、ヘルパー鎖なしで提供される、および／または
    工程（２）および／または（６）の前に、任意の１つ以上の合成サイクルにおいて、または全ての合成サイクルにおいて、前記合成鎖が、前記足場ポリヌクレオチドから除去される、
    請求項５～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. （ａ）各切断工程が、２工程切断プロセスを含み、各切断工程が、前記ユニバーサルヌクレオチドを除去し、よって脱塩基部位を形成することを含む第１の工程と、前記支持鎖を前記脱塩基部位で切断することを含む第２の工程とを含む、または
    （ｂ）各切断工程が、切断酵素を用いてユニバーサルヌクレオチドを除去することを含む１工程切断プロセスを含み、前記酵素が
    （ｉ）エンドヌクレアーゼＩＩＩ、
    （ｉｉ）エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、
    （ｉｉｉ）ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）、または
    （ｉｖ）８－オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＯＧＧ１）である、
    請求項４～６（i）、および請求項１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記第１の工程が、ヌクレオチド除去酵素を用いて行われ、および／または
    前記第２の工程が、脱塩基部位リアーゼ活性を有する酵素を用いて行われる、請求項１１に記載の方法。
  13. 脱塩基部位リアーゼ活性を有する前記酵素が、
    （ｉ）ＡＰエンドヌクレアーゼ１、
    （ｉｉ）エンドヌクレアーゼＩＩＩ（Ｎ番目）、または
    （ｉｉｉ）エンドヌクレアーゼＶＩＩＩである、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記切断工程が、前記支持鎖を酵素で切断することを含む、請求項４～５、請求項６（ｉｉ）および、請求項６（ｉｉｉ）のいずれか一項に記載の方法。
  15. （ａ）前記酵素が、前記ユニバーサルヌクレオチドの隣にある前記ヌクレオチドの後の前記支持鎖を切断し、それにより前記合成鎖中に突出端を作成する、および／または
    （ｂ）前記酵素が、エンドヌクレアーゼＶである、
    請求項１４に記載の方法。
  16. 工程（１）、（５）、および／または（９）において、
    ａ）前記ヘルパー鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、ヘアピンループによって接続されており、
    ｂ）前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、ヘアピンループによって接続されている、
    請求項５～１０、及び請求項５を引用する請求項１１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記連結ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、前記相補的連結末端と反対の末端で、前記支持鎖および前記ヘルパー鎖を接続するヘアピンループを含む単一分子として提供される、請求項１６に記載の方法。
  18. 各合成サイクルの前記連結ポリヌクレオチドが、前記相補的連結末端と反対の末端で、前記支持鎖および前記ヘルパー鎖を接続するヘアピンループをそれぞれ含む単一分子として提供される、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、前記共通の表面に繋留されている、請求項４～１０及び１６～１８、並びに請求項５に従属する請求項１１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、１つ以上の共有結合を介して、前記共通の表面に繋留されている、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記１つ以上の共有結合が、前記共通の表面上の官能基と足場分子上の官能基との間に形成され、前記足場分子上の前記官能基が、アミン基、チオール基、チオリン酸基、またはチオアミド基である、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記共通の表面上の前記官能基が、ブロモアセチル基である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記ブロモアセチル基が、Ｎ－（５－ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用して得られるポリアクリルアミド表面上に提供される、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記所定の配列のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去する前記除去工程が、前記連結工程の前または後に行われる、請求項３～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記所定の配列の第１の／隣のヌクレオチドと対合するパートナーヌクレオチドが、前記第１の／隣のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドである、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記所定の配列の第１の／隣のヌクレオチドと対合するパートナーヌクレオチドが、前記第１の／隣のヌクレオチドと天然に相補的なヌクレオチドである、請求項２５に記載の方法。
  27. （ａ）合成サイクルが、微小流体システム内の液滴中で行われ、および／または
    （ｂ）合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記鎖が分離されて、所定の配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを提供する、および／または
    （ｃ）合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドまたはその領域が増幅される、
    請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングシステムである、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングオン誘電体システム（ＥＷＯＤ）である、請求項２８に記載の方法。
  30. 合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドまたはその領域が、ＰＣＲによって増幅される、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 所定の配列を有するポリヌクレオチドをアセンブリする方法であって、所定の配列を有する第１のポリヌクレオチドおよび所定の配列を有する１つ以上の追加のポリヌクレオチドを合成するために、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法を行うことと、前記第１および１つ以上の追加のポリヌクレオチドを一緒に接合することと、を含む、方法。
  32. 前記第１のポリヌクレオチドおよび前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドが、適合する末端を作成するために切断され、一緒に接合される、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記第１のポリヌクレオチドおよび前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドが、適合する末端を作成するために切断され、連結によって一緒に接合される、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記第１のポリヌクレオチドおよび前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドが、切断部位で制限酵素によって切断される、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。
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