JP7391204B2 - ワモンゴキブリの抽出物、製剤、調製方法およびその使用 - Google Patents

Description

本発明は薬の分野に関連し、特に、ワモンゴキブリ（Periplaneta americana L）の抽出物、製剤、調製方法およびその使用に関する。

ワモンゴキブリ、ゴキブリ目（Blattodea）のゴキブリ属（Periplaneta）に属する昆虫は、「ゴキブリ目（blattaria）」または一般に「ゴキブリ（cockroach）」としても知られ、常に害虫と見なされてきた。それは、様々な手段によって人類に殺されているが、今でも粘り強く生き残っている。文献調査によると、ワモンゴキブリは、３億年以上前から地球上に生息している。地殻変動や気候・環境の変化に伴い、多くの種が絶滅していく中で、ゴキブリはますます強い生存適応力を発揮しており、その粘り強い生命力を示している。ワモンゴキブリは、２０００年以上の歴史を持つ、中国最古の薬物書である「神農本草経」に収載された薬物である。同書では、「味は塩味で寒く、鬱血を治し、寒熱を緩和し、消化不良、喉頭閉鎖、内寒、子無しを治す」と中品として掲載されている。「本草綱目」の補遺には、「乳児の栄養失調は、その重症度にもかかわらず（死に至ることさえある場合でも）、台所から得られたゴキブリを焼いて食べると効果的に治る」と書かれている。患者は、ゴキブリの香りを感じる程度で、魚臭は感じない。ゴキブリを１～２回食べるだけで、失敗することなく、患者を完全に治すことができる。治療した後、患者はよく発達して白くなる。これはどの試験でも成功することが証明されている。このように、ゴキブリ目は古くから薬や食用として利用されてきたことが分かる。ワモンゴキブリは、鬱血の分散、消化不良の治療、解毒、湿気の除去、腫れの軽減などの機能を持っていることが臨床的に証明されている。

近年、臨床投与量の増加により、中国南部と北部でワモンゴキブリの人工育種が徐々に行われ、薬物と食品の基準を満たす医薬品、薬物およびグリーンオーガニック食品としてワモンゴキブリを生産できるＧＡＰ標準給餌工場がある。

実際の生産のプロセスとワモンゴキブリの保存では、ワモンゴキブリの新鮮な昆虫は２～３日で腐敗し、劣化し、悪臭を放ち、使用できない。ワモンゴキブリを保存するために、製造業者は、通常、凍結乾燥または加熱乾燥の手段によって昆虫の体を乾燥昆虫に処理する。しかし、凍結乾燥または高温乾燥のいずれかであっても、エネルギー、人的資源、物的資源、時間を浪費し、さらには多くの生物活性物質を破壊し、それは、続いて製品を製剤する助けとはならない。

ワモンゴキブリをより有効に活用し、よりよい抽出物を得るためには、ワモンゴキブリの抽出および調製方法のさらなる研究および改善が依然として必要である。ワモンゴキブリの新鮮な体を直接抽出することは、間違いなく比較的よい方法である。現在、ワモンゴキブリの新鮮な体をより効果的に抽出する方法について、関連報告はない。

本発明者は、多数の実験により、優れたワモンゴキブリの体の新鮮な保管方法を偶然獲得した。この保管方法は、先行技術の問題を解決する。本明細書に記載の新鮮な保管方法は、ワモンゴキブリの新鮮な体を長期間保存し、それに含有される生物活性物質を改善できる。

したがって、一方で、本発明は、以下のステップを含む、ワモンゴキブリ抽出物を調製するための方法を提供する：
１）新鮮なワモンゴキブリをエタノールに浸漬するステップと；
２）エタノールで還流抽出した後、濾過して、濾液を混ぜ合わせるステップと；
３）濾液をエキスに濃縮するステップ。

本発明において、実施形態の１つとして、ステップ１）における浸漬をするために使用するエタノールの濃度は、２０％～９５％、好ましくは２５％～７０％、より好ましくは２５％～４５％、最も好ましくは２５％である。

本発明において、実施形態の１つとして、ステップ１）における浸漬時間は、１０～６０日、好ましくは２０～６０日、さらに好ましくは２０～４０日である。例として、浸漬時間は２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、または４０日であってよい。

本発明において、実施形態の１つとして、ステップ１）における浸漬温度は、２０℃～６０℃、好ましくは３０℃～５０℃、最も好ましくは４０℃である。

本発明において、実施形態の１つとして、ステップ１）における使用するエタノールの量は、新鮮なワモンゴキブリの重量の１．５～３．５倍である（すなわち、１．５～３．５ＢＶ）。

本発明において、実施形態の１つとして、ステップ２）におけるエタノールの濃度は、５０％～８０％、好ましくは８０％である。

本発明において、実施形態の１つとして、ステップ２）において加えられるエタノールの量は、新鮮なワモンゴキブリの重量の１．５～３．５倍（すなわち、１．５～３．５ＢＶ）、好ましくは１．５倍である。

実施形態の１つとして、ステップ１）において、新鮮な昆虫の１．５倍の重量のエタノールが浸漬中に加えられ、ステップ２）において、１．５倍の量のエタノールが、１回目の還流のために再度加えられる。

本発明において、実施形態の１つとして、ステップ２）における還流の回数は１～３回である。

本発明において、実施形態の１つとして、ステップ２）において、１回目の還流のために、新鮮なワモンゴキブリの１．５倍の重量（１．５ＢＶ）のエタノールが再度加えられ；ステップ２）において２回目または３回目の還流が行われる場合には、加えられるエタノールの量は新鮮なワモンゴキブリの３倍の重量（３ＢＶ）である。

本発明において、実施形態の１つとして、ステップ２）における還流の時間は、１～２時間である。

本発明において、実施形態の１つとして、ステップ３）における濃縮は、減圧濃縮である。

本発明において、実施形態の１つとして、ステップ３）における減圧濃縮の温度は、６０℃～９０℃である。

本発明において、実施形態の１つとして、ステップ３）におけるエキスの６０℃での相対密度は、１．０４～１．０８である。

別の態様では、本発明は、前記の方法によって調製されたワモンゴキブリ抽出物を提供する。実施形態の１つとして、抽出物中の遊離アミノ酸の含有量は、３０～５５％である。

別の態様では、本発明は、ワモンゴキブリ抽出物を含有する製剤を提供し、この製剤は前記記載の方法により調製されたワモンゴキブリ抽出物と、賦形剤とを含有する。本発明において、賦形剤は、清澄剤を含む。

本発明において、実施形態の１つとして、清澄剤は、キトサンとゼラチンの組成物である；実施形態の１つとして、キトサンは１％キトサン溶液である；および実施形態の１つとして、ゼラチンは１％ゼラチン溶液である。

本発明において、実施形態の１つとして、キトサン対ゼラチンの比は、１：１～１：４、好ましくは１：３～１：４、最も好ましくは１：３である。

本発明において、実施形態の１つとして、清澄化ステップにおける生薬濃度は、１／３～１／１１ｇ／ｍｌ、好ましくは１／３～１／７ｇ／ｍｌ、最も好ましくは１／３ｇ／ｍｌである。

生薬濃度とは、１ミリリットルあたりのワモンゴキブリの新鮮な体の質量または重量を指す。一例として、生薬濃度が１／３ｇ／ｍｌの場合、ワモンゴキブリの新鮮な体１／３ｇが１ｍｌの溶液に調製されることを意味する。

本発明において、実施形態の１つとして、製剤中の清澄剤の量は、０．２～１．０ｍｌ／ｇ生薬、好ましくは、０．２～０．６ｍｌ／ｇ生薬である。

本発明において、実施形態の１つとして、賦形剤は、甘味料および防腐剤をさらに含む。

本発明において、実施形態の１つとして、甘味料としては、グリセロール、チクロ、アスパルテームまたはステビオシドが挙げられるが、これらに限定されず、好ましくはグリセロールである。

本発明において、実施形態の１つとして、前記防腐剤としては、ヒドロキシフェニルアルキルエステル（例えば、ニパギン）、安息香酸、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸またはソルビン酸カリウムが挙げられるが、これらに限定されず、好ましくはソルビン酸カリウムである。

本発明において、実施形態の１つとして、甘味料の量は５～２０％である。

本発明において、実施形態の１つとして、防腐剤の量は０．０５～０．３％である。

本発明において、実施形態の１つとして、製剤は伝統的な漢方薬混合物である。

本発明のさらなる態様は、以下のステップを含む製剤を調製するための方法をさらに提供する：ワモンゴキブリ抽出物を水で希釈するステップと、次に１００℃に加熱するステップと、７０℃に冷却するステップと、撹拌しながら清澄剤を加えるステップと、冷却するステップと、濾過するステップと、濾液にグリセロールとソルビン酸カリウムを加えるステップと、最後に残りの水を加えるステップと、よく混合するステップと、微孔性フィルター膜で濾過するステップと、滅菌するステップ。

本発明において、実施形態の１つとして、前記方法は、ワモンゴキブリの新鮮な体を秤量するステップと、前記新鮮な体の１．５倍（１．５ＢＶ）の重量の２５％エタノールを加えるステップと、密封するステップと、４０℃で２０日間放置するステップと、取り出すステップと、８０％エタノールで３回還流抽出するステップであって、各抽出は１時間行い、1回目の抽出に１．５ＢＶを加え、２回目と３回目の抽出に３．０ＢＶを加えるステップ、濾過して濾液を混ぜ合わせるステップと、６５℃で減圧下、エタノールを回収して、相対密度１．０４（６０℃で測定）に濃縮するステップと、新鮮な昆虫の３倍の重量になるまで水を加えるステップと、よく混合するステップと、１０分間加熱および煮沸するステップと、７０℃に冷却するステップと、清澄剤をゆっくりと加えるステップと、撹拌するステップと、冷却するステップと、一晩冷蔵して濾過し、ワモンゴキブリの新鮮な体の透明な溶液を得るステップと、次にソルビン酸カリウムとグリセロールを加えるステップと、よく混ぜるステップと、水を加えるステップと、よく混ぜるステップと、濾過するステップと、１１５℃で４０分間滅菌して得るステップとを含む。

本発明は、抗炎症用薬物を調製するための、本発明によって調製されたワモンゴキブリ抽出物または本発明の製剤の使用をさらに提供する。

本発明の目的の１つは、ワモンゴキブリの新鮮な体を長期間保存する方法を提供することである。エタノールなどの環境保護試薬を使用すれば、時間、人的および物的資源、エネルギーを節約し、生産費用を削減する。同時に、ワモンゴキブリの生物活性物質を増加できる。

本発明の目的の一つは、水、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、水溶性キトサンおよび海藻多糖類から１種または複数種選択される、ワモンゴキブリの鮮度保持剤を提供することである。防腐剤で処理した新鮮な体は、未処理の生虫や乾燥昆虫に比べて生物活性物質が多いことが、多数の実験により判明している。

さらに、ワモンゴキブリの防腐剤溶液は、１０～９０％の濃度のエタノールである。

本発明の目的の１つは、ワモンゴキブリの鮮度保持方法を提供することである。この方法は、エタノール、プロピレングリコール、グリセロール、水溶性キトサンと海藻多糖類を含む１種または複数種の物質に、ワモンゴキブリが浸漬されることによって特徴づけられる。

さらに、ワモンゴキブリが１０～９０％の濃度のエタノールに浸漬されることによって特徴づけられる。

さらに、２５～６０％のエタノールは、ワモンゴキブリを浸漬するために使用される。

さらに、ワモンゴキブリの浸漬時間は、１０日以上である。

さらに、ワモンゴキブリを浸漬する温度は、２０～６０℃である。

さらに、ワモンゴキブリの鮮度保持法では、浸漬のためのエタノールの量は新鮮な体の重量の１．５～３．５倍（１．５～３．５ＢＶ）である。

本発明は、凍結乾燥や乾燥を必要とせずに、ワモンゴキブリの新鮮な体を長期間保存できる、という利点を有する。一方、本発明は、ワモンゴキブリの薬用材料中の生物活性物質を増加させることができる。エタノールおよび他の環境保護試薬を使用することで、時間、人的および物的資源を節約し、エネルギーを節約し、生産費用を削減できる。本発明により得られたワモンゴキブリの抽出物は、より優れた抗炎症活性を有し、アミノ酸の含有量も高い。

試験例１において、エタノール濃度および浸漬時間の違いが全遊離アミノ酸に及ぼす影響を示す図である。 試験例１において、エタノール濃度および浸漬時間の違いが水溶性全固形分の収量に及ぼす影響を示す図である。 試験例１において、エタノール濃度および浸漬時間の違いが全固形分に及ぼす影響を示す図である。 試験例１において、エタノール濃度および浸漬時間の違いが遊離アミノ酸に及ぼす影響を示す図である。 試験例１において、エタノール濃度および浸漬時間の違いが水溶性全固形分に及ぼす影響を示す図である。 試験例１において、エタノール濃度および浸漬時間の違いが遊離アミノ酸に及ぼす影響を示す図である。 試験例１において、常温群および４０℃群における時間の関数としての遊離アミノ酸収量の変動傾向を示す図である。 試験例１において、常温群および４０℃群における時間の関数としての水溶性全固形分の変動傾向を示す図である。 試験例１において、エタノールに浸す時間の違いが及ぼす影響の調査結果を示す図である。 試験例１において、全遊離アミノ酸の変動傾向を示す図である。 試験例１において、水溶性全固形分の変動傾向を示す図である。 試験例１において、３種の抽出物の様々な物質の合計量の比較図である。 試験例１において、ＭＬＰ、ＭＬＧ、ＭＬＸ試料の全固形分中の各種物質を示す円グラフである。 試験例１において、ＭＬＧ、ＭＬＰ、ＭＬＸによるＬＰＳ炎症誘発細胞のＴＮＦａ、ＩＬ－６、ＮＯの分泌量に対する影響（±ｓ、ｎ＝３）を示す図である。ここで、「ｃｏｎ．」はブランク群を表し、「ｍｏｄｅｌ」はモデル群を表し、「ａｎｄｒｏ．」は陽性薬物であるアンドログラホリド群を表し、Ｌは低用量群（原液を１６０倍に希釈したもの）を表し、Ｍは中用量群（原液を１２０倍に希釈したもの）を表し、Ｈは高用量群（原液を８０倍に希釈したもの）を表し、すべての薬物を同時に測定しているため、すべての薬物で同じ指標（対照群と比較して、＃Ｐ＜０．０１；モデル群と比較して、^*Ｐ＜０．０５、^**Ｐ＜０．０１）のため、ブランク群、モデル群、陽性薬物群のデータを共有している。

以下、実施例を通じて本発明を詳細に説明するが、本発明に不利な限定を課すことを意味するものではない。本発明を詳細に説明するが、その具体的な実施形態も開示する。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の特定の実施形態に様々な変更および改良を加えることは、当業者には明らかであろう。

ワモンゴキブリ抽出物の調製
［実施例１］

ワモンゴキブリの新鮮な体を１．５ＢＶの２５％エタノールに加え、４０℃±２℃で２０～４０日間浸漬し、８０％エタノールで３回還流し、ここで、各還流は１時間ずつ行い、還流ごとにエタノールをそれぞれ１．５倍、３．０倍、３．０倍加えた。この溶液を濾過した。６０～９０℃でエタノールを回収し、溶液を濃縮して相対密度１．０４～１．０８（６０℃で測定）の薄いエキスを得た。
［実施例２］

ワモンゴキブリの新鮮な体を１０００ｇ／部分で秤量し、ガラス瓶に入れ、２５％エタノール１５００ｍｌを加え、密封し、４０℃で２０日間放置し、取り出し、８０％エタノールで３回抽出し、ここで、各抽出は１時間行い、エタノールを１回目に１．５ＢＶ（１．５Ｌ）、２回目と３回目に３．０ＢＶ（３．０Ｌ）加える、および濾過した。濾液を混ぜ合わせた。６５℃で減圧下、エタノールを回収して、相対密度１．０６（６０℃）まで溶液を濃縮し、得た。
［実施例３］

ワモンゴキブリの新鮮な体１０００ｇを秤量し、ガラス瓶に入れ、５０％エタノール４５００ｍｌを加え、密封し、４０℃で６０日間放置し、取り出し、５０％エタノール５０００ｍｌで２時間還流して抽出し、濾過した。９０℃で減圧下、エタノールを回収し、相対密度１．０８（６０℃）まで溶液を濃縮した。
［実施例４］

ワモンゴキブリの新鮮な体１０００ｇを秤量し、ガラス瓶に入れ、２０％エタノール１５００ｍｌを加え、密封し、２０℃で１０日間放置し、取り出し、８０％エタノールで３回抽出し、ここで、各抽出は１時間行い、エタノールを1回目に１．５ＢＶ（１．５Ｌ）、２回目と３回目に３．０ＢＶ（３．０Ｌ）加える、および濾過した。濾液を混ぜ合わせた。６０℃で減圧下、エタノールを回収して、相対密度１．０４（６０℃）まで溶液を濃縮し、得た。
［実施例５］

ワモンゴキブリの新鮮な体１０００ｇを秤量し、ガラス瓶に入れ、９０％エタノール２０００ｍｌを加え、密封し、５０℃で６０日間放置し、取り出し、７０％エタノールで３回抽出し、ここで、各抽出は１．５時間行い、エタノールを1回目に２ＢＶ（２Ｌ）加え、２回目と３回目に４．０ＢＶ（４．０Ｌ）加える、および濾過した。濾液を混ぜ合わせた。７０℃で減圧下エタノールを回収して、相対密度１．０７（６０℃）まで溶液を濃縮し、得た。
［実施例６］

ワモンゴキブリの新鮮な体２０００ｇを秤量し、ガラス瓶に入れ、７０００ｍｌの３０％エタノールを加え、密封し、３０℃で４０日間放置し、取り出し、６０％エタノールで３回抽出し、ここで、各抽出は１時間行い、エタノールを1回目に０．５ＢＶ（１．０Ｌ）、２回目と３回目に４．０ＢＶ（８．０Ｌ）加える、および濾過した。濾液を混ぜ合わせた。６０℃で減圧下エタノールを回収して、相対密度１．０５（６０℃）まで溶液を濃縮し、得た。
［実施例７］

ワモンゴキブリの新鮮な体１５００ｇを秤量し、ガラス瓶に入れ、２５％エタノール３０００ｍｌを加え、密封し、３５℃で４５日間放置し、取り出し、８０％エタノールで３回抽出した。各抽出は１．５時間行い、エタノールを１回目に２．０ＢＶ（３．０Ｌ）、２回目と３回目に４．０ＢＶ（６．０Ｌ）加える、および濾過した。濾液を混ぜ合わせた。８０℃で減圧下エタノールを回収して、相対密度１．０７（６０℃）まで溶液を濃縮し、得た。

ワモンゴキブリ抽出混合物の調製
清澄剤の調製
１％ゼラチン溶液：ゼラチン３ｇを秤量し、１５０ｍｌの精製水に３０分間浸漬した後、１５０ｍｌの熱水（＞９５℃）を撹拌しながらゼラチンが完全に溶解するまで加え、冷却して、得た。

１％キトサン溶液：１ｇのキトサンを秤量し、１００ｍｌの精製水に加え、均一に撹拌し、キトサンが完全に溶解するまで撹拌しながら１ｍｌの氷酢酸をゆっくりと加えて、得た。

清澄剤溶液：１％ゼラチン溶液と１％キトサン溶液を３：１の比率で混合して、得た。
［実施例８］

ワモンゴキブリの新鮮な体２００ｇを２５％エタノール３００ｍｌに加え、４０℃（±２℃）で２０～４０日間置き、８０％エタノールで３回還流抽出し、ここで、各抽出は１時間行い、エタノールを１回目に３００ｍｌ、２回目と３回目にそれぞれ６００ｍｌずつ加える、および濾過した。５０～１００℃で減圧下、エタノールを回収して、溶液を濃縮し、相対密度１．０４～１．０８（６０℃下で測定）の薄いエキスを得た。薄いエキスに水を６００ｍｌまで加え、１０～３０分間煮沸し、６０～７０℃に冷却し、１％ゼラチン溶液と１％キトサン溶液を３：１の比率で均一に混合して調製した清澄剤４０～１２０ｍｌを加えた。均一に混合し、１～８℃で１６～４８時間放置し、濾過し、１５０ｇのグリセロールと１ｇのソルビン酸カリウムを加え、水を１０００ｍｌまで加え、均一に混合し、濾過し、瓶詰めし、１１６℃（±２℃）で４０分滅菌し、得た。
［実施例９］

ワモンゴキブリの新鮮な体を１０００ｇ／部分で秤量し、ガラス瓶に入れ、１５００ｍｌの２５％エタノールを加え、密封し、４０℃で２０日間放置し、取り出し、８０％エタノールで３回抽出し、ここで、各抽出は１時間行い、エタノールを１回目は１．５ＢＶ（１．５Ｌ）、２回目と３回目は３．０ＢＶ（３．０Ｌ）加える、および濾過した。濾液を混ぜ合わせた。６５℃で減圧下、エタノールを回収した。この溶液を相対密度１．０６（６０℃）まで濃縮し、冷却し、３０００ｍｌまで水を加え、均一に混合し、１０分間煮沸し、７０℃まで冷却し、清澄剤６００ｍｌをゆっくりと加え、１０分間撹拌し、冷却し、一晩冷蔵し、濾過してワモンゴキブリの新鮮な体の清澄な溶液を得た。この清澄な溶液を適量（生体２００ｇ相当）取り、ソルビン酸カリウム１．０ｇ、グリセロール１５０ｇをそれぞれ加え、均一に混合し、１０００ｍｌまで水を加え、均一に混合し、濾過し、１０ｍｌ／瓶で瓶に詰め、１１５℃で４０分間滅菌した。

試験例１ ワモンゴキブリの体を浸漬する際の条件の検討。

１）エタノール濃度と浸漬時間に関する検討
２０％、５０％、７０％、９５％エタノールを含む様々なエタノール濃度での新鮮な体の浸漬に関する検討
ワモンゴキブリの新鮮な体を１００ｇずつ数回採取し、２０％、５０％、７０％、９５％のエタノールをそれぞれ１５０ｍｌ加えた。それらを常温に保ち、０日目（０カ月）、１２日目（０．５カ月）、３１日目（１．０カ月）、４７日目（１．５カ月）および６１日目（２．０カ月）に、それぞれ４ＢＶ、３ＢＶ、３ＢＶの７０％エタノールで還流抽出し、濾過した。６５℃で減圧下、濾液からエタノールを回収し、溶解するため水を５００ｍｌになるまで加えた後、高速冷却遠心機（１０℃１２０００ｒ／ｍｉｎ）で３０分間遠心して上澄み、すなわち、試料を得た。試料中のアミノ酸の含有量および水溶性全固形分の収量を測定した。

（水溶性全固形分の収量は薬局方２０１５年版の乾燥法を参考にして測定し、全アミノ酸の含有量は試料を誘導体化した後、ＨＰＬＣ法により測定した。）試験結果を表１、表２に示す。

図１および図２より、異なる濃度のエタノールに浸漬されたワモンゴキブリの体の全アミノ酸含量および水溶性全固形分の収量は、浸漬時間の増加とともに異なる程度に増加している。エタノール濃度の上昇に伴い、増加速度が遅くなった。特に、２０％エタノールに浸漬すると、増加速度が最も速く、増加量が最大になる。９５％エタノールに浸漬すると、増加速度が最も低くなり、増加量が最小になる。

（ｉｉ）２５％、３５％、４５％エタノールでの浸漬に関する検討
ワモンゴキブリの新鮮な体の１００ｇ／部分をガラス瓶に入れ、それぞれ２５％、３５％、４５％のエタノール１５０ｍｌを加え、密封し、４０℃に保った。２５％、３５％、４５％エタノールに浸漬した試料の一部を５日ごとに取り出し、７０％エタノールで３回還流抽出し、ここで、1回目の還流抽出では２５０ｍｌのエタノールを加え、２回目と３回目の還流抽出では３００ｍｌのエタノールを加え、各抽出は１時間行う、および濾過した。濾液を混ぜ合わせた。６５℃で減圧下、エタノール臭がなくなるまで、エタノールを回収した。抽出物を冷却し、５００ｍｌになるまで水を加え、均一に混合し、３０分間遠心分離（１２０００ｒ／ｍｉｎ）して上澄みを得た。上澄みを濾過し、濾液中の遊離アミノ酸および水溶性全固形分の含有量を測定した。その結果を表３および表４に示す。

表３の試験結果に従って、ワモンゴキブリの新鮮な体を２５％、３５％、４５％のエタノールに浸漬したときの時間の関数としての水溶性固形物の変動傾向を示す図を描く。図３に示すように、浸漬時間は横軸で、水溶性全固形分は縦軸である。

表４の試験結果に従って、ワモンゴキブリの新鮮な体を２５％、３５％、４５％のエタノールに浸漬したときの時間の関数としての遊離アミノ酸の変動傾向を示す図を描く。図４に示すように、浸漬時間は横軸で、遊離アミノ酸の量は縦軸である。

その結果、水溶性全固形分および遊離アミノ酸の量がエタノール濃度の減少とともに有意に増加すること、および各時点で２５％エタノール浸漬群が最も高かったことを示した。したがって、ワモンゴキブリの新鮮な体を浸漬するために、２５％エタノールを選択した。

２５％エタノール浸漬群の結果は、水溶性全固形分および遊離アミノ酸の量が後の期間よりも最初の２０日間で有意に増加して、２０～３８日間で比較的平坦な増大があったことを示した。そのため、浸漬時間は２０～３８日と予備的に測定された。

以上の結果から、浸すエタノール濃度が低いほど、水溶性全固形分と遊離アミノ酸の収量が高くなることが分かった。２５％未満のエタノールに浸漬して、浸漬中の腐食防止の問題を検討する比較試験のため、ワモンゴキブリの新鮮な体の別の群を２０％エタノールに浸漬する。

（ｉｉｉ）２０％エタノールへの浸漬に関する検討。
ワモンゴキブリの新鮮な体を１００ｇ／部分で秤量し、ガラス瓶に入れ、１５０ｍｌの２０％エタノールを加え、密封し、４０℃で２５日間放置した。浸漬した試料の一部を５日ごとに取り出し、７０％エタノールで３回還流抽出し、ここで、１回目の抽出では２５０ｍｌのエタノールを加え、２回目と３回目で３００ｍｌのエタノールを加え、各抽出は１時間行う、および濾過した。濾液を混ぜ合わせた。６５℃で減圧下、エタノール臭がなくなるまで、エタノールを回収した。抽出物を冷却し、５００ｍｌまで水を加え、均一に混合し、３０分間遠心分離（１２０００ｒ／ｍｉｎ）して上澄みを得た。上澄みを濾過し、濾液中の遊離アミノ酸および水溶性全固形分の含有量を測定した。その結果を表５および表６に示す。

表５と表６の試験結果に従って、ワモンゴキブリの新鮮な体を２０％と２５％のエタノールに浸漬したときの、時間の関数としての水溶性固形物の変動傾向を示す図を描く。図５に示すように、浸漬時間は横軸で、水溶性全固形分は縦軸である。

表５と表６の試験結果に従って、ワモンゴキブリの新鮮な体を２０％と２５％のエタノールに浸漬したときの、時間の関数としての遊離アミノ酸の変動傾向を示す図を描く。図６に示すように、浸漬時間は横軸で、遊離アミノ酸は縦軸である。

前記の試験結果は、水溶性の全固形分と遊離アミノ酸の収量が２つの群で同様に増加すること、２５％エタノール群でわずかに高いことを示した。しかし、２０％エタノール群では、ワモンゴキブリの新鮮な体を２０日間浸漬した後、試料の臭いや劣化が見られた。したがって、ワモンゴキブリの新鮮な体を２０～３８日間浸漬するため、２５％エタノールを事前に選択した。

２）浸漬温度に関する検討
ワモンゴキブリの新鮮な体を１００ｇ／部分で秤量し、ガラス瓶に入れ、それぞれ１５０ｍｌの２５％エタノールを加え、密封し、４０℃で放置した。浸漬した試料を５日ごとに取り出し、７０％エタノールで３回還流抽出し、ここで、１回目の抽出で２５０ｍｌのエタノールを加え、２回目と３回目で３００ｍｌのエタノールを加え、各抽出は１時間行う、および濾過した。濾液を混ぜ合わせた。６５℃で減圧下、エタノール臭がなくなるまで、エタノールを回収した。抽出物を冷却し、５００ｍｌまで水を加え、均一に混合し、３０分間遠心分離（１２０００ｒ／ｍｉｎ）して上澄みを得た。上澄みを濾過し、濾液中の遊離アミノ酸および水溶性全固形分の含有量を測定した。その結果を表７および表８に示す。

表７および表８の試験結果に従って、図７に示すように、浸漬時間を横軸、得られたアミノ酸の量を縦軸とする、アミノ酸の収量の時間に対する変動傾向を示す図を描く。

表７および表８の試験結果に従って、図８に示すように、浸漬時間を横軸、水溶性全固形分を縦軸とする、水溶性全固形分の時間の関数としての変動傾向を示す図を描く。

前記の試験結果より、浸漬後の各時点において、常温群の水溶性全固形分および遊離アミノ酸の収量は、４０℃群のそれに比べ、有意に低いことが分かった。そのため、浸漬温度は４０℃を選択した。

３）エタノール量に関する検討
予備試験により、ワモンゴキブリの新鮮な体は１．５ＢＶのエタノール丁度で浸漬できることが分かった。したがって、１．５ＢＶ、２．５ＢＶ、３．５ＢＶの２５％エタノールを比較試験に加えた。

ワモンゴキブリの新鮮な体を１００ｇ／部分で秤量し、ガラス瓶に入れ、それぞれ１５０ｍｌ、２５０ｍｌ、３５０ｍｌの２５％エタノールを加え、密封し、４０℃で１０日間放置した。浸漬した試料を取り出し、７０％エタノールで３回還流抽出し、ここで、１回目はエタノール２５０ｍｌ、２回目と３回目はエタノール３００ｍｌを加え、各抽出は１時間行う、および濾過した。濾液を混ぜ合わせた。抽出物を冷却し、均一に混合した後、濾過した。濾液中の遊離アミノ酸および水溶性全固形分の含有量を測定した。その結果を表９に示す。

表９の結果に従って、図９に示すように、２５％エタノールの添加量を横軸、全固形分と遊離アミノ酸を縦軸とする、柱状図表を描く。

前記の試験結果は、２５％エタノールの添加量が全固形分と遊離アミノ酸にほとんど影響しないこと、１．５ＢＶの量でわずかに高くなっていることを示した。ワモンゴキブリの新鮮な体内の水分含有量は５０％以上であるため、エタノール濃度がわずかに低下し、低下の程度はエタノールの添加量に反比例すると考えられる。この実験結果は、エタノールの浸漬濃度と水溶性全固形分および遊離アミノ酸の収量とが反比例するというこれまでの結果と一致する。したがって、２５％エタノールの添加量は１．５ＢＶである。

４）浸漬温度と浸漬時間に関するさらなる検討
ワモンゴキブリの新鮮な体を１００ｇ／部分で秤量し、ガラス瓶に入れ、それぞれ１５０ｍｌの２５％エタノールを加え、密封し、それぞれ２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃で６０日間放置した。浸漬した試料を１０日ごとに取り出し、７０％エタノールで３回還流抽出し、ここで、１回目の抽出で２５０ｍｌのエタノールを加え、２回目と３回目で３００ｍｌのエタノールを加え、各抽出は１時間行う、および濾過した。濾液を混ぜ合わせた。６５℃で減圧下、エタノール臭がなくなるまで、エタノールを回収した。抽出物を冷却し、５００ｍｌまで水を加え、均一に混合し、３０分間遠心分離（１２０００ｒ／ｍｉｎ）して上澄みを得た。上澄みを濾過し、濾液中の遊離アミノ酸および水溶性全固形分の含有量を測定した。その結果を表１０に示す。

表１０の結果に従って、図１０および図１１に示すように、浸漬時間を横軸とし、遊離アミノ酸および水溶性全固形分の収量を縦軸とする、変化傾向を示す図を描く。

試験結果から、浸漬温度が全遊離アミノ酸と水溶性全固形分の収量に大きな影響を与えることが分かる。浸漬後の各時点で、４０℃群の全遊離アミノ酸と水溶性全固形分が最も多くなっている。生産費用や実情を考慮すると、浸漬温度は４０℃（±２℃）で管理することがより適切である。

一方、遊離アミノ酸と水溶性全固形分の収量は、最初の２０日間で急激に増加し、その後は比較的緩やかに増加し、４０日以降は大きな変化は見られない。したがって、ワモンゴキブリの体の浸漬時間を２０～４０日に決定した。

５）ワモンゴキブリの３種の抽出物の比較研究。
予備試験は、２５％エタノールに浸漬したワモンゴキブリの新鮮な体のアルコール抽出物中の全アミノ酸、遊離アミノ酸、ペプチド、および水溶性全固形分の含有量が有意に増加したことを示した。以下は、同じ調製プロセスにより、ワモンゴキブリの新鮮な体（ＭＬＸ）、ワモンゴキブリの乾燥体（ＭＬＧ）、および２５％エタノールに浸漬した後の新鮮な体（ＭＬＰ）から調製された抽出物中の物質を相対的に比較する試験、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの炎症に対する阻害を比較する試験である。

（ｉ）ＭＬＸ、ＭＬＧ、ＭＬＰ抽出物の調製プロセス
同じバッチのワモンゴキブリの新鮮な体を１０００ｇ／割合で秤量し、詳細については表１１に示すように、ＭＬＸ、ＭＬＧおよびＭＬＰの調製プロセスに従って、同じモデルおよび仕様を有する３種のワモンゴキブリの抽出物を調製した。

（ｉｉ）ＭＬＸ、ＭＬＧ、ＭＬＰ抽出物中の相対的な物質の比較
ＭＬＸ、ＭＬＧおよびＭＬＰの全固形分、ヌクレオシド塩基、遊離アミノ酸、全アミノ酸およびペプチドの含有量を測定した。その結果を表１２に示す。

表１２の結果に従って、抽出物中の各種物質を横軸、総量を縦軸とした柱状図表を描く。その結果を図１２に示す。

表１２の結果に従って、全固形分中の遊離アミノ酸、ペプチド、ヌクレオシド塩基の全量を算出する。その結果を図１３に示す。

表１３の結果に従って、ＭＬＰ、ＭＬＧ、ＭＬＸの各試料に含まれる全固形分中の各種物質を円グラフで描くと、図１３のようになる。

その結果、ヌクレオシド塩基を除いて、ワモンゴキブリの新鮮な体の浸漬群のその他の物質は、新鮮な体群および乾燥体群よりも有意に高かった。浸漬群の水溶性全固形分は、新鮮な体群のそれよりも４倍高く、乾燥体群のそれよりも２倍高かった。浸漬群の遊離アミノ酸量は、新鮮な体群のそれの１０倍高く、乾燥体群のそれの５倍以上高かった。浸漬群の全アミノ酸量は、新鮮な体群のそれの７倍以上高く、乾燥体群のそれの３倍以上高かった。また、浸漬群のペプチド量は、新鮮な体群のそれの３倍以上高く、乾燥体群のそれの２倍以上高かった。

新鮮な体群、乾燥体群、浸漬された新鮮な体群の抽出物は、遊離アミノ酸、ペプチド、ヌクレオシド塩基および他の物質を含有しているが、各種成分の割合や含有量は有意に異なっており、ＭＬＸ、ＭＬＧ、およびＭＬＰ抽出物の間で物質基盤が大きく異なることを示している。

（ｉｉｉ）抗炎症効果に関するｉｎ ｖｉｔｒｏでの比較研究の結果
ＴＮＦ－ａ－ＩＬ－６／ｉＮＯＳ－ＮＯ炎症シグナル経路に基づき、マウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）のＬＰＳ誘発炎症に対する薬物ＭＬＧ、ＭＬＰおよびＭＬＸの調節効果を評価した。

薬物ＭＬＧ、ＭＬＰ、ＭＬＸの原液をそれぞれ８０倍、１２０倍、１６０倍に希釈し、あらかじめ細胞とともに１２時間インキュベートし、最終濃度１μｇ／ｍｌのＬＰＳで細胞を刺激して炎症を誘導させるために使用した。ＬＰＳ刺激による５０分後のＴＮＦ－α放出量、４時間後ＩＬ－６の放出量、１２時間後のＮＯ放出量は酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）およびグリース（Ｇｒｉｅｓｓ）法により検出した。

その結果、ＭＬＧ、ＭＬＰおよびＭＬＸによるＬＰＳ誘発ＴＮＦ－αの放出に対する阻害効果は明白ではなかった。しかし、異なる希釈率で希釈したＭＬＧ、ＭＬＰおよびＭＬＸは、ＬＰＳによって誘導されるＮＯおよびＩＬ－６の放出を有意に抑制でき、中でも、ＭＬＰは同じ希釈率で最も有意なＮＯおよびＩＬ－６の抑制効果を示した。（詳細は別紙１参照：ＬＰＳ刺激マウスマクロファージ炎症モデルにおけるＭＬＧ、ＭＬＰ、ＭＬＸの効果に関する研究）

結論として、ワモンゴキブリの新鮮な体から、同じプロセス、すなわち２５％エタノールに２０～４０日間浸漬して作られた抽出物中の水溶性全固形分、全遊離アミノ酸、全アミノ酸およびペプチドの含有量は、ワモンゴキブリの新鮮な体／乾燥体から作られた抽出物のそれらよりも有意に高く、浸漬した新鮮な体からの抽出物は、ＬＰＳ誘発マウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）の炎症に対して最も高い調節効果がある。

（ｉｖ）ＭＬＧ、ＭＬＰ、ＭＬＸ細胞試験の結果
薬物ＭＬＧ、ＭＬＰ、ＭＬＸの原液をそれぞれ８０倍、１２０倍、１６０倍に希釈し、あらかじめ細胞と１２時間インキュベートした後、１μｇ／ｍＬのＬＰＳを加えて細胞の炎症を刺激した。ＬＰＳ刺激による５０分後のＴＮＦ－α放出量、４時間後のＩＬ－６放出量、１２時間後のＮＯ放出量を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）およびグリース法で検出し、ＬＰＳ誘導による細胞炎症に対する薬物ＭＬＧ、ＭＬＰ、ＭＬＸの調節作用について検討した。

細胞密度が６×１０⁵／ｍｌ、１ウェルあたり５００μＬとなるように、対数増殖期の細胞を２４ウェルプレートに接種した。１２時間培養後、培養液を捨て、ブランク群とモデル群には５００ｍＬのＤＭＥＭ高グルコース培地を加え、薬物投与群には濃度の異なる薬物溶液を含む５００μＬの培養液を入れた（個々の群の溶媒含有量は同一であった）。それらを３７℃および５％ＣＯ₂セルインキュベーターでさらに１２時間培養し、２０μＬの上澄みを個々のウェルから除去した。ブランク群には２０μＬのＤＭＥＭ培地を、その他の群には０．０２５μｇ／ｍＬのＬＰＳを含む２０μＬ培地を加え、ＬＰＳの終濃度が１μｇ／ｍＬとなるように調整した。さらに５０分間インキュベートした後、各ウェルから３００μＬの上澄みを吸引して、ＴＮＦ－αを検出するため、０．６ｍＬのＥＰチューブに充填した。

対応するプレートについても同様の操作を行った。ＬＰＳ添加後、４時間培養して、各ウェルから３００μＬの上清を吸引し、ＩＬ－６を検出するため、０．６ｍＬのＥＰチューブに充填した。

対応するプレートについても同様の操作を行った。ＬＰＳ添加後、１２時間培養して、各ウェルから３００μＬの上澄みを吸引し、ＮＯを検出するため、０．６ｍＬのＥＰチューブに充填した。

すべての指標は、キットの説明書に従って厳密に試験された。最後に、酵素標識装置で特定波長の吸光度値を検出し、同じ方法で作成した標準曲線に従って、各試料の指標含有量を算出した。吸光度値が標準曲線の下限の試料の吸光度値より低い場合、該当する値より低いと見なし、該当する統計量を平均０、分散０として計算する。

前記の方法と時点に従って検体を検出した結果、モデル群と比べ、ＭＬＧ、ＭＬＰ、ＭＬＸはＴＮＦ－αの抑制効果がないことが分かった。様々な薬物が、用量依存的にＩＬ－６の産生に有意な抑制効果を示した（Ｐ＜０．０５）。中でも、ＭＬＰは最も高い効果を示し、ＭＬＧのＩＬ－６抑制効果は投与量の増加とともに減少した。ＭＬＧ、ＭＬＰおよびＭＬＸは、用量依存的にＮＯの放出に対して有意な抑制効果を示し（Ｐ＜０．０５）、中でも、ＭＬＰは最も高い効果を示した。その結果を以下の図１４と表１４に示す。

（ｖ）キシレンによって誘導されるマウスの皮膚毛細血管透過性の増加におけるＭＬＸ、ＭＬＧ、ＭＬＰの３種の抽出物の影響。
体重１８～２２ｇの５０匹のマウスを体重に応じて無作為に５つの群に分けた：ＭＬＸ、ＭＬＧ、ＭＬＰ試験群。０．２ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンを陽性対照薬として使用し、モデル対照群に等容積の生理食塩水を灌流した。様々なグループに１日１回ずつ７回投与した。最後の投与から１時間後、様々なマウスに０．５％エバンスブルー生理食塩水を０．１ｍｌ／１０ｇ・ｂｗで尾静脈から注射し、２４時間前に脱毛した腹部皮膚にキシレンをマウス１匹あたり３０μＬ滴下した。２０分後、頸椎を切断することによりマウスを殺した。腹部の青く染色された皮膚を切り取り、手術用ハサミで細かく切り、栓付きの試験管に入れ、５ｍｌのアセトン通常生理食塩水（７：３）を加えて浸漬し、７２時間間暗所に置き、３０００ｒ／ｍｉｎで１０分間遠心分離し、上澄みを得た。吸光度（ＯＤ値）を測定するために、スペクトルスキャン多機能リーダーにより、５９０ｎｍの波長で比色検出した。透過性はＯＤ値で表され、結果は統計的に比較した。結果を表１５に示す。

その結果、キシレンモデリングの後、マウスの皮膚毛細血管透過性が有意に増加し、スキンブルー染色の程度が増加したことが分かった。デキサメタゾンの投与はキシレンによる皮膚毛細血管透過性の増加を抑制でき、スキンブルー染色の程度はモデル群のそれよりも有意に低く（Ｐ＜０．０１）、抑制率は８０％以上であった。ＭＬＸ、ＭＬＧ、およびＭＬＰ抽出物の胃内投与した後、様々な抽出物群における皮膚の青色染色の程度も、モデル群と比較して有意に減少した（Ｐ＜０．０５またはＰ＜０．０１）。ＭＬＰグループは、最も有意に減少し、ＭＬＸ群とＭＬＧ群と有意差があった。

（ｖｉ）マウスの綿球肉芽腫におけるＭＬＸ、ＭＬＧおよびＭＬＰの３種の抽出物の影響
体重１８～２２ｇのマウスを５０匹、１０／群、オスとメス半々で採取した。マウスを固定し、胸部をヨウ素で消毒した。７５％アルコール綿球でヨウ素を除去した。胸に小さな穴を開け、２０ｍｇの高圧滅菌済みの綿球を眼科用鉗子で切開部から腋窩に皮下移植し、皮膚を縫合した。手術の日から始めて、投与群にはＭＬＸ、ＭＬＧ、ＭＬＰの抽出物（２ｍｌ／ｋｇ）およびデキサメタゾン（０．２ｍｇ／ｋｇ）を与え、モデル対照群には等容積の生理食塩水を与えた。前記の群に７連続日投与した。８日目の試験が終了する前に、体重を測定した後、頸椎を切断してマウスを殺した。移植した綿球を周囲の結合組織と一緒に取り出し、脂肪組織を取り除き、湿重量を量り、６０℃のオーブンに２４時間入れ、精密天秤で秤量した。肉芽腫の重量は、秤量した重量から綿球の元の重量を差し引いて求め、群間の比較および統計分析を行った。結果を表１６に示す。

その結果、デキサメタゾン投与が綿球肉芽腫の形成を有意に抑制し、肉芽腫の湿重量および乾重量がモデル群のそれよりも有意に減少したことが分かった（Ｐ＜０．０１）。モデル群と比較して、ＭＬＧおよびＭＬＰの肉芽腫の湿重量および乾重量も有意に減少した（Ｐ＜０．０５またはＰ＜０．０１）、特にＭＬＰ群では、ＭＬＸ群およびＭＬＧ群とは有意に異なっていた。

結論として、細胞試験と動物試験は、ＭＬＸ、ＭＬＧ、ＭＬＰの３種の抽出物が炎症を抑制する効果があることを示しており、その中でも、ＭＬＰが最も効果があることを示している。

実験例２ 抽出条件の検討
ワモンゴキブリの新鮮な体を１００ｇ／部分で秤量し、ガラス瓶に入れ、それぞれ１５０ｍｌの２５％エタノールを加え、密封し、４０℃で２０日間放置し、取り出し、５０％、６０％、７０％、８０％のエタノールで３回還流抽出し、ここで、１回目の抽出で２．５ＢＶ（２５０ｍｌ）のエタノールを加え、２回目と３回目で３ＢＶ（３００ｍｌ）のエタノールを加え、各抽出は１時間行う、１０メッシュの濾過網で濾過した。濾液を混ぜ合わせ、冷却し、濾紙で濾過して、得た。得られた濾液中の全遊離アミノ酸の量と抽出率を検出した。その結果を図１７に示す。

その結果、エタノールの濃度は、全遊離アミノ酸の抽出量および抽出率にほとんど影響を与えないことが分かった。８０％エタノール群の抽出率はやや低くなるが、透明度が最も高く、濾過速度は最も速く、製造・操作に便利である。同時に、８０％エタノール抽出物は高分子タンパク質の種類が少なく、その後の精製プロセスに便利である。したがって、抽出溶媒として８０％エタノールを選択する。

２）粒子径の選択
エタノールに浸漬したワモンゴキブリの新鮮な体は、柔らかな触感で、粉砕するとホモジネートになり易いので、抽出物の濾過は困難である。また、ワモンゴキブリの新鮮な体は、長さ２．５～３．２ｃｍ、幅１～１．４ｃｍ、重量たった約１．３ｇ、つまり、大きさが小さい。そのため、全身を直接与えても抽出効果に影響はないだろう。

３）直交抽出試験
浸漬した後のワモンゴキブリの新鮮な体のエタノール抽出効果には、多くの要因が影響している。含有される物質の物理的および化学的特性の分析を通じて、検討要因として、抽出の回数、抽出時間、および８０％エタノールの添加の採用を決定した。実際の生産と組み合わせて、要因ごとに３つのレベルを設計する。試験計画を表１８に示す。

要因レベル表により、Ｌ₉（３⁴）直交表を検定に選択した。この表に従って、最大４つの３レベルの要因を配置できる。この実験では、テーブルにランダムに配置された要素は３つだけで、４番目の列は空である。試験項目の要素を左から右に表に記入することにより、試験結果を表１９に記入して、全遊離アミノ酸の抽出量と抽出率を評価指標とし、テスト結果について分散分析する。

試験結果の分散分析によると、Ｆ試験の臨床Ｆｐ表は、Ｆ_0.05（２，２）＝１９．０およびＦ_0.01（２，２）＝９．０であることが分かる。結果を表２０に示す。

範囲分析の結果、抽出時間と固液比は遊離アミノ酸の抽出量と抽出率にほとんど影響を与えず、抽出時間は遊離アミノ酸の抽出量と抽出率に大きな影響を与えたることが分かった。同時に、分散分析の結果、抽出時間は大きなＦ値を持ち、抽出量に大きな影響を与えることが分かった。２つの要因、すなわち、抽出時間と固液比は、抽出結果に有意な影響を与えない。

要約すると、生産効率の向上と生産費用の削減を考慮して、最良の抽出プロセスは次のように決定される：Ａ₃Ｂ₁Ｃ₁、つまり、８０％エタノールによる３回の還流抽出を実行し、ここで、１回目に１．５ＢＶ（３ＢＶまで補充）を加え、２回目と３回目に３ＢＶを加え、毎回１時間抽出を行った。

４）優先プロセス（Ａ₃Ｂ₁Ｃ₁）による試験
直交試験により決定された最適な技術条件に従って、全遊離アミノ酸の収量および抽出比を検討した。

ワモンゴキブリの新鮮な体を１０００ｇ／部分で秤量し、ガラス瓶に入れ、それぞれ１．５Ｌの２５％エタノールを加え、密封し、４０℃で２０日間放置し、取り出し、８０％エタノールで３回還流抽出し、ここで、１回目の抽出で１．５Ｌのエタノールを加え、２回目と３回目で３．０Ｌのエタノールを加え、各抽出は１時間行う、および濾過した。濾液を混ぜ合わせ、冷却し、濾過した。濾液を採取し、全遊離アミノ酸の量と抽出率を検出した。その結果を表２１に示す。

その結果は、浸漬後、ワモンゴキブリの新鮮な体を８０％エタノールで３回抽出し、ここで、各抽出は１時間行い、抽出のために３ＢＶのエタノールを加えたことを示す。全遊離アミノ酸の収率は６．４１％、抽出率は１６．３１％であった。

実験例３ ワモンゴキブリの新鮮な体のエタノール抽出物の混合物の調製プロセスの検討。

１）清澄プロセス用エキスの調製と清澄剤の調製
（ｉ）清澄プロセスのための低濃度エキスの調製
ワモンゴキブリの新鮮な体を１０００ｇ／部分で秤量し、ガラス瓶に入れ、１５００ｍｌの２５％エタノールを加え、密封し、４０℃で２０日間放置し、取り出し、８０％エタノールで３回還流抽出し、ここで、各抽出は１時間行い、１回目の抽出に１．５ＢＶのエタノール（３．０ＢＶに補充、１．５Ｌ）を加え、２回目の抽出と３回目の抽出に３．０ＢＶ（３．０Ｌ）のエタノールを加える、および濾過した。６０～９０℃で減圧下、濾液からエタノールを回収し、相対密度１．０４～１．０８（６０℃）まで濾液を濃縮した後、適量の水を加えて１．０ｇ生薬／ｍｌの薄いエキスを調製し、冷蔵して、使用可能とした。

（ｉｉ）清澄剤の調製
１％ゼラチン溶液：１０ｇのゼラチンを秤量し、５００ｍｌの精製水に３０分間浸漬した後、５００ｍｌの熱水（＞９５℃）を撹拌しながら、すべてのゼラチンが完全に溶解するまで加えて、冷却し、得た。

１％キトサン溶液：１０ｇのキトサンを秤量し、１％氷酢酸溶液１０００ｍｌを撹拌しながら加えて、完全に溶解するまで放置し、得た。

キトサン：ゼラチン（１：３）：１％キトサン溶液と１％ゼラチン溶液を１：３の比率で均一に混合した。

２）清澄剤の選択
前記の薄いエキスの８つの部分を、３０ｍｌ／部（３０ｇの生薬に相当）ずつ取り、それぞれ１８０ｍｌの精製水を加え（すなわち、生薬：薬液＝１：７）、よく混合し、それぞれ３０ｍｌの精製水、３０ｍｌの１％ゼラチン溶液、３０ｍｌの１％キトサン溶液、３０ｍｌのキトサン／ゼラチン（１：３）の混合溶液を撹拌しながら６０℃で加え、６０℃でさらに１０分間撹拌し、冷却し、一晩冷蔵した。抽出物を取り出し、濾過した。試料の濾過時間を記録し、濾液の状態を観察し、濾液の全固形分と全遊離アミノ酸の含有量と光透過率を検出した。その結果を表２２に示す。

試験結果から、全固形分および全遊離アミノ酸の収量は４群間で有意差はないことが分かった。キトサン／ゼラチン（１：３）は、最高の清澄効果、最短の濾過時間、透明な濾液、濾液の高い透過率をもたらす。したがって、清澄剤にキトサン／ゼラチンを選択し、清澄プロセスを研究した。

３）清澄剤の比率の選定
薄いエキスの１０部分を秤量し、３０ｍｌ／部（３０ｇの生薬に相当）に、１８０ｍｌの精製水（すなわち、生薬：薬液＝１：７）を加え、よく混合し、３０ｍｌのキトサン／ゼラチン（２：１）、キトサン／ゼラチン（１：１）、キトサン／ゼラチン（１：２）、キトサン／ゼラチン（１：３）およびキトサン／ゼラチン（１：４）をそれぞれ６０℃で撹拌しながら加え、すべての清澄剤は１％混合溶液であり、６０℃でさらに１０分間撹拌して、冷却し、一晩冷蔵した。抽出物を取り出して濾過した。試料の濾過時間を記録し、濾液の状態を観察し、濾液の全固形分と全遊離アミノ酸の含有量と光透過率を検出した。その結果を表２３に示す。

試験結果から、キトサン／ゼラチンの比率を変えても、全固形分および全遊離アミノ酸の収量に有意な差はないことが分かった。キトサンとゼラチンの比率が（１：３）、（１：４）の場合、濾過時間が最も短く、清澄効果が最も高くなる。キトサン／ゼラチンの比率が（１：３）の場合、濾液の透過率が最も高くなる。したがって、キトサン／ゼラチンの比率として（１：３）を選択する。

４）添加される水の量に関する検討
薄いエキスの１２部分を秤量し、適量の水を加えて生薬濃度がそれぞれ１ｇ／ｍｌ、１／３ｇ／ｍｌ、１／５ｇ／ｍｌ、１／７ｇ／ｍｌ、１／９ｇ／ｍｌ、１／１１ｇ／ｍｌの溶液を調製し、６０℃で清澄剤をゆっくり加え、１０分間撹拌し、冷却して、一晩冷蔵した。抽出物を取り出して濾過した。試料の濾過時間を記録し、濾液の清澄状態を観察し、濾液の全固形分と全遊離アミノ酸の含有量と光透過率を検出した。その結果を表２４に示す。

試験結果から、生薬濃度を１／３～１／７ｇ／ｍｌの間で変化させても、全遊離アミノ酸および全固形分の収率に有意な影響はないことが分かる。生薬濃度が１／３ｇ／ｍｌ未満であれば、清澄効果が高く、濾過速度が速く、濾液の光透過率が８０％以上であり、生産効率と費用のバランスが取れている。したがって、生薬濃度は１／３ｇ／ｍｌを選択する。

５）清澄剤量の検討
希釈抽出物の１２部分を秤量し、水を加え、それぞれ生薬濃度１／３ｇ／ｍｌの溶液を調製し、よく混合し、６０℃で０．１～１．２ｍｌ／ｇ生薬の清澄剤をゆっくり加え、１０分間撹拌し、冷却し、一晩冷蔵した。抽出物を取り出して濾過した。試料の濾過時間を記録し、濾液の清澄状態を観察し、濾液の全固形分および全遊離アミノ酸の含有量と光透過率を検出した。その結果を表２５に示す。

その結果、清澄剤の量が０．２～１．０ｍｌ／ｇ生薬の場合、濾液が清澄化され、濾過時間が短く、光透過率が７０％以上であることが分かった。０．２～０．６ｍｌ／ｇ生薬の場合、清澄剤中の全固形分および全遊離アミノ酸の収率がいずれも高くなることが分かった。したがって、清澄剤の量は０．２～０．６ｍｌ／ｇ生薬である。

６）清澄温度の検討
薄いエキスの８部分を秤量し、水を加えて、それぞれ生薬濃度１／３ｇ／ｍｌの溶液を調製し、よく混合し、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃で０．６ｍｌ／ｇ生薬の清澄剤をゆっくり加え、１０分間撹拌し、冷却し、一晩冷蔵した。抽出物を取り出して濾過した。試料の濾過時間を記録し、濾液の清澄状態を観察し、濾液の全固形分および全遊離アミノ酸の含有量と光透過率を検出した。その結果を表２６に示す。

その結果、清澄温度は水溶性全固形分および全遊離アミノ酸の収率に有意な影響を及ぼさないことが分かった。６０℃～７０℃の温度で清澄化した場合、試料の濾過時間は最短であり、濾液の光透過率は８０％を超える。したがって、清澄温度は６０℃～７０℃を選択する。

７）熱処理および冷蔵プロセスに関する検討
（ｉ）熱処理プロセスの検討
薄いエキスの４部分を秤量し、水を加え、生薬濃度がそれぞれ１／３ｇ／ｍｌの溶液を調製し、よく混合した。２部分を１０分間煮沸し、清澄剤０．６ｍｌ／ｇ生薬をそれぞれ７０℃でゆっくり加え、１０分間撹拌し、冷却し、一晩冷蔵した。抽出物を取り出して濾過した。試料の濾過時間を記録し、濾液の清澄状態を観察し、濾液の全固形分および全遊離アミノ酸の含有量と光透過率を検出した。その結果を表２７に示す。

その結果、熱処理および冷蔵プロセスの有無は、水溶性全固形分および全遊離アミノ酸の収率に大きな影響を与えないことが分かった。しかし、熱処理や冷凍プロセスを施した試料は、濾過され易くなる。そこで、煮沸ステップを追加し、煮沸順序が濾過に与える影響について検討した。

（ｉｉ）沸騰の順序の検討
エキスの２部分を秤量し、水を加えてそれぞれ生薬濃度１／３ｇ／ｍｌの溶液を調製し、よく混合した。一部分を、１０分間煮沸し、６０℃に冷却し、０．６ｍｌ／ｇ生薬の清澄剤をゆっくり加え、１０分間撹拌した。別の一部に６０℃で０．６ｍｌ／ｇの清澄剤をゆっくりと加え、１０分間撹拌し、１０分間沸騰し、冷却し、一晩冷蔵した。２つの部分を取り出して濾過した。試料の濾過時間を記録し、濾液の清澄状態を観察し、濾液の全固形分および全遊離アミノ酸の含有量と光透過率を検出した。その結果を表２８に示す。

その結果、煮沸の順序は水溶性全固形分および全遊離アミノ酸の収率に大きな影響を及ぼさないことが分かった。また、濾過液の清澄化も同様である。先に煮沸して清澄化した試料は、濾過速度が速い。それを考えると、実際の生産では、まず加熱して煮沸し、６０～７０℃に冷却して清澄化した後、冷却して冷蔵した方が、より滑らかになるであろう。したがって、まず煮沸した後、清澄化のために６０～７０℃に冷却する順序を選択する。

（ｉｉｉ）沸騰時間の検討
薄いエキスの適量を秤量し、水を加えて生薬濃度１／３ｇ／ｍｌの溶液を調製し、よく混合し、６部分に分け、それぞれ１０分、３０分、６０分煮沸し、７０℃まで冷却し、０．６ｍｌ／ｇの清澄剤をゆっくり加え、１０分間撹拌し、冷却し、一晩冷蔵し、取り出して、濾過した。試料の濾過時間と濾液の清澄状態を記録した。その結果を表２９に示す。

その結果、煮沸時間が長くなると、濾過時間が若干長くなることが分かった。したがって、煮沸時間を１０～３０分に制御することがより適切であろう。

８）清澄および冷蔵温度と冷蔵時間の決定
ワモンゴキブリの新鮮な体を２０００ｇ秤量し、ガラス瓶に入れ、２５％エタノール１．５ＢＶを加え、密封し、４０℃で３６日間放置し、取り出し、８０％エタノールで３回還流抽出し、ここで、各抽出は１時間行い、１回目の抽出に１．５ＢＶのエタノールを加え、２回目と３回目に３．０ＢＶのエタノールを加える、および濾過した。濾液を混ぜ合わせて冷却した。６５℃で減圧下、エタノールを回収した。濾液を相対密度１．０６（６０℃）まで濃縮し、水を６０００ｍｌまで加え、１０分間煮沸し、７０℃まで冷却し、清澄剤６００ｍｌをゆっくり加え、１０分間撹拌し、冷却し、１６分割し、それぞれ１℃と８℃で冷蔵し、１６時間、２４時間、４０時間および４８時間後にそれぞれ取り出し、濾過した。試料の濾過時間と濾液の清澄化状態を記録し、濾液中の全固形分、全遊離アミノ酸の収率および光透過率を検出した。その結果を表３０に示す。

その結果、冷蔵時間と温度は、試料の濾過時間、清澄度、全固形分および全遊離アミノ酸の収率に影響を及ぼさないことが分かった。１℃群の冷蔵試料の光透過率は、８℃群より若干高くなっている。実際の生産状況に応じて、清澄液は１℃～８℃で１６時間～４８時間静置することを選択する。

９）清澄化プロセス繰り返し試験
ワモンゴキブリの新鮮な体を１０００ｇ／部分秤量し、ガラス瓶に入れ、１５００ｍｌの２５％エタノールを加え、密封し、４０℃で２０日間放置し、取り出し、８０％エタノールで３回還流抽出し、ここで、各抽出は１時間行い、１回目の抽出に１．５ＢＶ（１．５Ｌ）のエタノールを加え、２回目と３回目に３．０ＢＶ（３．０Ｌ）のエタノールを加える、および濾過した。濾液を混ぜ合わせ、冷却した。６５℃で減圧下、エタノールを回収した。濾液を相対密度１．０５（６０℃）まで濃縮し、３０００ｍｌまで水を加え、１０分間煮沸し、７０℃まで冷却し、清澄剤６００ｍｌをゆっくり加え、１０分間撹拌し、冷却し、一晩冷蔵し、濾過した。試料の濾過時間と濾液の清澄化状態を記録し、濾液中の全固形分、全遊離アミノ酸の含有量および光透過率を検出した。その結果を表３１に示す。

繰り返しテストの結果、清澄効果は良好で、濾過も滑らかであることが分かった。水溶性全固形分、全遊離アミノ酸、全アミノ酸の転化率は９０％以上である。

１０）製剤形成プロセス
（１）製剤形成プロセスの説明
ワモンゴキブリの清澄液（生薬２００ｇに相当）を適量秤量し、グリセロール１５０ｇ、ソルビン酸カリウム１ｇを加え、１０００ｍｌまで水を加え、よく混合し、濾過（０．２２μｍ～０．４５μｍミクロポーラス濾過膜）し、瓶詰めし、１１６℃±２℃で４０分間殺菌し、冷却し、検査し、表示し、包装し、検査し、完成品を得た。

（２）滅菌方法の選択
混合物は通常、湿熱殺菌法を採用する。中国薬局方２０１５年版１４２１の滅菌方法による湿熱殺菌条件は、通常１２１℃×１５分、１２１℃×３０分、または１１６℃×４０分のプログラムを採用する。実生産を考慮し、本製剤の滅菌条件は１１６℃±２℃×４０分とした。同時に、殺菌前後の試料の物性、ｐＨ値、相対密度、全遊離アミノ酸の含有量の違いを比較した。

清澄液の適量（生薬８０ｇ相当）を秤量し、グリセロール６０ｇおよびソルビン酸カリウム０．４ｇを加え、４００ｍｌまで水を加え、よく混合し、濾過し、瓶詰めした。半数の試料を１１６℃、４０分間殺菌した後、取り出して冷却した。それぞれ試料を採取して特性を観察し、サンプルのｐＨ値、相対密度、総遊離アミノ酸含有量を測定した。その結果を表３２に示す。

その結果、殺菌プロセスによって、殺菌前後の試料の物性、ｐＨ値、相対密度、全遊離アミノ酸に大きな差はないことが分かった。

（３）形成プロセス繰り返し試験
１０００ｇ／部分のワモンゴキブリの新鮮な体を秤量し、ガラス瓶に入れ、１５００ｍｌの２５％エタノールを加え、密封し、４０℃で２０日間放置し、取り出し、８０％エタノールで３回還流抽出し、ここで、各抽出は１時間行い、１回目の抽出に１．５ＢＶ（１．５Ｌ）のエタノールを加え、２回目と３回目に３．０ＢＶ（３．０Ｌ）のエタノールを加える、および濾過した。濾液を混ぜ合わせ、冷却した。６５℃で減圧下、エタノールを回収した。濾液を相対密度１．０６（６０℃）まで濃縮し、冷却し、３０００ｍｌまで水を加え、よく混合し、１０分間煮沸し、７０℃まで冷却し、清澄剤６００ｍｌをゆっくり加え、１０分間撹拌し、冷却し、一晩冷蔵し、濾過し、ワモンゴキブリの新鮮な体の澄明な溶液を得た。清澄液の適量（新鮮な体２００ｇに相当）を秤量し、ソルビン酸カリウム１．０ｇおよびグリセロール１５０ｇを加え、よく混合し、１０００ｍｌまで水を加え、よく混合し、濾過し、１０ｍｌ／瓶で瓶詰めし、１１５℃で４０分間滅菌した。

（４）小規模試験試料の薬力学的試験の結果
１）薬力学的試料の調製
１０００ｇ／部分のワモンゴキブリの新鮮な体を秤量し、ガラス瓶に入れ、１５００ｍｌの２５％エタノールを加え、密封し、４０℃で２０日間放置し、取り出し、８０％エタノールで３回還流抽出し、ここで、各抽出は１時間行い、１回目の抽出に１．５ＢＶ（１．５Ｌ）のエタノールを加え、２回目と３回目に３．０ＢＶ（３．０Ｌ）のエタノールを加える、および濾過した。濾液を混ぜ合わせた。６５℃で減圧下、エタノールを回収した。濾液を相対密度１．０４（６０℃で測定）まで濃縮し、３０００ｍｌまで水を加え、よく撹拌し、１０分間煮沸し、７０℃に冷却し、清澄剤６００ｍｌをゆっくり加え、１０分間撹拌し、冷却し、一晩冷蔵し、濾過し、ワモンゴキブリの新鮮な体の透明溶液を得た。清澄液６１０ｍｌ（新鮮な体２００ｇ相当）を秤量し、ソルビン酸カリウム１．０ｇ、グリセロール１５０ｇを加え、よく撹拌し、１０００ｍｌまで水を加えてよく撹拌し、濾過し、１０ｍｌ／瓶で瓶詰めし、１１５℃で４０分間滅菌した。小規模の試料は、名称／コードがＧＤ－Ｎ１９０１であり、バッチ番号が１９０８０１である。

２）薬力学的試験の結果
ゴールデンハムスターの左頬袋に４０ＧｙのＸ線を照射した（照射面積：１．８２ｃｍ²）。口腔粘膜炎発症の後、１～２点の４０匹を口腔粘膜炎の点数（補助的な参照指標：動物体重）に応じてランダムに４群（モデル対照群１群、薬物治療群３群）に分けた。その後、腹腔内注射または胃内投与を併用する患部への浸潤により、対応する薬剤を１４日間投与した（１２～２５日、２回）。投与量を表３３に示す。動物口腔粘膜炎の点数（変形ソニス（Ｓｏｎｉｓ）採点法）の検出を通じて、ハムスターの放射線口腔粘膜炎に対する試験薬物の治療効果を評価した。その結果を表３４に示す。

ゴールデンハムスターの口腔粘膜炎の潰瘍発症時期は、モデリングから１２～１８日であった。口腔粘膜炎の点数が急激に増加し、１８日に頂点に達した（４点）。モデリングの後の２０日～２６日（Ｄ２０～Ｄ２６）から、潰瘍は回復期にあり、各群における動物の腔粘膜炎の点数は順調に減少を続けた。薬物介入後、モデル対照群（モデル）動物の口腔粘膜炎の点数は、投与の２日から試験終了まで（１４日～２６日）は最高の状態であった。オドキン（Ｏｄｋｉｎ）治療群、高容量群、低用量群の口腔粘膜炎の点数はモデル対照群のそれよりも低かった。全回復期間において、低用量群は、点数が最も低く、最も回復している。２０日から２４日まで、低用量群および高用量群における口腔粘膜炎の点数は、モデル群およびモデル対照群のそれよりも有意に低かった（Ｐ＜０．０５）。その結果、試料の投与量が低い場合と高い場合では、ハムスターの口腔粘膜炎の回復を有意に促進できることが分かった。

Claims (38)

1. 以下のステップ：
   １）新鮮なワモンゴキブリを２０～４５％エタノールに３０～５０℃で１０～６０日間浸漬するステップと；
   ２）５０～８０％エタノールを加え、還流抽出した後、濾過して、濾液を回収するステップと；
   ３）濾液をエキスに濃縮して得るステップと
   を含むことを特徴とする、ワモンゴキブリ抽出物を調製するための方法。
2. ステップ１）における浸漬するためのエタノールの濃度は、２５％～４５％であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. ステップ１）における浸漬時間は、２０～６０日であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
4. ステップ１）における浸漬温度は、４０℃であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
5. ステップ１）における２０～４５％エタノールの量は、新鮮なワモンゴキブリの重量の１．５～３．５倍であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
6. ステップ２）において加えられる５０～８０％エタノールの量は、新鮮なワモンゴキブリの重量の１．５～３．５倍であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
7. ステップ２）における還流の回数は、１～３回であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
8. ステップ２）における還流の時間は、１～２時間であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
9. ステップ３）における濃縮は、減圧濃縮であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
10. ステップ３）における減圧濃縮の温度は、６０℃～９０℃であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
11. ステップ３）におけるエキスの６０℃での相対密度は、１．０４～１．０８であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
12. １）新鮮なワモンゴキブリを２５～４５％エタノールに３０～５０℃で１０～６０日間浸漬するステップと；
    ２）５０～８０％エタノールで還流抽出した後、濾過して、濾液を回収するステップと；
    ３）濾液をエキスに濃縮して得るステップと
    によって調製されたワモンゴキブリ抽出物。
13. 抽出物中の遊離アミノ酸の含有量は、３０～５５％であることを特徴とする、請求項１２に記載のワモンゴキブリ抽出物。
14. 請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法によって調製されたワモンゴキブリ抽出物または請求項１２から１３のいずれか一項に記載のワモンゴキブリ抽出物と、賦形剤とを含有することを特徴とする、ワモンゴキブリ抽出物を含有する製剤。
15. 賦形剤は、キトサン、ゼラチン、およびキトサンとゼラチンの組成物からなる群より選択される清澄剤を含むことを特徴とする、請求項１４に記載の製剤。
16. 清澄剤は、キトサンとゼラチンの組成物であり、キトサンは１％キトサン溶液であり、ゼラチンは１％ゼラチン溶液であることを特徴とする、請求項１５に記載の製剤。
17. １％キトサン溶液対１％ゼラチン溶液の比は、１：１～１：４であることを特徴とする、請求項１６に記載の製剤。
18. 清澄プロセスにおける生薬濃度は、１／３～１／１１ｇ／ｍｌであることを特徴とする、請求項１５に記載の製剤。
19. 製剤中の清澄剤の量は、０．２～１．０ｍｌ／ｇ生薬であることを特徴とする、請求項１５に記載の製剤。
20. 賦形剤は、甘味料および防腐剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１５に記載の製剤。
21. 甘味料は、グリセロール、チクロ、アスパルテームまたはステビオシドであり；防腐剤は、ヒドロキシフェニルアルキルエステル、安息香酸、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸またはソルビン酸カリウムであることを特徴とする、請求項２０に記載の製剤。
22. 製剤は、伝統的な漢方薬混合物であることを特徴とする、請求項１４に記載の製剤。
23. ワモンゴキブリ抽出物を水で希釈するステップと、次に１００℃に加熱するステップと、７０℃に冷却するステップと、撹拌しながら清澄剤を加えるステップと、冷蔵するステップと、濾過するステップと、濾液にグリセロールとソルビン酸カリウムを加えるステップと、最後に残りの水を加えるステップと、よく混合するステップと、微孔性フィルター膜で濾過するステップと、滅菌するステップとを含むことを特徴とする、請求項１４から２２のいずれか一項に記載の製剤を調製するための方法。
24. ワモンゴキブリの新鮮な体を秤量するステップと、新鮮な体の１．５倍の重量の２５％エタノールを加えるステップと、密封するステップと、４０℃で２０日間放置するステップと、取り出すステップと、８０％エタノールで３回還流抽出するステップであって、各抽出は１時間行い、１回目の抽出に１．５ＢＶを加え、２回目と３回目の抽出に３．０ＢＶを加えるステップ、濾過して濾液を回収するステップと、６５℃で減圧下、エタノールを回収して、相対密度１．０４（６０℃で測定）に濃縮するステップと、新鮮な昆虫の３倍の重量になるまで水を加えるステップと、よく混合するステップと、１０分間加熱および煮沸するステップと、７０℃に冷却するステップと、清澄剤をゆっくりと加えるステップと、撹拌するステップと、冷却するステップと、一晩冷蔵して濾過し、ワモンゴキブリの新鮮な体の透明な溶液を得るステップと、次にソルビン酸カリウムとグリセロールを加えるステップと、よく混ぜるステップと、水を加えるステップと、よく混ぜるステップと、濾過するステップと、１１５℃で４０分間滅菌して得るステップとを含むことを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
25. 抗炎症薬物を調製するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法により調製されたワモンゴキブリ抽出物を含有する製剤、請求項１２から１３のいずれか一項に記載のワモンゴキブリ抽出物を含有する製剤、または請求項１４から２２のいずれか一項に記載の製剤の使用。
26. ステップ１における浸漬のためのエタノールの濃度が２５％である請求項２に記載の方法。
27. ステップ１における浸漬時間が２０～４０日間である、請求項３に記載の方法。
28. ステップ２において加えられるエタノールの濃度が８０％である、請求項１に記載の方法。
29. ステップ２において加えられるエタノールの量が、新鮮なワモンゴキブリの重量の１．５倍である、請求項６に記載の方法。
30. ステップ２において、１回目の還流において加えられるエタノールの量が新鮮なワモンゴキブリの重量の１．５倍であり、２および３回目の還流において加えられるエタノールの量が新鮮なワモンゴキブリの重量の３倍である、請求項７に記載の方法。
31. １％キトサン溶液対１％ゼラチン溶液の比が１：３～１：４である、請求項１７に記載の製剤。
32. １％キトサン溶液対１％ゼラチン溶液の比が１：３である、請求項３１に記載の製剤。
33. 清澄プロセスにおける生薬濃度が１／３～１／７ｇ／ｍｌである、請求項１８に記載の製剤。
34. 清澄プロセスにおける生薬濃度が１／３ｇ／ｍｌである、請求項３３に記載の製剤。
35. 製剤中の清澄剤の量が０．２～０．６ｍｌ／ｇ生薬である、請求項１９に記載の製剤。
36. 甘味料の量が５～２０％である、請求項２０に記載の製剤。
37. 防腐剤の量が０．０５～０．３％である、請求項２０に記載の製剤。
38. 甘味料がグリセロールであり、防腐剤がソルビン酸カリウムである、請求項２１に記載の製剤。