JP7367262B1 - 抗体含有製剤の調製方法 - Google Patents

Abstract

凝固第ＶＩＩＩ因子を代替する抗血液凝固第ＩＸａ／Ｘ因子抗体（二種特異性モノクローナル抗体）又はインターロイキン６の受容体との結合を阻害する抗ＩＬ－６受容体抗体を含有する粒子の形成が低減された医薬製剤を提供する。ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（ポロクサマー）を含む水溶液を含んでなる医薬製剤であって、
ポロクサマーは、式Ｉ：
ＨＯ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａ（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｃＨ （Ｉ）
［式中、ａおよびｃは独立に７５～８５から選択される整数であり、
ｂは２２～３３から選択される整数であり、
ａ、ｂおよびｃはポロクサマー全体における平均値である］
で表され、
ポロクサマーが、（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）を分子内に３４以上含むポロクサマー分子をポロクサマー全体に対して３％（ｗ／ｗ）以上の比率で含む、医薬製剤を提供する。

Description

本発明は、抗体を含有する安定な医薬製剤に関する。

近年、種々の抗体製剤が開発され実用に供されているが、抗体含有製剤においては、水溶液中での粒子の形成が問題となる。形成する粒子としては、抗体に由来する凝集体であり、一般的に目で見るのは困難とされる、１．５μｍ～５０μｍ未満までの粒径の微粒子であるサブビジブル粒子（sub-visible particle、ＳＶＰ）や、標準照度（２，０００－３，０００ｌｘ程度）で目視により検出可能な可視粒子（visible particle：ＶＰ、１００μｍより大きい）が知られている。なお、医薬製剤における可視粒子の目視による検出率は実施者による間差が大きいが、薬局方に規定されている標準照度（２，０００－３，０００ｌｘ程度）においては１００μｍの粒径の粒子の検出感度が４０％程度、１５０μｍの粒径の粒子の検出感度が７０％程度、２００μｍの粒径の粒子の検出感度がほぼ１００％となることが報告されている（非特許文献１）。また、医薬製剤を観察する照度を上げたり、観察時間を長くすることで、実際には最小４０μｍ程度の更に小さな粒径の粒子まで目視で検出することも可能である。

粒子の形成を低減するために界面活性剤を用いることが知られている。このような界面活性剤としては、ポロクサマー１８８（ＰＸ１８８）等のポロクサマー及びポリソルベート２０、ポリソルベート８０等のポリソルベートを含む非イオン性界面活性剤が挙げられる。しかし、粒子の形成を低減する能力は界面活性剤の種類及びグレードによって異なる（非特許文献２～４、特許文献１）。また、同種の界面活性剤であっても、含有される高分子の構造が不均一であることが知られている。ポロクサマー１８８は、ロット間でばらつきがあることが知られており、より均一なポロクサマー１８８を提供するための方法が研究されている（非特許文献２、特許文献２～５）。さらに、界面活性剤の不均一性の結果として生じる疎水度の違いが粒子の形成に影響する可能性があることが報告されている（非特許文献２）。

特表２０２０－５３４２６０号公報 特表２０１７－５２３８２８号公報 特表２０１９－５１１６０６号公報 特表２００９－５０８１３２号公報 特表２０１４－５０２６５６号公報

James A. Melchore, AAPS PharmSciTech; 2011; 12(1): 215-221. Chen et al., J. Chromatogr. A 1652 (2021) 462353. Grapentin et al., J. Pharm. Sci. 109 (2020) 2393-2404. Vaclaw et al., J. Pharm. Sci. 110 (2021) 746-759.

凝固第ＶＩＩＩ因子を代替する抗血液凝固第ＩＸａ／Ｘ因子抗体（二種特異性モノクローナル抗体）又はインターロイキン６の受容体との結合を阻害する抗ＩＬ－６受容体抗体において界面活性剤の疎水度がどの程度であれば粒子の形成が低減されるか知られていなかった。また、粒子の形成に対する界面活性剤を含む溶液の表面張力及び界面活性剤に含まれる不純物（例えば、不飽和結合を有する未反応の中間体化合物など）の影響は知られていなかった。粒子の発生を抑制するためのより良い界面活性剤が求められている。

本発明者らは、ポリプロピレンオキシドブロックが長く疎水度の高い成分を含有するポロクサマーなどの界面活性剤の添加が、特定の抗体を含む医薬製剤において粒子の形成を低減するために有効であることを見出した。本明細書は以下の発明の開示を包含する。

［１－１］配列番号１及び２のＨ鎖と配列番号３のＬ鎖を有する抗体、又は配列番号４のＨ鎖と配列番号５のＬ鎖を有する抗体から選択されるモノクローナル抗体、及びポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（ポロクサマー）を含む水溶液を含んでなる医薬製剤であって、
ポロクサマーは、式Ｉ：
ＨＯ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａ（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｃＨ （Ｉ）
［式中、ａおよびｃは独立に７５～８５から選択される数であり、
ｂは２２～４０から選択される数であり、
ａ、ｂおよびｃはポロクサマー全体における平均値である］
で表され、
下記で定義する条件による高速液体クロマトグラフィーにおいて溶出時間が１７分以後のピーク面積が全ピーク面積に対して３％以上である、医薬製剤：
［高速液体クロマトグラフィーの条件］
（１）カラム：マクロポーラス型スチレンジビニルベンゼンを充填したＨＰＬＣカラム（１０００Å、５μｍ、５０×２．１ｍｍ）
（２）移動相：
移動相Ａ：超純水
移動相Ｂ：アセトニトリル
（３）溶出配プログラム
０分から１６．０分まで：移動相Ｂ ５８％から６４％へ
１６．０分から１８．５分まで：移動相Ｂ ６４％から９０％へ
１８．５分から２１．５分まで：移動相Ｂ ９０％で固定
２１．５分から２３．５分まで：移動相Ｂ ９０％から１００％へ
２３．５分から３０．０分まで：移動相Ｂ １００％で固定
３０．０分から３０．１分まで：移動相Ｂ １００％から５８％へ
３０．１分から４０．０分まで：移動相Ｂ ５８％で固定
（４）流速：０．２ｍＬ／分
（５）検出方法：蒸発光散乱検出（ドリフトチューブ温度：５０±２５℃、ネブライザー加熱パワーレベル：７５％、ゲイン値：２５０、ガス圧：２０ｐｓｉ）
（６）カラム温度：６５±５℃
（７）ポロクサマー濃度（超純水中）：０．５ｍｇ／ｍＬ。

［１－２］ｂが２２～３３から選択される数である、［１－１］に記載の医薬製剤。
［１－３］ｂが２５～３０から選択される数である、［１－１］に記載の医薬製剤。
［１－４］ｂが３５～４０から選択される数である、［１－１］に記載の医薬製剤。

［１－５］１７分以後のピーク面積が６％以上、１９％以上、３３％以上、又は３５％以上である、［１－１］～［１－４］のいずれかに記載の医薬製剤。
［１－６］配列番号１及び２のＨ鎖と配列番号３のＬ鎖を有する抗体、又は配列番号４のＨ鎖と配列番号５のＬ鎖を有する抗体から選択されるモノクローナル抗体、及びポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（ポロクサマー）を含む水溶液を含んでなる医薬製剤であって、
ポロクサマーは、式Ｉ：
ＨＯ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａ（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｃＨ （Ｉ）
［式中、ａおよびｃは独立に７５～８５から選択される数であり、
ｂは２２～４０から選択される数であり、
ａ、ｂおよびｃはポロクサマー全体における平均値である］
で表され、
下記で定義する条件による高速液体クロマトグラフィーにおいて溶出時間が１７分以後のピーク面積が１．５分以後の全ピーク面積に対して３％以上である、医薬製剤：
［高速液体クロマトグラフィーの条件］
（１）カラム：マクロポーラス型スチレンジビニルベンゼンを充填したＨＰＬＣカラム（１０００Å、５μｍ、５０×２．１ｍｍ）
（２）移動相：
移動相Ａ：超純水
移動相Ｂ：アセトニトリル
（３）溶出配プログラム
０分から１６．０分まで：移動相Ｂ ５８％から６４％へ
１６．０分から１８．５分まで：移動相Ｂ ６４％から９０％へ
１８．５分から２１．５分まで：移動相Ｂ ９０％で固定
２１．５分から２３．５分まで：移動相Ｂ ９０％から１００％へ
２３．５分から３０．０分まで：移動相Ｂ １００％で固定
３０．０分から３０．１分まで：移動相Ｂ １００％から５８％へ
３０．１分から４０．０分まで：移動相Ｂ ５８％で固定
（４）流速：０．２ｍＬ／分
（５）検出方法：蒸発光散乱検出（ドリフトチューブ温度：５０±２５℃、ネブライザー加熱パワーレベル：７５％、ゲイン値：２５０、ガス圧：２０ｐｓｉ）
（６）カラム温度：６５±５℃
（７）ポロクサマー濃度（超純水中）：０．５ｍｇ／ｍＬ。

［１－７］ｂが２２～３３から選択される数である、［１－６］に記載の医薬製剤。
［１－８］ｂが２５～３０から選択される数である、［１－６］に記載の医薬製剤。
［１－９］ｂが３５～４０から選択される数である、［１－６］に記載の医薬製剤。

［１－１０］１７分以後のピーク面積が６％以上、２０％以上、３６％以上、又は４６％以上である、［１－６］～［１－９］に記載の医薬製剤。
［１－１１］マクロポーラス型スチレンジビニルベンゼンを充填したＨＰＬＣカラムがＰＬＲＰ－Ｓカラムである［１－１］～［１－１０］のいずれかに記載の医薬製剤。

［１－１２］配列番号１及び２のＨ鎖と配列番号３のＬ鎖を有する抗体、又は配列番号４のＨ鎖と配列番号５のＬ鎖を有する抗体から選択されるモノクローナル抗体、及びポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（ポロクサマー）を含む水溶液を含んでなる医薬製剤であって、
ポロクサマーは、式Ｉ：
ＨＯ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａ（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｃＨ （Ｉ）
［式中、ａおよびｃは独立に７５～８５から選択される数であり、
ｂは２２～４０から選択される数であり、
ａ、ｂおよびｃはポロクサマー全体における平均値である］
で表され、
ポロクサマーが、（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）を分子内に３４以上含むポロクサマー分子をポロクサマー全体に対して３％（ｗ／ｗ）以上の比率で含む、医薬製剤。

［１－１３］ｂが２２～３３から選択される数である、［１－１２］に記載の医薬製剤。
［１－１４］ｂが２５～３０から選択される数である、［１－１２］に記載の医薬製剤。

［１－１５］ｂが３５～４０から選択される数である、［１－１２］に記載の医薬製剤。
［１－１６］（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）を分子内に３４以上含むポロクサマー分子をポロクサマー全体に対して６％、２０％、２９％、または３６％（ｗ／ｗ）以上の比率で含む、［１－１２］～［１―１５］のいずれかに記載の医薬製剤。

［１－１７］ポロクサマーの数平均分子量が、７６８０～９５１０の範囲に含まれる、［１－１］～［１－１６］のいずれかに記載の医薬製剤。
［１－１８］水溶液中のポロクサマーの濃度が０．００１～１００ｍｇ／ｍＬ、０．０１～１０ｍｇ／ｍＬ、０．０５～５ｍｇ／ｍＬ、又は０．１～１ｍｇ／ｍＬである、［１－１］～［１－１７］のいずれかに記載の医薬製剤。

［１－１９］水溶液中の抗体の濃度が１０～３００ｍｇ／ｍＬ、２０～２００ｍｇ／ｍＬ、又は３０～１５０ｍｇ／ｍＬである、［１－１］～［１－１８］のいずれかに記載の医薬製剤。

［１－２０］水溶液が、糖、糖アルコール、緩衝剤、保存剤、担体、酸化防止剤、キレート剤、天然ポリマー、合成ポリマー、凍結保護剤、増量剤、および安定化剤から選択される、１以上の薬学的に許容される賦形剤を含む、［１－１］～［１－１９］のいずれかに記載の医薬製剤。

［１－２１］ポロクサマーがポロクサマー１８８又はポロクサマー２３７である、［１－１］～［１－２０］のいずれかに記載の医薬製剤。
［２－１］配列番号１及び２のＨ鎖と配列番号３のＬ鎖を有する抗体、又は配列番号４のＨ鎖と配列番号５のＬ鎖を有する抗体から選択されるモノクローナル抗体、及び界面活性剤を含む水溶液を含んでなる医薬製剤であって、
界面活性剤は、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度の当該界面活性剤を含有する水溶液が５２．３ｍＮ／ｍ以下の表面張力を有する界面活性剤である、医薬製剤。

［２－２］界面活性剤は、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度の当該界面活性剤を含有する水溶液が５２ｍＮ／ｍ以下、５１ｍＮ／ｍ以下、５０．７ｍＮ／ｍ以下、５０．５ｍＮ／ｍ以下、又は３９ｍＮ／ｍ以下の表面張力を有する界面活性剤である、［２－１］に記載の医薬製剤。

［２－３］界面活性剤が、ポロクサマー、又は脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート）から選択される、［２－１］又は［２－２］に記載の医薬製剤。
［２－４］界面活性剤が［１－１］～［１－４］又は［１－２１］のいずれかに記載の式Ｉで表されるポロクサマーである、［２－１］～［２－３］のいずれかに記載の医薬製剤。

［２－５］ポロクサマーがポロクサマー１８８又はポロクサマー２３７である、［２－３］に記載の医薬製剤。
［２－６］ポロクサマーの数平均分子量が、７６８０～９５１０の範囲に含まれる、［２－４］又は［２－５］に記載の医薬製剤。

［２－７］界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、又はポリソルベート８０から選択されるポリソルベートである、［２－１］～［２－６］のいずれかに記載の医薬製剤。

［２－８］界面活性剤が、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０から選択されるソルベートである、［２－１］～［２－７］のいずれかに記載の医薬製剤。
［２－９］界面活性剤がポリソルベート８０である、［２－１］～［２－８］のいずれかに記載の医薬製剤。

［２－１０］水溶液中の界面活性剤の濃度が０．００１～１００ｍｇ／ｍＬ、０．０１～１０ｍｇ／ｍＬ、０．０５～５ｍｇ／ｍＬ、又は０．１～１ｍｇ／ｍＬである、［２－１］～［２－９］のいずれかに記載の医薬製剤。

［２－１１］水溶液中の抗体の濃度が１０～３００ｍｇ／ｍＬ、２０～２００ｍｇ／ｍＬ、又は３０～１５０ｍｇ／ｍＬである、［２－１］～［２－１０］のいずれかに記載の医薬製剤。

［２－１２］水溶液が、糖、糖アルコール、緩衝剤、保存剤、担体、酸化防止剤、キレート剤、天然ポリマー、合成ポリマー、凍結保護剤、増量剤、および安定化剤から選択される１以上の薬学的に許容される賦形剤を含む、［２－１］～［２－１１］のいずれかに記載の医薬製剤。

［３－１］配列番号１及び２のＨ鎖と配列番号３のＬ鎖を有する抗体、又は配列番号４のＨ鎖と配列番号５のＬ鎖を有する抗体から選択されるモノクローナル抗体、及びポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（ポロクサマー）を含む水溶液を含んでなる医薬製剤であって、
ポロクサマーは、式Ｉ：
ＨＯ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａ（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｃＨ （Ｉ）
［式中、ａおよびｃは独立に７５～８５から選択される数であり、
ｂは２２～４０から選択される数であり、
ａ、ｂおよびｃはポロクサマー全体における平均値である］
で表され、
ポロクサマーの不飽和度が０．０１８ｍＥｑ／ｇ未満である、医薬製剤。

［３－２］ｂが２２～３３から選択される数である、［３－１］に記載の医薬製剤。
［３－３］ｂが２５～３０から選択される数である、［３－１］に記載の医薬製剤。
［３－４］ｂが３５～４０から選択される数である、［３－１］に記載の医薬製剤。

［３－５］ポロクサマーの数平均分子量が、７６８０～９５１０の範囲に含まれる、［３－１］～［３－４］のいずれかに記載の医薬製剤。
［３－６］水溶液中のポロクサマーの濃度が０．００１～１００ｍｇ／ｍＬ、０．０１～１０ｍｇ／ｍＬ、０．０５～５ｍｇ／ｍＬ、又は０．１～１ｍｇ／ｍＬである、［３－１］～［３－５］のいずれかに記載の医薬製剤。

［３－７］水溶液中の抗体の濃度が１０～３００ｍｇ／ｍＬ、２０～２００ｍｇ／ｍＬ、又は３０～１５０ｍｇ／ｍＬである、［３－１］～［３－６］のいずれかに記載の医薬製剤。

［３－８］水溶液が、糖、糖アルコール、緩衝剤、保存剤、担体、酸化防止剤、キレート剤、天然ポリマー、合成ポリマー、凍結保護剤、増量剤、および安定化剤から選択される１以上の薬学的に許容される賦形剤を含む、［３－１］～［３－７］のいずれかに記載の医薬製剤。

［３－９］ポロクサマーがポロクサマー１８８又はポロクサマー２３７である、［３－１］～［３－８］のいずれかに記載の医薬製剤。
［４－１］水溶液中に配列番号１及び２のＨ鎖と配列番号３のＬ鎖を有する抗体、又は配列番号４のＨ鎖と配列番号５のＬ鎖を有する抗体から選択されるモノクローナル抗体を含む医薬製剤において、水溶液中での粒子の発生を低減させる方法、であって、
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（ポロクサマー）を水溶液中に加えることを含み、
ポロクサマーが、式Ｉ：
ＨＯ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａ（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｃＨ （Ｉ）
［式中、ａおよびｃは独立に７５～８５から選択される数であり、
ｂは２２～４０から選択される数であり、
ａ、ｂおよびｃはポロクサマー全体における平均値である］
で表され、下記で定義する条件による高速液体クロマトグラフィーにおいて溶出時間が１７分以後のピーク面積が全ピーク面積に対して３％以上であるポロクサマーを水溶液中に加えることを含む、方法：
［高速液体クロマトグラフィーの条件］
（１）カラム：マクロポーラス型スチレンジビニルベンゼンを充填したＨＰＬＣカラム（１０００Å、５μｍ、５０×２．１ｍｍ）
（２）移動相：
移動相Ａ：超純水
移動相Ｂ：アセトニトリル
（３）溶出勾配プログラム
０分から１６．０分まで：移動相Ｂ ５８％から６４％へ
１６．０分から１８．５分まで：移動相Ｂ ６４％から９０％へ
１８．５分から２１．５分まで：移動相Ｂ ９０％で固定
２１．５分から２３．５分まで：移動相Ｂ ９０％から１００％へ
２３．５分から３０．０分まで：移動相Ｂ １００％で固定
３０．０分から３０．１分まで：移動相Ｂ １００％から５８％へ
３０．１分から４０．０分まで：移動相Ｂ ５８％で固定
（４）流速：０．２ｍＬ／分
（５）検出方法：蒸発光散乱検出（ドリフトチューブ温度：５０±２５℃、ネブライザー加熱パワーレベル：７５％、ゲイン値：２５０、ガス圧：２０ｐｓｉ）
（６）カラム温度：６５±５℃
（７）ポロクサマー濃度（超純水中）：０．５ｍｇ／ｍＬ。

［４－２］水溶液中に配列番号１及び２のＨ鎖と配列番号３のＬ鎖を有する抗体、又は配列番号４のＨ鎖と配列番号５のＬ鎖を有する抗体から選択されるモノクローナル抗体を含む医薬製剤において、水溶液中での粒子の発生を低減させる方法、であって、
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（ポロクサマー）を水溶液中に加えることを含み、
ポロクサマーが、式Ｉ：
ＨＯ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａ（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｃＨ （Ｉ）
［式中、ａおよびｃは独立に７５～８５から選択される数であり、
ｂは２２～４０から選択される数であり、
ａ、ｂおよびｃはポロクサマー全体における平均値である］
で表され、下記で定義する条件による高速液体クロマトグラフィーにおいて溶出時間が１７分以後のピーク面積が１．５分以後の全ピーク面積に対して３％以上であるポロクサマーを水溶液中に加えることを含む、方法：
［高速液体クロマトグラフィーの条件］
（１）カラム：マクロポーラス型スチレンジビニルベンゼンを充填したＨＰＬＣカラム（１０００Å、５μｍ、５０×２．１ｍｍ）
（２）移動相：
移動相Ａ：超純水
移動相Ｂ：アセトニトリル
（３）溶出勾配プログラム
０分から１６．０分まで：移動相Ｂ ５８％から６４％へ
１６．０分から１８．５分まで：移動相Ｂ ６４％から９０％へ
１８．５分から２１．５分まで：移動相Ｂ ９０％で固定
２１．５分から２３．５分まで：移動相Ｂ ９０％から１００％へ
２３．５分から３０．０分まで：移動相Ｂ １００％で固定
３０．０分から３０．１分まで：移動相Ｂ １００％から５８％へ
３０．１分から４０．０分まで：移動相Ｂ ５８％で固定
（４）流速：０．２ｍＬ／分
（５）検出方法：蒸発光散乱検出（ドリフトチューブ温度：５０±２５℃、ネブライザー加熱パワーレベル：７５％、ゲイン値：２５０、ガス圧：２０ｐｓｉ）
（６）カラム温度：６５±５℃
（７）ポロクサマー濃度（超純水中）：０．５ｍｇ／ｍＬ。

［４－３］マクロポーラス型スチレンジビニルベンゼンを充填したＨＰＬＣカラムがＰＬＲＰ－Ｓカラムである［４－１］又は［４－２］に記載の方法。
［４－４］水溶液中に配列番号１及び２のＨ鎖と配列番号３のＬ鎖を有する抗体、又は配列番号４のＨ鎖と配列番号５のＬ鎖を有する抗体から選択されるモノクローナル抗体を含む医薬製剤において、水溶液中での粒子の発生を低減させる方法、であって、
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（ポロクサマー）を水溶液中に加えることを含み、
ポロクサマーが、式Ｉ：
ＨＯ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａ（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｃＨ （Ｉ）
［式中、ａおよびｃは独立に７５～８５から選択される数であり、
ｂは２２～４０から選択される数であり、
ａ、ｂおよびｃはポロクサマー全体における平均値である］
で表され、ポロクサマーが、（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）を分子内に３４以上含むポロクサマー分子をポロクサマー全体に対して３％（ｗ／ｗ）以上の比率で含む、方法。

［４－５］ｂが２２～３３から選択される数である、［４－１］～［４－４］のいずれかに記載の方法。
［４－６］ｂが２５～３０から選択される数である、［４－１］～［４－４］のいずれかに記載の方法。

［４－７］ｂが３５～４０から選択される数である、［４－１］～［４－４］のいずれかに記載の方法。
［４－８］ポロクサマーがポロクサマー１８８又はポロクサマー２３７である、［４－１］～［４－７］のいずれかに記載の方法。

［４－９］水溶液中に配列番号１及び２のＨ鎖と配列番号３のＬ鎖を有する抗体、又は配列番号４のＨ鎖と配列番号５のＬ鎖を有する抗体から選択されるモノクローナル抗体を含む医薬製剤において、水溶液中での粒子の発生を低減させる方法、であって、
界面活性剤として、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度の界面活性剤水溶液において５２．３ｍＮ／ｍ以下の表面張力を有する界面活性剤を水溶液中に加えることを含む、方法。

［４－１０］界面活性剤が、ポロクサマー、又は脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート）から選択される、［４－９］に記載の方法。
［４－１１］界面活性剤が［１－１］～［１－４］又は［１―２１］のいずれかに記載の式Ｉで表されるポロクサマーである、［４－９］又は［４－１０］に記載の方法。

［４－１２］ポロクサマーの数平均分子量が、７６８０～９５１０の範囲に含まれる、［４－１１］に記載の方法。
［４－１３］界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、又はポリソルベート８０から選択されるポリソルベートである、［４－９］～［４－１２］のいずれかに記載の方法。

［４－１４］界面活性剤が、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０から選択されるポリソルベートである、［４－９］～［４－１３］のいずれかに記載の方法。
［４－１５］界面活性剤がポリソルベート８０である、［４－９］～［４－１４］のいずれかに記載の方法。

［４－１６］界面活性剤が水溶液中で０．００１～１００ｍｇ／ｍＬ、０．０１～１０ｍｇ／ｍＬ、０．０５～５ｍｇ／ｍＬ、又は０．１～１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように加えられる、［４－１］～［４－１５］のいずれかに記載の方法。

［４－１７］水溶液中の抗体の濃度が１０～３００ｍｇ／ｍＬ、２０～２００ｍｇ／ｍＬ、又は３０～１５０ｍｇ／ｍＬである、［４－１］～［４－１６］のいずれかに記載の方法。

［４－１８］水溶液が、糖、糖アルコール、緩衝剤、保存剤、担体、酸化防止剤、キレート剤、天然ポリマー、合成ポリマー、凍結保護剤、増量剤、および安定化剤から選択される１以上の薬学的に許容される賦形剤を含む、［４－１］～［４－１７］のいずれかに記載の方法。

［４－１９］前記粒子がタンパク質由来である、［４－１］～［４－１８］のいずれかに記載の方法。
［４－２０］前記粒子が４０μｍ以上の粒径を有する、［４－１］～［４－１９］のいずれかに記載の方法。
［５－１］配列番号１及び２のＨ鎖と配列番号３のＬ鎖を有する抗体、又は配列番号４のＨ鎖と配列番号５のＬ鎖を有する抗体から選択されるモノクローナル抗体、及びポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（ポロクサマー）を含む水溶液を含んでなる医薬製剤であって、
ポロクサマーの数平均分子量が、７６８０～９５１０の範囲に含まれる、医薬製剤。
［５－２］［５－１］に記載の医薬製剤であって、
ポロクサマーは、式Ｉ：
ＨＯ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａ（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｃＨ （Ｉ）
［式中、ａおよびｃは独立に６０～８５から選択される数であり、
ｂは２２～４０から選択される数であり、
ａ、ｂおよびｃはポロクサマー全体における平均値である］
で表される、医薬製剤。
［５－３］ａおよびｃは独立に６０～６８から選択される数である、［５－２］に記載の医薬製剤。
［５－４］ｂが２２～３３から選択される数である、［５－３］に記載の医薬製剤。
［５－５］ｂが２５～３０から選択される数である、［５－３］に記載の医薬製剤。
［５－６］ｂが３５～４０から選択される数である、［５－３］に記載の医薬製剤。
［５－７］ａおよびｃは独立に７５～８５から選択される数である、［５－２］に記載の医薬製剤。
［５－８］ｂが２２～３３から選択される数である、［５－７］に記載の医薬製剤。
［５－９］ｂが２５～３０から選択される数である、［５－７］に記載の医薬製剤。
［５－１０］ｂが３５～４０から選択される数である、［５－７］に記載の医薬製剤。
［５－１１］ａおよびｃは独立に７５～８５から選択される数であり、ｂは２５～３０から選択される数である、［５－２］に記載の医薬製剤。
［５－１２］ａおよびｃは独立に６０～６８から選択される数であり、ｂは３５～４０から選択される数である、［５－２］に記載の医薬製剤。
［５－１３］
下記で定義する条件による高速液体クロマトグラフィーにおいて溶出時間が１７分以後のピーク面積が１．５分以後の全ピーク面積に対して３％以上である、［５－１］～［５－１２］のいずれかに記載の医薬製剤：
［高速液体クロマトグラフィーの条件］
（１）カラム：マクロポーラス型スチレンジビニルベンゼンを充填したＨＰＬＣカラム（１０００Å、５μｍ、５０×２．１ｍｍ）
（２）移動相：
移動相Ａ：超純水
移動相Ｂ：アセトニトリル
（３）溶出配プログラム
０分から１６．０分まで：移動相Ｂ ５８％から６４％へ
１６．０分から１８．５分まで：移動相Ｂ ６４％から９０％へ
１８．５分から２１．５分まで：移動相Ｂ ９０％で固定
２１．５分から２３．５分まで：移動相Ｂ ９０％から１００％へ
２３．５分から３０．０分まで：移動相Ｂ １００％で固定
３０．０分から３０．１分まで：移動相Ｂ １００％から５８％へ
３０．１分から４０．０分まで：移動相Ｂ ５８％で固定
（４）流速：０．２ｍＬ／分
（５）検出医薬製剤：蒸発光散乱検出（ドリフトチューブ温度：５０±２５℃、ネブライザー加熱パワーレベル：７５％、ゲイン値：２５０、ガス圧：２０ｐｓｉ）
（６）カラム温度：６５±５℃
（７）ポロクサマー濃度（超純水中）：０．５ｍｇ／ｍＬ。
［５－１４］高速液体クロマトグラフィーにおいて溶出時間が１７分以後のピーク面積が全ピーク面積に対して３％以上である、［５－１３］に記載の医薬製剤。
［５－１５］１７分以後のピーク面積が６％以上、１９％以上、２０％以上、３３％以上、３５％以上、３６％以上、又は４６％以上である、［５－１３］又は［５－１４］に記載の医薬製剤。
［５－１６］マクロポーラス型スチレンジビニルベンゼンを充填したＨＰＬＣカラムがＰＬＲＰ－Ｓカラムである［５－１３］～［５－１５］のいずれかに記載の医薬製剤。
［５－１７］ポロクサマーが、（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）を分子内に３４以上含むポロクサマー分子をポロクサマー全体に対して３％（ｗ／ｗ）以上の比率で含む、［５－１］～［５－１６］のいずれかに記載の医薬製剤。
［５－１８］ポロクサマーが、（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）を分子内に３４以上含むポロクサマー分子をポロクサマー全体に対して６％、２０％、２９％、または３６％（ｗ／ｗ）以上の比率で含む、［５－１］～［５－１７］のいずれかに記載の医薬製剤。
［５－１９］ポロクサマーの不飽和度が０．０１８ｍＥｑ／ｇ未満である、［５－１］～［５－１８］のいずれかに記載の医薬製剤。
［５－２０］ポロクサマーの数平均分子量が、６８４０～８８３０の範囲に含まれる、［５－１］～［５－１９］のいずれかに記載の医薬製剤。
［５－２１］水溶液中のポロクサマーの濃度が０．００１～１００ｍｇ／ｍＬ、０．０１～１０ｍｇ／ｍＬ、０．０５～５ｍｇ／ｍＬ、又は０．１～１ｍｇ／ｍＬである、［５－１］～［５－２０］のいずれかに記載の医薬製剤。
［５－２２］水溶液中の抗体の濃度が１０～３００ｍｇ／ｍＬ、２０～２００ｍｇ／ｍＬ、又は３０～１５０ｍｇ／ｍＬである、［５－１］～［５－２１］のいずれかに記載の医薬製剤。
［５－２３］水溶液が、糖、糖アルコール、緩衝剤、保存剤、担体、酸化防止剤、キレート剤、天然ポリマー、合成ポリマー、凍結保護剤、増量剤、および安定化剤から選択される、１以上の薬学的に許容される賦形剤を含む、［５－１］～［５－２２］のいずれかに記載の医薬製剤。
［５－２４］ポロクサマーがポロクサマー１８８又はポロクサマー２３７である、［５－１］～［５－２３］のいずれかに記載の医薬製剤。
［６－１］水溶液中に配列番号１及び２のＨ鎖と配列番号３のＬ鎖を有する抗体、又は配列番号４のＨ鎖と配列番号５のＬ鎖を有する抗体から選択されるモノクローナル抗体を含む医薬製剤において、水溶液中での粒子の発生を低減させる方法、であって、
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（ポロクサマー）を水溶液中に加えることを含み、
ポロクサマーの数平均分子量が、７６８０～９５１０の範囲に含まれる、方法。
［６－２］［６－１］に記載の方法であって、
ポロクサマーは、式Ｉ：
ＨＯ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａ（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｃＨ （Ｉ）
［式中、ａおよびｃは独立に６０～８５から選択される数であり、
ｂは２２～４０から選択される数であり、
ａ、ｂおよびｃはポロクサマー全体における平均値である］
で表される、方法。
［６－３］ａおよびｃは独立に６０～６８から選択される数である、［６－２］に記載の方法。
［６－４］ｂが２２～３３から選択される数である、［６－３］に記載の方法。
［６－５］ｂが２５～３０から選択される数である、［６－３］に記載の方法。
［６－６］ｂが３５～４０から選択される数である、［６－３］に記載の方法。
［６－７］ａおよびｃは独立に７５～８５から選択される数である、［６－２］に記載の方法。
［６－８］ｂが２２～３３から選択される数である、［６－７］に記載の方法。
［６－９］ｂが２５～３０から選択される数である、［６－７］に記載の方法。
［６－１０］ｂが３５～４０から選択される数である、［６－７］に記載の方法。
［６－１１］ａおよびｃは独立に７５～８５から選択される数であり、ｂは２５～３０から選択される数である、［６－２］に記載の方法。
［６－１２］ａおよびｃは独立に６０～６８から選択される数であり、ｂは３５～４０から選択される数である、［６－２］に記載の方法。
［６－１３］下記で定義する条件による高速液体クロマトグラフィーにおいて溶出時間が１７分以後のピーク面積が１．５分以後の全ピーク面積に対して３％以上であるポロクサマーを水溶液中に加えることを含む、［６－１］～［６－１２］のいずれかに記載の方法：
［高速液体クロマトグラフィーの条件］
（１）カラム：マクロポーラス型スチレンジビニルベンゼンを充填したＨＰＬＣカラム（１０００Å、５μｍ、５０×２．１ｍｍ）
（２）移動相：
移動相Ａ：超純水
移動相Ｂ：アセトニトリル
（３）溶出勾配プログラム
０分から１６．０分まで：移動相Ｂ ５８％から６４％へ
１６．０分から１８．５分まで：移動相Ｂ ６４％から９０％へ
１８．５分から２１．５分まで：移動相Ｂ ９０％で固定
２１．５分から２３．５分まで：移動相Ｂ ９０％から１００％へ
２３．５分から３０．０分まで：移動相Ｂ １００％で固定
３０．０分から３０．１分まで：移動相Ｂ １００％から５８％へ
３０．１分から４０．０分まで：移動相Ｂ ５８％で固定
（４）流速：０．２ｍＬ／分
（５）検出方法：蒸発光散乱検出（ドリフトチューブ温度：５０±２５℃、ネブライザー加熱パワーレベル：７５％、ゲイン値：２５０、ガス圧：２０ｐｓｉ）
（６）カラム温度：６５±５℃
（７）ポロクサマー濃度（超純水中）：０．５ｍｇ／ｍＬ。
［６－１４］高速液体クロマトグラフィーにおいて溶出時間が１７分以後のピーク面積が全ピーク面積に対して３％以上である、［６－１３］に記載の方法。
［６－１５］１７分以後のピーク面積が６％以上、１９％以上、２０％以上、３３％以上、３５％以上、３６％以上、又は４６％以上である、［６－１３］又は［６－１４］に記載の方法。
［６－１６］マクロポーラス型スチレンジビニルベンゼンを充填したＨＰＬＣカラムがＰＬＲＰ－Ｓカラムである［６－１３］～［６－１５］のいずれかに記載の方法。
［６－１７］ポロクサマーが、（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）を分子内に３４以上含むポロクサマー分子をポロクサマー全体に対して３％（ｗ／ｗ）以上の比率で含む、［６－１］～［６－１６］のいずれかに記載の方法。
［６－１８］ポロクサマーが、（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）を分子内に３４以上含むポロクサマー分子をポロクサマー全体に対して６％、２０％、２９％、または３６％（ｗ／ｗ）以上の比率で含む、［６－１］～［６－１７］のいずれかに記載の方法。
［６－１９］ポロクサマーの不飽和度が０．０１８ｍＥｑ／ｇ未満である、［６－１］～［６－１８］のいずれかに記載の方法。
［６－２０］ポロクサマーの数平均分子量が、６８４０～８８３０の範囲に含まれる、［６－１］～［６－１９］のいずれかに記載の方法。
［６－２１］ポロクサマーがポロクサマー１８８又はポロクサマー２３７である、［６－１］～［６－２０］のいずれかに記載の方法。
［６－２２］水溶液中に配列番号１及び２のＨ鎖と配列番号３のＬ鎖を有する抗体、又は配列番号４のＨ鎖と配列番号５のＬ鎖を有する抗体から選択されるモノクローナル抗体を含む医薬製剤において、水溶液中での粒子の発生を低減させる方法、であって、
界面活性剤として、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度の界面活性剤水溶液において５２．３ｍＮ／ｍ以下の表面張力を有する界面活性剤を水溶液中に加えることを含む、方法。
［６－２３］界面活性剤が、ポロクサマー、又は脂肪酸ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート）から選択される、［６－２２］に記載の方法。
［６－２４］界面活性剤が［６－２］～［６－１２］、又は［６－２１］のいずれかに記載の式Ｉで表されるポロクサマーである、［６－２２］又は［６－２３］に記載の方法。
［６－２５］界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、又はポリソルベート８０から選択されるポリソルベートである、［６－２２］～［６－２４］のいずれかに記載の方法。
［６－２６］界面活性剤が、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０から選択されるポリソルベートである、［６－２２］～［６－２５］のいずれかに記載の方法。
［６－２７］界面活性剤がポリソルベート８０である、［６－２２］～［６－２５］のいずれかに記載の方法。
［６－２８］界面活性剤が水溶液中で０．００１～１００ｍｇ／ｍＬ、０．０１～１０ｍｇ／ｍＬ、０．０５～５ｍｇ／ｍＬ、又は０．１～１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように加えられる、［６－１］～［６－２７］のいずれかに記載の方法。
［６－２９］水溶液中の抗体の濃度が１０～３００ｍｇ／ｍＬ、２０～２００ｍｇ／ｍＬ、又は３０～１５０ｍｇ／ｍＬである、［６－１］～［６－２８］のいずれかに記載の方法。
［６－３０］水溶液が、糖、糖アルコール、緩衝剤、保存剤、担体、酸化防止剤、キレート剤、天然ポリマー、合成ポリマー、凍結保護剤、増量剤、および安定化剤から選択される１以上の薬学的に許容される賦形剤を含む、［６－１］～［６－２９］のいずれかに記載の方法。
［６－３１］前記粒子がタンパク質由来である、［６－１］～［６－３０］のいずれかに記載の方法。
［６－３２］前記粒子が４０μｍ以上の粒径を有する、［６－１］～［６－３１］のいずれかに記載の方法。

本発明の一つの側面によれば、粒子の形成が低減された、凝固第ＶＩＩＩ因子を代替する抗血液凝固第ＩＸａ／Ｘ因子抗体（二種特異性モノクローナル抗体）又はインターロイキン６の受容体との結合を阻害する抗ＩＬ－６受容体抗体及び界面活性剤を含む水溶液を含んでなる医薬製剤が提供される。

図１は、逆相クロマトグラフィーによる７種類のＰＸ１８８の成分の分析結果を示すクロマトグラムである。 図２は、７種類のＰＸ１８８及び１種類のＰＳ８０の表面張力値の測定結果を示すグラフである。 図３は、ＰＸ１８８に含まれる成分における遅い溶出物の割合（％）と表面張力値の相関を示すグラフである。 図４は、メカニカルストレス（１セットあるいは４セットの振動ストレスを含む）の操作を示す。 図５は、メカニカルストレス付与の操作を示す。 図６は、代表的なタンパク質のみからなる粒子（Protein-only）及びタンパク質とポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）の複合体からなる粒子（Protein-PDMS）のラマンスペクトルを示す。 図７は、ＰＸ１８８の遅い溶出物の割合とｍＡｂ１の熱ストレス条件における粒子の発生率との相関を示すグラフである。 図８は、ＰＸ１８８の遅い溶出物の割合とｍＡｂ２の熱ストレス条件における目視により検出可能な粒子の発生率との相関を示すグラフである。 図９は、それぞれＰＸ１８８の遅い溶出物の割合（％）、不飽和度（Unsaturation）、及び合成変数と、ｍＡｂ１のメカニカルストレス条件における目視により検出可能な粒子の発生率との相関を示すグラフである。 図１０は、それぞれＰＸ１８８の遅い溶出物の割合、不飽和度（Unsaturation）、及び合成変数と、ｍＡｂ２のメカニカルストレス条件における目視により検出可能な粒子の発生率との相関を示すグラフである。 図１１は、ＰＸ１８８の界面吸着による抗体保護のイメージ図である。 図１２は、ＰＸ１８８の表面張力値のグラフである。 図１３は、ＰＸ２３７の逆相クロマトグラフィーによる成分分析の結果を示す。 図１４は、ＰＸ２３７の表面張力値の測定結果を示すグラフである。

１．抗体
本明細書で用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限りは、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。

抗体の「クラス」は、抗体の重鎖に備わる定常ドメインまたは定常領域のタイプのことをいう。抗体には５つの主要なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭである。そして、このうちいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）に分けられてもよい。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインを、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ぶ。

本明細書でいう用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体のことをいう。すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、生じ得る変異抗体（例えば、自然に生じる変異を含む変異抗体、またはモノクローナル抗体調製物の製造中に発生する変異抗体。そのような変異体は通常若干量存在している。）を除いて、同一でありおよび／または同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られるものである、という抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の製造を求めるものと解釈されるべきではない。例えば、本発明にしたがって用いられるモノクローナル抗体は、これらに限定されるものではないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含んだトランスジェニック動物を利用する方法を含む、様々な手法によって作成されてよく、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。

本明細書で用語「Ｆｃ領域」は、少なくとも定常領域の一部分を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然型配列のＦｃ領域および変異体Ｆｃ領域を含む。

用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体を抗原へと結合させることに関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインのことをいう。天然型抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、通常、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む、類似の構造を有する。（例えば、Kindtet al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 参照。）１つのＶＨまたはＶＬドメインで、抗原結合特異性を与えるに充分であろう。さらに、ある特定の抗原に結合する抗体は、当該抗原に結合する抗体からのＶＨまたはＶＬドメインを使ってそれぞれＶＬまたはＶＨドメインの相補的ライブラリをスクリーニングして、単離されてもよい。例えばPortolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)；Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) 参照。

「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の、可変ドメイン残基のことをいう。可変ドメインのＦＲは、通常４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４からなる。それに応じて、ＨＶＲおよびＦＲの配列は、通常次の順序でＶＨ（またはＶＬ）に現れる：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。

本明細書で用いられる用語「超可変領域」または「ＨＶＲ」は、配列において超可変であり（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」（complementarity determining region））、および／または構造的に定まったループ（「超可変ループ」）を形成し、および／または抗原接触残基（「抗原接触」)を含む、抗体の可変ドメインの各領域のことをいう。通常、抗体は６つのＨＶＲを含む：ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、およびＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）である。

本発明の一つの側面において抗体は、（ａ）凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）および／または活性化血液凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）ならびに（ｂ）凝固第Ｘ因子（ＦＸ）および／または活性化血液凝固因子ＦＸ（ＦＸａ）と特異的に結合し、凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の補因子機能を模倣する二重特異性抗体（例えば、エミシズマブ）、又はインターロイキン６の受容体との結合を阻害する抗ＩＬ－６受容体抗体（例えば、サトラリズマブ（ＳＡ２３７））である。

エミシズマブは、配列番号１及び２のＨ鎖と配列番号３のＬ鎖を有する二重特異性抗体である。
本発明で使用される抗ＩＬ－６受容体抗体は、ＩＬ－６受容体と結合することにより、ＩＬ－６のＩＬ－６受容体への結合を阻害してＩＬ－６の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断する。そのような抗ＩＬ－６受容体抗体の例としては、配列番号４のＨ鎖と配列番号５のＬ鎖を有するモノクローナル抗体（サトラリズマブ（ＳＡ２３７））が挙げられる。

本発明の一つの側面において、抗体は、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を含む、モノクローナル抗体である。一態様において、抗体は、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、またはＦ（ａｂ’）_２断片などの、抗体断片である。別の態様において、抗体は、例えば、完全ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４抗体や、本明細書で定義された他の抗体クラスまたはアイソタイプの、全長抗体である。

本発明の一つの側面において、使用されるモノクローナル抗体としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ラクダ、サル等の動物由来のモノクローナル抗体だけでなく、キメラ抗体、ヒト化抗体、バイスペシフィック抗体など人為的に改変した遺伝子組み換え型抗体も含まれる。さらに、血中滞留性や体内動態の改善を目的とした抗体分子の物性の改変（具体的には、等電点（ｐ１）改変、Ｆｃ受容体の親和性改変等）を行うために抗体の定常領域等を人為的に改変した遺伝子組み換え型抗体も含まれる。

本発明の一つの側面において、使用される抗体は、公知の方法により作製することができる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。

また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 参照）。具体的には、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成する。目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを得たら、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。

本発明の一つの側面では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡ都連結し、これを発現ベクターに組見込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。

ヒト化抗体は、再構成(reshaped)ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定量域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域(framework region; FR)を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開第２３９４００号、ＷＯ ９６／０２５７６ 参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい(Sato, K.et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856)。

抗体の活性、物性、薬物動態、安全性等を改善するために抗体のアミノ酸を置換する技術としては、例えば以下に述べる技術も知られており、本発明の一つの側面において、使用される抗体には、このようなアミノ酸の置換（欠損や付加も含む）を施された抗体も含まれる。

ＩｇＧ抗体の可変領域にアミノ酸置換を施す技術は、ヒト化(Tsurushita N, Hinton PR、Kumar S. , Design of humanized antibodies: from anti-Tac to Zenapax., Methods.2005 May;36(1):69-83.)をはじめとして、結合活性を増強させるための相補性決定領域(CDR)のアミノ酸置換によるaffinity maturation(Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R. , A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jun 14;102(24):8466-71.)、フレームワーク（ＦＲ）のアミノ酸置換による物理化学的安定性の向上(Ewert S, Honegger A, Pluckthun A. , Stability improvement of antibodies for extracellular and intracellular applications: CDR grafting to stable frameworks and structure-based framework engineering. , Methods. 2004 Oct;34(2):184-99. Review)が報告されている。また、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域のアミノ酸置換を施す技術として、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）活性や補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）活性を増強させる技術が知られている(Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. 2005 Aug 31;20(1):17-29. Review.)。さらに、このようなエフェクター機能を増強させるだけではなく、抗体の血中半減期を向上させるFcのアミノ酸置換の技術が報告されている(Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life.、 J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56.,Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat Biotechnol. 1997 Jul;15(7):637-40.)。さらには抗体の物性改善を目的とした定常領域の種々のアミノ酸置換技術も知られている(WO 09/41613)。

また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原又は所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公第平１－５９８７８号公報参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる(WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735参照)。さらに、ヒト抗体ライブラリを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を含む適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、WO 92/01047、WO 92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438、WO 95/15388を参考にすることができる。本発明の一つの側面において、使用される抗体には、このようなヒト抗体も含まれる。

抗体遺伝子を一旦単離し、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いることができる。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ (baby hamster kidney)、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、（２）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３） 虫細胞、例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１、Ｔｎ５などが知られている。植物細胞としては、ニコティアナ(Nicotiana)属、例えばニコティアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス(Saccharomyces)属、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces serevisiae)、糸状菌、例えば、アスペルギルス(Aspergillus)属、例えばアスペスギルス・ニガー(Aspergillus niger)などが知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌(E. coli)、枯草菌が知られている。これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより抗体が得られる。

さらに、医薬製剤において使用される抗体には、抗体修飾物が含まれる。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や細胞障害性薬剤等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる（Farmaco. 1999 Aug 30;54(8): 497-516.、Cancer J. 2008 May-Jun;14(3):154-69）。このような抗体修飾物は、抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。

本発明の一つの側面では、本開示における抗体はキメラ抗体であってもよい。キメラ抗体は、例えばUS Patent No. 4,816,567やMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)に記載されている。キメラ抗体は非ヒト可変領域（例えば、サルのような非ヒト霊長類、又は、マウス、ラット、ハムスター、若しくはウサギ等に由来する可変領域）とヒトの定常領域を含んでもよい。

本発明の一つの側面では、本開示における抗体はヒト化抗体であってよい。典型的には、非ヒト抗体は、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を維持しつつ、ヒトでの免疫原性を減少させるためにヒト化される。典型的には、ヒト化抗体は一つ以上の可変領域を含み、その中にはＨＶＲ、例えば非ヒト抗体に由来するＣＤＲ（又はその一部）と、ヒト抗体配列に由来するＦＲ（又はその一部）とが存在する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部を含むことができる。一実施態様において、ヒト化抗体内のＦＲのアミノ酸残基は、例えば、抗体の特異性や親和性を維持又は改善させるために、非ヒト抗体（例えばＨＶＲ残基の由来となった抗体）の対応するアミノ酸残基と置換されていてもよい。

ヒト化抗体及びその作製方法は、例えば以下で総説されており（Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)）、更に例えば以下に記載されている：Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US Patent Nos. 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, and 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (describing specificity determining region (SDR) grafting); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (describing "resurfacing"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (describing "FR shuffling"); and Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) and Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (describing the "guided selection" approach to FR shuffling)。

本発明の一つの側面では、ヒト化に使われるであろうヒトフレームワークは、例えば、「ベストフィット」法（Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)）を用いて選択されたフレームワーク、重鎖又は軽鎖の可変領域のある特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク（Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992) and Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)）、FRライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域を含んでいてもよい（Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) とRosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618(1996)）。

本発明の一つの側面では、本開示における抗体はヒト抗体であってもよい。ヒト抗体は様々な技術で作製することができる。ヒト抗体は例えばvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-374 (2001) や Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に概説される。ヒト抗体は抗原へ応答して完全ヒト抗体又はヒト可変領域を伴う完全抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物へ免疫原を投与することにより調製されてもよい。そのような動物は、典型的にはヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部若しくは一部分を含み、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部若しくは一部分は、内因性の免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、又は、染色体外に若しくは当該動物の染色体内にランダムに取り込まれた状態で存在する。そのようなトランスジェニックマウスにおいて、内因性の免疫グロブリン遺伝子座は、通常不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の総説として、Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005) を参照。また、例えば、XENOMOUSE（商標）技術を記載したUS Patent No. 6,075,181、6,150,584号；HUMAB（登録商標）技術を記載したUS Patent No. 5,770,429；K-M MOUSE（登録商標）技術を記載したUS Patent No. 7,041,870；並びに、VELOCIMOUSE（登録商標）技術を記載したUS2007/0061900を参照。このような動物によって生成される完全抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせるなどして、さらに修飾されてもよい。

本発明の別の側面では、ヒト抗体はハイブリドーマに基づいた方法でも作製できる。ヒトモノクローナル抗体の産生のための、ヒトミエローマ細胞及びマウス－ヒトヘテロミエローマ細胞株は以下に記述される（例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)；Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及びBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)）。ヒトB細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体はLi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) に記述される。その他の方法としては、例えばUS Patent No. 7,189,826（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトIgM抗体の製造を記載）、及び、Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)（ヒト－ヒトハイブリドーマを記載）が挙げられてよい。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）は、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載される。

本発明の別の側面では、ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することでも生成できる。このような可変領域配列は、次に所望のヒト定常領域と組み合わせることができる。抗体ライブラリからヒト抗体を選択する手法は以下を参照。

本発明の一つの側面では、本開示における抗体は、所望の１つ又は複数の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって単離してもよい。例えば、ファージディスプレイライブラリの作製方法や、所望の結合特性を有する抗体についてそのようなライブラリをスクリーニングする方法等が当該技術分野において知られている。そのような方法は、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) で総説されており、さらに例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554；Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)； Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)；Marks and Bradbury, Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)；Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載される。

本発明の一つの側面における特定のファージディスプレイ法において、ＶＨおよびＶＬのレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応 (polymerase chain reaction：ＰＣＲ) により別々にクローニングでき、無作為にファージライブラリ中で再結合され、当該ファージライブラリは、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)で記載されるようにして、抗原結合ファージについてスクリーニングされてよい。ファージは、例えばｓｃＦｖやＦａｂといった抗体断片を提示する。免疫化された供給源からのライブラリは、ハイブリドーマを構築することを要さずに免疫原に対する高親和性抗体を提供できる。別の実施態様において、Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)に記載されるように、免疫化することなしに、ナイーブレパートリーを（例えば、ヒトから）クローニングして、広範な非自己又は自己抗原への単一由来の抗体を提供することもできる。さらなる別の実施態様において、ナイーブライブラリは、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992) に記載されるように、幹細胞から再編成前のV-遺伝子セグメントをクローニングし、超可変領域ＣＤＲ３をコードしかつin vitroで再構成を達成するための無作為配列を含んだＰＣＲプライマーを用いることにより、合成的に作ることもできる。ヒト抗体ファージライブラリを記載した特許文献は、例えばUS Patent No. 5,750,373, US2005/0079574, US2005/0119455, US2005/0266000, US2007/0117126, US2007/0160598, US2007/0237764, US2007/0292936, US2009/0002360が挙げられる。

ヒト抗体ライブラリから単離される抗体又は抗体断片は、本明細書においてヒト抗体又はヒト抗体断片とみなす。
本発明の一つの側面では、本開示における抗体は、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に結合特異性を有する抗体（例えばモノクローナル抗体）である。一実施態様において、結合特異性の一つは抗原に対するものであり、他はそれ以外の抗原に対するものである。別の実施態様において、二重特異性抗体は、抗原の異なった２つのエピトープに結合してもよい。二重特異性抗体は、抗原を発現する細胞に細胞傷害剤を局在化するために使用されてもよい。二重特異性抗体は、全長抗体として又は抗体断片として調製されてよい。

多重特異性抗体の作製手法としては、限定はされないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖ペアの組換え共発現（例えばMilstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)、WO93/08829、及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)）、及びknob-in-hole技術（例えばUS Patent No. 5,731,168）が挙げられる。多重特異性抗体は、Fcヘテロ二量体分子を作製するために静電ステアリング効果(electrostatic steering effects)を操作すること(例えばWO2009/089004A1)；２つ以上の抗体又は抗体断片を架橋すること（例えばUS Patent No. 4,676,980及びBrennan et al., Science, 229: 81(1985)）；ロイシンジッパーを用いて２つの特異性を有する抗体を作成すること（例えばKostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)）；「ダイアボディ」技術を用いて二重特異性抗体断片を作製すること（例えばHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)）；scFvダイマーを用いること（例えばGruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)）；三重特異性抗体を調製すること（例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)）によって作製してもよい。さらに、「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能的抗原結合部位を有するように操作された抗体であってもよい（例えばUS2006/0025576）。

本発明の一つの側面では、本開示における抗体又はそれの抗体断片は、抗原と別の異なる抗原とに結合する1つの抗原結合部位を含む、「デュアルアクティングＦａｂ」又は「ＤＡＦ」であってもよい（例えばUS2008/0069820）。

本発明の一つの側面では、本開示における抗体のアミノ酸配列の改変体（変異体）は、抗体の分子をコードする核酸に適当な修飾を導入したり、又は、ペプチドを合成することで調製し得る。このような修飾は、アミノ酸配列中への、任意のアミノ酸（残基）の任意の欠失、挿入、置換を一又は複数、適宜組み合わせて行ってよい。最終構築物が所望の特徴（例えば、抗原結合性）を有する限り、欠失、挿入、置換の任意の組合せが利用できる。

本発明の一つの側面では、一又は複数のアミノ酸置換を行った抗体改変体（変異体）が提供される場合には、置換的変異導入の目的部位は、ＨＶＲ及びＦＲを含み得る。
本発明の一つの側面において、水溶液中の抗体の濃度は、１０～３００ｍｇ／ｍＬ、２０～２００ｍｇ／ｍＬ、又は３０～１５０ｍｇ／ｍＬの範囲であってよい。

２．界面活性剤
本発明の一つの側面において、医薬製剤は、界面活性剤として、ポロクサマー１８８等のポロクサマー、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０等のポリソルベート、トリトン（登録商標）Ｘ－１００及びトリトンＸ－１１４等のトリトンＸ、Brij（登録商標）-35及びBrij-58等のBrij、Nonidet（商標）P-40、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド等の非イオン性界面活性剤をさらに含むが、これらに限定されていない。

本発明の一つの側面において、医薬製剤に添加する界面活性剤の添加量は、一般には０．００１～１００ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは０．０１～１０ｍｇ／ｍＬであり、０．０５～５ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．１～１ｍｇ／ｍＬである。

（１）ポロクサマー
本明細書において、ポロクサマーはエチレンオキシドとプロピレンオキシドとのブロックコポリマーである。本明細書において、「ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマー」、「ＰＰＣ」、「ＰＸ」または「ポロクサマー」は、以下の式Ｉａ：
ＨＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ａ─［ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２Ｏ］_ｂ─（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃＨ （Ｉａ）
により表され、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）を中央ブロックとして有し、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）のブロックをその両側に有するポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）の中央ブロックを含むブロックコポリマーを意味する。上記式中：ａ,ｂおよびｃは平均の数であり、ａおよびｃは、同一または異なっていてもよい。ａおよびｃの各々は、（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）によって表される親水性部分（すなわち、コポリマーのポリエチレンオキシド部分）がコポリマーの約６０重量％～９０重量％、例えばコポリマーの７０重量％～９０重量％を構成するような数であり；ｂは、（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂによって表される疎水性物質（すなわち、コポリマーのポリプロピレンオキシド部分）がおよそ９５０～４，０００ダルトン（Ｄａ）、例えば約１，２００～３，５００Ｄａ、例えば１，２００～２，３００Ｄａ、１，５００～２，１００Ｄａ、１，４００～２，０００Ｄａまたは１，７００～１，９００Ｄａの分子量を有するような数である。例えば、親水性部分の分子量は５，０００～１５，０００Ｄａであり得る。上記一般式を有する例示的ポロクサマーは、ａまたはｃが５～１５０の数であり、ｂが１５～７５の数であるポロクサマー、例えばａおよびｃは約６０～８５の間の数、好ましくは７５～８５の間の数、例えば７９であり、ｂは２２～４０の間の数、好ましくは２２～３３、２５～３０、又は３５～４０の間の数、最も好ましくは２２～３３の間の数である。化合物の平均全分子量はおよそ６，８４０～９，５１０Ｄａ、好ましくは６，８４０～８,８３０Ｄａ又は７，６８０～９，５１０Ｄａ、例えば概して８，４００～８，８００Ｄａ、例えば約８，４００Ｄａまたは８，４００Ｄａである。ポロクサマーとしては、ポロクサマー１８８（例えば、Pluronic（登録商標）F-68、Synperonic（商標）PE/F 68、Flocor（登録商標）、Kolliphor（登録商標）およびLutrol（登録商標）、Poloxamer 188 EMPROVE（登録商標）EXPERT、プロノン（登録商標）で販売されているもの）が挙げられる。市販グレードのポロクサマー１８８の品質は、供給業者によって異なる。また、ポロクサマー１８８は、同じ供給業者の同じグレードのものであっても、ロットによって品質が異なり得る。さらに、ポロクサマーとしてポロクサマー２３７（例えば、Pluronic（登録商標）F-87、Synperonic（商標）PE/F 87で販売されているもの）が挙げられる。

ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマーの命名法はモノマー組成に関連する。ポロクサマー数の上２桁に１００を掛けると、疎水性ポリプロピレンオキシドブロックのおよその分子量になる。下１桁に１０を掛けると、親水性ポリエチレンオキシド含有量のおよその重量パーセントが得られる。例えば、ポロクサマー１８８は、親水性ポリエチレンオキシドブロック含有量が全分子量の約８０％である、約１，８００Ｄａのポリプロピレンオキシド疎水性物質を含むポリマーを表す。また、ポロクサマー２３７は、親水性ポリエチレンオキシドブロック含有量が全分子量の約７０％である、約２，３００Ｄａのポリプロピレンオキシド疎水性物質を含むポリマーを表す。ここで、ポリエチレンオキシドとはポリオキシエチレンとも呼ばれ、ポリプロピレンオキシドはポリオキシプロピレンとも呼ばれる。

ポロクサマーは、２ステップで、まずポリプロピレンオキシドコアを構築し、次いでポリエチレンオキシドをポリプロピレンオキシドコアの末端に付加することによって合成することができる。両ステップ中の重合速度における変動のために、ポロクサマーは、様々な分子量の不均一ポリマー種を含む。ポリマー種の分布は、限定されるものではないが、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）をはじめとする標準的技術を用いて特性評価することができる。

本発明の一つの態様として、各種のポロクサマーに含まれるポリエチレンオキシド及びポリプロピレンオキシドブロックの平均数並びに数平均分子量を表１において示す。

本明細書においてポロクサマーを表す式Ｉ：
ＨＯ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａ（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｃＨ （Ｉ）
におけるａ及びｃ、並びにｂはそれぞれポロクサマー中の（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）単位及び（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）単位の平均の数である。ここで、（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）は（（ＣＨ_２）_２Ｏ）を意味しエチレンオキシド（ＥＯ）単位とも呼ばれる。（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）は（ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２Ｏ）を意味しプロピレンオキシド（ＰＯ）単位とも呼ばれる。エチレンオキシド単位及びプロピレンオキシド単位の平均は、対象ポロクサマー画分のＥＯ／ＰＯ比をＮＭＲによって得、さらにその画分についてＭＡＬＤＩ－ＦＴＩＣＲ－ＭＳを行って得られた分子量を入力値として算出することができる。ＥＯ／ＰＯ比はＮＭＲにおいてメチル基のピークをプロピレンオキシドの面積積分Ｉ_ＰＯとし、エチレンオキシド（水素、４個）とプロピレンオキシド（水素、３個）を合わせた面積積分をＩ_{ＥＯ＋ＰＯ}として、以下の式に基づいて算出される（非特許文献２）。

ＥＯ／ＰＯ＝（Ｉ_{ＥＯ＋ＰＯ}／Ｉ_ＰＯ－１）×（３／４）
本発明の一つの態様において、ポロクサマー１８８（Ｐ－１８８、ＰＸ１８８またはＰ１８８とも呼ばれる）は、以下の式Ｉａ：
ＨＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ａ－［ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２Ｏ］_ｂ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃＨ （Ｉａ）
を有するポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマーを指し、式中、ａ、ｂおよびｃは平均の数であり、ａおよびｃは同一または異なり得、各々は、（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）によって表される親水性部分（すなわち、コポリマーのポリエチレンオキシド部分）が約６０％～９０％、例えば約８０％を構成し、およびｂは、（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）によって表される疎水性物質がおよそ１，３００～２，３００Ｄａ、例えば１，４００～２，０００Ｄａ、例えばおよそ１，７５０Ｄａの分子量を有するような数である。例えば、ａおよびｃは約７５～８５の間の数、例えば７９であり、ｂは２５～３０の間の数、又は好ましくは、２２～３３の間の数、例えば２８である。化合物の平均全分子量はおよそ７，６８０～９，５１０Ｄａ、例えば概して８，４００～８，８００Ｄａ、例えば約８，４００Ｄａまたは８，４００Ｄａである。ポロクサマー１８８は、ポリマーの全体の鎖長が主に異なるが、不飽和を有する切断ポリマー鎖と、ある低分子量グリコールも含む不均質なポリマー種の分布を含み得る。低分子量（ＬＭＷ）ポリマー種および高分子量（ＨＭＷ）ポリマー種を表す主ピークと両側の「ショルダー」ピークとを含む種プロフィール（例えばＧＰＣによって決定）を示すものも、ポロクサマー１８８に含まれる。本発明の一つの側面においてポロクサマーは、主成分以外の種を除去するかまたは減らすためにポロクサマー１８８を精製して得られるポロクサマーであってもよい。

ポロクサマー１８８は、日本薬局方の規格において、「ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール」と呼称されることがある。
本明細書中で用いる場合、ポロクサマー１８８に関連した「主成分」または「主ピーク」は、約１３，０００Ｄａ未満でかつ約４，５００Ｄａを上回る分子量を有し、約７，６８０～９，５１０Ｄａ、例えば概して８，４００～８，８００Ｄａ、例えば約８，４００Ｄａまたは８，４００Ｄａの数平均分子量を有するコポリマー分子の種を指す。主ピーク種は、クロマトグラフィー条件に応じて１４～１５分でゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって溶出するものを含む（米国特許第５，６９６，２９８号を参照）。
本発明の一つの態様において、ポロクサマー２３７（Ｐ－２３７、ＰＸ２３７またはＰ２３７とも呼ばれる）は、以下の式Ｉａ：
ＨＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ａ－［ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２Ｏ］_ｂ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｃＨ （Ｉａ）
を有するポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマーを指し、式中、ａ、ｂおよびｃは平均の数であり、ａおよびｃは同一または異なり得、各々は、（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）によって表される親水性部分（すなわち、コポリマーのポリエチレンオキシド部分）が約６０％～８０％、例えば約７０％を構成し、およびｂは、（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）によって表される疎水性物質がおよそ１，８００～２，８００Ｄａ、例えば２，０００～２，６００Ｄａ、例えばおよそ２，３００Ｄａの分子量を有するような数である。例えば、ａおよびｃは約６０～６８の間の数、例えば６４であり、ｂは３５～４０の間の数、又は好ましくは、３２～４３の間の数、例えば３７である。化合物の平均全分子量はおよそ６，８４０～８，８３０Ｄａ、例えば概して７，５００～８，０００Ｄａ、例えば約７，８００Ｄａまたは７，８００Ｄａである。ポロクサマー２３７は、ポリマーの全体の鎖長が主に異なるが、不飽和を有する切断ポリマー鎖と、ある低分子量グリコールも含む不均質なポリマー種の分布を含み得る。低分子量（ＬＭＷ）ポリマー種および高分子量（ＨＭＷ）ポリマー種を表す主ピークと両側の「ショルダー」ピークとを含む種プロフィール（例えばＧＰＣによって決定）を示すものも、ポロクサマー２３７に含まれる。本発明の一つの側面においてポロクサマーは、主成分以外の種を除去するかまたは減らすためにポロクサマー２３７を精製して得られるポロクサマーであってもよい。

（２）ポリソルベート
ポリソルベートは、非イオン性界面活性剤及びタンパク質安定剤として有用な以下の化学式ＩＩまたは式ＩＩＩ：

［式中、ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚが、１５～２５から選択される整数であり、
Ｒは独立に炭素数が１１以上のアルキル又はアルケニルである］
を有する脂肪酸エステルである。ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、及びポリソルベート８０は、医薬品、化粧品、及び食品業界で安定剤及び乳化剤として広く使用されている。ポリソルベート２０は、主にポリオキシエチレン（２０）ソルビタンのモノラウリン酸エステルを含む。ポリソルベート４０は、主にポリオキシエチレン（２０）ソルビタンのモノパルミチン酸エステルを含む。ポリソルベート６０は、主にポリオキシエチレン（２０）ソルビタンのモノステアリン酸エステルを含む。ポリソルベート８０は、主にポリオキシエチレン（２０）ソルビタンのモノオレイン酸エステルを含む。

ポリソルベートは、多くの場合様々な化学物質の混合物であり、大部分がポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノエステルからなり、場合によってはイソソルビドエステル混入物質を含む。それらはまた、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、中間体構造、及び脂肪酸反応物質も含み得る。頭部基（この場合はポリオキシエチレン（２０）ソルビタン）は、そのアルコール基のうちの３つが、３つのポリエチレンオキシド基とエーテル結合を形成するように置換されたソルビタン（１，４－アンヒドロソルビトール、１，５－アンヒドロソルビトール、及び１，４，３，６－ジアンヒドロソルビトールを含む。

３．他の添加剤
本発明の一つの側面において、医薬製剤は、必要に応じて、適当な薬学的に許容される担体、媒体等と混和して調製し、溶液製剤とすることができる。溶液製剤の溶媒は、水又は薬学的に許容される有機溶媒である。そのような有機溶媒としては、例えば、プロピレングリコール（１，２－プロパンジオール）、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００、エタノール、グリセロール、酢酸などが挙げられる。適当な薬学的に許容される担体、媒体としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定化剤、酸化防止剤(アスコルビン酸等)、緩衝剤（リン酸、クエン酸、ヒスチジン、他の有機酸等）、防腐剤、キレート剤（ＥＤＴＡ等）、結合剤等を挙げることができる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、グリシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、メチオニン、アルギニン及びリシン等のアミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、マンニトールやソルビトール等の糖アルコールを含んでいてもよい。注射用の溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ＰＥＧ等）等と併用してもよい。

本発明の一つの側面において、溶液製剤において使用する緩衝剤は、溶液のｐＨを維持するための物質を使用して調製する。本発明の一つの側面において、高濃度抗体含有溶液製剤においては、溶液のｐＨが４．５～７．５であることが好ましく、５．０～７．０であることがより好ましく、５．５～６．５であることがさらに好ましい。本発明の一つの側面において、使用可能な緩衝剤は、この範囲のｐＨを調整でき、且つ医薬的に許容可能なものである。このような緩衝剤は溶液製剤の分野で当業者に公知であり、例えば、リン酸塩（ナトリウム又はカリウム）、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩；クエン酸塩（ナトリウム又はカリウム）、酢酸ナトリウム、コハク酸ナトリウムなどの有機酸塩；又は、リン酸、炭酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、グルコン酸などの酸類を使用できる。さらに、Ｔｒｉｓ類及びＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳのようなグッド緩衝剤、ヒスチジン（例えばヒスチジン塩酸塩）、グリシンなどを使用してもよい。

緩衝剤の濃度は、一般には１～５００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは５～１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、さらに好ましくは１０～２０ｍｍｏｌ／Ｌである。ヒスチジン緩衝剤を使用する場合、緩衝剤は好ましくは５～２５ｍｍｏｌ／Ｌのヒスチジン、さらに好ましくは１０～２０ｍｍｏｌ／Ｌのヒスチジンを含有する。

本発明の一つの側面において、高濃度抗体含有溶液製剤は、有効成分である抗体にとって適切な安定化剤を添加することによって、安定化されることが好ましい。本発明の一つの側面において、「安定な」高濃度抗体含有溶液製剤は、冷蔵温度（２～８℃）で少なくとも１２ヶ月、好ましくは２年間、さらに好ましくは３年間；又は室温（２２～２８℃）で少なくとも３ヶ月、好ましくは６ヶ月、さらに好ましくは１年間、有意な変化が観察されない。例えば、５℃で２年間保存後の二量体量及び分解物量の合計が５．０％以下、好ましくは２％以下、さらに好ましくは１．５％以下、あるいは２５℃で６ヶ月保存後の二量体量及び分解物量の合計が５．０％以下、好ましくは２％以下、さらに好ましくは１．５％以下である。

また本発明の製剤には、必要に応じて、凍結保護剤、懸濁剤、溶解補助剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を適宜添加することができる。

凍結保護剤として例えば、トレハロース、ショ糖、ソルビトール等の糖類を挙げることができる。
溶液補助剤として例えば、ポリエチレンオキシド硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリエチレンオキシドソルビタンモノラウレート、マグロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等を挙げることができる。

等張化剤として例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等を挙げることができる。
保存剤として例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等を挙げることができる。

吸着防止剤として例えば、ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリエチレンオキシド硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。

含硫還元剤として例えば、Ｎ－アセチルシステイン、Ｎ－アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、炭素原子数１～７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。

酸化防止剤として例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α－トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ－アスコルビン酸及びその塩、Ｌ－アスコルビン酸パルミテート、Ｌ－アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられる。

４．粒子の発生を低減させる界面活性剤
（１）疎水度
本発明の一つの側面において、高疎水度の界面活性剤を使用することによって、抗体を含有する医薬製剤における粒子の発生を低減させることができる。

ポロクサマーは疎水性のポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）鎖１ブロック及び両側に配置された親水性のポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）鎖２ブロックからなる３ブロック両親媒性コポリマーであり、ＰＰＯ鎖は平均２２～４０の間の数のプロピレンオキシド、好ましくは２２～３３、２５～３０、又は３５～４０の間の数、最も好ましくは２２～３３の間の数のプロピレンオキシド、からなり、ＰＥＯ鎖はそれぞれ平均７５～８５単位のエチレンオキシドからなる。プロピレンオキシドは疎水性成分であり、エチレンオキシドは親水性成分である。ポロクサマーのうち、より多くの疎水性成分を含むものはより疎水度が高い。

本発明の一つの側面において、ポロクサマーは、３４単位以上のプロピレンオキシドからなるＰＰＯ鎖を含むポロクサマーをポロクサマー全体に対して３％、６％、２０％、または２９％（ｗ／ｗ）以上の比率で含む。

本発明の一つの側面において、ポロクサマーの疎水度の違いは逆相クロマトグラフィーによって確認することができる。逆相クロマトグラフィーにおいて、ＰＥＯブロックが固定相と相互作用しないように設定することで、ＰＰＯブロックの長さの分布を特定することができる。また、この方法によって、ポロクサマーの疎水度の違いを分析することができる（非特許文献２）。本発明の一つの側面において、非特許文献２を参照して、ポロクサマーの逆相クロマトグラフィーの条件を以下のように設定する。逆相クロマトグラフィーでは、マクロポーラス型スチレンジビニルベンゼンを充填したＨＰＬＣカラム、例えばＡｇｉｌｅｎｔ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＰＬＲＰ－Ｓカラムを用いる。

［高速液体クロマトグラフィーの条件］
（１）カラム：ＰＬＲＰ－Ｓカラム（１０００Å、５μｍ、５０×２．１ｍｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
（２）移動相：
移動相Ａ：超純水
移動相Ｂ：アセトニトリル
（３）溶出配プログラム
０分から１６．０分まで：移動相Ｂ ５８％から６４％へ
１６．０分から１８．５分まで：移動相Ｂ ６４％から９０％へ
１８．５分から２１．５分まで：移動相Ｂ ９０％で固定
２１．５分から２３．５分まで：移動相Ｂ ９０％から１００％へ
２３．５分から３０．０分まで：移動相Ｂ １００％で固定
３０．０分から３０．１分まで：移動相Ｂ １００％から５８％へ
３０．１分から４０．０分まで：移動相Ｂ ５８％で固定
（４）流速：０．２ｍＬ／分
（５）検出方法：蒸発光散乱検出（ドリフトチューブ温度：５０±２５℃、ネブライザー加熱パワーレベル：７５％、ゲイン値：２５０、ガス圧：２０ｐｓｉ）
（６）カラム温度：６５±５℃
（７）ポロクサマー濃度（超純水水中）：０．５ｍｇ／ｍＬ。

本発明の一つの側面において、上記条件でのポロクサマーのクロマトグラフィーにおいて、溶出時間が１７分以後の溶出物は疎水度の高いポロクサマーに対応し、溶出時間が１７分以後のピーク面積が全ピーク面積に対して３％以上、６％以上、１９％以上、３３％以上、又は３５％以上である。

また、本発明の一つの側面において、上記条件でのポロクサマーのクロマトグラフィーにおいて、溶出時間が１７分以後のピーク面積が１．５分以後の全ピーク面積に対して３％以上、６％以上、２０％以上、３６％以上、又は４６％以上である。

（２）表面張力
本発明の一つの側面において、界面活性剤を含有する水溶液の表面張力を低くする界面活性剤を使用することによって、抗体を含有する医薬製剤の水溶液における粒子の発生を低減させることができる。本発明の一つの側面において、粒子の発生を低減させることができる界面活性剤としては、本発明の実施例において確認された、ポロクサマー１８８があり、さらにポロクサマー２３７、ポリソルベート２０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、及びポリソルベート８０がある。界面活性能の高い界面活性剤ほど界面活性剤を含有する水溶液の表面張力を低くする。ポロクサマーの疎水度の指標と表面張力値には相関がある。

表面張力は、Wilhelmy法（プレート法、垂直板法）、du Nouy法（リング法、輪環法）、懸滴法（ペンダント・ドロップ法）又は最大泡圧法等の一般的に知られた方法で測定することができるが、それに限定されない。

本発明の一つの側面において、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度の界面活性剤を含有する水溶液は、５２．３ｍＮ／ｍ以下、５２ｍＮ／ｍ以下、５１ｍＮ／ｍ以下、５０．７ｍＮ／ｍ以下、５０．５ｍＮ／ｍ以下、又は３９ｍＮ／ｍ以下の表面張力を有する。

（３）不飽和度
本発明の一つの側面において、不飽和度の低いポロクサマーを界面活性剤として使用することによって、特定の抗体を含有する医薬製剤における粒子の発生を低減させることができる。

不飽和度は米国薬局方に規定された方法により酢酸水銀（ＩＩ）溶液を用いて得ることができる。
酢酸水銀（ＩＩ）溶液の調製方法：
酢酸水銀（ＩＩ）５０ｇを１０００ｍＬのメスフラスコに入れ、氷酢酸０．５ｍＬを加えたメタノール約９００ｍＬに溶解させる。メタノールで容量まで希釈後、混合する。液が黄色ならば捨てる。濁っている場合はろ過する。それでも濁っている場合は廃棄する。溶液の調製を繰り返す必要がある場合は、新しい試薬を使用する。この液を暗所で褐色瓶に保存し、光から保護する。

ポロクサマーの不飽和度算出の手順：
約１５．０ｇのポロクサマーを２５０ｍＬの三角フラスコに移す。酢酸水銀（ＩＩ）溶液５０ｍＬをピペットでフラスコに量り入れ、マグネチックスターラーで完全に溶解するまで混合する。時々旋回させながら３０分間放置する。
臭化ナトリウムの結晶１０ｇを加え、マグネチックスターラーで約２分間撹拌する。遅滞なくフェノフタレイン試験液約１ｍＬを加え、遊離した酢酸を０．１Ｎメタノール性水酸化カリウム滴定液で滴定する。同様の方法で対照試験を行う。初期の酸性度を測定する。メタノール性水酸化カリウムでフェノールフタレインの最終点まで中和されたメタノール７５ｍＬ中にポロクサマー１５．０ｇを溶解させる。次にフェノールフタレイン試験液約１ｍＬを加え、窒素送入下、０．１Ｎメタノール性水酸化カリウム滴定液で滴定する。

下記式に従って不飽和度（ｍＥｑ／ｇ）を計算する：
（Ｖ_Ｕ－Ｖ_Ｂ－Ｖ_Ａ）Ｎ／１５
ここで、Ｖ_Ｕ、Ｖ_Ｂ及びＶ_Ａは、それぞれ試験試料、ブランク及び初期酸性度の滴定に用いた０．１Ｎメタノール性水酸化カリウムの容量（ｍＬ）であり、Ｎは滴定液の規定度（normality)である。

本発明の一つの側面において、界面活性剤として使用するポロクサマーの不飽和度は０．０１８ｍＥｑ／ｇ未満である。
５．粒子の発生の低減
（１）粒子の発生の低減
本発明の一つの側面において、「粒子の発生を低減させる」とは、所定の条件において目視により検出可能な粒子が発生する医薬製剤の水溶液において、目視により検出可能な粒子を発生しないようにする、又は発生する粒子数を減少させることを指す。目視により検出可能な粒子の発生が低減したことは、粒子数を計数することによって確認することができる。粒子のサイズや数は、光遮蔽粒子計数法、顕微鏡粒子計数法、フローサイト粒子画像解析法、目視検査、粒子を単離した後に顕微赤外分光（infrared spectroscopy；ＩＲ）測定や顕微ラマン分光測定することで測定可能であり、好ましくは目視検査と顕微赤外分光又は顕微ラマン分光測定の組み合わせで測定する。

（２）目視により検出可能な粒子
本明細書において、目視により検出可能な粒子とは、高照度で目視により検出可能な粒子であり、４０μｍ以上の粒径を有する。このうち、薬局方に規定されている標準照度（２，０００－３，０００ｌｘ程度）で目視により検出可能な粒子を「可視粒子」又は「不溶性可視性粒子」と呼ぶ。可視粒子は一般的に１００μｍより大きい粒径を有する（非特許文献１）。可視粒子よりも小さいサイズで、薬局方に規定されている標準照度（２，０００－３，０００ｌｘ程度）では目で見えないが照度を上げたり、観察時間を長くすることで目視により検出可能な粒子は「高照度でのみ目視により検出可能な粒子」であり、４０μｍ～１００μｍの粒径を有する。可視粒子は、照明下、標準照度（２，０００－３，０００ｌｘ程度）において、黒色背景又は白色背景の前で容器を緩やかに旋回又は転倒させて５秒以上、肉眼で目視検査することにより確認される。高照度でのみ目視により検出可能な粒子は、照明下、高照度（６，０００ｌｘ以上）において、黒色背景の前で容器を緩やかに旋回又は転倒させて３０秒以上、肉眼で目視検査することにより確認される。高照度における検査では可視粒子も確認可能である。

本明細書において「タンパク質由来粒子」とは、タンパク質のみからなる粒子並びにタンパク質とポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）の複合体からなる粒子を含む、タンパク質から生成された目視により検出可能な粒子を指す。粒子がタンパク質分子によるものであることは、顕微ラマン分光測定によって確認することができる。溶液中にタンパク質として含まれるのは医薬有効成分（API）のみであり、目視により検出可能な粒子はAPIから生じたものである。目視により検出可能な粒子の数は、光遮蔽粒子計数法、顕微鏡粒子計数法、フローサイト粒子画像解析法、目視検査、粒子を単離した後に顕微赤外分光（infrared spectroscopy；ＩＲ）測定や顕微ラマン分光測定することで測定可能であり、好ましくは目視検査と顕微赤外分光又は顕微ラマン分光測定の組み合わせにより測定される。

本明細書において「凝集体」とは、変性したタンパク質が多数集まることにより生じた比較的高分子量のタンパク質種で、「高分子種」及び「ＨＭＷＳ」という用語と互換的に使用される。タンパク質凝集体は、概して以下の点で異なり得る：サイズ（小型（２量体）～大型（顕微鏡で確認可能な粒子またはさらに可視粒子）の集合体であり、直径はナノメートル～マイクロメートルの範囲）、形態（概ね球状～繊維状）、タンパク質構造（ナイーブ対非ネイティブ／変性）、分子間結合のタイプ（共有対非共有）、可逆性、及び可溶性。可溶性の凝集体はおよそ１～１００ｎｍのサイズ範囲を網羅し、タンパク質粒子は顕微鏡で確認可能な（約０．１～１００μｍ）範囲及び可視（＞１００μｍ）範囲を網羅する。前述のタイプのタンパク質凝集体全てが、概して当該用語に包含される。したがって、「（タンパク質）凝集体」という用語は、２つ以上のタンパク質モノマーが物理的に会合したまたは化学的に結合したあらゆる種類の非ネイティブ種を指す。

本発明の一つの側面において、医薬製剤は、容器内の溶液を凍結させずに－３０℃～２５℃、好ましくは溶液の凍結点～２５℃、より好ましくは１℃～１０℃、より好ましくは２℃～８℃、さらに好ましくは５℃で保存される。保存は１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３１時間、３２時間、３３時間、３４時間、３５時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間行われる。保存は、少なくとも２４時間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも１０日、少なくとも２０日、少なくとも３０日、少なくとも４０日、少なくとも５０日、少なくとも６０日、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月、少なくとも５カ月、少なくとも６カ月、少なくとも７カ月、少なくとも８カ月、少なくとも９カ月、少なくとも１０カ月、少なくとも１１カ月、少なくとも１２カ月行われる。

５．容器
本発明の一つの側面において、医薬製剤は容器に充填されている。容器はプラスチック製又はガラス製のシリンジ、カートリッジ、またはバイアルである。

本発明の一つの側面において、患者に投与するための医薬製剤がシリンジ、カートリッジ又はバイアル内に充填されている。ある態様において、医薬製剤は製造用充填施設においてシリンジ、カートリッジ又はバイアル内に入れられる。ある態様において、シリンジ、カートリッジ又はバイアルは、組成物を入れる前に滅菌される。ある態様において、医薬製剤が充填されたシリンジ、カートリッジ又はバイアルは、患者に対する医薬製剤の投与の前に、１日、又は少なくとも７日、又は少なくとも１４日、又は少なくとも１ヶ月、又は少なくとも６ヶ月、又は少なくとも１年、又は少なくとも２年の保存期間を有する。ある態様において、シリンジ、カートリッジ又はバイアルは貯蔵及び／又は輸送の条件にさらされる。

本発明の一つの態様において、シリンジ、カートリッジ又はバイアルはメカニカルストレスにさらされる。メカニカルストレスとしては、落下ストレス、及び振動ストレスが挙げられるが、これに限定されない。本発明の一つの態様において、シリンジ、カートリッジ又はバイアルは、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、２１回、２２回、２３回、２４回、２５回、２５回以上、３０回以上、又は４０回以上の落下ストレスにさらされる。落下時にシリンジ、カートリッジ又はバイアルに加わるストレスは、落下回数以外に高さ、向きなどによって変化する。落下高さは、例えばAmerican Society for Testing and Materials（ASTM）D4169に記載されている３８．１ｃｍであるが、これに限定されない。

シリンジは、ＰＰ（ポリプロピレン）やガラスであってもよい。シリンジの内周面は潤滑剤としてのシリコーンオイルが塗布されていてもよい。
本発明の一つの側面において、シリコーンオイルはポリジメチルシロキサンである。いくつかの例示的なポリジメチルシロキサンには、例えば、粘度が３５０センチストークであるDow Corning（登録商標） 360 Medical Fluid、粘度が１０００センチストークであるDow Corning（登録商標） 360 Medical Fluid、粘度が１２，５００センチストークであるDow Corning（登録商標） 360 Medical Fluid、及びDow Corning（登録商標） MDX4-4159 fluid を非限定的に含む、Dow Corning（登録商標） 360 Medical Fluidが非限定的に含まれる。

本発明の一つの側面において、シリンジの容量のサイズ（規格）は特に限定されない。具体的には、容量が０．５ｍＬ～５．０ｍＬ、好ましくは１ｍＬまたは２．２５ｍＬである。

本発明の一つの側面において、カートリッジ容量のサイズ（規格）は特に限定されない。具体的には、容量が０．５ｍＬ～２０．０ｍＬであってよく、例えば１．０ｍＬ、１．５ｍＬ、１．８ｍＬ、２．０ｍＬ、２．２ｍＬ、３．０ｍＬ、５．０ｍＬ、１０．０ｍＬ、１５．０ｍＬ、２０．０ｍＬであってよいが、これらの量に限定されない。

本発明の一つの側面において、バイアルの容量のサイズ（規格）は特に限定されない。具体的には、３ｍＬ～１００ｍＬであってよく、３ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、１５ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、５０ｍＬ又は１００ｍＬであってよいが、これらの量に限定されない。

本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、下記の実施例に限定されるものではない。

［実施例１］ポロクサマー１８８（ＰＸ１８８）の逆相クロマトグラフィーによる成分分析
表２に示す異なるメーカー、グレード、ロットを含む７種類のＰＸ１８８について、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）ブロックの長さを評価するために逆相クロマトグラフィーによる分析を実施した。逆相クロマトグラフィーによるＰＰＯブロック長の分析方法については先行論文を参考とした（非特許文献１）。

ＨＰＬＣシステムはAlliance e2695 liquid chromatograph（Waters）に2424 evaporative light scattering detector（ＥＬＳＤ）（Waters）を取り付けたものを使用し、データ取得と解析にはEmpower 3 software（Waters）を用いた。分離に使用するカラムにはPLRP-S column（１０００Å、５μｍ、５０×２．１ｍｍ；Agilent Technologies）を用い、６５±５℃のカラム温度に設定した。流速は０．２ｍＬ／分で固定し、移動相としては超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）を移動相Ａ、アセトニトリルを移動相Ｂとして線形のグラジエントをかけた。グラジエントの詳細としては、５８％Ｂから６４％Ｂ（０－１６．０分）、６４％Ｂから９０％Ｂ（１６．０－１８．５分）、９０％Ｂで固定（１８．５－２１．５分）、９０％Ｂから１００％Ｂ（２１．５－２３．５分）、１００％Ｂで固定（２３．５－３０．０分）、１００％Ｂから５８％Ｂ（３０．０－３０．１分）、５８％Ｂで固定（３０．１－４０．０分）とした。ＥＬＳＤのドリフトチューブの温度は５０±２５℃、ネブライザーの加熱パワーレベルは７５％、ゲイン値は２５０、ガス圧は２０ｐｓｉとした。各ＰＸ１８８を超純水に０．５ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、そのＰＸ１８８溶液２０μＬをＨＰＬＣシステムに注入した。開始から１７分以後の溶出物を「遅い溶出物」と定義し、遅い溶出物の割合は、全ピーク面積に対する１７分後以後のピーク面積の割合（％）とした上で、各ＰＸ１８８のクロマトグラム（図１）から遅い溶出物の割合を算出した。さらに、開始後１．５分までのピーク面積を除いた全ピーク面積に対する１７分以後のピーク面積の割合を「（初期溶出物を除く）遅い溶出物」と定義し、各ＰＸ１８８のクロマトグラム（図１）から算出した。

更に５種類のＰＸ１８８について、遅い溶出物に相当する３４個以上のＰＰＯブロック長をもつ分子種の質量％を算出した。１７分以降に最初に溶出したピークのＰＰＯブロック長を３４個とし、各溶出ピークのＰＰＯブロック長を算出した。また、両端のＰＥＯブロック長についてはそれぞれ８０個として各溶出ピークに相当する分子種の分子量を算出した。続いてこれら分子量と溶出ピーク面積値を掛け合わせた値を出し、ＰＰＯブロック長が３４個以上となるものについて足し合わせたものを分子にとり、全てのピークについて足し合わせたものを分母にとり１００を乗じることで各ＰＸ１８８について３４個以上のＰＰＯブロック長をもつ分子種の質量％を算出した。３４個以上のＰＰＯブロック長をもつ分子種の全ポロクサマーに対する割合（質量％）の算出結果を表３に示す。

［実施例２］ＰＸ１８８およびＰＳ８０の表面張力値の測定
表２に示す７種類のＰＸ１８８、および１種類のＰＳ８０について、各界面活性剤を０．５ｍｇ／ｍＬとなるよう超純水に溶解させた水溶液の表面張力値を測定した。表面張力計（Force Tensiometer K100C, Kruss）を用い、白金プレートを使用したWilhelmy法による測定を２０－２５度で実施した。Ｋ１００Ｃの測定パラメータとしては検出速度を６ｍｍ／分、検出感度を０．００５ｇ、そして浸漬深度を２ｍｍとし、測定開始から６００秒までの表面張力値を６０秒間隔で取得した（図２）。なお、白金プレートを浸漬させる界面活性剤溶液を入れたガラス容器については測定ごとにイソプロピルアルコール、次いで超純水で複数回洗浄を実施した。白金プレートについても測定ごとにイソプロピルアルコール、次いで超純水で洗浄した後にアルコールランプで赤熱洗浄をした。

各種ＰＸ１８８水溶液の表面張力値は白金プレート浸漬後徐々に低下していき測定開始から６００秒経過時点で平衡に達していた。そのため、各種界面活性剤溶液の表面張力値としては６００秒経過時点での値を採用した。ＰＳ８０水溶液の表面張力値は６００秒経過後も減少を続けたが、ＰＸ１８８水溶液との比較のために、６００秒経過時点での表面張力値を採用することとした。

［実施例３］遅い溶出物の割合と表面張力値との相関
表２に示す７種類のＰＸ１８８の遅い溶出物の割合と上記方法で測定した表面張力値との間の相関を分析した。その結果、それら２つの値には高い相関があることが示された（図３）。つまり、ＰＸ１８８においてはＰＰＯブロックの長い成分の割合が界面活性能の指標となる表面張力値と相関すること、さらにはＰＰＯブロックが長い成分を多く含む場合に表面張力値が減少することが示された。

［実施例４］目視により検出可能な粒子評価用のサンプル調製
各種界面活性剤が目視により検出可能な粒子の発生に与える影響を調査するために、表２に示す７種類のＰＸ１８８、および１種類のＰＳ８０を用いて２種類のｍＡｂ製剤中での粒子の発生を調査した。ｍＡｂは中外製薬で製造及び精製されたｍＡｂ１（エミシズマブ、ＩｇＧ４、抗血液凝固第ＩＸａ／Ｘ因子ヒト化二重特異性モノクローナル抗体）とｍＡｂ２（サトラリズマブ、ＩｇＧ２，ｐＨ依存的結合性ヒト化抗ＩＬ－６レセプターモノクローナル抗体）を用いた。ｍＡｂ１のサンプルは、１５８ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ１、２０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのアルギニン、アスパラギン酸（適量）、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＸ１８８又はＰＳ８０を含有する水溶液をｐＨ６．０に調製し、バイアル（３ｍＬ サルファー処理ガラスバイアル、村瀬硝子）に１ｍＬ充てんした。ｍＡｂ２のサンプルは、１２３ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ１、２０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのアルギニン、アスパラギン酸（適量）、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＸ１８８又はＰＳ８０を含有する水溶液をｐＨ６．０に調製し、シリンジ（１ｍＬ ＣｌｅａｒＪｅｃｔ、大成化工）に１ｍＬ充てんした。各ｍＡｂにつき、表２に示した８種類の界面活性剤を用いて８種類ずつサンプルを作製した。作製したサンプルについては目視検査を実施し、サンプル製造工程中で可視性の異物を含んだサンプルを排除した。

目視検査後、可視性異物を含まないと判定したサンプルを２５℃で静置、又は４０℃で静置後に目視検査を実施するグループにｍＡｂ１及びｍＡｂ２をそれぞれ１０本ずつ供した。また、５℃で静置し、定期的なメカニカルストレスを付加した後に目視検査を実施するグループにｍＡｂ１については２０本、ｍＡｂ２については４０本を供した。

定期的なメカニカルストレスの付与方法
定期的なメカニカルストレスを与えるサンプル群はメカニカルストレスを室温で付与する際を除いては５℃で静置保管した。容器の破損を防ぐために適切に梱包した状態でＡＳＴＭ Ｄ４１６９を参照し、以下の落下試験と振動試験を組み合わせたストレス（落下試験→振動試験→落下試験）を施した。落下ストレスは落下試験装置(PDT-56ED、Lansmont)を使用し、３８．１ｃｍの高さから各サンプルへ付与されるストレスが均一となるような４つの面について各面を下にした状態での落下を２回ずつ行い、これを１セットの落下試験とした。この落下試験を振動試験の前後に１セットずつ実施した。振動ストレスについては振動試験装置(D-5900、振研)を使用し４つの強度の振動ストレス（Truck Low Level 40分、Truck Medium Level 15分、Truck High Level 5分、Air Level I 120分）を付与し、これを１セットの振動試験とした。図４の通り、振動試験を１セットのみ与えた場合と、４セット連続で与えた場合があり、それらの付与タイミングを図６に示す。

［実施例５］２５℃で静置した場合の粒子の発生
２５℃で６ヶ月静置保管した後のサンプルに対して目視検査を目視検査法１及び２の通りに実施した。目視検査で検出された粒子についてはラマン分光法による組成の同定をイメージング顕微ラマン装置（DXR2xi、Thermo scientific）を用いてラマン分光法による目視により検出可能な粒子の組成同定方法の通りに同定を実施した。

目視検査法１（バイアル；ｍＡｂ１）
バイアルの目視検査には目視検査台(EM-M102-06、日立産業制御ソリューションズ)を使用した。バイアルの外部を清浄にし、肉眼で黒色の背景および約２０，０００ｌｘの照度において充填された薬液中に目視により検出可能な粒子を含むバイアルの数を計数した。

目視検査法２（シリンジ；ｍＡｂ２）
シリンジの目視検査には蛍光灯を使用した。シリンジの外部を清浄にし、肉眼で黒色の背景および約１０，０００ｌｘの照度において充填された薬液中に目視により検出可能な粒子を含むシリンジの数を計数した。

ラマン分光法による粒子の組成同定方法
ニッケル性の孔径３ｍｍのフィルター（東京プロセスサービス）に粒子を捕集し、イメージング顕微ラマン装置（DXR2xi、Thermo scientific）を用いて５３２ｎｍのレーザーを照射した際のラマンスペクトルを得ることで内因性のタンパク性の粒子であることの確認を実施した。倍率が１０倍もしくは５０倍のレンズを使用し、組成の判定が可能となるような適切なスペクトルが得られるようにレーザー強度（５．０－１０．０ｍＷ）、露光時間（０．０５－１．０秒）、積算回数（１５－３５回）の値を記載の範囲内で設定してスペクトルを取得した。代表的なタンパク性の粒子としてはタンパク質単体から成る粒子とタンパク質とポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）の複合体から成る粒子が存在していたため、それらのラマンスペクトル例を図６に示す。

２５℃で６ヶ月静置保管した後のサンプルに対して、タンパク性の粒子を含んでいた容器数を計数し、表４に示した。ｍＡｂ１、ｍＡｂ２共に製剤中に含まれる界面活性剤の種類によって粒子の発生率が異なることが示された。

［実施例６］４０℃で静置後の粒子の発生
４０℃で６ヶ月静置保管した後のサンプルに対して目視検査を目視検査法１および２の通りに実施した。目視検査で検出された粒子についてはラマン分光法による組成の同定をイメージング顕微ラマン装置（DXR2xi、Thermo scientific）を用いてラマン分光法による粒子の組成同定方法の通りに同定を実施した。

４０℃で６ヶ月静置保管した後のサンプルに対して、タンパク性の粒子を含んでいた容器数を計数し、表５に示した。ｍＡｂ１、ｍＡｂ２共に製剤中に含まれる界面活性剤の種類によって粒子の発生率が大きく異なることが示された。

［実施例７］５℃静置及び定期的なメカニカルストレス条件における粒子の発生
５℃静置保管及び定期的な落下および振動ストレスを付与したサンプル（ｍＡｂ１については６ヶ月後、ｍＡｂ２については３ヶ月後のサンプル）に対して目視検査を目視検査法１および２の通りに実施した。目視検査で検出された粒子についてはラマン分光法による組成の同定をイメージング顕微ラマン装置（DXR2xi、Thermo scientific）を用いてラマン分光法による粒子の組成同定方法の通りに同定を実施した。

５℃静置保管及び定期的なメカニカルストレスを付与したサンプルに対して、タンパク性の粒子を含んでいた容器数を計数し、表６に示した。

ｍＡｂ２においては製剤中に含まれる界面活性剤の種類によって粒子の発生率が大きく異なることが示された。ｍＡｂ１においては粒子の発生率が十分に高くはなかったため、その後の解析には使用しないこととした。

［実施例８］ＰＸ１８８の遅い溶出物の割合および界面活性剤水溶液の表面張力値と粒子発生率との相関分析
表２に示す７種類のＰＸ１８８の遅い溶出物の割合と粒子の発生率の相関を明らかとするため相関分析を実施した。粒子発生率(%)については各サンプルにおいて、粒子が発生した容器数を、試験に供した総容器数で除し、１００を乗じることで算出した。また、２５℃での静置保管条件と４０℃での静置保管条件についてはいずれも昇温によるストレスであること、生成したタンパク性粒子の組成もタンパク質とポリジメチルシロキサンの複合体から成るものが大半を占めたことから、同等の粒子の形成経路に準じて生成したものと考え、熱ストレス条件として合算して粒子発生率(%)を算出した。５℃静置保管及び定期的なメカニカルストレスを付与したものについては、タンパク質単体から成る不溶性異物が大半を占め、熱ストレス条件とは異なる粒子形成経路に準じて生成したものと考えられたため、メカニカルストレス条件として別個に解析を実施することとした。

その結果、ｍＡｂ１において熱ストレス条件で遅い溶出物の割合と粒子の発生率に相関が見られた（図７）。また、ｍＡｂ２においても熱ストレス条件、およびメカニカルストレス条件においても遅い溶出物の割合と粒子の発生率に相関が見られた（図８、図１０中の左図）。ｍＡｂ１のメカニカルストレス条件においては弱い相関が見られた（図９中の左図）。

この相関図より、遅い溶出物の割合の値が高い、つまりはＰＰＯブロックが長いＰＸ１８８種を使用するほどｍＡｂ１、ｍＡｂ２製剤中における粒子の発生を低減することが可能であることが示された。また、実施例３で示した通り遅い溶出物の割合の値は表面張力の値とよく相関することから、より表面張力値を低くすることが可能な界面活性剤を使用することでｍＡｂ１、ｍＡｂ２製剤中における粒子の発生を低減することが可能であると言い換えることができる。これは、ＰＸ１８８とは異なる界面活性剤種であるＰＳ８０においても、ＰＳ８０水溶液の表面張力値が低く、なおかつ粒子の生成率が低いことから界面活性剤種には依らないことが実証されている。また、表面張力値５０－５３ｍＮ／ｍの範囲において顕著に粒子の発生率が異なる結果が得られたことから、この範囲にｍＡｂ１、ｍＡｂ２製剤中における粒子の発生増減の閾値が存在すると考えられる。

［実施例９］ＰＸ１８８の不飽和度と粒子発生率との相関分析
メカニカルストレス条件においては遅い溶出物の割合だけでなく、不飽和度（Unsaturation）と粒子の発生率の相関も解析した。その結果、不飽和度が低い、つまりは製品中のジブロック体（ＰＥＯ－ＰＰＯ体）が少ないほど粒子の発生率が低くなるような相関が一定程度見られた（図９中の中央図、図１０中の中央図）。特に、ＰＸ１８８の不飽和度に関する現行ＵＳＰ規格の下限値（０．０１８ｍＥｑ／ｇ）を下回る不飽和度を示すＰＸ（７）についてはｍＡｂ１、ｍＡｂ２いずれに対してもタンパク性異物の発生を完全に抑制した。

また、遅い溶出物の割合と不飽和度の２つのパラメータを用いた重回帰分析を実施したところ、相関係数の増加が見られ、その程度はｍＡｂ２で特に顕著であった。（図９中の右図、図１０中の右図）
［実施例１０］各製剤中で発生したＨＭＷＳの評価
界面活性剤種が製剤中での抗体に由来する凝集体（高分子量種、High Molecular Weight Species：ＨＭＷＳ）の発生に与える影響を評価するために、表２に示す７種類のＰＸ１８８、および１種類のＰＳ８０を用いた製剤中でのＨＭＷＳ発生量をサイズ排除クロマトグラフィーにより評価した。評価は５℃静置、２５℃静置、４０℃静置および５℃静置保管及び定期的なメカニカルストレスを付加した条件についてそれぞれ保管開始前、３ヵ月後、および６ヵ月後に実施した。ただし、ｍＡｂ２の５℃静置保管及び定期的な落下振動を付与した条件については６ヵ月時点での目視評価は実施していないため、ＨＭＷＳ評価も実施しなかった。

ＨＰＬＣシステムはAlliance 2695 liquid chromatograph（Waters）に2489 UV/Visible detector（Waters）を取り付けたものを使用し、データ取得と解析にはEmpower 3 software（Waters）を用いた。分離に使用するカラムにはTSKgel G3000SWXL column (２５０Å、５μｍ、３００×７．８ｍｍ；東ソー)を用い、２５±５℃のカラム温度に設定した。流速は０．２ｍＬ/分で固定とし、移動相としては５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４/Ｎａ_２ＨＰＯ_４、３００ｍＭのＮａＣｌ及び０．５ｍｇ／ｍＬのＮａＮ_３（ｐＨ７．０）を用い、流速は０．５ｍＬ／分で固定した。各抗体溶液は１ｍｇ／ｍＬの抗体濃度になるように移動相用溶液で希釈し６０μＬをＨＰＬＣシステムに注入した。ＨＭＷＳ％の値はピーク面積積分対象範囲（１０－２４分）の全ピーク面積に対する１４．５分近辺に現れるＨＭＷＳのピーク面積の割合として定義し、各サンプルのクロマトグラムから算出した。

算出したＨＭＷＳの値を表７に示す。

５℃静置条件および５℃静置保管及び定期的なメカニカルストレスを付与した条件についてはほぼ同等のＨＭＷＳ量を示しＨＭＷＳの顕著な増加、およびサンプル間での違いは確認されなかった。また、２５℃静置条件および４０℃静置条件においては５℃静置条件と比較しＨＭＷＳ量の増加が見られたが、サンプル間での顕著な違いは確認されなかった。熱ストレス条件ではＰＳ８０においてはややＰＸ１８８サンプル群と比較し低い値を示したが、粒子の発生率においては表面張力値の比較的低いＰＸ１８８（例えば、ＰＸ（１）やＰＸ（４））と比較して顕著な差は見られなかったことから、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２製剤中における粒子発生の低減には、ＨＭＷＳの発生量は関与していないこと、さらには気液界面や容器表面、シリコーンオイル（ＰＤＭＳ）表面ストレスからの各種界面活性剤の保護能が粒子発生率に影響を与えていると考えられる（図１１）。図１１の左側が界面活性剤による界面の保護が十分である場合、図９の右側が保護が不十分である場合のイメージ図を示している。

［実施例１１］低濃度ＰＸ１８８の表面張力値の測定
表２に示す７種類のＰＸ１８８のうち、ＰＸ（３）、ＰＸ（６）、ＰＸ（７）について各界面活性剤を０．０１ｍｇ／ｍＬとなるよう超純水に溶解させた水溶液の表面張力値を測定した。表面張力計（Force Tensiometer K100C, Kruss）を用い、白金プレートを使用したWilhelmy法による測定を２０－２５℃で実施した。Ｋ１００Ｃの測定パラメータとしては検出速度を６ｍｍ／分、検出感度を０．００５ｇ、そして浸漬深度を２ｍｍとし、測定開始から６００秒までの表面張力値を１０秒間隔で取得した（図１２）。なお、白金プレートを浸漬させる界面活性剤溶液を入れたガラス容器については測定ごとにイソプロピルアルコール、次いで超純水で複数回洗浄を実施した。白金プレートについても測定ごとにイソプロピルアルコール、次いで超純水で洗浄した後にアルコールランプで赤熱洗浄をした。

各種ＰＸ１８８水溶液の表面張力値は、ＰＸ１８８が０．５ｍｇ／ｍＬとなるよう超純水に溶解させた水溶液の表面張力値を測定した際と同様の挙動を示したため、各種界面活性剤溶液の表面張力値としては６００秒経過時点での値（ＰＸ（３）が５５．７ｍＮ／ｍ、ＰＸ（６）が５６．４ｍＮ／ｍ、ＰＸ（７）が５５．３ｍＮ／ｍ）を採用した。ここで測定をしたＰＸ１８８の６００秒経過時点での表面張力値の大小は実施例２と同様であり、ＰＸ１８８濃度が０．５ｍｇ／ｍＬよりも低い場合であっても各ＰＸ１８８の表面活性能の違いを評価することができた。

［実施例１２］ポロクサマー２３７（ＰＸ２３７）の逆相クロマトグラフィーによる成分分析
ポロクサマー２３７（ＰＸ２３７）の逆相クロマトグラフィーによる成分分析を実施例１と同様の手順で実施した結果を以下の図１３に示す。ＰＸ２３７においては開始後１．５分までのピーク面積を除くと全ピークが１７分以後に現れることが示された。

［実施例１３］ＰＸ２３７の表面張力値の測定
ＰＸ２３７を０．０５ｍｇ／ｍＬとなるよう超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に溶解させた水溶液の表面張力値を測定した。表面張力計（Force Tensiometer K100C, Kruss）を用い、白金プレートを使用したWilhelmy法による測定を２０－２５℃で実施した。Ｋ１００Ｃの測定パラメータとしては検出速度を６ｍｍ／分、検出感度を０．００５ｇ、そして浸漬深度を２ｍｍとし、測定開始から６００秒までの表面張力値を６０秒間隔で取得した（図１４）。なお、白金プレートを浸漬させる界面活性剤溶液を入れたガラス容器については測定ごとにイソプロピルアルコール、次いで超純水で複数回洗浄を実施した。白金プレートについても測定ごとにイソプロピルアルコール、次いで超純水で洗浄した後にアルコールランプで赤熱洗浄をした。

０．５ｍｇ／ｍＬのＰＸ２３７水溶液の表面張力値はＰＸ１８８が０．５ｍｇ／ｍＬとなるよう超純水に溶解させた水溶液の表面張力値を測定した際と同様の挙動を示したため、ＰＸ２３７水溶液の表面張力値としては６００秒経過時点での値（４５．９ｍＮ／ｍ）を採用した。０．５ｍｇ／ｍＬのＰＸ１８８水溶液の表面張力値と６００秒経過時点での値を採用した。ＰＸ２３７水溶液の表面張力値は表２に記載のいずれのＰＸ１８８水溶液の表面張力値よりも低く、ＰＸ２３７の表面活性能がＰＸ１８８よりも高いことを評価することができた。

［実施例１４］目視により検出可能な粒子評価用のサンプル調製
ＰＸ２３７が目視により検出可能な粒子の発生に与える影響を調査するために、ＰＸ２３７およびコントロールとして表２に示すＰＸ１８８の内ＰＸ（３）を用いて１種類のｍＡｂ製剤中での粒子の発生を調査した。ｍＡｂは中外製薬で製造及び精製されたｍＡｂ１（エミシズマブ、ＩｇＧ４、抗血液凝固第ＩＸａ／Ｘ因子ヒト化二重特異性モノクローナル抗体）を用いた。ｍＡｂ１のサンプルは、１５０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ１、２０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのアルギニン、アスパラギン酸（適量）、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＸ１８８又はＰＸ２３７を含有する水溶液をｐＨ６．０に調製し、バイアル（３ｍＬ サルファー処理ガラスバイアル、村瀬硝子）に１ｍＬ充てんした。作製したサンプルについては目視検査を実施し、サンプル製造工程中で可視性の異物を含んだサンプルを排除した。

目視検査後、可視性異物を含まないと判定したサンプルを２５℃で静置後に目視検査を実施するグループにｍＡｂ１を各サンプル毎に６０本ずつ供した。

［実施例１５］２５℃で静置した場合の粒子の発生
２５℃で６ヶ月静置保管した後のサンプルに対して目視検査を目視検査法１の通りに実施した。目視検査で検出された粒子についてはラマン分光法による組成の同定をイメージング顕微ラマン装置（DXR2xi、Thermo scientific）を用いてラマン分光法による目視により検出可能な粒子の組成同定方法の通りに同定を実施した。

２５℃で６ヶ月静置保管した後のサンプルに対して、タンパク性の粒子を含んでいた容器数を計数し、表８に示した。製剤中に含まれる界面活性剤がＰＸ２３７である場合、ＰＸ（３）より粒子の発生率が低いことが示された。

Claims (11)

1. 配列番号１及び２のＨ鎖と配列番号３のＬ鎖を有する抗体、又は配列番号４のＨ鎖と配列番号５のＬ鎖を有する抗体から選択されるモノクローナル抗体、及びポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（ポロクサマー）を含む水溶液を含んでなる医薬製剤であって、
   ポロクサマーは、式Ｉ：
   ＨＯ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ａ（Ｃ_３Ｈ_６Ｏ）_ｂ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｃＨ （Ｉ）
   ［式中、ａおよびｃは独立に７５～８５から選択される数であり、
   ｂは２２～３３から選択される数であり、
   ａ、ｂおよびｃはポロクサマー全体における平均値である］で表され、
   下記で定義する条件によるポロクサマーの高速液体クロマトグラフィーにおいて、溶出時間が１７分以後のピーク面積が全ピーク面積に対して１９％以上である、医薬製剤：
   ［高速液体クロマトグラフィーの条件］
   （１）カラム：マクロポーラス型スチレンジビニルベンゼンを充填したＨＰＬＣカラム（１０００Å、５μｍ、５０×２．１ｍｍ）
   （２）移動相：
   移動相Ａ：超純水
   移動相Ｂ：アセトニトリル
   （３）溶出配プログラム
   ０分から１６．０分まで：移動相Ｂ ５８％から６４％へ
   １６．０分から１８．５分まで：移動相Ｂ ６４％から９０％へ
   １８．５分から２１．５分まで：移動相Ｂ ９０％で固定
   ２１．５分から２３．５分まで：移動相Ｂ ９０％から１００％へ
   ２３．５分から３０．０分まで：移動相Ｂ １００％で固定
   ３０．０分から３０．１分まで：移動相Ｂ １００％から５８％へ
   ３０．１分から４０．０分まで：移動相Ｂ ５８％で固定
   （４）流速：０．２ｍＬ／分
   （５）検出方法：蒸発光散乱検出（ドリフトチューブ温度：５０±２５℃、ネブライザー加熱パワーレベル：７５％、ゲイン値：２５０、ガス圧：２０ｐｓｉ）
   （６）カラム温度：６５±５℃
   （７）ポロクサマー濃度（超純水中）：０．５ｍｇ／ｍＬ。
2. 溶出時間が１７分以後のピーク面積が全ピーク面積に対して３３％以上である、請求項１に記載の医薬製剤。
3. ｂが２２～３３から選択される数である、請求項１に記載の医薬製剤。
4. ｂが２５～３０から選択される数である、請求項１に記載の医薬製剤。
5. ｂが３５～４０から選択される数である、請求項１に記載の医薬製剤。
6. マクロポーラス型スチレンジビニルベンゼンを充填したＨＰＬＣカラムがＰＬＲＰ－Ｓカラムである請求項１に記載の医薬製剤。
7. ポロクサマーの数平均分子量が、７６８０～９５１０の範囲に含まれる、請求項１に記載の医薬製剤。
8. 水溶液中のポロクサマーの濃度が０．００１～１００ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の医薬製剤。
9. 水溶液中の抗体の濃度が１０～３００ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の医薬製剤。
10. 水溶液が、糖、糖アルコール、緩衝剤、保存剤、担体、酸化防止剤、キレート剤、天然ポリマー、合成ポリマー、凍結保護剤、増量剤、および安定化剤から選択される、１以上の薬学的に許容される賦形剤を含む、請求項１に記載の医薬製剤。
11. ポロクサマーがポロクサマー１８８又はポロクサマー２３７である、請求項１に記載の医薬製剤。

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