JP7366990B2 - 交流電場を用いたウイルス感染の抑制 - Google Patents

Description

本願は、２０１８年７月１０日出願の米国仮出願第６２／６９５９２５号の優先権を主張し、その全体が参照として本願に組み込まれる。

ウイルスは、小型の細胞内偏性寄生体である。ウイルスが含む核酸は、ウイルス複製のために宿主細胞の合成機構をプログラムするのに必要なゲノム情報を含み、これは最も単純なウイルスの場合には防御タンパク質膜である。

細胞を感染させるために、ウイルスは、細胞表面に取り付き、細胞内に侵入して、転写又は翻訳のためにそのゲノムをウイルス又は宿主の機構にアクセス可能にするのに十分に脱殻しなければならない。ウイルスの増殖は一般的に細胞の損傷又は死をもたらす。増殖感染は、子孫ウイルスの形成をもたらす。

細胞が有糸分裂している際に細胞が特定の周波数範囲の交流電場（ＡＥＦ，ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄ）に晒されると、ＡＥＦが有糸分裂過程を乱して、アポトーシスを生じさせることができることが以前から示されている。特許文献１及び特許文献２（各文献はその全体が参照として本願に組み込まれる）に記載されているように、この現象を用いて腫瘍（例えば、膠芽細胞腫、中皮腫等）を治療することができる。腫瘍治療に関して、この交流電場は、ＴＴフィールド（腫瘍治療電場，ｔｕｍｏｒ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｆｉｅｌｄ）と称される。ＴＴフィールド治療が腫瘍治療に適している理由の一つは、ＴＴフィールドは有糸分裂中の細胞分裂を選択的に乱すが、分裂していない細胞には一見して何ら作用しないからである。また、腫瘍細胞は人体中の他の細胞よりもはるかに頻繁に分裂するので、ＴＴフィールドを患者に印加することで、他の細胞を傷付けずに腫瘍細胞を選択的に攻撃する。特許文献３（その全体が参照として本願に組み込まれる）に記載されているように、同じ現象が細菌を破壊するのに有用であることも示されている。この場合も、この手法が細菌を破壊するのに適している理由の一つは、細菌細胞が人体中の他の細胞よりもはるかに高速に分裂するからである。

米国特許第７０１６７２５号明細書 米国特許第７５６５２０５号明細書 米国特許第９７５０９３４号明細書

本発明の一態様は、対象領域内の細胞がウイルスに感染することを抑制する第一方法を対象としている。第一方法は、或る期間にわたって対象領域に交流電場を印加するステップを備え、交流電場は或る周波数及び或る電場強度を有し、その期間にわたって交流電場が対象領域に印加されている際に、交流電場が、対象領域内の細胞がウイルスに感染することを抑制する。

第一方法の一部例では、対象領域は、生体内の領域であり、交流電場は生体にとって安全なものである。場合によっては、対象領域に腫瘍は無い。

第一方法の一部例は、対象領域に抗ウイルス剤を送達して、印加するステップが行われている間に治療に有効な量の抗ウイルス剤が対象領域に存在するようにするステップを更に備える。

第一方法の一部例では、交流電場は５０ｋＨｚから５００ｋＨｚの間の周波数を有する。第一方法の一部例では、交流電場は２５ｋＨｚから１ＭＨｚの間の周波数を有する。第一方法の一部例では、交流電場は略２００ｋＨｚの周波数を有する。

第一方法の一部例では、交流電場は、１Ｖ／ｃｍ ＲＭＳ（二乗平均平方根）から５Ｖ／ｃｍ ＲＭＳの間の電場強度を有する。第一方法の一部例では、交流電場は、略１．２Ｖ／ｃｍ ＲＭＳの電場強度を有する。

第一方法の一部例では、期間は１時間から４８時間の間である。第一方法の一部例では、期間は２日間から１４日間の間である。第一方法の一部例では、期間は略４８時間である。

第一方法の一部例では、交流電場は、期間中に少なくとも二つの方向の間で繰り返して切り替えられる向きを有する。場合によっては、交流電場の向きは略１秒に１回切り替えられる。

第一方法の一部例では、交流電場は、期間中に第一方向と第二方向との間で繰り返して切り替えられる向きを有し、第一方向は第二方向に略垂直である。

第一方法の一部例では、交流電場は、容量結合電極を介して対象領域に印加される。

二つのｉｎ ｖｉｔｒｏ（インビトロ、生体外）実験で用いられた皿の概略図である。 本開示の態様な実施形態において電極にＡＣ（交流）電圧を印加するのに用いられるＡＣ電圧発生器の概略図である。 第一実験について対照に対する相対的感染効率を示す。 第二実験について対照に対する相対的感染効率を示す。 図５Ａ、図５Ｂはそれぞれ例示的な実施形態における被験体の身体上の電極の位置決めについての正面図、背面図を示す。

以下、添付図面を参照して多様な実施形態を説明するが、図面中において同様の参照番号は同様の要素を示す。

本発明者は、驚くべきことに、交流電場がウイルス感染を抑制するためにも使用可能であることを示したものである。この結果は、ＡＥＦは有糸分裂中の細胞分裂を乱すことに関して論じられてきたものであるので、驚くべきものである。しかしながら、腫瘍細胞や細菌とは異なり、ウイルスは有糸分裂によって複製するものではない。

以下、ＡＥＦがウイルス感染を抑制することができることを実証している二つのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を説明する。これらの実験では、サーモフィッシャーサイエンティフィック社から入手したＨＥＫ２９３ＦＴヒト胎児腎臓細胞のレンチウイルス感染を測定するためにノボキュア（登録商標）社のＩｎｏｖｉｔｒｏ（登録商標）試験装置を用いた。

Ｉｎｏｖｉｔｒｏ（登録商標）試験装置は、８個の皿状の容器を含み、各容器は培養物を保持するための形状及び寸法にされていて、図１がこれらの皿のうち一つを代表する概略図である。各皿３０はセラミック側壁３１と底部パネル３２を含み、これらが共に皿を形成する。複数の電極４１～４４が、培養物が容器内に配置された際に複数の電極４１～４４間の電圧の印加が培養物を介する電場を誘起する位置においてセラミック側壁３１の外面上に配置される。より具体的には、（ａ）電極４１と電極４２との間のＡＣ電圧の印加が第一方向で培養物を介する交流電場を誘起し、（ｂ）電極４３と電極４４との間のＡＣ電圧の印加が第二方向で培養物を介する交流電場を誘起する。図１の実施形態では、セラミック側壁上の電極４１～４４の配置位置に起因して、第二方向は第一方向に垂直である。電極の一方の組（例えば、電極４１と電極４２）が小さな角度（例えば、１０°未満）でずれていると、第二方向が第一方向に略垂直となることに留意されたい。

次に、図２を参照すると、ＡＣ電圧発生器２０が、第一電極対４１、４２及び第二電極対４３、４４に印加される信号を発生させる。ＡＣ電圧発生器２０は、第一電極対４１、４２の間に選択周波数でＡＣ電圧を１秒間にわたって印加し、次いで、第二電極対４３、４４の間に同じ周波数でＡＣ電圧を１秒間にわたって印加し、これら二つのステップの流れを実験期間にわたって繰り返す。装置は熱センサ（図示せず）も含み、ＡＣ電圧発生器２０は、皿３０の検知温度が高くなり過ぎると、電極に印加されているＡＣ電圧の振幅を減少させる。

第一実験では、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ，ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするレンチウイルスに腎臓細胞を晒した。この実験では、ダーマコン（登録商標）社のトランスレンチウイルスパッケージングキットをリン酸カルシウムトランスフェクション試薬ＴＬＰ５９１６とプレシジョンレンチＯＲＦ ＲＥＰコントロールＤＮＡ ＯＨＳ５８３２と共に用いた。感染の多重度は５であり、２００ｋＨｚのＡＥＦを１．２Ｖ／ｃｍ ＲＭＳの電場強度で培養物に４８時間にわたって印加した。ＡＥＦの方向を上述のように１秒毎に切り替えた。対照実験は、ＡＥＦを印加しないこと以外は全く同じ条件にした。４８時間後に、ＧＦＰの存在に基づいて感染細胞を特定した（つまり、ＧＦＰの存在が、細胞が感染したこと意味する）。感染効率を、フローサイトメトリー分析によって、ウイルスにコードされたＧＦＰを表す細胞の％として測定した。ＡＥＦ処理培養物中の感染細胞の割合は３０％であり、対照培養物中の感染細胞の割合は４７％であった。次いで、（対照に対する）相対的感染効率を計算した。結果は図３に示されていて、２００ｋＨｚのＡＥＦについて、相対的感染レベルは、対照細胞（１００±５．４％、ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定）と比較して６４±０．５％であった。

４８時間後の観察で、ＡＥＦ処理培養物と対照の両方について実験中に細胞が分裂していたことと、ＡＥＦ処理細胞と対照との間において細胞の総数に対する顕著な影響がないことが明らかとなった。このことについて考えられる一つの説明は、ＡＥＦが２７℃以上で印加可能であって、比較的短い（４８時間）処理期間と低電場高度を組み合わせて用いたからである。

第二のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験は、第一実験で用いた２００ｋＨｚのＡＥＦの代わりに１００ｋＨｚのＡＥＦを用いた点を除いては全て第一実験と同じであった。第二実験の結果は以下の通りである。ＡＥＦ処理培養物中の感染細胞の割合は５１％であり、対照培養物中の感染細胞の割合は６４％であった。次いで、（対照に対する）相対的感染効率を計算した。結果は図４に示されていて、１００ｋＨｚのＡＥＦについて、相対的感染レベルは、対照細胞（１００±３．７％、ｐ＜０．０１ ｐ＜０．０００５、スチューデントのｔ検定）と比較して８０±２％であった。

上記二つのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、ＡＥＦの周波数は１００ｋＨｚ又は２００ｋＨｚであった。しかしながら、代替実施形態では、ＡＥＦの周波数は５０ｋＨｚから５００ｋＨｚの間の他の周波数となり得る。他の実施形態では、ＡＥＦの周波数は２５ｋＨｚから１ＭＨｚの間の他の周波数となり得る。他の実施形態では、ＡＥＦの周波数は１ＭＨｚから１０ＭＨｚの間の他の周波数となり得る。更に他の実施形態では、ＡＥＦの周波数は１０ＭＨｚから１００ＭＨｚの間の他の周波数となり得る。最適な周波数は、使用目的に応じて、所与の種類の宿主細胞と、宿主細胞を感染させている又は感染させたい所与の種類のウイルスとの組み合わせに対してそれぞれ実験的に決定され得る。好ましくは、選択された周波数が対象領域に悪影響を与えるような加熱を生じさせないように注意する。

上記二つのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、ＡＥＦの電場強度は１．２Ｖ／ｃｍ ＲＭＳであった。しかしながら、代替実施形態では、異なる電場強度を使用し得て、例えば、０．２Ｖ／ｃｍ ＲＭＳから１Ｖ／ｃｍ ＲＭＳの間、１Ｖ／ｃｍ ＲＭＳから５Ｖ／ｃｍ ＲＭＳの間、又は、５Ｖ／ｃｍ ＲＭＳから２５Ｖ／ｃｍ ＲＭＳの間となり得る。最適な電場強度は、使用目的に応じて、所与の種類の宿主細胞と、宿主細胞を感染させている又は感染させたい所与の種類のウイルスとの組み合わせに対してそれぞれ実験的に決定され得る。

上記二つのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、ＡＥＦを４８時間にわたって印加した。しかしながら、代替実施形態では、異なる期間を使用し得て、例えば、１時間から４８時間の間や、２日間から１４日間の間となり得る。一部実施形態では、ＡＥＦの印加が周期的に繰り返され得る。例えば、ＡＥＦが毎日２時間の期間にわたって印加され得る。

上記二つのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、ＡＥＦの方向は、二つの直交する方向の間で１秒間隔で切り替えられた。しかしながら、代替実施形態では、ＡＥＦの方向をより高速（例えば、１ｍｓから１０００ｍｓの間の間隔）又はより低速（例えば、１秒から１００秒の間の間隔）で切り替え得る。

上記二つのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、２Ｄ（２次元）空間内で互いに９０°離した二つの電極対に交互の順でＡＣ電圧を印加することによって、ＡＥＦの方向が二つの直交する方向の間で切り替えられた。しかしながら、代替実施形態では、電極対を再配置することによって直交しない二つの方向の間や、（追加の電極対が設けられるものとして）三つ以上の方向の間でＡＥＦの方向が切り替えられ得る。例えば、ＡＥＦの方向が三方向の間で切り替えられ得て、各方向は各電極対の配置位置によって決められる。任意選択的に、三つの電極対は、結果としての電場が３Ｄ（３次元）空間内で互いに９０°離れるようにして配置され得る。他の実施形態では、電極を対で配置する必要が無くなり得る。例えば、特許文献２（参照として本願に組み込まれる）に記載の電極配置を参照されたい。他の代替実施形態では、電場の方向を切り替える必要が全く無くなり得て、この場合、第二電極対４３、４４（図１参照）を省くことができる。

上記二つのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、導電性の電極４１～４４がセラミック側壁３１の外面に配置され、側壁３１のセラミック材が誘電体として機能するので、電場が培養物に容量結合されていた。しかしながら、代替実施形態では、電場を容量結合無しで培養物に直接印加することができる（例えば、図１に示される構成を変更して、導電性の電極が側壁の外面の代わりに側壁の内面に配置されるようにすることによって）。

上記二つのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、ＨＥＫ２９３ＦＴヒト胎児腎臓細胞を皿３０（図１参照）内の対象領域に配置し、細胞を感染させるのにレンチウイルスを使用し、対象領域に交流電場を印加することで、対象領域内の細胞がウイルスに感染することを抑制した。代替実施形態では、異なる種類の細胞及び／又は異なる種類のウイルスが使用され得る。

これらの結果は、生体である被験体の対象領域にＡＥＦを印加することでｉｎ ｖｉｖｏ（インビボ，生体内）に関しても適用可能である。対象領域に交流電場を印加することが、その対象領域内の細胞がウイルスに感染することを抑制する。このことは、被験体の皮膚上又は皮下に電極を配置して、選択された電極の組の間のＡＣ電圧の印加が被験体の身体の対象領域に電場を印加するようにすることによって達成可能である。例えば、問題となっているウイルスが典型的には肺に定着する場合、図５Ａ及び図５Ｂに示されるように電極５１～５４が配置され得る。一部実施形態では、電極が被験体の身体に容量結合される（例えば、導電板と、その導電板と被験体の身体との間に位置する誘電体層とを含む電極を用いることによって）。しかしながら、代替実施形態では、誘電体層が省かれ得て、この場合、導電板が被験体の身体と直接接触するようになる。

ＡＣ電圧発生器２０（図２参照）が、第一電極対５１、５２の間に選択周波数（例えば、２００ｋＨｚ）でＡＣ電圧を第一期間（例えば、１秒間）にわたって印加し、電気力線の主成分が被験体の身体の横軸に平行となるＡＥＦを誘起する。次いで、ＡＣ電圧発生器２０が、第二電極対５３、５４の間に同じ周波数（又は異なる周波数）でＡＣ電圧を第二期間（例えば、１秒間）にわたって印加し、電気力線の主成分が被験体の身体の矢状軸に平行となるＡＥＦを誘起する。次いで、この二段階の方法を処置期間にわたって繰り返す。任意選択的に、熱センサ（図示せず）が電極に含まれ得て、ＡＣ電圧発生器２０が、電極において検知された温度が高くなり過ぎると電極に印加されているＡＣ電圧の振幅を減少させるように構成され得る。一部実施形態では、一対以上の追加の電極対が加えられ、本方法に関与するものとなり得る。例えば、図５Ａ及び図５Ｂに示される追加の電極対５５、５６が追加され、ＡＣ電圧発生器２０がこれら二つの電極にＡＣ電圧を印加すると、電気力線の主成分が被験体の身体の縦軸に平行となるＡＥＦを誘起する。このｉｎ ｖｉｖｏ実施形態のパラメータ（例えば、周波数、電場強度、期間、方向切り替え速度、電極の配置位置）のいずれもｉｎ ｖｉｔｒｏ実施形態に関して上述したように変更可能である。しかしながら、交流電場が全ての時点において被験体にとって安全であることを保証するように注意しなければならない。

ｉｎ ｖｉｖｏに関して、ＡＥＦは、腫瘍が無い対象領域（例えば、或る人間の肺）に適用され得る。代わりに、ＡＥＦは、腫瘍を含む対象領域（例えば、別の人間の肺）に適用され得る。

上記実施形態のいずれかにおいて、ＡＥＦの印加を対象領域への抗ウイルス剤の送達と組み合わせて、ＡＥＦの印加が行われている間に治療に有効な量の抗ウイルス剤が対象領域に存在するようにし得る。

ＡＥＦはウイルス感染を抑制することができるので、ＡＥＦの印加は、新しい細胞の感染による損傷（細胞機能の変更、細胞の死や形質転換）を防止し、ウイルスの増殖と拡散を止め、感染者の健康に関する予期せぬ問題を回避することができる。

ＡＥＦ型の抗ウイルス治療は、感染していない健常な個々人を脅威的な感染から保護するのにも使用され得て、これは、感染者に密に接触する医療スタッフの場合等（特に、ウイルス疾患の急性期において、感染粒子が血液、皮膚病変、唾液等に発見され、直接接触又は間接接触（例えば、小滴やエアロゾルを介する）によって移り得る場合）である。

ＡＥＦ型の抗ウイルス保護は、身体本来の防衛機能を欠いているので極度に日和見感染し易くなっているという免疫系が抑制された個々人（先天性免疫不全、臓器移植、癌等の場合）によっても使用され得る。

また、ウイルス感染の抑制は、進行中のウイルス疾患の進行具合にとっても極めて重要なものとなり得る。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ，ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）は、人体内で、特にリンパ節において、長期期間にわたって臨床的に休眠状態にあるが、その期間中にウイルスが存続して複製するというウイルスの一例である。時間と共に、感受性免疫細胞の数は減少して、感染とＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群，ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）が発達する。連続的なウイルス感染サイクルを休止させることで、その拡散を抑え、疾患の進行を防ぐ。

更に、ＡＥＦ型の抗ウイルス治療は、追加の抗ウイルス薬と組み合わせることで更に高い効果を示す可能性がある。

本発明は特定の実施形態を参照して開示されているものであるが、特許請求の範囲に定められる本発明の要旨及び範囲から逸脱せずに、開示の実施形態に対する多数の修正、置換、変更が可能なものである。従って、本発明は、開示の実施形態に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲の文言及びその均等物によって定められる完全な範囲を有するものである。

３０ 皿
３１ セラミック側壁
３２ 底部パネル
４１、４２、４３、４４、５１、５２、５３、５４、５５、５６ 電極

Claims (13)

1. 対象領域内の細胞がウイルスに感染することを抑制する方法であって、
   前記対象領域に期間にわたって交流電場を印加するステップを備え、前記交流電場が周波数及び電場強度を有し、前記対象領域に期間にわたって交流電場を印加している際に前記交流電場が前記対象領域内の細胞がウイルスに感染することを抑制し、
   前記交流電場が２５ｋＨｚから１ＭＨｚの間の周波数を有し、
   前記交流電場が１Ｖ／ｃｍ ＲＭＳから５Ｖ／ｃｍ ＲＭＳの間の電場強度を有し、
   前記期間が２日間から１４日間の間である、方法。
2. 対象領域内の細胞がウイルスに感染することを抑制する方法であって、
   前記対象領域に期間にわたって交流電場を印加するステップを備え、前記交流電場が周波数及び電場強度を有し、前記対象領域に期間にわたって交流電場を印加している際に前記交流電場が前記対象領域内の細胞がウイルスに感染することを抑制し、
   前記交流電場が２５ｋＨｚから１ＭＨｚの間の周波数を有し、
   前記交流電場が１Ｖ／ｃｍ ＲＭＳから５Ｖ／ｃｍ ＲＭＳの間の電場強度を有し、
   前記期間が１時間から４８時間の間である、方法。
3. 前記対象領域が生体内の領域であり、前記交流電場が前記生体にとって安全である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記対象領域に腫瘍が無い、請求項３に記載の方法。
5. 前記対象領域に抗ウイルス剤を送達して、前記交流電場を印加するステップが行われている際に治療に有効な量の抗ウイルス剤が前記対象領域に存在しているようにするステップを更に備える請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記交流電場が５０ｋＨｚから５００ｋＨｚの間の周波数を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記交流電場が２００ｋＨｚの周波数を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記交流電場が１．２Ｖ／ｃｍ ＲＭＳの電場強度を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記期間が４８時間である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記交流電場が、前記期間中に少なくとも二つの方向の間で繰り返して切り替えられる向きを有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記交流電場の向きが１秒に１回切り替えられる、請求項１０に記載の方法。
12. 前記交流電場が、前記期間中に第一方向と第二方向との間で繰り返して切り替えられる向きを有し、前記第一方向が前記第二方向に垂直である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記交流電場が容量結合電極を介して前記対象領域に印加される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

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