JP7366249B2 - タウタンパク質の蓄積、凝集及びタングル形成抑制用組成物及びその抑制方法 - Google Patents

Description

本発明は、タウタンパク質の蓄積、凝集又はタングル形成抑制用組成物に関し、より詳細には、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子を共に、又はＮｕｒｒ１遺伝子を単独で導入して発現を誘導することにより、タウタンパク質の蓄積、凝集又はタングル形成（Ｔａｕ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ，ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ，ｏｒ ｔａｎｇｌｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を抑制する技術に関する。

アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ＡＤ）は、記憶力減退、言語及び認知障害、感情コントロール不足などを症状とする慢性神経退行性疾患である。

アルツハイマー病は、神経病理学的に、脳細胞、神経組織及び血管内のプラーク（ｐｌａｑｕｅ）の存在、及びタウタンパク質凝集から形成された神経原線維タングル（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅｓ，ＮＦＴ）の存在を特徴とする。アルツハイマー病は、また、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎｓ）又はプラーク（ｐｌａｑｕｅｓ）の形成及びシナプスの損傷などを特徴とする。アルツハイマー病の原因は完全に知られておらず、その治癒法も現在までは存在していない。アルツハイマー病は認知症の中で最も多く、心血管系疾患及び癌とともに主要な死亡原因となっている。人の平均寿命が増加するに伴って、アルツハイマー病の頻度も増加すると予想される。

また、アルツハイマー病患者を管理し治療するのに莫大な費用が発生し、患者の精神的苦痛も相当である。このため、アルツハイマー病患者の効果的な予防及び治療方法が必要な状況である。

近年、アルツハイマー病と関連してタウ（Ｔａｕ）タンパク質への研究に多くフォーカスされている。実際に、脳脊髓液のタウは、アルツハイマー病の前駆期間（ｐｒｏｄｒｏｍａｌ ｓｔａｇｅ）に増加し始め、発病後の病気の進行中には、増加した量が安定して維持される。タウタンパク質が過剰にリン酸化された（ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ）ＮＦＴは、発病初期から認められ、その量が病気の進行につれて次第に増加する。すなわち、タウ媒介の神経細胞損傷と機能異常（Ｔａｕ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）は、アルツハイマー病の症状を示す大部分の患者に見られる病理的所見である。また、ＮＦＴは、ＡＤの他にも、前頭側頭型認知症（Ｆｒｏｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｉｍｅｎｔｉａ ＦＴＤ）、進行性核上麻痺（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｃｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ ｐａｌｓｙ，ＰＳＰ）、ピック病（Ｐｉｃｋ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、慢性外傷性脳症（Ｃｈｒｏｎｉｃ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ，ＣＴＥ）などの別のタウオパチー（ｔａｕｏｐａｔｈｙ）のバイオマーカーでもあり、それらの疾病に対する治療剤も開発されていない実情である。

そこで、本発明者らは、転写因子Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を共に、又はＮｕｒｒ１を単独で導入して脳細胞に発現させる時に、タウタンパク質の蓄積、凝集又はタングル（ｔａｎｇｌｅ）を抑制することを実験的に究明し、本発明を完成するに至った。特に、Ｎｕｒｒ１が活性化補助因子（ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ）であるＦｏｘａ２と組み合わせて発現した時に、シナジー効果により、強力なタウタンパク質蓄積、凝集又はタングル抑制効果があることを確認した。他の具体例として、Ｎｕｒｒ１が単独で発現した時にも、タウタンパク質を阻害する実質的な効果を有することが発見された。

したがって、本発明の目的は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２、又はＮｕｒｒ１遺伝子が搭載されたベクターを含む、タウタンパク質蓄積、凝集又はタングル形成抑制用組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２、又はＮｕｒｒ１遺伝子が単独で導入された神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、タウタンパク質蓄積、凝集又はタングル抑制用組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２、又はＮｕｒｒ１遺伝子が搭載されたベクターを含む、タウタンパク質リン酸化抑制用組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子、又はＮｕｒｒ１遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、タウタンパク質リン酸化抑制用組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子、又はＮｕｒｒ１遺伝子が搭載されたベクターを含む、タウタンパク質蓄積、凝集又はタングル形成によって発病する疾患の予防又は治療用組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２、又はＮｕｒｒ１遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、タウタンパク質蓄積、凝集又はタングル形成によって発病する疾患の予防又は治療用組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子、又はＮｕｒｒ１遺伝子が搭載されたベクターを含む、タウオパチー予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子、又はＮｕｒｒ１遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、タウオパチー予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することである。

本発明者らは、タウオパチーの主要原因として知られたタウタンパク質の蓄積、凝集又はタングル抑制のための方法について鋭意研究努力した。その結果、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子を共に、又はＮｕｒｒ１遺伝子を単独で導入して発現させた場合に、タウタンパク質蓄積、凝集又は神経原線維タングル形成抑制効果、タウタンパク質リン酸化抑制効果があることを究明した。

本発明の一態様によれば、本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が搭載されたベクターを含む、タウタンパク質凝集抑制用組成物を提供する。

本発明の他の様態によれば、本発明は、Ｎｕｒｒ１遺伝子が搭載されているが、Ｆｏｘａ２遺伝子は搭載されていないベクターを含む、タウタンパク質蓄積、凝集又はタングル形成抑制用組成物を提供する。

本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、タウタンパク質蓄積、凝集又はタングル形成抑制用組成物を提供する。

本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、Ｎｕｒｒ１遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、タウタンパク質蓄積、凝集又はタングル形成抑制用組成物を提供する。

本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が搭載されたベクターを含む、タウタンパク質リン酸化抑制用組成物を提供する。

本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、Ｎｕｒｒ１遺伝子が搭載されたベクターを含む、タウタンパク質リン酸化抑制用組成物を提供する。

本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、タウタンパク質リン酸化抑制用組成物を提供する。

本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、Ｎｕｒｒ１遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、タウタンパク質リン酸化抑制用組成物を提供する。

本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が搭載されたベクターを含む、タウタンパク質蓄積、凝集又はタングル形成によって発病する疾患の予防又は治療用組成物を提供する。

本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、Ｎｕｒｒ１遺伝子が搭載されたベクターを含む、タウタンパク質蓄積、凝集又はタングル形成によって発病する疾患の予防又は治療用組成物を提供する。

本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、タウタンパク質蓄積、凝集又はタングル形成によって発病する疾患の予防又は治療用組成物を提供する。

本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、Ｎｕｒｒ１遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、タウタンパク質蓄積、凝集又はタングル形成によって発病する疾患の予防又は治療用組成物を提供する。

本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が搭載されたベクターを含む、タウオパチー予防又は治療用薬剤学的組成物を提供する。

本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、Ｎｕｒｒ１遺伝子が搭載されたベクターを含む、タウオパチー予防又は治療用薬剤学的組成物を提供する。

本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、Ｎｕｒｒ１又はＦｏｘａ２遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、タウオパチー予防又は治療用薬剤学的組成物を提供する。

本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、Ｎｕｒｒ１遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、タウオパチー予防又は治療用薬剤学的組成物を提供する。

本発明の一具体例によれば、前記タウオパチーは、タウ陽性アルツハイマー病（Ｔａｕ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、レビー小体型認知症（Ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ Ｂｏｄｉｅｓ）、前頭側頭型認知症（Ｆｒｏｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ，ＦＴＤ）、多発梗塞性認知症（Ｍｕｌｔｉ－Ｉｎｆａｒｃｔ Ｄｅｍｅｎｔｉａ，ＭＩＤ）、前頭側頭葉変性症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｌｏｂａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ＦＴＬＤ）、進行性核上麻痺（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｃｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ ｐａｌｓｙ，ＰＳＰ）、ピック病（Ｐｉｃｋ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、慢性外傷性脳症（Ｃｈｒｏｎｉｃ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ，ＣＴＥ）、大脳皮質基底核変性症（Ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ＣＢＤ）、球状神経膠タウオパチー（Ｇｌｏｂｕｌａｒ ｇｌｉａｌ ｔａｕｏｐａｔｈｙ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、神経節細胞膠腫（ｇａｎｇｌｉｏｇｌｉｏｍａ）、神経節細胞腫（ｇａｎｇｌｉｏｃｙｔｏｍａ）、原発性加齢性タウオパチー（ｐｒｉｍａｒｙ ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｔａｕｏｐａｔｈｙ，ＰＡＲＴ）、嗜銀顆粒病（ａｒｇｙｒｏｐｈｉｌｉｃ ｇｒａｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、鉛毒性脳症（ｌｅａｄ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、リポフスチン沈着症（ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｉｓ）、リティコ－ボディグ病（Ｌｙｔｉｃｏ－Ｂｏｄｉｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、髓膜血管腫症（ｍｅｎｉｎｇｉｏａｎｇｉｏｍａｔｏｓｉｓ）からなる群から選ばれる疾患であり、これに限定されない。

本発明は、Ｎｕｒｒ１遺伝子と共にＦｏｘａ２遺伝子を、タウオパチーの一種であるアルツハイマー病の予防及び治療に使用することができる。Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２の導入、又はＮｕｒｒ１単独導入による発現は、アルツハイマー病の病理的症状を緩和させることが発見された。前記病理的症状は、（１）タウタンパク質蓄積、（２）ベータアミロイド蓄積、（３）脳細胞老化、（４）シナプス損失、（５）末梢免疫細胞蓄積、を含む。また、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘ２を共に、又はＮｕｒｒ１単独を発現させると、脳細胞を神経栄養化し、タウオパチーの一種であるアルツハイマー病の予防及び治療効果を奏する。

一方、本発明の方法の一具体例において、「Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を導入（形質導入）する」ということは、これらの両遺伝子をコードする核酸を脳細胞に共に導入することを指す。両遺伝子はそれぞれ個別に又は同時に導入されてよい。

本発明の方法において「Ｎｕｒｒ１導入（形質導入）する」ということは、Ｎｕｒｒ１遺伝子をコードする核酸を脳細胞に導入することを指す。

脳細胞にＮｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２をコードする遺伝子を導入するために、ＤＮＡ－カルシウム沈殿法、リポソームを用いる方法、ポリアミン系列を使用する方法、エレクトロポレーション法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、レトロウイルスを用いる方法、アデノウイルスを用いる方法、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などを用いる方法など、当分野に公知された遺伝子の細胞内導入技術方法が用いられてよい。

Ｎｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２を搭載するとき、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターを使用することができる。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、及び／又はレンチウイルスなどがある。非ウイルスベクターは、ＲＮＡ分子、プラスミド、リポソーム複合体、分子結合体（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）、及び／又は遺伝子はさみ（ｓｃｉｓｓｏｒ）タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ，例えばＣａｓ９）などがある。したがって、本発明に係るＮｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２導入は、一具体例として、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２をコードする核酸を、個別の発現ベクター又は単一の発現ベクターに挿入させた後、それを脳細胞に導入することを含む。

Ｎｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２を発現させる具体例において、遺伝子編集技術を用いることができ、遺伝子編集技術とは、生命体の遺伝情報を自由に矯正し、目的とする遺伝形質を示させるものであり、遺伝子編集技術に利用可能なシステムとして、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）／ＣＲＩＳＰＲ結合プロテイン９（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）などがある。

本発明において、用語「ＲＮＡガイドヌクレアーゼ」とは、目的とするゲノム上の特定位置を認識して切断できるヌクレアーゼで、特に、ガイドＲＮＡによって標的特異性を有するヌクレアーゼのことを指す。前記ＲＮＡガイドヌクレアーゼは、これに制限されるものではないが、具体的に、微生物兔疫体系であるＣＲＩＳＰＲに由来するＣａｓタンパク質であり、より具体的に、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ９）ヌクレアーゼ（ｎｕｃｌｅａｓｅ）及びその変異体であるＣａｓ９ニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）を含むことができる。

本発明において、用語「Ｃａｓタンパク質」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの主要タンパク質構成要素であり、活性化されたエンドヌクレアーゼとして作用可能なタンパク質である。前記Ｃａｓタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と複合体を形成してそれの活性を示すことができる

前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ヒト細胞をはじめとする動植物細胞のゲノムにおいて特定の塩基配列を認識して二重鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ，ＤＳＢ）を起こす。前記二重鎖切断は、ＤＮＡの二重鎖を切って平滑末端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）又は粘着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ）を作る全てのことを含む。ＤＳＢは、細胞内で相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）又は非相同再接合（ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ－ｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＨＥＪ）機序により効率的に修繕されるが、この過程で、研究者が所望する変異を標的箇所に導入することができる。前記ＲＮＡガイドヌクレアーゼは、人工的な、或いは操作された非自然的に発生した（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ものであり得る。

前記Ｃａｓ９ニッカーゼは、その触媒的ドメインのうち１個に１個以上の突然変異を含むが、ここで、前記１個以上の突然変異は、ＲｕｖＣドメイン内のＤ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ及びＤ９８６Ａからなる群から選択されるか、又は前記１個以上の突然変異は、ＨＮＨドメイン内のＨ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ及びＮ８６３Ａからなる群から選ばれる。前記Ｃａｓ９ニッカーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼとは違い、単鎖切断（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ）を起こす。したがって、Ｃａｓ９ニッカーゼが作動するためには、２つのガイドＲＮＡが用いられ、対（ｐａｉｒ）として機能する。前記２つのガイドＲＮＡは、それぞれの標的配列に対してＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指示し、各標的配列近傍のＤＮＡデュプレックスの一方の鎖の切断を指示し、異なるＤＮＡ鎖に２つのニック（ｎｉｃｋ）を誘導することができる。

Ｃａｓタンパク質又は遺伝子情報は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋのような公知のデータベースから得ることができる。具体的に、前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であってよい。また、前記Ｃａｓタンパク質は、これに制限されるものではないが、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ネイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属由来のＣａｓタンパク質でよく、より具体的に、スタフィロコッカス属Ｃａｓ９タンパク質でよい。ただし、前述の例に本発明が制限されるものではない。本発明において、前記Ｃａｓタンパク質は組換えタンパク質でよい。

前記Ｎｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２をコードする各核酸は、当業界に公知の通り、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２をコードする塩基配列を有するものであればいずれも使用可能である。また、前記核酸は、Ｎｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２の各機能的同等物をコードする塩基配列を有することができる。機能的同等物とは、Ｎｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上の配列相同性（又は、同一性）を有するポリペプチドのことを指す。例えば、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列相同性を有するポリペプチドを含む。前記機能的同等物は、アミノ酸配列の一部が付加、置換又は欠失して生成されたものでよい。アミノ酸の欠失又は置換は、好ましくは、本発明のポリペプチドの生理活性に直接関連していない領域に位置している。

また、Ｎｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２タンパク質をコードする核酸は、当業界に公知の遺伝子組換え方法によって製造されてよい。例えば、ゲノムから核酸を増幅させるためのＰＣＲ増幅法、化学的合成法、又はｃＤＮＡ配列を製造する技術がある。

前記Ｎｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２をコードする核酸は、発現調節配列に作動可能に連結され、発現ベクター内に挿入されてよい。「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、一つの核酸断片が他の核酸断片と結合し、それの機能又は発現が、他の核酸断片から影響を受けることを指す。また、発現調節配列（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）とは、特定の宿主細胞において作動可能に連結された核酸配列の発現を調節するＤＮＡ配列を意味する。このような調節配列は、転写を開始するためのプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の終結を調節する配列を含む。これらを総じて「Ｎｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２をコードする核酸を含むＤＮＡ構築物（ＤＮＡ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」と表現することもできる。

「発現ベクター」とは、構造遺伝子をコードする核酸が挿入されてよく、宿主細胞内で前記核酸を発現可能な、当業界に公知のプラスミド、ウイルスベクター又はその他媒介体を意味する。一具体例において、ウイルスベクターであってよい。前記ウイルスベクターには、これに制限されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、アビポックスウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどがある。特に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はレンチウイルスを用いる方法が好ましい。

前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、特定の細胞に、ウイルスを生産可能な材料を導入して作製されたものであり、レンチウイルスベクターも、特定の細胞株にウイルスが生産可能となるように様々な段階を経て作製されたものである。遺伝子療法のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はレンチウイルスベクターの主要長所は、効率性と安全性である。

本発明に係る核酸を含む発現ベクターは、当業界に公知の方法、例えば、これに限定されないが、一過性トランスフェクション（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、微細注射、形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）、細胞融合、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム媒介されたトランスフェクション（ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ＤＥＡＥデキストラン媒介されたトランスフェクション（ＤＥＡＥ Ｄｅｘｔｒａｎ－ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ポリブレン媒介されたトランスフェクション（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）、及び細胞内に核酸を流入させるための他の公知の方法により、脳細胞内に導入可能である。例えば、Ｎｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２をＡＡＶ又はレンチウイルスベクターに挿入して発現ベクターを作製した後、このベクターをパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）細胞に形質導入し、形質導入されたパッケージング細胞を培養後に濾過してＡＡＶ又はレンチウイルス溶液を得、これを用いて脳細胞、神経細胞及び／又は神経前駆細胞を感染させることにより、脳細胞にＮｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２遺伝子を導入することができる。次いで、前記ＡＡＶ又はレンチウイルスベクターに含まれた選別マーカーを用いて、Ｎｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２を単独発現又は同時発現することを確認した後、所望の脳細胞を得ることができる。

一具体例として、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２が導入されて発現する脳細胞は、下記の段階を含む製造方法によって製造することができる：

（ａ）Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２をコードする核酸を含むＤＮＡ構築物を含む組換えウイルスベクターを構築する段階；

（ｂ）前記組換えウイルスベクターをウイルス生産細胞株にトランスフェクションし、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２発現組換えウイルスを製造する段階；及び

（ｃ）前記Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２発現組換えウイルスに脳細胞を感染させる段階。

まず、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２をコードする核酸を含むＤＮＡ構築物は、上述の通りに製造される。

一具体例として、本発明に係るＮｕｒｒ１が導入されて発現する脳細胞は、下記の段階を含む製造方法によって製造されてよい：

（ａ）Ｎｕｒｒ１をコードする核酸を含むＤＮＡ構築物を含む組換えウイルスベクターを構築する段階；

（ｂ）前記組換えウイルスベクターをウイルス生産細胞株にトランスフェクションし、Ｎｕｒｒ１発現組換えウイルスを製造する段階；及び

（ｃ）前記Ｎｕｒｒ１発現組換えウイルスで脳細胞を感染させる段階。

Ｎｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２をコードする核酸を含むＤＮＡ構築物も、上述の通りに製造されてよい。

前記ＤＮＡ構築物を、発現調節配列、例えばプロモーターに作動可能に連結し、当業界に公知のウイルスベクターに挿入させて、組換えウイルスベクターを製造する。その後、Ｎｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２をコードする核酸を含む組換えウイルスベクターを、ウイルス生産細胞株に導入し、Ｎｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２を発現させる組換えウイルスを製造する。前記ウイルス生産細胞株は、使用したウイルスベクターに対応するウイルス生産細胞株を使用することができる。その後、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２、又はＮｕｒｒ１を発現させる組換えＡＡＶ又はレンチウイルスを脳細胞に感染させる。これは、当業界に公知の任意の方法によって行われてよい。

本発明に係るＮｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２タンパク質を発現する脳細胞は、当業界に公知の任意の方法によって増殖及び培養されてよい。

本発明の脳細胞は、目的の脳細胞タイプの生存又は増殖を助ける培養液内で培養される。しばしば、血清の代わりに遊離アミノ酸により栄養を供給する培養液を使用することが好ましい。脳細胞の持続した培養のために開発された添加剤を培養液に補充することが好ましい。例えば、Ｇｉｂｃｏ社から市販されるＮ２培地及びＢ２７添加剤、ウシ血清などがある。培養の際、培地と細胞の状態を観察しながら培地を交換することが好ましい。このとき、脳細胞が増殖し続けて集合し、神経球（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）を形成すると、継代培養するものであり得る。継代培養は、特定の方法（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）及び観測された細胞成長特徴によって約７～８日ごとに実施可能である。

一方、Ｎｕｒｒ１及び／又はＦｏｘａ２が脳細胞に導入されて発現すると、（１）ベータアミロイド蓄積、（２）タウタンパク質蓄積、（３）脳細胞老化、（４）シナプス損失、（５）末梢免疫細胞蓄積のような、タウオパチーの一種であるアルツハイマー病の病理的症状を緩和させ、また、脳細胞を神経栄養化し、タウオパチーの一種であるアルツハイマー病の予防及び治療を助ける。Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２、又はＮｕｒｒ１が発現する際、脳細胞においてタウオパチーの一種であるアルツハイマー病の病理的症状を緩和させ、タウオパチーの一種であるアルツハイマー病の予防及び治療に効果を示す。

また、本発明は、別の態様において、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２が導入された脳細胞のタウオパチーの治療のための用途を提供する。

また、本発明は、別の態様において、Ｎｕｒｒ１が導入された脳細胞のタウオパチーの治療のための用途を提供する。

例えば、これらの細胞は、治療しようとする疾患又は状態に応じて、黒質部位にＦｏｘａ２及びＮｕｒｒ１、又はＮｕｒｒ１が導入された脳細胞を直接導入することにより、治療に使用することができる。また、Ｆｏｘａ２及びＮｕｒｒ１、又はＮｕｒｒ１が導入された脳細胞を、治療学的有効量で含有する組成物の形態で投与又は移植することにより、治療に使用することができる。そして、本発明は、タウオパチーの治療方法も含む。

本発明の一態様として、Ｆｏｘａ２及びＮｕｒｒ１、又はＮｕｒｒ１が導入された脳細胞を有効成分として含有する、タウタンパク質蓄積、凝集、又はＮＦＬによって発病する疾患（例えば、アルツハイマー病など）の予防又は治療用組成物、遺伝子治療剤又は細胞治療剤に関する。

本発明の遺伝子治療剤又は細胞治療剤は、タウタンパク質及び／又はベータアミロイド蓄積を防ぎ、神経細胞及び膠細胞を含む脳細胞を損傷から保護し、記憶関連神経細胞が補充（再生）又は再構築（復元）されるようにする。

「再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」とは、形成された器官又は個体の一部が喪失されたとき、その部分が補充される現象であり、「復元」とは、「再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とも呼ぶことができ、これは、組織の再構築を意味するもので、一旦解離した細胞又は組織から組織又は器官を再び構築することを指す。

本発明の組成物又は細胞治療剤は、投与方式に応じて、許容可能な担体を含み、適切な製剤とすることができる。投与方式に適する製剤は公知であり、典型的には、膜を通過し、移動を容易にさせる製剤を含むことができる。

また、本発明の組成物は、通常の医薬品製剤の形態で使用されてよい。非経口用製剤は、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤又は凍結乾燥製剤で調製することができる。経口投与の場合には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ又はウエハーなどの形態で調製できる。注射剤の場合には、単位投薬アンプル又は多回投薬の形態で調製できる。また、本発明の治療用組成物は、薬学的に許容される担体と共に投与されてよい。例えば、経口投与の場合には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁剤、色素又は香料などを使用することができ、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。

また、本発明の治療用組成物を用いてタウオパチーを治療する方法は、適切な方法で対象又は患者に所定の物質が導入される一般的な経路を通じて投与することを含むことができる。前記投与方法には、脳内投与、脳室内投与、脊椎腔投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与及び直腸内投与があるが、これに制限されない。ただし、経口投与時に、細胞が消化されることがあるため、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングするか、或いは胃で分解されることから保護するために剤形化することが好ましい。

また、製薬組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与されてよい。好ましい投与方式及び製剤は、定位システム（Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いた海馬注射剤、脳室注射剤、脳脊髄液注射剤、静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤又は点滴注射剤などである。注射剤は、生理食塩水又はリンゲル液などの水性溶剤、植物油、高級脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、アルコール類（例えば、エタノール、ベンジルアルコール、プロピレングリコール又はグリセリンなど）などの非水性溶剤などを用いて製造でき、変質防止のための安定化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＢＨＡ、トコフェロール、ＥＤＴＡなど）、乳化剤、ｐＨ調整のための緩衝剤、微生物発育を阻止するための保存剤（例えば、硝酸フェニル水銀、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、フェノール、クレゾール、ベンジルアルコールなど）などの薬剤学的担体を含むことができる。好ましくは、本発明の治療用組成物を用いてタウオパチーを治療する方法は、本発明の治療用組成物を薬学的有効量で投与することを含む。前記薬学的有効量は、疾患の種類、対象（患者）の年齢、体重、健康、性別、対象（患者）の薬物に対する敏感度、投与経路、投与方法、投与回数、治療期間、配合又は同時使用される薬物などの、医学分野によく知られた要素によって、当業者が容易に決定できる。

また、本発明の他の態様として、前述したＦｏｘａ２及びＮｕｒｒ１、又はＮｕｒｒ１が導入された脳細胞を含有する組成物を治療学的有効量で病変部位に直接移植することを含む、タウタンパク質蓄積、凝集、及びタングルによって発病する疾患（例えば、アルツハイマー病など）の治療方法に関する。移植及び細胞培養の方法は、当業者に広く知られた公知の方法を用いることができる。

前記細胞の「治療学的有効量」は、タウオパチーによって誘発される対象又は患者の生理学的効果を中止又は軽減させるのに十分な量である。使用された細胞の治療学的有効量は、対象（患者）の必要性、対象（患者）の年齢、生理学的状態及び健康、所定の治療効果、治療を必要とする組織の大きさ及び面積、病変の程度及び選択された導入経路に依存するであろう。また、細胞は、低用量の細胞を小さな複数の移植片の形で、所定の標的組織内の１以上の部位に投与できる。本発明の細胞は移植前に完全に分離され、例えば単一細胞の懸濁液を形成したり、又は移植前に略完全に分離され、例えば細胞の小型凝集塊を形成できる。細胞は、懸濁液や細胞の小型凝集塊を所定の組織部位に移植又は移動させ、機能的に欠乏している領域を再構成又は再生する方式で投与できる。

治療学的に有効達成可能に投与できる細胞の適当な範囲は、当業者の通常の知識内で、対象又は患者に応じて適切に使用することができる。例えば、約１，０００～１，０００，０００，０００細胞、或いはそれ以上であってもよいが、低用量では効果がなく、高用量では副作用の発生可能性があることを排除できないことから、１００，０００～５０，０００，０００個程度が好ましいだろう。

ただし、投与量はそれに限定されず、剤形の種類、投与方法、対象（患者）の年齢や体重、患者の症状などを考慮し、最終には医師の判断によって適切に決定されてよい。

本発明の組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、対象（患者）の年齢、体重、性別、疾病症状の程度、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって様々であり、熟練した通常の医師は、目的とする治療に効果的な投与量を容易に決定及び処方できる。一般に、本発明の薬剤学的組成物は、１×１０^３～１×１０^１３ｖｇ／μｌのウイルスベクター、又はウイルス遺伝子を含み、通常、１×１０^６～３×１０^１５ｖｇ／ｄｏｓｅのウイルスベクター、又はウイルス遺伝子を患者に１回～５回注射し、効果の持続のために、数ヶ月又は数年後に再び類似の方法で注射できる。

本発明において、前記組成物は、上述の医薬品製剤の形態で使用できる。

本発明において、「遺伝子治療剤」は、疾病治療などを目的に遺伝物質又は遺伝物質を移入した運搬体を人体に投与する医薬品を意味する。

遺伝子治療剤として適用可能な本発明の組成物に対して薬学的に許容可能な担体は、滅菌及び生体に適合するものとして、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びそれら成分の１成分以上を混合して使用することができ、必要によって、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤などの別の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤をさらに添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒又は錠剤として製剤化でき、標的器官に特異的に作用できるように標的器官特異的抗体又はその他リガンドを前記担体と結合させて使用することができる。

Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２、又はＮｕｒｒ１を発現させる脳細胞ではなくＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２、又はＮｕｒｒ１を発現させるベクターを直接使用する以外は、前述した内容を、組成物に適用又は準用することができる。

本発明は、また、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２の両方、又はＮｕｒｒ１だけで形質変換された脳細胞を含む組成物を治療学的有効量で対象に投与することを含むタウオパチー予防又は治療方法を提供する。

本発明の特徴及び利点を要約すると、次の通りである。

（ａ）本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２、又はＮｕｒｒ１遺伝子が搭載されたベクターを含む、タウタンパク質蓄積、凝集又はタングル形成抑制用組成物を提供する。

（ｂ）本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２、又はＮｕｒｒ１遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｒｏｕｓ）又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、タウタンパク質蓄積、凝集又はタングル形成抑制用組成物を提供する。

（ｃ）本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２、又はＮｕｒｒ１遺伝子が搭載されたベクターを含む、タウタンパク質リン酸化抑制用組成物を提供する。

（ｄ）本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２、又はＮｕｒｒ１遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、タウタンパク質リン酸化抑制用組成物を提供する。

（ｅ）本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２、又はＮｕｒｒ１遺伝子が搭載されたベクターを含む、タウタンパク質蓄積、凝集、及びタングルによって発病する疾患予防又は治療用組成物を提供する。

（ｆ）本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２、又はＮｕｒｒ１遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｒｏｕｓ）又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、タウタンパク質蓄積、凝集、及びタングルによって発病する疾患予防又は治療用組成物を提供する。

（ｇ）本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２、又はＮｕｒｒ１遺伝子が搭載されたベクターを含む、タウオパチー予防又は治療用薬剤学的組成物を提供する。

（ｈ）本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２、又はＮｕｒｒ１遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、タウオパチー予防又は治療用薬剤学的組成物を提供する。

（ｉ）本発明の抑制剤、組成物を用いる場合、アルツハイマー病のようなタウタンパク質の蓄積、凝集、及びタングルによって発病する脳神経疾患の予防又は治療に活用することができる。

本開示における上記および他の態様、特徴および利点は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明から、より明らかになるであろう。

ＡＡＶ９ウイルスを用いた遺伝子導入システムテスト実験過程を示す。

ＡＡＶ９ウイルスを用いた遺伝子導入テスト実験結果（海馬及び脳室におけるＧＦＰ発現程度）を示す。

脳細胞にＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子を導入したマウスの海馬部位におけるベータアミロイド及びタウタンパク質の蛍光を、免疫染色方法を用いて確認した結果を示す。

脳細胞にＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子を導入したマウスの海馬部位におけるタウタンパク質（Ｔａｕ）及びリン酸化タウタンパク質（ｐｈｏｓｐｈｏｒ－ｔａｕ，ｐＴａｕ）の蛍光を、免疫染色方法を用いて確認した結果を示す。

水迷路（Ｗａｔｅｒ Ｍａｚｅ）実験により、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２－ＡＡＶ９ウイルスを注入したマウスの行動指標とコントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）ウイルス（ＧＦＰ－ＡＡＶ９）を注入したマウスの行動指標とを比較した結果を示す。

Ｙ Ｍａｚｅ実験により、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２－ＡＡＶ９ウイルスを注入したマウスの行動指標とコントロールウイルス（ＧＦＰ－ＡＡＶ９）を注入したマウスの行動指標とを比較した結果を示す。

水迷路実験により、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２－ＡＡＶ９ウイルスを注入したマウスの行動指標とコントロールウイルス（ＧＦＰ－ＡＡＶ９）を注入したマウスの行動指標（移動様相記録）とを比較した結果を示す。

水迷路実験により、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２－ＡＡＶ９ウイルスを注入したマウスの行動指標とコントロールウイルス（ＧＦＰ－ＡＡＶ９）を注入したマウスの行動指標（目標まにおける移動距離）とを比較した結果を示す。

水迷路実験により、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２－ＡＡＶ９ウイルスを注入したマウスの行動指標とコントロールウイルス（ＧＦＰ－ＡＡＶ９）を注入したマウスの行動指標（平均速度）とを比較した結果を示す。

３ｘＦＡＤ形質転換（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ，Ｔｇ）マウスにおいて、ＰＢＳ投与対照群、Ｎｕｒｒ１単独投与群、又はＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２同時投与群のリン酸化されたタウタンパク質（ｐ－ｔａｕ）及びＴｕｊ１で免疫染色方法を行った結果を示す写真である。

３ｘＦＡＤ Ｔｇマウスにおいて、ＰＢＳ投与対照群、Ｎｕｒｒ１単独投与群、又はＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２同時投与群のリン酸化されたタウタンパク質（ｐ－ｔａｕ）及びＴｕｊ１で免疫染色方法を行った結果を示すグラフである。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないということは、当業界における通常の知識を有する者には明らかであろう。

本明細書で使われる用語に対する定義は、次の通りである。

「脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）」は、脳に位置している細胞を意味し、神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ，ｎｅｕｒｏｎ ｃｅｌｌｓ）及び膠細胞（ｇｌｉａ，ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）などで構成されている。

「神経細胞」は、神経系の細胞であり、用語「ニューロン」又は「ニューロン細胞」と同じ意味で使わてよい。

「膠細胞」は、脳に存在する細胞のうち最も多い部分を占める細胞であり、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）又は小膠（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）細胞を含む。

前記星状細胞は、神経細胞の保護及び栄養供給、炎症に関与し、前記小膠細胞は、脳で炎症を担当する細胞であって、アルツハイマー病のような脳疾患において重要な役割を担う細胞群として知られている。

「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」は、バクテリオファージを媒介にして遺伝形質が一つの細胞から他の細胞に移って遺伝形質が導入される現象である。バクテリオファージがいずれかのタイプの細菌に感染されるとファージＤＮＡが宿主ＤＮＡと結合する。溶菌現象によってファージが出る時、自分のＤＮＡを一部失う代わりに宿主ＤＮＡの一部を持ち出す場合がある。このようなファージが他の細菌に感染されると、前宿主の遺伝子を新しく導入することになり、新しい形質が現れる。生物学的研究において「形質導入」という用語は、一般に、ウイルスベクターを用いて標的細胞において特定の外因性遺伝子を導入して発現させることを意味する。

「蓄積、凝集及びタングル抑制」は、タウタンパク質及び／又はアミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）の生成を抑制して、その蓄積、凝集及びタングルを抑制する場合と、既に生成されたタウタンパク質及び／又はアミロイドベータを分解してタウタンパク質又はアミロイドベータの蓄積、凝集及びタングルを抑制する場合を含む概念である。

「対象」は、治療、観察又は実験の対象である脊椎動物、好ましくは哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギ、ギニアピッグ、ヒトなどであってよい。

「組織又は細胞サンプル」は、対象又は患者の組織から得た類似の細胞の集合体を意味する。組織又は細胞サンプルの供給源は、新鮮な、凍結した及び／又は保存された臓器又は組織サンプル若しくは生検又は吸引物からの固形組織；血液又は任意の血液構成分；対象の妊娠又は発生の任意の時点における細胞であってよい。組織サンプルは、また、１次又は培養細胞又は細胞株であってよい。

「治療」は、有益な或いは好ましい臨床的結果を得るためのアプローチを意味する。本発明の目的のために、有益な或いは好ましい臨床的結果は、非制限的に、症状の緩和、疾病範囲の減少、疾病状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾病進行の遅延又は速度の減少、疾病状態の改善又は一時的緩和及び軽減（部分的に又は全体的に）、検出可能か又は検出されないことを含む。また、「治療」は、治療を受けない時に予想される生存率と比較して生存率を上げることを意味することもできる。「治療」は、治療学的治療及び予防的又は予防措置方法のいずれをも指す。前記治療は、予防される障害の他に既に発生した障害においても要求される治療を含む。疾病を「緩和（Ｐａｌｌｉａｔｉｎｇ）」させることは、治療をしない場合と比較して、疾病状態の範囲及び／又は好ましくない臨床的徴候が減少し及び／又は進行の時間的推移（ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ）が遅延されたり延びることを意味する。

「遺伝子治療剤」は、疾病治療などを目的に遺伝物質又は遺伝物質を移入した運搬体を人体に投与する医薬品を意味する。

「細胞治療剤」は、ヒトから分離、培養及び特殊な操作によって製造された細胞及び組織に治療、診断及び予防の目的で使用される医薬品（米国ＦＤＡ規定に従う）であり、細胞或いは組織の機能を復元させるために、生きている自家、同種、又は異種細胞を体外で増殖、選別したり、他の方法で細胞の生物学的特性を変化させたりするなどの一連の行為によって治療、診断及び予防の目的で使用される医薬品のことを指す。細胞治療剤は、細胞の分化程度によって、概ね、体細胞治療剤、幹細胞治療剤に分類される。

治療を必要とする「哺乳類」は、ヒト、家畜、農場家畜、及びイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、サルのような動物園、スポーツ或いは愛玩用の動物を含め、哺乳類として分類されるいかなる動物も可能である。好ましくは、前記哺乳類はヒトである。

「投与」は、いずれか適切な方法で対象又は患者に本発明の組成物を導入することを意味し、本発明の組成物の投与経路は、目的組織に到達できる限り、経口又は非経口の様々な経路を通じて投与されてよい。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与されてよいが、それに制限されない。

「有効量」は、目的とする治療すべき特定疾患の発病又は進行を遅延させ、又は完全に止めるために必要な量を意味する。本発明において、組成物は、薬学的有効量で投与されてよい。適度な１日使用量は、正確な医学的判断範囲内で処置医によって決定され得るということは、当業者にとって明らかである。

本発明の目的上、特定対象又は患者に対する具体的な治療学的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によって、他の製剤が使用されるか否かをはじめとする具体的な組成物、対象（患者）の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、具体的な組成物と同時投与または同時に使用される薬物、ならびに、医薬分野によく知られた類似の要因を含む様々な要因によって異なるように適用することが好ましい。

本発明で使われる技術用語はいずれも、特に断りのない限り、本発明の関連分野における通常の当業者が一般的に理解するのと同じ意味で使われる。また、本明細書には好ましい方法や試料が記載されるが、これと類似又は同等なものも本発明の範疇に含まれる。本明細書に参考文献として記載される全ての刊行物の内容は、本発明に組み込まれる。

実施例１．Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子導入を用いたタウオパチー（ｔａｕｏｐａｔｈｙ）治療効果及び認知欠損症（学習及び記憶力）改善確認

材料及び方法
（１）動物管理及び実験
３ｘＦＡＤ動物モデル実験に関する全ての手続は、承認番号２０１８－００４７Ａ下にハンヤング医学専門大学院動物実験倫理議員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，ＩＡＣＵＣ）の承認を受けた。また、３ｘＦＡＤ動物モデル実験に関する全ての手続は、ハンヤング大学校実験動物使用に関するガイドラインに従ってなされた。動物を１２時間 、明／暗サイクルを用いた特定の無菌障壁施設に収容し、標準食物（５０５３ ＰｉｃｏＬａｂ^Ｒ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ ２０）を提供した。本実験のための動物の大きさは、本実験の生体外分析及び予備試験によって、事前統計的演算無しで決定された。実験は、ＮＩＨガイドラインに従って実施された。偏向を最小化するために、挙動的分析は、概ね、２名の実験者によって盲検方式で行われた。１８月齢及び１５月齢アルツハイマー病遺伝子導入（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）（３ｘＴｇ－ＡＤ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍａｉｎｅ，ＵＳＡ）が実験に使用された。

（２）アルツハイマー病モデルマウスに対する定位方法のＡＡＶ注射
１８月齢（１８ｍ）及び１５月齢（１５ｍ）アルツハイマー病遺伝子導入（３ｘＴｇ－ＡＤ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍａｉｎｅ，ＵＳＡ）に、Ｎｕｒｒ１－ＡＡＶ９（１μｌ）＋Ｆｏｘａ２－ＡＡＶ９（１μｌ）（合計２μｌ、１０^１２ｖｇ／μｌ、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２群）又はＮｕｒｒ１－ＡＡＶ９（１μｌ）＋対照ＡＡＶ９（１μｌ）（合計２μｌ、５×１０^１１ｖｇ／μｌ、Ｎｕｒｒ１単独群）、又はＡＡＶ９のみを有する対照群（２μｌ、１０^１２ｖｇ／μｌ、対照群のみで構成）を含むウイルスベクターを、Ｒｏｍｐｕｍ（９３．２８μｇ／ｋｇ）と混合されたＺｏｌｅｔｉｌ ５０（０．１ｍｇ／ｋｇ）によって誘導された麻酔状態で、１０分にわたって、海馬（Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）（ブレグマから後方に１．５ｍｍ；ミッドラインから側面に±１ｍｍ；硬膜から腹側へ２ｍｍ（－２ ｍｍ ｖｅｎｔｒａｌ ｔｏ ｔｈｅ ｄｕｒａ））及び脳室（Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｌｅ，ＩＣＶ）（ブレグマから後方に０．９ｍｍ；ミッドラインから側面に±１．７ｍｍ；硬膜から腹側へ２．２ｍｍ（－２．２ ｍｍ ｖｅｎｔｒａｌ ｔｏ ｔｈｅ ｄｕｒａ））に注射した。毎注射完了の後に、針（２６ゲージ）は、前記注射部位に刺された状態で５～１０分間置いた後、ゆっくり除去した。海馬（Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）及び脳室（Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｌｅ，ＩＣＶ）部位における注射に誤りがあったと判明される場合、それらのマウスは分析から除外した。

（３）ウイルス生成
ＣＭＶプロモーターの統制下に、Ｎｕｒｒ１又はＦｏｘａ２を発現させるレンチウイルスベクターを、それぞれのｃＤＮＡをｐＣＤＨ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）の多重クローニング部位に挿入することによって生成した。ｐＧＩＰＺ－ｓｈＮｕｒｒ１とｐＧＩＰＺ－ｓｈＦｏｘａ２レンチウイルスベクターをＯｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から購入した。空（ｅｍｐｔｙ）のバックボーンベクター（ｐＣＤＨ又はｐＧＩＰＺ）が陰性対照群として用いられた。レンチウイルスを、前述のように、生体外培養における形質導入のために製造して使用した（Ｙｉ ＳＨ，Ｈｅ ＸＢ，Ｒｈｅｅ ＹＨ，Ｐａｒｋ ＣＨ，Ｔａｋｉｚａｗａ Ｔ，Ｎａｋａｓｈｉｍａ Ｋ，Ｌｅｅ ＳＨ（２０１４）Ｆｏｘａ２ ａｃｔｓ ａｓ ａ ｃｏ－ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｒｒ１－ｉｎｄｕｃｅｄ ＤＡ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｖｉａ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４１：７６１－７７２）。レンチウイルスの力価は、ＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ（登録商標） ＨＩＶレンチウイルス定量キット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて測定され、１０^６個の形質導入ユニット（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｕｎｉｔ，ＴＵ）／ｍｌ（６０～７０ｎｇ／ｍｌ）を含む２００μｌ／ウェル（２４ウェルプレート）又は２ｍｌ／６ｃｍ皿がそれぞれの形質導入反応に使用された。

定位方法（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ）による注射によって生体内発現を誘導するために、ＣＭＶプロモーターの統制下に、Ｎｕｒｒ１又はＦｏｘａ２（赤血球凝集素（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ＨＡ）でタグ付け）を発現するＡＡＶを、それぞれのｃＤＮＡをｐＡＡＶ－ＭＣＳベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）にサブクローニングすることによって生成した。導入遺伝子の発現の効率を評価するために、ＧＦＰを発現するＡＡＶも生成した。ＡＡＶ（血清型９又は２）のパッケージング及び生成は、韓国科学技術研究院（大韓民国ソウル）で行った。ＡＡＶ力価は、ＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ（登録商標） ＡＡＶ定量キット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社）で測定された。共発現研究は、個別ウイルス製剤の混合物（１：１，ｖ.ｖ））で細胞を感染させて行った。

（４）免疫染色
培養細胞及び凍結切片化された脳切片を、次のような一次抗体で染色した：Ｎｕｒｒ１（１：５００、ウサギ、胚２０日目、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ、及び１：１，０００、マウス、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）；Ｆｏｘａ２（１：５００、ヤギ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）；ＧＦＰ（１：２，０００、ウサギ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）；ＧＦＡＰ（１：２００、マウス、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社、Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）；Ｉｂａ－１（１：２００、ウサギ、Ｗａｋｏ社）、ＮｅｕＮ（１：１００、マウス、ＥＭＤ Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社）；ＴＡＵ（１：５００、マウス、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）；ｐＴＡＵ（１：５００、ウサギ、ＡＢｃａｍ社）

培養された細胞は、ＰＢＳ溶液の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）によって固定され、０．３％トリプトンＸ－１００及び１％ ＢＳＡによって４０分間ブロックされた。そして、４゜Ｃで一晩、一次抗体と共に培養された。視覚化のための２次抗体は、次の通りである。Ｃｙ３（１：２００，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（１：２００，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）。染色された細胞は、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤとＤＡＰＩマウント液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）と共にマウントされ、写真は、落射蛍光顕微鏡（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，Ｌｅｉｃａ社）及び共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＰＣＳ ＳＰ５）によって得られた。

（５）挙動検査
（５）－１．水迷路（Ｗａｔｅｒ Ｍａｚｅ）法
水迷路法は、モーリスウォーター迷路とも呼ばれ、空間記憶と学習を研究する上で広く用いられている。動物は、粉状の無脂肪牛乳や無毒性ペイントで不透明に染めた水溜まりに置かれるが、そこから彼らは、隠された脱出プラットホームまで泳いで行かなければならない。動物は不透明な水中にいるため、プラットホームを見ることができず、匂いを頼りに脱出路を探すこともできない。代わりに、動物は外部或いは迷路外の手がかりを頼りにしなければならない。動物がそのことに熟練するにつれ、彼らはそのプラットホームをより速く探すことができる。１９８４年にリチャードＧ．モーリスによって開発されたこのパラダイムは、行動神経科学の「ゴールドスタンダード」の一つとなった。

（５）－２．Ｙ迷路（Ｙ－Ｍａｚｅ）法
Ｙ迷路（Ｙ－Ｍａｚｅ）法は、空間学習と記憶を研究するための事前臨床研究において行動を評価するために広く用いられている。動物は、Ｙ迷路法において、Ｙ状の迷路で３個の腕（ａｒｍ）のいずれか一方の腕の端に置かれるが、ここで、彼らは、別れ道から左側又は右側のどこへ移動するかを決定する。このようなテストは同一動物に数回反復されてよい。観察者は、Ｙ迷路内で動物の一連の選択（例えば、特定腕を訪問した回数、３個の腕を訪問した総回数、動物基準で左側の腕を選択した回数、動物基準で右側の腕を選択した回数）を記録する。Ｙ迷路テストの使用は、自発的交替テスト（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ）と認識記憶力テストを含む。自発的交替テストにおいて、観察者は、動物が最近に訪問しなかった腕に訪問する傾向を示すかを観察して記録する（例えば、自発的交替数字を測定）。これらの検査は、海馬損傷、遺伝子操作、そして記憶喪失薬物に敏感であることが明らかにされた。

（６）細胞数集計及び統計分析
免疫染色及びＤＡＰＩ－染色された細胞は、２００倍又は４００倍の倍率で接眼グリッド（ｅｙｅｐｉｅｃｅ ｇｒｉｄ）を用いて、各培養カバースリップ内の無作為領域でカウントされた。全ての図に対してデータは平均±ＳＥＭで表示され、統計的検定は適切に立証される。統計学的比較は、スチューデントt検定（対応なし；ｕｎｐａｉｒｅｄ）、又は、両側検定（２－ｔａｉｌｅｄ）又は一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）、次いでＳＰＳＳ（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ２１；ＩＢＭ Ｉｎｃ．Ｂｅｎｔｏｎｖｉｌｌｅ，ＡＲ，ＵＳＡ）を用いたＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ ｐｏｓｔ ｈｏｃ分析で行われた。ｎ、ｐ－値及び統計分析方法は、図面凡例に表示されている。０．０５未満のＰ値は有意なものと見なされた。

結果
（１）Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子導入がタウオパチー（ｔａｕｏｐａｔｈｙ）に及ぼす影響
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はヒトで免疫原性が非常に低いため、主に脳において神経細胞及び膠細胞に感染しやすいＡＡＶ９血清型を用いて膠細胞に特異的にターゲッティングするＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子導入システムを構築した。Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子発現のためにＣＭＶ又はＧＦＡＰプロモーターが使用された。Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２－ＡＡＶ９ウイルスの注入は、タウオパチーの一種であるアルツハイマー病の病変部位である海馬（Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）と脳室（Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｌｅ，ＩＣＶ）に行われた。

前記ＡＡＶ９ウイルスを用いた遺伝子導入テストを行うために、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）に特異的なＧＦＡＰプロモーター下でＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現させるＡＡＶ９ウイルスをマウスの海馬と脳室（ＩＣＶ）に注入した。ＧＦＰ－ＡＡＶ９ウイルス注入３週後にＧＦＰ発現を測定した（図１）。ＧＦＰ－ＡＡＶ９を海馬と脳室に注入した結果、ＧＦＰが海馬の全領域に発現し、ＧＦＡＰ＋星状細胞に特異的に発現した（図２）。ＧＦＡＰは星状細胞マーカー、ＮｅｕＮは成熟神経細胞（ｍａｔｕｒｅ ｎｅｕｒｏｎ）マーカー、Ｉｂａ１は小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）マーカーとして使用された。ＧＦＡＰとＧＦＰは共発現し、ＮｅｕＮとＩｂａ１はＧＦＰと共発現しないことから、ウイルスが星状細胞において特異的に遺伝子を発現することがわかった。

タウタンパク質は、正常な神経細胞のアクソン（ａｘｏｎ）に存在する微小管結合タンパク質（ＭＡＰ）の一つである。脳でタウタンパク質の凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）が発生すると、タウ媒介の神経細胞の損傷及び機能異常（Ｔａｕ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）が発生するが、これは、アルツハイマー病の代表的な病因及び症状として教科書及び諸文献に記述されている。

ヒト患者と類似に、脳内にタウタンパク質が凝集されるアルツハイマー病疾患動物モデル３ｘＦＡＤマウスにおいて、１５月齢および１８月齢に、海馬及び脳室に存在する膠細胞に特異的にＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子を導入した。遺伝子導入２ヶ月後に、海馬領域の、タウタンパク質を免疫染色により定量的に分析した。

図３Ａは、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２－ＡＡＶ９が注入された３ｘＦＡＤマウスはＣｏｎｔｒｏｌ－ＡＡＶ９が注入された３ｘＦＡＤマウスと比較して、海馬領域に存在するタウ特異的（ｔａｕ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）タングル（ｔａｎｇｌｅｓ）が顕著に減っていることを示す。図３Ｂは、Ｔａｕ＋タングルの定量データを示す。

タウタンパク質は、正常状態でも存在するタンパク質であるが、異常タウタンパク質は神経退行性疾患の原因として知られており、タウタンパク質の過度なリン酸化は、異常タウの特徴である。

１５月齢、１８月齢の３ｘＦＡＤマウスの海馬及び脳室に存在する膠細胞に特異的にＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子を導入した。遺伝子導入２ヶ月後に、海馬領域の、リン酸化されたタウ（ｐｈｏｓｐｈｏｒ－ｔａｕ，ｐＴａｕ）タンパク質を免疫染色により定量的に分析した。

その結果、ＡＡＶ９－ｐＧＦＡＰ－Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２が注入された３ｘＦＡＤマウスは、コントロールＡＡＶ９が注入されたマウスに比べて、免疫組織化学的検査（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＩＨＣ）下のリン酸化された（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ）タウレベルが減少した（図４）。

前記結果は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２の発現により、タウタングルが生成される絶対量を低減させ、リン酸化されたタウタンパク質の量を減少させることができ、結果的に、タウオパチーの治療に、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２の発現が効果を奏することを示す。

（２）水迷路とＹ迷路行動実験を用いたアルツハイマー病（ＡＤ）マウスモデルにおいてＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子導入による認知欠損症（学習と記憶力）改善確認
タウオパチーの一種であるアルツハイマー病の治療に、膠細胞のＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２発現が与える効果を検討した。３種の遺伝子であるＡＰＰ、ＰＳ１、及びｔａｕを変異させてアルツハイマー病を誘発した１５～１８月齢の３ｘＦＡＤマウスの海馬及び脳室の膠細胞に特異的にＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２発現を起こした。１５～１８月齢は、マウスの平均寿命が約２４ヶ月であることからして、かなり高齢である。アルツハイマー病モデルマウスにＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子を導入し、遺伝子導入３ヶ月後に、当該マウスの認知能力分析を行った。

タウオパチーの一種であるアルツハイマー病は、患者の記憶力及び認知力の低下が徐々に進む退行性脳神経系疾患であり、これを代弁するための動物実験として水迷路とＹ迷路実験を行った。水迷路とＹ迷路実験は、記憶力及び認知力に対する効能実験の代表的な公認実験方法であり、タウオパチーの一種であるアルツハイマー病の進行及び治療効果を判断するための行動実験指標として用いられる。

１５～１８月齢のマウスにＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２－ＡＡＶ９ウイルスを注入して約２週後から２週間隔で２ヶ月間、水迷路とＹ迷路行動実験を行い、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２－ＡＡＶ９ウイルスを注入したマウスの行動指標とコントロールウイルス（ＧＦＰ－ＡＡＶ９）を注入したモデルマウスの行動指標とを比較した。実験の結果、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２が発現したマウスは、コントロールマウスに比べてより良い行動指標及びより速い反応速度を示した。このことから、膠細胞のＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２の発現が学習及び記憶部分の認知活動の有意な改善をもたらし、これにより、タウオパチーの一種であるアルツハイマー病治療効果を奏することを、動物モデルから行動学的に確認した。すなわち、脳細胞におけるＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２の発現を用いたタウオパチーの一種であるアルツハイマー病の臨床遺伝子治療効果を確認した（図５、図６、図７、図８および図９）。

実施例２：Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子導入を用いたｐ－ｔａｕタンパク質（リン酸化されたタウタンパク質）形成抑制確認
Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子導入により、リン酸化されたタウタンパク質の形成を抑制できるかどうか、をさらに確認した。

ＡＰＰ、ＰＳ１、ｔａｕに変異を誘導した１８月齢及び１５月齢のアルツハイマー病遺伝子導入（３ｘＴｇ－ＡＤ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍａｉｎｅ，ＵＳＡ）において、Ｎｕｒｒ１－ＡＡＶ９（１μｌ）＋Ｆｏｘａ２－ＡＡＶ９（１μｌ）（合計２μｌ、１０^１２ｖｇ／μｌ、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２群）、Ｎｕｒｒ１－ＡＡＶ９（１μｌ）単独、又は食塩水（ＰＢＳ）を、定位微細注入方法により、麻酔されたマウスの脳室及び海馬に投与した。投与２ヶ月後に、アルツハイマー病遺伝子導入マウスを犠牲させ、パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した後、１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液に０．６％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を追加して１時間ブロッキングした。その後、同溶液に１次抗体（ｐ－ｔａｕ、Ｔｕｊ１）を付け、４℃で一晩（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）組織染色を行った。そして、視覚化のための２次抗体としてＣｙ３（１：２００，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（１：２００，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて２次染色した。染色された細胞をＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ、ＤＡＰＩマウント液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）と共にマウントし、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＰＣＳ ＳＰ５）で内嗅内皮質領域（ｅｎｔｏｒｈｉｎａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｒｅｇｉｏｎ）を撮影し、撮影された写真を図１０に示し、これを定量化した結果を、図１１及び表１に示した。

実験の結果、図１０及び図１１から確認できるように、３ｘＦＡＤ Ｔｇマウスの脳ニューロンで発現するリン酸化されたタウタンパク質レベルが、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を導入発現させた時に顕著に減少し、Ｎｕｒｒ１単独導入発現した時も有意に減少する現象を確認した。

前記実験結果は、アルツハイマー病モデルマウスである３ｘＦＡＤ Ｔｇマウスに、転写因子Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を共に、又はＮｕｒｒ１単独で発現させた時に、対照群に比べて、ニューロンにおいてリン酸化されたタウタンパク質が減少することを示す。また、リン酸化されたタウタンパク質は、アルツハイマー病の主要特徴である神経原線維タングルを構成する物質で、ニューロンに蓄積されてニューロンの細胞死（ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）を引き起こし、結局は記憶力減退につながるようにする点を考慮すれば、本発明に係るＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２共同で、又はＮｕｒｒ１単独で導入することは、タウオパチー及びアルツハイマー病の治療に利用可能であることが期待される。

Claims (10)

1. Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が搭載されたベクターを含む、タウタンパク質のリン酸化により引き起こされるタウオパチーの予防又は治療用医薬組成物。
2. 前記ベクターが、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターである、請求項１に記載の医薬組成物。
3. Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、タウタンパク質のリン酸化により引き起こされるタウオパチーの予防又は治療用医薬組成物。
4. 前記膠細胞（ｇｌｉａ）が、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）又は小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）である、請求項３に記載の医薬組成物。
5. 前記タウオパチーが、タウ陽性アルツハイマー病（Ｔａｕ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、レビー小体型認知症（Ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ Ｂｏｄｉｅｓ）、前頭側頭型認知症（Ｆｒｏｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ，ＦＴＤ）、多発梗塞性認知症（Ｍｕｌｔｉ－Ｉｎｆａｒｃｔ Ｄｅｍｅｎｔｉａ，ＭＩＤ）、前頭側頭葉変性症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｌｏｂａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ＦＴＬＤ）、進行性核上麻痺（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｃｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ ｐａｌｓｙ，ＰＳＰ）、ピック病（Ｐｉｃｋ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、慢性外傷性脳症（Ｃｈｒｏｎｉｃ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ，ＣＴＥ）、大脳皮質基底核変性症（Ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ＣＢＤ）、球状神経膠タウオパチー（Ｇｌｏｂｕｌａｒ ｇｌｉａｌ ｔａｕｏｐａｔｈｙ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、神経節細胞膠腫（ｇａｎｇｌｉｏｇｌｉｏｍａ）、神経節細胞腫（ｇａｎｇｌｉｏｃｙｔｏｍａ）、原発性加齢性タウオパチー（ｐｒｉｍａｒｙ ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｔａｕｏｐａｔｈｙ：ＰＡＲＴ）、嗜銀顆粒病（ａｒｇｙｒｏｐｈｉｌｉｃ ｇｒａｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、鉛毒性脳症（ｌｅａｄ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、リポフスチン沈着症（ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｉｓ）、リティコ－ボディグ病（Ｌｙｔｉｃｏ－Ｂｏｄｉｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、髓膜血管腫症（ｍｅｎｉｎｇｉｏａｎｇｉｏｍａｔｏｓｉｓ）からなる群から選ばれる疾患である、請求項１～４のいずれかに記載の医薬組成物。
6. Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が搭載されたベクターを含む、タウタンパク質の蓄積、凝集又はタングルにより引き起こされるタウオパチーの予防又は治療用医薬組成物。
7. 前記ベクターが、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターである、請求項６に記載の医薬組成物。
8. Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、タウタンパク質の蓄積、凝集又はタングルにより引き起こされるタウオパチーの予防又は治療用医薬組成物。
9. 前記膠細胞（ｇｌｉａ）が、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）又は小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）である、請求項８に記載の医薬組成物。
10. 前記タウオパチーが、タウ陽性アルツハイマー病（Ｔａｕ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、レビー小体型認知症（Ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ Ｂｏｄｉｅｓ）、前頭側頭型認知症（Ｆｒｏｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ，ＦＴＤ）、多発梗塞性認知症（Ｍｕｌｔｉ－Ｉｎｆａｒｃｔ Ｄｅｍｅｎｔｉａ，ＭＩＤ）、前頭側頭葉変性症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｌｏｂａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ＦＴＬＤ）、進行性核上麻痺（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｃｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ ｐａｌｓｙ，ＰＳＰ）、ピック病（Ｐｉｃｋ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、慢性外傷性脳症（Ｃｈｒｏｎｉｃ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ，ＣＴＥ）、大脳皮質基底核変性症（Ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ＣＢＤ）、球状神経膠タウオパチー（Ｇｌｏｂｕｌａｒ ｇｌｉａｌ ｔａｕｏｐａｔｈｙ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、神経節細胞膠腫（ｇａｎｇｌｉｏｇｌｉｏｍａ）、神経節細胞腫（ｇａｎｇｌｉｏｃｙｔｏｍａ）、原発性加齢性タウオパチー（ｐｒｉｍａｒｙ ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｔａｕｏｐａｔｈｙ：ＰＡＲＴ）、嗜銀顆粒病（ａｒｇｙｒｏｐｈｉｌｉｃ ｇｒａｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、鉛毒性脳症（ｌｅａｄ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、リポフスチン沈着症（ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｉｓ）、リティコ－ボディグ病（Ｌｙｔｉｃｏ－Ｂｏｄｉｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、髓膜血管腫症（ｍｅｎｉｎｇｉｏａｎｇｉｏｍａｔｏｓｉｓ）からなる群から選ばれる疾患である、請求項６～９のいずれかに記載の医薬組成物。