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JP7235391B2 - 人工的に操作された免疫細胞 - Google Patents

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Description

本発明は、免疫調節遺伝子の人工的操作または改変に関する。より具体的には、本発明は、免疫調節遺伝子を人工的に操作するために使用される、遺伝子操作用組成物、および、人工的に操作された免疫調節遺伝子を含む免疫細胞に関する。
細胞治療剤は、再生を誘導する医薬品であり、生細胞を使用して、損傷または病変した細胞／組織／実体を回復する。これらは、自己細胞、同種異系細胞、または、異種細胞の物理的、化学的または生物学的操作（例えば、ｅｘ ｖｉｖｏ培養、増殖、選択または同様のものなど）によって生成される医薬品である。
それらのうち、免疫調節細胞治療剤は、免疫細胞（例えば、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞など）を使用して身体の免疫応答を調節することによって、疾患を治療する目的で使用される医薬品である。
現在、免疫調節細胞治療剤は主に、適応として癌治療を標的に開発されている。癌治療に従来使用されてきた外科療法、抗癌剤および放射線療法とは異なり、免疫調節細胞治療剤は、免疫細胞を患者に直接投与することを通して免疫機能を活性化することによって治療効果を獲得するという治療機構および治療有効性を有し、将来の新しい生物製剤の大部分を占めると予想される。
細胞に導入される抗原の物理的および化学的特性は、免疫調節細胞治療剤の種類に応じて互いに異なる。外来遺伝子がウイルスベクターなどの形態で免疫細胞に導入されるとき、これらの細胞は細胞治療剤および遺伝子治療剤の両方の特性を有することが可能になるであろう。
免疫調節細胞治療剤の投与は、様々な抗体およびサイトカインで様々な免疫細胞（例えば、アフェレシスで患者から単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、Ｔ細胞、ＮＫ細胞など）を活性化し、次いで、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させ、患者に再度注射する、または、遺伝子（例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）もしくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ））が導入された免疫細胞を患者に再度注射することによって実行され得る。
ｅｘ ｖｉｖｏで生成される自己抗原特異的免疫細胞（例えばＴ細胞）の送達を伴う養子免疫療法は、様々な免疫疾患および癌を治療するための有望な手段になり得る。
近年、免疫細胞治療剤が、例えば自己免疫阻害剤としてなど様々に使用できること、および、抗癌機能を発揮することが報告された。このため、免疫細胞治療剤は、免疫応答を調整することによって様々な適応において使用できる。したがって、養子免疫療法に使用される、操作された免疫細胞の治療有効性の改善および発展に対する大きい需要がある。
［開示］ ［技術的問題］
例示的な実施形態として、本発明は、免疫細胞を人工的に操作するために使用される、免疫細胞操作用組成物を提供する。
例示的な実施形態として、本発明は、少なくとも１つの人工的に改変された免疫調節遺伝子、および、少なくとも１つの人工受容体を含む、操作された免疫細胞を提供する。
例示的な実施形態として、本発明は、少なくとも１つの人工的に改変された免疫調節遺伝子、および、少なくとも１つの人工受容体を含む人工免疫細胞を産生するための方法を提供する。
例示的な実施形態として、本発明は、活性成分として、少なくとも１つの人工的に改変された免疫調節遺伝子、および、少なくとも１つの人工受容体を含む人工免疫細胞を含む、免疫疾患治療方法を提供する。 ［技術的解決法］
これらの問題を解決するべく、本発明は、免疫細胞操作用組成物に関する。より具体的には、本発明は、免疫細胞を人工的に操作するために使用される、免疫細胞操作用組成物、および、当該組成物を使用して生成された、人工的に改変された免疫調節遺伝子および人工受容体を含む操作された免疫細胞、ならびに、それらの使用に関する。
本発明は、特定の目的のために、免疫細胞操作用組成物を提供する。
「免疫細胞操作用組成物」という用語は、免疫細胞を人工的に操作または改変するために使用される、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸、タンパク質、ウイルス、化学化合物などから選択される１または複数の物質を指す。
特定の実施形態において、免疫細胞操作用組成物は、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、Ｄｇｋα遺伝子、Ｄｇｋζ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子、および、ＫＤＭ６Ａ遺伝子から成る群から選択される、少なくとも１つの免疫調節遺伝子の核酸配列における標的配列との相補結合を形成可能なガイド核酸、ならびに、野性型受容体でない、人工的に調製される人工受容体を含み得る。
「免疫調節遺伝子」という用語は、免疫機能または免疫応答の形成および性能の直接的な原因となる、または、それらに間接的に影響する任意の遺伝子を含むことを意図する。本発明において、免疫調節遺伝子は、免疫細胞だけでなく、食細胞などの免疫細胞と相互作用できる細胞の機能的調節の直接的な原因となる、または、それらに間接的に影響する任意の遺伝子を含む。ここで、免疫調節遺伝子は、免疫調節遺伝子自体、または、免疫調節遺伝子から発現されたタンパク質の形態で、免疫機能または免疫応答の形成および性能に関する機能を実行し得る。
「人工受容体」という用語は、野性型受容体ではなく人工的に調製された、抗原を認識し特定の機能を実行する特定の能力を有する機能実体を指す。
免疫細胞操作用組成物は選択的に、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、および、Ｃｐｆ１タンパク質から成る群から選択される少なくとも１つのエディタータンパク質を更に含み得る。
標的配列は、免疫調節遺伝子のプロモーター領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
標的配列は、免疫調節遺伝子のイントロン領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
標的配列は、免疫調節遺伝子のエクソン領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
標的配列は、免疫調節遺伝子のエンハンサー領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
標的配列は、免疫調節遺伝子の３'‐ＵＴＲ（非翻訳領域）または５'‐ＵＴＲに位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
標的配列は、免疫調節遺伝子の核酸配列における、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
ここで、ＰＡＭ配列は、以下の配列から選択される少なくとも１つであり得る。
５'‐ＮＧＧ‐３'（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）
５'‐ＮＮＮＮＲＹＡＣ‐３'（Ｎの各々は独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴ）
５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｎの各々は独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＷはＡまたはＴ）
５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'（Ｎの各々は独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）
５'‐ＮＮＧＲＲ（Ｔ）‐３'（Ｎの各々は独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ）
５'‐ＴＴＮ‐３'（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）
特定の実施形態において、標的配列は、配列識別番号１～２８９から選択される１または複数であり得る。
ガイド核酸は、免疫調節遺伝子における標的配列との相補結合を形成可能なガイドドメインを含み得て、相補結合は０～５個のミスマッチを含み得る。
ここで、ガイドドメインは、免疫調節遺伝子における標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得て、相補的ヌクレオチド配列は、０～５個のミスマッチを含み得る。
ガイド核酸は、第１相補ドメイン、リンカドメイン、第２相補ドメイン、近位ドメインおよび尾部ドメインから成る群から選択される少なくとも１つのドメインを含み得る。
人工受容体は、少なくとも１つの抗原の結合特異性を有し得る。
ここで、少なくとも１つの抗原は、癌細胞または／およびウイルスによって特異的に発現される抗原であり得る。
ここで、少なくとも１つの抗原は、腫瘍関連抗原であり得る。
ここで、少なくとも１つの抗原は、Ａ３３、ＡＬＫ、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、アドレナリン受容体β３（ＡＤＲＢ３）、葉酸受容体α、ＡＤ０３４、ＡＫＴ１、ＢＣＭＡ、ベータ‐ヒト絨毛性ゴナドトロピン、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）、ＢＳＴ２、ＢＲＡＰ、ＣＤ５、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５２、ＣＤ７２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８９、ＣＤ９７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１６０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＡ‐１２５、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＣＲ４、Ｃ型レクチン様分子（ＣＬＬ‐１またはＣＬＥＣＬ１）、ｃｌａｕｄｉｎ６（ＣＬＤＮ６）、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＡＧＥ、ＣＤＸ２、ＣＬＰ、ＣＴ‐７、ＣＴ８／ＨＯＭ‐ＴＥＳ‐８５、ｃＴＡＧＥ‐１、ＥＲＢＢ２、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、Ｅ７４様因子２変異（ＥＬＦ２Ｍ）、Ａ型エフリン受容体２（ＥｐｈＡ２）、ＥＭＲ２、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、ＦＣＲＬ５、ファイブリン１、Ｇ２５０、ＧＤ２、糖タンパク質３６（ｇｐ３６）、糖タンパク質１００（ＧＰ１００）、糖質コルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＧｌｏｂｏＨ、Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）、ＧＰＣ３、ｈｓｐ７０‐２、ヒト高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）、Ａ型肝炎ウイルス細胞表面受容体１（ＨＡＶＣＲ１）、ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）、ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）、ＨＡＧＥ、ＨＣＡ５８７／ＭＡＧＥ‐Ｃ２、ｈＣＡＰ‐Ｇ、ＨＣＥ６６１、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＬＡ‐Ｃｗ、ＨＯＭ‐ＨＤ‐２１／Ｇａｌｅｃｔｉｎ９、ＨＯＭ‐ＭＥＥＬ‐４０／ＳＳＸ２、ＨＯＭ‐ＲＣＣ‐３．１．３／ＣＡＸＩＩ、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＢ６、Ｈｕ、ＨＵＢ１、インスリン成長因子（ＩＧＦ１）‐Ｉ、ＩＧＦ‐ＩＩ、ＩＧＦＩ受容体、インターロイキン１３受容体サブユニットアルファ２（ＩＬ‐１３Ｒａ２またはＣＤ２１３Ａ２）、インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ‐１１Ｒａ）、ＩＧＬＬ１、ＫＩＴ（ＣＤ１１７）、ＫＭ‐ＨＮ‐３、ＫＭ‐ＫＮ‐１、ＫＯＣ１、ＫＯＣ２、ＫＯＣ３、ＫＯＣ３、ＬＡＧＡ‐１ａ、ＬＡＧＥ‐１、ＬＡＩＲ１、ＬＩＬＲＡ２、ＬＹ７５、Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗原、ＭＵＣ１、ＭＮ‐ＣＡ ＩＸ、Ｍ‐ＣＳＦ、ＭＡＧＥ‐１、ＭＡＧＥ‐４ａ、メソテリン、ＭＡＧＥ‐Ａ１、ＭＡＤ‐ＣＴ‐１、ＭＡＤ‐ＣＴ‐２、ＭＡＲＴ１、ＭＰＰｌ１、ＭＳＬＮ、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、ＮＹ‐ＥＳＯ‐１、ＮＹ‐ＥＳＯ‐５、Ｎｋｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＹ‐ＢＲ‐１、ＮＹ‐ＢＲ‐６２、ＮＹ‐ＢＲ‐８５、ＮＹ‐ＣＯ‐３７、ＮＹ‐ＣＯ‐３８、ＮＮＰ‐１、ＮＹ‐ＬＵ‐１２、ＮＹ‐ＲＥＮ‐１０、ＮＹ‐ＲＥＮ‐１９／ＬＫＢ／ＳＴＫ１１、ＮＹ‐ＲＥＮ‐２１、ＮＹ‐ＲＥＮ‐２６／ＢＣＲ、ＮＹ‐ＲＥＮ‐３／ＮＹ‐ＣＯ‐３８、ＮＹ‐ＲＥＮ‐３３／ＳＮＣ６、ＮＹ‐ＲＥＮ‐４３、ＮＹ‐ＲＥＮ‐６５、ＮＹ‐ＲＥＮ‐９、ＮＹ‐ＳＡＲ‐３５、ｏ‐アセチル‐ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）、ＯＧＦｒ、ＰＳＭＡ、前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）、ｐ５３、前立腺癌腫瘍抗原１（ＰＣＴＡ‐１）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、セリンプロテアーゼ２１（ｔｅｓｔｉｓｉｎまたはＰＲＳＳ２１）、血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲベータ）、ＰＬＡＣ１、パネキシン３（ＰＡＮＸ３）、ＰＬＵ‐１、ＲＯＲ‐１、ＲＡＧＥ‐１、ＲＵ１、ＲＵ２、Ｒａｂ３８、ＲＢＰＪカッパ、ＲＨＡＭＭ、ステージ特異的胎児抗原‐４（ＳＳＥＡ‐４）、ＳＣＰ１、ＳＳＸ３、ＳＳＸ４、ＳＳＸ５、Ｔｙｒｐ‐１、ＴＡＧ７２、サイログロブリン、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、５Ｔ４、腫瘍関連糖タンパク質（ＴＡＧ７２）、チロシナーゼ、トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）、ＴＥＭ１、ＴＥＭ７Ｒ、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）、Ｔｉｅ２、ＴＲＰ‐２、ＴＯＰ２Ａ、ＴＯＰ２Ｂ、ウロプラキン２（ＵＰＫ２）、ビメンチン、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質１（ＷＴ１）、および、ルイス（Ｙ）抗原から成る群から選択される１または複数であり得る。
人工受容体はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得る。
人工受容体は、人工的に操作または改変されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であり得る。
ガイド核酸、人工受容体およびエディタータンパク質は、それらの各々をコードする核酸配列の形態であり得る。
核酸配列は、プラスミドまたはウイルスベクターに含まれ得る。
ここで、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルスまたは単純ヘルペスウイルスから成る群から選択される１または複数であり得る。
人工受容体およびエディタータンパク質は、それらの各々をコードするｍＲＮＡの形態であり得る。
人工受容体およびエディタータンパク質は、ポリペプチドまたはタンパク質の形態であり得る。
免疫細胞操作用組成物が選択的に、エディタータンパク質を更に含むとき、組成物は、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体の形態であり得る。
本発明は、特定の目的のために操作された免疫細胞を提供する。
「操作された免疫細胞」とは、野性型でなく、人工的に操作された免疫細胞を指す。
特定の実施形態において、操作された免疫細胞は、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子、ＫＤＭ６Ａ遺伝子から成る群から選択される、少なくとも１つの人工的に設計された免疫調節遺伝子、および／または、人工的に設計された免疫調節遺伝子から発現される産物、ならびに、少なくとも１つの人工受容体タンパク質、および／または、人工受容体タンパク質をコードする核酸を備え得る。
少なくとも１つの人工的に設計された免疫調節遺伝子は、免疫調節遺伝子のヌクレオチド配列における人工的改変を含み得る。
少なくとも１つの人工的に設計された免疫調節遺伝子は、免疫調節遺伝子における標的配列における、または、標的配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチド配列領域における少なくとも１つのヌクレオチドの欠失および／または挿入を含み得る。
少なくとも１つの人工的に設計された免疫調節遺伝子は、免疫調節遺伝子の核酸配列におけるＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチド配列領域における少なくとも１つのヌクレオチドの欠失および／または挿入を含み得る。
ここで、少なくともヌクレオチドの欠失は、連続の１ｂｐ～５０ｂｐ、もしくは、不連続の１ｂｐ～５０ｂｐの欠失である、または、連続形態および不連続形態が混在する、１ｂｐ～５０ｂｐの欠失であり得る。
ここで、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失は、連続する２ｂｐ～５０ｂｐの欠失であり得る。
ここで、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入は、連続の１ｂｐ～５０ｂｐ、不連続の１ｂｐ～５０ｂｐの挿入である、または、連続形態および不連続形態が混在する、１ｂｐ～５０ｂｐの挿入であり得る。
ここで、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入は、連続の５ｂｐ～１０００ｂｐのヌクレオチド断片の挿入であり得る。
ここで、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入は、特異的な遺伝子のヌクレオチド配列の一部または全体の挿入であり得る。
特異的な遺伝子は、免疫調節遺伝子を含む免疫細胞に含まれない、外部領域から導入された外来遺伝子であり得る。
特異的な遺伝子は、免疫調節遺伝子を含む免疫細胞のゲノムに存在する内在性遺伝子であり得る。
ここで、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失および挿入は、同一のヌクレオチド配列領域において生じ得る。
ここで、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失および挿入は、異なるヌクレオチド配列領域において生じ得る。
人工的に設計された免疫調節遺伝子から発現される少なくとも１つの産物は、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の形態であり得る。
人工的に操作されない野性型免疫細胞によって免疫調節遺伝子から発現される産物の量と比較して、人工的に設計された免疫調節遺伝子から発現される産物の発現の量が減少する、または、阻害され得る。
ここで、人工的に操作されない野性型免疫細胞は、ヒトから分離された免疫細胞であり得る。
ここで、人工的に操作されない野性型免疫細胞は、人工的操作の前の免疫細胞であり得る。
人工受容体タンパク質をコードする核酸は細胞に存在するが、操作された免疫細胞のゲノムに挿入されないことがあり得る。
人工受容体タンパク質をコードする核酸は、操作された免疫細胞のゲノムにおける免疫調節遺伝子の３'‐ＵＴＲ、５'‐ＵＴＲ、イントロン、エクソン、プロモーター、および／または、エンハンサー領域に挿入され得る。
人工受容体タンパク質をコードする核酸は、操作された免疫細胞のゲノムに存在するイントロンから選択される少なくとも１つのイントロンに挿入され得る。
人工受容体タンパク質をコードする核酸は、操作された免疫細胞のゲノムに存在するエクソンから選択される少なくとも１つのエクソンに挿入され得る。
人工受容体タンパク質をコードする核酸は、操作された免疫細胞のゲノムに存在するプロモーターから選択される、少なくとも１つのプロモーターに挿入され得る。
人工受容体タンパク質をコードする核酸は、操作された免疫細胞のゲノムに存在するエンハンサーから選択される少なくとも１つのエンハンサーに挿入され得る。
人工受容体タンパク質をコードする核酸は、操作された免疫細胞のゲノムに存在するイントロン、エクソン、プロモーター、および、エンハンサー以外の１または複数の領域に挿入され得る。
操作された免疫細胞は、樹状細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞およびＣＩＫ細胞から成る群から選択された、人工的に操作免疫細胞であり得る。
本発明は、特定の目的のために操作された免疫細胞を提供し、少なくとも１つの特徴を示す。
特定の実施形態において、少なくとも１つの特徴は、以下から成る群から選択される１または複数であり得る。 サイトカインの産生および／または分泌の増大
細胞増殖
細胞毒性の増大
ここで、サイトカインは、ＩＬ‐２、ＴＮＦα、および、ＩＦＮ‐γから成る群から選択される１または複数であり得る。
操作された免疫細胞に関する説明は、上に記載の通りである。
本発明は、特定の目的のために操作された免疫細胞を産生するための方法を提供する。
特定の実施形態において、操作された免疫細胞を産生するための方法は、（ａ）免疫細胞、（ｂ）人工受容体タンパク質を発現するための人工受容体タンパク質または組成物、（ｃ）ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子およびＫＤＭ６Ａ遺伝子から成る群から選択される少なくとも１つの免疫調節遺伝子を人工的に操作可能な遺伝子操作用組成物を接触させることを含み得る。 （ａ）免疫細胞は、人体から単離される免疫細胞、または、幹細胞から分化される免疫細胞であり得る。
（ｂ）人工受容体タンパク質を発現するための組成物は、人工受容体タンパク質をコードする核酸配列を含み得る。
（ｃ）遺伝子操作用組成物は、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子およびＫＤＭ６Ａ遺伝子から成る群から選択される少なくとも１つの免疫調節遺伝子の核酸配列における配列識別番号１～２８９の標的配列に相同な、または、それとの相補結合を形成可能なガイド核酸、または、ガイド核酸をコードする核酸、ならびに、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、および、Ｃｐｆ１タンパク質から成る群から選択される少なくとも１つのエディタータンパク質、または、エディタータンパク質をコードする核酸を含み得る。
ここで、ガイド核酸およびエディタータンパク質は各々、少なくとも１つのベクターの形態であるヌクレオチド配列の形態であり得る、または、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体の形態であり得て、ガイド核酸およびエディタータンパク質が結合する。
接触はｅｘ ｖｉｖｏで実行され得る。
接触は、（ａ）免疫細胞を、（ｂ）人工受容体タンパク質を発現する組成物、および、（ｃ）遺伝子操作用組成物を順次または同時に接触させることであり得る。
接触は、電気穿孔、リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ナノ粒子およびタンパク質移行ドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質法から選択される少なくとも１つの方法によって実行され得る。
本発明は、特定の目的のために操作された免疫細胞を使用する免疫疾患治療方法を提供する。
特定の実施形態において、免疫疾患治療方法は、活性成分として操作された免疫細胞を含む医薬組成物を対象に投与する段階を備える。
操作された免疫細胞に関する説明は、上に記載の通りである。
医薬組成物は追加のコンポーネントを更に含み得る。
ここで、追加のコンポーネントは免疫チェックポイント阻害剤であり得る。
免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＬＡＧ‐３、ＴＩＭ‐３、ＣＴＬＡ‐４、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＣＤ１６０、ＣＤ２４４またはＣＤ３９の阻害剤であり得る。
ここで、追加のコンポーネントは、抗原結合剤、サイトカイン、サイトカインの分泌促進剤、または、サイトカインの阻害剤であり得る。
ここで、追加のコンポーネントは、操作された免疫細胞を身体に送達するための適切な担体であり得る。
医薬組成物に含まれる、操作された免疫細胞は、対象の自家細胞、または、同種異系細胞であり得る。
免疫疾患は自己免疫疾患であり得る。
ここで、自己免疫疾患は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、全身性エリテマトーデス、セリアック病、１型糖尿病、グレーヴス病、炎症性腸疾患、乾癬、関節リウマチ、または、多発性硬化症であり得る。
疾患は、病原体が知られているが治療が未知である難治性疾患であり得る。
ここで、難治性疾患は、ウイルス感染症、プリオン病原体によって引き起こされる疾患、または、癌であり得る。
免疫疾患を有する対象への医薬組成物の投与は、注射、輸血、インプラントまたは移植から選択される方法によって実行され得る。
対象は、ヒト、サル、マウスおよびラットを含む哺乳動物である。
人工的に改変または操作された標的遺伝子の例を示す。 人工的に改変または操作された標的遺伝子の例を示す。 人工的に改変または操作された標的遺伝子の例を示す。 人工的に改変または操作された標的遺伝子の例を示す。 人工的に改変または操作された標的遺伝子の例を示す。 人工的に改変または操作された標的遺伝子の例を示す。 人工的に改変または操作された標的遺伝子の例を示す。 人工的に改変または操作された標的遺伝子の例を示す。 人工的に改変または操作された標的遺伝子の例を示す。 人工的に改変または操作された標的遺伝子の例を示す。 人工的に改変または操作された標的遺伝子の例を示す。 人工的に改変または操作された標的遺伝子の例を示す。 人工的に改変または操作された標的遺伝子の例を示す。 人工的に改変または操作された標的遺伝子の例を示す。 人工的に改変または操作された標的遺伝子の例を示す。 人工的に改変または操作された標的遺伝子の例を示す。 人工的に改変または操作された標的遺伝子の例を示す。 人工的に改変または操作された標的遺伝子の例を示す。 人工的に改変または操作された標的遺伝子の例を示す。 人工的に改変または操作された標的遺伝子の例を示す。 人工的に改変または操作された標的遺伝子の例を示す。 人工的に改変または操作された標的遺伝子の例を示す。 人工的に改変または操作された標的遺伝子の例を示す。 人工的に改変または操作された標的遺伝子の例を示す。 人工的に改変または操作された標的遺伝子の例を示す。 人工的に改変または操作された標的遺伝子の例を示す。 人工的に改変または操作された標的遺伝子の例を示す。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で処理された１３９ＣＡＲ‐Ｔ細胞のＣＡＲ発現量を示すグラフである。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を電気穿孔法で導入した後のＴ細胞の増殖を示すグラフである。
Ｔ細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって選択的にノックアウトされるＤＧＫを示し、グラフでは、（Ａ）ＤＧＫのインデル（％）および（Ｂ）ＤＧＫのタンパク質発現が確認される。
Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑを使用して、各ＤＧＫのｇＲＮＡの識別されたオフターゲット部位を示すグラフである。
ＡＡＶＳ１がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によってノックアウトされる、１３９ＣＡＲ‐Ｔ細胞の細胞毒性効果を示すグラフである。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によってＡＡＶＳ１がノックアウトされた、または、ＤＧＫがノックアウトされた１３９ＣＡＲ‐Ｔ細胞の（Ａ）細胞毒性効果、および、（Ｂ）サイトカイン分泌量を比較するグラフである。
Ｕ８７またはＵ８７ｖＩＩＩ細胞を１３９ＣＡＲ‐Ｔ細胞と共培養した後の、（Ａ）Ｕ８７ｖＩＩＩにおけるＰＤＬ‐１の発現量、および、（Ｂ）Ｔ細胞におけるＰＤ‐１の発現量を比較するグラフである。
ＤＧＫノックアウト１３９ ＣＡＲ‐Ｔ細胞における、（Ａ）カルシウム流入の変化、および、（Ｂ）ｐＥＲＫタンパク質の発現を示す画像である。
免疫抑制因子の存在下で、ＡＡＶＳ１ノックアウトまたはＤＧＫノックアウト１３９ ＣＡＲ‐Ｔ細胞の細胞毒性効果およびサイトカイン分泌量を比較するグラフであり、（Ａ）はＴＧＦ‐βの存在下、（Ｂ）はＰＥＧ２の存在下を示す。
免疫抑制因子の存在で、ＡＡＶＳ１ノックアウトまたはＤＧＫノックアウト１３９ ＣＡＲ‐Ｔ細胞のエフェクター機能を示すグラフである。
免疫抑制因子の存在下で、ＡＡＶＳ１ノックアウトまたはＤＧＫノックアウトｃ２５９ ＴＣＲ Ｔ細胞のエフェクター機能を示すグラフである。
繰り返し抗原に曝したＤＧＫノックアウトＴ細胞のエフェクター活性を識別するための実験設計を示す。
繰り返し抗原に曝したＤＧＫノックアウトＴ細胞の細胞増殖を示し、グラフは、（Ａ）生存細胞の数、および、（Ｂ）増殖細胞の数（％）を比較する。
ＤＧＫノックアウトＴ細胞における細胞死を誘導するＦａｓ媒介活性を示し、グラフは、（Ａ）活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ、％）、および、（Ｂ）Ｆａｓの発現量（％）を示す。
反復的な腫瘍接種が後に続くＡＡＶＳ１ノックアウトまたはＤＧＫノックアウト１３９ ＣＡＲ‐Ｔ細胞のサイトカイン分泌量を示すグラフである。
ＡＡＶＳ１ノックアウトまたはＤＧＫノックアウト１３９ ＣＡＲ‐Ｔ細胞の（Ａ）ナイーブＴ細胞の総量、および、（Ｂ）エフェクターメモリーＴ細胞の総量を示すグラフである。
ＡＡＶＳ１ノックアウトまたはＤＧＫノックアウト１３９ ＣＡＲ‐Ｔ細胞の（Ａ）エフェクターメモリー調節因子の発現量、（Ｂ）１型サイトカインの発現量、（Ｃ）２型サイトカインの発現量を示すグラフである。
ＡＡＶＳ１ノックアウトまたはＤＧＫノックアウト１３９ ＣＡＲ‐Ｔ細胞におけるＴ細胞疲弊に関するマーカーの発現量を示すグラフである。
ＡＡＶＳ１ノックアウトまたはＤＧＫノックアウト１３９ ＣＡＲ‐Ｔ細胞の抗癌効果を示し、グラフは、（Ａ）静脈内注射されたときの抗癌効果、（Ｂ）腫瘍内注射されたときの抗癌効果を示し、画像は、（Ｃ）各条件における腫瘍のサイズを比較する。
（Ａ、Ｂ）ｉｎ ｖｉｖｏ注射されたＡＡＶＳ１、αＫＯ、ζＫＯ、および、ｄＫＯ １３９ ＣＡＲ‐Ｔ細胞の残存状態、および、（Ｃ）各条件における腫瘍のサイズを比較するグラフ、および、（Ｄ）各条件における腫瘍浸潤Ｔ細胞の数を示すグラフを示す。
ｉｎ ｖｉｖｏ注射されたＡＡＶＳ１、αＫＯ、ζＫＯ、および、ｄＫＯ １３９ ＣＡＲ‐Ｔ細胞の（Ａ）ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦα陽性細胞（％）、（Ｂ）Ｋｉ‐６７陽性細胞（％）、および、（Ｃ）Ｔ‐ｂｅｔ陽性細胞（％）を比較するグラフである。
特別の定めのない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明の当業者によって一般に理解される意味と同一である。本明細書で説明されるものと同様または同一の方法および物質を、本発明の実施または試験において使用できるが、以下では好適な方法および物質を説明する。本明細書で言及されるすべての公報、特許出願、特許、および、他の参照文献は、参照によって全体が組み込まれる。加えて、材料、方法および例は、単に説明のためのものであり、限定の意図はない。
本発明において開示される態様はガイド核酸に関する。
「ガイド核酸」という用語は、標的核酸、遺伝子、または、染色体を認識し、エディタータンパク質と相互作用できるヌクレオチド配列を指す。ガイド核酸は、標的核酸、遺伝子または染色体におけるヌクレオチド配列の一部と相補的に結合できる。また、ガイド核酸におけるヌクレオチド配列の一部は、エディタータンパク質におけるアミノ酸の一部と相互作用して、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体を形成できる。
ガイド核酸は、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体が標的核酸、遺伝子または染色体の標的領域に配置されるよう誘導するように機能できる。
ガイド核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡ混合物の形態で存在し得て、５～１５０の核酸配列を有し得る。
ガイド核酸は１つの連続核酸配列であり得る。
例えば、１つの連続核酸配列は、（Ｎ）ｍであり得て、ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、または、Ａ、Ｕ、ＣまたはＧであり、ｍは１～１５０の整数である。
ガイド核酸は２つ以上の連続核酸配列であり得る。
例えば、２つ以上の連続核酸配列は、（Ｎ）ｍおよび（Ｎ）ｏであり得て、ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ、または、Ａ、Ｕ、ＣまたはＧを表し、ｍおよびｏは、１～１５０の整数であり、互いに同一であり得る、または、異なり得る。
ガイド核酸は１または複数のドメインを含む。
当該ドメインは、これらに限定されないが、ガイドドメイン、第１相補ドメイン、リンカドメイン、第２相補ドメイン、近位ドメイン、または、尾部ドメインなどの機能ドメインであり得る。
ここで、１つのガイド核酸は、２以上の機能ドメインを有し得る。更に、２以上の機能ドメインは、互いに異なり得る。代替的に、ガイド核酸に含まれる２以上の機能ドメインは、互いに同一であり得る。例えば、１つのガイド核酸は、２以上の近位ドメインを有し得て、別の例において、１つのガイド核酸は２以上の尾部ドメインを有し得る。しかしながら、ガイド核酸に含まれる機能ドメインが２つの同一ドメインであることは、２つの機能ドメインが同一配列を有することを表すものではない。ドメインは、配列が異なるときでも、同一の機能を実行する限り、同一とみなすことができる。
機能ドメインについての詳細は、下で詳述する。
［ｉ）ガイドドメイン］
「ガイドドメイン」という用語は、標的遺伝子または標的核酸における配列の一部と相補結合を形成可能な相補的ガイド配列を有するドメインであり、標的遺伝子または標的核酸と特異的に相互作用するよう機能する。例えば、ガイドドメインは、標的遺伝子または標的核酸の特異的なヌクレオチド配列を有する位置にガイド核酸‐エディタータンパク質複合体を誘導するよう機能できる。
ガイドドメインは、１０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、ガイドドメインは、１０ｂｐ～３５ｂｐ、１５ｂｐ～３５ｂｐ、２０ｂｐ～３５ｂｐ、２５ｂｐ～３５ｂｐ、または、３０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、ガイドドメインは、１０ｂｐ～１５ｂｐ、１５ｂｐ～２０ｂｐ、２０ｂｐ～２５ｂｐ、２５ｂｐ～３０ｂｐ、または、３０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
ガイドドメインは、ガイド配列を含み得る。
「ガイド配列」という用語は、標的遺伝子または標的核酸の二本鎖のうち一本鎖における配列の一部に相補的なヌクレオチド配列であり、ガイド配列は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または、９５％以上の相補性または完全相補性を有するヌクレオチド配列であり得る。
ガイド配列は、１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、ガイド配列は、１０ｂｐ～２５ｂｐ、１５ｂｐ～２５ｂｐ、または、２０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、ガイド配列は、１０ｂｐ～１５ｂｐ、１５ｂｐ～２０ｂｐ、または、２０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
追加的に、ガイドドメインは追加のヌクレオチド配列を有し得る。
追加のヌクレオチド配列は、ガイドドメインの機能を促進または阻害するものであり得る。
追加のヌクレオチド配列は、ガイド配列の機能を促進または阻害するものであり得る。
追加のヌクレオチド配列は、１ｂｐ～１０ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、追加のヌクレオチド配列は、２ｂｐ～１０ｂｐ、４ｂｐ～１０ｂｐ、６ｂｐ～１０ｂｐ、または、８ｂｐ～１０ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、追加のヌクレオチド配列は、１ｂｐ～３ｂｐ、３ｂｐ～６ｂｐ、または、７ｂｐ～１０ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、追加のヌクレオチド配列は、１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、６ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐ、または、１０ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
例えば、追加のヌクレオチド配列は、１塩基ヌクレオチド配列Ｇ（グアニン）、または、２塩基ヌクレオチド配列ＧＧであり得る。
追加のヌクレオチド配列は、ガイド配列の５'末端に位置し得る。
追加のヌクレオチド配列は、ガイド配列の３'末端に位置し得る。
［ｉｉ）第１相補ドメイン］
「第１相補ドメイン」という用語は、以下で説明される第２相補ドメインに相補的なヌクレオチド配列を含むドメインであり、第２相補ドメインと二本鎖を形成するのに十分な相補性を有する。例えば、第１相補ドメインは、第２相補ドメインと少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または、９５％以上の相補性または完全相補性を有するヌクレオチド配列であり得る。
第１相補ドメインは、相補的結合によって、第２相補的ドメインと二本鎖を形成し得る。二本鎖は、エディタータンパク質におけるアミノ酸の一部と相互作用するように機能し得て、それにより、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体を形成し得る。
第１相補ドメインは、５～３５のヌクレオチド配列であり得る。
一例において、第１相補ドメインは、５～３５、１０～３５、１５～３５、２０～３５、２５～３５、または、３０～３５のヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、第１相補ドメインは、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、または、３０～３５のヌクレオチド配列であり得る。
［ｉｉｉ）リンカドメイン］
「リンカドメイン」という用語は、２つ以上の同一または異なるドメインである２つ以上のドメインを接続する核酸配列である。リンカドメインは、共有結合または非共有結合によって２つ以上のドメインに接続され得るか、または、共有結合または非共有結合によって２つ以上のドメインを接続し得る。
リンカドメインは、１～３０のヌクレオチド配列であり得る。
一例において、リンカドメインは、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、または、２５～３０のヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、リンカドメインは、１～３０、５～３０、１０～３０、１５～３０、２０～３０、または、２５～３０のヌクレオチド配列であり得る。
［ｉｖ）第２相補ドメイン］
「第２相補ドメイン」という用語は、上に記載した第１相補ドメインに相補的な核酸配列を含むヌクレオチド配列を含むドメインであり、第１相補ドメインと二本鎖を形成するのに十分な相補性を有する。例えば、第２相補ドメインは、第１相補ドメインと少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または、９５％以上の相補性または完全相補性を有するヌクレオチド配列であり得る。
第２相補ドメインは、相補的結合によって第１相補ドメインとの二本鎖を形成し得る。形成された二本鎖は、エディタータンパク質におけるアミノ酸の一部と相互作用するよう機能し得て、それにより、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体を形成する。
第２相補ドメインは、第１相補ドメインに相補的なヌクレオチド配列、および、第１相補ドメインとの相補性を有しないヌクレオチド配列、例えば、第１相補ドメインとの二本鎖を形成しないヌクレオチド配列を有し得て、第１相補ドメインより長いヌクレオチド配列を有し得る。
第２相補ドメインは、５～３５のヌクレオチド配列を有し得る。
一例において、第２相補ドメインは、１～３５、５～３５、１０～３５、１５～３５、２０～３５、２５～３５、または、３０～３５のヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、第２相補ドメインは、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、または、３０～３５のヌクレオチド配列であり得る。
［ｖ）近位ドメイン］
「近位ドメイン」という用語は、第２相補ドメインに隣接して位置するヌクレオチド配列である。
近位ドメインは、その中に相補的ヌクレオチド配列を有し得て、相補的ヌクレオチド配列に起因して二本鎖で形成され得る。
近位ドメインは、１～２０のヌクレオチド配列であり得る。
一例において、近位ドメインは、１～２０、５～２０、１０～２０、または、１５～２０のヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、近位ドメインは、１～２０、５～２０、１０～２０、または、１５～２０の塩基配列であり得て、近位ドメインは、１～５、５～１０、１０～１５、または、１５～２０のヌクレオチド配列であり得る。
［ｖｉ）尾部ドメイン］
「尾部ドメイン」という用語は、ガイド核酸の両末端のうち１または複数の末端に位置するヌクレオチド配列である。
尾部ドメインは、その中に相補的ヌクレオチド配列を有し得て、相補的ヌクレオチド配列に起因して二本鎖で形成され得る。
尾部ドメインは、１～５０のヌクレオチド配列であり得る。
一例において、尾部ドメインは、５～５０、１０～５０、１５～５０、２０～５０、２５～５０、３０～５０、３５～５０、４０～５０、または４５～５０のヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、尾部ドメインは、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、または４５～５０のヌクレオチド配列であり得る。
一方、ドメインに含まれる核酸配列、すなわち、ガイドドメイン、第１相補ドメイン、リンカドメイン、第２相補ドメイン、近位ドメインおよび尾部ドメインの一部または全部は、選択的に、または、追加的に化学修飾を含み得る。
化学修飾は、これらに限定されないが、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'‐Ｏ‐メチル３'ホスホロチオエート（ＭＳ）、または、２'‐Ｏ‐メチル３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得る。
ガイド核酸は１または複数のドメインを含む。
ガイド核酸はガイドドメインを含み得る。
ガイド核酸は第１相補ドメインを含み得る。
ガイド核酸はリンカドメインを含み得る。
ガイド核酸は第２相補ドメインを含み得る。
ガイド核酸は近位ドメインを含み得る。
ガイド核酸は尾部ドメインを含み得る。
ここでは、１、２、３、４、５、６またはより多くのドメインがあり得る。
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはより多くのガイドドメインを含み得る。
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはより多くの第１相補ドメインを含み得る。
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはより多くのリンカドメインを含み得る。
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはより多くの第２相補ドメインを含み得る。
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはより多くの近位ドメインを含み得る。
ガイド核酸は、１、２、３、４、５、６またはより多くの尾部ドメインを含み得る。
ここで、ガイド核酸において、１種類のドメインが重複し得る。
ガイド核酸は、重複を有する、または、有しないいくつかのドメインを含み得る。
ガイド核酸は、同じ種類のドメインを含み得る。ここで、同じ種類のドメインは、同一の核酸配列または異なる核酸配列を有し得る。
ガイド核酸は２種類のドメインを含み得る。ここで、２つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同一の核酸配列を有し得る。
ガイド核酸は、３種類のドメインを含み得る。ここで、３つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同一の核酸配列を有し得る。
ガイド核酸は、４種類のドメインを含み得る。ここで、４つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同一の核酸配列を有し得る。
ガイド核酸は、５種類のドメインを含み得る。ここで、５つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同一の核酸配列を有し得る。
ガイド核酸は、６種類のドメインを含み得る。ここで、６つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同一の核酸配列を有し得る。
例えば、ガイド核酸は、［ガイドドメイン］‐［第１相補ドメイン］‐［リンカドメイン］‐［第２相補ドメイン］‐［リンカドメイン］‐［ガイドドメイン］‐［第１相補ドメイン］‐［リンカドメイン］‐［第２相補ドメイン］から成り得る。ここで、２つのガイドドメインは、異なる、または、同一の標的に対するガイド配列を含み得て、２つの第１相補ドメインおよび２つの第２相補ドメインは、同一または異なる核酸配列を有し得る。ガイドドメインが、異なる標的に対するガイド配列を含むとき、ガイド核酸は、２つの異なる標的に特異的に結合し得て、ここでは、特異的結合は、同時または順次に実行され得る。加えて、リンカドメインは、特異的酵素に切断され得て、ガイド核酸は、特異的酵素の存在下で、２または３つの部分に分割され得る。
本明細書によって開示される内容の実施形態として、ガイド核酸はｇＲＮＡであり得る。
［ｇＲＮＡ］
「ｇＲＮＡ」という用語は、標的遺伝子または標的核酸に関して、ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体を特異的に標的化可能な核酸を指す。加えて、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ酵素に結合してＣＲＩＳＰＲ酵素を標的遺伝子または標的核酸へ誘導し得る核酸特異的ＲＮＡである。
ｇＲＮＡは、複数のドメインを含み得る。各ドメインに起因して、ｇＲＮＡ鎖の３次元構造もしくは活性形態において、または、これらの鎖の間で、相互作用が生じ得る。
ｇＲＮＡは、一本鎖ｇＲＮＡ（単一ＲＮＡ分子）、または、二本鎖ｇＲＮＡ（１つより多くの、一般的には２つの別個のＲＮＡ分子を含む）と称され得る。
例示的な一実施形態において、一本鎖ｇＲＮＡは、５'から３'の方向に、ガイドドメイン、すなわち、標的遺伝子または標的核酸との相補結合を形成可能なガイド配列を含むドメインと、第１相補ドメインと、リンカドメインと、第２相補ドメイン、すなわち、第１相補ドメイン配列に相補的な配列を有し、それにより、第１相補ドメインと共に二本鎖核酸を形成するドメインと、近位ドメインと、任意で、尾部ドメインとを含み得る。
別の実施形態において、二本鎖ｇＲＮＡは、ガイドドメイン、すなわち、標的遺伝子または標的核酸との相補結合を形成可能なガイド配列を含むドメイン、および、第１相補ドメインを含む第１鎖と、５'から３'の方向に、第２相補ドメイン、すなわち、第１相補ドメイン配列に相補的な配列を有し、それにより、第１相補ドメインと共に二本鎖核酸を形成するドメイン、近位ドメイン、任意で、尾部ドメインを含む第２鎖とを含み得る。
ここで、第１鎖は、ｃｒＲＮＡと称され得て、第２鎖は、ｔｒａｃｒＲＮＡと称され得る。ｃｒＲＮＡは、ガイドドメインおよび第１相補ドメインを含み得て、ｔｒａｃｒＲＮＡは、第２相補ドメイン、近位ドメイン、任意で尾部ドメインを含み得る。
更に別の実施形態において、一本鎖ｇＲＮＡは、３'から５'の方向に、ガイドドメイン、すなわち、標的遺伝子または標的核酸との相補結合を形成可能なガイド配列を含むドメインと、第１相補ドメインと、第２相補ドメイン、すなわち、第１相補ドメイン配列に相補的な配列を有し、それにより、第１相補ドメインと共に二本鎖核酸を形成するドメインとを含み得る。
第１相補ドメインは、天然第１相補ドメインとの相同性を有し得る、または、天然第１相補ドメインに由来し得る。加えて、第１相補ドメインは、天然に存在する種に応じて、第１相補ドメインの塩基配列に差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる第１相補ドメインに由来し得るか、または、天然に存在する種に含まれる第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る。
例示的な一実施形態において、第１相補ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスの第１相補ドメインとの、または、それらに由来する第１相補ドメインとの部分的、すなわち少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
例えば、第１相補ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインであるとき、第１相補ドメインは、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ‐３'であり得る、または、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ‐３'との部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、もしくは、完全相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、第１相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（Ｘ）ｎ‐３'が生じる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは、塩基の数を表し得て、５～１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧであり得る。
別の実施形態において、第１相補ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインであるとき、第１相補ドメインは、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ‐３'との部分的、すなわち、少なくとも５０％以上、または、完全相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、第１相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ（Ｘ）ｎ‐３'が生じる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは塩基の数を表し得て、５～１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
別の実施形態において、第１相補ドメインは、パルクバクテリア・バクテリウム（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、ラクノスピラ・バクテリウム（ＭＣ２０１７）、ブチリビブリオプロテオカシカス、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、アシダミノコッカスｓｐ（ＢＶ３Ｌ６）、ポルフィロモナス・マカカエ、ラクノスピラ・バクテリウム（ＮＤ２００６）、ポルフィロモナス・クレビオリカニ、プレボテラ・ディシエンス、モラクセラ・ボーボクリ（２３７）、スミセラｓｐ（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、レプトスピラ・イナダイ、ラクノスピラ・バクテリウム（ＭＡ２０２０）、フランシセラノビサイダ（Ｕ１１２）、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツムまたはユーバクテリウム・エリゲンスの第１相補ドメイン、または、それらに由来する第１相補ドメインとの部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
例えば、第１相補ドメインがパルクバクテリア・バクテリウムの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインであるとき、第１相補ドメインは、５'‐ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ‐３'と部分的な、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、第１相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'‐（Ｘ）ｎＵＵＵＧＵＡＧＡＵ‐３'が生じる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは、塩基の数を表し得て、１～５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
ここで、リンカドメインは、第１相補ドメインを第２相補ドメインに接続するヌクレオチド配列であり得る。
リンカドメインは、共有結合または非共有結合によって、第１相補ドメインおよび第２相補ドメインにそれぞれ接続され得る。
リンカドメインは、共有結合または非共有結合によって、第１相補ドメインを第２相補ドメインに接続し得る。
リンカドメインは、一本鎖ｇＲＮＡ分子において使用されるのに好適であり、共有結合または非共有結合により、二本鎖ｇＲＮＡの第１鎖および第２鎖と接続されることによって、または、第１鎖を第２鎖と接続することによって、一本鎖ｇＲＮＡを生成するのに使用され得る。
リンカドメインは、二本鎖ｇＲＮＡのｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡと接続されることによって、または、共有結合または非共有結合でｃｒＲＮＡをｔｒａｃｒＲＮＡに接続することによって、一本鎖ｇＲＮＡを生成するために使用され得る。
ここで、第２相補ドメインは、天然第２相補ドメインとの相同性を有し得る、または、天然第２相補ドメインに由来し得る。加えて、第２相補ドメインは、天然に存在する種に応じて、第２相補ドメインの塩基配列において差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる第２相補ドメインに由来し得て、または、天然に存在する種に含まれる第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る。
例示的な実施形態において、第２相補ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスとの部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有する第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインを有し得る。
例えば、第２相補ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインであるとき、第２相補ドメインは、５'‐ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'と部分的な、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る（第１相補ドメインと共に二本鎖を形成する塩基配列を下線で示す）。ここで、第２相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎおよび／または（Ｘ）ｍを含み得て、５'‐（Ｘ）ｎ ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ（Ｘ）ｍ‐３'が生じる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎおよびｍの各々は、塩基の数を表し得て、ｎは１～１５の整数であり得て、ｍは、１～６の整数であり得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。加えて、（Ｘ）ｍは、同一の塩基のｍ回反復、または、混在したｍ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
別の例において、第２相補ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインであるとき、第２相補ドメインは、５'‐ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ‐３'と部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る（第１相補ドメインと共に二本鎖を形成する塩基配列を下線で示す）。ここで、第２相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎおよび／または（Ｘ）ｍを含み得て、５'‐（Ｘ）ｎＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ（Ｘ）ｍ‐３'が生じる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎおよびｍの各々は、塩基の数を表し得て、ｎは１～１５の整数であり得て、ｍは１～６の整数であり得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。加えて、（Ｘ）ｍは、同一の塩基のｍ回反復、または、混在したｍ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
別の実施形態において、第２相補ドメインは、パルクバクテリア・バクテリウム（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、ラクノスピラ・バクテリウム（ＭＣ２０１７）、ブチリビブリオ・プロテオクラシカス、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、アシダミノコッカスｓｐ（ＢＶ３Ｌ６）、ポルフィロモナス・マカカエ、ラクノスピラ・バクテリウム（ＮＤ２００６）、ポルフィロモナス・クレビオリカニ、プレボテラ・ディシエンス、モラクセラ・ボーボクリ（２３７）、スミセラｓｐ（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、レプトスピラ・イナダイ、ラクノスピラ・バクテリウム（ＭＡ２０２０）、フランシセラノビサイダ（Ｕ１１２）、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツム、または、ユウバクテリウム・エリゲンスの第１相補ドメイン、または、それらに由来する第２相補ドメインとの部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または完全相同性を有し得る。
例えば、第２相補ドメインがパルクバクテリア・バクテリウムの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインであるとき、第２相補ドメインは、５'‐ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ‐３'と部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る（第１相補ドメインと共に二本鎖を形成する塩基配列を下線で示す）。ここで、第２相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎおよび／または（Ｘ）ｍを含み得て、５'‐（Ｘ）ｎＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ（Ｘ）ｍ‐３'が生じる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎおよびｍの各々は、塩基の数を表し得て、ｎは１～１０の整数であり得て、ｍは１～６の整数であり得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。加えて、（Ｘ）ｍは、同一の塩基のｍ回反復、または、混在したｍ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
ここで、第１相補ドメインおよび第２相補ドメインは相補結合を形成し得る。
第１相補ドメインおよび第２相補ドメインは、相補結合を通して二本鎖を形成し得る。
形成された二本鎖はＣＲＩＳＰＲ酵素と相互作用し得る。
選択的に、第１相補ドメインは、第２鎖の第２相補ドメインと相補結合を形成しない追加のヌクレオチド配列を含み得る。
ここで、追加のヌクレオチド配列は、１ｂｐ～１５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。例えば、追加のヌクレオチド配列は、１ｂｐ～５ｂｐ、５ｂｐ～１０ｂｐ、または、１０ｂｐ～１５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
ここで、近位ドメインは、第２相補ドメインの５'から３'方向のドメインであり得る。
近位ドメインは、天然近位ドメインと相同性を有し得る、または、天然近位ドメインに由来し得る。加えて、近位ドメインは、天然に存在する種に従って、塩基配列において差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる近位ドメインに由来し得て、または、天然に存在する種に含まれる近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る。
例示的な実施形態において、近位ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスの近位ドメイン、または、それらに由来する近位ドメインとの部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
例えば、近位ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインであるとき、近位ドメインは、５'‐ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ‐３'との部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、近位ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'‐ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（Ｘ）ｎ‐３'が生じる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは塩基の数を表し得て、１～１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、Ａ、Ｔ、ＵおよびＧの混在したｎ個の塩基を表し得る。
更なる別の例において、近位ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインであるとき、近位ドメインは、５'‐ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、近位ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'‐ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ（Ｘ）ｎ‐３'が生じる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは、塩基の数を表し得て、１～４０の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
ここで、尾部ドメインは、一本鎖ｇＲＮＡまたは二本鎖ｇＲＮＡの第１鎖または第２鎖の３'末端に選択的に追加され得る。
加えて、尾部ドメインは、天然尾部ドメインと相同性を有し得る、または、天然尾部ドメインに由来し得る。加えて、尾部ドメインは、天然に存在する種に応じて、塩基配列において差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる尾部ドメインに由来し得て、または、天然に存在する種に含まれる尾部ドメインと部分的相同性または完全相同性を有し得る。
例示的な一実施形態において、尾部ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインと、部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
例えば、尾部ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネスの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインであるとき、尾部ドメインは、５'‐ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ‐３'であり得る、または、５'‐ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ‐３'と部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、尾部ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'‐ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（Ｘ）ｎ‐３'となる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは塩基の数を表し得て、１～１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、Ａ、Ｔ、ＵおよびＧなどの混在したｎ個の塩基を表し得る。
別の例において、尾部ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインであるとき、尾部ドメインは、５'‐ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ‐３'と部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、尾部ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'‐ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ（Ｘ）ｎ‐３'となる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは塩基の数を表し得て、１～１５の整数である。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、混在したｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧを表し得る。
別の実施形態において、尾部ドメインは、３'末端において、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ転写法に関与する１～１０塩基配列を含み得る。
例えば、Ｔ７プロモーターがｇＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写において使用されるとき、尾部ドメインは、ＤＮＡ鋳型の３'末端に存在する任意の塩基配列であり得る。加えて、Ｕ６プロモーターがｉｎ ｖｉｖｏ転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵＵＵであり得て、Ｈ１プロモーターが転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵであり得て、Ｐｏｌ‐ＩＩＩプロモーターが使用されるとき、尾部ドメインはいくつかのウラシル塩基または代替的な塩基を含み得る。
ｇＲＮＡは、上記の複数のドメインを含み得て、このため、核酸配列の長さは、ｇＲＮＡに含まれるドメインに従って調節され得て、各ドメインに起因して、ｇＲＮＡの３次元構造または活性形態の鎖において、または、これらの鎖の間で相互作用が生じ得る。
ｇＲＮＡは、一本鎖ｇＲＮＡ（単一ＲＮＡ分子）、または、二本鎖ｇＲＮＡ（１つより多くの、一般的には２つの別個のＲＮＡ分子を含む）と称され得る。
［二本鎖ｇＲＮＡ］
二本鎖ｇＲＮＡは第１鎖および第２鎖から成る。
ここで、第１鎖は、以下から成り得る。
５'‐［ガイドドメイン］‐［第１相補ドメイン］‐３'
第２鎖は、以下から成り得る。
５'‐［第２相補ドメイン］‐［近位ドメイン］‐３'、または、
５'‐［第２相補ドメイン］‐［近位ドメイン］‐［尾部ドメイン］‐３'
ここで、第１鎖は、ｃｒＲＮＡと称され得て、第２鎖は、ｔｒａｃｒＲＮＡと称され得る。
ここで、第１鎖および第２鎖は任意選択で、追加のヌクレオチド配列を含み得る。
一例において、第１鎖は以下であり得る。
５'‐（Ｎｔａｒｇｅｔ）‐（Ｑ）ｍ‐３'、または、
５'‐（Ｘ）ａ‐（Ｎｔａｒｇｅｔ）‐（Ｘ）ｂ‐（Ｑ）ｍ‐（Ｘ）ｃ‐３'
ここで、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子または標的核酸の二本鎖のうち一本鎖における配列の一部に相補的なヌクレオチド配列である。標的遺伝子または標的核酸における標的配列に従って変更され得るヌクレオチド配列領域であり得る。
ここで、（Ｑ）ｍは、第２鎖の第２相補ドメインとの相補結合を形成可能な第１相補ドメインを含む塩基配列である。（Ｑ）ｍは、天然に存在する種の第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第１相補ドメインの塩基配列は、由来の種に従って変化し得る。Ｑは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｍは塩基の数であり得て、５～３５の整数である。
例えば、第１相補ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネスの第１相補ドメイン、または、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来の第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ‐３'であり得る、または、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
別の例において、第１相補ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニの第１相補ドメイン、または、カンピロバクター・ジェジュニ由来の第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
更に別の例において、第１相補ドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィラスの第１相補ドメイン、または、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ‐３'であり得る、または、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
加えて、（Ｘ）ａ、（Ｘ）ｂ、（Ｘ）ｃの各々は、選択的に、追加の塩基配列であり、Ｘは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され、ａ、ｂおよびｃの各々は塩基の数であり得て、０または１～２０の整数であり得る。
例示的な一実施形態において、第２鎖は以下であり得る。
５'‐（Ｚ）ｈ‐（Ｐ）ｋ‐３'、または、
５'‐（Ｘ）ｄ‐（Ｚ）ｈ‐（Ｘ）ｅ‐（Ｐ）ｋ‐（Ｘ）ｆ‐３'
別の実施形態において、第２鎖は以下であり得る。
５'‐（Ｚ）ｈ‐（Ｐ）ｋ‐（Ｆ）ｉ‐３'、または、
５'‐（Ｘ）ｄ‐（Ｚ）ｈ‐（Ｘ）ｅ‐（Ｐ）ｋ‐（Ｘ）ｆ‐（Ｆ）ｉ‐３'
ここで、（Ｚ）ｈは、第１鎖の第１相補ドメインとの相補結合を形成可能な第２相補ドメインを含む塩基配列である。（Ｚ）ｈは、天然に存在する種の第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第２相補ドメインの塩基配列は、由来の種に従って改変され得る。Ｚは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｈは塩基の数であり得て、５～５０の整数である。
例えば、第２相補ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネスの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'‐ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
別の例において、第２相補ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'‐ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ‐３'との少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
更に別の例において、第２相補ドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィラスの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'‐ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
（Ｐ）ｋは、天然に存在する種の近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る近位ドメインを含む塩基配列であり、近位ドメインの塩基配列は、由来の種に従って改変され得る。Ｐは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｋは塩基の数であり得て、１～２０の整数である。
例えば、近位ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'‐ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
別の例において、近位ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'‐ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
更に別の例において、近位ドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィラスの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'‐ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
（Ｆ）ｉは、尾部ドメインを含む塩基配列であり得て、天然に存在する種の尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し、尾部ドメインの塩基配列は、由来の種に従って改変され得る。Ｆは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｉは塩基の数であり得て、１～５０の整数である。
例えば、尾部ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'‐ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ‐３'であり得る、または、５'‐ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
別の例において、尾部ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインと部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'‐ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
更に別の例において、尾部ドメインがストレプトコッカス・サーモフィラスの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'‐ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
加えて、（Ｆ）ｉは３'末端において、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ転写法に関与する１～１０塩基の配列を含み得る。
例えば、ｇＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写においてＴ７プロモーターが使用されるとき、尾部ドメインは、ＤＮＡ鋳型の３'末端に存在する任意の塩基配列であり得る。加えて、Ｕ６プロモーターがｉｎ ｖｉｖｏ転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵＵＵであり得て、Ｈ１プロモーターが転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵであり得て、Ｐｏｌ‐ＩＩＩプロモーターが使用されるとき、尾部ドメインはいくつかのウラシル塩基または代替的な塩基を含み得る。
加えて、（Ｘ）ｄ、（Ｘ）ｅおよび（Ｘ）ｆは、選択的に追加される塩基配列であり得て、Ｘは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｄ、ｅ、ｆの各々は、塩基の数であり得て、０または１～２０の整数である。
［一本鎖ｇＲＮＡ］
一本鎖ｇＲＮＡは、第１の一本鎖ｇＲＮＡおよび第２の一本鎖ｇＲＮＡに分類され得る。
［第１の一本鎖ｇＲＮＡ］
第１の一本鎖ｇＲＮＡは、一本鎖ｇＲＮＡであり、二本鎖ｇＲＮＡの第１鎖および第２鎖は、リンカドメインによって連結される。
具体的には、一本鎖ｇＲＮＡは、以下から成り得る。
５'‐［ガイドドメイン］‐［第１相補ドメイン］‐［リンカドメイン］‐［第２相補ドメイン］‐３'
５'‐［ガイドドメイン］‐［第１相補ドメイン］‐［リンカドメイン］‐［第２相補ドメイン］‐［近位ドメイン］‐３'、または、
５'‐［ガイドドメイン］‐［第１相補ドメイン］‐［リンカドメイン］‐［第２相補ドメイン］‐［近位ドメイン］‐［尾部ドメイン］‐３'
第１の一本鎖ｇＲＮＡは任意選択で、追加のヌクレオチド配列を含み得る。
例示的な一実施形態において、第１の一本鎖ｇＲＮＡは以下であり得る。
５'‐（Ｎｔａｒｇｅｔ）‐（Ｑ）ｍ‐（Ｌ）ｊ‐（Ｚ）ｈ‐３'
５'‐（Ｎｔａｒｇｅｔ）‐（Ｑ）ｍ‐（Ｌ）ｊ‐（Ｚ）ｈ‐（Ｐ）ｋ‐３'、または、
５'‐（Ｎｔａｒｇｅｔ）‐（Ｑ）ｍ‐（Ｌ）ｊ‐（Ｚ）ｈ‐（Ｐ）ｋ‐（Ｆ）ｉ‐３'
別の例示的な実施形態において、一本鎖ｇＲＮＡは以下であり得る。
５'‐（Ｘ）ａ‐（Ｎｔａｒｇｅｔ）‐（Ｘ）ｂ‐（Ｑ）ｍ‐（Ｘ）ｃ‐（Ｌ）ｊ‐（Ｘ）ｄ‐（Ｚ）ｈ‐（Ｘ）ｅ‐３'
５'‐（Ｘ）ａ‐（Ｎｔａｒｇｅｔ）‐（Ｘ）ｂ‐（Ｑ）ｍ‐（Ｘ）ｃ‐（Ｌ）ｊ‐（Ｘ）ｄ‐（Ｚ）ｈ‐（Ｘ）ｅ‐（Ｐ）ｋ‐（Ｘ）ｆ‐３'、または、
５'‐（Ｘ）ａ‐（Ｎｔａｒｇｅｔ）‐（Ｘ）ｂ‐（Ｑ）ｍ‐（Ｘ）ｃ‐（Ｌ）ｊ‐（Ｘ）ｄ‐（Ｚ）ｈ‐（Ｘ）ｅ‐（Ｐ）ｋ‐（Ｘ）ｆ‐（Ｆ）ｉ‐３'
ここで、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子または標的核酸における標的配列との相補結合を形成可能な塩基配列、および、標的遺伝子または標的核酸における標的配列に従って変更可能な塩基配列領域である。
（Ｑ）ｍは、第２相補ドメインとの相補結合を形成可能な第１相補ドメインを含む塩基配列を含む。（Ｑ）ｍは、天然に存在する種の第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第１相補ドメインの塩基配列は、由来の種に従って変化し得る。Ｑは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｍは塩基の数であり得て、５～３５の整数である。
例えば、第１相補ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ‐３'であり得る、または、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
別の例において、第１相補ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
更に別の例において、第１相補ドメインがストレプトコッカス・サーモフィラスの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ‐３'であり得る、または、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
加えて、（Ｌ）ｊは、リンカドメインを含み、第１相補ドメインを第２相補ドメインに接続し、それにより一本鎖ｇＲＮＡを生成する塩基配列である。ここで、Ｌは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｊは塩基の数であり得て、１～３０の整数である。
（Ｚ）ｈは、第１相補ドメインとの相補結合を有することが可能な第２相補ドメインを含む塩基配列である。（Ｚ）ｈは、天然に存在する種の第２相補ドメインと部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第２相補ドメインの塩基配列は、由来の種に従って変化し得る。Ｚは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｈは塩基の数であり、５～５０の整数であり得る。
例えば、第２相補ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネスの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'‐ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
別の例において、第２相補ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'‐ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ‐３'との少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
更に別の例において、第２相補ドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィラスの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'‐ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
（Ｐ）ｋは天然に存在する種の近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る近位ドメインを含む塩基配列であり、近位ドメインの塩基配列は由来の種に従って改変され得る。Ｐは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｋは塩基の数であり得て、１～２０の整数である。
例えば、近位ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'‐ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
別の例において、近位ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'‐ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
更に別の例において、近位ドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィラスの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'‐ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
（Ｆ）ｉは、尾部ドメインを含み、天然に存在する種の尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する塩基配列であり得て、尾部ドメインの塩基配列は、由来の種に従って改変され得る。Ｆは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｉは塩基の数であり得て、１～５０の整数である。
例えば、尾部ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'‐ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ‐３'であり得る、または、５'‐ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
別の例において、尾部ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインと部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'‐ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
更に別の例において、尾部ドメインがストレプトコッカス・サーモフィラスの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'‐ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
加えて、（Ｆ）ｉは３'末端において、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ転写法に関与する１～１０塩基の配列を含み得る。
例えば、ｇＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写においてＴ７プロモーターが使用されるとき、尾部ドメインは、ＤＮＡ鋳型の３'末端に存在する任意の塩基配列であり得る。加えて、Ｕ６プロモーターがｉｎ ｖｉｖｏ転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵＵＵであり得て、Ｈ１プロモーターが転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵであり得て、ｐｏｌ‐ＩＩＩプロモーターが使用されるとき、尾部ドメインはいくつかのウラシル塩基または代替的な塩基を含み得る。
加えて、（Ｘ）ａ、（Ｘ）ｂ、（Ｘ）ｃ、（Ｘ）ｄ、（Ｘ）ｅおよび（Ｘ）ｆは、選択的に追加される塩基配列であり得て、Ｘは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆの各々は塩基の数であり得て、０または１～２０の整数である。
［第２の一本鎖ｇＲＮＡ］
第２の一本鎖ｇＲＮＡは、ガイドドメイン、第１相補ドメイン、および、第２相補ドメインから成る一本鎖ｇＲＮＡであり得る。
ここで、第２の一本鎖ｇＲＮＡは、以下から成り得る。
５'‐［第２相補ドメイン］‐［第１相補ドメイン］‐［ガイドドメイン］‐３'、または、
５'‐［第２相補ドメイン］‐［リンカドメイン］‐［第１相補ドメイン］‐［ガイドドメイン］‐３'
第２の一本鎖ｇＲＮＡは任意選択で、追加のヌクレオチド配列を含み得る。
例示的な一実施形態において、第２の一本鎖ｇＲＮＡは以下であり得る。
５'‐（Ｚ）ｈ‐（Ｑ）ｍ‐（Ｎｔａｒｇｅｔ）‐３'、または、
５'‐（Ｘ）ａ‐（Ｚ）ｈ‐（Ｘ）ｂ‐（Ｑ）ｍ‐（Ｘ）ｃ‐（Ｎｔａｒｇｅｔ）‐３'
別の実施形態において、一本鎖ｇＲＮＡは以下であり得る。
５'‐（Ｚ）ｈ‐（Ｌ）ｊ‐（Ｑ）ｍ‐（Ｎｔａｒｇｅｔ）‐３'、または、
５'‐（Ｘ）ａ‐（Ｚ）ｈ‐（Ｌ）ｊ‐（Ｑ）ｍ‐（Ｘ）ｃ‐（Ｎｔａｒｇｅｔ）‐３'
ここで、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子または標的核酸上の標的配列との相補結合を形成可能な塩基配列であり、標的遺伝子または標的核酸上の標的配列に従って変化し得る塩基配列領域である。
（Ｑ）ｍは、第２鎖の第２相補ドメインとの相補結合を形成可能な第１相補ドメインを含む塩基配列である。（Ｑ）ｍは、天然に存在する種の第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第１相補ドメインの塩基配列は、由来の種に従って変化し得る。Ｑは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｍは塩基の数であり得て、５～３５の整数である。
例えば、第１相補ドメインがパルクバクテリア・バクテリウムの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'‐ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
（Ｚ）ｈは、第１鎖の第１相補ドメインとの相補結合を形成可能な第２相補ドメインを含む塩基配列である。（Ｚ）ｈは、天然に存在する種の第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第２相補ドメインの塩基配列は、由来の種に従って改変され得る。Ｚは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｈは塩基の数であり得て、５～５０の整数である。
例えば、第２相補ドメインがパルクバクテリア・バクテリウムの第２相補ドメイン、または、パルクバクテリア・バクテリウム由来第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは５'‐ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ‐３'との少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
加えて、（Ｌ）ｊは、第１相補ドメインを第２相補ドメインに接続するリンカドメインを含む塩基配列である。ここで、Ｌは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｊは塩基の数であり得て、１～３０の整数である。
加えて、（Ｘ）ａ、（Ｘ）ｂ、（Ｘ）ｃの各々は選択的に、追加の塩基配列であり、Ｘは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ａ、ｂおよびｃは塩基の数であり得て、０または１～２０の整数である。
本発明において開示される態様として、ガイド核酸は、免疫調節遺伝子の標的配列との相補結合を形成可能なｇＲＮＡであり得る。
「免疫調節遺伝子」という用語は、免疫機能、または、免疫応答の形成および性能に関連する機能の調節に直接的に関与する、または、間接的に影響する遺伝子の全部を指す。本発明において、免疫調節遺伝子は、免疫細胞、および、免疫細胞と相互作用できる食細胞などの機能の調節に直接的に関与する、または、間接的に影響する遺伝子の全部を含む。特に、免疫調節遺伝子は、免疫機能、または、免疫調節遺伝子自体、または、免疫調節遺伝子によって発現されるタンパク質に起因する免疫応答の形成および性能に関連する機能を実行できる。
免疫調節遺伝子は、免疫調節遺伝子によって発現されるタンパク質の機能に基づいて分類され得る。以下で列挙される免疫調節遺伝子は、機能に基づく免疫調節遺伝子の例に過ぎず、従って、本発明に含まれる免疫調節遺伝子の種類を制限するものではない。下で列挙される遺伝子は、１種類の免疫調節機能を有し得るだけでなく、複数の種類の機能を有し得る。追加的に、２以上の免疫調節遺伝子が必要に応じて提供され得る。
一例において、免疫調節遺伝子は、免疫細胞活性調節遺伝子であり得る。
「免疫細胞活性調節遺伝子」という用語は、免疫応答の程度または活性を調節するように機能する遺伝子であり、例えば、免疫応答の程度または活性を刺激または抑制する遺伝子であり得る。ここで、免疫細胞活性調節遺伝子は、免疫細胞活性調節遺伝子によって、または、免疫細胞活性調節遺伝子から発現されるタンパク質によって免疫応答の程度または活性を制御する機能を実行し得る。
免疫細胞活性化調節遺伝子は、免疫細胞の活性化または不活性化に関連する機能を実行し得る。
免疫細胞活性調節遺伝子は、免疫細胞の活性化または不活性化に関連する機能を実行し得る。
免疫細胞活性調節遺伝子は、免疫応答を抑制するよう機能し得る。
免疫細胞活性調節遺伝子は、細胞膜のチャネルタンパク質および受容体に結合し得て、それにより、免疫応答を調節するタンパク質の合成に関連する機能を実行する。
例えば、免疫細胞活性調節遺伝子は、プログラム細胞死タンパク質（ＰＤ‐１）であり得る。
ＰＤ‐１遺伝子（ＰＤＣＤ１遺伝子とも称され、以降、ＰＤ‐１遺伝子およびＰＤＣＤ１遺伝子は、同一遺伝子を意味するように使用される）とは、分化抗原群２７９（ＣＤ２７９）とも称されるタンパク質ＰＤ‐１をコードする遺伝子（完全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を指す。一実施形態において、ＰＤ‐１遺伝子は、これらに限定されないが、以下の遺伝子、すなわち、ヒトＰＤ‐１（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００５００９．２など）をコードする遺伝子、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００５０１８．２、ＮＧ＿０１２１１０．１などとして発現されるＰＤ‐１遺伝子から成る群から選択される１または複数であり得る。
免疫細胞活性調節遺伝子は、細胞毒性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ‐４）であり得る。
ＣＴＬＡ‐４遺伝子とは、分化抗原群１５２（ＣＤ１５２）とも称されるタンパク質ＣＴＬＡ‐４をコードする遺伝子（完全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を指す。一実施形態において、ＣＴＬＡ‐４遺伝子は、これに限定されないが、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１０３７６３１．２、ＮＭ＿００５２１４．４、ＮＧ＿０１１５０２．１などとして表現されるＣＴＬＡ‐４遺伝子など、ヒトＣＴＬＡ‐４をコードする遺伝子（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１０３２７２０．１、ＮＰ＿００５２０５．２など）といった遺伝子から成る群から選択される１または複数であり得る。
免疫細胞活性調節遺伝子はＣＢＬＢであり得る。
免疫細胞活性調節遺伝子はＰＳＧＬ‐１であり得る。
免疫細胞活性調節遺伝子はＩＬＴ２であり得る。
免疫細胞活性調節遺伝子はＫＩＲ２ＤＬ４であり得る。
免疫細胞活性調節遺伝子はＳＨＰ‐１であり得る。
上記の遺伝子は、霊長動物（例えば、ヒト、サルなど）、齧歯動物（例えば、ラット、マウスなど）を含む哺乳動物に由来し得る。
遺伝情報は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋなど、既知のデータベースから取得できる。
一実施形態において、免疫細胞活性調節遺伝子は、免疫応答を刺激するように機能し得る。
免疫細胞活性調節遺伝子は免疫細胞増殖調節遺伝子であり得る。
「免疫細胞増殖調節遺伝子」という用語は、免疫細胞におけるタンパク質合成を調節することなどによって、免疫細胞の増殖を調節するように機能する遺伝子、例えば、免疫細胞の増殖を刺激または抑制する遺伝子を指す。この場合、免疫細胞増殖調節遺伝子は、免疫細胞増殖調節遺伝子自体、または、免疫細胞増殖調節遺伝子から発現されるタンパク質で、免疫細胞におけるタンパク質合成を制御することによって、免疫細胞の増殖を制御する機能を実行し得る。
免疫細胞増殖調節遺伝子は、ＤＮＡ転写、ＲＮＡ翻訳、および、細胞分化において機能し得る。
免疫細胞増殖調節遺伝子の例は、ＮＦＡＴ、ＩκＢ／ＮＦ‐κＢ、ＡＰ‐１、４Ｅ‐ＢＰ１、ｅＩＦ４Ｅ、Ｓ６の発現経路に関与する遺伝子であり得る。
例えば、
免疫細胞増殖調節遺伝子はＤＧＫ‐アルファであり得る。
ＤＧＫＡ（Ｄｇｋ‐アルファ）遺伝子は、タンパク質ジアシルグリセロールキナーゼアルファ（ＤＧＫＡ）をコードする遺伝子（完全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を指す。一実施形態において、ＤＧＫＡ遺伝子は、これに限定されないが、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１３４５．４、ＮＭ＿２０１４４４．２、ＮＭ＿２０１４４５．１、ＮＭ＿２０１５５４．１、ＮＣ＿００００１２．１２などとして表現されるＤＧＫＡ遺伝子など、ヒトＤＧＫＡをコードする遺伝子（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１３３６．２、ＮＰ＿９５８８５２．１、ＮＰ＿９５８８５３．１、ＮＰ＿９６３８４８．１など）といった遺伝子から成る群から選択される１または複数であり得る。
免疫細胞増殖調節遺伝子はＤＧＫ‐ゼータであり得る。
ＤＧＫＺ（Ｄｇｋ‐ゼータ）遺伝子は、タンパク質ジアシルグリセロールキナーゼゼータ（ＤＧＫＺ）をコードする遺伝子（完全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を指す。一実施形態において、ＤＧＫＺ遺伝子は、これに限定されないが、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１１０５５４０．１、ＮＭ＿００１１９９２６６．１、ＮＭ＿００１１９９２６７．１、ＮＭ＿００１１９９２６８．１、ＮＭ＿００３６４６．３、ＮＭ＿２０１５３２．２、ＮＭ＿２０１５３３．３、ＮＧ＿０４７０９２．１などとして表現されるＤＧＫＺ遺伝子など、ヒトＤＧＫＺをコードする遺伝子（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１０９９０１０．１、ＮＰ＿００１１８６１９５．１、ＮＰ＿００１１８６１９６．１、ＮＰ＿００１１８６１９７．１、ＮＰ＿００３６３７．２、ＮＰ＿９６３２９０．１、ＮＰ＿９６３２９１．２など）といった遺伝子から成る群から選択される１または複数であり得る。
免疫細胞増殖調節遺伝子はＥＧＲ２であり得る。
ＥＧＲ２遺伝子は、初期増殖応答タンパク質２（ＥＧＲ２）をコードする遺伝子（完全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を指す。一実施形態において、ＥＧＲ２遺伝子は、これらに限定されないが、ヒトＥＧＲ２（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０００３９０、ＮＰ＿００１１２９６４９、ＮＰ＿００１１２９６５０、ＮＰ＿００１１２９６５１、ＮＰ＿００１３０７９６６など）をコードする遺伝子から成る群から選択される１または複数であり得る。例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００３９９、ＮＭ＿００１１３６１７７、ＮＭ＿００１１３６１７８、ＮＭ＿００１１３６１７９、ＮＭ＿００１３２１０３７として表現されるＥＧＲ２遺伝子。
免疫細胞増殖調節遺伝子はＥＧＲ３であり得る。
免疫細胞増殖調節遺伝子はＰＰＰ２ｒ２ｄであり得る。
免疫細胞増殖調節遺伝子はＡ２０（ＴＮＦＡＩＰ３）であり得る。
上記の遺伝子は、霊長動物（例えば、ヒト、サルなど）、齧歯動物（例えば、ラット、マウスなど）を含む哺乳動物に由来し得る。
遺伝情報は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋなど、既知のデータベースから取得できる。
一実施形態において、免疫細胞活性調節遺伝子は免疫細胞死調節遺伝子であり得る。
「免疫細胞死調節遺伝子」という用語は、免疫細胞の死に関連して機能する、例えば、免疫細胞の死を刺激または抑制する遺伝子を指す。ここで、免疫細胞死調節遺伝子は、免疫細胞死調節遺伝子自体、または、免疫細胞死調節遺伝子から発現されるタンパク質によって、免疫細胞の死を制御する機能を実行し得る。
免疫細胞死調節遺伝子は、免疫細胞のアポトーシスまたは壊死に関連する機能を実行し得る。
例えば、免疫細胞死調節遺伝子は、カスパーゼカスケード関連遺伝子であり得る。
この場合、免疫細胞死調節要素はＦａｓであり得る。以下で当該遺伝子に言及するとき、当業者にとって、遺伝子が作用する受容体または結合部分を操作できることは明らかである。
免疫細胞死調節遺伝子は、細胞死ドメイン関連遺伝子であり得る。
ここで、免疫細胞死調節遺伝子はＤａｘｘであり得る。
免疫細胞死調節遺伝子は、Ｂｃｌ‐２ファミリー遺伝子であり得る。
免疫細胞死調節遺伝子は、ＢＨ３だけのファミリー遺伝子であり得る。
免疫細胞死調節遺伝子はＢｉｍであり得る。
免疫細胞死調節遺伝子はＢｉｄであり得る。
免疫細胞死調節遺伝子はＢＡＤであり得る。
免疫細胞死調節遺伝子は、免疫細胞外膜に位置するリガンドまたは受容体をコードする遺伝子であり得る。
ここで、免疫細胞死調節遺伝子は、ＰＤ‐１であり得る。
追加的に、免疫細胞死調節遺伝子は、ＣＴＬＡ‐４であり得る。
上記の遺伝子は、霊長動物（例えば、ヒト、サルなど）、齧歯動物（例えば、ラット、マウスなど）を含む哺乳動物に由来し得る。
遺伝情報は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋなど、既知のデータベースから取得できる。
一実施形態において、免疫細胞活性調節遺伝子は免疫細胞疲弊調節遺伝子であり得る。
「免疫細胞疲弊調節遺伝子」という用語は、免疫細胞の機能の進行性消失に関連する機能を実行する遺伝子であり、ここで、免疫細胞疲弊調節遺伝子は、免疫細胞疲弊調節遺伝子自体、または、免疫細胞疲弊調節遺伝子から発現されるタンパク質によって、免疫細胞の機能の進行性消失を制御する機能を実行し得る。
免疫細胞疲弊調節遺伝子は、免疫細胞の不活性化に関与する遺伝子の転写または翻訳を助けるように機能し得る。
ここで、転写を補助する機能は、対応する遺伝子を脱メチル化する機能であり得る。
追加的に、免疫細胞の不活性化に関与する遺伝子は、免疫細胞活性調節遺伝子を含む。
例えば、免疫細胞疲弊調節遺伝子はＴＥＴ２であり得る。
ＴＥＴ２遺伝子とは、ＴＥＴ２（Ｔｅｔ ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ２）をコードする遺伝子（完全長ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を指す。一実施形態において、ＴＥＴ２遺伝子は、これらに限定されないが、ヒトＴＥＴ２（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１１２０６８０．１、ＮＰ＿０６００９８．３）をコードする遺伝子（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１１２７２０８．２、ＮＭ＿０１７６２８．４、ＮＧ＿０２８１９１．１などとして表現されるＴＥＴ２遺伝子）から成る群から選択される１または複数であり得る。
免疫細胞疲弊調節遺伝子は、免疫細胞の過剰増殖に関与するように機能し得る。ここで、過剰増殖を経て再生しない免疫細胞は、その機能を失う。
ここで、免疫細胞疲弊調節遺伝子はＷｎｔであり得る。
追加的に、免疫細胞疲弊調節遺伝子はＡｋｔであり得る。
上記の遺伝子は、霊長動物（例えば、ヒト、サルなど）、齧歯動物（例えば、ラット、マウスなど）を含む哺乳動物に由来し得る。
遺伝情報は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋなど、既知のデータベースから取得できる。
別の実施形態において、免疫細胞活性調節要素はサイトカイン産生調節遺伝子であり得る。
「サイトカイン産生調節遺伝子」という用語は、そのような機能を実行する免疫細胞から発現される、免疫細胞のサイトカインの分泌に関与する要素であり、ここで、サイトカイン産生調節遺伝子は、サイトカイン産生調節遺伝子自体、または、サイトカイン産生調節遺伝子から発現されるタンパク質によって、免疫細胞のサイトカインの産生を制御する機能を実行し得る。
サイトカインとは、免疫細胞によって分泌されるタンパク質を指す総称であり、ｉｎ ｖｉｖｏで重要な役割を果たすシグナルタンパク質である。サイトカインは、感染、免疫、炎症、外傷、腐敗、癌などに関与する。サイトカインは細胞から分泌され、次いで、他の細胞またはそれらを分泌する細胞に影響を与えることができる。例えば、マクロファージの増殖を誘導でき、または、分泌細胞自体の分化を促進できる。しかしながら、過剰な量のサイトカインが分泌されるとき、正常細胞を攻撃するなどの問題を引き起こし得るので、サイトカインの適切な分泌も免疫応答において重要である。
サイトカイン産生調節遺伝子は、例えば、好ましくは、ＴＴＮＦα、ＩＦＮ‐γ、ＴＧＦ‐β、ＩＬ‐２、ＩＬ‐４、ＩＬ‐１０、ＩＬ‐１３、ＩＬ‐１、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１２、およびＩＦＮ‐α分泌の経路における遺伝子であり得る。
代替的に、サイトカインは他の免疫細胞にシグナルを伝達することにより、認識された抗原を有する細胞を傷害するように免疫細胞を誘導する、または、分化を支援するように機能し得る。この場合、サイトカイン産生調節遺伝子は、好ましくは、ＩＬ‐２分泌に関連する遺伝子経路における遺伝子であり得る。
上記の遺伝子は、霊長動物（例えば、ヒト、サルなど）、齧歯動物（例えば、ラット、マウスなど）を含む哺乳動物に由来し得る。
遺伝情報は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋなど、既知のデータベースから取得できる。
一実施形態において、本明細書によって開示される免疫調節遺伝子は、免疫細胞活性調節遺伝子であり得る。
免疫調節遺伝子は、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子および／またはＫＤＭ６Ａ遺伝子であり得る。
本明細書によって開示される内容の一実施形態において、ガイド核酸は、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子、および／またはＫＤＭ６Ａ遺伝子の標的配列に相補的に結合するｇＲＮＡであり得る。
「標的配列」という用語は、標的遺伝子または標的核酸におけるヌクレオチド配列、具体的には、標的遺伝子または標的核酸における標的領域のヌクレオチド配列の一部を指し、「標的領域」は、ガイド核酸エディタータンパク質によって改変できる標的遺伝子または標的核酸における領域である。
本明細書によって開示される標的遺伝子は、免疫調節遺伝子であり得る。
本明細書によって開示される標的遺伝子は、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子および／またはＫＤＭ６Ａ遺伝子であり得る。
以下で、「標的配列」という用語は、両方のヌクレオチド配列情報を指し得る。例えば、標的遺伝子については、標的配列は、標的遺伝子ＤＮＡの転写鎖配列情報、または、非転写鎖のヌクレオチド配列情報を指し得る。
例えば、標的配列は、標的遺伝子Ａの標的領域におけるヌクレオチド配列（転写鎖）の一部、５'‐ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ‐３'、または、それに相補的なヌクレオチド配列（非転写鎖）、５'‐ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ‐３'を指し得る。
標的配列は、５～５０のヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、標的配列は、１６ｂｐ、１７ｂｐ、１８ｂｐ、１９ｂｐ、２０ｂｐ、２１ｂｐ、２２ｂｐ、２３ｂｐ、２４ｂｐまたは２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
標的配列は、ガイド核酸結合配列またはガイド核酸非結合配列を含む。
「ガイド核酸結合配列」という用語は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列との相補結合を形成し得る、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列と部分的または完全な相補性を有するヌクレオチド配列を指す。標的配列およびガイド核酸結合配列は、標的遺伝子または標的核酸、すなわち、遺伝子操作または修正の対象に応じて変化し得るヌクレオチド配列であり、標的遺伝子または標的核酸に従って、様々な形式で設計され得る。
「ガイド核酸非結合配列」という用語は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列と相補結合を形成できないガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列との部分的相同性または完全相同性を有するヌクレオチド配列を指す。追加的に、ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸結合配列に相補的なヌクレオチド配列であり、ガイド核酸結合配列と相補結合を形成し得る。
ガイド核酸結合配列は、標的配列におけるヌクレオチド配列の一部であり、標的配列の異なる配列順序を有する２つのヌクレオチド配列、すなわち、相補結合を形成し得る２つのヌクレオチド配列のいずれか１つであり得る。ここで、ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸結合配列以外の標的配列のヌクレオチド配列であり得る。
例えば、標的遺伝子Ａの標的領域におけるヌクレオチド配列の一部、５'‐ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ‐３'、および、それに相補的なヌクレオチド配列、５'‐ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ‐３'が標的配列であるとき、ガイド核酸結合配列は、２つの標的配列、すなわち、５'‐ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ‐３'または５'‐ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ‐３'のいずれか１つであり得る。ここで、ガイド核酸結合配列が５'‐ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ‐３'であるとき、ガイド核酸非結合配列は、５'‐ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ‐３'であり得る、または、ガイド核酸結合配列が５'‐ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ‐３'であるとき、ガイド核酸非結合配列は、５'‐ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ‐３'であり得る。
ガイド核酸結合配列は、標的配列、すなわち転写鎖に相同なヌクレオチド配列、および、非転写鎖に相同なヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列であり得る。ここで、ガイド核酸非結合配列は、標的配列、すなわち転写鎖におけるガイド核酸結合配列に相同なヌクレオチド配列、および、非転写鎖に相同なヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列であり得る。
ガイド核酸結合配列は、標的配列と同一の長さを有し得る。
ガイド核酸非結合配列は、標的配列またはガイド核酸結合配列と同一の長さを有し得る。
ガイド核酸結合配列は、５～５０のヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、ガイド核酸結合配列は、１６ｂｐ、１７ｂｐ、１８ｂｐ、１９ｂｐ、２０ｂｐ、２１ｂｐ、２２ｂｐ、２３ｂｐ、２４ｂｐ、または、２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
ガイド核酸非結合配列は、５ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、ガイド核酸非結合配列は、１６ｂｐ、１７ｂｐ、１８ｂｐ、１９ｂｐ、２０ｂｐ、２１ｂｐ、２２ｂｐ、２３ｂｐ、２４ｂｐ、または、２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
ガイド核酸結合配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列との部分的または完全な相補結合を形成し得て、ガイド核酸結合配列の長さはガイド配列と同一であり得る。
ガイド核酸結合配列は、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相補性または完全相補性を有するガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列に相補的なヌクレオチド配列であり得る。
一例において、ガイド核酸結合配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列に相補的でない１ｂｐ～８ｂｐのヌクレオチド配列を有する、または、含み得る。
ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列との部分的または完全相同性を有し得て、ガイド核酸非結合配列の長さは、ガイド配列と同一であり得る。
ガイド核酸非結合配列は、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または、９５％以上の相同性、または、完全相同性を有するガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列との相同性を有するヌクレオチド配列であり得る。
一例において、ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列に相補的でない１ｂｐ～８ｂｐのヌクレオチド配列を有する、または、含み得る。
ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸結合配列との相補結合を形成し得て、ガイド核酸非結合配列の長さは、ガイド核酸結合配列と同一であり得る。
ガイド核酸非結合配列は、例えば、少なくとも９０％、または、９５％以上の相補性または完全相補性を有するガイド核酸結合配列に相補的なヌクレオチド配列であり得る。
一例において、ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸結合配列に相補的でない１ｂｐから２ｂｐのヌクレオチド配列を有する、または、含み得る。
追加的に、ガイド核酸結合配列は、エディタータンパク質によって認識可能なヌクレオチド配列の近くに位置するヌクレオチド配列であり得る。
一例において、ガイド核酸結合配列は、エディタータンパク質によって認識可能なヌクレオチド配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、本明細書によって開示される標的配列は、免疫調節遺伝子のプロモーター領域に位置する連続の１０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
ここで、標的配列は、１０ｂｐ～３５ｂｐ、１５ｂｐ～３５ｂｐ、２０ｂｐ～３５ｂｐ、２５ｂｐ～３５ｂｐ、または、３０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
代替的に、標的配列は、１０ｂｐ～１５ｂｐ、１５ｂｐ～２０ｂｐ、２０ｂｐ～２５ｂｐ、２５ｂｐ～３０ｂｐまたは３０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＰＤ‐１遺伝子のプロモーター領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＣＴＬＡ‐４遺伝子のプロモーター領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、Ａ２０遺伝子のプロモーター領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＤＧＫＡ遺伝子のプロモーター領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＤＧＫＺ遺伝子のプロモーター領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＦＡＳ遺伝子のプロモーター領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＥＧＲ２遺伝子のプロモーター領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子のプロモーター領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＴＥＴ２遺伝子のプロモーター領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＰＳＧＬ‐１遺伝子のプロモーター領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の例において、標的配列は、ＫＤＭ６Ａ遺伝子のプロモーター領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
本明細書によって開示される標的配列は、免疫調節遺伝子のイントロン領域に位置する連続の１０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
ここで、標的配列は、１０ｂｐ～３５ｂｐ、１５ｂｐ～３５ｂｐ、２０ｂｐ～３５ｂｐ、２５ｂｐ～３５ｂｐ、または、３０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
代替的に、標的配列は、１０ｂｐ～１５ｂｐ、１５ｂｐ～２０ｂｐ、２０ｂｐ～２５ｂｐ、２５ｂｐ～３０ｂｐまたは３０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＰＤ‐１遺伝子のイントロン領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＣＴＬＡ‐４遺伝子のイントロン領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、Ａ２０遺伝子のイントロン領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＤＧＫＡ遺伝子のイントロン領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＤＧＫＺ遺伝子のイントロン領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＦＡＳ遺伝子のイントロン領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＥＧＲ２遺伝子のイントロン領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子のイントロン領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＴＥＴ２遺伝子のイントロン領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＰＳＧＬ‐１遺伝子のイントロン領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の例において、標的配列は、ＫＤＭ６Ａ遺伝子のイントロン領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
本明細書によって開示される標的配列は、免疫調節遺伝子のエクソン領域に位置する連続の１０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
ここで、標的配列は、１０ｂｐ～３５ｂｐ、１５ｂｐ～３５ｂｐ、２０ｂｐ～３５ｂｐ、２５ｂｐ～３５ｂｐ、または、３０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
代替的に、標的配列は、１０ｂｐ～１５ｂｐ、１５ｂｐ～２０ｂｐ、２０ｂｐ～２５ｂｐ、２５ｂｐ～３０ｂｐまたは３０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＰＤ‐１遺伝子のエクソン領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＣＴＬＡ‐４遺伝子のエクソン領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、Ａ２０遺伝子のエクソン領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＤＧＫＡ遺伝子のエクソン領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＤＧＫＺ遺伝子のエクソン領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＦＡＳ遺伝子のエクソン領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＥＧＲ２遺伝子のエクソン領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子のエクソン領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＴＥＴ２遺伝子のエクソン領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＰＳＧＬ‐１遺伝子のエクソン領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の例において、標的配列は、ＫＤＭ６Ａ遺伝子のエクソン領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
本明細書によって開示される標的配列は、免疫調節遺伝子のエンハンサー領域に位置する連続の１０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
ここで、標的配列は、１０ｂｐ～３５ｂｐ、１５ｂｐ～３５ｂｐ、２０ｂｐ～３５ｂｐ、２５ｂｐ～３５ｂｐ、または、３０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
代替的に、標的配列は、１０ｂｐ～１５ｂｐ、１５ｂｐ～２０ｂｐ、２０ｂｐ～２５ｂｐ、２５ｂｐ～３０ｂｐまたは３０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＰＤ‐１遺伝子のエンハンサー領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＣＴＬＡ‐４遺伝子のエンハンサー領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、Ａ２０遺伝子のエンハンサー領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＤＧＫＡ遺伝子のエンハンサー領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＤＧＫＺ遺伝子のエンハンサー領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＦＡＳ遺伝子のエンハンサー領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＥＧＲ２遺伝子のエンハンサー領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子のエンハンサー領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＴＥＴ２遺伝子のエンハンサー領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＰＳＧＬ‐１遺伝子のエンハンサー領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の例において、標的配列は、ＫＤＭ６Ａ遺伝子のエンハンサー領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
本明細書によって開示される標的配列は、免疫調節遺伝子のコード領域、非コード領域、または、それらが組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
ここで、標的配列は、１０ｂｐ～３５ｂｐ、１５ｂｐ～３５ｂｐ、２０ｂｐ～３５ｂｐ、２５ｂｐ～３５ｂｐ、または、３０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
代替的に、標的配列は、１０ｂｐ～１５ｂｐ、１５ｂｐ～２０ｂｐ、２０ｂｐ～２５ｂｐ、２５ｂｐ～３０ｂｐまたは３０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＰＤ‐１遺伝子のコード領域、非コード領域、または、それらが組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＣＴＬＡ‐４遺伝子のコード領域、非コード領域、または、それらが組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、Ａ２０遺伝子のコード領域、非コード領域、または、それらが組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＤＧＫＡ遺伝子のコード領域、非コード領域、または、それらが組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＤＧＫＺ遺伝子のコード領域、非コード領域、または、それらが組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＦＡＳ遺伝子のコード領域、非コード領域、または、それらが組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＥＧＲ２遺伝子のコード領域、非コード領域、または、それらが組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子のコード領域、非コード領域、または、それらが組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＴＥＴ２遺伝子のコード領域、非コード領域、または、それらが組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＰＳＧＬ‐１遺伝子のコード領域、非コード領域、または、それらが組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の例において、標的配列は、ＫＤＭ６Ａ遺伝子のコード領域、非コード領域、または、それらが組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
本明細書によって開示される標的配列は、免疫調節遺伝子のプロモーター、エンハンサー、３'‐ＵＴＲ、５'‐ＵＴＲ、ポリＡ、または、それらの組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
ここで、標的配列は、１０ｂｐ～３５ｂｐ、１５ｂｐ～３５ｂｐ、２０ｂｐ～３５ｂｐ、２５ｂｐ～３５ｂｐ、または、３０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
代替的に、標的配列は、１０ｂｐ～１５ｂｐ、１５ｂｐ～２０ｂｐ、２０ｂｐ～２５ｂｐ、２５ｂｐ～３０ｂｐまたは３０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＰＤ‐１遺伝子のプロモーター、エンハンサー、３'‐ＵＴＲ、５'‐ＵＴＲ、ポリＡ、または、それらの組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＣＴＬＡ‐４遺伝子のプロモーター、エンハンサー、３'‐ＵＴＲ、５'‐ＵＴＲ、ポリＡ、または、それらの組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、Ａ２０遺伝子のプロモーター、エンハンサー、３'‐ＵＴＲ、５'‐ＵＴＲ、ポリＡ、または、それらの組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＤＧＫＡ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、３'‐ＵＴＲ、５'‐ＵＴＲ、ポリＡ、または、それらの組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＤＧＫＺ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、３'‐ＵＴＲ、５'‐ＵＴＲ、ポリＡ、または、それらの組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＦＡＳ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、３'‐ＵＴＲ、５'‐ＵＴＲ、ポリＡ、または、それらの組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＥＧＲ２遺伝子のプロモーター、エンハンサー、３'‐ＵＴＲ、５'‐ＵＴＲ、ポリＡ、または、それらの組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、３'‐ＵＴＲ、５'‐ＵＴＲ、ポリＡ、または、それらの組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＴＥＴ２遺伝子のプロモーター、エンハンサー、３'‐ＵＴＲ、５'‐ＵＴＲ、ポリＡ、または、それらの組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＰＳＧＬ‐１遺伝子のプロモーター、エンハンサー、３'‐ＵＴＲ、５'‐ＵＴＲ、ポリＡ、または、それらの組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の例において、標的配列は、ＫＤＭ６Ａ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、３'‐ＵＴＲ、５'‐ＵＴＲ、ポリＡ、または、それらの組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
本明細書によって開示される標的配列は、免疫調節遺伝子のエクソン、イントロン、または、それらが組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
ここで、標的配列は、１０ｂｐ～３５ｂｐ、１５ｂｐ～３５ｂｐ、２０ｂｐ～３５ｂｐ、２５ｂｐ～３５ｂｐ、または、３０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
代替的に、標的配列は、１０ｂｐ～１５ｂｐ、１５ｂｐ～２０ｂｐ、２０ｂｐ～２５ｂｐ、２５ｂｐ～３０ｂｐまたは３０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＰＤ‐１遺伝子のエクソン、イントロン、または、それらが組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＣＴＬＡ‐４遺伝子のエクソン、イントロン、または、それらが組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、Ａ２０遺伝子のエクソン、イントロン、または、それらが組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＤＧＫＡ遺伝子のエクソン、イントロン、または、それらが組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＤＧＫＺ遺伝子のエクソン、イントロン、または、それらが組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＦＡＳ遺伝子のエクソン、イントロン、または、それらが組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＥＧＲ２遺伝子のエクソン、イントロン、または、それらが組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子のエクソン、イントロン、または、それらが組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＴＥＴ２遺伝子のエクソン、イントロン、または、それらが組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＰＳＧＬ‐１遺伝子のエクソン、イントロン、または、それらが組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の例において、標的配列は、ＫＤＭ６Ａ遺伝子のエクソン、イントロン、または、それらが組み合わされた領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
本明細書によって開示される標的配列は、免疫調節遺伝子の変異領域（例えば、野性型遺伝子と異なる領域）を含む、または、それに隣接する連続の１０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
ここで、標的配列は、１０ｂｐ～３５ｂｐ、１５ｂｐ～３５ｂｐ、２０ｂｐ～３５ｂｐ、２５ｂｐ～３５ｂｐ、または、３０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
代替的に、標的配列は、１０ｂｐ～１５ｂｐ、１５ｂｐ～２０ｂｐ、２０ｂｐ～２５ｂｐ、２５ｂｐ～３０ｂｐまたは３０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＰＤ‐１遺伝子の変異領域（例えば、野性型遺伝子と異なる領域）を含む、または、それに隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＣＴＬＡ‐４遺伝子の変異領域（例えば、野性型遺伝子と異なる領域）を含む、または、それに隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、Ａ２０遺伝子の変異領域（例えば、野性型遺伝子と異なる領域）を含む、または、それに隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＤＧＫＡ遺伝子の変異領域（例えば、野性型遺伝子と異なる領域）を含む、または、それに隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＤＧＫＺ遺伝子の変異領域（例えば、野性型遺伝子と異なる領域）を含む、または、それに隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＦＡＳ遺伝子の変異領域（例えば、野性型遺伝子と異なる領域）を含む、または、それに隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＥＧＲ２遺伝子の変異領域（例えば、野性型遺伝子と異なる領域）を含む、または、それに隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子の変異領域（例えば、野性型遺伝子と異なる領域）を含む、または、それに隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＴＥＴ２遺伝子の変異領域（例えば、野性型遺伝子と異なる領域）を含む、または、それに隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＰＳＧＬ‐１遺伝子の変異領域（例えば、野性型遺伝子と異なる領域）を含む、または、それに隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の例において、標的配列は、ＫＤＭ６Ａ遺伝子の変異領域（例えば、野性型遺伝子と異なる領域）を含む、または、それに隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
本明細書によって開示される標的配列は、免疫調節遺伝子の核酸配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
「プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列」という用語は、エディタータンパク質が認識できるヌクレオチド配列である。ここで、ＰＡＭ配列は、エディタータンパク質の種類、および、由来する種に従って変動するヌクレオチド配列を有し得る。
ここで、ＰＡＭ配列は、例えば、以下の配列の１または複数であり得る（５'から３'の方向で記載する）。
ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）
ＮＮＮＮＲＹＡＣ（Ｎは各々独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）
ＮＮＡＧＡＡＷ（Ｎは各々独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＷはＡまたはＴである）
ＮＮＮＮＧＡＴＴ（Ｎは各々独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）
ＮＮＧＲＲ（Ｔ）（Ｎは各々独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）
ＴＴＮ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）
ここで、標的配列は、１０ｂｐ～３５ｂｐ、１５ｂｐ～３５ｂｐ、２０ｂｐ～３５ｂｐ、２５ｂｐ～３５ｂｐ、または、３０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
代替的に、標的配列は、１０ｂｐ～１５ｂｐ、１５ｂｐ～２０ｂｐ、２０ｂｐ～２５ｂｐ、２５ｂｐ～３０ｂｐまたは３０ｂｐ～３５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＰＤ‐１遺伝子の核酸配列におけるＰＡＭ配列の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'および／または５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＰＤ‐１遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'および／または５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が、５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'、または／および５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＰＤ‐１遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'または／および５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が、５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＰＤ‐１遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ；Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｙ＝ＣもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＰＤ‐１遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ；Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｙ＝ＣもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧまたはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されたＰＡＭ配列が５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＰＤ‐１遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'または／および５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＰＤ‐１遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'または／および５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＰＤ‐１遺伝子の核酸配列における５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する１０～２５の連続のヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＣＴＬＡ‐４遺伝子の核酸配列におけるＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'および／または５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＣＴＬＡ‐４遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'および／または５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が、５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'、または／および５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＣＴＬＡ‐４遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'または／および５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が、５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＣＴＬＡ‐４遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ；Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｙ＝ＣもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＣＴＬＡ‐４遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ；Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｙ＝ＣもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧまたはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されたＰＡＭ配列が５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＣＴＬＡ‐４遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'または／および５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＣＴＬＡ‐４遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'または／および５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＣＴＬＡ‐４遺伝子の核酸配列における５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、Ａ２０遺伝子の核酸配列におけるＰＡＭ配列の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'および／または５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、Ａ２０遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'および／または５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が、５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'、または／および５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、Ａ２０遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'または／および５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が、５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、Ａ２０遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ；Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｙ＝ＣもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、Ａ２０遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ；Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｙ＝ＣもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧまたはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されたＰＡＭ配列が５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、Ａ２０遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'または／および５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、Ａ２０遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'または／および５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、Ａ２０遺伝子の核酸配列における５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＤＧＫＡ遺伝子の核酸配列におけるＰＡＭ配列の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'または／および５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＤＧＫＡ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'または／および５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が、５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'、または／および５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＤＧＫＡ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'または／および５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が、５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＤＧＫＡ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ；Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｙ＝ＣもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＤＧＫＡ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ；Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｙ＝ＣもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧまたはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されたＰＡＭ配列が５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＤＧＫＡ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'または／および５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＤＧＫＡ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'または／および５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＤＧＫＡ遺伝子の核酸配列における５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＤＧＫＺ遺伝子のヌクレオチド配列におけるＰＡＭ配列の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'または／および５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＤＧＫＺ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'または／および５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が、５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'、または／および５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＤＧＫＺ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'または／および５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が、５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＤＧＫＺ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ；Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｙ＝ＣもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＤＧＫＺ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ；Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｙ＝ＣもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧまたはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されたＰＡＭ配列が５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＤＧＫＺ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'または／および５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＤＧＫＺ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'または／および５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＤＧＫＺ遺伝子の核酸配列における５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＦＡＳ遺伝子のヌクレオチド配列におけるＰＡＭ配列の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'または／および５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＦＡＳ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'または／および５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が、５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'、または／および５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＦＡＳ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'または／および５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が、５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＦＡＳ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ；Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｙ＝ＣもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＦＡＳ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ；Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｙ＝ＣもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧまたはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されたＰＡＭ配列が５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＦＡＳ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'または／および５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＦＡＳ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'または／および５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＦＡＳ遺伝子の核酸配列における５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＥＧＲ２遺伝子の核酸配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'または／および５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＥＧＲ２遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'または／および５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が、５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'、または／および５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＥＧＲ２遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'または／および５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が、５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＥＧＲ２遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ；Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｙ＝ＣもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＥＧＲ２遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ；Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｙ＝ＣもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧまたはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されたＰＡＭ配列が５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＥＧＲ２遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'または／および５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＥＧＲ２遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'または／および５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＥＧＲ２遺伝子の核酸配列における５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子のヌクレオチド配列におけるＰＡＭ配列の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'または／および５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'または／および５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が、５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'、または／および５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'または／および５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が、５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ；Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｙ＝ＣもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ；Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｙ＝ＣもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧまたはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されたＰＡＭ配列が５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'または／および５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'または／および５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子の核酸配列における５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一例において、標的配列は、ＴＥＴ２遺伝子の核酸配列におけるＰＡＭ配列の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'または／および５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＴＥＴ２遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'または／および５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が、５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'、または／および５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＴＥＴ２遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'または／および５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が、５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＴＥＴ２遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ；Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｙ＝ＣもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＴＥＴ２遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ；Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｙ＝ＣもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧまたはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されたＰＡＭ配列が５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＴＥＴ２遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'または／および５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＴＥＴ２遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'または／および５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＴＥＴ２遺伝子の核酸配列における５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の例において、標的配列は、ＰＳＧＬ‐１遺伝子の核酸配列におけるＰＡＭ配列の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'または／および５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＰＳＧＬ‐１遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'または／および５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が、５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'、５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＰＳＧＬ‐１遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'、５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が、５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＰＳＧＬ‐１遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ；Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｙ＝ＣもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＰＳＧＬ‐１遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ；Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｙ＝ＣもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧまたはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されたＰＡＭ配列が５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＰＳＧＬ‐１遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'または／および５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＰＳＧＬ‐１遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'または／および５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＰＳＧＬ‐１遺伝子の核酸配列における５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の例において、標的配列は、ＫＤＭ６Ａ遺伝子の核酸配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'および／または５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＫＤＭ６Ａ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'および／または５'‐ＮＧＡ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が、５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'、または／および５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＫＤＭ６Ａ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'または／および５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が、５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＫＤＭ６Ａ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ；Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｙ＝ＣもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧまたはＣ）であるとき、標的配列は、ＫＤＭ６Ａ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ；Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｙ＝ＣもしくはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧまたはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されたＰＡＭ配列が５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＫＤＭ６Ａ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＡＡＲ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
更に別の実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'または／および５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＫＤＭ６Ａ遺伝子の核酸配列における５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'または／および５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（Ｒ＝ＡもしくはＧ、Ｖ＝Ｇ、ＣもしくはＡ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＫＤＭ６Ａ遺伝子の核酸配列における５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣ；または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端または／および３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
以下では、本発明の一実施形態において使用され得る標的配列の例をテーブルで示し、テーブルにおいて記載あれる標的配列はガイド核酸非結合配列である。相補的配列、すなわち、ガイド核酸結合配列は、記載された配列を介して予想できる。
［テーブル１］
免疫調節遺伝子の標的配列
Figure 0007235391000001
Figure 0007235391000002
Figure 0007235391000003
Figure 0007235391000004
Figure 0007235391000005
Figure 0007235391000006
Figure 0007235391000007
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 本明細書によって開示される内容の態様は、免疫調節遺伝子を人工的に操作するための遺伝子操作用組成物に関する。
遺伝子操作用組成物は、人工的に改変された免疫調節遺伝子を産生するために使用され得る。追加的に、遺伝子操作の組成物によって人工的に改変された免疫調節遺伝子は、免疫系を調節し得る。
「人工的に改変または設計された、または、人工的設計された」という用語は、天然状態に生じるそのままの状態でなく、人工的改変が適用された状態を指す。以下では、人工的に改変または設計された非天然の免疫調節遺伝子が、人工的な免疫調節遺伝子と交換可能に使用され得る。
本発明の「免疫系」とは、操作された免疫調節因子の機能の変化によってｉｎ ｖｉｖｏ免疫応答に影響する（すなわち、新規の免疫効果を発揮する機構に関与する）すべての現象を含む用語であり、そのような免疫系に直接的または間接的に関与するすべての物質、組成物、方法、用途を含む。例えば、自然免疫、適応免疫、細胞性免疫、体液性免疫、能動免疫、受動免疫応答に関与する、すべての遺伝子、免疫細胞、免疫器官／組織を含む。
本明細書によって開示される遺伝子操作用組成物は、ガイド核酸およびエディタータンパク質を含み得る。
遺伝子操作用組成物は、以下を含み得る。
（ａ）免疫調節遺伝子の標的配列と相補結合を形成し得るガイド核酸、または、それをコードする核酸配列
（ｂ）１または複数のエディタータンパク質、または、それをコードする核酸配列
上の免疫調節遺伝子についての説明は上に記載した。
上の標的配列についての説明は、上に記載した通りである。
遺伝子操作用組成物は、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体を含み得る。
「ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体」という用語は、ガイド核酸およびエディタータンパク質の間の相互作用によって形成される複合体を指す。
上のガイド核酸についての説明は上に記載した通りである。
「エディタータンパク質」は、直接結合するかどうかに関係なく、直接的に核酸に結合する、または、それと相互作用することが可能なペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。
この場合、核酸は、標的核酸、遺伝子または染色体に含まれる核酸であり得る。ここで、核酸はガイド核酸であり得る。
エディタータンパク質は酵素であり得る。
ここで、「酵素」という用語は、核酸、遺伝子または染色体を切断可能なドメインを含むポリペプチドまたはタンパク質を指す。
酵素はヌクレアーゼまたは制限酵素であり得る。
エディタータンパク質は完全活性酵素を含み得る。
ここで、「完全活性酵素」は、核酸、遺伝子または染色体を切断する野性型酵素の元の機能と同一の機能を有する酵素を指す。例えば、ＤＮＡの二本鎖を切断する野性型酵素は、ＤＮＡの二本鎖全部を切断する完全活性酵素であり得る。別の例において、ＤＮＡの二本鎖を切断する野性型酵素のアミノ酸配列の一部が、人工的改変によって欠失または置換されるとき、人工的に改変された酵素変異体が野性型酵素と同様にＤＮＡの二本鎖を切断する場合、人工的に改変された酵素変異体は、完全活性酵素であり得る。
追加的に、完全活性酵素は、野性型酵素の機能と比較して改善された機能を有する酵素を含み得る。例えば、ＤＮＡの二本鎖を切断する野性型酵素の特異的に改変または設計された形式は、野性型酵素と比較して改善された完全酵素活性、すなわち、ＤＮＡの二本鎖を切断する改善された活性を有し得る。
エディタータンパク質は、不完全または部分的な活性酵素を含み得る。
ここで、「不完全または部分的な活性酵素」という用語は、核酸、遺伝子または染色体を切断する野性型酵素の元の機能の一部だけを有する酵素を指す。例えば、ＤＮＡの二本鎖を切断する野性型酵素の特異的に改変または設計された形式は、第１の機能を有する形式、または、第２の機能を有する形式であり得る。ここで、第１の機能は、ＤＮＡの二本鎖の第１鎖を切断する機能であり得て、第２の機能は、ＤＮＡの二本鎖の第２鎖を切断する機能であり得る。ここで、第１の機能を有する酵素、または、第２の機能を有する酵素は、不完全または部分的な活性酵素であり得る。
エディタータンパク質は、不活性酵素を含み得る。
ここで、「不活性酵素」という用語は、核酸、遺伝子または染色体を切断する野性型酵素の元の機能が完全に不活性化された酵素を指す。例えば、野性型酵素の特異的に改変または設計された形式は、第１の機能および第２の機能の両方を失った形式であり得て、すなわち、ＤＮＡの二本鎖の第１鎖を切断する第１の機能、および、ＤＮＡの二本鎖の第２鎖を切断する第２の機能の両方が失われている。ここで、第１の機能および第２の機能の両方を失った酵素は、不活性酵素であり得る。
エディタータンパク質は融合タンパク質であり得る。
ここで、「融合タンパク質」は、酵素を追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と融合することによって生成されるタンパク質を指す。
追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、酵素に含まれる機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と同一の、または、異なる機能を有する機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。
融合タンパク質は、酵素のアミノ末端またはその付近、カルボキシル末端またはその付近、酵素の中間部、および、それらの組み合わせのうち１または複数の領域において、追加の機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含み得る。
ここで、機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性もしくは核酸結合活性を有するドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、または、タンパク質（ペプチドを含む）の単離および精製のためのタグもしくはレポーター遺伝子であり得るが、本発明はこれに限定されない。
機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、デアミナーゼであり得る。
タグは、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ‐Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグを含み、レポーター遺伝子は、グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、自家蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む）を含むが、本発明はこれらに限定されない。
加えて、機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、核局在配列もしくはシグナル（ＮＬＳ）、または、核外搬出配列もしくはシグナル（ＮＥＳ）であり得る。
ＮＬＳは、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有する、ＳＶ４０ウイルスのラージＴ抗原のＮＬＳ、ヌクレオプラスミンに由来するＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有する双節型ヌクレオプラスミンＮＬＳ）、アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤまたはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ‐ｍｙｃ ＮＬＳ、または、配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ、インポーチンα由来ＩＢＢドメイン配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ、筋腫Ｔタンパク質配列ＶＳＲＫＲＰＲＰおよびＰＰＫＫＡＲＥＤ、ヒトｐ５３配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ、マウスｃ‐ａｂｌ ＩＶ配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ、インフルエンザウイルスＮＳ１配列ＤＲＬＲＲおよびＰＫＱＫＫＲＫ、Ｄ型肝炎ウイルス抗原配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ、マウスＭｘ１タンパク質配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ、ヒトポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ、または、ステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイド配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫであり得るが、本発明はこれらに限定されない。
追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、特異的な機能を実行しない機能不全ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。ここで、機能不全ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、酵素の機能に影響しないドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。
融合タンパク質は、酵素のアミノ末端またはその付近、カルボキシル末端またはその付近、酵素の中間部、および、それらの組み合わせのうち１または複数の領域において、追加の機能不全ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含み得る。
エディタータンパク質は、天然の酵素または融合タンパク質であり得る。
エディタータンパク質は、部分的に改変された天然の酵素または融合タンパク質の形態で存在し得る。
エディタータンパク質は、天然に存在しない人工的に生成された酵素または融合タンパク質であり得る。
エディタータンパク質は、天然に存在しない、部分的に改変された人工酵素または融合タンパク質の形態で存在し得る。
ここで、改変は、エディタータンパク質に含まれるアミノ酸の置換、除去、追加、または、それらの組み合わせであり得る。
加えて、改変は、エディタータンパク質をコードする塩基配列におけるいくつかの塩基の置換、除去、追加、または、それらの組み合わせであり得る。
追加的に、遺伝子操作用組成物は任意選択で、挿入が望まれる特異的なヌクレオチド配列、または、それをコードする核酸配列を含むドナーを更に含み得る。
ここで、挿入が望まれるヌクレオチド配列は、免疫関与遺伝子におけるヌクレオチド配列の一部であり得る。
ここで、挿入が望まれるヌクレオチド配列は、操作を受ける免疫調節遺伝子の変異を修正または導入するためのヌクレオチド配列であり得る。
「ドナー」という用語は、ＨＤＲを介して、損傷した遺伝子または核酸の修復を助ける核酸配列を指す。
ドナーは、二本鎖核酸または一本鎖核酸であり得る。
ドナーは鎖状または環状であり得る。
ドナーは、標的遺伝子または標的核酸との相同性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
例えば、ドナーは、特異的な核酸がそれぞれ挿入される位置（例えば、損傷した核酸の上流および下流）におけるヌクレオチド配列との相同性を有するヌクレオチド配列を含み得る。特に、挿入される特異的な核酸は、損傷した核酸の下流のヌクレオチド配列との相同性を有するヌクレオチド配列と、損傷した核酸の上流のヌクレオチド配列との相同性を有するヌクレオチド配列との間に配置され得る。特に、上の相同性を有するヌクレオチド配列は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
ドナーは任意選択で、追加のヌクレオチド配列を含み得る。特に、追加のヌクレオチド配列は、ドナーの安定性、ノックイン効率、または、ＨＤＲ効率を強化する役割を有し得る。
例えば、追加のヌクレオチド配列は、ＡおよびＴ塩基が豊富なヌクレオチド配列（すなわち、Ａ‐Ｔリッチドメイン）であり得る。代替的に、追加のヌクレオチド配列は、足場／マトリクス付着領域（Ｓ／ＭＡＲ）であり得る。
本明細書によって開示されるガイド核酸、エディタータンパク質、または、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体は、様々な形式で対象に送達または導入され得る。
「対象」という用語は、ガイド核酸、エディタータンパク質またはガイド核酸‐エディタータンパク質複合体が導入される生物、ガイド核酸、エディタータンパク質またはガイド核酸‐エディタータンパク質複合体がはたらく生物、または、当該生物から取得される標本または試料を指す。
対象は、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体の標的遺伝子または染色体を含む生物であり得る。
生物は、動物、動物組織、または、動物細胞であり得る。
生物はヒト、ヒト組織、または、ヒト細胞であり得る。
組織は、目、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、肺、脳、筋肉、または、血液であり得る。
細胞は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージまたは幹細胞などの免疫細胞であり得る。
標本または試料は、標的遺伝子または染色体を含む生物（例えば、唾液、血液、肝臓組織、脳組織、肝臓細胞、神経細胞、食細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、アストロサイト、癌細胞、または、幹細胞）から取得され得る。
好ましくは、対象は、免疫調節遺伝子を含む生物であり得る。
ガイド核酸、エディタータンパク質またはガイド核酸‐エディタータンパク質複合体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、混在形式の形態で対象に送達または導入され得る。
ここで、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードするＤＮＡ、ＲＮＡ、または、それらの混合物の形態は、当技術分野において既知の方法によって、対象に送達または導入され得る。
または、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードするＤＮＡ、ＲＮＡまたはその混合物の形態は、ベクター、非ベクターまたはその組み合わせによって対象に送達または導入され得る。
ベクターは、ウイルスまたは非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）であり得る。
非ベクターは、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ複合体またはｍＲＮＡであり得る。
ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、ベクターによって対象に送達または導入され得る。
ベクターは、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列を含み得る。
例えば、ベクターは、ガイド核酸およびエディタータンパク質をそれぞれコードする複数の核酸配列を同時に含み得る。
例えば、ベクターは、ガイド核酸をコードする核酸配列を含み得る。
例として、ガイド核酸に含まれるドメインはすべて１つのベクターに含まれ得る、または、分割されて、次いで、異なるベクターに含まれ得る。
例えば、ベクターは、エディタータンパク質をコードする核酸配列を含み得る。
一例において、エディタータンパク質の場合、エディタータンパク質をコードする核酸配列は、１つのベクターに含まれ得る、または、分割され、次いで、いくつかのベクターに含まれ得る。
ベクターは、１または複数の調節／制御コンポーネントを含み得る。
ここで、調節／制御コンポーネントは、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、スプライスアセプターおよび／または２Ａ配列を含み得る。
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。
プロモーターは、誘導プロモーターであり得る。
プロモーターは、対象特異的プロモーターであり得る。
プロモーターは、ウイルスまたは非ウイルスプロモーターであり得る。
プロモーターは、制御領域（すなわち、ガイド核酸またはエディタータンパク質をコードする核酸配列）に従って好適なプロモーターを使用し得る。
例えば、ガイド核酸に有用なプロモーターは、Ｈ１、ＥＦ‐１ａ、ｔＲＮＡまたはＵ６プロモーターであり得る。例えば、エディタータンパク質に有用なプロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ‐１ａ、ＥＦＳ、ＭＳＣＶ、ＰＧＫ、または、ＣＡＧプロモーターであり得る。
ベクターは、ウイルスベクターまたは組み換えウイルスベクターであり得る。
ウイルスは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスであり得る。
ここで、ＤＮＡウイルスは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ウイルスまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウイルスであり得る。
ここで、ＲＮＡウイルスは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスであり得る。
ウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルスまたは単純ヘルペスウイルスであり得るが、本発明はこれらに限定されない。
一般的に、ウイルスは、宿主（例えば細胞）に感染し得て、それにより、ウイルスの遺伝情報をコードする核酸を宿主に導入する、または、遺伝情報をコードする核酸を宿主ゲノムに挿入する。ガイド核酸および／またはエディタータンパク質は、そのような特徴を有するウイルスを使用して対象に導入され得る。ウイルスを使用して導入されたガイド核酸および／またはエディタータンパク質は、対象（例えば細胞）において一時的に発現され得る。代替的に、ウイルスを使用して導入されたガイド核酸および／またはエディタータンパク質は、対象（例えば細胞）において継続的に長時間（例えば、１、２または３週、１、２、３、６または９か月、１または２年、または、恒久的）発現され得る。
ウイルスのパッケージング能力は、ウイルスの種類に従って、少なくとも２ｋｂ～５０ｋｂ変動し得る。そのようなパッケージング能力に応じて、ガイド核酸またはエディタータンパク質を含むウイルスベクター、または、ガイド核酸およびエディタータンパク質の両方を含むウイルスベクターが設計され得る。代替的に、ガイド核酸、エディタータンパク質、および、追加のコンポーネントを含むウイルスベクターが設計され得る。
一例において、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列が、組み換えレンチウイルスによって送達または導入され得る。
別の例において、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、組み換えアデノウイルスによって送達または導入され得る。
更に別の例において、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列が組み換えＡＡＶによって送達または導入され得る。
更なる別の例において、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、ハイブリッドウイルスによって、例えば、本明細書において列挙されるウイルスの１または複数のハイブリッドによって、送達または導入され得る。
ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、非ベクターを使用して対象に送達または導入され得る。
非ベクターは、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列を含み得る。
非ベクターは、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ複合体、ｍＲＮＡまたはそれらの混合物であり得る。
非ベクターは、電気穿孔、パーティクルボンバードメント、ソノポレーション、マグネットフェクション、一過性細胞圧縮またはスクイージング（例えば、文献Ｌｅｅ， ｅｔ ａｌ， （２０１２） Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．， １２， ６３２２‐６３２７］において説明されている）、脂質を介したトランスフェクション、デンドリマー、ナノ粒子、リン酸カルシウム、シリカ、ケイ酸塩（Ｏｒｍｏｓｉｌ）、または、それらの組み合わせによって対象に送達または導入され得る。
例として、電気穿孔を通した送達は、細胞と、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列とをカートリッジ、チャンバーまたはキュベットにおいて混合し、予め定められた期間および強度で細胞に電気刺激を加えることによって実行され得る。
別の例において、非ベクターは、ナノ粒子を使用して送達され得る。ナノ粒子は、無機ナノ粒子（例えば、磁気ナノ粒子、シリカなど）、または、有機ナノ粒子（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で被覆された脂質など）であり得る。ナノ粒子の外側表面には、付着可能な正電荷ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリセリンなど）が結合され得る。
特定の実施形態、非ベクターは、脂質シェルを使用して送達され得る。
特定の実施形態において、非ベクターは、エキソソームを使用して送達され得る。エキソソームは、タンパク質およびＲＮＡを運搬する、ＲＮＡを脳および別の標的臓器へ送達する内在性ナノ小胞である。
特定の実施形態において、非ベクターは、リポソームを使用して送達され得る。リポソームは、内部の水性区画を囲む単一または複数のラメラ脂質二重層と、比較的非浸透性である、外部の親油性リン脂質二重層とから成る球状の小胞構造である。リポソームは、いくつかの異なる種類の脂質からできていることがあり得るが、リン脂質は、薬剤の担体としてリポソームを産生することに使用されることがもっとも一般的である。
追加的に、非ベクター送達のための組成物は、他の添加剤を含み得る。
エディタは、ペプチド、ポリペプチド、または、タンパク質の形態で対象に送達または導入され得る。
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形態のエディタータンパク質は、当技術分野において既知の方法によって、対象に送達または導入され得る。
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形態は、電気穿孔、マイクロインジェクション、一過性細胞圧縮、または、スクイ―ジング（例えば、文献［Ｌｅｅ， ｅｔ ａｌ， （２０１２） Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．， １２， ６３２２‐６３２７］において説明される）、脂質を介したトランスフェクション、ナノ粒子、リポソーム、ペプチドを媒介した送達、または、それらの組み合わせによって、対象に送達または導入され得る。
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、ガイド核酸をコードする核酸配列と共に送達され得る。
一例において、電気穿孔を通した移入は、エディタータンパク質がガイド核酸と共に、または、ガイド核酸無しで導入されることになる細胞をカートリッジ、チャンバーまたはキュベットにおいて混合し、予め定められた期間および強度で細胞に電気刺激を加えることによって実行され得る。
ガイド核酸およびエディタータンパク質は、核酸‐タンパク質の混合物の形態で対象に送達または導入され得る。
ガイド核酸およびエディタータンパク質は、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体の形態で、対象に送達または導入され得る。
例えば、ガイド核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその混合物であり得る。エディタータンパク質はペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。
一例において、ガイド核酸およびエディタータンパク質は、ＲＮＡ型ガイド核酸、および、タンパク質型エディタータンパク質、すなわち、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を含むガイド核酸‐エディタータンパク質複合体の形態で対象に送達または導入され得る。
本明細書によって開示されるガイド核酸‐エディタータンパク質複合体は、標的核酸、遺伝子または染色体を改変し得る。
例えば、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体は、標的核酸、遺伝子または染色体の配列の改変を誘導する。結果として、標的核酸、遺伝子または染色体によって発現されるタンパク質は、その構造および／または機能が改変され、その発現が制御され、または、その発現が阻止され得る。
ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子または染色体レベルで作用し得る。
一例において、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体は、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を調節する（例えば、阻害、抑制、低減、増大、または、促進する）ために、または、タンパク質活性を調節する（例えば、阻害、抑制、低減、増大または促進する）ために、または、標的遺伝子を設計または改変することによって改変タンパク質を発現させるために使用され得る。
ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体は、遺伝子転写および翻訳の段階で作用し得る。
一例において、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体は、標的遺伝子の転写を促進または抑制し得て、それにより、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を調節（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）する。
別の例において、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体は、標的遺伝子の翻訳を促進または抑制し得て、それにより、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を調節（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）する。
本明細書によって開示される一実施形態において、遺伝子操作用組成物は、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素を含み得る。
遺伝子操作用組成物は以下を含み得る。
（ａ）免疫調節遺伝子の標的配列との相補結合を形成可能なｇＲＮＡ、または、それをコードする核酸配列
（ｂ）１または複数のＣＲＩＳＰＲ酵素、または、それをコードする核酸配列
上の免疫調節遺伝子についての説明は、上に記載した通りである。
上の標的配列についての説明は上に記載した通りである。
遺伝子操作の組成物は、ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体を含み得る。
「ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体」という用語は、ｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲ酵素との間の相互作用によって形成される複合体を指す。
上のｇＲＮＡについての説明は、上に記載した通りである。
「ＣＲＩＳＰＲ酵素」は、ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ系の主要なタンパク質コンポーネントであり、ｇＲＮＡとの複合体を形成することによってＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ系を形成する。
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列を有する核酸またはポリペプチド（またはタンパク質）であり得る。
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、２型ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
２型ＣＲＩＳＰＲ酵素の結晶構造は、２種類以上の天然の微生物２型ＣＲＩＳＰＲ酵素分子に関する研究（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３４３（６１７６）：１２４７９９７， ２０１４）、および、ｇＲＮＡと複合化されたストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）に関する研究（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １５６：９３５‐９４９， ２０１４；Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ，２０１４， ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３５７９）に従って決定された。
２型ＣＲＩＳＰＲ酵素は２つのローブ．すなわち、認識（ＲＥＣ）ローブおよびヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブを含み、各ローブはいくつかのドメインを含む。
ＲＥＣローブは、アルギニンリッチブリッジへリックス（ＢＨ）ドメイン、ＲＥＣ１ドメインおよびＲＥＣ２ドメインを含む。
ここで、ＢＨドメインは、ロングαへリックスおよびアルギニンリッチ領域であり、ＲＥＣ１およびＲＥＣ２ドメインは、例えば、一本鎖ｇＲＮＡ、二本鎖ｇＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡなど、ｇＲＮＡに形成される二本鎖の認識において重要な役割を果たす。
ＮＵＣローブは、ＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメインおよびＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインを含む。ここで、ＲｕｖＣドメインはＲｕｖＣ様ドメインを含む、または、ＨＮＨドメインはＨＮＨ様ドメインを含むために使用される。
ここで、ＲｕｖＣドメインは、２型ＣＲＩＳＰＲ酵素を有する、天然に存在する微生物ファミリーのメンバーと構造類似性を共有し、例えば、標的遺伝子または標的核酸の非相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成しない鎖などの一本鎖を切断する。ＲｕｖＣドメインは、当技術分野において、ＲｕｖＣＩドメイン、ＲｕｖＣ ＩＩドメイン、または、ＲｕｖＣ ＩＩＩドメインと称されることがあり、一般的には、ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩまたはＲｕｖＣ ＩＩＩと称される。
ＨＮＨドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼと構造類似性を共有し、例えば、標的核酸分子の相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する鎖など、一本鎖を切断する。ＨＮＨドメインは、ＲｕｖＣ ＩＩとＩＩＩモチーフとの間に位置する。
ＰＩドメインは、標的遺伝子または標的核酸における特異的なヌクレオチド配列、すなわちプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する、またはＰＡＭと相互作用する。ここで、ＰＡＭは、２型ＣＲＩＳＰＲ酵素の由来に従って変化し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９であるとき、ＰＡＭは、５'‐ＮＧＧ‐３'であり得て、ＣＲＩＳＰＲ酵素がストレプトコッカス・サーモフィラスＣａｓ９（ＳｔＣａｓ９）であるとき、ＰＡＭは、５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ）であり得て、ＣＲＩＳＰＲ酵素がナイセリア・メニンギティディスＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９）であるとき、ＰＡＭは、５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'であり得て、ＣＲＩＳＰＲ酵素がカンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）であるとき、ＰＡＭは、５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝ＧまたはＣまたはＡ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ）であり得て、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣであり得る。しかしながら、上に記載したように、ＰＡＭは、酵素の由来に従って決定されることが一般に理解されているが、ＰＡＭは、由来の酵素の変異体に関する研究が進むにつれて、変化し得る。
２型ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９であり得る。
Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、ＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃＨｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓおよびＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ．などの様々な微生物に由来し得る。
Ｃａｓ９は、標的遺伝子または標的核酸上の標的配列または位置を切断または改変するように、ｇＲＮＡに結合する酵素であり、ｇＲＮＡと相補結合を形成する核酸鎖を切断可能なＨＮＨドメイン、ｇＲＮＡと非相補結合を形成する核酸鎖を切断可能なＲｕｖＣドメイン、標的を認識するＲＥＣドメイン、および、ＰＡＭを認識するＰＩドメインから成り得る。Ｃａｓ９の具体的な構造特性については、Ｈｉｒｏｓｈｉ Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ， ｅｔ ａｌ．（２０１４） Ｃｅｌｌ １５６：９３５‐９４９を参照されたい。
Ｃａｓ９は、組み換えまたは合成法によって生成される天然または非天然に存在する微生物から単離され得る。
追加的に、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、５型ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
５型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、２型ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメインに対応する類似のＲｕｖＣドメインを含み、２型ＣＲＩＳＰＲ酵素のＨＮＨドメインではなく、Ｎｕｃドメインと、標的と相互作用するＲＥＣおよびＷＥＤドメインと、ＰＡＭを認識するＰＩドメインとから成り得る。５型ＣＲＩＳＰＲ酵素の具体的な構造特性については、Ｔａｋａｓｈｉ Ｙａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ． （２０１６） Ｃｅｌｌ １６５：９４９‐９６２を参照されたい。
５型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ｇＲＮＡと相互作用し得て、それにより、ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成し、ｇＲＮＡと協働して、ＰＡＭ配列を含む標的配列にガイド配列が接近することを可能にし得る。ここで、標的遺伝子または標的核酸との相互作用のための５型ＣＲＩＳＰＲ酵素の能力は、ＰＡＭ配列に依存する。
ＰＡＭ配列は、標的遺伝子または標的核酸に存在する配列であり、５型ＣＲＩＳＰＲ酵素のＰＩドメインによって認識され得る。ＰＡＭ配列は、５型ＣＲＩＳＰＲ酵素の由来に従って変動し得る。すなわち、種に応じて特異的に認識されることが可能な異なるＰＡＭ配列がある。例えば、Ｃｐｆ１によって認識されるＰＡＭ配列は、５'‐ＴＴＮ‐３'（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）であり得る。しかしながら、上に記載したように、ＰＡＭは、酵素の由来に従って決定されることが一般に理解されているが、ＰＡＭは、由来の酵素の変異体に関する研究が進むにつれて、変化し得る。
５型ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣｐｆ１であり得る。
Ｃｐｆ１は、ストレプトコッカス、カンピロバクター、ニトロフラクター、スタフィロコッカス、パルビバキュラム、ローズブリア、ナイセリア、グルコナセトバクター、アゾスピリルム、スファエロチャータ、ラクトバチルス、ユーバクテリウム、コリネバクター、カルノバクテリウム、ロドバクター、リステリア、パルディバクター、クロストリジウム、ラクノスピラ、クロストリジウム、レプトトリシア、フランシセラ、レジオネラ、アリシクロバチルス、メタノメチオフィラス、ポルフィロモナス、プレボテラ、バクテロイデス、ヘルコッカス、レトスピラ、デスルホビブリオ、デスルホナトロナム、オピトゥトゥス、ツベリバチルス、バチルス、ブレビバシラス、メチルバクテリウム、またはアシダミノコッカスに由来するＣｐｆ１であり得る。
Ｃｐｆ１は、２型ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメインに対応する類似のＲｕｖＣドメインを含み、Ｃｐｆ１のＨＮＨドメインではなく、Ｎｕｃドメインと、標的と相互作用するＲＥＣおよびＷＥＤドメインと、ＰＡＭを認識するＰＩドメインとから成り得る。Ｃｐｆ１の具体的な構造特性については、Ｔａｋａｓｈｉ Ｙａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ． （２０１６） Ｃｅｌｌ １６５：９４９‐９６２を参照されたい。
Ｃｐｆ１は、組み換えまたは合成法によって生成される天然または非天然に存在する微生物から単離され得る。
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的遺伝子または標的核酸の二本鎖を切断する機能を有するヌクレアーゼまたは制限酵素であり得る。
ＣＲＩＳＰＲ酵素は完全活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
ここで、「完全活性」とは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能と同一の機能を有する状態を指し、この状態におけるＣＲＩＳＰＲ酵素は、「完全活性ＣＲＩＳＰＲ酵素」と称される。ここで、「野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能」とは、ＤＮＡの二本鎖を切断する機能を有する状態、すなわち、ＤＮＡの二本鎖の第１鎖を切断する第１の機能、および、ＤＮＡの二本鎖の第２鎖を切断する第２の機能の両方を有する状態を指す。
完全活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡの二本鎖を切断する野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
完全活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡの二本鎖を切断する野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素が改変または操作されるＣＲＩＳＰＲ酵素変異体であり得る。
ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸配列における１または複数のアミノ酸が別のアミノ酸で置換される、または、１または複数のアミノ酸が除去される酵素であり得る。
ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が追加される酵素であり得る。ここで、追加されたアミノ酸の位置は、Ｎ末端、Ｃ末端であり得る、または、野性型酵素のアミノ酸配列内にあり得る。
ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して機能が改善された完全活性酵素であり得る。
例えば、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の特異的に改変または操作された形式、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、切断されるＤＮＡの二本鎖に結合することなく、または、特定の距離を維持しながら、ＤＮＡの二本鎖を切断し得る。この場合、改変または操作された形式は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して機能活性が改善された完全活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して機能が低減された完全活性酵素であり得る。
例えば、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の特異的な改変または操作された形式、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、切断されるＤＮＡの二本鎖から特定の距離で、もしくは、より近くで、または、特定の結合の存在下で、ＤＮＡの二本鎖を切断し得る。ここで、特定の結合は例えば、酵素の特定の位置におけるアミノ酸と、切断位置におけるＤＮＡヌクレオチド配列との間の結合であり得る。この場合、改変または操作された形式は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して機能活性が低減された完全活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、不完全または部分的活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
「不完全または部分的活性」という用語は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能、すなわち、ＤＮＡの二本鎖の第１鎖を切断する第１の機能、およびＤＮＡの二本鎖の第２鎖を切断する第２の機能から選択された機能を有する状態を指す。追加的に、不完全または部分的活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ニッカーゼと称され得る。
「ニッカーゼ」という用語は、標的遺伝子または標的核酸の二本鎖のうち一本鎖のみを切断するように操作または改変されたＣＲＩＳＰＲ酵素を指し、ニッカーゼは、例えば、標的遺伝子または標的核酸のｇＲＮＡに相補的でない、または、相補的な鎖である一本鎖を切断するヌクレアーゼ活性を有する。このため、二本鎖を切断するには、２つのニッカーゼのヌクレアーゼ活性が必要である。
ニッカーゼは、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメインによるヌクレアーゼ活性を有し得る。すなわち、ニッカーゼは、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性を含まないことがあり得て、この目的で、ＨＮＨドメインは操作または改変され得る。
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素が２型ＣＲＩＳＰＲ酵素であるとき、ニッカーゼは改変されたＨＮＨドメインを含む２型ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
例えば、２型ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＳｐＣａｓ９であるとき、ニッカーゼは、野性型ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列における残基８４０がヒスチジンからアラニンに変異し、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されるＳｐＣａｓ９変異体であり得る。ここで、生成されたニッカーゼ、すなわち、ＳｐＣａｓ９変異体は、ＲｕｖＣドメインによるヌクレアーゼ活性を有し、したがって、標的遺伝子または標的核酸、すなわち、ｇＲＮＡの非相補鎖との相補結合を形成しない鎖を切断可能である。
別の例において、２型ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＣｊＣａｓ９であるとき、ニッカーゼは、野性型ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列における残基５５９がヒスチジンからアラニンに変異し、ＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性が不活性化されるＣｊＣａｓ９変異体であり得る。ここで、生成されたニッカーゼ、すなわち、ＣｊＣａｓ９変異体は、ＲｕｖＣドメインによるヌクレアーゼ活性を有し、したがって、標的遺伝子または標的核酸、すなわち、ｇＲＮＡの非相補鎖との相補結合を形成しない鎖を切断可能である。
追加的に、ニッカーゼは、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性を有し得る。すなわち、ニッカーゼは、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメインによるヌクレアーゼ活性を含まないことがあり得て、この目的で、ＲｕｖＣドメインは操作または改変され得る。
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素が２型ＣＲＩＳＰＲ酵素であるとき、ニッカーゼは改変されたＲｕｖＣドメインを含む２型ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
例えば、２型ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＳｐＣａｓ９であるとき、ニッカーゼは、野性型ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列における残基１０がアスパラギン酸からアラニンに変異し、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されるＳｐＣａｓ９変異体であり得る。ここで、生成されたニッカーゼ、すなわち、ＳｐＣａｓ９変異体は、ＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性を有し、したがって、標的遺伝子または標的核酸、すなわち、ｇＲＮＡの相補鎖との相補結合を形成しない鎖を切断可能である。
別の例において、２型ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＣｊＣａｓ９であるとき、ニッカーゼは、野性型ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列における残基８がアスパラギン酸からアラニンに変異し、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されるＣｊＣａｓ９変異体であり得る。ここで、生成されたニッカーゼ、すなわち、ＣｊＣａｓ９変異体は、ＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性を有し、したがって、標的遺伝子または標的核酸、すなわち、ｇＲＮＡの相補鎖との相補結合を形成しない鎖を切断可能である。
ＣＲＩＳＰＲ酵素は不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
「不活性」という用語は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能、すなわち、ＤＮＡの二本鎖の第１鎖を切断する第１の機能、およびＤＮＡの二本鎖の第２鎖を切断する第２の機能が完全に失われた状態を指す。この状態におけるＣＲＩＳＰＲ酵素は、不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素と称される。
不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ヌクレアーゼ活性を有する野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のドメインにおける変異による不活性化ヌクレアーゼを有し得る。
不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が変異に起因して不活性化されたものであり得る。すなわち、不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性を含まないことがあり得て、この目的で、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインは操作または改変され得る。
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素が２型ＣＲＩＳＰＲ酵素であるとき、改変された不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインを含む２型ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
例えば、２型ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＳｐＣａｓ９であるとき、野性型ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列における残基１０および８４０の両方をアスパラギン酸およびヒスチジンからアラニンにそれぞれ変異させることによって、不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性が不活性化されたＳｐＣａｓ９変異体であり得る。ここで、産生された不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素、すなわち、ＳｐＣａｓ９変異体では、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化され、したがって、標的遺伝子または標的核酸の二本鎖を完全に切断できない。
別の例において、２型ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＣｊＣａｓ９であるとき、野性型ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列における残基８および５５９の両方をアスパラギン酸およびヒスチジンからアラニンにそれぞれ変異させることによって、不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性が不活性化されたＣｊＣａｓ９変異体であり得る。ここで、産生された不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素、すなわち、ＣｊＣａｓ９変異体では、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化され、したがって、標的遺伝子または標的核酸の二本鎖を完全に切断できない。
上に記載されたヌクレアーゼ活性に加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のへリックス構造をアニールする能力を有し得る。
追加的に、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のヘリカーゼ活性を完全に、不完全に、または、部分的に活性化するように改変され得る。
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、人工的に操作または改変された野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素を有するＣＲＩＳＰＲ酵素変異体であり得る。
ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能、すなわち、ＤＮＡの二本鎖の第１鎖を切断する第１の機能、および／または、ＤＮＡの二本鎖の第２鎖を切断する第２の機能を改変するために人工的に操作または改変されたＣＲＩＳＰＲ酵素変異体であり得る。
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能のうち第１の機能を失った形態であり得る。
代替的に、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能のうち第２の機能を失った形態であり得る。
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能、すなわち、第１の機能および第２の機能の両方を失った形態であり得る。
ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、ｇＲＮＡと相互作用することによってｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体を形成し得る。
ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、ｇＲＮＡと相互作用する野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能を改変するようにＣＲＩＳＰＲ酵素変異体を人工的に操作または改変され得る。
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して、ｇＲＮＡとの相互作用が減少した形態であり得る。
代替的に、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して、ｇＲＮＡとの相互作用が増加した形態であり得る。
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の第１の機能を有し、ｇＲＮＡとの相互作用が減少した形態であり得る。
代替的に、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の第１の機能を有し、ｇＲＮＡとの相互作用が増加した形態であり得る。
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の第２の機能を有し、ｇＲＮＡとの相互作用が減少した形態であり得る。
代替的に、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の第２の機能を有し、ｇＲＮＡとの相互作用が増加した形態であり得る。
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の第１の機能および第２の機能を有さず、ｇＲＮＡとの相互作用が減少した形態であり得る。
代替的に、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の第１の機能および第２の機能を有さず、ｇＲＮＡとの相互作用が増加した形態であり得る。
ここで、様々なｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、ｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲ酵素変異体との相互作用の強度に応じて形成され得て、標的配列に接近または切断する機能は、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体に応じて変化し得る。
例えば、ｇＲＮＡとの相互作用が減少したＣＲＩＳＰＲ酵素変異体によって形成されたｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、ｇＲＮＡとの完了相補結合を形成する標的配列に接近または局在するときだけ、標的配列の二本鎖または一本鎖を切断可能である。
ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、改変された野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸のうち少なくとも１つを有し得る。
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体では、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸のうち少なくとも１つが置換され得る。
別の例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体では、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸のうち少なくとも１つが削除され得る。
更に別の例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体では、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸のうち少なくとも１つが追加され得る。
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体では、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸のうち少なくとも１つが置換、削除、および／または追加され得る。
追加的に、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の元の機能、すなわち、ＤＮＡの二本鎖の第１鎖を切断する第１の機能、および、ＤＮＡの二本鎖の第２鎖を切断する第２の機能以外に、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、任意選択の機能ドメインを更に含み得る。ここで、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体では、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の元の機能以外の機能が追加され得る。
機能ドメインは、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性もしくは核酸結合活性を有するドメイン、または、タンパク質（ペプチドを含む）の単離および精製のためのタグもしくはレポーター遺伝子であり得るが、本発明はこれに限定されない。
タグは、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ‐Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグを含み、レポーター遺伝子は、グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、自家蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む）を含むが、本発明はこれらに限定されない。
機能ドメインはデアミナーゼであり得る。
例えば、不完全または部分的なＣＲＩＳＰＲ酵素は、機能ドメインとしてシチジンデアミナーゼを追加的に含み得る。例示的な一実施形態、シチジンデアミナーゼ、例えば、アポリポタンパク質Ｂ編集複合体１（ＡＰＯＢＥＣ１）はＳｐＣａｓ９ニッカーゼに追加され得て、それにより、融合タンパク質を産生する。それにより形成される［ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ］‐［ＡＰＯＢＥＣ１］は、ヌクレオチドＣをＴまたはＵにする、または、ヌクレオチドＧをＡにするヌクレオチド修復または編集において使用され得る。
別の例において、不完全または部分的なＣＲＩＳＰＲ酵素は更に、機能ドメインとしてシチジンデアミナーゼを含み得る。一実施形態において、アデニンデアミナーゼ、例えば、ＴａｄＡバリアント、ＡＤＡＲ２バリアント、ＡＤＡＴ２バリアントなどは、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼに追加され得て、それにより、融合タンパク質を産生する。それにより形成された［ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ］‐［ＴａｄＡバリアント］、［ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ］‐［ＡＤＡＲ２バリアント］、または、［ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ］‐［ＡＤＡＴ２バリアント］は、ヌクレオチドＡをイノシンに改変し、改変されたイノシンは、ポリメラーゼによってヌクレオチドＧとして認識され、ヌクレオチドＡをＧに修復または編集する効果を著しく示し、したがって、ヌクレオチドＡをＧにする、または、ヌクレオチドＴをＣにするヌクレオチド修復または編集において使用され得る。
機能ドメインは、核局在配列またはシグナル（ＮＬＳ）、または、核外搬出配列またはシグナル（ＮＥＳ）であり得る。
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は１または複数のＮＬＳを含み得る。ここで、１または複数のＮＬＳは、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＮ末端もしくはその近位、酵素のＣ末端もしくはその近位、または、それらの組み合わせに含まれ得る。ＮＬＳは、以下のＮＬＳ、すなわち、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有するＳＶ４０ウイルスのラージＴ抗原のＮＬＳ、ヌクレオプラスミンからのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有する双節型ヌクレオプラスミンＮＬＳ）、アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤまたはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ‐ｍｙｃ ＮＬＳ、配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ、インポーチン‐αからのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ、筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰおよびＰＰＫＫＡＲＥＤ、ヒトｐ５３の配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ、マウスｃ‐ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ、インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲおよびＰＫＱＫＫＲＫ、Ｄ型肝炎ウイルス抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ、マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ、ヒトポリ（ＡＤＰ‐リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ、または、ステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列に由来するＮＬＳ配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫに由来するＮＬＳ配列であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、ＣＲＩＳＰＲ酵素を２つ以上の部分に分割することによって調製されたスプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み得る。「スプリット」という用語は、タンパク質を機能的または構造的に分割する、または、タンパク質をランダムに分割することにより２つ以上の部分にすることを指す。
スプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、完全、不完全、もしくは、部分的活性酵素、または不活性酵素であり得る。
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９であるとき、スプリット型ＳｐＣａｓ９は、残基６５６チロシンと残基６５７スレオニンとの間で２つの部分に分割することによって生成され得る。
スプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素は選択的に、再構成のための追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含み得る。
再構成のための追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、スプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と構造的に同一または類似であるように組み立てられ得る。
再構成のための追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、ＦＲＢおよびＦＫＢＰ二量体化ドメイン、インテイン、ＥＲＴおよびＶＰＲドメイン、または、特定の条件下でヘテロダイマーを形成するドメインであり得る。
例えば、ＳｐＣａｓ９は、残基７１３セリンと残基７１４グリシンとの間で２つの部分に分割され得て、それにより、スプリット型ＳｐＣａｓ９を生成する。ＦＲＢドメインは、２つの部分のうち１つに接続され得て、ＦＫＢＰドメインは、他方に接続され得る。それにより生成されるスプリット型ＳｐＣａｓ９において、ＦＲＢドメインおよびＦＫＢＰドメインは、ラパマイシンが存在する環境において二量体として形成され得て、それにより、再構成されたＣＲＩＳＰＲ酵素を生成する。
本発明において説明されるＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、ポリペプチド、タンパク質、または、それをコードする配列を有する核酸であり得て、ＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣＲＩＳＰＲ酵素変異体を導入するべく対象に対してコドン最適化され得る。
「コドン最適化」という用語は、宿主細胞における発現を改善するように、天然配列の少なくとも１つのコドンを、宿主細胞においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンと置換しながら、天然アミノ酸配列を維持することによって核酸配列を改変するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸の特定のコドンへの特定のバイアスを有し、コドンバイアス（生物間におけるコドン使用率の差異）は、翻訳されるコドンの特徴、および、特定のｔＲＮＡ分子の入手可能性に依存すると考えられる、ｍＲＮＡの翻訳の効率と頻繁に相関する。細胞において選択されるｔＲＮＡの優位性（ｄｏｍｉｎａｎｃｅ）は一般的に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンを反映する。このため、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現によりカスタマイズされ得る。
本明細書によって開示されるｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ酵素、または、ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、様々な形式で対象に送達または導入され得る。
上の対象の説明は、上に記載した通りである。
一実施形態において、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素はそれぞれ、それをコードする核酸配列を含むベクターによって対象に送達または導入され得る。
ベクターは、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列を含み得る。
一例において、ベクターは、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列を同時に含み得る。
別の例において、ベクターは、ｇＲＮＡをコードする核酸配列を含み得る。
例えば、ｇＲＮＡに含まれるドメインは、ベクターに全体的に含まれ得る、または、当該ドメインは、分離されてベクターに個々に含まれ得る。
別の例において、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列を含み得る。
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素については、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列は、全体がベクターに含まれ得る、または、分割されたベクターに個々に含まれ得る。
ベクターは、１または複数の調節／制御コンポーネントを含み得る。
ここで、調節／制御コンポーネントは、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、スプライスアセプターおよび／または２Ａ配列を含み得る。
プロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。
プロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。
プロモーターは誘導プロモーターであり得る。
プロモーターは対象特異的プロモーターであり得る。
プロモーターはウイルスまたは非ウイルスプロモーターであり得る。
プロモーターは、制御領域（ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列）に従って、適切なプロモーターを使用し得る。
例えば、ｇＲＮＡに有用なプロモーターは、Ｈ１、ＥＦ‐１ａ、ｔＲＮＡまたはＵ６プロモーターであり得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素に有用なプロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ‐１ａ、ＥＦＳ、ＭＳＣＶ、ＰＧＫ、または、ＣＡＧプロモーターであり得る。
ベクターは、ウイルスベクターまたは組み換えウイルスベクターであり得る。
ウイルスは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスであり得る。
ここで、ＤＮＡウイルスは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ウイルスまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウイルスであり得る。
ここで、ＲＮＡウイルスは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスであり得る。
ウイルスは、これらに限定されないが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルスまたは単純ヘルペスウイルスであり得る。
一例において、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列は、組み換えレンチウイルスによって送達または導入され得る。
別の例において、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列は、組み換えアデノウイルスによって送達または導入され得る。
更に別の例において、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列は、組み換えＡＡＶによって送達または導入され得る。
更に別の例において、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列は、ハイブリッドウイルス、例えば、ここに列挙されるウイルスの１または複数のハイブリッドによって送達または導入され得る。
一実施形態において、ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体の形態は、対象に送達または導入され得る。
例えば、ｇＲＮＡは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、それらの混合物であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。
一例において、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲＮＡ型ｇＲＮＡおよびタンパク質型ＣＲＩＳＰＲを含むｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわち、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）の形態で対象に送達または導入され得る。
ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、電気穿孔、マイクロインジェクション、一過性細胞圧縮、または、スクイージング（例えば、文献［Ｌｅｅ， ｅｔ ａｌ， （２０１２） Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．， １２， ６３２２‐６３２７］において説明される）、脂質を介したトランスフェクション、ナノ粒子、リポソーム、ペプチドを媒介した送達、または、それらの組み合わせによって、対象に送達または導入され得る。
本明細書によって開示されたｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、標的遺伝子、すなわち、免疫調節遺伝子を人工的に操作または改変するために使用され得る。
標的遺伝子は、上述のｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して操作または改変され得る。ここで、標的遺伝子の操作または改変は、ｉ）標的遺伝子を切断または損傷する、および、ｉｉ）損傷した標的遺伝子を修復または復元する段階の全部を含む。
ｉ）標的遺伝子を切断または損傷することは、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的遺伝子を切断または損傷すること、具体的には、標的遺伝子における標的配列を切断または損傷することであり得る。
標的配列は、ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体の標的であり得て、標的配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素によって認識されるＰＡＭ配列を含んでも含まなくてもよい。そのような標的配列は、ｇＲＮＡの設計についての重要な基準を医療従事者に提供し得る。
標的配列は、ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体のｇＲＮＡによって特異的認識され得て、それにより、ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、認識された標的配列の近くに配置され得る。
標的部位における「切断」は、ポリヌクレオチドの共有結合主鎖の切断を指す。切断は、これらに限定されないが、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含み得て、様々な他の方法によって実行され得る。一本鎖の切断および二本鎖の切断の両方が可能であり得て、二本鎖の切断は、２つの別個の一本鎖の切断の結果として生じ得る。二本鎖の切断は、平滑末端または付着末端を生成し得る。
一例において、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的遺伝子を切断または損傷することは、標的配列の二本鎖を完全に切断または損傷することであり得る。
一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＳｐＣａｓ９であるとき、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の二本鎖を完全に切断し得る。
別の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）であるとき、各ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の２つの一本鎖を個々に切断し得る。すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって切断され得て、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の非相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって切断され得て、切断は順次に、または、同時に生じ得る。
別の例において、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的遺伝子または標的核酸を切断または損傷することは、標的配列の二本鎖のうち一本鎖だけを切断または損傷することであり得る。ここで、一本鎖は、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列のガイド核酸結合配列、すなわち相補一本鎖、または、ｇＲＮＡとの相補結合を形成しないガイド核酸非結合配列、すなわちｇＲＮＡに非相補的な一本鎖であり得る。
一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）であるとき、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列のガイド核酸結合配列を切断し得て、すなわち、相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって切断され得て、ｇＲＮＡとの相補結合を形成しないガイド核酸非結合配列、すなわち、ｇＲＮＡに非相補的な一本鎖は切断されないことがあり得る。
別の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）であるとき、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ｇＲＮＡとの相補結合を形成しない標的配列のガイド核酸非結合配列を切断し得て、すなわち、ｇＲＮＡに非相補的な一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって切断され得て、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列のガイド核酸結合配列、すなわち、相補一本鎖は切断されないことがあり得る。
更なる別の例において、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用する、標的遺伝子または標的核酸の切断または損傷は、核酸断片の部分的除去であり得る。
一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ複合体が、異なる標的配列と個々に相補結合を形成する２つのｇＲＮＡおよび野性型ＳｐＣａｓ９によって形成されるとき、第１のｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の二本鎖は切断され得て、第２のｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の二本鎖は切断され得て、結果として、第１および第２のｇＲＮＡならびにＳｐＣａｓ９によって核酸断片が除去される。
ｉｉ）損傷した標的遺伝子の修復または復元は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修復または復元され得る。
非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、切断された二本鎖または一本鎖の両方の末端を共に結合することによって、ＤＮＡにおける二本鎖の切断を復元または修復する方法であり、一般に、二本鎖の破損（例えば切断）によって形成される２つの適合する末端が互いに頻繁に接触して２つの末端を完全に連結するとき、破損された二本鎖が復元される。ＮＨＥＪは、細胞周期全体で使用されることが可能な復元方法であり、通常、Ｇ１期など、鋳型として使用される相同ゲノムが細胞に無いときに生じる。
ＮＨＥＪを使用する、損傷した遺伝子または核酸の修復プロセスにおいて、核酸配列におけるいくつかの挿入および／または欠失（インデル）がＮＨＥＪ修復領域において生じ、そのような挿入および／または欠失は、リーディングフレームのシフトを引き起こし、トランスクリプトームｍＲＮＡのフレームシフトをもたらす。結果として、ナンセンス媒介分解、または、正常タンパク質の合成の失敗が原因で、先天的機能が失われる。加えて、リーディングフレームが維持される一方で、タンパク質の機能を破損するために、相当量の配列の挿入または欠失が引き起こされる変異が引き起こされ得る。重要な機能ドメインにおける変異は、タンパク質の非重要領域における変異より、おそらく許容性が低いので、変異は座位依存的である。
天然状態においてＮＨＥＪによりインデル変異が生じると予期するのは不可能であるが、所与の切断領域では特定のインデル配列が好適であり、マイクロホモロジーの小さい領域に由来し得る。従来、欠失の長さは、１ｂｐ～５０ｂｐの範囲に及び、挿入は、より短い傾向があり、切断領域を直接囲む短い反復配列を頻繁に含む。
加えて、ＮＨＥＪは、変異を引き起こすプロセスであり、特定の最終的な配列を生成する必要がないとき、小さい配列のモチーフの除去に使用され得る。
ＣＲＩＳＰＲ複合体によって標的化される遺伝子の特異的なノックアウトは、そのようなＮＨＥＪを使用して実行され得る。標的遺伝子または標的核酸の二本鎖または２つの一本鎖は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１などのＣＲＩＳＰＲ酵素を使用して切断され得て、標的遺伝子または標的核酸の破損された二本鎖または２つの一本鎖は、ＮＨＥＪを通してインデルを有し得て、それにより、標的遺伝子または標的核酸の特異的なノックアウトを誘導する。ここで、ＣＲＩＳＰＲ酵素によって切断される標的遺伝子または標的核酸の部位は、非コードまたはコード領域であり得て、加えて、ＮＨＥＪにより復元される標的遺伝子または標的核酸の部位は、非コードまたはコード領域であり得る。
一例において、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用すること、および、ＮＨＥＪによって復元することによって、様々な挿入および欠失（インデル）が、標的遺伝子の二本鎖を切断するプロセスに起因して、復元領域において生じ得る。
「インデル」という用語は、いくつかのヌクレオチドがＤＮＡのヌクレオチド配列において挿入される、または、欠失する変異をまとめて指す。上に記載したように、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体が免疫調節遺伝子の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を切断するとき、インデルは、相同組換え（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機構による修復のプロセスにおいて標的配列に導入されるものであり得る。
相同組換え（ＨＤＲ）は、エラーが無い修正方法であり、損傷した遺伝子または核酸を修復または復元するために、一般には、破損されたＤＮＡを修復または復元する、すなわち、細胞の生来の情報を復元するために、鋳型として相同配列を使用し、破損されたＤＮＡは、非改変の相補的ヌクレオチド配列の情報、または、姉妹染色分体の情報を使用して、修復または復元される。ＨＤＲのもっとも一般的な種類は相同組換え（ＨＲ）である。ＨＤＲは、活発に分裂している細胞のＳまたはＧ２／Ｍ期に通常生じる修復または復元方法である。
ＨＤＲを使用して損傷したＤＮＡを修復または復元するために、細胞の相補的ヌクレオチド配列または姉妹染色分体を使用する代わりに、相補的ヌクレオチド配列または相同ヌクレオチド配列の情報を使用して人工的に合成されたＤＮＡ鋳型、すなわち、相補的ヌクレオチド配列または相同ヌクレオチド配列を含む核酸鋳型が細胞に提供され得て、それにより、破損されたＤＮＡを修復または復元する。ここで、破損されたＤＮＡを修復するために核酸配列または核酸断片が核酸鋳型に更に追加されるとき、破損されたＤＮＡに更に追加される核酸配列または核酸断片は、ノックインの対象になり得る。更に追加される核酸配列または核酸断片は、これらに限定されないが、通常の遺伝子または核酸への変異によって改変された標的遺伝子または標的核酸を補正するための核酸配列または核酸断片、または、細胞において発現が望まれる遺伝子または核酸であり得る。
一例において、標的遺伝子または標的核酸の二本鎖または一本鎖は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して切断され得て、ＨＤＲ法を通して、切断された標的遺伝子または標的核酸のヌクレオチド配列を修復または復元するために、切断部位に隣接するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸鋳型が細胞に提供され得る。
ここで、相補的ヌクレオチド配列を含む核酸鋳型は、破損されたＤＮＡ、すなわち、相補的ヌクレオチド配列の切断された二本鎖または一本鎖を有し得て、更に、破損されたＤＮＡに挿入されることが望まれる核酸配列または核酸断片を含み得る。追加の核酸配列または核酸断片は、相補的塩基配列に挿入される核酸配列または核酸断片を含む核酸鋳型を使用して、破損されたＤＮＡの切断部位、すなわち、標的遺伝子または標的核酸に挿入され得る。ここで、挿入される核酸配列または核酸断片、および、追加の核酸配列または核酸断片は、変異によって改変された標的遺伝子または標的核酸を正常な遺伝子または核酸に、または、細胞において発現されるべき遺伝子または核酸に修正するための核酸配列または核酸断片であり得る。相補的ヌクレオチド配列は、破損されたＤＮＡとの相補結合を形成するヌクレオチド配列、すなわち、標的遺伝子または標的核酸の切断された二本鎖または一本鎖の右および左のヌクレオチド配列であり得る。代替的に、相補的ヌクレオチド配列は、破損されたＤＮＡとの相補結合を形成するヌクレオチド配列、すなわち、標的遺伝子または標的核酸の切断された二本鎖または一本鎖の３'および５'末端であり得る。相補的ヌクレオチド配列は、１５ｂｐ～３０００ｂｐのヌクレオチド配列であり得て、相補的ヌクレオチド配列の長さまたはサイズは、核酸鋳型、または、標的遺伝子または標的核酸のサイズに従って適切に設計され得る。ここで、核酸鋳型として、二本鎖または一本鎖の核酸が使用され得る、または、それは、鎖状または環状であり得るが、本発明はそれに限定されない。
別の例において、二本鎖または一本鎖の標的遺伝子または標的核酸は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して切断され得て、ＨＤＲ法によって、標的遺伝子または標的核酸の切断されたヌクレオチド配列を修復または復元するために、切断部位に隣接するヌクレオチド配列との相同ヌクレオチド配列を含む核酸鋳型が細胞に提供され得る。
ここで、相同ヌクレオチド配列を含む核酸鋳型は、破損されたＤＮＡ、すなわち、切断された二本鎖または一本鎖の相同ヌクレオチド配列を有し得て、破損されたＤＮＡに挿入されることが望まれる核酸配列または核酸断片を更に含み得る。追加の核酸配列または核酸断片は、相同塩基配列、および、挿入される核酸配列または核酸断片を含む核酸鋳型を使用して、破損されたＤＮＡ、すなわち、標的遺伝子または標的核酸の切断部位に挿入され得る。ここで、挿入される核酸配列または核酸断片、および、追加の核酸配列または核酸断片は、変異によって改変された標的遺伝子または標的核酸を正常な遺伝子または核酸に、または、細胞において発現されるべき遺伝子または核酸に修正するための核酸配列または核酸断片であり得る。相同ヌクレオチド配列は、破損されたＤＮＡとの相同性を有するヌクレオチド配列、すなわち、標的遺伝子または標的核酸の切断された二本鎖または一本鎖の右および左のヌクレオチド配列であり得る。代替的に、相補的ヌクレオチド配列は、破損されたＤＮＡとの相同性を有するヌクレオチド配列、すなわち、標的遺伝子または標的核酸の切断された二本鎖または一本鎖の３'および５'末端であり得る。相同ヌクレオチド配列は、１５ｂｐ～３０００ｂｐのヌクレオチド配列であり得て、相同ヌクレオチド配列の長さまたはサイズは、核酸鋳型、または、標的遺伝子または標的核酸のサイズに従って適切に設計され得る。ここで、核酸鋳型として、二本鎖または一本鎖の核酸が使用され得て、それは、鎖状または環状であり得るが、本発明はそれに限定されない。
ＮＨＥＪおよびＨＤＲ以外に、破損された標的遺伝子を修復または復元する方法がある。例えば、破損された標的遺伝子を修復または復元する方法は、一本鎖アニール、一本鎖破損修復、ミスマッチ修復、または、ヌクレオチド破損修復、または、ヌクレオチド破損修復を使用する方法であり得る。
一本鎖アニール（ＳＳＡ）は、標的核酸に存在する２つの反復配列の間の二本鎖破損を修復する方法であり、一般に、３０ｂｐより多くのヌクレオチド配列の反復配列を使用し得る。反復配列は、破損された末端の各々において、標的核酸の二本鎖に関して一本鎖を有するように（粘着末端を有するように）切断され、切断後、反復配列を含む一本鎖オーバーハングは、不適切に反復配列を互いにアニールさせることを防止するように、ＲＰＡタンパク質で被覆される。ＲＡＤ５２は、オーバーハング上の各反復配列に結合し、相補的反復配列をアニール可能な配列が構成される。アニール後、オーバーハングの一本鎖フラップが切断され、新規のＤＮＡの合成が特定のギャップを満たし、ＤＮＡ二本鎖を復元する。この修復の結果、２つの反復の間のＤＮＡ配列は欠失され、欠失の長さは、本明細書において使用される２つの反復の場所、および、切断の進捗の経路または程度を含む、様々な因子に依存し得る。
ＨＤＲと同様に、ＳＳＡは相補的配列、すなわち、相補的反復配列を利用し、対照的に、標的核酸配列を改変または修正するために核酸鋳型を必要としない。
ゲノムにおける一本鎖破損は、上述の修復機構とは別の機構である一本鎖破損修復（ＳＳＢＲ）を通して修復または復元され得る。一本鎖ＤＮＡ切断の場合、ＰＡＲＰ１および／またはＰＡＲＰ２は、切断を認識し、修復機構を集める。ＤＮＡ切断部に関するＰＡＲＰ１の結合および活性は一時的であり、ＳＳＢＲは、損傷領域におけるＳＳＢＲタンパク質複合体の安定性を促進することによって促進される。ＳＳＢＲ複合体におけるもっとも重要なタンパク質は、ＤＮＡの３'末端および５'末端処理を促進するタンパク質と相互作用してＤＮＡを安定化するＸＲＣＣ１である。末端処理は一般に、損傷した３'末端をヒドロキシル化状態に、および／または、損傷した５'末端をリン酸塩部分に修復することを伴い、末端が処理された後に、ＤＮＡギャップフィリングが生じる。ＤＮＡギャップフィリングには２つの方法、すなわち、短いパッチの修復、および、長いパッチの修復がある。短いパッチの修復は、転移した単一ヌクレオチドの挿入を伴う。ＤＮＡギャップフィリング後、ＤＮＡリガーゼは末端の連結を促進する。
ミスマッチ修復（ＭＭＲ）は、ミスマッチしたＤＮＡヌクレオチドに作用し得る。ＭＳＨ２／６またはＭＳＨ２／３複合体の各々は、ＡＴＰａｓｅ活性を有するので、ミスマッチの認識および修復の開始において重要な役割を果たし、ＭＳＨ２／６は主に、ヌクレオチドとヌクレオチドのミスマッチを認識し、ミスマッチした１または２つのヌクレオチドを識別し、一方、ＭＳＨ２／３は主に、より大きいミスマッチを認識する。
塩基除去修復（ＢＥＲ）は、細胞周期全体を通してアクティブな修復方法であり、小さい非へリックス変形ヌクレオチド損傷領域をゲノムから除去するために使用される。損傷したＤＮＡにおいて、損傷したヌクレオチドは、塩基をリン酸塩‐デオキシリボース主鎖に結合するＮ‐グリコシド結合を切断することによって除去され、次に、ホスホジエステル主鎖が切断され、それにより、一本鎖ＤＮＡにおける破損を生成する。それにより形成された、破損した一本鎖の末端は除去され、除去された一本鎖に起因して生成されたギャップは新しい相補塩基で充填され、次に、新しく充填された相補的塩基の末端は、ＤＮＡリガーゼによって主鎖とライゲーションされ、結果として、損傷したＤＮＡが修復または復元する。
ＮＥＲ（ヌクレオチド除去修復）は、大きいへリックス変形損傷をＤＮＡから除去するために重要な切除機構であり、損傷が認識されるとき、損傷した領域を含む短い一本鎖ＤＮＡセグメントが除去され、結果として、２２ｂｐ～３０ｂｐのヌクレオチド配列の一本鎖ギャップが生じる。生成されたギャップは、新しい相補塩基で充填され、新しく充填された相補的塩基の末端は、ＤＮＡリガーゼによって主鎖とライゲーションされ、結果として、損傷したＤＮＡが修復または復元する。
標的遺伝子、すなわち、免疫調節遺伝子をｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ複合体で人工的に操作する効果は、概ね、ノックアウト、ノックダウン、および、ノックインであり得る。
「ノックアウト」という用語は、標的遺伝子または標的核酸の不活性化を指し、「標的遺伝子または標的核酸の不活性化」とは、標的遺伝子または標的核酸の転写および／または翻訳が生じない状態を指す。疾患を引き起こす遺伝子、または、異常な機能を有する遺伝子の転写および翻訳は、ノックアウトを通して阻害され得て、タンパク質発現の防止がもたらされる。
例えば、標的遺伝子または染色体が、ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して編集または訂正されるとき、標的遺伝子または染色体は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して切断され得る。損傷した標的遺伝子または染色体は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用してＮＨＥＪを通して復元され得る。損傷した標的遺伝子または染色体は、ＮＨＥＪに起因するインデルを有し得て、それにより、標的遺伝子または染色体の特異的なノックアウトが誘導され得る。
別の例において、標的遺伝子または染色体がｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体およびドナーを使用して編集または訂正されるとき、標的遺伝子または標的核酸はＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して切断され得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体によって損傷された標的遺伝子または標的核酸は、ドナーを使用してＨＤＲを通して復元され得る。ここで、ドナーは、挿入が望まれる相補的ヌクレオチド配列およびヌクレオチド配列を含む。ここで、挿入が望まれるヌクレオチド配列の数は、挿入の位置または目的に従って調整され得る。損傷した遺伝子または染色体が、ドナーを使用することによって復元されるとき、挿入されることを望まれるヌクレオチド配列は、損傷したヌクレオチド配列領域に挿入され、それにより、標的遺伝子または染色体の特異的なノックアウトが誘導され得る。
「ノックダウン」という用語は、標的遺伝子または標的核酸の転写および／または翻訳の低下、または、標的タンパク質の発現の低下を指す。ノックダウンで遺伝子またはタンパク質の過剰発現を調節することにより、疾患の発症は防止され得る、または、疾患は治療され得る。
例えば、ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ不活性酵素‐転写阻害活性ドメイン複合体、すなわち、転写阻害活性ドメインを含むＣＲＩＳＰＲ不活性複合体を使用して標的遺伝子または染色体が編集または訂正されるとき、ＣＲＩＳＰＲ不活性複合体は、標的遺伝子または染色体に特異的に結合し得て、標的遺伝子または染色体の転写は、ＣＲＩＳＰＲ不活性複合体に含まれる転写阻害活性ドメインによって阻害され得て、それにより、対応する遺伝子または染色体の発現が阻害されるノックダウンを誘導する。
別の例において、ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して、標的遺伝子または染色体が編集または訂正されるとき、標的遺伝子または染色体のプロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって切断され得る。ここで、ｇＲＮＡは、標的遺伝子または染色体のプロモーターおよび／またはエンハンサー領域におけるヌクレオチド配列の一部を標的配列として認識し得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体によって損傷された標的遺伝子または染色体は、ＮＨＥＪを通して復元され得る。損傷した標的遺伝子または染色体はＮＨＥＪに起因するインデルを有し得て、それにより、標的遺伝子または染色体の特異的なノックアウトが誘導され得る。代替的に、ドナーが選択的に使用されるとき、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって損傷された標的遺伝子または染色体はＨＤＲを通して復元され得る。損傷した遺伝子または染色体が、ドナーを使用することによって復元されるとき、挿入されることを望まれるヌクレオチド配列は、損傷したヌクレオチド配列領域に挿入され、それにより、標的遺伝子または染色体の特異的なノックダウンが誘導され得る。
「ノックイン」という用語は、特異的な核酸または遺伝子を標的遺伝子または標的核酸に挿入することを指す。特に、「特異的な核酸または遺伝子」という用語は、挿入されることが意図される、または、発現されることが望まれる核酸または遺伝子を指す。ノックインは、疾患を引き起こす変異体遺伝子を正確に修正することにより、または、通常の遺伝子を挿入することによって通常の遺伝子発現を誘導することにより、疾患を治療するために使用され得る。
加えて、ノックインは追加のドナーを必要とし得る。
例えば、標的遺伝子または標的核酸がｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体およびドナーを使用して編集または訂正されるとき、標的遺伝子または標的核酸はＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して切断され得る。損傷した標的遺伝子または標的核酸は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用してＨＤＲで復元され得る。ここで、ドナーは、特異的な核酸または遺伝子を含み、特異的な核酸または遺伝子は、ドナーを使用して損傷した遺伝子または染色体に挿入され得る。ここで、挿入された特異的な核酸または遺伝子は、タンパク質の発現を誘導し得る。
本明細書によって開示される実施形態として、ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子および／またはＫＤＭ６Ａ遺伝子を人工的に操作または改変し得る。
ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子および／またはＫＤＭ６Ａ遺伝子の標的配列を特異的に認識し得る。
標的配列は、ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体のｇＲＮＡによって特異的に認識され得て、それにより、認識された標的配列の近くにｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体を配置する。
標的配列は、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子、および／または、ＫＤＭ６Ａ遺伝子に人工的改変が成される領域またはエリアであり得る。
標的配列は、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子、および／または、ＫＤＭ６Ａ遺伝子のプロモーター領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
標的配列は、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子、および／または、ＫＤＭ６Ａ遺伝子のイントロン領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
標的配列は、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子、および／または、ＫＤＭ６Ａ遺伝子のエクソン領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
標的配列は、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子、および／または、ＫＤＭ６Ａ遺伝子のエンハンサー領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
標的配列は、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子、および／または、ＫＤＭ６Ａ遺伝子の３'‐ＵＴＲ領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
標的配列は、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子、および／または、ＫＤＭ６Ａ遺伝子の５'‐ＵＴＲ領域に位置する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列であり得る。
標的配列は、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子、および／またはＫＤＭ６Ａ遺伝子のヌクレオチド配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列領域であり得る。
ここで、ＰＡＭ配列は、例えば、以下の配列のうち１または複数であり得る（５'から３'の方向で記載）。
ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）
ＮＮＮＮＲＹＡＣ（Ｎは各々独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ）
ＮＮＡＧＡＡＷ（Ｎは各々独立にＡ、Ｔ，ＣまたはＧ、ＷはＡまたはＴ）
ＮＮＮＮＧＡＴＴ（Ｎは各々独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）
ＮＮＧＲＲ（Ｔ）（Ｎは各々独立にＡ，Ｔ、ＣまたはＧ、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ）
ＴＴＮ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）
一実施形態において、標的配列は、テーブル１に記載されるヌクレオチド配列から選択される１または複数のヌクレオチド配列であり得る。
ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素で形成され得る。
ｇＲＮＡは、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子および／またはＫＤＭ６Ａ遺伝子の標的配列におけるガイド核酸結合配列との部分的にまたは完全相補結合を形成可能なガイドドメインを含み得る。
ガイドドメインは、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相補性または完全相補性を有するガイド核酸結合配列に相補的なヌクレオチド配列であり得る。
ガイドドメインは、ＰＤ‐１遺伝子の標的配列におけるガイド核酸結合配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。ここで、相補的ヌクレオチド配列は、０～５、０～４、０～３、または、０～２のミスマッチを含み得る。
ガイドドメインは、ＣＴＬＡ‐４遺伝子の標的配列におけるガイド核酸結合配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。ここで、相補的ヌクレオチド配列は、０～５、０～４、０～３、または、０～２のミスマッチを含み得る。
ガイドドメインは、Ａ２０遺伝子の標的配列におけるガイド核酸結合配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。ここで、相補的ヌクレオチド配列は、０～５、０～４、０～３、または、０～２のミスマッチを含み得る。
ガイドドメインは、ＤＧＫＡ遺伝子の標的配列におけるガイド核酸結合配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。ここで、相補的ヌクレオチド配列は、０～５、０～４、０～３、または、０～２のミスマッチを含み得る。
ガイドドメインは、ＤＧＫＺ遺伝子の標的配列におけるガイド核酸結合配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。ここで、相補的ヌクレオチド配列は、０～５、０～４、０～３、または、０～２のミスマッチを含み得る。
ガイドドメインは、ＦＡＳ遺伝子の標的配列におけるガイド核酸結合配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。ここで、相補的ヌクレオチド配列は、０～５、０～４、０～３、または、０～２のミスマッチを含み得る。
ガイドドメインは、ＥＧＲ２遺伝子の標的配列におけるガイド核酸結合配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。ここで、相補的ヌクレオチド配列は、０～５、０～４、０～３、または、０～２のミスマッチを含み得る。
ガイドドメインは、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子の標的配列におけるガイド核酸結合配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。ここで、相補的ヌクレオチド配列は、０～５、０～４、０～３、または、０～２のミスマッチを含み得る。
ガイドドメインは、ＴＥＴ２遺伝子の標的配列におけるガイド核酸結合配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。ここで、相補的ヌクレオチド配列は、０～５、０～４、０～３、または、０～２のミスマッチを含み得る。
ガイドドメインは、ＰＳＧＬ‐１遺伝子の標的配列におけるガイド核酸結合配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。ここで、相補的ヌクレオチド配列は、０～５、０～４、０～３、または、０～２のミスマッチを含み得る。
ガイドドメインは、ＫＤＭ６Ａ遺伝子の標的配列におけるガイド核酸結合配列に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。ここで、相補的ヌクレオチド配列は、０～５、０～４、０～３、または、０～２のミスマッチを含み得る。
ｇＲＮＡは、第１相補ドメイン、連結ドメイン、第２相補ドメイン、近位ドメイン、尾部ドメインから成る群から選択される１または複数のドメインを含み得る。
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、および、Ｃｐｆ１タンパク質から成る群から選択される１または複数のタンパク質であり得る。一例において、エディタータンパク質は、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質またはストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質であり得る。
ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素の種類に従って、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子および／またはＫＤＭ６Ａ遺伝子を人工的に操作または改変し得る。
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９タンパク質であるとき、以下のうち１または複数の改変が、人工的に操作または改変されたＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子および／またはＫＤＭ６Ａ遺伝子の標的領域に存在する５'‐ＮＧＧ‐３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣ）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１ｂｐ～５０ｂｐ、１ｂｐ～４０ｂｐ、１ｂｐ～３０ｂｐ、好ましくは連続の１ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列領域に含まれ得る。
ｉ）１または複数のヌクレオチドの欠失
ｉｉ）野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの１または複数のヌクレオチドの置換
ｉｉｉ）１または複数のヌクレオチドの挿入、または、
ｉｖ）上のｉ）からｉｉｉ）からの２以上の選択の組み合わせ
別の例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣｊＣａｓ９タンパク質であるとき、以下のうち１または複数の改変が、人工的に操作または改変されたＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子および／またはＫＤＭ６Ａ遺伝子の標的領域に存在する５'‐ＮＮＮＮＲＹＡＣ‐３'（Ｎは各々独立にＡ、Ｔ、ＧまたはＣ、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１ｂｐ～５０ｂｐ、１ｂｐ～４０ｂｐ、１ｂｐ～３０ｂｐ、好ましくは連続の１ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列領域に含まれ得る。
ｉ）１または複数のヌクレオチドの欠失
ｉｉ）野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの１または複数のヌクレオチドの置換
ｉｉｉ）１または複数のヌクレオチドの挿入、または、
ｉｖ）上のｉ）からｉｉｉ）からの２以上の選択の組み合わせ
更に別の例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｔＣａｓ９タンパク質であるとき、以下のうち１または複数の改変が、人工的に操作または改変されたＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子および／またはＫＤＭ６Ａ遺伝子の標的領域に存在する５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｎは各々独立にＡ、Ｔ、ＧまたはＣ、ＷはＡまたはＴ）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１ｂｐ～５０ｂｐ、１ｂｐ～４０ｂｐ、１ｂｐ～３０ｂｐ、好ましくは連続の１ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列領域に含まれ得る。
ｉ）１または複数のヌクレオチドの欠失
ｉｉ）野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの１または複数のヌクレオチドの置換
ｉｉｉ）１または複数のヌクレオチドの挿入、または、
ｉｖ）上のｉ）からｉｉｉ）からの２以上の選択の組み合わせ
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＮｍＣａｓ９タンパク質であるとき、以下のうち１または複数の改変が、人工的に操作または改変されたＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子および／またはＫＤＭ６Ａ遺伝子の標的領域に存在する５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'（Ｎは各々独立にＡ、Ｔ、ＧまたはＣ）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１ｂｐ～５０ｂｐ、１ｂｐ～４０ｂｐ、１ｂｐ～３０ｂｐ、好ましくは連続の１ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列領域に含まれ得る。
ｉ）１または複数のヌクレオチドの欠失
ｉｉ）野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの１または複数のヌクレオチドの置換
ｉｉｉ）１または複数のヌクレオチドの挿入、または、
ｉｖ）上のｉ）からｉｉｉ）からの２以上の選択の組み合わせ
別の例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳａＣａｓ９タンパク質であるとき、以下のうち１または複数の改変が、人工的に操作または改変されたＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子および／またはＫＤＭ６Ａ遺伝子の標的領域に存在する５'‐ＮＮＧＲＲ（Ｔ）‐３'（Ｎは各々独立にＡ、Ｔ、ＧまたはＣ、ＲはＡまたはＧ、（Ｔ）は任意選択で含めることができる任意の配列）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１ｂｐ～５０ｂｐ、１ｂｐ～４０ｂｐ、１ｂｐ～３０ｂｐ、好ましくは連続の１ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列領域に含まれ得る。
ｉ）１または複数のヌクレオチドの欠失
ｉｉ）野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの１または複数のヌクレオチドの置換
ｉｉｉ）１または複数のヌクレオチドの挿入、または、
ｉｖ）上のｉ）からｉｉｉ）からの２以上の選択の組み合わせ
更に別の例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣｐｆ１タンパク質であるとき、以下のうち１または複数の改変が、人工的に操作または改変されたＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子および／またはＫＤＭ６Ａ遺伝子の標的領域に存在する５'‐ＴＴＮ‐３'（Ｎは各々独立にＡ、Ｔ、ＧまたはＣ）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１ｂｐ～５０ｂｐ、１ｂｐ～４０ｂｐ、１ｂｐ～３０ｂｐ、好ましくは連続の１ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列領域に含まれ得る。
ｉ）１または複数のヌクレオチドの欠失
ｉｉ）野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの１または複数のヌクレオチドの置換
ｉｉｉ）１または複数のヌクレオチドの挿入、または、
ｉｖ）上のｉ）からｉｉｉ）からの２以上の選択の組み合わせ
ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体によって、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子、および／または、ＫＤＭ６Ａ遺伝子を人工的に操作する効果はノックアウトであり得る。
ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体によって、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子、および／または、ＫＤＭ６Ａ遺伝子を人工的に操作する効果は、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子、および／またはＫＤＭ６Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を阻害し得る。
ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体によって、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子、および／または、ＫＤＭ６Ａ遺伝子を人工的に操作する効果はノックダウンであり得る。
ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体によって、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子、および／または、ＫＤＭ６Ａ遺伝子を人工的に操作する効果は、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子、および／またはＫＤＭ６Ａ遺伝子によってそれぞれコードされるタンパク質の発現を低減し得る。
ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体によって、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子、および／または、ＫＤＭ６Ａ遺伝子を人工的に操作する効果はノックインであり得る。
ここで、ノックイン効果は、ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体によって、および、追加的に、外来ヌクレオチド配列または遺伝子を含むドナーによって誘導され得る。
ｇＲＮＡ‐ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体によって、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子、および／または、ＫＤＭ６Ａ遺伝子を人工的に操作する効果は、外来ヌクレオチド配列または遺伝子によってコードされるペプチドまたはタンパク質を発現し得る。
本明細書によって開示される一態様は、操作された免疫細胞に関する。
「免疫細胞」は、免疫応答に関与する細胞であり、免疫応答に直接的または間接的に関与する全部の細胞、および、その分化前細胞を含む。
免疫細胞は、サイトカイン分泌、他の免疫細胞への分化、および、細胞毒性の機能を有し得る。免疫細胞は、天然状態からの変異を経た細胞も含む。
免疫細胞は、骨髄における造血幹細胞から分化し、概ね、リンパ球系前駆細胞および骨髄前駆細胞を含み、また、リンパ球系前駆細胞が分化する、獲得免疫を担うＴ細胞およびＢ細胞のすべてと、骨髄前駆細胞から分化する、マクロファージ、好酸球、好中球、好塩基、巨核球、赤血球などとを含む。
具体的には、細胞は、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞またはエフェクターメモリーＴ細胞）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、幹細胞メモリーＴ細胞、リンパ球系前駆細胞、造血幹細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、樹状細胞、サイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ）、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、単球、マクロファージ、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞などから成る群から選択される少なくとも１つであり得る。
「操作された免疫細胞」とは、天然状態ではなく、人工的操作を受けた免疫細胞を意味する。近年、身体から免疫細胞を抽出して人工的操作を適用することによって免疫を増強するための技法が活発に研究されている。そのような操作された免疫細胞は、特定の疾患に対して優れた免疫効果を有することから、新規の治療方法であることが示されている。特に、操作された免疫細胞に関する研究は、癌治療に関連して活発に行われている。
操作された免疫細胞は、免疫細胞操作用組成物によって人工的に操作または改変された免疫細胞であり得る。ここで、「免疫細胞操作用組成物」という用語は、免疫細胞を人工的に改変または操作するために使用されるＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸、タンパク質、ウイルス、組成物など、１または複数の物質を指し、例えば、免疫細胞操作用組成物は、遺伝子操作用組成物の一部または全体をを含み得て、また、外因性タンパク質を発現するための外因性タンパク質をコードする核酸も含み得る。
操作された免疫細胞は、遺伝子操作によって生成される免疫細胞であり得る。
ここで、遺伝子操作は、遺伝子発現の調節プロセスを考慮して実行され得る。
一例において、遺伝子操作は、各ステップに適切な操作意味を選択することによって、転写調節、ＲＮＡ処理調節、ＲＮＡ輸送調節、ＲＮＡ分解調節、翻訳調節、または、タンパク質改変調節のステップにおいて実行され得る。
例えば、遺伝子操作は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）またはＲＮＡサイレンシングを使用してｍＲＮＡを防止することによって、および、いくつかの場合、中間段階におけるタンパク質合成の情報の送達を防止するように破壊することによって、遺伝子情報の発現を制御し得る。
別の例において、遺伝子操作は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、好ましくは、ＤＮＡ分子における核酸間の結合の加水分解（切断）を触媒可能な野性型またはバリアント酵素を使用し得る。ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体が使用され得る。
例えば、遺伝子操作は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（Ｃａｓ９タンパク質）、ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃｐｆ１（Ｃｐｆ１タンパク質）およびＴＡＬＥヌクレアーゼから成る群から選択される１または複数のヌクレアーゼを使用して遺伝子を操作することによって、遺伝子情報の発現を制御し得る。
好ましい例において、これらに限定されないが、遺伝子操作は、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体によって実行され得て、上のガイド核酸エディタータンパク質についての説明は上に記載した通りである。
追加的に、操作された免疫細胞は、特異的なタンパク質の機能の喪失または損傷に起因して改変された機能を有する免疫細胞であり得る。
ここで、特異的なタンパク質の機能は、化合物よって喪失または損傷され得る。
化合物は、特異的なタンパク質に結合し、免疫調節因子の機能を妨げ得る。
追加的に、化合物は、特異的なタンパク質に結合して、免疫調節因子の構造を改変し得て、それにより、その正常機能を妨げる。
代替的に、特異的なタンパク質の機能は、特異的なタンパク質に結合するタンパク質の改変によって喪失または損傷され得る。
操作された免疫細胞は、機能的に操作された免疫細胞または操作されたハイブリッド免疫細胞であり得る。
本発明によって開示される実施形態のように、操作された免疫細胞は、機能的に操作された免疫細胞であり得る。
「機能的に操作された免疫細胞」という用語は、免疫調節因子の機能を損傷させるように、野性型免疫調節因子の自然な発現が改変された、または、人工的に操作された、免疫細胞を指す。
「免疫調節因子」という用語は、免疫調節遺伝子によってコードされたポリペプチドまたはタンパク質を指し、免疫調節遺伝子によって転写、翻訳および発現された免疫調節タンパク質とも称され得る。
機能的に操作された免疫細胞は、免疫調節因子の発現を抑制または阻害するように操作された免疫細胞であり得る。
ここで、機能的に操作された免疫細胞は、免疫調節因子の発現を抑制または阻害するように免疫調節遺伝子が操作された、免疫細胞であり得る。
機能的に操作された免疫細胞は、免疫細胞活性調節遺伝子が操作されたものであり得る。
ここで、機能的に操作された免疫細胞は、ＳＨＰ‐１、ＰＤ‐１、ＣＴＬＡ‐４、ＣＢＬＢ、ＩＬＴ‐２、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＰＳＧＬ‐１から選択される１または複数の遺伝子が不活性化されたものであり得る。
機能的に操作された免疫細胞は、免疫細胞増殖調節遺伝子が操作されたものであり得る。
ここで、機能的に操作された免疫細胞は、ＤＧＫ‐アルファ、ＤＧＫ‐ゼータ、ＦＡＳ、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、ＰＰＰ２ｒ２ｄ、Ａ２０から選択される１または複数の遺伝子が不活性化されたものであり得る。好ましい実施形態において、ＤＧＫ‐アルファ、ＤＧＫ‐ゼータ、ＥＧＲ２、ＰＰＰ２ｒ２ｄ、Ａ２０から選択された１または複数の遺伝子が不活性化される。
機能的に操作された免疫細胞は、免疫細胞死調節遺伝子が操作されたものであり得る。
ここで、機能的に操作された免疫細胞は、ＤＡＸＸ、ＢＩＭ、ＢＩＤ、ＢＡＤ、ＰＤ‐１およびＣＴＬＡ‐４から選択された１または複数の遺伝子が不活性化された免疫細胞であり得る。
追加的に、機能的に操作された免疫細胞は、自殺を誘導する要素が挿入された免疫細胞であり得る。
機能的に操作された免疫細胞は、免疫細胞疲弊調節要素が操作された、免疫細胞であり得る。
ここで、機能的に操作された免疫細胞は、ＴＥＴ２、ＷＮＴ、ＡＫＴから選択された１または複数の遺伝子が不活性化された免疫細胞であり得る。
機能的に操作された免疫細胞は、サイトカイン分泌要素が操作されたものであり得る。
機能的に操作された免疫細胞は、抗原結合調節要素が操作されたものであり得る。
ここで、機能的に操作された免疫細胞は、ｄＣＫ、ＣＤ５２、Ｂ２ＭおよびＭＨＣから選択された１または複数の遺伝子が不活性化された免疫細胞であり得る。
機能的に操作された免疫細胞は、上述の遺伝子とは異なる免疫調節遺伝子が操作されたものであり得る。
機能的に操作された免疫細胞は、１または複数の免疫調節遺伝子が同時に操作されるものであり得る。ここで、１または複数の種類の免疫調節遺伝子が操作され得る。
ここで、１つの免疫調節遺伝子を操作するとき、新規の免疫効果は、必ずしも示されない。１つの免疫調節遺伝子の操作は、様々な新規の免疫効果を生じさせ得る、または、阻害し得る。
機能的に操作された免疫細胞は、免疫調節遺伝子に加えて、野性型受容体をコードする遺伝子が操作された、免疫細胞であり得る。
ここで、野性型受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であり得る。
機能的に操作された免疫細胞は、野性型受容体が表面上に存在しない、または、低い割合で存在するものであり得る。
機能的に操作された免疫細胞は、表面上に野性型受容体がより高い割合で存在するものであり得る。
機能的に操作された免疫細胞は、野性型受容体が特異的抗原の認識能力を強化させたものであり得る。
機能的に操作された免疫細胞は、野性型受容体および免疫調節遺伝子を操作することによって、新しい免疫学的有効性を有し得る。
新規の免疫効果は、特定の抗原を認識する能力が調節されたものであり得る。
新規の免疫効果は、特定の抗原を認識する能力が改善されたものであり得る。
特に、特定の抗原は、例えば癌細胞の抗原など、疾患の抗原であり得る。
新規の免疫効果は、特定の抗原を認識する能力が低下したものであり得る。
新規の免疫効果は、新規の免疫効果が改善されたものであり得る。
新規の免疫効果は、免疫細胞の増殖が調節されたものであり得る。特に、免疫効果は、増殖および分化が促進または遅延されるものであり得る。
新規の免疫効果は、免疫細胞の細胞死が調節されたものであり得る。特に、免疫効果は、免疫細胞の死を防止するためのものであり得る。追加的に、免疫効果は、適切な時間が経過したときに、免疫細胞に自殺させるためのものであり得る。
新規の免疫効果は、免疫細胞の機能の消失が緩和されたものであり得る。
新規の免疫効果は、免疫細胞のサイトカイン分泌が調節されたものであり得る。特に、免疫効果は、サイトカインの分泌を促進または阻害するためのものであり得る。
新規の免疫効果は、免疫細胞における野性型受容体の抗原結合能を調節するためのものであり得る。特に、免疫効果は、特定の抗原に対する野性型受容体の特異性を改善するためのものであり得る。
追加的に、機能的に操作された免疫細胞は、免疫調節因子の機能が損傷されるように操作された免疫細胞であり得る。
ここで、免疫調節因子の機能は、化合物によって喪失または損傷され得る。
化合物は、免疫調節因子、または、免疫調節因子と相互作用する特異的タンパク質と結合し、免疫調節因子の機能を妨げ得る。
追加的に、化合物は、免疫調節因子に結合し、免疫調節因子の３次元構造を人工的に改変し得て、それにより、その正常機能を妨げる。
代替的に、免疫調節因子の機能は、免疫調節因子と相互作用するタンパク質の改変によって喪失または損傷され得る。
本明細書によって開示される一実施形態として、操作された免疫細胞は、免疫調節遺伝子が人工的に操作された、機能的に操作された免疫細胞であり得る。
ここで、免疫調節遺伝子は、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子および／またはＫＤＭ６Ａ遺伝子であり得る。
機能的に操作された免疫細胞は、遺伝子操作用組成物によって操作され得る。
上の遺伝子操作用組成物についての説明は上に記載した通りである。
機能的に操作された免疫細胞は、１または複数の人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子を含み得る。
ここで、人工的に改変された免疫調節遺伝子は、標的配列、または、標的配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチド配列領域における以下の１または複数の改変を含み得る。
ｉ）１または複数のヌクレオチドの欠失
ｉｉ）野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの１または複数のヌクレオチドの置換
ｉｉｉ）１または複数のヌクレオチドの挿入、または、
ｉｖ）上のｉ）からｉｉｉ）からの２以上の選択の組み合わせ
一例において、機能的に操作された免疫細胞は、１または複数の人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子を含み得る。
ここで、人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子は、標的配列、または、標的配列の５'末端および／または３'末端に隣接する１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチド配列領域において、欠失された１または複数のヌクレオチドを含み得る。
例えば、人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子は、標的配列に配置されたヌクレオチド配列領域における欠失された１または複数のヌクレオチドを含み得る。
ここで、欠失したヌクレオチドは、連続、不連続、または、両方の形態（すなわち、連続および不連続）が混在した１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチドであり得る。例えば、欠失したヌクレオチドは、標的配列に配置された１ｂｐのヌクレオチドであり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列に配置された１ｂｐのヌクレオチドであり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、連続の３ｂｐのヌクレオチドであり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する不連続の４ｂｐのヌクレオチドであり得て、不連続の４ｂｐのヌクレオチドは、１ｂｐのヌクレオチドおよび連続の３ｂｐのヌクレオチドであり得る、または、連続の２ｂｐのヌクレオチドおよび別の連続の２ｂｐのヌクレオチドであり得る（図１）。例えば、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する不連続の３０ｂｐのヌクレオチドであり得て、不連続の３０ｂｐのヌクレオチドは、連続の２５ｂｐのヌクレオチド、連続の４ｂｐのヌクレオチド、および、不連続の１ｂｐのヌクレオチドであり得る。
ここで、代替的に、欠失したヌクレオチドは、２ｂｐ以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド断片であり得る。ヌクレオチド断片は、２ｂｐ～５ｂｐ、６ｂｐ～１０ｂｐ、１１ｂｐ～１５ｂｐ、１６ｂｐ～２０ｂｐ、２１ｂｐ～２５ｂｐ、２６ｂｐ～３０ｂｐ、３１ｂｐ～３５ｂｐ、３６ｂｐ～４０ｂｐ、４１ｂｐ～４５ｂｐまたは４６ｂｐ～５０ｂｐであり得る。例えば、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する２ｂｐのヌクレオチド断片であり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列に配置された１０ｂｐのヌクレオチド断片であり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する１６ｂｐのヌクレオチド断片であり得る（図２）。
代替的に、ここで、欠失したヌクレオチドは、２ｂｐ以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド断片であり得る。ここで、２ｂｐ以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド断片は、不連続のヌクレオチド配列を有する、すなわち、１または複数のヌクレオチド配列ギャップを有する個々のヌクレオチド断片であり得て、２以上の欠失領域は、２以上の欠失されたヌクレオチド断片によって生成され得る。例えば、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する２ｂｐのヌクレオチド断片、および、６ｂｐのヌクレオチド断片であり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する１２ｂｐのヌクレオチド断片および６ｂｐのヌクレオチド断片であり得る（図３）。
別の例において、人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子は、標的配列の５'末端および／または３'末端に隣接する１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチド配列領域における欠失された１または複数のヌクレオチドを含み得る。
ここで、欠失したヌクレオチドは、連続、不連続、または、両方の形態（すなわち、連続および不連続）が混在した１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチドであり得る。例えば、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する１ｂｐのヌクレオチドであり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列の３'末端に隣接して位置する、連続の４ｂｐのヌクレオチドであり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する不連続の４ｂｐのヌクレオチドであり得て、不連続の４ｂｐのヌクレオチドは、標的配列の５'末端に隣接して位置する連続の３ｂｐのヌクレオチド、および、標的配列の３'末端に隣接して位置する１ｂｐのヌクレオチドであり得る（図４）。例えば、欠失したヌクレオチドは、標的配列に配置する不連続の２５ｂｐのヌクレオチドであり得て、不連続の２５ｂｐのヌクレオチドは、連続の１５ｂｐのヌクレオチド、連続の８ｂｐのヌクレオチド、不連続の１ｂｐのヌクレオチド、および、不連続の１ｂｐのヌクレオチドであり得る。
ここで、代替的に、欠失したヌクレオチドは、連続の２ｂｐ以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド断片であり得る。ヌクレオチド断片は、２ｂｐ～５ｂｐ、６ｂｐ～１０ｂｐ、１１ｂｐ～１５ｂｐ、１６ｂｐ～２０ｂｐ、２１ｂｐ～２５ｂｐ、２６ｂｐ～３０ｂｐ、３１ｂｐ～３５ｂｐ、３６ｂｐ～４０ｂｐ、４１ｂｐ～４５ｂｐまたは４６ｂｐ～５０ｂｐであり得る。例えば、欠失したヌクレオチドは、標的配列の３'末端に隣接して位置する２ｂｐのヌクレオチド断片であり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列の５'末端に隣接して位置する１０ｂｐのヌクレオチド断片であり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列の３'末端に隣接して位置する２０ｂｐのヌクレオチド断片であり得る（図５）。
ここで、代替的に、欠失したヌクレオチドは、２ｂｐ以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド断片であり得る。ここで、２ｂｐ以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド断片は、不連続のヌクレオチド配列を有する、すなわち、１または複数のヌクレオチド配列ギャップを有する個々のヌクレオチド断片であり得て、２以上の欠失領域は、２以上の欠失されたヌクレオチド断片によって生成され得る。例えば、欠失したヌクレオチドは、標的配列の５'末端に隣接して位置する３ｂｐのヌクレオチド断片、および、標的配列の３'末端に隣接して位置する６ｂｐのヌクレオチド断片であり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列の３'末端に隣接して位置する１２ｂｐのヌクレオチド断片および６ｂｐのヌクレオチド断片であり得る（図６）。
更に別の例において、人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子は、標的配列、および、標的配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチド配列領域において、欠失された１または複数のヌクレオチドを含み得る。
ここで、欠失したヌクレオチドは、連続、不連続、または、両方の形態（すなわち、連続および不連続）が混在した１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチドであり得る。例えば、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する、および、標的配列の３'末端に隣接して位置する連続の４ｂｐのヌクレオチドであり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する、および、標的配列の３'末端に隣接する不連続の３ｂｐのヌクレオチドであり得て、不連続の３ｂｐのヌクレオチドは、標的配列に位置する連続の２ｂｐのヌクレオチド、および、標的配列の３'末端に隣接して位置する１ｂｐのヌクレオチドであり得る（図７）。例えば、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する不連続の４０ｂｐのヌクレオチドであり得る、不連続の２５ｂｐのヌクレオチドは、連続の１０ｂｐのヌクレオチド、連続の８ｂｐのヌクレオチド、および、不連続の５ｂｐ（不連続の１ｂｐ、１ｂｐ、１ｂｐ、１ｂｐ、１ｂｐ）のヌクレオチドであり得る。
ここで、代替的に、欠失したヌクレオチドは、２ｂｐ以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド断片であり得る。ヌクレオチド断片は、２ｂｐ～５ｂｐ、６ｂｐ～１０ｂｐ、１１ｂｐ～１５ｂｐ、１６ｂｐ～２０ｂｐ、２１ｂｐ～２５ｂｐ、２６ｂｐ～３０ｂｐ、３１ｂｐ～３５ｂｐ、３６ｂｐ～４０ｂｐ、４１ｂｐ～４５ｂｐまたは４６ｂｐ～５０ｂｐであり得る。例えば、欠失したヌクレオチドは、標的配列に、および、標的配列の３'末端に隣接して位置する２５ｂｐのヌクレオチド断片であり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列の５'末端および３'末端に隣接する、標的配列に位置する３５ｂｐのヌクレオチド断片であり得る（図８）。
ここで、代替的に、欠失したヌクレオチドは、２以上のヌクレオチド断片であり得る。ここで、２以上のヌクレオチド断片は、不連続のヌクレオチド配列を有する、すなわち、１または複数のヌクレオチド配列ギャップを有する個々のヌクレオチド断片であり得て、２以上の欠失領域は、２以上の欠失されたヌクレオチド断片によって生成され得る。例えば、欠失したヌクレオチドは、標的配列に、および、標的配列の５'末端に隣接して位置する６ｂｐのヌクレオチド断片、ならびに、標的配列、および、標的配列の３'末端に隣接して位置する１３ｂｐのヌクレオチド断片であり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列における、および、標的配列の３'末端に隣接する１７ｂｐのヌクレオチド断片、ならびに、標的配列の３'末端に隣接して位置する４ｂｐのヌクレオチド断片であり得る（図９）。
別の例において、機能的に操作された免疫細胞は、１または複数の人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子を含み得る。
ここで、人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子は、標的配列、または、標的配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチド配列領域において、挿入された１または複数のヌクレオチドを含み得る。
例えば、人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子は、標的配列に位置するヌクレオチド配列領域における挿入された１または複数のヌクレオチドを含み得る。
ここで、挿入されたヌクレオチドは、連続、不連続、または、両方の形態（すなわち、連続および不連続）が混在した１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチドであり得る。例えば、挿入されたヌクレオチドは、標的配列におけるヌクレオチド配列領域に挿入される連続の２ｂｐのヌクレオチドであり得る。代替的に、挿入されたヌクレオチドは、標的配列におけるヌクレオチド配列領域に挿入される不連続の３ｂｐのヌクレオチドであり得て、不連続の３ｂｐのヌクレオチドは、１ｂｐのヌクレオチド、および、連続の２ｂｐのヌクレオチドであり得る。代替的に、挿入されたヌクレオチドは、標的配列におけるヌクレオチド配列領域に挿入された不連続の４ｂｐのヌクレオチドであり得て、不連続の４ｂｐのヌクレオチドは、１ｂｐのヌクレオチド、連続の２ｂｐのヌクレオチド、および、別の１ｂｐのヌクレオチドであり得る（図１０）。例えば、挿入されたヌクレオチドは、標的配列におけるヌクレオチド配列領域に挿入された不連続の３０ｂｐのヌクレオチドであり得て、不連続の３０ｂｐのヌクレオチドは、連続の１５ｂｐのヌクレオチド、連続の１２ｂｐのヌクレオチド、および、不連続の３ｂｐ（不連続の１ｂｐ、１ｂｐおよび１ｂｐ）のヌクレオチドであり得る。
ここで、代替的に、挿入されたヌクレオチドは、連続の５ｂｐ以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド断片であり得る。ヌクレオチド断片は、５ｂｐ～１０ｂｐ、１１ｂｐ～５０ｂｐ、５０ｂｐ～１００ｂｐ、１００ｂｐ～２００ｂｐ、２００ｂｐ～３００ｂｐ、３００ｂｐ～４００ｂｐ、４００ｂｐ～５００ｂｐ、５００ｂｐ～７５０ｂｐ、または７５０ｂｐ～１０００ｂｐであり得る。例えば、挿入されたヌクレオチドは、標的配列におけるヌクレオチド配列領域に挿入された１０ｂｐのヌクレオチド断片であり得る。代替的に、挿入されたヌクレオチドは、標的配列におけるヌクレオチド配列領域に挿入された２８ｂｐのヌクレオチド断片であり得る（図１１）。
ここで、代替的に、挿入されたヌクレオチドは、特異的な遺伝子のヌクレオチド配列の一部または全体であり得る。特異的な遺伝子は、免疫調節遺伝子を含む対象、例えばヒト細胞に含まれない外部領域から導入される遺伝子であり得る。代替的に、特異的な遺伝子は、免疫調節遺伝子を含む対象、例えばヒト細胞に存在する遺伝子、例えば、ヒト細胞ゲノムに存在する遺伝子であり得る。例えば、挿入されたヌクレオチドは、標的配列におけるヌクレオチド配列領域に挿入された外来遺伝子におけるヌクレオチド配列の一部であり得る。代替的に、挿入されたヌクレオチドは、標的配列におけるヌクレオチド配列領域に挿入された外来遺伝子のヌクレオチド配列の全体であり得る。代替的に、挿入されたヌクレオチドは、標的配列におけるヌクレオチド配列領域に挿入される内在性遺伝子におけるヌクレオチド配列の一部であり得て、内在性遺伝子は、標的遺伝子、すなわち、免疫調節遺伝子の対立遺伝子、または、標的遺伝子以外の遺伝子であり得る。代替的に、挿入されたヌクレオチドは、標的配列におけるヌクレオチド配列領域に挿入される内在性遺伝子におけるヌクレオチド配列の全体であり得て、内在性遺伝子は、標的遺伝子、すなわち、免疫調節遺伝子の対立遺伝子、または、標的遺伝子以外の遺伝子であり得る（図１２）。
別の例において、人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子は、標的配列、または、標的配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチド配列領域において、挿入された１または複数のヌクレオチドを含み得る。
ここで、挿入されたヌクレオチドは、連続、不連続、または、両方の形態（すなわち、連続および不連続）が混在した１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチドであり得る。例えば、挿入されたヌクレオチドは、標的配列の５'末端に隣接して位置するヌクレオチド配列領域に挿入される連続の２ｂｐのヌクレオチドであり得る。代替的に、挿入されたヌクレオチドは、標的配列の３'末端に隣接して位置するヌクレオチド配列領域に挿入される不連続の３ｂｐのヌクレオチドであり得て、不連続の３ｂｐのヌクレオチドは、１ｂｐのヌクレオチド、および、連続の２ｂｐのヌクレオチドであり得る（図１３）。例えば、挿入されたヌクレオチドは、標的配列におけるヌクレオチド領域に挿入される不連続の４０ｂｐのヌクレオチドであり得て、不連続の４０ｂｐのヌクレオチドは、連続の１５ｂｐのヌクレオチド、連続の２０ｂｐのヌクレオチド、および、連続の５ｂｐのヌクレオチドであり得る。
ここで、代替的に、挿入されたヌクレオチドは、連続の５ｂｐ以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド断片であり得る。ヌクレオチド断片は、５ｂｐ～１０ｂｐ、１１ｂｐ～５０ｂｐ、５０ｂｐ～１００ｂｐ、１００ｂｐ～２００ｂｐ、２００ｂｐ～３００ｂｐ、３００ｂｐ～４００ｂｐ、４００ｂｐ～５００ｂｐ、５００ｂｐ～７５０ｂｐ、または７５０ｂｐ～１０００ｂｐであり得る。例えば、挿入されたヌクレオチドは、標的配列の５'末端に隣接して位置するヌクレオチド配列領域に挿入される２２ｂｐのヌクレオチド断片であり得る。代替的に、挿入されたヌクレオチドは、標的配列の３'末端に隣接して位置するヌクレオチド配列領域に挿入される３７ｂｐのヌクレオチド断片であり得る（図１４）。
ここで、代替的に、挿入されたヌクレオチドは、特異的な遺伝子のヌクレオチド配列の一部または全体であり得る。特異的な遺伝子は、免疫調節遺伝子を含む対象、例えばヒト細胞に含まれない外部領域から導入される遺伝子であり得る。代替的に、特異的な遺伝子は、免疫調節遺伝子を含む対象、例えばヒト細胞に存在する遺伝子、例えば、ヒト細胞ゲノムに含まれる遺伝子であり得る。例えば、挿入されたヌクレオチドは、標的配列の５'末端に隣接して位置するヌクレオチド配列領域に挿入される外来遺伝子におけるヌクレオチド配列の一部であり得る。代替的に、挿入されたヌクレオチドは、標的配列の３'末端に隣接して位置するヌクレオチド配列領域に挿入された外来遺伝子におけるヌクレオチド配列の全体であり得る。代替的に、挿入されたヌクレオチドは、標的配列の５'末端に隣接して位置するヌクレオチド配列領域に挿入される内在性遺伝子におけるヌクレオチド配列の一部であり得て、内在性遺伝子は、標的遺伝子、すなわち、免疫調節遺伝子の対立遺伝子、または、標的遺伝子以外の遺伝子であり得る。代替的に、挿入されたヌクレオチドは、標的配列の３'末端に隣接して位置するヌクレオチド配列領域に挿入される内在性遺伝子におけるヌクレオチド配列の全体であり得て、内在性遺伝子は、標的遺伝子、すなわち、免疫調節遺伝子の対立遺伝子、または、標的遺伝子以外の遺伝子であり得る（図１５）。
更に別の例において、機能的に操作された免疫細胞は、１または複数の人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子を含み得る。
ここで、人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子は、標的配列、または、標的配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチド配列領域において、欠失または挿入された１または複数のヌクレオチドを含み得る。
例えば、人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子は、標的配列に配置されたヌクレオチド配列領域における欠失または挿入された１または複数のヌクレオチドを含み得る。
ここで、欠失したヌクレオチドは、連続、不連続、または、両方の形態（すなわち、連続および不連続）が混在した１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチドであり得る。
ここで、挿入されたヌクレオチドは、連続、不連続、または、両方の形態（すなわち、連続および不連続）が混在した１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチド、ヌクレオチド断片、または、特異的な遺伝子のヌクレオチド配列の一部または全体であり得て、欠失および挿入は順次または同時に生じ得る。
挿入されたヌクレオチド断片は、５ｂｐ～１０ｂｐ、１１ｂｐ～５０ｂｐ、５０ｂｐ～１００ｂｐ、１００ｂｐ～２００ｂｐ、２００ｂｐ～３００ｂｐ、３００ｂｐ～４００ｂｐ、４００ｂｐ～５００ｂｐ、５００ｂｐ～７５０ｂｐ、または７５０ｂｐ～１０００ｂｐであり得る。
特異的な遺伝子は、免疫調節遺伝子を含む対象、例えばヒト細胞に含まれない外部領域から導入される遺伝子であり得る。代替的に、特異的な遺伝子は、免疫調節遺伝子を含む対象、例えばヒト細胞に存在する遺伝子、例えば、ヒト細胞ゲノムに含まれる遺伝子であり得る。
例えば、ヌクレオチドの欠失および挿入は、標的配列における同様の位置において生じ得て、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する１ｂｐのヌクレオチドであり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、欠失したヌクレオチド配列の位置に挿入された連続の２ｂｐのヌクレオチドであり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する連続の３ｂｐのヌクレオチドであり得る、この場合、挿入されたヌクレオチドは、欠失したヌクレオチド配列の位置に挿入された連続の２０ｂｐのヌクレオチド断片であり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する連続の２ｂｐのヌクレオチドであり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、欠失したヌクレオチド配列の位置に挿入された外来遺伝子ヌクレオチド配列の一部であり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する連続の３ｂｐのヌクレオチドであり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、欠失したヌクレオチド配列の位置に挿入される内在性遺伝子ヌクレオチド配列の全体であり得て、内在性遺伝子は、標的遺伝子、すなわち免疫調節遺伝子の対立遺伝子、または、標的遺伝子以外の遺伝子であり得る（図１６）。
例えば、ヌクレオチドの欠失および挿入は、標的配列における異なる位置で生じ得て、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する連続の４ｂｐのヌクレオチドであり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、標的配列における欠失していない異なる位置に挿入された連続の１２ｂｐのヌクレオチド断片であり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する連続の５ｂｐのヌクレオチドであり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、標的配列における欠失していない異なる位置に挿入される内在性遺伝子ヌクレオチド配列の一部であり得て、内在性遺伝子は、標的遺伝子、すなわち、免疫調節遺伝子の対立遺伝子、または、標的遺伝子以外の遺伝子であり得る（図１７）。
例えば、ヌクレオチドの欠失および挿入は、標的配列における類似の、または、異なる位置で生じ得て、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する１ｂｐのヌクレオチドおよび連続の４ｂｐのヌクレオチドであり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、標的配列の２つの欠失位置のうち１つ、すなわち、１ｂｐのヌクレオチド欠失の位置に挿入された連続の１０ｂｐのヌクレオチド断片であり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する連続の５ｂｐのヌクレオチドおよび１ｂｐのヌクレオチドであり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、２つの欠失位置のうち１つ、すなわち、連続の５ｂｐのヌクレオチド欠失の位置に挿入された内在性遺伝子ヌクレオチド配列の全体であり得て、内在性遺伝子は、標的遺伝子、すなわち、免疫調節遺伝子の対立遺伝子、または、標的遺伝子以外の遺伝子であり得る（図１８）。
ここで、代替的に、欠失したヌクレオチドは、２ｂｐ以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド断片であり得る。
欠失されたヌクレオチド断片は、２ｂｐ～５ｂｐ、６ｂｐ～１０ｂｐ、１１ｂｐ～１５ｂｐ、１６ｂｐ～２０ｂｐ、２１ｂｐ～２５ｂｐ、２６ｂｐ～３０ｂｐ、３１ｂｐ～３５ｂｐ、３６ｂｐ～４０ｂｐ、４１ｂｐ～４５ｂｐまたは４６ｂｐ～５０ｂｐであり得る。
ここで、挿入されたヌクレオチドは、連続、不連続、または、両方の形態（すなわち、連続および不連続）が混在した１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチド、ヌクレオチド断片、または、特異的な遺伝子のヌクレオチド配列の一部または全体であり得て、欠失および挿入は順次または同時に生じ得る。
例えば、ヌクレオチドの欠失および挿入は、標的配列における同様の位置において生じ得て、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する１０ｂｐのヌクレオチド断片であり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、欠失したヌクレオチド配列の位置に挿入された連続の２ｂｐのヌクレオチドであり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する連続の１７ｂｐのヌクレオチド断片であり得る、この場合、挿入されたヌクレオチドは、欠失したヌクレオチド配列の位置に挿入された連続の２０ｂｐのヌクレオチド断片であり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する１５ｂｐのヌクレオチド断片であり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、欠失したヌクレオチド配列の位置に挿入される内在性遺伝子ヌクレオチド配列の一部であり得て、内在性遺伝子は、標的遺伝子、すなわち、免疫調節遺伝子の対立遺伝子、または、標的遺伝子以外の遺伝子であり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する７ｂｐのヌクレオチド断片であり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、欠失したヌクレオチド配列の位置に挿入された外来遺伝子ヌクレオチド配列の全体であり得る（図１９）。
ここで、代替的に、欠失したヌクレオチドは、２ｂｐ以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド断片であり得る。
ここで、挿入されたヌクレオチドは、連続、不連続、または、両方の形態（すなわち、連続および不連続）が混在した１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチド、ヌクレオチド断片、または、特異的な遺伝子のヌクレオチド配列の一部または全体であり得て、欠失および挿入は順次または同時に生じ得る。追加的に、挿入は、２以上の欠失領域の一部または全域において生じ得る。
例えば、ヌクレオチドの欠失および挿入は、標的配列の類似および／または異なる位置において生じ得て、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する６ｂｐのヌクレオチド断片および１２ｂｐのヌクレオチド断片であり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、標的配列の２つの欠失位置のうち１つ、すなわち、６ｂｐのヌクレオチド欠失の位置における１５ｂｐのヌクレオチド断片であり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する１２ｂｐのヌクレオチド断片および８ｂｐのヌクレオチド断片であり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、２つの欠失したヌクレオチド配列にそれぞれ挿入された１３ｂｐのヌクレオチド断片、すなわち、欠失した１２ｂｐのヌクレオチド断片の位置に挿入された１３ｂｐのヌクレオチド断片、および、欠失した８ｂｐのヌクレオチドの位置に挿入された１３ｂｐのヌクレオチド断片であり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する７ｂｐのヌクレオチド断片および８ｂｐのヌクレオチド断片であり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドはそれぞれ、２つの欠失したヌクレオチド配列に挿入された内在性遺伝子ヌクレオチド配列の一部または全体、すなわち、欠失した７ｂｐのヌクレオチド断片の位置に挿入された内在性遺伝子ヌクレオチド配列の全体、および、欠失した８ｂｐのヌクレオチド断片の位置に挿入された内在性遺伝子ヌクレオチド配列の一部であり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する９ｂｐのヌクレオチド断片および８ｂｐのヌクレオチド断片であり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドはそれぞれ、２つの欠失したヌクレオチド配列に挿入された、８ｂｐのヌクレオチド断片の全体、および、外来遺伝子ヌクレオチド配列の一部、すなわち、欠失した９ｂｐのヌクレオチド断片の位置に挿入された８ｂｐのヌクレオチド断片、および、欠失した８ｂｐのヌクレオチド断片の位置に挿入された外来遺伝子ヌクレオチド配列の一部であり得る（図２０）。
別の例において、人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子は、標的配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチド配列領域における欠失および挿入された１または複数のヌクレオチドを含み得る。
ここで、欠失したヌクレオチドは、連続、不連続、または、両方の形態（すなわち、連続および不連続）が混在した１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチドであり得る。
ここで、挿入されたヌクレオチドは、連続、不連続、または、両方の形態（すなわち、連続および不連続）が混在した１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチド、ヌクレオチド断片、または、特異的な遺伝子のヌクレオチド配列の一部または全体であり得て、欠失および挿入は順次または同時に生じ得る。
挿入されたヌクレオチド断片は、５ｂｐ～１０ｂｐ、１１ｂｐ～５０ｂｐ、５０ｂｐ～１００ｂｐ、１００ｂｐ～２００ｂｐ、２００ｂｐ～３００ｂｐ、３００ｂｐ～４００ｂｐ、４００ｂｐ～５００ｂｐ、５００ｂｐ～７５０ｂｐ、または７５０ｂｐ～１０００ｂｐであり得る。
特異的な遺伝子は、免疫調節遺伝子を含む対象、例えばヒト細胞に含まれない外部領域から導入される遺伝子であり得る。代替的に、特異的な遺伝子は、免疫調節遺伝子を含む対象、例えばヒト細胞に存在する遺伝子、例えば、ヒト細胞ゲノムに含まれる遺伝子であり得る。
例えば、ヌクレオチドの欠失および挿入は、標的配列の５'末端および／または３'末端に隣接する同様の位置において生じ得て、欠失したヌクレオチドは、標的配列の３'末端に隣接して位置する１ｂｐのヌクレオチドであり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、欠失したヌクレオチド配列の位置に挿入される連続の２ｂｐのヌクレオチドであり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列の５'末端に隣接して位置する連続の３ｂｐのヌクレオチドであり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、欠失したヌクレオチド配列の位置に挿入された２０ｂｐのヌクレオチドであり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列の３'末端に隣接して位置する連続の３ｂｐのヌクレオチドであり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、欠失したヌクレオチド配列の位置に挿入された内在性遺伝子ヌクレオチド配列の一部であり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列の５'末端に隣接して位置する連続の２ｂｐのヌクレオチドであり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、欠失したヌクレオチド配列の位置に挿入された外来遺伝子ヌクレオチド配列の全体であり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列の３'末端に隣接して位置する１ｂｐのヌクレオチドおよび連続の４ｂｐのヌクレオチドであり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、２つの欠失したヌクレオチド配列にそれぞれ挿入された、内在性遺伝子ヌクレオチド配列の全体、および、連続の４ｂｐのヌクレオチド配列、すなわち、欠失した１ｂｐのヌクレオチド配列の位置に挿入された内在性遺伝子ヌクレオチド配列の全体、および、欠失した連続の４ｂｐのヌクレオチドの位置に挿入された連続の４ｂｐのヌクレオチド配列であり得る（図２１）。
例えば、ヌクレオチドの欠失および挿入は、標的配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置するヌクレオチド配列の類似または異なる位置において生じ得て、欠失したヌクレオチドは、標的配列の５'末端に隣接して位置する１ｂｐのヌクレオチド、および、標的配列の３'末端に隣接して位置する連続の３ｂｐのヌクレオチドであり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、欠失したヌクレオチド配列の位置、すなわち、欠失した連続の３ｂｐのヌクレオチドの位置の１つに挿入された８ｂｐのヌクレオチド断片であり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列の５'末端に隣接して位置する連続の４ｂｐのヌクレオチドであり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、標的配列の３'末端に隣接する欠失していない異なる位置に挿入される内在性遺伝子ヌクレオチド配列の一部であり得る（図２２）。
ここで、代替的に、欠失したヌクレオチドは、２ｂｐ以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド断片であり得る。
欠失されたヌクレオチド断片は、２ｂｐ～５ｂｐ、６ｂｐ～１０ｂｐ、１１ｂｐ～１５ｂｐ、１６ｂｐ～２０ｂｐ、２１ｂｐ～２５ｂｐ、２６ｂｐ～３０ｂｐ、３１ｂｐ～３５ｂｐ、３６ｂｐ～４０ｂｐ、４１ｂｐ～４５ｂｐまたは４６ｂｐ～５０ｂｐであり得る。
ここで、挿入されたヌクレオチドは、連続、不連続、または、両方の形態（すなわち、連続および不連続）が混在した１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチド、ヌクレオチド断片、または、特異的な遺伝子のヌクレオチド配列の一部または全体であり得て、欠失および挿入は順次または同時に生じ得る。
例えば、ヌクレオチドの欠失および挿入は、標的配列の５'末端および／または３'末端に隣接する同様の位置において生じ得て、欠失したヌクレオチドは、標的配列の３'末端に隣接して位置する１７ｂｐのヌクレオチド断片であり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、欠失したヌクレオチド配列の位置に挿入される連続の２ｂｐのヌクレオチドであり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列の５'末端に隣接して位置する１５ｂｐのヌクレオチド断片であり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、欠失したヌクレオチド配列の位置に挿入される３０ｂｐのヌクレオチド断片であり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列の５'末端に隣接して位置する１５ｂｐのヌクレオチド断片であり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、欠失したヌクレオチド配列の位置に挿入された内在性遺伝子ヌクレオチド配列の一部であり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列の３'末端に隣接して位置する２５ｂｐのヌクレオチド断片であり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、欠失したヌクレオチド配列の位置に挿入される内在性遺伝子ヌクレオチド配列の全体であり得る（図２３）。
ここで、代替的に、欠失したヌクレオチドは、２ｂｐ以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド断片であり得る。
ここで、挿入されたヌクレオチドは、１、２、３、４または５ｂｐ；ヌクレオチド断片；または、特異的な遺伝子のヌクレオチド配列の一部または全体であり得て、欠失および挿入は、順次または同時に生じ得る。代替的に、挿入は、２以上の欠失領域の一部または全域において生じ得る。
例えば、ヌクレオチドの欠失および挿入は、標的配列の５'末端および／または３'末端に隣接する同様の位置において生じ得て、欠失したヌクレオチドは、標的配列の５'末端に隣接して位置する７ｂｐのヌクレオチド断片、および、標的配列の３'末端に隣接して位置する１８ｂｐのヌクレオチド断片であり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、２つの欠失したヌクレオチド配列にそれぞれ挿入される外来遺伝子ヌクレオチド配列の一部および１２ｂｐのヌクレオチド断片、すなわち、欠失した７ｂｐのヌクレオチド断片の位置に挿入された外来遺伝子ヌクレオチド配列、および、欠失した１８ｂｐのヌクレオチド断片の位置に挿入された１２ｂｐのヌクレオチド断片の一部であり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列の３'末端に隣接して位置する１０ｂｐのヌクレオチド断片、および、標的配列の５'末端に隣接して位置する６ｂｐのヌクレオチド断片であり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、２つの欠失したヌクレオチド配列にそれぞれ挿入された、内在性遺伝子ヌクレオチド配列の全体、および、連続の４ｂｐのヌクレオチド、すなわち、欠失した１０ｂｐのヌクレオチド断片の位置に挿入された内在性遺伝子ヌクレオチド配列の全体、および、欠失した６ｂｐのヌクレオチド断片の位置に挿入された連続の４ｂｐのヌクレオチドであり得る（図２４）。
更に別の例において、人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子は、標的配列、および、標的配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチド配列領域において、挿入または欠失された１または複数のヌクレオチドを含み得る。
ここで、欠失したヌクレオチドは、連続、不連続、または、両方の形態（すなわち、連続および不連続）が混在した１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチドであり得る。
ここで、挿入されたヌクレオチドは、連続、不連続、または、両方の形態（すなわち、連続および不連続）が混在した１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチド、ヌクレオチド断片、または、特異的な遺伝子のヌクレオチド配列の一部または全体であり得て、欠失および挿入は順次または同時に生じ得る。
挿入されたヌクレオチド断片は、５ｂｐ～１０ｂｐ、１１ｂｐ～５０ｂｐ、５０ｂｐ～１００ｂｐ、１００ｂｐ～２００ｂｐ、２００ｂｐ～３００ｂｐ、３００ｂｐ～４００ｂｐ、４００ｂｐ～５００ｂｐ、５００ｂｐ～７５０ｂｐまたは７５０ｂｐ～１０００ｂｐであり得る。
特異的な遺伝子は、免疫調節遺伝子を含む対象、例えばヒト細胞に含まれない外部領域から導入される遺伝子であり得る。代替的に、特異的な遺伝子は、免疫調節遺伝子を含む対象、例えばヒト細胞に存在する遺伝子、例えば、ヒト細胞ゲノムに含まれる遺伝子であり得る。
例えば、ヌクレオチドの欠失および挿入は、標的配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、標的配列に位置するヌクレオチド配列の同様の位置において生じ得て、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する、標的配列の３'末端に隣接する連続の４ｂｐのヌクレオチドであり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、欠失したヌクレオチド配列の位置に挿入された５ｂｐのヌクレオチド断片であり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列に位置する連続の２ｂｐのヌクレオチド、および、標的配列の３'末端に隣接して位置する連続の２ｂｐのヌクレオチドであり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、２つの欠失したヌクレオチド配列にそれぞれ挿入された１０ｂｐのヌクレオチド断片、および、外来遺伝子ヌクレオチド配列の一部、すなわち、標的配列に位置する欠失した連続の２ｂｐのヌクレオチド配列の位置に挿入された１０ｂｐのヌクレオチド断片、および、標的配列の３'末端に隣接して位置する欠失した連続の２ｂｐのヌクレオチド配列の位置に挿入された外来遺伝子ヌクレオチド配列の一部であり得る（図２５）。
ここで、代替的に、欠失したヌクレオチドは、２ｂｐ以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド断片であり得る。
欠失されたヌクレオチド断片は、２ｂｐ～５ｂｐ、６ｂｐ～１０ｂｐ、１１ｂｐ～１５ｂｐ、１６ｂｐ～２０ｂｐ、２１ｂｐ～２５ｂｐ、２６ｂｐ～３０ｂｐ、３１ｂｐ～３５ｂｐ、３６ｂｐ～４０ｂｐ、４１ｂｐ～４５ｂｐまたは４６ｂｐ～５０ｂｐであり得る。
ここで、挿入されたヌクレオチドは、連続、不連続、または、両方の形態（すなわち、連続および不連続）が混在した１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチド、ヌクレオチド断片、または、特異的な遺伝子のヌクレオチド配列の一部または全体であり得て、欠失および挿入は順次または同時に生じ得る。
例えば、ヌクレオチドの欠失および挿入は、標的配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、標的配列に位置するヌクレオチド配列の同様の位置において生じ得て、欠失したヌクレオチドは、標的配列の３'末端に隣接する、標的配列に位置する２５ｂｐのヌクレオチド断片であり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、欠失したヌクレオチド配列の位置に挿入された外来遺伝子ヌクレオチド配列の全体であり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列の５'末端または３'末端に隣接する、標的配列に位置する３０ｂｐのヌクレオチド断片であり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、欠失したヌクレオチド配列の位置に挿入された４５ｂｐのヌクレオチド断片であり得る（図２６）。
ここで、代替的に、欠失したヌクレオチドは、２ｂｐ以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド断片であり得る。
ここで、挿入されたヌクレオチドは、連続、不連続、または、両方の形態（すなわち、連続および不連続）が混在した１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチド、ヌクレオチド断片、または、特異的な遺伝子のヌクレオチド配列の一部または全体であり得て、欠失および挿入は順次または同時に生じ得る。追加的に、挿入は、２以上の欠失した領域の一部または全域において生じ得る。
例えば、ヌクレオチドの欠失および挿入は、標的配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、標的配列に位置するヌクレオチド配列の同様の位置において生じ得て、欠失したヌクレオチドは、標的配列の３'末端に隣接する、標的配列に位置する２５ｂｐのヌクレオチド断片、標的配列の３'末端に隣接して位置する６ｂｐのヌクレオチド断片であり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、２つの欠失したヌクレオチド配列にそれぞれ挿入された、内在性遺伝子ヌクレオチド配列の全体および２０ｂｐのヌクレオチド断片、すなわち、欠失した２５ｂｐのヌクレオチド断片の位置に挿入された内在性遺伝子ヌクレオチド配列の全体、および、欠失した６ｂｐのヌクレオチド断片の位置に挿入された２０ｂｐのヌクレオチド断片であり得る。代替的に、欠失したヌクレオチドは、標的配列の５'末端に隣接する標的配列に位置する１０ｂｐのヌクレオチド断片、および、標的配列の３'末端に隣接する標的配列に位置する２２ｂｐのヌクレオチド断片であり得て、この場合、挿入されたヌクレオチドは、２つの欠失したヌクレオチド配列にそれぞれ挿入された内在性遺伝子ヌクレオチド配列の一部、および、外因性ヌクレオチド配列の全体、すなわち、欠失した１０ｂｐのヌクレオチド断片の位置に挿入された内在性遺伝子ヌクレオチド配列の一部、および、欠失した２２ｂｐのヌクレオチド断片の位置に挿入された外因性ヌクレオチド配列の全体であり得る（図２７）。
機能的に操作された免疫細胞は、１または複数の人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子を含み得る。
人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子は、免疫調節遺伝子のヌクレオチド配列に存在するＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する連続の１ｂｐ～５０ｂｐのヌクレオチド配列領域において、以下のうち１または複数の改変を含み得る。
ｉ）１または複数のヌクレオチドの欠失
ｉｉ）野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの１または複数のヌクレオチドの置換
ｉｉｉ）１または複数のヌクレオチドの挿入、または、
ｉｖ）上のｉ）からｉｉｉ）からの２以上の選択の組み合わせ
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９タンパク質であるとき、人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子は、免疫調節遺伝子のヌクレオチド配列に存在する５'‐ＮＧＧ‐３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣ）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する連続の１ｂｐ～５０ｂｐ、１ｂｐ～４０ｂｐ、１ｂｐ～３０ｂｐ、または、１ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列領域において、以下のうち１または複数の改変を含み得る。
ｉ）１または複数のヌクレオチドの欠失
ｉｉ）野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの１または複数のヌクレオチドの置換
ｉｉｉ）１または複数のヌクレオチドの挿入、または、
ｉｖ）上のｉ）からｉｉｉ）からの２以上の選択の組み合わせ
別の例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣｊＣａｓ９タンパク質であるとき、人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子は、免疫調節遺伝子のヌクレオチド配列に存在する５'‐ＮＮＮＮＲＹＡＣ‐３'（Ｎは各々独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する連続の１ｂｐ～５０ｂｐ、１ｂｐ～４０ｂｐ、１ｂｐ～３０ｂｐ、または、１ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列領域において、以下のうち１または複数の改変を含み得る。
ｉ）１または複数のヌクレオチドの欠失
ｉｉ）野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの１または複数のヌクレオチドの置換
ｉｉｉ）１または複数のヌクレオチドの挿入、または、
ｉｖ）上のｉ）からｉｉｉ）からの２以上の選択の組み合わせ
更に別の例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｔＣａｓ９タンパク質であるとき、人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子は、免疫調節遺伝子のヌクレオチド配列に存在する５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｎは各々独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＷはＡまたはＴ）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する連続の１ｂｐ～５０ｂｐ、１ｂｐ～４０ｂｐ、１ｂｐ～３０ｂｐ、および、１ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列領域において、以下のうち１または複数の改変を含み得る。
ｉ）１または複数のヌクレオチドの欠失
ｉｉ）野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの１または複数のヌクレオチドの置換
ｉｉｉ）１または複数のヌクレオチドの挿入、または、
ｉｖ）上のｉ）からｉｉｉ）からの２以上の選択の組み合わせ
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＮｍＣａｓ９タンパク質であるとき、人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子は、免疫調節遺伝子のヌクレオチド配列に存在する５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'（Ｎは各々独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する連続の１ｂｐ～５０ｂｐ、１ｂｐ～４０ｂｐ、１ｂｐ～３０ｂｐ、または、１ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列領域において、以下のうち１または複数の改変を含み得る。
ｉ）１または複数のヌクレオチドの欠失
ｉｉ）野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの１または複数のヌクレオチドの置換
ｉｉｉ）１または複数のヌクレオチドの挿入、または、
ｉｖ）上のｉ）からｉｉｉ）からの２以上の選択の組み合わせ
別の例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳａＣａｓ９タンパク質であるとき、人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子は、免疫調節遺伝子のヌクレオチド配列に存在する５'‐ＮＮＧＲＲ（Ｔ）‐３'（Ｎは各々独立にＡ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＲはＡまたはＧ、（Ｔ）は任意選択で含めることができる任意の配列である）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１ｂｐ～５０ｂｐ、１ｂｐ～４０ｂｐ、１ｂｐ～３０ｂｐ、および、１ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列領域において、以下のうち１または複数の改変を含み得る。
ｉ）１または複数のヌクレオチドの欠失
ｉｉ）野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの１または複数のヌクレオチドの置換
ｉｉｉ）１または複数のヌクレオチドの挿入、または、
ｉｖ）上のｉ）からｉｉｉ）からの２以上の選択の組み合わせ
更に別の例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣｐｆ１タンパク質であるとき、人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子は、免疫調節遺伝子のヌクレオチド配列に存在する５'‐ＴＴＮ‐３'（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接して位置する連続の１ｂｐ～５０ｂｐ、１ｂｐ～４０ｂｐ、１ｂｐ～３０ｂｐ、および、１ｂｐ～２５ｂｐのヌクレオチド配列領域において、以下のうち１または複数の改変を含み得る。
ｉ）１または複数のヌクレオチドの欠失
ｉｉ）野性型遺伝子とは異なるヌクレオチドへの１または複数のヌクレオチドの置換
ｉｉｉ）１または複数のヌクレオチドの挿入、または、
ｉｖ）上のｉ）からｉｉｉ）からの２以上の選択の組み合わせ
機能的に操作された免疫細胞は、１または複数のノックアウトされた人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子を含み得る。
ここで、ノックアウトは、免疫調節遺伝子の人工的操作または改変による効果であり得る。
ここで、ノックアウトは、人工的操作または改変を通して、免疫調節遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の阻害であり得る。
機能的に操作された免疫細胞は、１または複数のノックダウンされた人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子を含み得る。
ここで、ノックダウンは、免疫調節遺伝子の人工的操作または改変による効果であり得る。
ここで、ノックダウンは、人工的操作または改変を通して、免疫調節遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の阻害であり得る。
機能的に操作された免疫細胞は、１または複数のノックインされた外来核酸または外来遺伝子を含み得る。
ここで、１または複数のノックインされた外来核酸または外来遺伝子は、免疫調節遺伝子の人工的操作または改変によって導入され得る。
ここで、１または複数のノックインされた外来核酸または外来遺伝子は、コードする外来ペプチドまたは外来タンパク質を発現し得る。
追加的に、機能的に操作された免疫細胞は、免疫調節因子の発現が抑制または阻害された免疫細胞であり得る。
ここで、免疫調節因子は、免疫調節遺伝子、すなわち、ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子および／またはＫＤＭ６Ａ遺伝子によって発現されるポリペプチドまたはタンパク質であり得る。
ここで、機能的に改変された免疫細胞によって発現される、改変された免疫調節因子の量は、野性型免疫細胞、すなわち、天然に発生する免疫細胞によって発現される免疫調節因子の量と比較したとき、少なくとも３０％減少する。ここで、比較の基準である、野性型免疫細胞によって発現される免疫調節因子の量は、例えば癌および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）などの免疫疾患が無い健康なヒトから採取された天然に発生する免疫細胞によって発現される免疫調節因子の平均数であり得て、この場合、個体数、すなわち、野性型免疫細胞を取得可能な健康なヒトの数は、少なくとも５０であり得る。
ここで、機能的に改変された免疫細胞によって発現される、改変された免疫調節因子の量は、野性型免疫細胞、すなわち、人工的操作の前に免疫細胞によって発現される免疫調節因子の量と比較したとき、少なくとも３０％減少する。ここで、比較のための基準である、野性型免疫細胞によって発現される免疫調節因子の量は、野性型免疫細胞、すなわち、人工的操作前の免疫細胞、例えば、免疫調節遺伝子標的化遺伝子操作用組成物または免疫細胞操作用組成物による治療前のヒトから分離した免疫細胞によって発現される免疫調節因子の平均数であり得る。
本明細書によって開示される実施形態として、操作された免疫細胞は、操作されたハイブリッド免疫細胞であり得る。
「操作されたハイブリッド免疫細胞」という用語は、免疫細胞であり、１または複数の人工構造が人工的操作によって補足された、機能的に操作された免疫細胞、または、天然の免疫調節因子の発現を改変する、もしくは、免疫調節因子の機能を損傷するように人工的操作が加えられた、人工構造補足免疫細胞を指す。
「人工構造補足免疫細胞」という用語は、１または複数の人工構造が補足された免疫細胞を指す。
例えば、人工構造は人工受容体であり得る。
「人工受容体」という用語は、野性型受容体ではなく人工的に調製され、抗原を認識する能力を有し、特異的な機能を実行する機能的実体を指す。
そのような人工受容体は、特異的抗原を認識する能力を改善することにより、または、増強された免疫応答シグナルを産生することにより、免疫応答の強化に寄与し得る。
例として、人工受容体は、以下の構成を有し得る。
（ｉ）抗原認識部分
人工受容体は抗原認識部分を含む。
「抗原認識部分」という用語は、抗原を認識する領域を指す人工受容体の部分である。
抗原認識部分は、野性型受容体と比較して、特定の抗原の認識が改善されたものであり得る。特に、特定の抗原は、癌細胞の抗原であり得る。加えて、特定の抗原は、身体における一般的な細胞の抗原であり得る。
抗原認識部分は、抗原に対する結合親和性を有し得る。
抗原認識部分は、抗原に結合している間にシグナルを生成し得る。シグナルは電気的シグナルであり得る。シグナルは化学的シグナルであり得る。
抗原認識部分はシグナル配列を含み得る。
シグナル配列は、タンパク質合成のプロセス中に、タンパク質を特定の部位に送達することを可能にするペプチド配列を指す。
シグナル配列は、抗原認識部分のＮ末端の近くに位置し得る。特に、Ｎ末端からの距離は、約１００アミノ酸であり得る。シグナル配列は、抗原認識部分のＣ末端の近くに位置し得る。特に、Ｃ末端からの距離は、約１００アミノ酸であり得る。
抗原認識部分は、第１シグナル生成部分と有機的な機能関係を有し得る。
抗原認識部分は、抗体の断片抗原結合（Ｆａｂ）ドメインと相同であり得る。
抗原認識部分は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり得る。
抗原認識部分は、それ自体によって、または、抗原認識構造を形成することによって抗原を認識し得る。
抗原認識構造は、特異的な構造を確立することによって抗原を認識でき、当業者であれば、特異的な構造を構成する単量体ユニットと、単量体ユニットの結合とを容易に理解できる。加えて、抗原認識構造は１または２以上の単量体ユニットから成り得る。
抗原認識構造は、単量体ユニットが直列に接続された構造であり得る、または、単量体ユニットが並列に接続された構造であり得る。
直列に接続された構造とは、２つ以上の単量体ユニットが１方向に連続的に接続された構造を指し、一方で、並列に接続された構造とは、２つ以上の単量体ユニットの各々が、例えば異なる方向で、１つの単量体ユニットの遠位末端において並列に接続された構造を指す。
例えば、 単量体ユニットは無機物質であり得る。
単量体ユニットは、生化学的リガンドであり得る。
単量体ユニットは、野性型受容体の抗原認識部分と相同であり得る。
単量体ユニットは、抗体タンパク質と相同であり得る。
単量体ユニットは、免疫グロブリンの重鎖であり得て、または、それと相同であり得る。
単量体ユニットは、免疫グロブリンの軽鎖であり得て、または、それと相同であり得る。
単量体ユニットはシグナル配列を含み得る。
一方、単量体ユニットは、化学的結合によって連結され得て、または、特定の結合部分を通して結合され得る。
「抗原認識ユニット結合部分」という用語は、抗原認識ユニットが互いに接続される領域であり、２つ以上の抗原認識ユニットから成る抗原認識構造が存在するときに存在する任意の構成であり得る。
抗原認識ユニット結合部分はペプチドであり得る。特に、結合部分は、高い割合のセリンおよびスレオニンを有し得る。
抗原認識ユニット結合部分は化学的結合であり得る。
抗原認識ユニット結合部分は、特定の長さを有することによって、抗原認識ユニットの３次元構造の発現を助けることができる。
抗原認識ユニット結合部分は、抗原認識ユニット間の特定の位置関係を有することによって、抗原認識構造の機能を助けることができる。
（ｉｉ）受容体ボディ
人工受容体は受容体ボディを含む。
「受容体ボディ」という用語は、抗原認識部分とシグナル生成部分との間の接続が媒介される領域のことであり、抗原認識部分およびシグナル生成部分は物理的に接続され得る。
受容体ボディの機能は、抗原認識部分またはシグナル生成部分において生成されるシグナルを伝達することであり得る。
受容体ボディの構造は、場合に応じて、同時にシグナル生成部分の機能を有し得る。
受容体ボディの機能は、人工受容体を免疫細胞上に固定化することを可能にすることであり得る。
受容体ボディはアミノ酸らせん構造を含み得る。
受容体ボディの構造は、身体に存在する一般的な受容体タンパク質の一部と相同である部分を含み得る。相同性は５０％～１００％の範囲内であり得る。
受容体ボディの構造は、免疫細胞上のタンパク質と相同である部分を含み得る。相同性は５０％～１００％の範囲内であり得る。
例えば、受容体ボディは、ＣＤ８膜貫通ドメインであり得る。
受容体ボディはＣＤ２８膜貫通ドメインであり得る。特に、第２シグナル生成部分がＣＤ２８であるとき、ＣＤ２８は、第２シグナル生成部分および受容体ボディの機能を実行できる。
（ｉｉｉ）シグナル生成部分
人工受容体はシグナル生成部分を含み得る。
「第１シグナル生成部分」という用語は、人工受容体の一部であり、免疫応答シグナルを生成する部分を指す。
「第２シグナル生成部分」という用語は、人工受容体の一部であり、第１シグナル生成部分と相互作用することによって、または独立に免疫応答シグナルを生成する部分を指す。
人工受容体は第１シグナル生成部分および／または第２シグナル生成部分を含み得る。
人工受容体は、第１および／または第２シグナル生成部分それぞれのうち２つ以上を含み得る。
第１および／または第２シグナル生成部分は特定の配列モチーフを含み得る。
配列モチーフは、ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ（ＣＤ）タンパク質のモチーフと相同であり得る。
特に、ＣＤタンパク質は、ＣＤ３、ＣＤ２４７、ＣＤ７９であり得る。
配列モチーフは、ＹｘｘＬ／Ｉのアミノ酸配列であり得る。
配列モチーフは第１および／または第２シグナル生成部分に複数存在し得る。
特に、第１配列モチーフは、第１シグナル生成部分の開始位置から１～２００アミノ酸の距離に位置し得る。第２配列モチーフは、第２シグナル生成部分の開始位置から１～２００アミノ酸の距離に位置し得る。
加えて、各配列モチーフ間の距離は１～１５アミノ酸であり得る。
特に、各配列モチーフ間の距離な好適は６～８アミノ酸である。
例えば、第１および／または第２シグナル生成部分はＣＤ３ζであり得る。
第１および／または第２シグナル生成部分はＦｃεＲＩγであり得る。
第１および／または第２シグナル生成部分は、特定の条件が満たされたときのみ、免疫応答を生成するものであり得る。
特定の条件は、抗原認識部分が抗原を認識することであり得る。
特定の条件は、抗原認識部分が抗原との結合を形成することであり得る。.
特定の条件は、抗原認識部分が抗原との結合を形成するとき、生成されるシグナルが送達されることであり得る。
特定の条件は、抗原認識部分が抗原を認識する、または、抗原認識部分が抗原に結合している間に抗原から離れることであり得る。
免疫応答シグナルは、免疫細胞の増殖および分化に関連するシグナルであり得る。
免疫応答シグナルは、免疫細胞の細胞死に関連するシグナルであり得る。
免疫応答シグナルは免疫細胞の活性に関連するシグナルであり得る。
免疫応答シグナルは、免疫細胞の補助に関連するシグナルであり得る。
免疫応答シグナルは、抗原認識部分において生成されるシグナルに対して特異的となるように活性化され得る。
免疫応答シグナルは、関心のある遺伝子の発現を調節するシグナルであり得る。
免疫応答シグナルは、免疫応答を抑制するシグナルであり得る。
一実施形態において、シグナル生成部分は、追加のシグナル生成部分を含み得る。
「追加のシグナル生成部分」という用語は、人工受容体の一部であり、第１および／または第２シグナル生成部分によって生成される免疫応答シグナルに関して追加の免疫応答シグナルを生成する領域を指す。
以降、追加のシグナル生成部分は、順序に従って、第ｎシグナル生成部分（ｎ≠１）と称される。
人工受容体は、第１シグナル生成部分に加えて、追加のシグナル生成部分を含み得る。
２つ以上の追加のシグナル生成部分は、人工受容体に含めることができる。
追加のシグナル生成部分は、４‐１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０の免疫応答シグナル、または、その他のシグナルが生成され得る構造であり得る。
追加のシグナル生成部分が免疫応答シグナルを生成する条件、および、それによって生成される免疫応答シグナルの特性は、第１および／または第２シグナル生成部分の免疫応答シグナルに対応する詳細を含む。
免疫応答シグナルは、サイトカインの合成を促進するものであり得る。免疫応答シグナルは、サイトカインの分泌を促進または阻害するものであり得る。特に、サイトカインは好ましくは、ＩＬ‐２、ＴＮＦα、または、ＩＦＮ‐γであり得る。
免疫応答シグナルは、他の免疫細胞の増殖または分化に役立つシグナルであり得る。
免疫応答シグナルは、シグナルが生じる場所に他の免疫細胞を引き付けるシグナルであり得る。
本発明は、人工受容体の可能な結合関係をすべて含む。したがって、本発明の人工受容体の態様は、本明細書に記載されるものに限定されない。
人工受容体は、抗原認識部分‐受容体ボディ‐第１シグナル生成部分から成り得る。受容体ボディは任意で含まれ得る。
人工受容体は、抗原認識部分‐受容体ボディ‐第２シグナル生成部分‐第１シグナル生成部分から成り得る。受容体ボディは任意で含まれ得る。特に、第１シグナル生成部分および第２シグナル生成部分の位置は変化し得る。
人工受容体は、抗原認識部分‐受容体ボディ‐第２シグナル生成部分‐第３シグナル生成部分‐第１シグナル生成部分から成り得る。受容体ボディは任意で含まれ得る。特に、第１シグナル生成部分から第３シグナル生成部分までの位置は変化し得る。
人工受容体において、シグナル生成部分の数は、１～３に限定されず、３より多くのものが含まれ得る。
上記の実施形態に加えて、人工受容体は、抗原認識部分‐シグナル生成部分‐受容体ボディの構造を有し得る。当該構造は、人工受容体を有する細胞の外で作用する免疫応答シグナルを生成する必要があるときに有利であり得る。
人工受容体は、野性型受容体に対応する方式で機能し得る。
人工受容体は、特定の抗原との結合を形成することによって、特定の位置関係を形成するように機能し得る。
人工受容体は、抗原を認識し、特定の抗原に対する免疫応答を促進する免疫応答シグナルを生成するように機能し得る。
人工受容体は、身体における一般的な細胞の抗原を認識し、身体における細胞に対する免疫応答を阻害するように機能し得る。
（ｉｖ）シグナル配列
一実施形態において、人工受容体は任意でシグナル配列を含み得る。
人工受容体が特定のタンパク質のシグナル配列を含むとき、これは、人工受容体が免疫細胞の膜上に容易に配置されることを助け得る。好ましくは、人工受容体が膜貫通タンパク質のシグナル配列を含むとき、これは、人工受容体が免疫細胞の膜を貫通して免疫細胞の外側の膜上に配置されることを助け得る。
人工受容体は、１または複数のシグナル配列を含み得る。
シグナル配列は、多くの正荷電アミノ酸を含み得る。
シグナル配列は、ＮまたはＣ末端に近い場所にある正荷電アミノ酸を含み得る。
シグナル配列は、膜貫通タンパク質のシグナル配列であり得る。
シグナル配列は、免疫細胞の外側の膜上に配置されるタンパク質のシグナル配列であり得る。
シグナル配列は、好ましくは、ＳｃＦｖのシグナル配列であり得る。
シグナル配列は、人工受容体が保持する構造、すなわち、抗原認識部分、受容体ボディ、第１シグナル生成部分、追加のシグナル生成部分に含まれ得る。
特に、シグナル配列は、各構造のＮまたはＣ末端の近くの位置に配置され得る。
特に、ＮまたはＣ末端からのシグナル配列の距離は、約１００アミノ酸であり得る。
一実施形態において、人工受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得る。
キメラ抗原受容体は、１または複数の抗原への結合特異性を有する受容体であり得る。
１または複数の抗原は、癌細胞および／またはウイルスによって特異的に発現される抗原であり得る。
１または複数の抗原は腫瘍関連抗原であり得る。
１または複数の抗原は、これらに限定されないが、Ａ３３、ＡＬＫ、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、アドレナリン受容体β３（ＡＤＲＢ３）、葉酸受容体α、ＡＤ０３４、ＡＫＴ１、ＢＣＭＡ、ベータ‐ヒト絨毛性ゴナドトロピン、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）、ＢＳＴ２、ＢＲＡＰ、ＣＤ５、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５２、ＣＤ７２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８９、ＣＤ９７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１６０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＡ‐１２５、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＣＲ４、Ｃ型レクチン様分子（ＣＬＬ‐１またはＣＬＥＣＬ１）、ｃｌａｕｄｉｎ６（ＣＬＤＮ６）、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＡＧＥ、ＣＤＸ２、ＣＬＰ、ＣＴ‐７、ＣＴ８／ＨＯＭ‐ＴＥＳ‐８５、ｃＴＡＧＥ‐１、ＥＲＢＢ２、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、Ｅ７４様因子２変異（ＥＬＦ２Ｍ）、Ａ型エフリン受容体２（ＥｐｈＡ２）、ＥＭＲ２、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、ＦＣＲＬ５、ファイブリン１、Ｇ２５０、ＧＤ２、糖タンパク質３６（ｇｐ３６）、糖タンパク質１００（ＧＰ１００）、糖質コルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＧｌｏｂｏＨ、Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）、ＧＰＣ３、ｈｓｐ７０‐２、ヒト高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）、Ａ型肝炎ウイルス細胞表面受容体１（ＨＡＶＣＲ１）、ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）、ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）、ＨＡＧＥ、ＨＣＡ５８７／ＭＡＧＥ‐Ｃ２、ｈＣＡＰ‐Ｇ、ＨＣＥ６６１、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＬＡ‐Ｃｗ、ＨＯＭ‐ＨＤ‐２１／Ｇａｌｅｃｔｉｎ９、ＨＯＭ‐ＭＥＥＬ‐４０／ＳＳＸ２、ＨＯＭ‐ＲＣＣ‐３．１．３／ＣＡＸＩＩ、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＢ６、Ｈｕ、ＨＵＢ１、インスリン成長因子（ＩＧＦ１）‐Ｉ、ＩＧＦ‐ＩＩ、ＩＧＦＩ受容体、インターロイキン１３受容体サブユニットアルファ２（ＩＬ‐１３Ｒａ２またはＣＤ２１３Ａ２）、インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ‐１１Ｒａ）、ＩＧＬＬ１、ＫＩＴ（ＣＤ１１７）、ＫＭ‐ＨＮ‐３、ＫＭ‐ＫＮ‐１、ＫＯＣ１、ＫＯＣ２、ＫＯＣ３、ＫＯＣ３、ＬＡＧＡ‐１ａ、ＬＡＧＥ‐１、ＬＡＩＲ１、ＬＩＬＲＡ２、ＬＹ７５、Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗原、ＭＵＣ１、ＭＮ‐ＣＡ ＩＸ、Ｍ‐ＣＳＦ、ＭＡＧＥ‐１、ＭＡＧＥ‐４ａ、メソテリン、ＭＡＧＥ‐Ａ１、ＭＡＤ‐ＣＴ‐１、ＭＡＤ‐ＣＴ‐２、ＭＡＲＴ１、ＭＰＰｌ１、ＭＳＬＮ、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、ＮＹ‐ＥＳＯ‐１、ＮＹ‐ＥＳＯ‐５、Ｎｋｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＹ‐ＢＲ‐１、ＮＹ‐ＢＲ‐６２、ＮＹ‐ＢＲ‐８５、ＮＹ‐ＣＯ‐３７、ＮＹ‐ＣＯ‐３８、ＮＮＰ‐１、ＮＹ‐ＬＵ‐１２、ＮＹ‐ＲＥＮ‐１０、ＮＹ‐ＲＥＮ‐１９／ＬＫＢ／ＳＴＫ１１、ＮＹ‐ＲＥＮ‐２１、ＮＹ‐ＲＥＮ‐２６／ＢＣＲ、ＮＹ‐ＲＥＮ‐３／ＮＹ‐ＣＯ‐３８、ＮＹ‐ＲＥＮ‐３３／ＳＮＣ６、ＮＹ‐ＲＥＮ‐４３、ＮＹ‐ＲＥＮ‐６５、ＮＹ‐ＲＥＮ‐９、ＮＹ‐ＳＡＲ‐３５、ｏ‐アセチル‐ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）、ＯＧＦｒ、ＰＳＭＡ、前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）、ｐ５３、前立腺癌腫瘍抗原１（ＰＣＴＡ‐１）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、セリンプロテアーゼ２１（ｔｅｓｔｉｓｉｎまたはＰＲＳＳ２１）、血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲベータ）、ＰＬＡＣ１、パネキシン３（ＰＡＮＸ３）、ＰＬＵ‐１、ＲＯＲ‐１、ＲＡＧＥ‐１、ＲＵ１、ＲＵ２、Ｒａｂ３８、ＲＢＰＪカッパ、ＲＨＡＭＭ、ステージ特異的胎児抗原‐４（ＳＳＥＡ‐４）、ＳＣＰ１、ＳＳＸ３、ＳＳＸ４、ＳＳＸ５、Ｔｙｒｐ‐１、ＴＡＧ７２、サイログロブリン、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、５Ｔ４、腫瘍関連糖タンパク質（ＴＡＧ７２）、チロシナーゼ、トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）、ＴＥＭ１、ＴＥＭ７Ｒ、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）、Ｔｉｅ２、ＴＲＰ‐２、ＴＯＰ２Ａ、ＴＯＰ２Ｂ、ウロプラキン２（ＵＰＫ２）、ビメンチン、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質１（ＷＴ１）、および、ルイス（Ｙ）抗原であり得る。
本明細書によって開示される実施形態として、操作されたハイブリッド免疫細胞は、以下の全部を含む人工的に操作された免疫細胞であり得る。
（ｉ）１または複数の人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子、および／または、その発現産物
（ｉｉ）人工受容体タンパク質、および／または、それをコードする核酸
上の１または複数の人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子についての説明は、上に記載した通りである。
（ｉ）の発現産物は、１または複数の人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子によって発現されたｍＲＮＡまたはタンパク質であり得る。
追加的に、上の人工受容体についての説明は、上に記載した通りである。
例えば、操作されたハイブリッド免疫細胞は、人工受容体を含む機能的に操作された免疫細胞であり得る。
ここで、人工受容体は、キメラ抗原受容体であり得て、それに関する説明は、上に記載した通りである。
操作されたハイブリッド免疫細胞は、１または複数のキメラ抗原受容体を含む１または複数の人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子を有する免疫細胞であり得る。ここで、１または複数の人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子を有する免疫細胞は、機能的に操作された免疫細胞であり得て、それに関する説明は、上に記載した通りである。
操作されたハイブリッド免疫細胞は、１または複数のキメラ抗原受容体を含む１または複数の免疫調節遺伝子の発現が抑制または阻害される免疫細胞であり得る。ここで、１または複数の免疫調節遺伝子の発現が抑制または阻害される免疫細胞は、機能的に操作された免疫細胞であり得て、それに関する説明は、上に記載した通りである。
例として、操作されたハイブリッド免疫細胞は、機能的に操作された免疫細胞に、キメラ抗原受容体をコードする１または複数の核酸または遺伝子を人工的に導入することによって生成される免疫細胞であり得る。
ここで、キメラ抗原受容体をコードする核酸または遺伝子は、機能的に操作された免疫細胞のゲノムに挿入されない形態で、細胞に存在し得る。
ここで、キメラ抗原受容体をコードする核酸または遺伝子は、機能的に操作された免疫細胞のゲノムにおける特異的な座位に挿入され得る。特異的な座位は、免疫調節遺伝子のイントロン、エクソン、プロモーター、または、エンハンサー座位であり得る。
ここで、キメラ抗原受容体をコードする核酸または遺伝子は、機能的に操作された免疫細胞のゲノムに存在する１または複数のイントロンにランダムに挿入され得る。
ここで、キメラ抗原受容体をコードする核酸または遺伝子は、機能的に操作された免疫細胞のゲノムに存在する１または複数のエクソンにランダムに挿入され得る。
ここで、キメラ抗原受容体をコードする核酸または遺伝子は、機能的に操作された免疫細胞のゲノムに存在する１または複数のプロモーターにランダムに挿入され得る。
ここで、キメラ抗原受容体をコードする核酸または遺伝子は、機能的に操作された免疫細胞のゲノムに存在する１または複数のエンハンサーにランダムに挿入され得る。
ここで、キメラ抗原受容体をコードする核酸または遺伝子は、機能的に操作された免疫細胞のゲノムに存在するイントロン、エクソン、プロモーター、および、エンハンサー以外の１または複数の領域にランダムに挿入され得る。
機能的に操作された免疫細胞に人工的に導入されたキメラ抗原受容体は、操作されたハイブリッド免疫細胞においてタンパク質の形態で発現され得て、タンパク質発現キメラ抗原受容体は、操作されたハイブリッド免疫細胞の表面上に位置し得る。ここで、キメラ抗原受容体をコードする核酸または遺伝子が人工的に導入される、機能的に操作された免疫細胞は、操作されたハイブリッド免疫細胞の形態であり得る。
別の例において、操作されたハイブリッド免疫細胞は、機能的に操作された免疫細胞に、１または複数のキメラ抗原受容体タンパク質を人工的に導入することによって生成された免疫細胞であり得る。
機能的に操作された免疫細胞に人工的に導入されたキメラ抗原受容体タンパク質は、操作されたハイブリッド免疫細胞の表面に位置し得る。ここで、キメラ抗原受容体タンパク質が人工的に導入された、機能的に操作された免疫細胞は、操作されたハイブリッド免疫細胞の形態であり得る。
別の例において、操作されたハイブリッド免疫細胞は、１または複数の人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子を含む、人工構造補足免疫細胞であり得る。
ここで、人工構造補足免疫細胞は、人工受容体を含む免疫細胞であり得る。人工受容体は、キメラ抗原受容体であり得る。
１または複数の人工的に操作または改変された免疫調節遺伝子を含む人工構造補足免疫細胞では、免疫調節因子の発現が抑制または阻害され得る。ここで、１または複数の免疫調節遺伝子が人工的に改変された人工構造補足免疫細胞は、操作されたハイブリッド免疫細胞の形態であり得る。
更に別の例において、操作されたハイブリッド免疫細胞は、１または複数の免疫調節因子の発現が抑制または阻害された人工構造補足免疫細胞であり得る。
本明細書によって開示される態様は、操作された免疫細胞を産生する方法に関する。
上に記載の説明は、人工的に改変された免疫調節遺伝子に関する説明のために参照され得る。以下では、操作された免疫細胞の代表的な実施形態に注目して方法を説明する。
例として、操作された免疫細胞を産生するための方法は、機能的に操作された免疫細胞を産生する方法であり得る。方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで実行され得る。
いくつかの実施形態において、方法は、ヒトまたはヒト以外の動物の細胞または細胞群を試料抽出し、細胞または細胞群を改変することを含む。培養は、任意の段階で、ｅｘ ｖｉｖｏで生じ得る。細胞または細胞群は更に、ヒト以外の動物または植物に再導入され得る。
一実施形態において、方法は、１または複数の人工的に操作された免疫調節遺伝子を含む、機能的に操作された免疫細胞を産生するための方法であり得て、以下を接触させることを含む。
（ａ）免疫細胞
（ｂ）ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子およびＫＤＭ６Ａ遺伝子から成る群から選択される少なくとも１つの免疫調節遺伝子を人工的に操作可能な遺伝子操作用組成物
ここで、（ａ）免疫細胞は、人体から単離され得る、または、幹細胞から分化した免疫細胞であり得る。
（ｂ）遺伝子操作用組成物は以下を含む。
（ｂ'）ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子およびＫＤＭ６Ａ遺伝子から成る群から選択される１または複数の遺伝子の核酸配列における配列識別番号１～２８９の標的配列に相同な、または、それとの相補結合を形成可能なガイド核酸
（ｂ"）ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、および、Ｃｐｆ１タンパク質から成る群から選択される１または複数のタンパク質であるエディタータンパク質
上の遺伝子操作用組成物の説明は上に記載した通りである。
接触は、ｅｘ ｖｉｖｏで実行され得る。
接触は、（ｂ）遺伝子操作用組成物を（ａ）免疫細胞に導入することを含み得る。
方法は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ、例えばｅｘ ｖｉｖｏで実行され得る。
例えば、接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実行され得て、接触後、接触された細胞は対象の身体に戻され得る。
方法は、生体における免疫細胞、または、生体、例えば人体から単離された免疫細胞、または、人工的に生成された免疫細胞を使用し得る。例として、癌を患う対象に由来する細胞を接触させることが含まれ得る。
方法において使用される免疫細胞は、霊長動物（例えばヒト、サルなど）を含む哺乳動物、および、齧歯動物（例えばマウス、ラットなど）に由来する免疫細胞であり得る。例えば、免疫細胞は、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞などであり得る。ここで、免疫細胞は、免疫受容体が補足された、操作された免疫細胞であり得る（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が補足される）。
方法は、血清（例えば、ウシ胎児血清またはヒト血清）、インターロイキン２（ＩＬ‐２）、インスリン、ＩＦＮ‐ガンマ、ＩＬ‐４、ＩＬ‐７、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐１０、ＩＬ‐１５、ＴＧＦ‐ベータ、ＴＮＦ‐アルファを含み得る、免疫細胞のための適切な培地において、または、当業者に知られている、細胞の増殖のための他の添加剤を含む、増殖および生存に必要な因子を含み得る適切な培地（例えば、最小必須培地、ＲＰＭＩ培地１６４０、または、Ｘ‐ｖｉｖｏ‐１０、‐１５、‐２０（ロンザ））において実行され得るが、培地はこれらに限定されない。
別の例において、操作された免疫細胞を産生する方法は、操作されたハイブリッド免疫細胞を産生する方法であり得る。方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、または、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実行され得る。
いくつかの実施形態において、方法は、ヒトまたはヒト以外の動物の細胞または細胞群を試料抽出し、細胞または細胞群を改変することを含む。培養は、任意の段階で、ｅｘ ｖｉｖｏで生じ得る。細胞または細胞群は更に、ヒト以外の動物または植物に再導入され得る。
一実施形態において、方法は、１または複数の人工的に操作された免疫調節遺伝子、および、１または複数の人工受容体を含む、操作されたハイブリッド免疫細胞を産生するための方法であり得て、以下を接触させることを含む。
（ａ）免疫細胞
（ｂ）人工受容体発現用組成物または人工受容体タンパク質
（ｃ）ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子およびＫＤＭ６Ａ遺伝子から成る群から選択される１または複数の免疫調節遺伝子を人工的に操作可能な遺伝子操作用組成物
（ａ）免疫細胞は、人体から単離され得る、または、幹細胞から分化した免疫細胞であり得る。
（ｂ）人工受容体発現用組成物は、キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を有するベクターを含む組成物であり得る。
（ｂ）人工受容体発現用組成物は、電気穿孔、リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ナノ粒子およびタンパク質移行ドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質法から選択される１または複数の方法で免疫細胞に導入され得る。
例えば、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルスまたは単純ヘルペスウイルスから成る群から選択される１または複数であり得る。
（ｃ）遺伝子操作用組成物は以下を含み得る。
（ｃ'）ＰＤ‐１遺伝子、ＣＴＬＡ‐４遺伝子、ＤＧＫＡ遺伝子、ＤＧＫＺ遺伝子、ＦＡＳ遺伝子、ＥＧＲ２遺伝子、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子、ＴＥＴ２遺伝子、ＰＳＧＬ‐１遺伝子、Ａ２０遺伝子およびＫＤＭ６Ａ遺伝子から成る群から選択される１または複数の免疫調節遺伝子の核酸配列における配列識別番号１～２８９の標的配列に相同な、または、それとの相補結合を形成可能なガイド核酸
（ｃ"）ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、および、Ｃｐｆ１タンパク質から成る群から選択される１または複数のタンパク質であるエディタータンパク質
上の遺伝子操作用組成物についての説明は、上に記載した通りである。
接触は、ｅｘ ｖｉｖｏで実行され得る。
接触は、（ａ）免疫細胞を（ｂ）人工受容体発現用組成物および（ｃ）遺伝子操作用組成物に順次または同時に接触させることであり得る。
接触は、（ａ）免疫細胞を（ｃ）遺伝子操作用組成物および（ｂ）人工受容体発現用組成物に順次または同時に接触させることであり得る。
接触は、（ｂ）人工受容体発現用組成物および（ｃ）遺伝子操作用組成物を（ａ）免疫細胞に導入することを含み得る。
方法は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、例えば、人体の外で実行され得る。
例えば、接触は、ｅｘ ｖｉｖｏで実行され得て、接触した細胞は、接触後に、対象の身体に戻され得る。
方法は、生物における免疫細胞、例えば、人体から単離された免疫細胞、または、人工的に生成された免疫細胞を採用し得る。一例において、癌を患う対象の細胞を接触させることが含まれ得る。
上記の方法において使用される免疫細胞は、霊長動物（例えば、ヒト、サルなど）、齧歯動物（例えば、マウス、ラットなど）を含む哺乳動物に由来する免疫細胞であり得る。例えば、免疫細胞は、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞などであり得る。特に、免疫細胞は、免疫受容体が補足された（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が補足された）操作された免疫細胞であり得る。
方法は、血清（例えば、ウシ胎児血清またはヒト血清）、インターロイキン２（ＩＬ‐２）、インスリン、ＩＦＮガンマ、ＩＬ‐４、ＩＬ‐７、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐１０、ＩＬ‐１５、ＴＧＦ‐ベータ、およびＴＮＦ‐アルファを含み得る免疫細胞のための適切な培地において、または、当業者に知られている、細胞の増殖のための他の添加剤を含む、増殖および生存に必要な因子を含み得る適切な培地（例えば、最小必須培地、ＲＰＭＩ培地１６４０、または、Ｘ‐ｖｉｖｏ‐１０、‐１５、‐２０（ロンザ））において実行され得るが、培地はこれらに限定されない。
本明細書によって開示される態様は、操作された免疫細胞を使用する病気治療法の方法に関する。
本明細書によって開示された実施形態は、例えば、キメラ抗原受容体を含む遺伝子改変された免疫細胞など、人工的に改変された細胞を対象に投与することを含む、免疫療法の手法を使用する病気治療法のための使用である。
治療の対象は、霊長動物（例えば、ヒト、サルなど）および齧歯動物（例えばマウス、ラットなど）を含む哺乳動物であり得る。
本明細書によって開示される実施形態は、人工的に改変された免疫細胞を使用する病気治療法において使用される医薬組成物である。
医薬組成物は、免疫応答を使用する病気治療法において使用され得る。例えば、医薬組成物は、改変された免疫細胞を含む組成物である。医薬組成物は、治療用組成物、または、細胞療法製品と称され得る。
一例に、医薬組成物は、機能的に改変された免疫細胞を含み得る。
ここで、医薬組成物に含まれる機能的に改変された免疫細胞数は、医薬組成物に含まれる免疫細胞総数の５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、または９０％～１００％の部分を占め得る。
別の例において、医薬組成物は操作されたハイブリッド免疫細胞を含み得る。
ここで、医薬組成物に含まれる機能的に改変された免疫細胞数は、医薬組成物に含まれる免疫細胞総数の５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、または９０％～１００％の部分を占め得る。
更に別の例において、医薬組成物は、機能に操作された免疫細胞、および、操作されたハイブリッド免疫細胞を含み得る。
ここで、医薬組成物に含まれる、機能的に改変された免疫細胞数は、医薬組成物に含まれる免疫細胞総数の１％～２０％、２０％～６０％、６０％～８０％、または８０％～９９％の部分を占め得て、この場合、医薬組成物に含まれる、改変されたハイブリッド免疫細胞数は、医薬組成物に含まれる免疫細胞総数の８０％～９９％、６０％～８０％、４０％～６０％、２０％～４０％または１％～２０％の部分を占め得る。
ここで、医薬組成物は、追加のコンポーネントを更に含み得る。
例えば、医薬組成物は、免疫チェックポイント阻害剤を含み得る。
ここで、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＬＡＧ‐３、ＴＩＭ‐３、ＣＴＬＡ‐４、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ、ＣＤ１６０、ＣＤ２４４またはＣＤ３９の阻害剤であり得る。ここで、阻害剤は、これらに限定されないが、抗体；化合物；免疫チェックポイントに結合または相互作用することが可能な核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質；ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のためのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；または、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）もしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓなど、免疫チェックポイント遺伝子のノックアウトまたはノックダウンのためのヌクレアーゼであり得る。
医薬組成物は、抗原結合メディエータを含み得る。
医薬組成物は、サイトカインを含み得る。
医薬組成物は、サイトカイン分泌の刺激剤または抑制剤を含み得る。
医薬組成物は、操作された免疫細胞を身体に送達するための適切な担体を含み得る。
ここで、医薬組成物に含まれる免疫細胞は、患者の自家細胞、または、患者の同種異系細胞であり得る。
本明細書によって開示される別の実施形態は、上で説明される医薬組成物の生成と、治療を必要とする患者への医薬組成物の投与とを含む、患者の疾患を治療するための方法である。
治療される疾患
疾患は、免疫疾患であり得る。
特に、免疫疾患は、免疫機能が劣化した疾患であり得る。
免疫疾患は、自己免疫疾患であり得る。
例えば、自己免疫疾患は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、全身性エリテマトーデス、セリアック病、１型糖尿病、グレーヴス病、炎症性腸疾患、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症などを含み得る。
追加的に、疾患は、病原体が知られているが治療が未知である難治性疾患であり得る。
難治性疾患は、ウイルス感染症の癌であり得る。
難治性疾患は、プリオン病原体由来疾患であり得る。
難治性疾患は癌であり得る。
免疫増強治療
免疫が著しく低下した患者の場合、軽度な感染でも致命的結果をもたらすことがり得る。免疫低下は、免疫細胞の機能低下、免疫細胞生産量の低下などによって引き起こされる。免疫を増強して免疫機能の劣化を治療するための方法として、１つの方法は、正常免疫細胞の生産を活性化する恒久的治療方法であり得て、別の方法は、免疫細胞が一時的に注射される一時的治療方法であり得る。
免疫増強治療は、患者の身体に治療用組成物を注射して免疫を恒久的に増強することを意図するものであり得る。
免疫増強治療は、治療用組成物を患者の特定の身体部分に注射する方法であり得る。特に、特定の身体部分とは、免疫細胞発生源を供給する組織を有する部分であり得る。
免疫増強治療は、患者の身体において、免疫細胞の新規の発生源を生成することであり得る。特に、一例において、治療用組成物は幹細胞を含み得る。特に、幹細胞は、造血幹細胞であり得る。
免疫増強治療は、治療用組成物を患者の身体に注射して免疫を一時的に増強することを意図するものであり得る。
免疫増強治療は、患者の身体に治療用組成物を注射するものであり得る。
特に、好適な治療組成物は分化した免疫細胞を含み得る。
免疫増強治療に使用される治療用組成物は特定の数の免疫細胞を含み得る。
特定の数は、免疫の劣化の程度に応じて変動し得る。
特定の数は、身体の体積に応じて変動し得る。
特定の数は、患者から放出されるサイトカインの量に従って調節され得る。
難治性疾患の治療
免疫細胞操作技法は、ＨＩＶ、プリオン、癌などの病原体のための完全な治療が知られていない疾患を治療するための方法を提供し得る。これらの疾患の病原体は知られているが、抗体がほとんどと形成されない、疾患が急激に進行して患者の免疫系を不活性化する、病原体が身体において潜伏期間を有するという問題があるため、多くの場合、これらの疾患は治療が難しい。操作された免疫細胞は、これらの問題を解決するための強力な手段であり得る。
難治性疾患の治療は、治療用組成物を身体に注射することによって実行され得る。特に、好適な治療組成物は、操作された免疫細胞を含み得る。加えて、治療用組成物は、身体の特定の部分に注射され得る。
操作された免疫細胞は、標的疾患の病原体を認識する能力が改善された免疫細胞であり得る。
操作された免疫細胞は、免疫応答の強度または活性が増強されたものであり得る。
遺伝子修正治療
外部で抽出された免疫細胞を使用する治療方法に加えて、生体の遺伝子を操作することによって、免疫細胞の発現に直接影響する治療方法であり得る。そのような治療方法は、遺伝子を操作するための遺伝子修正組成物を身体に直接注射することによって実現され得る。
遺伝子修正組成物は、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体を含み得る。
遺伝子修正組成物は、身体の特定の部分に注射され得る。
身体の特定の部分は、免疫細胞の発生源、例えば骨髄であり得る。
投与の対象は、霊長動物（例えば、ヒト、サルなど）、齧歯動物（例えば、マウス、ラットなど）を含む哺乳動物であり得る。
組成物の投与は、例えば、注射、輸血、インプラント、移植などの任意の好都合な方式で実行され得る。投与経路は、皮下、皮内、腫瘍内、節内、髄内、筋肉内、静脈内、リンパ管内、腹腔内の投与などから選択され得る。
組成物（所望の効果を達成するための薬学的有効量）の単回投与量は、投与される対象の体重（ｋｇ）あたり、約１０４～１０９の範囲のすべての整数値のうちから選択され得る個数の細胞（例えば、約１０５～１０６細胞／ｋｇ（体重））であり得るが、投与量はこれに限定されず、組成物の単回投与量は、投与される対象の年齢、健全状態、体重と、該当する場合は併用療法の種類と、治療の頻度と、所望の効果の性質とを考慮して適切に処方され得る。
例えば、免疫調節遺伝子が、本明細書によって開示される遺伝子操作用組成物によって人工的に操作および調節されるとき、生存、増殖、持続性、細胞毒性、サイトカイン放出および／または浸潤などに関与する、免疫細胞の免疫効果が改善され得る。追加的に、免疫疾患および難治性疾患は、本明細書によって開示される、操作された免疫細胞を含む医薬組成物、および、医薬組成物を使用する治療方法によって緩和または治療され得る。
実験例
１．ｓｇＲＮＡの設計
ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮツール（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ、韓国）を使用して、ヒトＰＤ‐１遺伝子（ＰＤＣＤ１、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００５０１８．２）、ＣＴＬＡ‐４遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１０３７６３１．２）、Ａ２０遺伝子（ＴＮＦＡＩＰ３、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１２７０５０７．１）、Ｄｇｋ‐アルファ遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１３４５．４）、Ｄｇｋ‐ゼータ遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１１０５５４０．１）、ＥＧＲ２遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００３９９．４）、ＰＰＰ２ｒ２ｄ遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１２９１３１０．１）、ＰＳＧＬ‐１遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１１９３５３８．１）、ＴＥＴ２遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１７６２８．４）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的領域を選択し、オフターゲット試験によって推定した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的領域について、ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）におけるオンターゲット配列領域を除き、０、１、または２ｂｐのミスマッチ部位が無いＤＮＡ配列をｓｇＲＮＡの標的領域として選択した。
２．ｓｇＲＮＡの合成
２つの相補的オリゴヌクレオチドをアニールして延長することによって、ｓｇＲＮＡ合成のための鋳型をＰＣＲ増幅した。
このとき使用された標的領域配列、それを増幅するためのプライマー配列、および、それから取得されるｓｇＲＮＡによって標的化されるＤＮＡ標的配列を以下のテーブル２において説明する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写は、鋳型ＤＮＡ（標的配列の３'末端におけるＮＧＧを除く）のためのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を使用して実行し、ＲＮＡは、製造元の指示に従って合成し、次いで、ＤＮＡａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して鋳型ＤＮＡを除去した。転写されたＲＮＡは、Ｅｘｐｉｎ Ｃｏｍｂｏキット（ＧｅｎｅＡｌｌ）およびイソプロパノール沈殿によって精製した。
Ｔ細胞を使用する実験において、ｓｇＲＮＡの免疫原性および分解を最小化するべく、アルカリホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を使用して上記の方法によって合成されたｓｇＲＮＡから、５'末端のリン酸残基を除去し、次いで、Ｅｘｐｉｎ Ｃｏｍｂｏキット（ＧｅｎｅＡｌｌ）およびイソプロパノール沈殿によってＲＮＡを再度精製した。加えて、いくつかのＴ細胞実験において、化学的に合成されたｓｇＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を使用した。
特定の例において使用された化学的に合成されたｓｇＲＮＡは、２'ＯＭｅおよびホスホロチオエートで改変されたｓｇＲＮＡである。
例えば、この例において使用されたＤＧＫα ｓｇＲＮＡ ＃１１は、５'‐２'ＯＭｅ（Ｃ（ｐｓ）Ｕ（ｐｓ）Ｃ（ｐｓ）） ＵＣＡ ＡＧＣ ＵＧＡ ＧＵＧ ＧＧＵ ＣＣＧ ＵＵＵ ＵＡＧ ＡＧＣ ＵＡＧ ＡＡＡ ＵＡＧ ＣＡＡ ＧＵＵ ＡＡＡ ＡＵＡ ＡＧＧ ＣＵＡ ＧＵＣ ＣＧＵ ＵＡＵ ＣＡＡ ＣＵＵ ＧＡＡ ＡＡＡ ＧＵＧ ＧＣＡ ＣＣＧ ＡＧＵ ＣＧＧ ＵＧＣ ２'ＯＭｅ（Ｕ（ｐｓ）Ｕ（ｐｓ）Ｕ（ｐｓ）Ｕ‐３'という構造を有する（２'ＯＭｅ＝２'‐メチルＲＮＡ、ｐｓ＝ホスホロチオエート）。
別の例において、この実施形態で使用されるＡ２０ ｓｇＲＮＡ ＃１は、ＧＣＵＵＧＵＧＧＣＧＣＵＧＡＡＡＡＣＧＡＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵであり（太字部分は、標的配列領域にハイブリダイズされる配列であり、他の標的遺伝子または他の標的配列のｓｇＲＮＡは、その太字配列が標的配列を有することであり（ただし、ＴがＵに変化する））、配列の３'末端における３つのヌクレオチドおよび５'末端における３つのヌクレオチドが、２'‐ＯＭｅおよびホスホロチオエート主鎖導入により改変されるように改変される。
［テーブル２］
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一方、ｓｇＲＮＡはテーブル１に記載される配列識別番号１～８４のＤＮＡ標的配列に関するＰＳＧＬ‐１遺伝子についての上と同一の方法で生成された。
例３．ジャーカット細胞におけるｓｇＲＮＡのスクリーニング
Ａ２０、Ｄｇｋα、Ｅｇｒ２、ＰＰＰ２ｒ２ｄ、ＰＤ‐１、ＣＴＬＡ‐４、Ｄｇｋζ、ＰＳＧＬ‐１、ＫＤＭ６Ａ、ＴＥＴ２のエクソンを標的化する上の合成されたｓｇＲＮＡの活性をジャーカット細胞において試験した。
１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＧｅｎｅＡｌｌ）を補足したＲＰＭＩ１６４０培地において、ジャーカット細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ‐１５２；ヒトＴ細胞の不死化細胞株）を培養した。３７℃および５％ＣＯ２の条件下で、細胞を培養器において培養した。
細胞活性化のために、培地における細胞の濃度は、各々個々に、１×１０６個の細胞／ｍＬとした。
ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８ビード（抗ＣＤ２／３／ＣＤ２８ダイナビード（登録商標）；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を３：１の比（ビードおよび細胞の数に基づき、ビード：細胞）で追加し、細胞を３７℃および５％ＣＯ２の条件下で培養器において培養した。細胞活性化を７２時間にわたって実行し、磁石を使用してＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８ビードを除去し、ビード無しで１２～２４時間にわたって細胞を更に培養した。
電気穿孔（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）を介して、１μｇ（マイクログラム）の合成されたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ｓｇＲＮＡ、および、４μｇのＣａｓ９タンパク質（Ｔｏｏｌｇｅｎ）を１×１０６個の培養されたジャーカット細胞に導入した。Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）の１０μＬチップ：Ｊｕｒｋａｔｓ （Ｂｕｆｆｅｒ Ｒ）：１，４００Ｖ、２０ｍｓ、２ ｐｕｌｓｅｓを使用して、以下の条件下で遺伝子を導入した。
トランスフェクトした細胞を、抗生物質を含まない培地５００μｌで平板培養し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養器において培養した。
トランスフェクション無しのジャーカット細胞（「‐ａＲＧＥＮ」と示される）と比較して、トランスフェクトしたジャーカット細胞（「＋ａＲＧＥＮ」と示される）におけるインデル率を試験した。試験したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的配列をテーブル３にまとめた。各ｓｇＲＮＡのインデル率をテーブル４にまとめた。
［テーブル３］
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［テーブル４］標的配列についてのジャーカット細胞に対する各ｓｇＲＮＡの活性
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４．腫瘍細胞株培養
ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性Ｕ８７ ＭＧ膠芽腫細胞株（Ｕ８７ｖＩＩＩ）をＣｅｌｔｈｅｒ Ｐｏｌｓｋａから購入した。Ａ３７５Ｐメラノーマ細胞株をＫｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｂａｎｋから購入した。１０％ウシ胎児血清アルブミン（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培地において細胞株を培養した。
５．レンチウイルスの調製
ＣＤ８ヒンジと融合された抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ ｓｃＦｖ、４‐１ＢＢおよびＣＤ３ζドメインを含む融合タンパク質１３９ＣＡＲ、ならびに、ＮＹ‐ＥＳＯ‐１を標的化するｃ２５９ ＴＣＲコンストラクトは、Ｓａｍｐｓｏｎ， Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ． （Ｓａｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ． ２０１４， Ｒａｐｏｐｏｒｔ， Ｓｔａｄｔｍａｕｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１５）の研究を参考にした。コドン最適化ｃＤＮＡ ＣＡＲおよびＴＣＲコンストラクトをｐＬＶＸベクターでサブクローニングした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、レンチウイルスベクターおよびヘルパープラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を培養することによってレンチウイルス産生培養上清を取得した。培養上清の取得後、レンチウイルスを含む培養上清を、スクロースを含むバッファ（１００ｍＭ、ＮａＣｌ、０．５ｍＭエチレンジアミンＴＥＴＲＡ酢酸［ＥＤＴＡ］、５０ｍＭ Ｔｒｉ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．４）に４：１の比で加え、１００００ｇを４時間にわたって４℃で遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えた後に再懸濁した。
６．ＤＧＫ ＫＯ １３９ＣＡＲ‐Ｔ細胞の構造
ヒト末梢血Ｔ細胞（ｐａｎ‐Ｔ細胞）はＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳから購入した。５０Ｕ／ｍＬのｈＩＬ‐２、５ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ－７、ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ培地において、解凍したＴ細胞を活性化前に一晩培養した。抗ＣＤ３／２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が細胞を活性化するために使用され、１０％ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ培地において、３：１の比（ビード：細胞）で使用された。活性化の２４時間後、１００μｇ／ｍＬのレトロネクチンで被覆されたプレートにおいて、Ｔ細胞を１３９‐ＣＡＲレンチウイルスと４８時間にわたって混合した。刺激の３日後にビードを除去した。Ａｍａｘａ Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌキットおよび４Ｄ‐Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｒ （ロンザ）を使用して電気穿孔を実行した。Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するために、４０μｇの組み換えＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（Ｔｏｏｌｇｅｎ）および１０μｇの化学的に合成されたｔｒａｃｒ／ｃｒＲＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を２０分にわたってインキュベートした。プレインキュベートされたＣａｓ９ ＲＮＰ複合体を、Ｐ３バッファに再懸濁した３×１０６個の刺激されたＴ細胞に加えた。プログラムＥＯ‐１１５を使用して、Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体を細胞の核に導入した。電気穿孔後、５０Ｕ／ｍＬのｈＩＬ－２、５ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ‐７、および、１０％ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ培地において、５×１０５細胞／ｍＬで、細胞を播種した。試験において使用されたｃｒＲＮＡの標的配列は、ＤＧＫα：ＣＴＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣ、ＤＧＫζ：ＡＣＧＡＧＣＡＣＴＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＣである。
７．フローサイトメトリー染色および抗体
別段の定めが無い限り、細胞染色は、１％ ＦＢＳを加えたＰＢＳにおいて、４℃で実行した。フローサイトメトリーおよび機能的研究のための抗体および薬剤のリストは、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ／Ｆａｒ ｒｅｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、７‐ＡＡＤ（Ｓｉｇｍａ）、抗ＣＤ３：ＵＣＨＴ１（ＢＤ）、抗ＣＤ４：ＲＰＡ‐Ｔ４（ＢＤ）、抗ＣＤ８：ＨＩＴ８ａ（ＢＤ）、抗ＣＤ５６：Ｂ１５９（ＢＤ）、抗ＮＫＧ２Ｄ：１Ｄ１１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ４５ＲＯ：ＵＣＨＬ１（ＢＤ）、抗ＣＣＲ７：１５０５１３（ＢＤ）、抗ＰＤ‐１：ＥＨ１２．２Ｈ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ２５：Ｍ‐Ａ２５１（ＢＤ）、抗Ｆａｓ：Ｄｘ２（ＢＤ）、抗ＣＤ１０７ａ：Ｈ４Ａ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、抗ＥＧＦＲｖｉｉｉ：（Ｂｉｏｒｂｙｔ）、ヤギ抗ヒトＩｇＧ：（Ｂｉｏｒａｄ）である。データをＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴ Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒから取得し、ＦｌｏｗＪｏを使用して解析した。
８． ｉｎ ｖｉｔｒｏ殺傷アッセイ、サイトカイン放出、および、増殖アッセイ
Ｕ８７ｖＩＩＩおよびＡ３７５ＰをＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。指示された比で、腫瘍細胞株をＴ細胞と共培養し、２×１０４～５×１０４個の腫瘍細胞株を、Ｕ‐ｂｏｔｔｏｍ９６ウェルプレートにおいて、ウェルごとに分注した。指示されたエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で、休止１３９ＣＡＲ‐Ｔ細胞およびｃ２５９Ｔ細胞を各標的細胞に追加した。１８時間の共培養の後に細胞を採取し、生存／死亡細胞を識別するために７‐アミノアクチノマイシンで染色した。試料をＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴ Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで測定し、ＦｌｏｗＪｏで解析した。細胞毒性は、［（％ｌｙｓｉｓ ｓａｍｐｌｅ％ｌｙｓｉｓ ｍｉｎｉｍｕｍ）／（％ｌｙｓｉｓ ｍａｘ ［１００％］－％ｌｙｓｉｓ ｍｉｎｉｍｕｍ］×１００％の式を使用して計算した。試験を３回繰り返した。共培養の後に採取した培養上清は、ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用してＩＬ‐２およびＩＦＮ‐γの分泌量を計測するために使用した。Ｃｅｌｌｔｒａｃｅで標識した１３９ＣＡＲ‐Ｔ細胞を、増殖アッセイのためにＵ８７ｖＩＩＩ細胞と共に４日間にわたって共培養し、フローサイトメトリーを使用して１３９ＣＡＲ‐Ｔ細胞におけるＣｅｌｌｔｒａｃｅの分布を評価した。
９．反復的腫瘍チャレンジ実験
連続的な腫瘍試験のために、ＩＬ‐７培地において、３：１の比（Ｅ：Ｔ）で、１３９ ＣＡＲ‐ＴをＵ８７ｖＩＩＩと共培養した（０日目）。４日目に、１３９ＣＡＲ‐Ｔ細胞を採取し、ＩＬ‐７培地において、同一のＥ：Ｔ比で、Ｕ８７ｖＩＩＩと共に再度共培養した。ＩＦＮ‐γおよびＩＬ‐２の放出を評価するために、第１および第２の腫瘍接種の２４時間後、培養上清を個々に採取した。
１０．ウエスタンブロット解析
Ｔ細胞のＴＣＲ遠位シグナルを評価するべく、１：２の比（ビード：細胞）で、抗ＣＤ３活性ビード（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用することによって、１５分間および６０分間にわたって、１×１０６個の細胞を活性化した。ＥＲＫ、ｐＥＲＫ、およびＧＡＰＤＨを測定するべく、ＲＩＰＡ ｌｙｓｉｓおよび抽出バッファを使用して、細胞溶解液を調製した。試験において使用されたすべての抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから購入した。
１１．カルシウム流入
Ｔ細胞カルシウム流入の計測を、カルシウムアッセイキット（ＢＤ）マニュアルに従って実行した。簡潔に説明すると、Ｔ細胞をＲＰＭＩ培地で洗浄し、同一の培地に再懸濁し、色素と共に３７℃で１時間インキュベートした。非処理細胞からＦＩＴＣシグナルの基本的な基準を取得した後に、ビード：細胞が５：１の比となるように、抗ＣＤ３活性ビード（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を加え、フローサイトメトリーで測定した。フローサイトメトリーから採取したデータは、ｋｉｎｅｔｉｃモードを使用してＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析した。
１２．リアルタイムＰＣＲ
ＲＮＡシーケンシングのために、１：１の比（ビード：細胞）でヒトＴ活性化因子抗ＣＤ３／２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用して、１×１０６個の細胞を４８時間にわたって活性化した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出し、製造元の指示（ＡＢＩ）に従ってｃＤＮＡを生成した。ＴａｑＭａｎ遺伝子発現解析キット／プローブセット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用してリアルタイムＰＣＲを実行した。各遺伝子の発現は、ＧＡＰＤＨ発現で正規化した。ここで、試験に使用したプライマーは、ｈＤＧＫα Ｆ：５'‐ＡＡＴＡＣＣＴＧＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴ‐３'、ｈＤＧＫα Ｒ：５'‐ＧＴＣＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＴＣ、ｈＤＧＫζＦ：５'‐ＧＴＡＣＴＧＧＣＡＡＣＧＡＣＴＴＧＧＣ‐３'、ｈＤＧＫζＲ：５'‐ＧＣＣＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＴＡＧＴＴＧＴＴ‐３'、ｈβＦ：５'‐ＧＧＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＣ‐３'、ｈβＲ：５'‐ＴＡＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧＣＧＧＡＴＧＴＣ‐３'、ＩＤ２：Ｈｓ００７４７３７９＿ｍ１、ＰＲＤＭ１：ＨＳ００１５３３５７＿ｍ１、ＩＬ１０：００１７４０８６＿ｍ１、ＩＦＮＧ：Ｈｓ００１７４１４３＿ｍ１、ＩＬ２：ＨＳ００１７４１１４である。
１３．Ｄｉｇｅｎｏｍｅシーケンシング
ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してヒトＴ細胞のゲノムＤＮＡを分離した。１０００μｌの反応溶液（ＮＥＢ３．１バッファ）において、ゲノムＤＮＡ（２０μｇ）をＣａｓ９タンパク質（１０μｇ）、ｃｒＲＮＡ（３．８μｇ）、および、ｔｒａｃｒＲＮＡ（３．８μｇ）で処理し、３７℃で４時間にわたって培養した。消化されたＤＮＡは、ＲＮａｓｅ Ａ（５０μｇ／ｍＬ）で３７℃で３０分間にわたって培養し、ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔで精製した。消化されたＤＮＡは、Ｃｏｖａｒｉｓシステムを使用して断片化し、ライブラリを形成するためにアダプタに接続した。ＤＮＡライブラリは、ＴＨＥＲＡＧＥＮ ＥＴＥＸにおいて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ × Ｔｅｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを使用して、全ゲノム配列に適用された。Ｂａｍファイルを形成するべく、ｖｅｒ． ０１．１４．０３．１２； Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， ｈｇ１９ ｆｒｏｍ ＵＣＳＣ （ｏｒｉｇｉｎａｌ ＧＲＣｈ３７ ｆｒｏｍ ＮＣＢＩ， Ｆｅｂ． ２００９）， Ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， ｍｍ１０ ｆｒｏｍ ＵＣＳＣ； Ｂａｓｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｕｔｏｆｆ， １５； Ｋｅｅｐ ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ｒｅａｄｓ， ｙｅｓ； Ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅａｄ ｌｅｎｇｔｈ ｓｕｐｐｏｒｔ， ｙｅｓ； Ｒｅａｌｉｇｎ ｇａｐｓ， ｎｏ；およびＡｄａｐｔｏｒ ｃｌｉｐｐｉｎｇ， ｙｅｓ （ａｄａｐｔｏｒ： ５'‐ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣ‐３'， ５'‐ＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ‐３'）のパラメータを使用することによって、Ｉｓａａｃ ａｌｉｇｎｅｒを使用した。
１４．マウス異種移植の研究
Ｕ８７ｖＩＩＩ腫瘍モデルについては、１００μＬ ＰＢＳの体積で、６～８週齢の雌ＮＳＣマウスの右脇腹に１×１０６個のＵ８７ｖＩＩＩ細胞を皮下注射した（０日目）。移植後の２８日目に、腫瘍の大きさは１５０±５０ｍｍ２に達し、マウスをランダムにグループ化した。各グループは６～８匹のマウスから成り、腫瘍の大きさは同様であった。５×１０６個のＴ細胞、１３９ ＡＡＶＳ１ ＣＡＲ‐Ｔ細胞、および、１３９ ＤＧＫαζ ＣＡＲ Ｔ細胞を、２８日目および３２日目に、各グループにそれぞれ静脈内（ＩＶ）または腫瘍内（ＩＴ）注射した。１３９ＡＡＶＳ１ ＣＡＲ‐Ｔ細胞および１３９ＤＧＫαζ ＣＡＲ Ｔ細胞についてのＣＡＲの表面発現を識別した（表面ＣＡＲ発現範囲：２５％～７０％）。３２日目から３５日目まで毎日、すべてのマウスにテモゾロミド（ＴＭＺ）（Ｓｉｇｍａ）を腹腔内投与した（０．３３ｍｇ／マウス／日）。カリパスを用いて、腫瘍の大きさを週に２回モニタリングした。腫瘍の大きさが２０００ｍｍ３に達したときにマウスを死亡させた。ｉｎ ｖｉｖｏ送達後のＣＡＲ‐Ｔ細胞の追加的研究のために、末梢血、脾臓および腫瘍組織を各マウスから分離した。腫瘍組織を分離するべく、はさみを用いて腫瘍試料を切り、３７℃の水槽において、１００Ｕ／ｍＬコラゲナーゼＩＶおよび２０Ｕ／ｍｌ Ｄｎａｓｅと共に１時間にわたって処理した。その後、追加調査のために細胞を無菌細胞ストレーナに通した。脾臓から細胞を分離するべく、無菌プランジャを用いて組織を破砕し、無菌細胞ストレーナに通した。溶血のために、ＡＣＫバッファ溶液（１５０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１０ ｍＭ ＫＨＣＯ３、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．２）で細胞懸濁液を更に５分間処理した。腫瘍浸潤Ｔ細胞のエフェクター機能を解析するべく、腫瘍組織から解離した細胞を、ＣＯ２培養器において５０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡおよび１μｇ／ｍＬイオノマイシンと共に５時間にわたって再活性化し、細胞内ＩＦＮ‐γおよびＴＮＦαの染色を実行した。
例１．最適化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ送達によるヒト一次Ｔ細胞におけるＤＧＫの効果的阻害
ヒト一次Ｔ細胞の抗腫瘍活性におけるＤＧＫの役割を識別するべく、ＤＧＫα遺伝子のエクソン５‐７、および、ＤＧＫζ遺伝子のエクソン３‐１２をそれぞれ標的化するｇＲＮＡをスクリーニングした。最適化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＰ電気穿孔およびレンチウイルストランスフェクションの後、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で処理したＴ細胞は、活発なＣＡＲ発現を示した（図２８）。生存率および細胞増殖のわずかな減少が観察されたが、生存率および細胞増殖は、電気穿孔の２日後、すぐに戻った（図２９）。一例において、１３９ＣＡＲ、高い特異性を有する抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ＣＡＲが、膠芽腫細胞を標的化するために使用された（Ｓａｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ． ２０１４）。ＥＧＦＲｖＩＩＩの発現は、悪性組織に厳密に限定される。したがって、１３９‐ＣＡＲを使用することによって操作されたＣＡＲ‐Ｔ細胞の潜在的な安全性に関する懸念は、例えば、オンターゲット効果が改善することが予想された。単一遺伝子ノックアウト実験におけるインデル率は、ディープシーケンシングに基づいて、約８０％～９０％であると測定された（図３０）。切断部位における詳細な配列解析の結果として、ＤＧＫαおよびＤＧＫζ１３９ ＣＡＲ‐Ｔ細胞におけるＮＨＥＪ復元によって誘導されるフレーム外変異はそれぞれ、６６．７％および５９・６％であることが分かった。これは、ＤＧＫタンパク質発現の減少に著しく従う（図３０）。以前の研究で、ＤＧＫαおよびＤＧＫζの非重複機能について報告されたので、単一のＤＧＫノックアウト１３９Ｔ細胞と同等のノックアウト効率を示すＤＧＫαζダブルノックアウトＴ細胞を産生することによって相乗効果を識別した（図３０）。ＤＧＫを標的化するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のオフターゲットを調査するべく、ＤＧＫα １３９ ＣＡＲ‐ＴおよびＤＧＫζ１３９ ＣＡＲ‐Ｔにおいて、ミスマッチベースｉｎ ｓｉｌｉｃｏ解析、および、全ゲノムにおけるオフターゲット識別方法であるＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑを実行した（図３１）。全体として、結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子操作は、ＤＧＫを効率的かつ特異的に阻害し、一方、ヒト一次Ｔ細胞における細胞増殖およびＣＡＲ発現を著しく鈍化することがないことを示した。
例２．人工的に操作されたＤＧＫによって増幅されるＣＤ３末端シグナルによって示されるエフェクター機能の強化
ＤＧＫζ欠乏Ｔ細胞におけるサイトカイン分泌の増大が以前に異なるグループによって報告されたので、例においてＤＧＫ １３９ＣＡＲ‐Ｔ細胞の抗腫瘍機能を評価した（Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ． ２０１２， Ｒｉｅｓｅ ｅｔ ａｌ． ２０１３）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ特性解析において、１３９ ＣＡＲ‐Ｔの細胞毒性を維持し、１３９ ＣＡＲ‐ＴよりもＤＧＫ １３９ ＣＡＲ‐Ｔと類似の生理学的状態を有するＡＡＶＳ１ １３９ ＣＡＲ‐Ｔをネガティブコントロールとして使用した（図３２）。ＤＧＫ １３９ ＣＡＲ‐Ｔは、Ｕ８７ｖＩＩＩと共培養されたとき、ＡＡＶＳ１ ＣＡＲ‐Ｔと比較して、細胞毒性、および、サイトカインの著しい増大など、優れたエフェクター機能を示した（図３３）。興味深いことに、ＤＧＫαζ１３９ ＣＡＲ‐Ｔは、ＤＧＫαまたはＤＧＫζ１３９ ＣＡＲ‐Ｔより、ＩＦＮ‐γおよびＩＬ‐２を生成した。このことは、抗腫瘍活性におけるＤＧＫダブルノックアウトによる相乗効果の存在を強く意味する。追加的に、ＣＡＲ‐Ｔ細胞および標的腫瘍細胞株が共培養されたときに増加するＰＤ‐１の発現、および、Ｕ８７ｖＩＩＩ膠芽腫細胞株におけるＰＤ‐Ｌ１の強い発現も識別された。このことは、ＰＤ‐１抗体またはＰＤ‐１ノックアウトなどのＰＤ‐１妨害と組み合わせるときに相乗効果が示され得ることを意味する（図３４）。
次に、シグナル１（ＣＤ３シグナル）経路がＤＧＫ破壊によって影響されるかどうかが調査された。ＡＡＶＳ１ Ｔ細胞およびＤＧＫ Ｔ細胞は、指示された期間にわたって抗ＣＤ３ビードで刺激され、カルシウム流入、および、シグナル１の末梢シグナルであるＥＲＫを測定した。カルシウム流入は、ＴＣＲ活性化によって影響されなかったが、リン酸化ＥＲＫシグナルが増幅され、ＤＧＫノックアウト変異体において、より長く続いた（図３５）。ＤＧＫαζＴ細胞におけるリン酸化ＥＲＫシグナルの著しい増大は、図３３におけるＤＧＫダブルノックアウトの相乗効果に従っている。そのような結果は、ＤＧＫの除去により、ＴＣＲ末梢シグナルが増大し、それにより、Ｔ細胞の細胞毒性およびサイトカイン放出が増加することを示す。
例３．ＤＧＫが人工的に操作されたＴ細胞によるＴＧＦ‐βおよびＰＧＥ２の免疫抑制効果の回避。
前の例において、ＤＧＫを除去することがＴＣＲシグナリングを効果的に活性化することを発見した後に、人工的に操作されたＤＧＫが、シグナル１阻害剤についてのＴ細胞の感度を低減することが可能かどうかを試験した。ＣＡＲ‐Ｔ治療方法の治療結果は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）における高濃度のＴＧＦ‐βおよびＰＧＥ２に起因して限定されているので、阻害因子の中で、ＴＧＦ‐βおよびＰＧＥ２に注目した（Ａｒｕｍｕｇａｍ， Ｂｌｕｅｍｎ ｅｔ ａｌ． ２０１５， Ｐｅｒｎｇ ａｎｄ Ｌｉｍ ２０１５， Ｏ'Ｒｏｕｒｋｅ， Ｎａｓｒａｌｌａｈ ｅｔ ａｌ． ２０１７）。まず、Ｕ８７ｖＩＩＩについてのＣＡＲ‐Ｔ活性におけるＴＧＦ‐β阻害効果を調査した。ＤＧＫダブルノックアウト１３９ＣＡＲ‐Ｔが、ＰＧＥ２およびＴＧＦ‐β媒介免疫抑制において相乗的抵抗を示したので、ＤＧＫαζ１３９ ＣＡＲ‐Ｔを試験のために使用した（図３６）。ＴＧＦ‐βの高い生理学的濃度（１０ｎｇ／ｍｌ）（図３６）に曝されたとき、ＡＡＶＳ１ １３９ ＣＡＲ‐Ｔによる、腫瘍死滅活性、ならびに、ＩＦＮ‐γおよびＩＬ‐２の産生などの活性が急激に減少した（Ｘｕ， Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ． ２０００）（Ｉｖａｎｏｖｉｃ， Ｔｏｄｏｒｏｖｉｃ‐Ｒａｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ． ２００３）。一方、ＤＧＫαζ１３９ ＣＡＲ‐Ｔは、ＴＧＦ‐βで処理したときでも、エフェクター機能を維持した。同様に、ＰＧＥ２処理による細胞毒性能力が著しく損傷されたＡＡＶＳ１ １３９ ＣＡＲ‐Ｔとは対照的に、ＤＧＫαζ１３９ ＣＡＲ‐Ｔは、阻害因子に対する感受性が比較的低い（図３６）。つまり、ＡＡＶＳ１ ＣＡＲ‐Ｔの腫瘍応答は、大幅に喪失し、一方、ＤＧＫ ＣＡＲ‐Ｔ細胞は、活性の４９％～９９％を維持し、ＴＧＦ‐βおよびＰＧＥ２に曝されたときでも一定の抗腫瘍機能を示した（図３７）。追加的に、ｃ２５９ ＴＣＲ‐ＴにおけるＤＧＫノックアウトの有利な役割が識別された。ＮＹ‐ＥＳＯを発現するＡ３７５Ｐ細胞と共に培養されたとき、ＤＧＫ ｃ２５９ ＴＣＲ‐Ｔは、ＴＧＦ‐βおよびＰＧＥ２への感受性が低く、養子細胞移動におけるＤＧＫノックアウトプラットフォームの柔軟性を示した（図３８）。ＴＧＦ‐βおよびＰＧＥ２抑制実験におけるＤＧＫαζ１３９ ＣＡＲ‐Ｔ抗腫瘍活性のわずかな減少は、ＤＧＫの不完全な破壊に起因するとみなされる。なぜなら、ＤＧＫαおよびＤＧＫζのフレーム外ノックアウトの割合はそれぞれ、６６．７％および５９．６％である（図３０）。このデータは、ＤＧＫノックアウトによる細胞内ＤＡＧの利用可能性の増大により、Ｔ細胞が、シグナル１抑制剤による免疫抑制を克服できることを意味し、シグナル２抑制剤と組み合わせて投与するときに効果的な相乗効果を示し得ることを示唆する。
例４．反復抗原刺激における、ＤＧＫが人工的に操作されたＴ細胞のエフェクター機能の維持
Ｔ細胞は、多くの場合、繰り返し抗原を認識するとき、ＩＬ‐２分泌および細胞毒性が失われる機能低下状態、すなわち、アネルギーになる。ＤＡＧ代謝は、Ｔ細胞活性化およびアネルギーを調節する重要な決定因子である（Ｏｌｅｎｃｈｏｃｋ， Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ． ２００６， Ｚｈａ， Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ． ２００６）。複数の研究において、ＤＧＫαの薬学的抑制が、マウスＴ細胞のアネルギー状態を戻すことが可能であることが報告されており、それにより、ＤＧＫが人工的に操作されたヒトＴ細胞がＴ細胞アネルギーを克服するかどうかが識別された（Ｏｌｅｎｃｈｏｃｋ， Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ． ２００６， Ｍｏｏｎ， Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１４）。まず、繰り返される抗原攻撃中のＤＧＫαζ１３９ ＣＡＲ‐Ｔの増殖能を評価した。１３９ＣＡＲ‐Ｔ細胞をＵ８７ｖＩＩＩと共に９６時間培養し、次に、Ｕ８７ｖＩＩＩを再度接種し、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ分布および細胞集計を使用することによってＣＡＲ‐Ｔの細胞増殖能を測定した（図３９）。わずかな増殖を示すＡＡＶＳ１ １３９ ＣＡＲ‐Ｔとは異なり、ＤＧＫαζ１３９ ＣＡＲ‐Ｔは、反復活性化において、増殖に成功した（図４０）。ＤＧＫαζ１３９ ＣＡＲ‐Ｔの優れた増殖が、増殖能の強化、または、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）の減少の結果であるかどうかを識別するべく、アポトーシス解析を実行した。Ｕ８７ｖＩＩＩと遭遇した１３９ＣＡＲ Ｔ細胞を７‐ＡＡＤで染色したとき、ＤＧＫαζ１３９ ＣＡＲ‐Ｔは、ＡＡＶＳ１ １３９ ＣＡＲ‐Ｔと比較して、より大きな７‐ＡＡＤ陽性Ｔ細胞集団を示した（図４１）。ＤＧＫαの抑制がＦＡＳ依存的アポトーシスを誘導可能であるので、１３９ ＣＡＲ‐ＴにおけるＦＡＳ発現を識別し、その結果、１３９ ＣＡＲ‐Ｔの表面におけるＦＡＳ発現の著しい増大が識別された（図４１）（Ａｌｏｎｓｏ， Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ． ２００５）。そのようなデータは、腫瘍認識により増加されたＤＧＫαζ１３９ ＣＡＲ‐Ｔ細胞は、主に、細胞増殖能によるものであり、この増大は、腫瘍認識によって誘導されるＴ細胞のアポトーシスを補償することを示す。複数の腫瘍接種におけるＤＧＫαζ１３９ ＣＡＲ‐Ｔのサイトカイン分泌を解析した（図４２）。ＡＡＶＳ１ １３９ ＣＡＲ‐Ｔ細胞は、Ｕ８７ｖＩＩＩに対する最初の曝露の後に、ＩＦＮ‐γおよびＩＬ‐２を強く産生するが、ＡＡＶＳ１ １３９ ＣＡＲ‐Ｔ細胞を採取し、それを新しいＵ８７ｖＩＩＩに再度曝露し、ＥＬＩＳＡを使用してサイトカインの産生を識別した後に、サイトカイン産生能力の著しい低減が識別された。対照的に、ＤＧＫαζ１３９ ＣＡＲ‐Ｔは、第２の曝露の後でも、Ｕ８７ｖＩＩＩによる活性化に反応することによるサイトカインの分泌を維持し、ＤＧＫノックアウトがＴ細胞アネルギーを回避できることを示した。
例５．ＤＧＫが人工的に操作されたＴ細胞のエフェクターメモリーＴ細胞への再プログラミングの効果
ＤＧＫαおよびＤＧＫζの両方を喪失すると、ＣＤ８ Ｔ細胞が、短寿命エフェクター細胞およびエフェクターメモリー群に分化することが報告されている（Ｙａｎｇ， Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１６）。ＤＧＫの欠損がＴ細胞分化を変化させるかどうかを調査するべく、ＤＧＫが操作された１３９ＣＡＲ‐Ｔ細胞をＵ８７ｖＩＩＩと共に４日間共培養しながら、ＤＧＫが操作されたＣＡＲ‐Ｔ細胞のメモリーサブセットの特性を示す。ＤＧＫαζ１３９ ＣＡＲ‐Ｔ細胞は、腫瘍に接種される前に、ＡＡＶＳ１ １３９ ＣＡＲ‐Ｔ細胞より小さいナイーブＴ細胞集団を示した（図４３）。腫瘍接種の４日後、ＤＧＫαζ１３９ ＣＡＲ‐Ｔ細胞のナイーブＴ細胞集団は、エフェクターメモリー細胞へ好ましく分化し、結果として、より小さいナイーブおよびセントラルメモリーＴ細胞集団を形成した（図４３）。次に、ＤＧＫの人工的操作が、Ｔ細胞を転写的に再プログラムしたかどうかを調査した。ＣＤ３／２８ダイナビード（登録商標）を使用して４８時間にわたってＴ細胞を活性化した後に、関連する転写因子を識別した結果、ＤＧＫαζＴ細胞のエフェクターメモリー制御因子であるＩＤ２およびＰＲＤＭ１の大きな増大が識別された（図４４）。追加的に、１型サイトカインの発現は、ＤＧＫが人工的に操作されたＴ細胞において増加したが、２型サイトカインであるＩＬ‐１０の転写は大幅に減少した（図４４）。最後に、ＤＧＫノックアウトによって生成されたエフェクターＴ細胞に機能不全が無いことを識別するべく、ＤＧＫαζ１３９ ＣＡＲ‐Ｔにおける枯渇マーカーであるＰＤ‐１およびＴＩＭ‐３を調査した。Ｕ８７ｖＩＩＩを使用して７日間にわたって１３９ＣＡＲ‐Ｔ細胞を活性化したとき、ＤＧＫ １３９ ＣＡＲ‐Ｔは、ＡＡＶＳ１ １３９ ＣＡＲ‐Ｔと比較して、同様のレベルのＰＤ‐１およびＴＩＭ‐３発現を示した（図４５）。ＤＧＫが人工的に操作されたＴ細胞は、Ｔ細胞の枯渇無く、エフェクターメモリーＴ細胞に再プログラミングされ、その結果、ｅｘ ｖｉｖｏで強い抗癌効果を示した。
例６．ＤＧＫが人工的に操作されたＴ細胞の腫瘍浸潤能力および腫瘍除去効果
ＤＧＫαζ１３９ ＣＡＲ‐Ｔの強化されたエフェクター機能のｉｎ ｖｉｖｏの機能的関連性を調査するべく、ＡＡＶＳ１ １３９ ＣＡＲ‐Ｔ、または、ＤＧＫαζ１３９ ＣＡＲ‐Ｔを、Ｕ８７ｖＩＩＩが移植されたＮＳＧマウスに静脈内注射（ＩＶ）または腫瘍内注射（ＩＴ）した。養子細胞転移の効果は、既存の腫瘍の数、および免疫細胞の数に応じて大きく変化し得る。Ｌｅｖｉ Ｊ， Ｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ．は、腫瘍数が少ないマウスを用いた実験において、対照群であるＣＤ１９ ＣＡＲ‐Ｔ細胞、および、ＰＤ‐１ノックアウトＣＤ１９ ＣＡＲ‐Ｔ細胞の両方で、多くのＴ細胞注射により、腫瘍を完全に除去可能であることを証明した（Ｒｕｐｐ， Ｓｃｈｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． ２０１７）。したがって、本研究は、ＤＧＫノックアウトＴ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を調査するべく、高い腫瘍数のモデルにおいて、低いＴ細胞の数を使用した。腫瘍の体積が１５０±５０ｍｍ３に達したとき、Ｔ細胞を第１に注射し、４日後に腫瘍のサイズが４００±５０ｍｍ３に達したとき、第２Ｔ細胞注射を実行した。ここで、第１および第２の注射は、それぞれ、約１：１０および１：２０のＥ：Ｔ比で実行した。多くの研究では、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ膠芽腫標的化Ｔ細胞治療中、テモゾロミド（ＴＭＺ）無しの治療は、多くの場合、非効率的な結果を示すことが報告されている（Ｏｈｎｏ， Ｏｈｋｕｒｉ ｅｔ ａｌ． ２０１３， Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｓｃｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１５）。したがって、腫瘍退縮を刺激するべく、第２Ｔ細胞注射中に、テモゾロミドアジュバントを腹腔内に注射した。ＩＶ注射された群はすべて、３２日間のＴＭＺ処理後に、腫瘍増殖の遅れを示したが、ＡＡＶＳ１ １３９ ＣＡＲ‐Ｔを注射されたマウスは、対照群のＴ細胞マウス群と比較して、抗癌効果を示さなかった（図４６）。対照的に、５６日目のＤＧＫαζ１３９ ＣＡＲ‐Ｔマウス群において完全な腫瘍退縮が見られた。同様に、ＡＡＶＳ１ １３９ ＣＡＲ‐Ｔの腫瘍内注射により、Ｕ８７ｖＩＩＩ腫瘍を除去できなかったが、ＤＧＫαζ １３９ ＣＡＲ‐Ｔの養子細胞転移は、５２日目に、腫瘍細胞退縮の有意な結果を示した。ＤＧＫαζ１３９ ＣＡＲ‐Ｔのｉｎ ｖｉｖｏ機能を評価するべく、４９日目に腫瘍を抽出し、腫瘍が浸潤したＴ細胞の数を集計した。
ＤＧＫノックアウト１３９ ＣＡＲ‐Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ機能を追加的に評価するべく、注射されたＡＡＶＳ１、αＫＯ、ζ、および、ｄＫＯ １３９ ＣＡＲ‐Ｔ細胞の生存率を解析した。結果として、ζＫＯおよびｄＫＯ １３９ ＣＡＲ‐Ｔ細胞は、著しく多くの数の腫瘍を維持することが識別された（図４７）。これは、Ｋｉ‐６７染色細胞で代表される、分割中のＴ細胞が大量に存在するからであり、これらが機能的に優れたエフェクターＴ細胞であることを、Ｔ‐ｂｅｔ発現の増大、ならびに、ＩＦＮ‐γおよびＴＮＦ‐αなどのサイトカインの分泌能力の強化により識別した（図４８）。
結論として、データの結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＤＧＫの人工的操作により、ヒトＣＡＲ‐Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を強化可能であることを示す。
産業上の応用
有効な免疫細胞治療剤は、人工的に改変された免疫調節遺伝子および人工受容体を含む操作された免疫細胞により取得され得る。例えば、本発明の免疫細胞操作用組成物によって人工的に操作された免疫細胞、または、操作された免疫細胞が使用されるとき、それらは、有効な免疫細胞治療剤として使用され得る。なぜなら、特異的抗原への特異的結合が可能な免疫細胞の生存、増殖、持続性、細胞毒性、サイトカイン放出および／または浸潤などに関与する免疫効果が改善され得るからである。
免疫調節遺伝子の標的配列

Claims (13)

  1. （ａ）免疫細胞
    （ｂ）人工受容体のタンパク質、または、前記人工受容体のタンパク質をコードする核酸、および、
    （ｃ）ＤＧＫＡ遺伝子およびＤＧＫＺ遺伝子から選択される少なくとも１つの免疫調節遺伝子を人工的に操作可能な遺伝子操作用組成物
    を接触させる段階を備え、前記組成物は、
    ＤＧＫＡ遺伝子またはＤＧＫＺ遺伝子のエクソン領域における標的配列をターゲット可能なガイド核酸であって、前記ガイド核酸は、配列番号１９、２０、２１、２３、１０９、１１０、１１１、１１２および１１３（ＴはＵに変更される）から選択される核酸配列の１番目から２０番目の塩基からなるガイドドメイン、第１相補ドメイン、リンカードメイン、第２相補ドメインを含む、ガイド核酸、
    および、
    ガイド核酸とガイド核酸‐エディタータンパク質複合体を形成できるエディタータンパク質であって、前記ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体は前記標的配列への改変を誘導でき、前記標的配列は、配列番号１９、２０、２１、２３、１０９、１１０、１１１、１１２および１１３から選択される核酸配列の１番目から２０番目の塩基であり、
    前記エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質である、エディタータンパク質、
    を含む、
    操作された免疫細胞を産生するためのｅｘ ｖｉｖоまたはｉｎ ｖｉｔｒоで実行される方法。
  2. 前記人工受容体は、Ａ３３、ＡＬＫ、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、アドレナリン受容体β３（ＡＤＲＢ３）、葉酸受容体α、ＡＤ０３４、ＡＫＴ１、ＢＣＭＡ、ベータ‐ヒト絨毛性ゴナドトロピン、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）、ＢＳＴ２、ＢＲＡＰ、ＣＤ５、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５２、ＣＤ７２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８９、ＣＤ９７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１６０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＡ‐１２５、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＣＲ４、Ｃ型レクチン様分子（ＣＬＬ‐１またはＣＬＥＣＬ１）、ｃｌａｕｄｉｎ６（ＣＬＤＮ６）、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＡＧＥ、ＣＤＸ２、ＣＬＰ、ＣＴ‐７、ＣＴ８／ＨＯＭ‐ＴＥＳ‐８５、ｃＴＡＧＥ‐１、ＥＲＢＢ２、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、Ｅ７４様因子２変異（ＥＬＦ２Ｍ）、Ａ型エフリン受容体２（ＥｐｈＡ２）、ＥＭＲ２、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、ＦＣＲＬ５、ファイブリン１、Ｇ２５０、ＧＤ２、糖タンパク質３６（ｇｐ３６）、糖タンパク質１００（ＧＰ１００）、糖質コルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＧｌｏｂｏＨ、Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）、ＧＰＣ３、ｈｓｐ７０‐２、ヒト高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）、Ａ型肝炎ウイルス細胞表面受容体１（ＨＡＶＣＲ１）、ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）、ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）、ＨＡＧＥ、ＨＣＡ５８７／ＭＡＧＥ‐Ｃ２、ｈＣＡＰ‐Ｇ、ＨＣＥ６６１、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＬＡ‐Ｃｗ、ＨＯＭ‐ＨＤ‐２１／Ｇａｌｅｃｔｉｎ９、ＨＯＭ‐ＭＥＥＬ‐４０／ＳＳＸ２、ＨＯＭ‐ＲＣＣ‐３．１．３／ＣＡＸＩＩ、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＢ６、Ｈｕ、ＨＵＢ１、インスリン成長因子（ＩＧＦ１）‐Ｉ、ＩＧＦ‐ＩＩ、ＩＧＦＩ受容体、インターロイキン１３受容体サブユニットアルファ２（ＩＬ‐１３Ｒａ２またはＣＤ２１３Ａ２）、インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ‐１１Ｒａ）、ＩＧＬＬ１、ＫＩＴ（ＣＤ１１７）、ＫＭ‐ＨＮ‐３、ＫＭ‐ＫＮ‐１、ＫＯＣ１、ＫＯＣ２、ＫＯＣ３、ＬＡＧＡ‐１ａ、ＬＡＧＥ‐１、ＬＡＩＲ１、ＬＩＬＲＡ２、ＬＹ７５、ＭＵＣ１、ＭＮ‐ＣＡ ＩＸ、Ｍ‐ＣＳＦ、ＭＡＧＥ‐１、ＭＡＧＥ‐４ａ、メソテリン、ＭＡＧＥ‐Ａ１、ＭＡＤ‐ＣＴ‐１、ＭＡＤ‐ＣＴ‐２、ＭＡＲＴ１、ＭＰＰｌ１、ＭＳＬＮ、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、ＮＹ‐ＥＳＯ‐１、ＮＹ‐ＥＳＯ‐５、Ｎｋｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＹ‐ＢＲ‐１、ＮＹ‐ＢＲ‐６２、ＮＹ‐ＢＲ‐８５、ＮＹ‐ＣＯ‐３７、ＮＹ‐ＣＯ‐３８、ＮＮＰ‐１、ＮＹ‐ＬＵ‐１２、ＮＹ‐ＲＥＮ‐１０、ＮＹ‐ＲＥＮ‐１９／ＬＫＢ／ＳＴＫ１１、ＮＹ‐ＲＥＮ‐２１、ＮＹ‐ＲＥＮ‐２６／ＢＣＲ、ＮＹ‐ＲＥＮ‐３／ＮＹ‐ＣＯ‐３８、ＮＹ‐ＲＥＮ‐３３／ＳＮＣ６、ＮＹ‐ＲＥＮ‐４３、ＮＹ‐ＲＥＮ‐６５、ＮＹ‐ＲＥＮ‐９、ＮＹ‐ＳＡＲ‐３５、ｏ‐アセチル‐ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）、ＯＧＦｒ、ＰＳＭＡ、前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）、ｐ５３、前立腺癌腫瘍抗原１（ＰＣＴＡ‐１）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、セリンプロテアーゼ２１（ｔｅｓｔｉｓｉｎまたはＰＲＳＳ２１）、血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲベータ）、ＰＬＡＣ１、パネキシン３（ＰＡＮＸ３）、ＰＬＵ‐１、ＲＯＲ‐１、ＲＡＧＥ‐１、ＲＵ１、ＲＵ２、Ｒａｂ３８、ＲＢＰＪカッパ、ＲＨＡＭＭ、ステージ特異的胎児抗原‐４（ＳＳＥＡ‐４）、ＳＣＰ１、ＳＳＸ３、ＳＳＸ４、ＳＳＸ５、Ｔｙｒｐ‐１、ＴＡＧ７２、サイログロブリン、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、５Ｔ４、腫瘍関連糖タンパク質（ＴＡＧ７２）、チロシナーゼ、トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）、ＴＥＭ１、ＴＥＭ７Ｒ、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）、Ｔｉｅ２、ＴＲＰ‐２、ＴＯＰ２Ａ、ＴＯＰ２Ｂ、ウロプラキン２（ＵＰＫ２）、ビメンチン、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質１（ＷＴ１）、および、ルイス（Ｙ）抗原から成る群から選択される少なくとも１つの抗原に対する結合特異性を有する、請求項１に記載の操作された免疫細胞を産生するための方法。
  3. 前記人工受容体はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１または２に記載の操作された免疫細胞を産生するための方法。
  4. 前記ガイド核酸、前記人工受容体、および、前記エディタータンパク質から選択される少なくとも１つは、それらの各々をコードする核酸の形態である、請求項１から３のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞を産生するための方法。
  5. 前記核酸配列は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルスまたは単純ヘルペスウイルスから成る群から選択されるウイルスベクターに含まれる、請求項４に記載の操作された免疫細胞を産生するための方法。
  6. 前記組成物は、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体の形態である、請求項１から５のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞を産生するための方法。
  7. 前記接触は、
    前記人工受容体のタンパク質をコードする前記核酸に前記免疫細胞を接触させること、および、
    前記遺伝子操作用組成物に前記免疫細胞を接触させること
    を順次に実行することである、請求項１から６のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞を産生するための方法。
  8. 前記接触は、電気穿孔、リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ナノ粒子、および、タンパク質移行ドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質法から選択される少なくとも１つの方法によって実行される、請求項１から７のいずれか一項に記載の操作された免疫細胞を産生するための方法。
  9. ＤＧＫＡ遺伝子およびＤＧＫＺ遺伝子から選択される少なくとも１つの人工的に設計された免疫調節遺伝子、および／または、前記人工的に設計された免疫調節遺伝子から発現される産物と、
    少なくとも１つの人工受容体タンパク質、および／または、前記人工受容体タンパク質をコードする核酸と
    を備える、操作された免疫細胞であって、
    前記少なくとも１つの人工的に設計された免疫調節遺伝子は、前記免疫調節遺伝子のヌクレオチド配列における人工的改変を含み、
    前記人工的改変は、ＤＧＫＡ遺伝子またはＤＧＫＺ遺伝子の野性型のヌクレオチド配列に基づいて、ヌクレオチド配列領域における少なくとも１つのヌクレオチドの欠失および／または挿入であり、
    前記ヌクレオチド配列領域は、前記免疫調節遺伝子のエクソン領域に位置する１ｂｐ～５０ｂｐであり、
    前記ヌクレオチド配列領域は、配列番号１９、２０、２１、２３、１０９、１１０、１１１、１１２および１１３から選択される、
    操作された免疫細胞。
  10. 前記人工的改変は、前記ヌクレオチド配列領域における少なくとも１つのヌクレオチドの欠失である、請求項９に記載の操作された免疫細胞。
  11. 前記ＤＧＫＡ遺伝子は、配列番号２３に人工的改変を含み、
    前記ＤＧＫＺ遺伝子は、配列番号１１３に人工的改変を含む、
    請求項９に記載の操作された免疫細胞。
  12. ＤＧＫＡ遺伝子またはＤＧＫＺ遺伝子のエクソン領域における標的配列をターゲット可能なガイド核酸であって、前記ガイド核酸は、配列番号１９、２０、２１、２３、１０９、１１０、１１１、１１２および１１３（ＴはＵに変更される）から選択される核酸配列の１番目から２０番目の塩基からなるガイドドメイン、第１相補ドメイン、リンカードメイン、第２相補ドメインを含む、ガイド核酸、
    ガイド核酸とのガイド核酸‐エディタータンパク質複合体を形成できるエディタータンパク質であって、前記ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体は、前記標的配列への改変を誘導できる、エディタータンパク質と、
    人工的に調製された、野性型受容体でない人工受容体と
    を備える、免疫細胞を操作するための組成物であって、
    前記標的配列は、配列番号１９、２０、２１、２３、１０９、１１０、１１１、１１２および１１３から選択される核酸配列の１番目から２０番目の塩基である、
    免疫細胞を操作するための組成物。
  13. 操作された免疫細胞および薬学的に許容される担体を含む、ウイルス感染症、プリオン病原体によって引き起こされる疾患、または癌から選択される免疫疾患を治療するための医薬組成物であって、
    前記操作された免疫細胞は、
    ＤＧＫＡ遺伝子およびＤＧＫＺ遺伝子から選択される少なくとも１つの人工的に設計された免疫調節遺伝子、および／または前記人工的に設計された免疫調節遺伝子から発現される産物、および
    少なくとも１つの人工受容体タンパク質、および／または、前記人工受容体タンパク質をコードする核酸、を含み、
    前記少なくとも１つの人工的に操作された免疫調節遺伝子は、前記免疫調節遺伝子のヌクレオチド配列における人工的改変を含み、
    前記人工的改変は、ＤＧＫＡ遺伝子またはＤＧＫＺ遺伝子の野性型のヌクレオチド配列に基づいて、ヌクレオチド配列領域の少なくとも１つのヌクレオチドの挿入および／または欠失であり、
    前記ヌクレオチド配列領域は、前記免疫調節遺伝子のエクソン領域に位置する１～５０ｂｐであり、
    前記ヌクレオチド配列領域は、配列番号１９、２０、２１、２３、１０９、１１０、１１１、１１２および１１３から選択される、
    医薬組成物。
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