JP7231647B2 - ニューロン生存因子を含む構築物、及びその使用 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

〔技術分野〕
本発明は網膜神経変性障害に関し、より詳細には、神経変性障害を治療及び／又は予防するための医薬組成物に関する。

〔背景技術〕
神経変性障害は、ニューロン変性を特徴とする一連の重篤な消耗性健康状態を包含する。

網膜色素変性症（retinitis pigmentosa；ＲＰ）のような桿体錐体ジストロフィーは、桿体光受容体の進行性死滅とそれに続く連続的な錐体の消失を特徴とする遺伝的に不均一な網膜変性疾患である。ＲＰは遺伝性網膜変性症の中で最も多くみられる形態の１つで、世界中で約１：３，５００の人が罹患している（１）。ＲＰを引き起こす６３以上の異なる遺伝子における変異が現在までに同定されており、これらの変異のかなりの割合は桿体特異的転写物にある。ＲＰ患者は最初、桿体機能不全の結果として薄暗い光の条件下で視力低下を呈し、黄斑錐体によって介される視力は相対的に保存される。しかしながら、疾患が進行することにつれて、初期の桿体の消失に続いて、錐体変性が起こり、対応する錐体によって介される視力に欠損が生じる。環境の多くが人工的に照明され、多くの活動が高度に鋭い色覚に依存している現代社会では、ＲＰ患者における錐体によって介される視力の保持は生活の質の有意な改善につながるのであろう。

桿体特異的変異によって引き起こされる、ＲＰ部分集合における錐体の消失は完全には理解されていないが、いくつかの機構（必ずしも相互に排他的ではない）が提唱されている。いくつかの仮定された機構は、「隣接効果」に関係があるとしている。この「隣接効果」によると、錐体死滅は周囲の桿体の変性による内毒素の放出の結果であるか、又は桿体、網膜色素上皮（retinal pigment epithelium；ＲＰＥ）若しくはミュラーグリアとの接触が無くなった結果である。あるいは、ミュラー細胞の活性化及び毒性分子の放出が寄与している可能性がある。別の仮説は、桿体の代謝負荷が失われるため、脈絡膜血液循環からＲＰＥによって光受容体層に送達される酸素又はレチノイドの量が過剰かつ毒性である、というものである（２）。Ｐｕｎｚｏらは、マウスの網膜変性症モデルにおいて、錐体死滅の原因の一つは、インスリン／哺乳類ラパマイシン標的経路によって駆動される飢餓及び栄養失調であることの証拠を示した（３）。さらに、桿体から分泌される、錐体の生存に必要な生存因子の消失が、錐体の消失に寄与している可能性が示唆されている（４、５）。

最後の仮説を認めるように、ｒｄ１マウスにおいて、移植された健常な網膜組織は、移植組織から離れた領域では錐体の生存を支えることが示されている（６、７）。

国際特許出願ＷＯ２００８／１４８８６０Ａ１には、桿体由来錐体生存因子（rod-derived cone viability factor；ＲｄＣＶＦ）及びＲｄＣＶＦ２と呼ばれる栄養因子のファミリーが記載されており、該栄養素は、ニューロンの生存率を高めることができ、ＲＰなどの神経変性障害を治療及び／又は予防に有用である。

桿体由来錐体生存因子（rod-derived cone viability factor；ＲｄＣＶＦ）は、元々、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするハイスループットな方法により、この救助効果の原因となる分子の候補として同定された（４）。桿体はＲｄＣＶＦを分泌するため、桿体が死ぬにつれて、このパラクリン因子の供給源が失われ、ＲｄＣＶＦレベルが低下する。したがって、ＲｄＣＶＦの発現の消失、及びこれに似た分泌因子の発現の消失は、桿体錐体ジストロフィーで観察される、錐体変性の第二波に寄与している可能性がある。ＲｄＣＶＦは、培養において錐体生存を仲介することが示されており（８）、また、劣性型及び優性型の網膜色素変性症のマウスモデル及びラットモデルにおいて網膜下に注入した場合も、錐体生存を仲介することが示されている（４，９）。ＲｄＣＶＦをコードする遺伝子であるＮｘｎｌ１が破壊されると、マウスの光受容体は、光受容体の機能不全及び錐体の消失が経時的に起こりやすくなる（１０）。

Ｎｘｎｌ１は、選択的スプライシングを介した２つのタンパク質アイソフォームをコードする。錐体生存を取り持つアイソフォームであるＲｄＣＶＦは、より長いその対応物であるＲｄＣＶＦＬの切断されたチオレドキシンフォールドタンパク質であり、ＲｄＣＶＦＬは酵素的チオールオキシドレダクターゼ活性を付与するＣ末端伸長を含む（１１）。ＲｄＣＶＦのすべてのアミノ酸を含むＲｄＣＶＦＬは、Ｎｘｎｌ１遺伝子のエキソン１と２にコードされ、チオレドキシンファミリーのメンバーである（１２）。チオレドキシンは、細胞内の適正な還元環境を維持すること、及びアポトーシス経路に関与すること等、多様な機能を有する。これらの機能は、チオレドキシンフォールド内に保存されたＣＸＸＣ触媒部位によって媒介されるチオールオキシドレダクターゼ反応によって達成される（１３）。

Ｂｙｒｎｅら（３２）は、ＲｄＣＶＦの２つのアイソフォームが相補的機能を有することを示した。ＲｄＣＶＦをコードするアデノ随伴ウイルス（adeno-associated virus；ＡＡＶ）の全身投与は錐体機能を改善し、錐体の消失を遅延させた。ＲｄＣＶＦＬはロドプシンｍＲＮＡを増加させ、酸化ストレスを低下させた。ＲｄＣＶＦＬは、桿体に対する光酸化損傷を防止する（３６）。

国際特許出願ＷＯ２０１６／１８５０３７には、ＲｄＣＶＦ及びＲｄＣＶＦＬの両方をコードするＡＡＶベクター、特に、ＡＡＶ ＣＴ３５が記載されており、網膜色素変性症等の病理を治療するための該ベクターの使用が記載されている。

ＲｄＣＶＦとＲｄＣＶＦＬとの間の相乗効果が実証されている（３４）。一方では、ＲｄＣＶＦは、網膜色素上皮（retinal pigmented epithelium；ＲＰＥ）によって産生、分泌され、非細胞自律的機構によって錐体の細胞表面におけるＲｄＣＶＦ受容体を介して好気的解糖を刺激することによって錐体を保護する（３７）。一方、ＲｄＣＶＦＬは、そのチオールオキシドレダクターゼ機能により、細胞自律的に錐体を酸化的損傷から保護する。

ところで、本発明者らは、このようなＡＡＶベクターの産生が予想外にも、ＡＡＶゲノムのキャプシド形成（encapsidation）の問題を与えることを発見した。この不完全なパッケージングの問題は、完全なゲノムを有するＡＡＶ粒子の産生における欠陥をもたらす。

これは、ヒト治療に使用するためのＧＭＰ準拠のＡＡＶベクターの産生に制限を与える。

したがって、網膜神経変性障害を治療するために、ＲｄＣＶＦ因子及びＲｄＣＶＦＬ因子の発現のための改善された構築物が依然として必要とされている。

〔発明の概要〕
本発明者らは、ＲｄＣＶＦをコードする第１の核酸とＲｄＣＶＦＬをコードする第２の核酸とを含む単一のＡＡＶベクターの産生には、ウイルスキャプシド内のＡＡＶ一本鎖ＤＮＡの不完全なパッケージングの問題があり得ることを見出した。この不完全なキャプシド形成は、不完全なＡＡＶゲノムの産生につながるので、より小さなサイズのＤＮＡとなる。

本発明者らは驚くべきことに、この不完全なキャプシド形成が、ＡＡＶゲノム内の直接反復配列の存在に起因することを発見し、また、第１の発現カセットと第２の発現カセットとの間に共通する同一のヌクレオチドの長さを制限し、最大２００の連続した同一のヌクレオチドとすることにより、ＡＡＶが完全にパッケージングされ得ることを発見した。

したがって、本発明は、ＲｄＣＶＦをコードする第１の核酸を含む第１の発現カセットと、ＲｄＣＶＦＬをコードする第２の核酸を含む第２の発現カセットとを含み、ＡＡＶ粒子の産生が最適化されたＡＡＶベクターを提供することによって、この問題に対する解決策を提供する。

本発明に係るＡＡＶは、最大で２００個の連続した同一のヌクレオチド、好ましくは最大で１９０個、さらにより好ましくは最大で１８０個、１７０個、１６７個、１６５個、１６４個、１６０個、１５０個、１４０個、１３０個、１２０個、１１０個、１００個、９０個、８０個、７０個、６０個、５５個、５４個、５０個、４０個、３０個、２０個、１５個、１０個、９個又は８個の連続した同一のヌクレオチドを示す第１及び第２の発現カセットを含む。

本発明者らは、第１の発現カセットと第２の発現カセットとの間の直接反復配列の問題に対する、いくつかの代替的及び／又は累積的な解決策を開発した。

したがって、一態様において、本発明は、アデノ随伴ベクター（adeno-associated vector；ＡＡＶ）であって、
ＲｄＣＶＦをコードする第１の核酸を含む第１の発現カセットと、
ＲｄＣＶＦＬをコードする第２の核酸を含む第２の発現カセットとを含み、
前記第１及び第２の発現カセットは、２００個未満の連続した同一のヌクレオチドを示す、ＡＡＶに関する。

別の態様において、本発明は、アデノ随伴ベクター（adeno-associated vector；ＡＡＶ）であって、
ＲｄＣＶＦをコードする第１の核酸を含む第１の発現カセットと、
ＲｄＣＶＦＬをコードする第２の核酸を含む第２の発現カセットとを含み、
網膜神経変性障害の治療方法に使用するためであり、
前記第１及び第２の発現カセットは、２００個未満の連続した同一のヌクレオチドを示す、ＡＡＶに関する。

本発明はまた、網膜変性疾患に罹患している患者の治療方法であって、治療有効量のアデノ随伴ベクター（adeno-associated vector；ＡＡＶ）を前記患者に投与することからなる工程を含み、前記アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）は、
ＲｄＣＶＦをコードする第１の核酸を含む第１の発現カセットと、
ＲｄＣＶＦＬをコードする第２の核酸を含む第２の発現カセットとを含み、
前記第１及び第２の発現カセットは、２００個未満の連続した同一のヌクレオチドを示す、方法に関する。

本発明はまた、ＡＡＶ構築物における不活性ヒトＤＮＡ配列の使用に関する。

一態様において、本発明は、配列番号１０に記載の配列を有する核酸を含むＡＡＶであって、配列番号１０に記載の配列を有する前記核酸は、発現カセットに存在しない、ＡＡＶに関する。

〔発明の詳細な説明〕
したがって、一態様において、本発明は、アデノ随伴ベクター（adeno-associated vector；ＡＡＶ）であって、
ＲｄＣＶＦをコードする第１の核酸を含む第１の発現カセットと、
ＲｄＣＶＦＬをコードする第２の核酸を含む第２の発現カセットとを含み、
前記第１及び第２の発現カセットは、２００個未満の連続した同一のヌクレオチドを示す、ＡＡＶに関する。

第１及び第２の発現カセットが２００個未満の連続した同一のヌクレオチドを示すとは、第１の発現カセットと第２の発現カセットとが共通して２００個未満の連続した同一のヌクレオチドを有することを意味する。

典型的には、第１の発現カセットと第２の発現カセットとの間で共通する連続した同一のヌクレオチドは、最大で２００個、好ましくは最大で１９０個、さらにより好ましくは最大で１８０個、１７０個、１６７個、１６５個、１６４個、１６０個、１５０個、１４０個、１３０個、１２０個、１１０個、１００個、９０個、８０個、７０個、６０個、５５個、５４個、５０個、４０個、３０個、２０個、１５個、１０個、９個又は８個である。

別の態様において、本発明は、アデノ随伴ベクター（adeno-associated vector；ＡＡＶ）であって、
ＲｄＣＶＦをコードする第１の核酸を含む第１の発現カセットと、
ＲｄＣＶＦＬをコードする第２の核酸を含む第２の発現カセットとを含み、
網膜神経変性障害の治療方法に使用するためであり、
前記第１及び第２の発現カセットは、２００個未満の連続した同一のヌクレオチドを示す、ＡＡＶに関する。

本発明はまた、網膜変性疾患に罹患している患者の治療方法であって、治療有効量のアデノ随伴ベクター（adeno-associated vector；ＡＡＶ）を前記患者に投与することからなる工程を含み、前記アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）は、
ＲｄＣＶＦをコードする第１の核酸を含む第１の発現カセットと、
ＲｄＣＶＦＬをコードする第２の核酸を含む第２の発現カセットとを含み、
前記第１及び第２の発現カセットは、２００個未満の連続した同一のヌクレオチドを示す、方法に関する。

本明細書において、用語「桿体由来錐体生存因子」（Rod-derived Cone Viability Factor；ＲｄＣＶＦ）は、チオレドキシン様６（ＴＸＮＬ６）遺伝子又はヌクレオレドキシン様１（ＮＸＮＬ１）遺伝子によってコードされるタンパク質を意味する。それは、あらゆる動物種のＲｄＣＶＦタンパク質を包含する。典型的には、本発明に係るＲｄＣＶＦタンパク質は、哺乳類ＲｄＣＶＦタンパク質（マウス、ラット、ネコ、イヌ、非ヒト霊長類、及びヒトを含むがこれに限定されない）であり得る。

特記しない限り、用語「ＲｄＣＶＦ」は、ＮＸＮＬ１遺伝子の短いアイソフォームを指し、用語「ＲｄＣＶＦＬ」又は「ＲｄＣＶＦ－Ｌ」は、ＮＸＮＬ１遺伝子の長いアイソフォームを指す。

典型的にはマウスにおいて、短いアイソフォーム（ＲｄＣＶＦ）はUniprot accession 番号Ｑ９１Ｗ３８で参照される、１０９個のアミノ酸の長さのタンパク質である。マウスの長いアイソフォーム（ＲｄＣＶＦＬ）は、Ｑ８ＶＣ３３で参照される、２１７個のアミノ酸を長さのタンパク質である。

本発明の一実施形態において、短いアイソフォームＲｄＣＶＦは、ヒトの短いアイソフォームＲｄＣＶＦ(ｈＲｄＣＶＦ)であって、以下の配列を有する：

したがって、短いアイソフォームＲｄＣＶＦをコードする第１の核酸は、以下のヒト核酸配列を含み得る：

あるいは、第１の核酸は、配列番号３とは異なるが同じアミノ酸配列をコードする核酸を含み得る。

適した核酸配列としては、以下が挙げられるが、これに限定されない：
ヒトＲｄＣＶＦをコードするｃＤＮＡの多型；
ヒトＲｄＣＶＦをコードするｃＤＮＡの多型の組合せ（稀なハプロタイプ）。稀なハプロタイプｃＤＮＡの例は、配列番号１１として示される；
特定のコドンが同じアミノ酸をコードするコドンに置換された、「最適化された」配列。ＲｄＣＶＦをコードする適したコドン最適化配列としては、配列番号１２に記載の配列が挙げられるが、これに限定されない；
相同配列。例えば、本発明者らは、チンパンジーＲｄＣＶＦの短いアイソフォームをコードするチンパンジーｃＤＮＡ配列がヒトｃＤＮＡと同じアミノ酸配列をコードするので、使用され得ることを見出した。チンパンジーｃＤＮＡは、配列番号４に記載の配列を有する。

本発明の一実施形態において、ＮＸＮＬ１遺伝子の長いアイソフォームは、ヒトの長いアイソフォームＲｄＣＶＦＬ(ｈＲｄＣＶＦＬ)であり、accession 番号Ｑ９６ＣＭ４で参照される以下の配列を有する：

したがって、ＲｄＣＶＦＬをコードする第２の核酸は、以下のヒト核酸配列を含み得る：

あるいは、第２の核酸は、配列番号５とは異なるが同じアミノ酸配列をコードする核酸を含み得る。

適した核酸配列としては、以下が挙げられるが、これに限定されない：
ヒトＲｄＣＶＦをコードするｃＤＮＡの多型又はその組合せ；
特定のコドンが同じアミノ酸をコードするコドンに置換された、「最適化された」配列；ＲｄＣＶＦをコードする適したコドン最適化配列としては、配列番号１２に記載の配列が挙げられるが、これに限定されない；
他の種の相同配列。

ＲｄＣＶＦタンパク質及びＲｄＣＶＦＬタンパク質の配列は、Ｃｈａｌｍｅｌら、２００７（３９）及び国際特許出願ＷＯ２００８／１４８８６０に記載されている。

本明細書において、用語「アデノ随伴ベクター」又は「ＡＡＶ」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有する。

ＡＡＶは、遺伝子送達に適したベクターとして、当技術分野で頻繁に記載されている。

実際、ＡＡＶは非病原性であり、その血清型に応じて広範囲の組織特異性を示す。典型的には、本発明に係るＡＡＶは、網膜細胞を標的とすることができるＡＡＶである。

例としてはＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／９、及びＡＡＶ７ｍ８が挙げられるが、これらに限定されない。

一実施形態において、本発明に係るＡＡＶは、国際特許出願ＷＯ２０１２／１５８７５７に記載される方法に従って得られる。

典型的には、ＮＸＮＬ１遺伝子の短いアイソフォーム及び長いアイソフォームをそれぞれコードする第１及び第２の核酸は、該短いアイソフォーム及び長いアイソフォームの、標的細胞における発現を可能にするプロモーターの制御下にある。

適したプロモーターは、ＣＭＶ／ＣＢＡプロモーターのような、ユビキタスプロモーターであり得る。

適したプロモーターは、網膜における発現、好ましくは網膜色素上皮細胞及び光受容体細胞における発現を可能にするプロモーターであり得る。

一実施形態において、プロモーターは、網膜色素上皮細胞における遺伝子発現を可能にする。

一実施形態において、プロモーターは、錐体光受容体における遺伝子発現を可能にする。非限定的な例の一つは、錐体オプシンプロモーターである。

典型的には、ＮＸＮＬ１遺伝子の短いアイソフォームは、少なくとも網膜色素上皮細胞によって発現され、長いアイソフォームは、少なくとも錐体光受容体細胞によって発現される。

本発明の一実施形態において、短いアイソフォーム及び長いアイソフォームの発現を駆動するために、異なるプロモーターが使用される。

典型的には、ＮＸＮＬ１遺伝子の短いアイソフォームは、ＣＭＶ／ＣＢＡプロモーターの制御下で発現され得、ＮＸＮＬ１遺伝子の長いアイソフォームは、錐体オプシンプロモーターの制御下で発現され得る。

本発明の一実施形態において、２つの発現カセットは逆方向であり、一方の発現カセットは５’から３’であり、他方の発現カセットは３’から５’である。

本発明者らは、この構成が不完全なパッケージングを避けるのにも適していることを見出した。

本発明の一実施形態において、上記のアデノ随伴ベクター（adeno-associated vector；ＡＡＶ）は、配列番号１０のスタッファー配列をさらに含む。

一実施形態において、本発明は、アデノ随伴ベクター（adeno-associated vector；ＡＡＶ）であって、
ユビキタスプロモーター、好ましくはＣＭＶ／ＣＢＡプロモーターの制御下にある、ＲｄＣＶＦをコードするコドン最適化ｃＤＮＡを含む第１の核酸を含む第１の発現カセットと、
錐体オプシンプロモーター（ＯＰＮ１Ｌ／ＭＷ）の制御下にある、ＲｄＣＶＦＬをコードするコドン最適化ｃＤＮＡを含む第２の核酸を含む第２の発現カセットとを含む、ＡＡＶに関する。

一実施形態において、ＲｄＣＶＦをコードするコドン最適化ｃＤＮＡを含む第１の核酸は、配列番号１２に記載の配列を有する。

一実施形態において、ＲｄＣＶＦＬをコードするコドン最適化ｃＤＮＡを含む第２の核酸は、配列番号１３に記載の配列を有する。

一実施形態において、アデノ随伴ベクターは、配列番号６（以下の実施例の構築物３に対応する）に記載の配列を有する。

本発明の文脈において、本明細書中で使用される用語「治療する」又は「治療」は、該用語が適用される障害もしくは健康状態、又はこのような障害若しくは健康状態の１つ以上の症状（例えば、網膜変性疾患）の回復、軽減、進行の抑制、又は予防を意味する。

用語「網膜変性疾患」は、錐体変性に関連する全ての疾患を包含する。網膜変性疾患は、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、バルデー・ビードル症候群、バッセン・コーンツヴァイク症候群、ベスト病、コロイデマ（choroidema）、脳回転状萎縮、レーバー先天性黒内障、レフサム病、シュタルガルト病、又はアッシャー症候群を含むが、これらに限定されない。

本発明の一実施形態において、網膜変性疾患は網膜色素変性症である。

本発明によれば、用語「患者」又は「それを必要とする患者」は、網膜変性疾患に罹患しているか、罹患している可能性が高いヒト又は非ヒト哺乳動物を意図する。

本発明によれば、組成物の「治療有効量」は、所望の生物学的効果（ここでは、ニューロン生存を高めること）を達成するのに十分な量である。有効な投与量は、受容者の年齢、性別、健康状態、及び体重、同時治療の種類（もしあれば）、治療の頻度、及び所望の効果の性質に依存することが理解される。しかし、当業者によって理解され、当業者によって決定可能であるように、好ましい投与量は、過度の実験なしに個々の対象者に合わせることができる。

本発明の発現ベクターは、眼内投与に適し得る。特定の実施形態において、発現ベクターは、網膜下注入によって投与される。

一態様において、本発明はまた、アデノ随伴ベクター（adeno-associated vector；ＡＡＶ）と、医薬的に許容できる担体とを含む医薬組成物であって、前記ＡＡＶは、
ＲｄＣＶＦをコードする第１の核酸を含む第１の発現カセットと、
ＲｄＣＶＦＬをコードする第２の核酸を含む第２の発現カセットとを含み、
前記第１及び第２の発現カセットは、２００個未満の連続した同一のヌクレオチドを示す、医薬組成物に関する。

別の態様において、本発明は、配列番号１０に記載の配列を有する核酸を含むＡＡＶであって、配列番号１０に示される配列を有する前記核酸は、発現カセットに存在しない、ＡＡＶに関する。この配列番号１０の配列は、ＡＡＶにおけるスタッファーＤＮＡの役割を有する。スタッファー配列の役割は、目的の遺伝子の代わりにプロウイルスプラスミドがキャプシド形成することを避けるために、ベクターのサイズを増加させることである。

通常、バクテリオファージラムダＤＮＡに対応するスタッファーがＡＡＶにおいて使用される。しかし、スタッファーとして最も一般的に用いられるバクテリオファージラムダの配列は、オープンリーディングフレームであるｎｉｎ領域を含んでいる。このようなスタッファーは、ヒトとの系統発生的距離のために不活性であると考えられているが、Ｃｈｅｎｇら（３８）は、ｎｉｎ領域が強い転写活性を有し得るため、このようなスタッファーが予想されるほど不活性ではないことを実証している。したがって、このようなスタッファーを有するＡＡＶをヒト患者に投与すると、バクテリオファージラムダＤＮＡの転写のリスクがある。

したがって、新しい不活性スタッファーを開発することが重要であった。本発明者らは、ＡＡＶ構築物のサイズを増加させるために、バクテリオファージラムダスタッファーの代わりに、配列番号１０に記載の配列を有する核酸を、「スタッファー」ＤＮＡとして予想外に使用され得ることを見出した。配列番号１０に記載の配列を有する該核酸は、不活性であるという大きな利点を有する。これは、この配列が非翻訳配列であり、ｍｉＲＮＡ標的ではなく、非テロメア配列であり、ＤＮＡ複製起点を含まず、ヌクレオチド反復を含まないためである。この配列が何らかの機能的活性を持つとしても、ＡＡＶにおいてスタッファーとして用いた場合には転写のリスクはない。

配列番号１０に記載の配列は、図３に記載されるような徹底的なプロセスを通して選択された。これは、セントロメア、遺伝子、偽遺伝子、複製起点、マイクロＲＮＡ標的配列、又は反復の要素を含まないヒトゲノム領域において同定することからなるバイオインフォマティクス的アプローチである。これらの遺伝子座の中から配列番号１０を選択した。

本発明を、以下の実施例及び図面を用いてさらに説明する。

〔図面の簡単な説明〕
図１：本発明に係る好ましい構築物の模式図：
図１Ａは、ＷＯ２０１６／１８５０３７号に記載の比較例（したがって、本発明に係る構築物ではない）である構築物ＣＴ３５を示す。図１Ｂ、図１Ｃ及び図１Ｄは、それぞれ、本発明に係る構築物３（Ｃ０３）、６（Ｃ０６）及び１１（Ｃ１１）を示す。

図２：変性ゲル電気泳動により解析した、ＡＡＶゲノムの一本鎖ＤＮＡのサイズ
異なる構築物のＡＡＶゲノムの一本鎖ＤＮＡのサイズを、変性条件下でゲル電気泳動によって分析した。

ＲｄＣＶＦ及びＲｄＣＶＦＬの両方を発現する構築物３（Ｃ０３）（７^ｖ７．ＡＡＶ２－ＣＭＶ／ＣＢＡ^ｏｒｉｇ－ＲｄＣＶＦ－５’＿１．７．ＯＰＮ１Ｌ／ＭＷ－ＲｄＣＶＦＬ）
ＲｄＣＶＦ及びＲｄＣＶＦＬの両方を発現するＣＴ３５（ＡＡＶ２－ＣＭＶ/ＣＢＡ－ＲｄＣＶＦ－ＣＭＶ/ＣＢＡ－ＲｄＣＶＦＬ)(配列番号１５）
ＲｄＣＶＦのみを発現するＣＴ３７（ＡＡＶ２－ＣＭＶ/ＣＢＡ－ＲｄＣＶＦ＋スタッファー）（配列番号１６）。

図３：不活性「スタッファー」ＤＮＡの選択プロセスの模式図
図４：パッケージングの比較
図４Ａ：ＡＡＶ ＣＴ３５の別の表示。ＲｄＣＶＦ及びＲｄＣＶＦＬの両方を発現するこのＡＡＶでは、第１及び第２の発現カセットは、プロモーター［ＣＭＶ／ＣＢＡデルタ３９０］の直接反復のために、３９０の連続した同一のヌクレオチドを有する。

図４Ｂ：カセット［ＣＭＶ／ＣＢＡデルタ３９０－ＲｄＣＶＦ］の排除、又はカセット［ＣＭＶ／ＣＢＡデルタ３９０－ＲｄＣＶＦＬ］との組換えを生じさせる、２つのコピー［ＣＭＶ／ＣＢＡデルタ３９０］の間の組換えの模式図。

図４Ｃ：豚色素上皮の初代細胞におけるＣＴ３５（ＡＡＶ－ＣＭＶ/ＣＢＡ－ＲｄＣＶＦ ＣＭＶ/ＣＢＡ－ＲｄＣＶＦＬ）の形質導入。ウサギポリクローナル抗ＲｄＣＶＦ抗体を用いた、ＲｄＣＶＦ及びＲｄＣＶＦＬのウェスタンブロット分析（４）。

図４Ｄ：ＡＡＶ Ｃ０６の別の表示及び組換えの模式図。このＡＡＶにおいて、第１及び第２の発現カセットは、１６７の連続した同一のヌクレオチドの直接反復を共通して有する。

図４Ｅ：ＡＡＶ Ｃ０３の別の表示。

図４Ｆ：キャプシド形成したＡＡＶ Ｃ０６、Ｃ０３、ＣＴ３５、及びＣＴ３７（キャプシドタンパク質プラスＤＮＡ）のゲノム完全性解析。

図４Ｇ及び図４Ｈ：Ｃ０３及びＣ０６について、完全にキャプシド形成したＡＡＶを含むキャプシド（ｆｕｌｌ）の割合、不完全にキャプシド形成したＡＡＶを含むキャプシド（中間）の割合、及びＡＡＶを含まないキャプシド（ｅｍｐｔｙ；ＤＮＡなし）の割合を示す表。表４Ｇは、キャプシドタンパク質及びＤＮＡ（ＡＡＶゲノム）の両方について得られた検出結果を示す。表４Ｈは、ＤＮＡのみについて得られた検出結果を示す。

〔実施例〕
実施例１
以下、本発明に係る、適した構築物の非限定的な例を提供する。

構築物３（Ｃ０３）：７^ｖ７．ＡＡＶ２－ＣＭＶ/ＣＢＡ^ｏｒｉｇ－ＲｄＣＶＦ－５’＿１．７．ＯＰＮ１Ｌ／ＭＷ－ＲｄＣＶＦＬ
図１Ｂに示すように、この構築物において、ヒトＲｄＣＶＦのｃＤＮＡ配列を（第１の最適化プロセスｖ１を使用して）コドン最適化し、ユビキタスプロモーターＣＭＶ／ＣＢＡ下に置いた。ヒトＲｄＣＶＦＬのｃＤＮＡも（異なる最適化プロセスｖ２を用いて）コドン最適化し、錐体オプシンプロモーターの制御下に置いた。第１の発現カセットと第２の発現カセットとで共通して有する直接反復は、９ヌクレオチド長である。

ＡＡＶベクターは、配列番号６に記載の配列を有する。

構築物６（Ｃ０６）：
ＡＡＶ２＿ＣＭＶ/ＣＢＡ＿ｏｒｉｇ＿ＲｄＣＶＦ＿ｃｈｉｍｐ＿５ｐ＿１．７＿ＯＰＮ１ＬＭＷ＿ＲｄＣＶＦＬ
図１Ｃ及び図４Ｄに示すように、この構築物において、チンパンジーＲｄＣＶＦのｃＤＮＡ配列を第１の発現されたカセットにおいて使用し、ユビキタスプロモーターＣＭＶ／ＣＢＡ下に置いた。ヒトＲｄＣＶＦＬのｃＤＮＡを錐体オプシンプロモーターの制御下に置いた。第１の発現カセットと第２の発現カセットとで共通して有する直接反復は、１６７ヌクレオチド長である。

ＡＡＶベクターは、配列番号７に記載の配列を有する。

構築物７（Ｃ０７）：
ＡＡＶ２＿ｒｅｖ＿ＣＭＶ／ＣＢＡ＿ｏｒｉｇ＿ＲｄＣＶＦ＿ｃｈｉｍｐ＿５ｐ＿１．７＿ＯＰＮ１ＬＭＷ＿ＲｄＣＶＦＬ
この構築物は、第１の発現カセットが逆方向に配置されていることを除いて、構築物６と同様である。

ＡＡＶベクターは、配列番号８に記載の配列を有する。

構築物８（Ｃ０８）：
ＡＡＶ２＿ＣＭＶ/ＣＢＡ＿ｏｒｉｇ＿ＲｄＣＶＦ＿ｃｈｉｍｐ＿ｒｅｖ＿５ｐ＿１．７＿ＯＰＮ１ＬＭＷ＿ＲｄＣＶＦＬ－ｈＧＨ
この構築物は、第２の発現カセットが逆方向に配置されていることを除いて、構築物６と同様である。

ＡＡＶベクターは、配列番号９に記載の配列を有する。

構築物１１（Ｃ１１）：
ＡＡＶ２＿ＣＭＶ/ＣＢＡ＿ｏｒｉｇ＿ＲｄＣＶＦ＿ｒａｒｅ＿ｈａｐｌｏｔｙｐｅ＿ｈｕｍａｎ＿５ｐ＿１．７＿ＯＰＮ１ＬＭＷ＿ＲｄＣＶＦＬ
図１Ｄに示すように、この構築物において、第１の発現カセットは、ユビキタスプロモーターＣＭＶ／ＣＢＡ下にある、多型の組合せ（稀なハプロタイプ）であるヒトＲｄＣＶＦをコードするｃＤＮＡを含む。第２の発現カセットは、錐体オプシンプロモーターの制御下にあるヒトＲｄＣＶＦＬのｃＤＮＡを含む。第１の発現カセットと第２の発現カセットとで共通して有する直接反復は、５４ヌクレオチド長である。

ＡＡＶベクターは、配列番号１４に記載の配列を有する。

実施例２：同一のヌクレオチドの長い伸長を示すＡＡＶ構築物は、不完全なパッケージングが起きる。

材料及び方法
ウイルスベクターの産生
マウスＲｄＣＶＦ、ＲｄＣＶＦＬ、又はｅＧＦＰをコードするｃＤＮＡを持つＡＡＶベクターをプラスミドコトランスフェクション法（３１）により産生した。組換えＡＡＶを、塩化セシウム又はイオジキサノール勾配超遠心によって精製した。ウイルス溶離液を緩衝液交換し、ＰＢＳ中でＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔｓを用いて濃縮し、標準曲線に対する定量ＰＣＲによって滴定した。

変性ゲル電気泳動
ゲノムＤＮＡを抽出し、変性ゲル電気泳動に供した。核酸のサイズをＤＮＡラダーと比較した。

結果
図２及び図４Ｆは、ＷＯ２０１６／１８５０３７に開示された構築物ＣＴ３７が、したがって本発明に係る構築物ではないことを示す。ＲｄＣＶＦのみを発現するこの比較例は、その産生が、予想されるサイズである約５０００ｂｐのＤＮＡを生じるので、完全なパッケージングが起きる。

図２及び図４Ｆに示されるように、３９０個の連続した同一のヌクレオチドの反復を含むＣＴ３５（図４Ａ）は、その産生が、４８０４ｂｐのＡＡＶゲノムのではなく、異常なＡＡＶゲノムサイズを生じるので、不完全なパッケージングが起きる。

従って、ＲｄＣＶＦをコードする第１の核酸及びＲｄＣＶＦＬをコードする第２の核酸をＡＡＶにおいて発現することは、ウイルスキャプシド内にＡＡＶ一本鎖ＤＮＡの不完全なキャプシド形成を導き得ることが十分に実証されている。

対照的に、ＲｄＣＶＦ及びＲｄＣＶＦＬの両方を発現し、１６７ヌクレオチド長のみの直接反復を含む、本発明に係る構築物Ｃ０６は、予想されるサイズである４９４２ｂｐでバンドを示す。この結果は、構築物Ｃ０６の場合の完全なキャプシド形成を実証する。

同様に、９個の連続した同一のヌクレオチドの反復を含む構築物Ｃ０３は、予想されるサイズである４９２６ｂｐで単一のバンドを示す。

２つの発現カセットの間で共通して有される連続した同一のヌクレオチドの数を少なくすることは、ＲｄＣＶＦをコードする核酸及びＲｄＣＶＦＬをコードする核酸の両方を含むＡＡＶの完全なキャプシド形成の割合を増加させることを可能にすることが示される。

したがって、本発明者らは、第１及び第２の発現カセットに含まれる連続した核酸が２００個以下である場合に、完全なパッケージングが得られることを実証した。

この現象をさらに調査するために、Ｂｕｒｎｈａｍら（３５）に従って分析的超遠心を使用して、異なる構築物を比較した（図４Ｇ及び図４Ｈ）。Ｃ０３及びＣ０６についての結果は、変性ゲルにおいて観察された追加的なバンドが、中間の沈降係数を有する、高い割合のＡＡＶ粒子のバンドと一致し、ｆｕｌｌとｅｍｐｔｙの間の粒子を表し、したがって、不完全にパッケージングされたＡＡＶを含む粒子に対応することを示す。変性ゲル電気泳動で得られた結果によれば、構築物Ｃ０６は１８％の完全な（ｆｕｌｌ）キャプシド形成を示し、構築物Ｃ０３は分析的超遠心法において適した結果をもたらし、高い割合の完全な（ｆｕｌｌ）ＡＡＶ粒子（５８％）を示す（図４Ｈ）。

このことから、２つの発現カセットの間で共通して有される連続した同一のヌクレオチドの数が２００個を超えない場合には、完全なゲノムを有する粒子の割合が高くなることが確認される。

実施例３：ＲｄＣＶＦとＲｄＣＶＦＬとの組合せは相乗効果をもたらす。

以下の構築物を産生し、ＡＡＶ２ベクターに導入した。

プロウイルスプラスミドｐ６１８及びその要素は、ＷＯ２０１２１５８７５７Ａ１として公開された国際特許出願及び文献（３３）に記載されている。

２ｘＲｄＣＶＦ：プラスミドｐ８５７及びＡＡＶ ＣＴ３９
Ｐ８５７／ＣＴ３９は、網膜色素変性症（ＲＰ）患者において十分な錐体保護を得るために、ＲｄＣＶＦの発現レベルをＣＴ３７（ＲｄＣＶＦ－スタッファー）と比較して高めるように設計された。

ＲｄＣＶＦ－ＲｄＣＶＦＬ：プラスミドｐ８５３及びＡＡＶ ＣＴ３５
このベクターは、ＲｄＣＶＦの短いアイソフォーム及び長いアイソフォームを共発現することができる。
しかしながら、その産生において、治療薬としての使用を制限する、異常な不完全なパッケージング事象が起きる。

実施例４：ファージラムダスタッファーを置換するための不活性ＤＮＡの選択
本発明者らは、十分なサイズを有するＡＡＶ構築物を得るために従来使用されているファージラムダスタッファー配列の代わりに、より安全な代替物として使用され得る核酸配列を同定するためのスクリーニングプロセスを開発した。

セントロメア、既知遺伝子、偽遺伝子、反復、ｍｉＲＮＡ標的、及び、複製起点などの望ましくない配列を排除するために、ヒトゲノム全体のスクリーニングを行った。この独創的なスクリーニングプロセスの結果、ヒト第１５染色体からの不活性配列である配列番号１０が選択された。

実施例５：組換え分析
図４Ｃのウサギポリクローナル抗ＲｄＣＶＦ抗体を用いたウェスタンブロット分析は、ＲｄＣＶＦ及びＲｄＣＶＦＬの発現を示す。両タンパク質は構築物ＣＴ３５において検出され、このことは、ＣＴ３５は相同体組換えが起きないことを示している。

参考文献
本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が関係する技術水準を記載している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み込まれる。
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図１：本発明に係る好ましい構築物の模式図： 図１Ａは、ＷＯ２０１６／１８５０３７号に記載の比較例（したがって、本発明に係る構築物ではない）である構築物ＣＴ３５を示す。図１Ｂ、図１Ｃ及び図１Ｄは、それぞれ、本発明に係る構築物３（Ｃ０３）、６（Ｃ０６）及び１１（Ｃ１１）を示す。 図１：本発明に係る好ましい構築物の模式図： 図１Ａは、ＷＯ２０１６／１８５０３７号に記載の比較例（したがって、本発明に係る構築物ではない）である構築物ＣＴ３５を示す。図１Ｂ、図１Ｃ及び図１Ｄは、それぞれ、本発明に係る構築物３（Ｃ０３）、６（Ｃ０６）及び１１（Ｃ１１）を示す。 図１：本発明に係る好ましい構築物の模式図： 図１Ａは、ＷＯ２０１６／１８５０３７号に記載の比較例（したがって、本発明に係る構築物ではない）である構築物ＣＴ３５を示す。図１Ｂ、図１Ｃ及び図１Ｄは、それぞれ、本発明に係る構築物３（Ｃ０３）、６（Ｃ０６）及び１１（Ｃ１１）を示す。 図１：本発明に係る好ましい構築物の模式図： 図１Ａは、ＷＯ２０１６／１８５０３７号に記載の比較例（したがって、本発明に係る構築物ではない）である構築物ＣＴ３５を示す。図１Ｂ、図１Ｃ及び図１Ｄは、それぞれ、本発明に係る構築物３（Ｃ０３）、６（Ｃ０６）及び１１（Ｃ１１）を示す。 図２：変性ゲル電気泳動により解析した、ＡＡＶゲノムの一本鎖ＤＮＡのサイズ 異なる構築物のＡＡＶゲノムの一本鎖ＤＮＡのサイズを、変性条件下でゲル電気泳動によって分析した。 ＲｄＣＶＦ及びＲｄＣＶＦＬの両方を発現する構築物３（Ｃ０３）（７^ｖ７．ＡＡＶ２－ＣＭＶ／ＣＢＡ^ｏｒｉｇ－ＲｄＣＶＦ－５’＿１．７．ＯＰＮ１Ｌ／ＭＷ－ＲｄＣＶＦＬ） ＲｄＣＶＦ及びＲｄＣＶＦＬの両方を発現するＣＴ３５（ＡＡＶ２－ＣＭＶ/ＣＢＡ－ＲｄＣＶＦ－ＣＭＶ/ＣＢＡ－ＲｄＣＶＦＬ)(配列番号１５） ＲｄＣＶＦのみを発現するＣＴ３７（ＡＡＶ２－ＣＭＶ/ＣＢＡ－ＲｄＣＶＦ＋スタッファー）（配列番号１６）。 図３：不活性「スタッファー」ＤＮＡの選択プロセスの模式図 図４：パッケージングの比較 図４Ａ：ＡＡＶ ＣＴ３５の別の表示。ＲｄＣＶＦ及びＲｄＣＶＦＬの両方を発現するこのＡＡＶでは、第１及び第２の発現カセットは、プロモーター［ＣＭＶ／ＣＢＡデルタ３９０］の直接反復のために、３９０の連続した同一のヌクレオチドを有する。 図４：パッケージングの比較 図４Ｂ：カセット［ＣＭＶ／ＣＢＡデルタ３９０－ＲｄＣＶＦ］の排除、又はカセット［ＣＭＶ／ＣＢＡデルタ３９０－ＲｄＣＶＦＬ］との組換えを生じさせる、２つのコピー［ＣＭＶ／ＣＢＡデルタ３９０］の間の組換えの模式図。 図４：パッケージングの比較 図４Ｃ：豚色素上皮の初代細胞におけるＣＴ３５（ＡＡＶ－ＣＭＶ/ＣＢＡ－ＲｄＣＶＦ ＣＭＶ/ＣＢＡ－ＲｄＣＶＦＬ）の形質導入。ウサギポリクローナル抗ＲｄＣＶＦ抗体を用いた、ＲｄＣＶＦ及びＲｄＣＶＦＬのウェスタンブロット分析（４）。 図４：パッケージングの比較 図４Ｄ：ＡＡＶ Ｃ０６の別の表示及び組換えの模式図。このＡＡＶにおいて、第１及び第２の発現カセットは、１６７の連続した同一のヌクレオチドの直接反復を共通して有する。 図４：パッケージングの比較 図４Ｅ：ＡＡＶ Ｃ０３の別の表示。 図４：パッケージングの比較 図４Ｆ：キャプシド形成したＡＡＶ Ｃ０６、Ｃ０３、ＣＴ３５、及びＣＴ３７（キャプシドタンパク質プラスＤＮＡ）のゲノム完全性解析。 図４：パッケージングの比較 図４Ｇ及び図４Ｈ：Ｃ０３及びＣ０６について、完全にキャプシド形成したＡＡＶを含むキャプシド（ｆｕｌｌ）の割合、不完全にキャプシド形成したＡＡＶを含むキャプシド（中間）の割合、及びＡＡＶを含まないキャプシド（ｅｍｐｔｙ；ＤＮＡなし）の割合を示す表。表４Ｇは、キャプシドタンパク質及びＤＮＡ（ＡＡＶゲノム）の両方について得られた検出結果を示す。表４Ｈは、ＤＮＡのみについて得られた検出結果を示す。 図４：パッケージングの比較 図４Ｇ及び図４Ｈ：Ｃ０３及びＣ０６について、完全にキャプシド形成したＡＡＶを含むキャプシド（ｆｕｌｌ）の割合、不完全にキャプシド形成したＡＡＶを含むキャプシド（中間）の割合、及びＡＡＶを含まないキャプシド（ｅｍｐｔｙ；ＤＮＡなし）の割合を示す表。表４Ｇは、キャプシドタンパク質及びＤＮＡ（ＡＡＶゲノム）の両方について得られた検出結果を示す。表４Ｈは、ＤＮＡのみについて得られた検出結果を示す。

Claims (15)

1. アデノ随伴ベクター（adeno-associated vector；ＡＡＶ）であって、
   ＲｄＣＶＦをコードする第１の核酸を含む第１の発現カセットと、
   ＲｄＣＶＦＬをコードする第２の核酸を含む第２の発現カセットとを含み、
   前記第１及び第２の発現カセットは、最大で７０個の連続した同一のヌクレオチドを示す、ＡＡＶ。
2. 前記第１及び第２の発現カセットは、最大で５４個の連続した同一のヌクレオチドを示す、請求項１に記載のＡＡＶ。
3. 前記第１及び第２の発現カセットは、最大で９個の連続した同一のヌクレオチドを示す、請求項１に記載のＡＡＶ。
4. 前記ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ２／８である、請求項１～３のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
5. ＲｄＣＶＦをコードする前記第１の核酸は、ユビキタスプロモーターの制御下にある、請求項１～４のいずれか一項に記載のＡＡＶ。
6. ＲｄＣＶＦをコードする前記第１の核酸は、ＣＭＶ／ＣＢＡプロモーターの制御下にある、請求項５に記載のＡＡＶ。
7. ＲｄＣＶＦＬをコードする前記第２の核酸は、錐体オプシンプロモーターの制御下にある、請求項１～６の何れか一項に記載のＡＡＶ。
8. 前記ＡＡＶは、配列番号６、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１４からなる群のうちの一つの核酸配列を有する、請求項１～７の何れか一項に記載のＡＡＶ。
9. 前記ＡＡＶは、配列番号６に記載の核酸配列を有する、請求項８に記載のＡＡＶ。
10. 前記第１の核酸は、配列番号１２に記載のＲｄＣＶＦをコードするコドン最適化ｃＤＮＡを含み、
    前記第２の核酸は、配列番号１３に記載のＲｄＣＶＦＬをコードするコドン最適化ｃＤＮＡを含む、請求項１に記載のＡＡＶ。
11. 請求項１～１０のいずれか一項に記載のＡＡＶを含む、医薬組成物。
12. 請求項１～１０の何れか一項に記載のＡＡＶを含む、網膜神経変性障害の治療のための医薬組成物。
13. 前記網膜神経変性障害は、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、バルデー・ビードル症候群、バッセン・コーンツヴァイク症候群、ベスト病、コロイデマ（choroidema）、脳回転状萎縮、レーバー先天性黒内障、レフサム病、シュタルガルト病、又はアッシャー症候群からなる群から選択される、請求項１２に記載の網膜神経変性障害の治療のための医薬組成物。
14. 前記網膜神経変性障害は、前記網膜色素変性症である、請求項１３に記載の網膜神経変性障害の治療のための医薬組成物。
15. 前記ＡＡＶは、網膜下注入によって投与される、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の網膜神経変性障害の治療のための医薬組成物。
    

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