JP7208169B2 - 新規合成ポリマーおよび架橋ヒドロゲルシステム - Google Patents

Description

本出願は全体として、細胞、治療薬などのカプセル化または送達などの生物医学的用途に用いられるヒドロゲルシステムへの組み込みに有用な新規合成ポリマーの設計および調製に関する。

合成ポリマーは化学的に定義された物質であり、拡張することが可能で、ヒドロゲルの形成に使用されるケースが増えている。このようなヒドロゲルの形成には、しばしば「クリック反応」などの効率的で生体適合性がある架橋反応が利用されている。合成ポリマーヒドロゲルは、天然の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に類似した多くの特徴を示しているため、ＥＣＭ模倣物としての使用が検討されている。合成ポリマーヒドロゲルは、組織構築物への構造的完全性の付与や薬物送達の制御といった機能を有するだけでなく、治療用細胞の移植における免疫隔離バリアとしても機能しうる。

ヒドロゲルの形成に使用されるポリマーは、水溶性と親水性を有する必要があり、理想的には、架橋反応および後官能基化反応に必要な反応性基の導入が容易であることが求められる。互いに反応可能な官能基がそれぞれ導入された異なる２種類のポリマーの架橋反応は、グルタルアルデヒドなどの、一般的に細胞毒性を有する低分子カップリング試薬または架橋試薬を使用せずに、共有結合で架橋された細胞適合性ポリマーヒドロゲルを形成することができる有望な方法として認識されている。

一般的には、これらの反応性ポリマーを、治療用細胞またはモデル細胞を含むアルギン酸ナトリウムの水溶液と組み合わせて、アルギン酸カルシウムを含むゲル化浴に滴下することにより、互いに反応可能なポリマー性ゲル形成剤の一方または両方を含むアルギン酸カルシウムビーズを形成する。アルギン酸カルシウムビーズ内に該反応性ポリマーの一方のみが含まれる場合は、ビーズ形成後、架橋剤とも呼ばれる第２のゲル形成剤を、内部拡散によりビーズに導入する必要がある。

ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）は、このような架橋ヒドロゲルの調製に広く使用されているが、ＰＥＧの官能基化はＰＥＧ鎖末端に制限されているため、ＰＥＧの官能基化によって材料の物理的特性および化学的特性を微調整できる範囲は限られている。汎用性を高めるために、側鎖の官能基化が可能な親水性ポリマーが検討されてきた。

ポリ（メチルビニルエーテル－ａｌｔ－無水マレイン酸）（ＰＭＭＡｎ）は、側鎖の官能基化が容易に行える市販のポリマーであり、様々な生物医学的用途で使用されている。加水分解された形態であるポリ（メチルビニルエーテル－ａｌｔ－マレイン酸）（ＰＭＭ）は、生理学的条件下では親水性ポリアニオンとなる。これらのポリマーの無水カルボン酸基、カルボン酸基はいずれも、用途に特化した官能基化、ポリカチオンとの静電的集合化、および多価イオンとの錯体形成の場を提供する。ＰＭＭＡｎおよびＰＭＭは、細胞含有カプセルのコーティングに従来から使用されており、フランおよびマレイミドで官能基化されたＰＭＭは、ディールス・アルダーカップリング反応による架橋ヒドロゲルの調製に使用されてきた。

したがって、インビボで有用な架橋ヒドロゲルの調製に適した特性を有する新規合成ポリマーを開発することができれば望ましい。

今般、活性化アルケンで官能基化された親水性ポリアニオン骨格が、生体適合性の架橋ヒドロゲルの形成に有用であることが明らかとなった。

したがって、一態様において、活性化アルケンまたは活性化エポキシで官能基化された親水性骨格を含む、第１の側鎖官能基化合成ポリアニオン性骨格ポリマーが提供される。

別の一態様において、活性化アルケン基または活性化エポキシ基で官能基化された第１の側鎖官能基化骨格ポリマーが、遊離または保護されたチオール含有化合物と架橋を形成した構造を有する架橋ヒドロゲルが提供される。

本発明の別の一態様において、活性化アルケン基または活性化エポキシ基で官能基化された第１の側鎖官能基化骨格ポリマーの水溶液と、チオール含有化合物の水溶液とを、架橋反応の進行に適した条件下で組み合わせることを含み、前記チオール含有化合物が、２以上のチオール基を含む極性の水溶性化合物、および保護されたチオール基で官能基化された第２の側鎖官能基化骨格ポリマーから選択される、架橋ヒドロゲルの調製方法が提供される。

さらなる一実施形態において、架橋ヒドロゲルが、二価カチオン結合および熱ゲル化から選択される生体適合性手段によりゲル化可能な水溶性ポリマーマトリックス内に分散された構造を有するヒドロゲルシステムが提供される。この架橋ヒドロゲルは、活性化アルケン基または活性化エポキシ基で官能基化された第１の側鎖官能基化骨格ポリマーが、遊離または保護されたチオール含有化合物と架橋を形成した構造を有しており、該チオール含有化合物は、２以上のチオール基を含む極性の水溶性化合物、および保護されたチオール基で官能基化された第２の側鎖官能基化骨格ポリマーから選択される。

本出願の上記の態様および他の態様は、「発明を実施するための形態」の記載により、また以下の図を参照することにより明らかになるであろう。

図１は、中間生成物であるＮ－ＢＯＣ ＣＶＳ（１）を経てＣＶＳ ＴＦＡ（２）を生成する、３段階合成を示した図である。

図２は、ＣＶＳ ＴＦＡによるＰＭＭの官能基化、および得られたＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘポリマーとＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨとの架橋を示した図である。

図３は、水平傾斜試験（ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ ｔｉｌｔ ｔｅｓｔ）で測定した５％ｗ／ｖのＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ／ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨシステムのゲル化時間を、ＣＶＳ含有量およびｐＨの関数として示した図である。

図４は、５％ｗ／ｖ ＰＭＭ－ＣＶＳ_３０／ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨシステムをｐＨ７．１でゲル化させた際の残存ビニルシグナル（ＮＭＲの積分値）のプロファイルである。残存ビニルシグナルが約２０％に達した時点で反応は頭打ちになるが、これは、ポリマー結合反応物の固定化によるものである。

図５は、ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ／ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨ架橋ヒドロゲルの平衡膨潤率を示した図である。水平破線は、膨潤率が１であることを示す。

図６は、作製したそのままの状態のゲル（Ａ）と膨潤ゲル（Ｂ）のヤング率を、ＰＭＭ－ＣＶＳの官能基化率および導入率の関数として示した図である。いずれのゲルも１：１ ビニルスルホン／チオールで作製された。

図７は、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＤ７．７およびｐＤ８．７）における遠位プロトンシグナル（δ６．４０）の経時的な消失を示した図である。ビニルスルホン部分の水和は、チオール－エン架橋反応よりも桁違いに遅く起こる。

図８は、ＰＭＭ－ＣＶＳ_３０／ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨゲルの残存官能基単位の段階的な後官能基化を示した図である。中抜き丸印は、システアミンキャッピング剤の注入時点を示す。

図９は、チオピリジルジスルフィド（１）とシステアミン（２）からのＳ－（２－アミノエチルチオ）－２－チオピリジン（３）の合成を示した図である。

図１０は、ＰＭＭＡｎ（Ａ）の官能基化によるＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ（Ｃ）およびＰＭＭ－ＳＰｙ_ｘ（Ｂ）の形成、およびその後のＴＣＥＰ添加による架橋ヒドロゲルの形成を示した図である。

図１１は、ＴＣＥＰ添加前（赤）およびＴＣＥＰ添加８分後（青）のＰＭＭ－ＳＰｙ_２０の^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。内部標準であるギ酸のピーク（δ８．３、赤、δ８．５、青）が確認される。

図１２は、種々の官能基化率および架橋剤濃度で作製した１．０％ｗ／ｖ ＭＶＧアルギン酸塩ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ／１０００Ｄａ ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨビーズの膨潤率を示した図である。

図１３は、ＰＭＭ－ＣＶＳ_２０－ｒ／ＰＭＭ－ＳＰｙ_２０／アルギン酸塩ビーズの１時間および２４時間の膨潤率を時間の関数として示した図である。ＴＣＥＰゲル化浴中に静置したビーズの実験では、ゲル化浴中でビーズが形成された時点から時間の計測を開始した。ＴＣＥＰ中に１５分間静置したビーズの実験では、洗浄が完了した時点から時間の計測を開始した。

図１４は、種々の官能基化率およびポリマー濃度で作製したＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ／ＰＭＭ－ＳＰｙ_ｘビーズの膨潤率を示した図である。

図１５は、Ａ）クエン酸塩添加前、Ｂ）クエン酸塩添加後１分、Ｃ）クエン酸塩添加後２分、Ｄ）クエン酸塩添加後２０分、Ｅ）クエン酸塩添加後４０分、およびＦ）クエン酸塩添加後６０分の時点での１％ＰＭＭ－ＣＶＳ_２０－ｒ／１％ＰＭＭＳＰｙ_２０／アルギン酸塩ビーズの共焦点顕微鏡画像である。

図１６は、Ａ）光退色後１分、Ｂ）光退色後６０分の時点でのＰＭＭ－ＣＶＳ_２０－ｒ／ＰＭＭ－ＳＰｙ_２０ビーズの共焦点顕微鏡画像である。いずれの画像も光退色した領域を白い矢印で示している。

図１７は、８０００Ｄａ ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨとの架橋濃度が異なる１％ｗ／ｖ ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘビーズの膨潤率を示した図である。

図１８は、１０００Ｄａ ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨとの架橋濃度が異なる２％ｗ／ｖ ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘビーズの膨潤率を示した図である。

図１９は、ＴＣＥＰ濃度および接触時間を変化させて測定したビーズの膨潤率を示している。

図２０は、クエン酸塩で処理した、Ａ）ＰＭＭ－ＣＶＳ_１０／ＳＰｙ_１０、Ｂ）ＰＭＭ－ＣＶＳ_２０／ＳＰｙ_２０、およびＣ）ＰＭＭ－ＣＶＳ_３０／ＳＰｙ_３０で構成されるマトリックスビーズ内へのデキストランｆの内部拡散を示した図である。

図２１は、クエン酸塩で処理した１％ｗ／ｖ ＰＭＭ－ＣＶＳ_２０／ＳＰｙ_２０ビーズ内へのデキストラン－ｆ（１０、７０、２５０および５００ｋＤａ）の拡散速度を示した図である。

本発明の一態様において、側鎖の官能基化により活性化アルケン基または活性化エポキシ基が導入された親水性骨格を含む、生体適合性を有する第１の側鎖官能基化ポリアニオン性骨格合成ポリマーが提供される。

前記親水性骨格は、分子量が約２０００～２，０００，０００Ｄａ、例えば５０００～１，０００，０００Ｄａまたは２０，０００～５００，０００Ｄａの生体適合性ポリマーであり得る。このポリマーは、マイケルドナーとの架橋反応に適した多官能性マイケルアクセプターである。好適なポリマーの例としては、ポリアクリル酸もしくはポリメタクリル酸のホモポリマー、またはアクリル酸もしくはメタクリル酸と、アニオン性、非荷電性もしくはカチオン性のモノマー、例えば、スチレンスルホン酸（これに限定されない）とのコポリマー；アクリルアミドおよびＮ、Ｎ－ジメチルアクリルアミドなどのアクリルアミドおよびメタクリルアミド、またはＰＥＧ側鎖の重合度が１～２０以上のＰＥＧアクリレートおよびＰＥＧメタクリレート、ならびにＮ、Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレートまたは無水アクリル酸が挙げられるが、これらに限定されない。他の例としては、アルキル基がエチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－、ｓｅｃ－またはｔ－ブチル基およびより高級なアルキル基（例えばＣ_５－Ｃ_１２）からなるアルキルビニルエーテルと、例えばマレイン酸、イタコン酸もしくはシトラコン酸などのジカルボン酸の無水物との共重合によって形成されるポリマー；エチレンオキシドオリゴマーのビニルエーテルと無水物（例えばマレイン酸無水物もしくはイタコン酸無水物）との共重合によって形成されるポリマー；脱水によりポリマー骨格に沿って環状無水物基を形成したポリアクリル酸をベースとするポリ無水物；無水酢酸などのカルボン酸無水物のポリマー、ならびにスチレンなどの芳香族モノマーと無水マレイン酸または無水イタコン酸もしくは無水シトラコン酸などの他のビニル官能性無水物とのコポリマー、例えばスチレンとビニル官能性無水物との交互コポリマーが挙げられる。その他の骨格ポリマーの例としては、グリシジルメタクリレートなどのエポキシ基を含み、任意選択で、アクリルアミドおよびメタクリルアミド、Ｎ－アルキル置換アクリルアミドおよびＮ－アルキル置換メタクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリルアミド、ヒドロキシエチルメタクリルアミド、ＰＥＧメタクリレート、ならびにアクリル酸、メタクリル酸、ビニルベンゼンスルホン酸およびそれらのそれぞれのアルカリ金属塩から選択される中性モノマーまたはアニオン性モノマーを含むポリマーが挙げられる。

前記骨格ポリマーとして、例えば、ポリ（メチルビニルエーテル－ａｌｔ－マレイン酸）などの、アルキルビニルエーテルと、マレイン酸、イタコン酸またはシトラコン酸の無水物などの酸無水物とのコポリマーは、無水物側鎖の官能基化を容易に行うことができ、官能基化後に残存する無水物基は加水分解により生体適合性になるので、好ましい。

前記骨格ポリマーは、架橋性化合物によって側鎖が官能基化されており、該架橋性化合物は、骨格ポリマーとの反応性を有するとともに、活性化アルケン官能基または活性化エポキシ官能基を含む。活性化アルケン官能基としては、エステルなどの電子吸引基で置換されたビニルスルホン基、アクリレート基、メタクリレート基、マレイミド基またはアルキニル基が挙げられるが、これらに限定されない。反応性エポキシ基は、エピクロロヒドリンとアミノ官能性ポリマーとの反応を介してポリマー骨格中に導入してもよく、またグリシジルメタクリレートなどのエポキシ官能性ビニルモノマーと併せて、アクリルアミドおよびメタクリルアミド、Ｎ－アルキル置換アクリルアミドおよびＮ－アルキル置換メタクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリルアミド、ヒドロキシエチルメタクリルアミド、ＰＥＧメタクリレート、ならびにアクリル酸、メタクリル酸、ビニルベンゼンスルホン酸およびそれらのそれぞれのアルカリ金属塩から選択される中性モノマーまたはアニオン性モノマーの任意選択的な使用によりポリマー骨格中に導入してもよい。

活性化アルケン官能基に加えて、前記架橋性化合物には、前記骨格ポリマーとの反応性を有する基、例えばアミン基も含まれている。一実施形態において、２つの活性化アルケン官能基を含む化合物（例えば、ジビニルスルホン）と、チオール基およびアミン基の両方を含む部分構造とを組み合わせてもよい。チオール基およびアミン基の両方を含む部分構造としては、例えば、アミン末端とチオール末端との間に直鎖状または分岐鎖状のＣ_１－Ｃ_６鎖を有するアルファ、オメガチオールアミンが挙げられ、これらはヒドロキシル基、エーテル基、またはカルボン酸基などの他の官能基を含んでもよく、アミノ酸（システインなど）、そのジペプチドもしくはトリペプチド、または糖であってもよい。システアミンは、ジビニルスルホンなどの２つの活性化アルケン官能基を含む化合物と組み合わせてもよい化合物の一例であり、システアミンを、この２つの活性化アルケンのうち１つのみが反応する条件下で当該化合物を組み合わせることにより、システアミンビニルスルホンなどの連結化合物が形成される。別の一実施形態において、システインをジビニルスルホンと組み合わせてもよく、上記と同様の条件下、すなわち、ジビニルスルホンの活性化アルケンのうちの１つのみが反応する条件下でジビニルスルホンと組み合わせることにより、システインビニルスルホンが形成される。

第１の側鎖官能基化骨格ポリマーの合成は、前記架橋性化合物の遊離アミノ基が骨格ポリマー上のアニオン基（例えば、無水物基、エポキシ基またはカルボン酸基）と反応するように、前記架橋性化合物を骨格ポリマー中の反応性基（例えば、無水物、カルボン酸またはエポキシ）の５～４５モル％、好ましくは反応性アニオン基の１０～３０モル％の量で導入することにより達成される。

第１の側鎖官能基化骨格ポリマーと、チオール含有架橋性化合物、例えば、遊離または保護されたジチオールおよびポリチオールとの架橋反応により、架橋ヒドロゲルが得られる。

一実施形態において、前記架橋ヒドロゲルは、約０．５～１５重量％の第１の側鎖官能基化骨格ポリマー、好ましくは約２．５～７．５重量％の第１の側鎖官能基化骨格ポリマーを含む水溶液と、ジチオール架橋剤またはポリチオール架橋剤の水溶液とを反応させることにより形成される。好適な架橋剤の例としては、２以上のチオール基を有する極性の水溶性化合物、例えば、約２００～１，０００，０００Ｄａの範囲の分子量、好ましくは約１０００～２０，０００Ｄａの間の分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－ジチオールなどが挙げられる。架橋反応としては、電子密度の高い求核剤（チオール）と第１の側鎖官能基化骨格ポリマーの電子密度の低いアルケン（ビニルスルホンなど）とをモル比１：４～４：１、好ましくは１：２～２：１の範囲で反応させるマイケル付加反応が挙げられる。この付加反応は、生理学的条件下で速やかに進行し、触媒が不要で、細胞毒性を有する副産物も生成しない。

別の一実施形態において、前記架橋ヒドロゲルは、活性化アルケン官能基を含む側鎖官能基化骨格ポリマー（すなわち、第１の側鎖官能基化骨格ポリマー）と第２の側鎖官能基化骨格ポリマーとを反応させることにより形成される。第２の側鎖官能基化骨格ポリマーは、架橋性化合物によって官能基化されており、該架橋性化合物は、第１の骨格ポリマーに導入されている架橋性基（例えばビニルスルホン）との反応性を有するとともに、保護されたチオールを含む。第２の側鎖官能基化骨格ポリマーの骨格ポリマーは上述したようなものであってもよく、第１の側鎖官能基化骨格ポリマーの骨格ポリマーと同じであっても、または異なっていてもよい。好ましい骨格ポリマーは、アルキルビニルエーテルと、マレイン酸、イタコン酸またはシトラコン酸の無水物などの酸無水物とのコポリマー、例えばポリ（メチルビニルエーテル－ａｌｔ－マレイン酸）である。

第２の側鎖官能基化骨格ポリマーを調製するための架橋性化合物には、第１の側鎖官能基化骨格ポリマーの場合と同様に、骨格ポリマーとの反応性を有する基、例えばアミン基が含まれている。この架橋性化合物には、保護されたチオール基も含まれている。保護されたチオール基は特に制限されず、容易に脱保護されてチオールを生じ得る基であればよく、このチオールは、第１の側鎖官能基化骨格ポリマーの反応性アルケンと反応し、第１と第２の官能基化骨格ポリマー間に共有結合を形成する。前記架橋性化合物に含まれる保護されたチオール基としては、チオピリジン、ジチオカーボネート、ジチオカルバメートおよびチオエステルが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい架橋性化合物は、Ｓ－（２－アミノエチルチオ）－２－チオピリジンである。

第２の側鎖官能基化骨格ポリマーの合成は、第１の側鎖官能基化骨格ポリマーと同様、前記架橋性化合物の遊離アミノ基が骨格ポリマー上の反応性基（例えば、無水物基、エポキシ基またはカルボン酸基）と反応するように、前記架橋性化合物を骨格ポリマー中の反応性基の５～４５モル％、好ましくは１０～３０モル％の量で導入することにより達成される。

第１と第２の側鎖官能基化骨格ポリマーを用いた架橋ヒドロゲルの形成は、第２の側鎖官能基化骨格ポリマー上のチオール官能基を脱保護し露出させることができる還元剤または脱保護剤の存在下で行われ、前記チオール基が第１の側鎖官能基化骨格ポリマー上の反応性アルケン官能基と反応することにより所望の架橋生成物が形成される。脱保護剤または還元剤としては、保護されたチオール官能基の脱保護または還元に適した生体適合性の脱保護剤または還元剤を使用することができ、例として、分子量が約２５，０００以下の脱保護剤または還元剤が挙げられる。一実施形態において、分子量が約３０００未満、好ましくは１０００未満の低分子脱保護剤が使用される。この反応に使用できる脱保護剤としては、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン、トリス（３－ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰＰ）などのホスフィンおよびジチオトレイトールが挙げられるが、これらに限定されない。保護されたチオール基がジチオカーボネート、ジチオカルバメートまたはチオエステルの形で存在する場合、使用される脱保護剤は、システアミン、システインまたはアミノ糖などのアミンである。

前記架橋ヒドロゲルをヒドロゲルマトリックスに組み込むことにより、生物医学的用途に用いられる生体適合性ヒドロゲルシステムを提供することができる。本明細書において、ヒドロゲルマトリックスとは、確立された技術に従って二価カチオン結合および熱ゲル化などの生体適合性手段によりゲル化可能な水溶性ポリマーマトリックスを指す。このヒドロゲルシステムでの使用に適したヒドロゲルとしては、Ｐｒｏｋｏｐ ｅｔ ａｌ．（Ａｄｖ Ｐｏｌｙｍ Ｓｃｉ １９９８，１３６，１－５１ ａｎｄ ５３－７３）に記載されている、アルギン酸カルシウム、アルギン酸ストロンチウム、アルギン酸バリウム、アガロース、およびアルギン酸の代わりに、またはアルギン酸と一緒に使用できる硫酸セルロースなどの高粘度ゲル形成ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。なお、当該文献の内容は参照により本明細書に組み込まれる。この目的に適したイオン性ゲル化剤としては、塩化カルシウムまたは塩化バリウムが挙げられる。

前記ヒドロゲルシステムは、選択したヒドロゲルマトリックスの水溶液と、第１の側鎖官能基化骨格ポリマーの溶液とを、（ゲル化してビーズまたはカプセルを形成する）該ヒドロゲルマトリックスを後にゲル化することが可能な条件下、例えば二価カチオンの存在下（例えば、約２０～３００ｍＭの二価カチオンの存在下、任意選択で約２０～１５０ｍＭの塩化ナトリウムが存在してもよい）、または熱ゲル化条件下で組み合わせることにより調製することができる。次いで、調製したゲルと、ジチオール架橋剤またはポリチオール架橋剤の溶液とを、該架橋剤が内部拡散して第１の側鎖官能基化骨格ポリマーとの架橋反応が可能な条件下で一定時間組み合わせる。前記ヒドロゲルシステムの各成分量は、所望の生成物を得るために変更してもよい。通常、ヒドロゲルマトリックス溶液は、約１～５重量％のヒドロゲルポリマー、約１～５重量％の第１の側鎖官能基化骨格ポリマー、および約１～５重量％のジ－またはポリジオール架橋剤を含む。

前記ヒドロゲルシステムは、選択したヒドロゲルマトリックスの水溶液と、第１の側鎖官能基化骨格ポリマーおよび第２の側鎖官能基化骨格ポリマーを含む溶液とを、該ヒドロゲルマトリックスを後にゲル化することが可能な条件下で組み合わせることにより調製することもできる。第１および第２の側鎖官能基化骨格ポリマー間の架橋反応は、前記ヒドロゲルマトリックスのゲル化時またはゲル化後に、還元剤または脱保護剤を添加することにより開始される。ゲル化時に還元剤を添加する場合は、前記ヒドロゲルマトリックスのゲル化と、第１および第２の官能基化骨格ポリマー間の共有結合性架橋反応とが同時に起こる。ゲル化後に還元剤を添加する場合は、ゲル化過程で第１および第２の官能基化骨格ポリマーが共にゲル内に封入されているため、架橋反応の開始に必要な高分子成分の内部拡散を行わなくても架橋反応が起こる。上述した通り、前記ヒドロゲルシステムの各成分量は、所望の生成物を得るために変更してもよい。通常、ヒドロゲルマトリックス溶液は、約１～５重量％のヒドロゲルポリマー、約１～５重量％の第１の側鎖官能基化骨格ポリマーおよび約１～５重量％の第２の側鎖官能価骨格ポリマーを含む。ゲル化浴または続いて使用する脱保護溶液は、第２の官能基化骨格ポリマーの保護されたチオール基に対して過剰量、例えば保護されたジチオール基に対して２～２００倍、好ましくは１０～５０倍のモル過剰量の脱保護剤、または約０．００５～１重量％、好ましくは０．０２～０．１重量％の量の脱保護剤を含む。

この方法の別の利点は、ゲル化時にヒドロゲルマトリックス内に形成されたナノメートルスケールの細孔内に第１および第２の官能基化骨格ポリマーが固定（または同時配置）されることで、これらのポリマーの架橋性基（すなわち、活性化アルケンおよび脱保護されたチオール基）間の架橋反応を容易かつ速やかに進行させることができるという点である。さらに、第２の官能基化骨格ポリマー上の保護されたチオール基の提供により、架橋反応の開始前に、ヒドロゲルマトリックス内で２種類のポリマーゲル形成性骨格をあらかじめ混合することが可能であり、所望により、カプセル化したい細胞、治療薬またはその他の薬剤をあらかじめ混合することも可能である。

上記２つの前記ヒドロゲルシステムの調製方法により機能的なシステムが提供されるとともに、ヒドロゲルマトリックス内で第１および第２の官能基化骨格ポリマー間の架橋反応が進行するという利点により、後で高分子架橋成分を添加してヒドロゲルマトリックス内に拡散させなくても済む。これは、架橋成分、すなわち、第１および第２の官能基化骨格ポリマーが同時に、ヒドロゲルマトリックス（例えば、ゲル化時に形成されるヒドロゲルビーズ）内に効果的に封入されるためである。この方法の別の利点は、ゲル化時にヒドロゲルマトリックス内に形成されたナノメートルスケールの細孔内に第１および第２の官能基化骨格ポリマーが同時に固定され配置されることで、これらのポリマーをゲル化ヒドロゲルマトリックス（例えばアルギン酸カルシウムビーズ）の全体に巨視的拡散させなくても、これらのポリマーの架橋性基（すなわち、活性化アルケンおよび脱保護されたチオール基）間の架橋反応を容易かつ速やかに進行させることができるという点である。低分子の細胞適合性還元剤／脱保護剤の拡散であれば、大きな拡散抵抗は生じない。さらに、第２の官能基化骨格ポリマー上の保護されたチオール基の提供により、ゲル化および架橋反応の開始前に、ヒドロゲルマトリックス内で２種類のポリマーゲル形成性骨格をあらかじめ混合することが可能であり、所望により、カプセル化したい細胞、治療薬またはその他の薬剤をあらかじめ混合することも可能である。

上述した方法により、本発明の架橋ヒドロゲルがヒドロゲルマトリックス内にカプセル化されたヒドロゲルシステムであって、該架橋ヒドロゲルが該マトリックスの架橋ヒドロゲルコアを形成するヒドロゲルシステムを調製してもよい。また、本発明の架橋ヒドロゲルは、ヒドロゲルマトリックスを取り囲むシェルを形成してもよい。この場合、アルギン酸塩溶液などのヒドロゲルマトリックスをゲル化条件下（例えば、カチオン性または熱ゲル化）においてコア－ヒドロゲルビーズを形成する。得られたコア－ヒドロゲルビーズは、ポリ－Ｌ－リジンなどの生体適合性カチオンポリマーでコーティングしてもよく、このコア－ヒドロゲルビーズを、第１の側鎖官能基化ポリマーを含むヒドロゲルマトリックス（たとえばアルギン酸塩溶液）中に分散する。このヒドロゲルマトリックスをゲル化し、その後、第２の側鎖官能基化ポリマーと組み合わせて、脱保護剤を添加して架橋を形成させるか、または本明細書に記載のジチオールまたはポリチオール（例えばＰＥＧ）を添加して架橋を形成させる。

第１の側鎖官能基化骨格ポリマーを含む本発明の生体適合性合成ポリマーは、チオール系架橋剤または第２の側鎖官能基化骨格ポリマーとの架橋効率がよく、生体適合性ヒドロゲルマトリックス内に組み込むことにより、生物医学的用途、例えば、治療用細胞やその他の治療薬（医薬品など）のインビボ送達に使用される安定なヒドロゲルシステムを提供することができる。この場合、ヒドロゲル形成反応は、生物医学的用途や細胞の生存維持に適した生理学的条件下で実施され、例えばｐＨ７～８などの生理学的に許容されるｐＨの緩衝水溶液を用いて、０℃～３７℃の温度で実施される。

本発明の合成架橋ポリマーは、生物医学的用途に適した十分な強度を有し、組成に応じて１～１４１ｋＰａの範囲の弾性率を示すことが確認されている。この弾性率は様々なヒト組織の硬さに相当する。

本発明の合成架橋ポリマーはさらに、例えば、残存する反応性部位（すなわち、活性化アルケン部位）に官能基を導入する、後官能基化も可能である（選択した架橋性化合物で側鎖の官能基化を行う前に導入してもよい）。導入する官能基としては、ＲＧＤなどの接着活性モチーフ、ジメチルアミノエチルアミンなどの一級アミンもしくは二級アミンを含むカチオン基、チオール部分を有する中性基、またはアルコール、例えばアミノエタノールなどのその他の求核試薬；抗炎症性サイトカイン、細胞促進タンパク質および細胞成長因子などの機能性生体分子、または低分子（治療薬、抗炎症剤など）；蛍光標識などの検出可能な標識、例えばフルオレセインアミン、ＴＡＭＲＡ－カダベリン、フルオレセインカダベリンまたはローダミンカダベリンになどが挙げられる。後官能基化には、残存する反応性部位の不活化も含まれ、例えば、システアミンまたはその他のチオールなどの不活化基を添加して反応性アルケン部位を不活化することなどが含まれる。

「約」などの程度を示す用語は、本明細書において、最終結果が著しく変化しないような所与量からの合理的な偏差を表すものであり、例えば、所与量の意味または機能が否定されない限りは、所与量の少なくとも±５％の偏差を表す。

以下の具体的な実施例において、本発明の実施形態について説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものと解釈すべきではない。

実施例１：システアミンビニルスルホンで官能基化されたＰＭＭ
本発明に従って、新規の官能基化ポリマーを調製した。具体的には、親水性ポリアニオンであるポリ（メチルビニルエーテル－ａｌｔ－無水マレイン酸）（ＰＭＭ）を、活性化アルケンマイケルアクセプター、例えばシステアミンビニルスルホンで官能基化した。

材料。塩酸システアミン、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）、ポリ（メチルビニルエーテル－ａｌｔ－無水マレイン酸）（Ｍ_ｎ＝８０ｋＤａ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）ナトリウム塩、フルオレセインアミン、ＤＭＳＯ－ｄ_６、フタル酸水素カリウム（ＰＨＴ）および２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳヘミナトリウム塩）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入し、そのまま使用した。ポリ（エチレングリコール）－ジチオール（Ｍ_ｎ＝１ｋＤａ）（ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨ）はＣｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ社から購入した。二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチルはＦｌｕｋａ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ社から購入した。トリエチルアミン（ＴＥＡ）およびクエン酸三ナトリウム二水和物は、ＥＭＤ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から購入した。ギ酸（≧９８％）はＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ社から購入した。無水硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム二水和物、アセトニトリル、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、酢酸エチル、ヘキサン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、酢酸、エチルエーテルおよびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Ｃａｌｅｄｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から購入し、そのまま使用した。重水（９９．９９ａｔｏｍ％Ｄ）は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入した。アルギン酸ナトリウム（Ｐｒｏｎｏｖａ ＵＰ ＭＶＧ）はＮｏｖａＭａｔｒｉｘ社（Ｓａｎｄｖｉｋａ、Ｎｏｒｗａｙ）から購入し、そのまま使用した。水酸化ナトリウム（１．０Ｎ）はＬａｂＣｈｅｍ社から購入した。ＴＡＭＲＡ－カダベリンはＡｎａＳｐｅｃ社から購入した。チオピリジルジスルフィドは、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ社から購入した。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、高グルコース、ピルビン酸塩）、ウシ胎児血清（試験済（ｑｕａｌｉｆｉｅｄ）、カナダ産）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍＬ）および０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（１×）フェノールレッドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、オンタリオ州）から入手した。カルセイン－ＡＭ／エチジウムホモダイマー－１（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｋｉｔ、哺乳動物細胞用）はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。ＮＩＨ／３Ｔ３マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）線維芽細胞（ＣＲＬ－１６５８）はＡＴＣＣから入手した。

Ｎ－ＢＯＣ保護システアミンビニルスルホン（１）の合成。ＤＭＳＯ（５０ｍＬ）に溶解した塩酸システアミン（１．１０２ｇ、９．６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ（１０ｍＬ）に溶解したジビニルスルホン（ＤＶＳ、５．７３ｇ、４８．５ｍｍｏｌ、システアミン塩酸塩に対して５．０当量）の撹拌溶液に、室温で撹拌しながら滴下した。４時間よく撹拌した後、ＤＭＳＯ（１０ｍＬ）に溶解したジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカーボネート（３．１７５ｇ、１４．６ｍｍｏｌ）溶液およびＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解したトリエチルアミン（２．０３ｍＬ、１４．６ｍｍｏｌ、システアミン塩酸塩に対して１．５当量）を室温で滴下した。２４時間撹拌した後、蒸留水（３００ｍＬ）をフラスコに加え、分液漏斗を用いて水相を４×１５０ｍＬのＤＣＭで抽出した。有機相を合わせて、無水硫酸ナトリウムで脱水し、ろ紙を用いて重力ろ過し、ロータリーエバポレーションにより濃縮した。得られた油状物質を中性シリカゲルカラムにロードし、２×４００ｍＬの１：３酢酸エチル／ヘキサン、２×３００ｍＬの１：２酢酸エチル／ヘキサン、続いて１×４００ｍＬの酢酸エチルで溶出し（図１）、シリカＴＬＣでモニターした。Ｎ－ＢＯＣシステアミンビニルスルホン（１）（２．４７ｇ、８．４ｍｍｏｌ）を無色透明の油状物質として収率８７．５％で得た。
¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆): 6.99 (dd, J = 9.6 Hz, 16.8 Hz, CH₂=CHSO₂, 1H), 6.92 (bt, BOC-NHC), 6.29 (m, CH₂=C, 2H), 3.40 (m, NHCH₂CH₂, 2H), 3.09 (m, CH₂CH₂SO₂, 2H), 2.75 (m, NHCH₂CH₂S, 2H), 2.60 (m, SCH₂CH₂SO₂, 2H), 1.39 (s, (CH₃)₃C, 9H).

システアミンビニルスルホントリフルオロアセテート（２）の合成。Ｎ－ＢＯＣシステアミンビニルスルホン（１）（１．０１ｇ、３．４２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解し、よく撹拌したこの溶液に過剰のＴＦＡ（２ｍＬ、２６ｍｍｏｌ）を滴下した（図１）。反応液を４時間撹拌した後、４０℃の水浴で温めながら窒素気流下で濃縮した。システアミンビニルスルホントリフルオロアセテート（２）（０．８３ｇ、２．６６ｍｍｏｌ）を、粘性の黄色油状物質として７８％の収率で得た。
¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆): 7.91 (bs, ⁺NH₃CH₂), 7.01 (dd, CH₂=CHSO₂,1H), 6.30 (q, CH₂=CH, 2H), 3.45 (m, NH₃CH₂CH₂, 2H), 3.00 (m, CH₂CH₂SO₂, 2H), 2.80 (m, CH₂CH₂SCH₂CH₂, 4H).

１０、２０および３０ｍｏｌ％ＣＶＳを含むＰＭＭ－ＣＶＳ－ｆの合成。ＰＭＭＡｎ（０．２５０ｇ、１．６ｍｍｏｌ無水物）を１０ｍＬのアセトニトリルに溶解した。フルオレセインアミン（５ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ、０．９ｍｏｌ％）を１ｍＬの１：１ ＤＭＦ：アセトニトリルに溶解し、ＰＭＭＡｎ溶液によく撹拌しながら滴下した。この溶液に、トリエチルアミン（ＴＥＡ）（１５０μＬ、０．１０８８ｇ、１．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させた。システアミンビニルスルホントリフルオロアセテート（２）（１７５．１ｍｇ、０．５７７ｍｍｏｌ、ＰＭＭＡｎ中の無水物基に対して３５ｍｏｌ％）を５ｍＬの１：１ ＤＭＳＯ：アセトニトリルに溶解し、撹拌溶液に数分かけて滴下した。室温で２４時間後、得られた溶液を４Ｌの０．０５Ｍ ＮａＣｌで１日間、その後４Ｌの蒸留水で３日間、液を毎日交換して透析した（Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ、ＭＷＣＯ＝３５００Ｄａ）。透析した溶液を凍結乾燥し、黄色粉末としてＰＭＭ－ＣＶＳ_３０を単離した。官能基導入量が１０～３０％の他のＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ誘導体、ならびに非標識類似体も調製した。^１Ｈ ＮＭＲにより、ポリマー骨格のＣＨ_２シグナル（δ１．７５ ２Ｈ）を基準としたＣＶＳのビニルシグナル（δ６．２５－７．０ ３Ｈ）から官能基化度を求めた。

物性分析用のＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨゲルの調製。様々なポリマー濃度およびＣＶＳ官能基化度のＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘとＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨを、ＣＶＳ：チオールのモル比が１：１になるように組み合わせてヒドロゲルを調製した。以下の実施例では、２．５％ｗ／ｖ ＰＭＭ－ＣＶＳ_１０を含むゲルの調製について記載する。ＰＭＭ－ＣＶＳ_１０（１０ｍｇ；５．３μｍｏｌ ＣＶＳ）を３００μＬ ＨＥＰＥＳバッファー（５０ｍＭ）に溶解し、５Ｍ ＮａＯＨでｐＨを７．４±０．２に調整した。ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨ（２．７ｍｇ；５．４μｍｏｌチオール）を別のバイアルに入れ、１００μＬの蒸留水に溶解した。２つの溶液を混合し、スライドガラス上のシリコンゴム製鋳型の４つのくぼみ（直径＝７ｍｍ、深さ＝５ｍｍ、体積＝１００μＬ、ｎ＝４）にピペットで注入した。その後、鋳型をシリコンゴム製シートで密閉し、湿ったペーパータオルに包んで水分の蒸発を防ぎ、３７℃で２４時間かけてゲル化させた。また、同様の方法で、官能基化度が１０、２０および３０％のＰＭＭ－ＣＶＳを用いて、ＰＭＭ－ＣＶＳの導入量が２．５、５および７．５％ｗ／ｖのゲルを調製した。

ゲル化のプロファイリングおよびゲル化効率。ＰＭＭ－ＣＶＳ ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨヒドロゲルのゲル化を、６００ＭＨｚのＢｒｕｋｅｒ分光計（ｎｓ＝６４、ｄ１＝１秒）を用いて、^１Ｈ ＮＭＲにより２４時間モニターした。３０ｍｇのＰＭＭ－ＣＶＳ_３０（４２．８μｍｏｌ ＣＶＳ）を、外部標準としてＰＨＴ（０．５ｍｇ、２．４５μｍｏｌ）を含む５００μＬのＤ_２Ｏ ＨＥＰＥＳバッファー（２５ｍＭ）に溶解し、５Ｍ Ｄ_２Ｏ／ＮａＯＨでｐＤ７．５に調整したものを、ＮＭＲサンプルチューブに入れて、ゲル化前のスペクトルを取得した。２１．４ｍｇのＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨ（４２．８μｍｏｌチオール）を１００μＬのＤ_２Ｏに溶解し、先に準備したビニルスルホン含有溶液とよく混合した。^１Ｈスペクトルは、２４時間内の所定の時点で取得した。

ゲルの機械的特性。シリコーン製鋳型を用いて調製した上記ゲルディスクのカバーを外し、水分の蒸発を抑えるためにシリコーンオイル１滴（約０．０５ｍＬ）滴下してコーティングし、顕微鏡ステージに載置した。ガラス製融点チューブ（ＶＷＲ、直径＝０．８５ｍｍ）を荷重変換器（Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ＧＳＯ、フルスケール１０ｇ）に取り付け、閉じた丸い端がゲルディスクの真上にくるように配置した。圧子が一定速度で下方に移動するように設定し、移動速度を、作製したそのままの状態のゲルでは０．２ｍｍ／秒、膨潤したゲルでは０．４ｍｍ／秒として、時間に対する荷重と垂直方向の位置を測定した。測定は、各ゲルの表面の３点で行った。

膨潤率測定。シリコーン製鋳型を用いて調製した上記ゲルディスクを秤量し、２４ウェルプレートに入れ、３ｍＬのＰＢＳバッファー（１０ｍＭリン酸、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を加え、３７℃で７日間インキュベートした。ゲルを入れていないウェルには蒸留水を満たし、また、水分の蒸発を抑えるために、蓋をしたプレート全体を湿ったペーパータオルで包んだ。７日間の間にバッファーを５回交換した。１週間後、ゲルをウェルから取り出し、キムワイプで軽く拭いて余分な水分を取り除き、計量した。膨潤率は、初期質量に対する最終質量の比として求めた。

ＰＭＭ－ＣＶＳの加水分解安定性。１０ｍｇのＰＭＭ－ＣＶＳ_３０を、内部標準としてギ酸（５０ｍＭ）を含む１ｍＬ ＨＥＰＥＳバッファー（５０ｍＭ）（Ｄ_２Ｏで調製）に溶解し、５Ｍ ＮａＯＨ／Ｄ_２ＯでｐＤ７．７または８．７に調整した。サンプルを３７℃で維持しながら、ＣＶＳのビニルシグナル（δ６．２５～δ７．０）の消失を^１Ｈ ＮＭＲにより３週間モニターした。

残存ビニルスルホン単位の後修飾。５０ｍｇのＰＭＭ－ＣＶＳ_３０（７１．２μｍｏｌ ＣＶＳ）を、外部標準としてＰＨＴ（２．７ｍｇ、１３．１μｍｏｌ）を含む０．８ｍＬ ＨＥＰＥＳバッファー（２５ｍＭ、ｐＨ７．８）（Ｄ_２Ｏで調製）に溶解し、５Ｍ ＮａＯＨ／Ｄ_２ＯでｐＤ７．４に調整した。１８ｍｇのＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨ（３６μｍｏｌチオール、０．５：１ チオール：ＣＶＳ）を２００μＬ Ｄ_２Ｏに溶解した。２つの溶液を速やかに混合し、スライドガラス上のシリコンゴム製鋳型の６つのくぼみ（直径＝７ｍｍ、深さ＝５ｍｍ、体積＝１５０μＬ、ｎ＝６）にピペットで注入した。その後、鋳型をシリコンゴム製シートで密閉し、湿ったペーパータオルに包んで水分の蒸発を防ぎ、３７℃で２４時間かけてゲル化させた。得られたゲルを鋳型から取り出し、乳鉢と乳棒で５０～１５０ｎｍの大きさの粒子に粉砕し、４ｍＬのＤ_２Ｏに懸濁し、ｐＤ７．４に調整した。得られた懸濁液を回収し、遠心分離（３５００ＲＰＭ、５分）して上清を除去した。１．１ｍＬの高密度ゲル充填材（ｄｅｎｓｅ ｇｅｌ ｐａｃｋｉｎｇ）を含む２つのＮＭＲサンプルを準備した。サンプル１をコントロールとして使用し、こちらには何も添加しなかった。サンプル２（０．７３３ｍｇ、３．６μｍｏｌ ＰＨＴ、４．７１μｍｏｌ ＣＶＳ）に、システアミンＨＣｌを３段階に分けて添加した。システアミンＨＣｌを１ｍＬのＤ_２Ｏに溶解し、この溶液１００μＬをサンプル２に加え（Ａ：０．１７５ｍｇ、１．５μｍｏｌ Ｂ：０．３５ｍｇ、３．１μｍｏｌ Ｃ：０．１７５ｍｇ、３．１μｍｏｌ）、よく混合した。６００ＭＨｚのＮＭＲ分光計を用いて^１Ｈスペクトルを取得した（ｎｓ＝６４、ｄ１＝１秒）。

ｐＨ依存性ゲル化時間の評価。官能基化率の異なる（１０、２０、３０％）ＰＭＭ－ＣＶＳの５％ｗ／ｖ溶液を用いて、ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨとの架橋反応によるゲル化時間を、水平傾斜試験（ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ ｔｉｌｔ ｔｅｓｔ）により、４つの異なるｐＨ値（６．５、７、７．５、８．５）で測定した（ｎ＝３）。４０ｍｇのＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘをＨＥＰＥＳバッファー（３００μＬ、１００ｍＭ）に溶解し、水酸化ナトリウム（５Ｍ）または塩酸（１Ｍ）でｐＨを目標値に調整した。脱イオン水を加えて溶液の容量を４００μＬにし、１０％ｗ／ｖ ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘのＨＥＰＥＳ緩衝液（７５ｍＭ）溶液を得た。同様にして、等モルのＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨのストック溶液を１ｍＬの脱イオン水で調製し、各ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘストック溶液の１００μＬとＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨストック溶液１００μＬとを混合した。混合液を３７℃に維持しながら、最初の５分間は約３０秒ごと、２０分までは約６０秒ごと、４５分までは約５分ごとに試験を行った。バイアルを９０°傾けた際に混合液が流れなかった場合、サンプルがゲル化したと見なした。この間にゲル化しなかったヒドロゲルは３７℃に維持しながら、２４時間および４８時間の時点で試験を行った。これらの試験はｎ＝３で行った。

インビトロ細胞毒性。ＮＩＨ ３Ｔ３マウス線維芽細胞に対するＰＭＭ－ＣＶＳヒドロゲルの細胞毒性を、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄカルセインＡＭ／エチジウムホモダイマー－１（ＥｔｈＤ－１）アッセイにより調べた。線維芽細胞を１０％ｖ／ｖウシ胎児血清（ＢＣＳ）および１％ｖ／ｖペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に懸濁して組織培養フラスコに播種し、５％ＣＯ_２、３７℃、湿度１００％のウォータージャケットインキュベーター内で培養した。７５～８０％コンフルエントに達した時点で、細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄し、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（１×）フェノールレッドを添加して剥離し、新鮮なＤＭＥＭで継代した。ＰＭＭ－ＣＶＳおよびＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨの溶液は、細胞毒性アッセイの前にシリンジフィルターでろ過し、測定はＰＭＭ－ＣＶＳゲルについてはｎ＝３で、コントロールについてはｎ＝４で行った。

ＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ＰＳと５％ｗ／ｖ ＰＭＭ－ＣＶＳ_２０および等モルのＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨとを含むＤＭＥＭ培地に懸濁した。線維芽細胞／ポリマー溶液（１．５×１０^４細胞／ウェル）を９６ウェルガラスボトムプレートのウェルに移し、２４時間インキュベートした。インキュベーション後、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄアッセイにより細胞生存率を求めて、カプセル化細胞に対する得られたヒドロゲルの細胞毒性を評価した。カルセインＡＭ／ＥｔｈＤ－１溶液（２μＭカルセインＡＭおよび４μＭ ＥｔｈＤ－１を含む滅菌ＰＢＳ、１００μＬ）を各ウェルに加え、室温で２０分間インキュベートした。Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ共焦点顕微鏡下で蛍光画像を取得した。生細胞数および死細胞数をカウントし、細胞生存率（％）＝［（生細胞数／（生細胞数）＋（死細胞数）］×１００％を算出することにより細胞生存率を求めた。

Ｓ－（２－アミノエチルチオ）－２－チオピリジンの合成。Ｓ－（２－アミノエチルチオ）－２－チオピリジンを、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂ．２０１６，４，３３８７－３３９７）の手順に従って合成した。以下に簡潔に述べる。チオピリジルジスルフィド（４．４１ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのメタノール（ＭｅＯＨ）に溶解した。次に、反応フラスコに０．８ｍＬの酢酸を加えた。システアミン塩酸塩（１．１４ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのＭｅＯＨに溶解し、チオピリジルジスルフィド溶液に加えた。撹拌しながら室温で４８時間反応させた。次に、反応溶液を真空下で蒸発させて、黄色の油状物質を得た。この油状物質を５０ｍＬのジエチルエーテルで洗浄した。得られた黄色の沈殿物を、空気流下で乾燥させた。次いで、沈殿物を１０ｍＬのＭｅＯＨに溶解した。この溶液を２００ｍＬの冷ジエチルエーテルに滴下し、沈殿物を回収して１０ｍＬのＭｅＯＨに再溶解し、２００ｍＬの冷ジエチルエーテル中で再度沈殿させ、真空ろ過により単離し、白色粉末を得た。^１Ｈ－ＮＭＲ分光法により、Ｓ－（２－アミノエチルチオ）－２－チオピリジン（ＳＰｙ）の性状解析を行った。

ＰＭＭ－ＳＰｙ_ｘの合成。ＳＰｙで官能基化されたＰＭＭ（ＰＭＭ－ＳＰｙ_ｘ）として、それぞれ官能基導入量が異なるＰＭＭ－ＳＰｙ_１０、ＰＭＭ－ＳＰｙ_２０、およびＰＭＭ－ＳＰｙ_３０の３種類を調製した。以下に、ＰＭＭ－ＳＰｙ_３０の合成例を示す。ＰＭＭＡｎ（０．２５０ｇ、１．６ｍｍｏｌ無水物）を１０ｍＬのアセトニトリルに溶解した。この溶液に、トリエチルアミン（ＴＥＡ）（１５０μＬ、１．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間反応させた。ＳＰｙ（１２４．７ｍｇ、無水物に対して３５％ｍｏｌ）を５ｍＬの１：１ジメチルスルホキシド：アセトニトリルに溶解し、反応液に５分間かけて滴下した。反応液を室温で２４時間撹拌し、４Ｌの０．０５Ｍ ＮａＣｌ溶液で２日間、次いで４ＬのｄＨ_２Ｏで３日間透析した（Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ、ＭＷＣＯ＝３５００Ｄａ）。透析した溶液を凍結乾燥し、黄褐色の粉末を得た。ＳＰｙ官能基化度は、^１Ｈ－ＮＭＲにより、ＰＭＭＡｎポリマー骨格（δ１．８４、２Ｈ）を基準としたピリジン環のプロトンシグナル（δ７．２、１Ｈ；δ７．５－７．８、２Ｈ；δ８．３、１Ｈ）から求めた。

ＴＣＥＰによるＰＭＭ－ＳＰｙ_ｘ中のジスルフィド結合の分解のＮＭＲによる解析。ＰＭＭ－ＳＰｙ_ｘ中のジスルフィド結合がトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ（ＴＣＥＰ）によって分解される時間を、^１Ｈ－ＮＭＲ分光法により調べた。ＰＭＭ－ＳＰｙ_２０の０．４％ｗ／ｖ溶液５ｍＬを、０．５Ｍ ＨＥＰＥＳバッファー（Ｄ_２Ｏで調製）で調製した。この溶液にＴＣＥＰ（０．０５５７ｇ、１０倍モル過剰）および約０．１ｍＬのギ酸を加え、ｐＤを７．８（ｐＨ＝７．４）に調整した。このポリマー溶液のＴＣＥＰ添加前とＴＣＥＰ添加８分後の^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを取得した。

ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ／ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨ／アルギン酸塩複合ビーズの調製。様々な官能基導入量およびポリマー濃度でビーズを調製した。以下は、チオール：ＣＶＳ比が４：１の１％ＰＭＭ－ＣＶＳ_２０ビーズの調製手順である。アルギン酸ナトリウム（７５ｍｇ、１．５％ｗ／ｖ）を５ｍＬの１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し、０．４５μｍのシリンジフィルターでろ過し、次いで０．２０μｍのシリンジフィルターでろ過した。ＰＭＭ－ＣＶＳ_２０（１０ｍｇ）を２５０μＬの１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した。７５０μＬのアルギン酸塩溶液をＰＭＭ－ＣＶＳ_２０溶液に加えた。得られた１ｍＬの溶液には、１％ｗ／ｖ ＰＭＭ－ＣＶＳ_２０および１．１２５％ｗ／ｖアルギン酸塩が含まれていた。この溶液を２７ゲージ針を通して０．５ｍＬ／分で、５０ｍＬの１００ｍＭ ＣａＣｌ_２／７７ｍＭ ＮａＣｌゲル化浴内に押し出した。形成されたビーズをゲル化浴に沈殿させ、約１０分後にプラスチックピペットを使って取り出し、３ｍＬのゲル化浴の入ったコニカルバイアルに加えた。ビーズの約５０％をガラスバイアルに入れ、上清を除去した。このバイアルに、１ｍＬのＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨ（１ｋＤａ）溶液（３８．２ｍｇ、ＣＶＳに対して４倍モル）を加えた。２４時間後、ビーズを５ｍＬのゲル化浴で５回洗浄した。この操作を、４種類の濃度の１ｋＤａ ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨ溶液を用いて、チオール：ビニルスルホン比４：１、３：１、２：１、１：１で行った。

これとは別に、上記の手順に従って、１％ｗ／ｖ ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘと８ｋＤａ ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨを使用して、また２％ｗ／ｖ ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘと１ｋＤａ ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨを使用して、ビーズを調製した。

ビーズ膨潤率の測定。約５０個のビーズを４８ウェルプレートの５つのウェルに分配した。ビーズの直径は、Ｎｉｋｏｎ ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ倒立蛍光顕微鏡下で測定した。各ウェルの上清をガラスピペットで除去し、７５ｍＭクエン酸ナトリウム溶液０．３ｍＬに交換した。クエン酸塩添加１、２、１０、２０、４０、６０分後に、ビーズの直径を再度測定した。膨潤率は、６０分後の平均ビーズ直径をクエン酸塩添加前の平均ビーズ直径（ｔ＝０分）で除することにより求めた。この操作を、合成したすべての種類のＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ／ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨ／アルギン酸塩ビーズおよびＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ／ＰＭＭ－ＳＰｙ_ｘ／アルギン酸塩ビーズに対して行った。

ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ／ＰＭＭ－ＳＰｙ_ｘ／アルギン酸塩複合ビーズの最適化。ＰＭＭ－ＣＶＳ_２０－ｒ（１０ｍｇ）およびＰＭＭ－ＳＰｙ_２０（１０ｍｇ、９．７１μＭ ＳＰｙ）を２５０μＬの１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した。アルギン酸ナトリウム（７５ｍｇ、１．５％ｗ／ｖ）を５ｍＬの１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し、０．４５μｍのシリンジフィルターでろ過し、次いで０．２０μｍのシリンジフィルターでろ過した。ＰＭＭ－ＣＶＳ_２０－ｒ／ＰＭＭ－ＳＰｙ_２０溶液と、７５０μＬの１．５％ｗ／ｖアルギン酸ナトリウム溶液とを混合して、１％ｗ／ｖ ＰＭＭ－ＣＶＳ_２０－ｒ、１％ｗ／ｖ ＰＭＭ－ＳＰｙ_２０および１．１２５％アルギン酸ナトリウムを含む１ｍＬの溶液を得た。このビーズ溶液を、２７ゲージの先端が平らな針を通して０．５ｍＬ／分の速度で押し出すとともに、３Ｌ／分の速度の同軸空気流にさらすことにより、５０ｍＬの３５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝ゲル化浴（３５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＣａＣｌ_２、７７ｍＭ ＮａＣｌ）に液滴として滴下した。ゲル化浴溶液には、０．０２７９ｇのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ（ＴＣＥＰ）（９７．１μＭ、ＳＰｙに対して１０倍モル）がさらに含まれており、１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ７．４～７．８に調整されていた。ビーズ溶液をＴＣＥＰ含有ＨＥＰＥＳ緩衝ゲル化浴に押し出してから４分後、１時間後、２時間後および４時間後にこの浴からビーズサンプルを取り出し、撮影を行って膨潤率を測定した。これとは別に、形成されたビーズをＴＣＥＰ含有ＨＥＰＥＳ緩衝ゲル化浴中に１５分間静置し、その後１５ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝ゲル化浴で３回洗浄した。ビーズサンプルを、洗浄後４分、１時間、２時間および４時間で取り出し、撮影を行って膨潤率を測定した。ビーズの膨潤率は、いずれの場合も上記と同様にして測定し、また、２４時間の膨潤率を、０．３ｍＬの７５ｍＭクエン酸塩溶液中に２４時間静置した後のビーズ直径をクエン酸塩添加前のビーズ直径で除することによって求めた。

コントロール実験として、１％ｗ／ｖ ＰＭＭ－ＣＶＳ_２０－ｒ、１％ｗ／ｖ ＰＭＭ－ＳＰｙ_２０および１．１２５％アルギン酸ナトリウム溶液を、２７ゲージの先端が平らな針を通して０．５ｍＬ／分の速度で押し出すとともに、３Ｌ／分の速度の同軸空気流にさらすことにより、５０ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝ゲル化浴（３５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１００ｍＭ ＣａＣｌ_２／７７ｍＭ ＮａＣｌ）に液滴として滴下した。このゲル化浴にはＴＣＥＰは含まれていなかった。ゲル化浴中に２４時間静置した後、ビーズをウェルプレートに移し、約１０個のビーズに対して０．３ｍＬの７５ｍＭクエン酸塩溶液を加えた。クエン酸溶液中にビーズを１時間静置した後、Ｎｉｋｏｎ ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ倒立蛍光顕微鏡下でウェルの撮影を行った。

ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ／ＰＭＭ－ＳＰｙ_ｘ／アルギン酸塩複合ビーズの調製。様々な官能基導入量およびポリマー濃度でビーズを調製した。以下は、１％ＰＭＭ－ＣＶＳ_２０－ｒ／１％ＰＭＭ－ＳＰｙ_２０ビーズの調製手順である。アルギン酸ナトリウム（７５ｍｇ、１．５％ｗ／ｖ）を５ｍＬの１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し、０．４５μｍのシリンジフィルターでろ過し、次いで０．２０μｍのシリンジフィルターでろ過した。ＰＭＭ－ＣＶＳ_２０－ｒ（１０ｍｇ）およびＰＭＭ－ＳＰｙ_２０（１０ｍｇ、９．７１μＭ ＳＰｙ）を２５０μＬの１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した。７５０μＬの１．５％アルギン酸塩溶液をＰＭＭ－ＣＶＳ_２０－ｒ／ＰＭＭ－ＳＰｙ_２０溶液に加えた。得られた１ｍＬの溶液には、１％ｗ／ｖ ＰＭＭ－ＣＶＳ_２０－ｒ、１％ｗ／ｖ ＰＭＭ－ＳＰｙ_２０および１．１２５％ｗ／ｖアルギン酸塩が含まれていた。３５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１００ｍＭ ＣａＣｌ_２／７７ｍＭ ＮａＣｌゲル化浴の溶液を調製し、０．０２７９ｇ ＴＣＥＰ（９７．１μＭ）を添加した。この溶液のｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨで７．４～７．８に調整した。ビーズ溶液を２７ゲージの先端が平らな針を通して０．５ｍＬ／分の速度で押し出すとともに、３Ｌ／分の速度の同軸空気流にさらすことにより、５０ｍＬのゲル化浴に液滴として滴下した。ビーズをゲル化浴中に１５分間静置した後、１５ｍＬの３５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１００ｍＭ ＣａＣｌ_２／７７ｍＭ ＮａＣｌゲル化浴で３回洗浄した。ビーズは、ゲル化浴中に１時間静置してから試験に供した。この操作を、表１に示すポリマーの各ペアで行った。

ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ／ＰＭＭ－ＳＰｙ_２０／アルギン酸塩複合ビーズの光退色。ＰＭＭ－ＣＶＳ_２０－ｒ／ＰＭＭ－ＳＰｙ_２０／アルギン酸塩ビーズを、ポリマー導入量を１％ｗ／ｖとして、上記と同様に調製した。４８ウェルプレートに１ウェルあたり約１０個のビーズを入れた。各ウェルに０．３ｍＬの７５ｍＭクエン酸ナトリウム溶液を加え、ビーズを１時間静置した。ビーズをＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ共焦点顕微鏡下で撮影し、顕微鏡の１つの領域に焦点を合わせてレーザー強度を増加させることにより、ビーズ内部の小さな領域を光退色させた。レーザー強度を通常の設定に戻し、光退色の１、１０、２０、３０、４０、５０および６０分後にビーズを撮影した。

結果
システアミンビニルスルホントリフルオロアセテートの合成。ここでは、図１に概説されているように、ＣＶＳをＴＦＡ塩として調製して単離し、純度の高い状態でビニルスルホン官能基化ＰＭＭの調製に使用した。このようなビニルスルホン官能基化ＰＭＭは、水性媒体中で生理学的条件下におけるジチオールおよびポリチオールとの架橋反応に適した新規なポリアニオンポリエンである。

システアミンＨＣｌと過剰のＤＶＳとの反応によりシステアミンが完全に変換されたことは、^１Ｈ ＮＭＲによるδ３．５およびδ３．１３のシステアミンのエチレンシグナルの消失、ならびにδ２．８およびδ３．０の新しいエチレンシグナルの出現から確認された。得られたＣＶＳをＮ－ＢＯＣ ＣＶＳに変換することにより、カラムクロマトグラフィーによる精製および単離が可能となった。^１Ｈ ＮＭＲにより、ｔ－ブチル保護基の存在（δ１．４９Ｈ、ｓ）、およびチオエーテルに隣接するシステアミンメチレンのダウンフィールドシフト（δ２．７５ ２Ｈ、δ２．６ ２Ｈ）が確認された。精製後、ＤＣＭ中でＴＦＡを加えてＮ－ＢＯＣ ＣＶＳを脱保護した。溶媒および過剰のＴＦＡを、穏やかに加熱しながら窒素気流下で蒸発させ、高純度のＣＶＳを初めてＴＦＡ塩として６８％の収率で単離した。最終的に得られたＣＶＳ ＴＦＡの存在および純度を、チオエーテルに隣接する^１Ｈ ＮＭＲシグナル（δ２．８）の収束、およびｔ－ブチルシグナル（δ１．４、９Ｈ、ｓ）の消失により確認した。

別の方法によるＣＶＳの合成。アミン基とビニルスルホンの反応を防ぐために、共有結合保護基の代わりにプロトン化を利用した、ＣＶＳの別の合成方法を開発した。この手順はより速く、よりスケールアップに適している。システアミンＨＣｌ（１．９ｇ、８．８ｍｍｏｌ）を１０ｍＬの水に溶解し、滴下漏斗でジビニルスルホンの撹拌溶液（５ｍＬ、４９．８ｍｍｏｌ、５．６倍モル過剰）に滴下した。二相混合液を室温で６時間反応させた後、４０ｍＬのＣＨＣｌ_３で１回抽出し、続いて２０ｍＬのＣＨＣｌ_３で５回抽出した。水相を硫酸ナトリウムで脱水させた後、凍結乾燥して粘稠な油状物質を得た。油状物質を１０ｍＬのＭｅＯＨに溶解して飽和溶液を得た後、９０ｍＬの乾燥ジクロロメタン（ＤＣＭ）を加えた。生じた沈殿物をろ去した。所望の生成物を含むＭｅＯＨ／ＤＣＭ混合液を、１０％ＭｅＯＨのＤＣＭ溶液８００ｍＬを用いて１ｃｍシリカプラグに通した。回収した画分をロータリーエバポレーターで乾燥させて、生成物であるＣＶＳ ＨＣｌをワックス状の白色固体として収率７７％で得た。この生成物の性状解析を^１Ｈ ＮＭＲにより行った：δ６．８５（１Ｈ）、δ６．４３（１Ｈ）、６．３６（１Ｈ）、δ３．５２（２Ｈ）、δ３．１９（２Ｈ）、δ２．９２（２Ｈ）およびδ２．８７（２Ｈ）。

ポリマー修飾によるＰＭＭ－ＣＶＳ。ＰＭＭＡｎは、アセトニトリル中、ＣＶＳ ＴＦＡまたはＣＶＳ ＨＣｌとＴＥＡとを用いて容易に修飾することができた（図２）。過剰のＴＥＡを加えることにより、ＣＶＳと、ＰＭＭの無水物の開環によって形成されたマレアミド酸との両方の脱プロトン化を確実に行った。以下に示すような、官能基化率が１０、２０および３０ｍｏｌ％のＰＭＭ－ＣＶＳを調製した。

ＰＭＭ－ＣＶＳ_１０は以下の通りにして調製した。ＰＭＭＡｎ（０．２５０ｇ、１．６ｍｍｏｌ無水物）を１０ｍＬのアセトニトリルに溶解した後、トリエチルアミン（ＴＥＡ）（１５０μＬ、０．１０８８ｇ １．１ｍｍｏｌ）を添加した。ＣＶＳ ＨＣｌ（４５ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、ＰＭＭＡｎの無水物基に対して１５ｍｏｌ％）を５ｍＬの１：１ ＤＭＳＯ：アセトニトリルに溶解し、撹拌溶液に数分間かけて滴下した。反応液をそのまま室温で２４時間混合した後、４Ｌの０．０５Ｍ ＮａＣｌで１日間、その後４Ｌの蒸留水で３日間、液を毎日交換して透析した（Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ、ＭＷＣＯ＝３５００ Ｄａ）。透析した溶液を凍結乾燥し、白色粉末としてＰＭＭ－ＣＶＳ_１０を単離した。Ｄ_２Ｏを用いてＢｒｕｋｅｒ ＡＶ６００ ＮＭＲ分光計で測定した^１Ｈ ＮＭＲにより、ポリマー骨格のメチレンシグナル（δ１．８、２Ｈ）を基準としたＣＶＳのビニルシグナル（δ６．２５～７．０ ３Ｈ）から官能基化度を求めた。ＰＭＭ－ＣＶＳ_２０およびＰＭＭ－ＣＶＳ_３０も同様の方法で調製した。ＣＶＳの組み込み効率は６５～８５％であった（表２）。

ＰＭＭ－ＣＶＳのいくつかをアミノフルオレセインで標識して、蛍光顕微鏡によるゲルの性状解析が実施できるようにした。

アルギン酸塩の非存在下においてＰＭＭ－ＣＶＳとＰＥＧ－ジチオールとの反応により形成されたバルクゲル。ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘおよびＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨの各水溶液を、ビニルスルホン／チオール比が１：１となるように混合してゲルを形成した。１０、２０および３０ｍｏｌ％のＣＶＳを含むＰＭＭ－ＣＶＳを用いて、ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘの導入量が２．５、５および７．５％ｗ／ｖのゲルを調製し、膨潤率およびヤング率に関する特性を調べた。ＰＭＭ－ＣＶＳ_１０の溶液は、導入量が７．５％ｗ／ｖ以上でゲルを形成することがわかった。ＰＭＭ－ＣＶＳ_２０およびＰＭＭ－ＣＶＳ_３０は、３つのいずれの導入量でもゲルを形成した。ＰＭＭ－ＣＶＳ_４５も調製したが、水にわずかしか溶けなかったため、これ以上の検討は行わなかった。

５％ｗ／ｖで調製したＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘゲルについてｐＨ６．５、７．５、８．５におけるゲル化時間を測定した。ガラスバイアルを手動で傾けた際に、流動性が見られない場合をゲル化として定義した。ゲル化に要する時間は、ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘの官能基化度およびシステムのｐＨの両方に強く依存していた。図３に示すように、ゲル化時間はＣＶＳのｐＨまたは官能基化率の増加とともに短縮された。例えば、ＰＭＭ－ＣＶＳ_２０はｐＨ７．５では５．６±０．５分以内にゲル化したが、ｐＨ６．５では４４±５分かかった。ＰＭＭ－ＣＶＳ_３０のゲル化時間は、ｐＨ７．５ではわずか１分であったが、ｐＨ８．５では数秒であった。システアミンはｐＫａ値が８．３２であるため、この範囲のｐＨの小さな変化によって、チオレート型の割合、したがって反応速度は非常に敏感に変化する。ＰＭＭ－ＣＶＳ_２０およびＰＭＭ－ＣＶＳ_３０についてはｐＨ６．０以下、ＰＭＭ－ＣＶＳ_１０についてはｐＨ８．０以下ではゲル化は観測されなかった。

^１Ｈ－ＮＭＲで、チオール－エン結合（図２）によるδ６．４およびδ６．７５でのビニルシグナルの消失をモニターすることにより、ゲル化時の反応速度を測定した（図４）。評価対象のシステム（５ｗｔ％ＰＭＭ－ＣＶＳ_３０）のゲル化時間は約１分であり、これは、ビニル消費量に換算すると１～５％に相当し、繰り返し単位の０．５～１．５％が架橋形成していることと同等であり、ゲル形成に必要な架橋点が少ないことを示している。プロファイルは８～１２時間で横ばいになり、１８％近いビニル基がそのまま残存している。これは一部の反応基の空間的隔離に起因する。このような残存する反応基を利用して、ヒドロゲルの後官能基化が可能であり、ヒドロゲルにキャッピング剤、接着タンパク質、標識またはその他の官能基単位を組み込むことができる。

膨潤率測定。ヒドロゲルの平衡膨潤は、網目（ネットワーク）と溶媒との混合の自由エネルギーと、可動イオンの正味の浸透圧という２つのファクターによって決定され、これらのファクターと膨張の膨潤圧力とが釣り合った状態にある。作製したＰＭＭ－ＣＶＳゲルの膨潤率を評価するため、作製したそのままの状態のバルクゲルディスクをＰＢＳバッファー（１０ｍＭリン酸、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に浸して３７℃で７日間インキュベートし、算出した膨潤率を図５に示した。７．５％ｗ／ｖのＰＭＭ－ＣＶＳ_１０で調製したゲルは、ＣＶＳのモル量が同じでも、２．５％ｗ／ｖのＰＭＭ－ＣＶＳ_３０より高い膨潤率を示す（図３）。これは、ＰＭＭ－ＣＶＳ_１０の方が電荷密度が高く、静電反発により架橋効率が低くなることに起因する。

図５の水平破線は、平衡膨潤率が１であることを示しており、過剰なＰＢＳ溶液で平衡化しても、作製したそのままの状態のゲルがそれ以上膨潤しないことを示している。ＰＭＭ－ＣＶＳ_３０の重量パーセントを変えて作製したゲルはいずれも１に近い膨潤率を示した。これは、ＣＶＳ側鎖基の架橋密度が高いこととＣＶＳ側鎖基の疎水性の両方に起因する。

ヒドロゲルの機械的特性。ヒドロゲルの硬さは、足場依存性細胞に物理的刺激を提供し、増殖および分化の能力に影響を与え得る。ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨヒドロゲルの硬さを評価するために、ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘの導入率（％）と官能基化度を変えることで架橋密度の異なるヒドロゲルを調製し、その弾性率をインデンテーション法により測定した。その結果、１～１４１ｋＰａの範囲の弾性率が観測されたが、これは様々なヒト組織の硬さに相当する。力と弾性率の関係は、球体と弾性変形した非圧縮性材料との接触に関するヘルツ理論によって説明される。ここで、Ｆは力（ｍＮ）、ｄは変形の深さ、Ｒは圧子の半径（Ｒ＝０．８５ｍｍ）、νはポアソン比（エラストマーヒドロゲルの場合は０．５と仮定）、およびＥはヤング率（式１）である。

ヤング率Ｅは、線形ヘルツ理論が信頼できると考えられる応力ひずみプロットの線形近似の初期勾配（ｄ≦０．３ｍｍ）から求めることができる。測定は、膨潤前（図６ａ）と、１０ｍＭ ＰＢＳバッファーで７日間膨潤させた後（図６ｂ）の両方で行った。作製したそのままの状態のゲルの場合、予測された通り、ＰＭＭ－ＣＶＳの官能基化度の増加とともに、またポリマー導入率の増加とともに弾性率が増加した。７．５％ｗ／ｖ ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘで作製したゲルは、ＣＶＳ含有量の増加とともにヤング率が段階的に増加した：ＰＭＭ－ＣＶＳ_１０（４．８ｋＰａ）、ＰＭＭ－ＣＶＳ_２０（８６ｋＰａ）およびＰＭＭ－ＣＶＳ_３０（１４１ｋＰａ）。ヤング率は、官能基化率が同じでも、ポリマー導入量の増加とともに増加し、ＰＭＭ－ＣＶＳ_３０では、４．１ｋＰａ（２．５％ｗ／ｖ）から１４１ｋＰａ（７．５％ｗ／ｖ）へと増加する。以上のような傾向から、ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨシステムの機械的特性は、官能基化率（％）または重量比率（％）を変更することにより、幅広く調整することが可能となる。膨潤後、一部のゲル（ＰＭＭ－ＣＶＳ_２０ ２．５％ｗ／ｖおよびＰＭＭ－ＣＶＳ_１０ ５％および７．５％ｗ／ｖ）は柔らかくなり過ぎたため、圧子を用いた弾性率の測定は実施できなかった。

ＰＭＭ－ＣＶＳの加水分解安定性。チオエーテル結合は、一般に生理学的条件下で安定であると考えられているが、このシステムにおけるビニルスルホン部分の水性媒体中での安定性を調べることに関心があった（図７）。文献報告では、ビニルスルホンをタンパク質修飾などの用途に使用する強みとして、この基の水中での安定性がよく言及されている。ｐＤ７．７およびｐＤ８．７のＰＭＭ－ＣＶＳ_３０のＤ_２Ｏ溶液を３７℃で３週間保存し、^１Ｈ ＮＭＲで間隔をあけてモニターした。スペクトルの変化は、ペンダントビニルスルホンに関連するシグナルにのみ見られ、ビニル基の水和によるものと解釈した。ビニルシグナルの消失は、ゲル化時間よりも数桁遅いことがわかり、このようなＣＶＳの副反応は、高いｐＨでもゲル化を妨害したり、ゲル化と競合したりしないことを示している。

残存ビニルスルホン単位の後修飾。反応性ポリマーおよびヒドロゲルの後修飾は、反応性基をキャップし、機能性生体分子を組み込む効果的な方法であることが実証されている。具体的には、チオール－エンマイケル付加反応の利用が、後官能基化において注目されており、ＰＥＧベースのビニルスルホン含有ヒドロゲルおよびマレイミド含有ヒドロゲルへのＶＥＧＦおよびＲＧＤの組み込みが可能であることが示されている。

簡単な実証実験として、作製したそのままの状態のＰＭＭ－ＣＶＳ_３０／ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨヒドロゲルを、チオール含有低分子であるシステアミンを用いて後官能基化する試みを行った（図８）。後官能基化に利用できるＣＶＳが残存するように、チオール：ＣＶＳ比を０．５：１としてゲルの架橋を行った。低分子の付加による後官能基化度を調べるために、後官能基化の際に^１Ｈ ＮＭＲ用の内部標準を用いた。後官能基化スペクトルのビニル領域を積分するために、両方のピーク（δ６．８およびδ６．４）を別々に分析し、ビニル夾雑物（δ６．６５）を除外した。内部標準であるＰＨＴは、δ７．４で観測された。キャッピング剤は最初のポーションを（図８、Ａ）、３６％のキャッピング比で添加し、２８％を不活化した。次いで、より大きな６６％のポーション（図８、Ｂ）で５２％を不活化し、最後に、残存するすべてのビニル基のキャッピングを行った（図８、Ｃ）。段階的な後官能基化により、様々な比率で効率よく多官能基付加を行うことが可能であり、完全にキャップされたヒドロゲルが得られる可能性が示された。

インビトロ細胞毒性。５％ｗ／ｖのＰＭＭ－ＣＶＳ_２０／ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨヒドロゲルの、カプセル化３Ｔ３線維芽細胞に対するインビトロ細胞毒性を、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄアッセイで評価した。生細胞では、非蛍光カルセインＡＭが酵素によって高蛍光カルセインに変換され、高蛍光カルセインが生細胞内に保持されるため、５１５ｎｍ（緑色）で蛍光が発せられる。ＥｔｈＤ－１は、膜が損傷した細胞に入って核酸と結合するため、死細胞では６３５ｎｍ（赤色）で可視の蛍光の顕著な増加が見られるが、細胞膜が損傷していない生細胞では排除される。２４時間インキュベーションした後のヒドロゲル中の細胞の生存率は、コントロールと変わらず、ＰＭＭ－ＣＶＳ_２０ヒドロゲルでは９８±１％、コントロールウェルでは９８±１％であった。この結果は、ＰＭＭ－ＣＶＳで構成されるヒドロゲルがカプセル化細胞に対して細胞毒性を示さないことを示唆しており、さらに当該ヒドロゲルが、細胞治療を目的とした細胞カプセル化などの生物医学的用途のプラットフォーム材料としての生体適合性と可能性を有していることを示唆している。

Ｓ－（２－アミノエチルチオ）－２－チオピリジンの合成。チオピリジルジスルフィドとシステアミンＨＣｌをメタノール中で反応させて、Ｓ－（２－アミノエチルチオ）－２－チオピリジンを生成した（図９）。システアミンを確実に完全にプロトン化するために、酢酸を用いた。未反応のチオピリジルジスルフィドなどの夾雑物を、ジエチルエーテルで沈殿させて生成物から除去した。生成物を真空ろ過により単離し、Ｓ－（２－アミノエチルチオ）－２－チオピリジン（ＳＰｙ）を７３％の収率で得た。この生成物の性状解析を^１Ｈ－ＮＭＲにより行ったところ、明確なピリジルピーク（δ７．２、１Ｈ、ｔ；δ７．６、１Ｈ、ｄ；δ７．７、１Ｈ、ｔ；δ８．３、１Ｈ、ｄ）およびエチレンピーク（δ３．０、２Ｈ、ｔ；δ３．２、２Ｈ、ｔ）が観測された。

ＳＰｙ官能基化ＰＭＭの合成。ＰＭＭＡｎのＳＰｙによる官能基化を、官能基導入量を１０、２０および３０％として行った（図１０）。ＴＥＡを加えて、ＣＶＳと、ＰＭＭＡｎの無水物基の開環によって形成されたマレアミド酸とを確実に脱プロトン化した。

１０ｍｏｌ％ＳＰｙを含むＰＭＭ－ＳＰｙの合成例を以下に示す。ＰＭＭ－ＳＰｙ_１０は以下の通りにして調製した。ＰＭＭＡｎ（０．２５０ｇ、１．６ｍｍｏｌ無水物）を１０ｍＬのアセトニトリルに溶解した後、トリエチルアミン（ＴＥＡ）（１５０μＬ、０．１０８８ｇ １．１ｍｍｏｌ）を添加した。ＳＰｙ（５３．６ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、ＰＭＭＡｎの無水物基に対して１５ｍｏｌ％）を５ｍＬの１：１ ＤＭＳＯ：アセトニトリルに溶解し、撹拌溶液に数分間かけて滴下した。反応液をそのまま室温で２４時間混合した後、４Ｌの０．０５Ｍ ＮａＣｌで１日間、その後４Ｌの蒸留水で３日間、液を毎日交換して透析した（Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ、ＭＷＣＯ＝３５００ Ｄａ）。透析した溶液を凍結乾燥し、白色粉末としてＰＭＭ－ＳＰｙ_１０を単離した。Ｄ_２Ｏを用いてＢｒｕｋｅｒ ＡＶ６００ ＮＭＲ分光計で測定した^１Ｈ ＮＭＲにより、ポリマー骨格のメチレンシグナル（δ１．８、２Ｈ）を基準としたＳＰｙのビニルシグナル（δ７．０～８．４、４Ｈ）から官能基化度を求めた。ＰＭＭ－ＳＰｙ_２０およびＰＭＭ－ＳＰｙ_３０も同様の方法で調製した。

ＴＣＥＰによるＰＭＭ－ＳＰｙ_ｘのジスルフィド結合の分解のＮＭＲによる解析。ＳＰｙ中のジスルフィド結合がＴＣＥＰにより還元される速度を定量化するために、ＴＣＥＰ添加前後のＰＭＭ－ＳＰｙ_２０溶液の^１Ｈ－ＮＭＲを取得した。ＮＭＲスペクトルのピリジルピークのモニタリング（図１１）により、最初の測定時点（ＴＣＥＰ添加８分後）より前にＴＣＥＰによる反応性チオールの完全な脱保護が確認された。ピリジル基がポリマー骨格から除去される前は、ピリジル基に由来する幅広いピークが見られた。ＴＣＥＰ添加後は、２－ピリジンチオンの鋭く明確なピークが見られる。

ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ／ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨ／アルギン酸塩複合ビーズ。異なる濃度のＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘを含む１．１２５％ｗ／ｖアルギン酸ナトリウムの溶液を針から押し出し、同軸の環状空気流でせん断された液滴を、ｐＨ７．４の緩衝カルシウムイオンゲル化浴に回収した。Ｃａ^２＋の存在下でのアルギン酸塩のイオン性架橋によりゲル状の足場材が形成され、形成されたアルギン酸カルシウムビーズ内にはＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘが封入されていた。次に、このビーズをＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨを含む溶液と接触させることにより、ＰＥＧ－ジチオールの内部拡散が起こり、ＰＭＭ－ＣＶＳ基とチオール基のマイケル付加反応による共有結合性架橋反応が開始された。ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘのポリアニオン性により、アニオン性ＰＭＭ骨格がＣａ^２＋カチオンと相互作用するため、共有結合性架橋反応の開始前にアルギン酸カルシウムビーズ内にこのポリマーを効率的に封入することができる。

ビーズを、１０００ＤａのＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨを含む溶液（チオール：ＣＶＳ比１：１～４：１）中に２４時間静置した場合、７０ｍＭクエン酸ナトリウムを加えてＣａ^２＋を除去してもビーズは溶解しなかった。ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ／ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨ架橋ビーズは、２つのビーズ組成（膨潤率０として図１２に示す）を除いては、カルシウムキレート化とそれに続くアルギン酸塩液化後も球形を維持していた。クエン酸塩によるカルシウム抽出の１時間後と、その直前のビーズ直径との比を膨潤率とし、ビーズ内の架橋密度の指標として使用した。

図１２に見られるように、ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ／ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨゲルの膨潤率は、官能基化率または架橋剤比には依存しなかった。これに対する２つの例外、ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨとの比が１：１のＰＭＭ－ＣＶＳ_１０およびＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨとの比が１：１のＰＭＭ－ＣＶＳ_３０では十分な架橋が形成されておらず、アルギン酸塩からなる足場材を取り除くと、集合体としてのビーズを維持できなかった。ＰＭＭ－ＣＶＳ_２０でゲルが形成された理由としては、このポリマーで達成可能な架橋密度がＰＭＭ－ＣＶＳ_１０より高く、疎水性がＰＭＭ－ＣＶＳ_３０より低いということが挙げられるが、その一方でＰＭＭ－ＣＶＳ_１０：ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨの比が１：１より大きければ十分な架橋は形成される。

１％ｗ／ｖのＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘを含み、８０００ＤａのＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨ架橋剤と接触させたアルギン酸カルシウムビーズの膨潤率も測定した。ＣＶＳ官能基化率やチオール：ＣＶＳ比の違いに関係なく、作製したカプセルはいずれも、クエン酸塩でＣａ^２＋を除去した後も破損せず、この場合も、カプセルの膨潤率に有意な差は見られなかった（図１３）。

２％ｗ／ｖのＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘを含み、１０００ＤａのＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨ架橋剤を含む溶液と接触させたアルギン酸カルシウムビーズも、ＣＶＳ官能基化率やチオール：ＣＶＳ比の違いに関係なく、作製したカプセルはいずれも、カプセルの完全性を維持していた（図１４）。これらのビーズでは、ＰＭＭ－ＣＶＳ_１０ビーズよりＰＭＭ－ＣＶＳ_２０およびＰＭＭ－ＣＶＳ_３０ビーズの膨潤率が低かった。チオール：ＣＶＳ濃度の比は膨潤率に影響を及ぼさなかった。

全体として、ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ／ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨ／アルギン酸塩ビーズの膨潤率において、ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘの濃度および官能基化度による大きな変化は見られなかった。これは、アルギン酸カルシウムゲル内にＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘが固定されていることに起因するものであり、ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨとの完全な架橋反応が制限されているためと考えられる。

得られたカプセルから、ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘと内部拡散したＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨとの間で速やかなチオール－エン反応が起こることが分かるが、２種類のＰＭＭ系ポリマー、すなわち、ＣＶＳで官能基化されたＰＭＭ系ポリマーと保護されたチオールで官能基化されたＰＭＭ系ポリマーを同時封入することにより、構築されるネットワークをさらに良好に制御することもできる。例えば、同時封入した後、低分子の細胞適合性還元剤との反応で保護されたチオールを脱保護すれば、アルギン酸カルシウムゲルビーズの内部や全体に拡散させることなく、２種類のＰＭＭポリマー間の共有結合性架橋反応を開始させることができる。さらに、アルギン酸カルシウムゲルのナノメートルサイズの細孔内に２種類の反応性ＰＭＭポリマーを同時に固定できることから、それらの濃度が局所的に増加するため、同様のバルクチオール－エン架橋反応より、架橋速度と架橋効率が上昇するはずである。

ゲル化および架橋の同時進行により作製されるＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ／ＰＭＭ－ＳＰｙ_ｘ／アルギン酸塩複合ビーズの最適化（Ａ）。１％ｗ／ｖのＰＭＭ－ＣＶＳ_２０－ｒ、１％のＰＭＭ－ＳＰｙ_２０および１．１２５％のアルギン酸ナトリウム溶液の液滴を、ＴＣＥＰを含むＨＥＰＥＳ緩衝ゲル化浴でゲル化した。ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘとＰＭＭ－ＳＰｙ_ｘとの間の共有結合性架橋反応は、ＳＰｙのジスルフィド結合を還元してピリジル保護基を除去することによって促進された。脱保護によりチオール官能基化ＰＭＭが生じたことで、ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘのシステアミンビニルスルホンとのマイケル付加反応が可能になった。ＣａＣｌ_２ゲル化浴のｐＨは、塩基触媒によるマイケル付加反応の促進と生理学的条件の反映の観点から、ｐＨ＝７．４～７．８で維持した。ビーズをＴＣＥＰ溶液中に４分間、１時間、２時間または４時間静置した。次いで、ビーズをゲル化浴で洗浄して残ったＴＣＥＰを除去し、ビーズの直径を計測した。最後に、カルシウムを抽出するためにクエン酸塩で処理し、ビーズの１時間および２４時間の膨潤率を測定した。これとは別に、ＴＣＥＰ含有ゲル化浴で１５分間ゲル化させたビーズを、洗浄してＨＥＰＥＳ緩衝ゲル化浴に４分、１時間、２時間または４時間静置した。このビーズに関しても、１時間および２４時間の膨潤率を測定した（図１５）。

ＴＣＥＰ溶液中に静置した時間、クエン酸塩溶液で処理した時間に関係なく、すべてのビーズで膨潤率に有意な差は見られなかった。これは、ポリマーネットワークにおける共有結合性架橋反応が、ＴＣＥＰとの接触から４分以内に最大になることを示している。上記のＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ／ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨシステムで観察される架橋反応は、ビーズ内へのＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨの拡散と架橋形成に２４時間を要するが、この架橋反応は、それよりもはるかに速い反応である。

ＴＣＥＰの非存在下でゲル化し、その後２４時間保存したＰＭＭ－ＣＶＳ_２０－ｒ／ＰＭＭ－ＳＳＰｙ_２０ビーズは、クエン酸塩によるカルシウム抽出により完全に溶解したことから、ＴＣＥＰによるＳＰｙの脱保護が共有結合性架橋反応に必要であることが分かる。

ゲル化および架橋の同時進行により作製されるＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ／ＰＭＭ－ＳＰｙ_ｘ／アルギン酸塩複合ビーズ（Ｂ）。上記と同様にして、種々の濃度のＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘおよびＰＭＭ－ＳＰｙ_ｘを含む１．１２５％ｗ／ｖのアルギン酸ナトリウム溶液を針から押し出し、同軸空気流でせん断した液滴を、ＴＣＥＰを含むＨＥＰＥＳ緩衝カルシウムイオンゲル化浴に回収した。ＴＣＥＰ含有ＨＥＰＥＳ緩衝ゲル化浴中に１５分間静置した後、ビーズをＨＥＰＥＳ緩衝ゲル化浴で洗浄し、１時間静置した。作製したビーズはクエン酸塩添加後もカプセルの完全性を維持しており、溶液中に散逸する唯一の組成物であった。種々のポリマー濃度および官能基化率で作製したこれらのビーズの膨潤率（図１６）を、Ｎｉｋｏｎ ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ倒立蛍光顕微鏡およびＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ共焦点顕微鏡で撮影した画像を用いて計算した（図１７）。

このシステムでは、１．５％ｗ／ｖのポリマー濃度において、カプセルの膨潤率の調整可能性が見られる。ＣＶＳおよびＳＰｙの官能基化率が２０％から３０％に増加すると、膨潤率が大幅に増加する。ＣＶＳ官能基化ＰＭＭの疎水性により、カプセル内のＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘとアルギン酸塩間のナノ相分離が促進されると考えられる。相分離が進むと、ＰＭＭ－ＣＶＳ_３０およびＰＭＭ－ＳＰｙ_３０の高濃度領域の架橋密度は増加するが、ポリマーが豊富な領域間の全体的な架橋効率は低下する。

ゲル化および架橋の連続進行により作製されるＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ／ＰＭＭ－ＳＰｙ_ｘ／アルギン酸塩複合ビーズ。ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（８００μＬ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）に溶解したアルギン酸ナトリウム（１．２％ｗ／ｖ）の溶液を、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水に溶解したＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ（５～１５ｍｇ、０．５～１．５％ｗ／ｖ）とＰＭＭ－ＳＰｙ_ｙ（５～１５ｍｇ、０．５～１．５％ｗ／ｖ）を含む溶液２００μＬに加えて、最終濃度１％ｗ／ｖのアルギン酸ナトリウム、１％ｗ／ｖのＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘおよび１％ｗ／ｖのＰＭＭ－ＳＰｙ_ｙを含む溶液とした。この溶液を軽くボルテックスして完全に混合した後、２７ゲージの針を通して押し出し、流速０．５ｍＬ／分に設定したシリンジポンプを用いて空気せん断した液滴を、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．４５％ｗ／ｖ（７７ｍＭ）ＮａＣｌおよび１．１％ｗ／ｖ（１００ｍＭ）ＣａＣｌ_２を含む５０ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝ゲル化浴（ｐＨ７．４）に滴下した。形成したビーズを含む高密度懸濁液（約１ｍＬ）を回収し、ゲル化浴を取り除き、ＴＣＥＰ（ＳＰｙ単位に対して２０倍モル過剰、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．４５％ｗ／ｖ（７７ｍＭ）ＮａＣｌ、１．１％ｗ／ｖ（１００ｍＭ）ＣａＣｌ_２、ｐＨ７．４）を含むゲル化浴に交換した。各種ポリマー導入量に対応するＴＣＥＰの使用量は、表３にまとめて示す。ＴＣＥＰ溶液中に１０分間静置した後、上清を除去し、ビーズを５ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝ゲル化浴で１回すすぎ、続いて生理食塩水で２回洗浄し、３７℃の生理食塩水中で保存した。正立光学顕微鏡で５倍の対物レンズを使用して明視野観察を行い、ビーズの直径を測定したところ（ｎ＝２０）、比較的一定であった。

ビーズ架橋に対するＴＣＥＰ濃度および接触時間の影響。１％ｗ／ｖアルギン酸塩、１％ｗ／ｖＰＭＭ－ＣＶＳ_２０および１％ｗ／ｖＰＭＭ－ＳＰｙ_２０で構成されるビーズを、上記した標準手順により調製した。押し出しが完了してから１０分後にゲル化浴を取り除き、ＴＣＥＰを含むＨＥＰＥＳ緩衝ゲル化浴（５０ｍＬのゲル化浴中に、ＳＰｙ単位に対して１０、２０、３０、４０、５０倍モル過剰のＴＣＥＰを含む：表４にまとめて示す）に交換した。所定の時間が経過した時点で、ＴＣＥＰゲル化浴から０．１ｍＬのビーズを取り出し、１ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝ゲル化浴で１回、１ｍＬの生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）で２回すすいだ。明視野に設定した顕微鏡下でビーズの直径を測定した（ｎ＝２０）。その後、上清を除去し、１ｍＬのクエン酸ナトリウム（７０ｍＭ）に交換し、３７℃で１時間インキュベートした。クエン酸塩で抽出した後のビーズの直径を測定し（ｎ＝２０）、この直径の比率から膨潤度を求めた。ＴＣＥＰに接触させていないコントロールビーズも、１ｍＬ ＨＥＰＥＳ緩衝ゲル化浴で１回、１ｍＬ生理食塩水で２回すすぎ、インキュベートした後、クエン酸ナトリウムで処理した。

ＴＣＥＰが１０倍過剰の場合、接触時間により膨潤率に有意差が生じ、ビーズとＴＣＥＰとの接触時間が長くなると、膨潤率が減少することが明らかとなった。２０倍過剰のＴＣＥＰの場合、ビーズとＴＣＥＰ溶液との接触時間に関係なく、膨潤率はほぼ同じであったことから、この濃度では、ＴＣＥＰによってジスルフィド結合が速やかに還元され、共有結合性架橋反応が進行したことが示唆される。ＴＣＥＰ濃度が３０～５０倍過剰になると、ビーズの膨潤度はさらに増加し、ＴＣＥＰとの接触時間の増加とともに増加した。これらの知見に基づき、ビーズの架橋に用いるＴＣＥＰの濃度として、ジスルフィドの開裂が１０分以内に完了する２０倍モル過剰を選択した。これにより、ビーズとＴＣＥＰ溶液との接触時間を短縮することができる。

クエン酸ナトリウムを使用した共有結合性架橋効率の測定。１％のアルギン酸塩と様々な導入率のＰＭＭ－ＣＶＳ／ＳＰｙとで構成されるビーズを、上記と同様にして調製し、２０倍過剰のＴＣＥＰで１０分間処理した。次に、ＴＣＥＰ上清を除去し、ビーズを５ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝ゲル化浴で１回すすぎ、続いて１０ｍＬの生理食塩水で２回すすいだ。透過光モードの顕微鏡下でビーズの直径を測定した（ｎ＝２０）。次に、約３００個のビーズをガラスバイアルに入れ、上清を除去した。ビーズを１ｍＬのクエン酸ナトリウムですすいだ後、これを除去して３ｍＬの新鮮なクエン酸ナトリウムに交換した。ビーズを４時間穏やかに撹拌した後、透過光モードに設定した顕微鏡または共焦点顕微鏡のもとで観察と測定を行った（ｎ＝２０）。

０．５％ＰＭＭ－ＣＶＳ_１０／ＳＰｙ_１０で構成されたビーズは、カルシウムキレート化に耐えられなかったことから、十分な共有結合性架橋反応が起こるのに必要な十分な官能基が存在していなかったことが示唆された。１．０％および１．５％ｗ／ｖのＰＭＭ－ＣＶＳ_１０／ＳＰｙ_１０で構成されたビーズは完全には溶解しなかったが、大幅に膨潤し、多くのビーズが破損した。０．５、１．０および１．５％ｗ／ｖのＰＭＭ－ＣＶＳ_２０／ＳＰｙ_２０で構成されたビーズはいずれも、クエン酸塩で処理した後も破損しなかったが、０．５％ｗ／ｖのビーズは弱くなり、変形しやすくなった。ＰＭＭ－ＣＶＳ_３０／ＳＰｙ_３０では、３つの組成物はいずれも破損せず、１．０％および１．５％ｗ／ｖのビーズで見られる不透明度はクエン酸塩処理後に低下したが、これはおそらく電荷遮蔽の減少と膨潤率の増加によるものと考えられる。

蛍光標識デキストランを用いて評価したビーズの平衡透過性。ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ／ＳＰｙ_ｙビーズの透過性を、様々な分子量（１０ｋＤａ、７０ｋＤａ、２５０ｋＤａ、５００ｋＤａ）の蛍光標識デキストランを用いて評価した。上記と同様にしてビーズを調製し、３７℃で２４時間インキュベートして、共有結合性架橋反応を完了させた。約１５０μＬの濃縮ビーズ懸濁液を、２ｍＬのコニカルバイアルに移した。この懸濁液に１ｍＬのクエン酸ナトリウム（７０ｍＭ）を加え、バイアルを穏やかに撹拌し、３７℃で２４時間保存して、アルギン酸カルシウムテンプレート（足場）を完全に液化させた。バイアルから約５０個のビーズを取り出し、９６ウェルプレートのウェルに入れ、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水に溶解した蛍光標識デキストラン（０．０５％ｗ／ｖ）１００μＬを加えた。ビーズを３７℃で２４時間インキュベートした。その後、ビーズをＮｉｋｏｎ共焦点顕微鏡下で撮影し、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（Ｎｉｋｏｎ）ソフトウェアを用いて、ビーズのほぼ中心の２５％の蛍光強度（ｎ＝４）とビーズ周囲の蛍光溶液の蛍光強度（ｎ＝４）を測定し、比率を求めた。

結果－ビーズの透過性測定のための蛍光標識デキストランの内部拡散。ヒドロゲルビーズは半透膜として機能し、カプセル化された細胞を保護する。ビーズは、酸素および栄養素の内部拡散を可能にし、インスリンなどの治療薬の周囲環境への外部拡散を可能にするものでなければならない。また、ビーズは、抗体およびサイトカインを排除することにより、カプセル化された細胞を免疫攻撃から防御するものでなければならない。０．５％ｗ／ｖのＰＭＭ－ＣＶＳ_１０／ＳＰｙ_１０で構成されたビーズは架橋形成が不十分で、クエン酸塩処理に耐えることができなかった。１．０％および１．５％ｗ／ｖのＰＭＭ－ＣＶＳ_１０／ＳＰｙ_１０で構成されたビーズは弱く、一部が破損した。壊れたビーズは透過性の測定には使用しなかった。ポリマー導入率は、官能基化率よりもビーズの多孔性に大きな影響を与えることが分かった。これは、膨潤率が導入率の関数であり、官能基化率の関数ではないことを示す膨潤率のデータと一致しており、多孔性が膨潤率の関数であると理解できる。ＰＭＭ－ＣＶＳ_１０／ＳＰｙ_１０およびＰＭＭ－ＣＶＳ_２０／ＳＰｙ_２０で構成されたビーズは、標準的なアルギン酸塩ビーズと同等の透過性を示すことから、アルギン酸塩からなる足場材の液化後も、反応性ポリマーが同様の多孔性を保持していることが示唆される。１０ｋＤａのデキストラン－ｆでは多量の内部拡散が見られ、ＭＷが増加するにつれてデキストラン－ｆの部分的排除が増加した。０．５％および１．０％のＰＭＭ－ＣＶＳ_３０／ＳＰｙ_３０で構成されたビーズも、アルギン酸塩ビーズと同等の多孔性を有していた。しかし、ポリマー導入量が１．５％の場合は、デキストランｆの部分的排除が確認された。これは、おそらくポリマーからなる足場材が幾分か疎水性であることによるものと考えられる。

蛍光標識デキストランを用いて評価したビーズの速度論的透過性。１％ｗ／ｖのアルギン酸塩および１．０％ｗ／ｖのＰＭＭ－ＣＶＳ_２０／ＳＰｙ_２０で構成されたビーズを上記と同様にクエン酸ナトリウムで処理して、アルギン酸塩からなる足場材を液化した。次いで、クエン酸溶液からビーズを５０個ずつ４回に分けて取り出し、９６ウェルプレートの４つのウェルに入れ、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水に溶解した蛍光標識デキストラン（０．０５％ｗ／ｖ；１０ｋＤａ、７０ｋＤａ、２５０ｋＤａ、５００ｋＤａ）を１ウェルあたり１００μＬ加えた。所定の時間にＮｉｋｏｎ共焦点顕微鏡下でビーズを撮影し、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（Ｎｉｋｏｎ）ソフトウェアを用いて、ビーズのほぼ中心の２５％の蛍光強度（ｎ＝４）とビーズ周囲の蛍光溶液の蛍光強度（ｎ＝４）を測定し、比率を求めた。

結果－速度論的透過性評価。速度論的透過性試験により、様々な分子量の蛍光標識デキストランの内部拡散速度を測定した。１０ｋＤａのデキストラン－ｆはビーズ内に速やかに拡散し、２０分以内に平衡に達することが確認された。これにより、酸素やその他の小さな代謝物もマトリックスビーズの内外に速やかに拡散すると考えられる。７０ｋＤａおよび２５０ｋＤａのデキストラン－ｆのビーズ内へ拡散速度はこれより遅く、平衡に達するまで１時間程度かかり、また、５００ｋＤａのデキストラン－ｆの内部拡散速度はさらに遅かった。

ＰＭＭ－ＣＶＳ_２０－ｒ／ＰＭＭ－ＳＰｙ_２０／アルギン酸塩複合ビーズの光退色。ＴＣＥＰ存在下で架橋した１％ｗ／ｖのＰＭＭ－ＣＶＳ_２０－ｒ／ＰＭＭ－ＳＰｙ_２０アルギン酸カルシウムビーズの内部の小さな部分にクエン酸塩処理を施した後、内部領域に選択的な光退色を誘発し（矢印）、その後ビーズを１時間撮影して、ビーズの退色部分の蛍光回復の程度を調べた（図１８）。顕著な蛍光回復が見られれば、ビーズ内部の可溶性ポリマーの存在が確認できる。光退色した内部領域では目立った蛍光回復は起こらなかったことから、蛍光標識ＰＭＭ－ＣＶＳ_２０－ｒはビーズ内部を移動することができず、共有結合性チオール－エン架橋がビーズ全体に広がっていたことが示唆される。

考察
システアミンビニルスルホン（ＣＶＳ）トリフルオロ酢酸塩を合成し、ＣＶＳのアミノ基と無水物との反応によりポリ（メチルビニルエーテル－ａｌｔ－無水マレイン酸）（ＰＭＭＡｎ）を官能基化した。付加したペンダント官能基単位を保持したまま、残存する無水物基をマレイン酸単位に加水分解し、１０、２０、３０ｍｏｌ％ＣＶＳを含むＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘを得た。チオール－エンクリック反応により、ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘとＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨとの間に共有結合性架橋が形成されたバルクヒドロゲルを作製した。これらのゲルの特性、例えば、ヤング率、ゲル化時間、平衡膨潤率などは、ＰＭＭ－ＣＶＳの官能基化率および導入量、ならびにｐＨを変化させることで制御することができる。このようにして得られるヒドロゲルは、脂肪、筋肉および軟骨と同等の弾性係数を有しており、細胞毒性も低い。

ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘとＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨ（Ｍ_ｎ＝１ｋＤａ、８ｋＤａ）またはＰＭＭ－ＳＰｙ_ｘ／ＴＣＥＰとのチオール－エンクリック反応により、イオン性架橋アルギン酸塩ゲル内に共有結合性架橋ヒドロゲルカプセルを作製した。ポリマー濃度および官能基化率を変えても、ほとんどのカプセルが、アルギン酸塩の除去後に構造を維持していた。これらのカプセルの膨潤特性（架橋濃度および細孔径の指標となる）を、イオン性架橋アルギン酸塩からなる一時的な足場材を除去して測定した。作製した各種ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ／ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨ／アルギン酸塩システムを比較したところ、ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨ分子量の増加およびＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ濃度の増加とともに膨潤率の低下が見られた。それぞれ異なる濃度のＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨで架橋したビーズを比較したところ、ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨの濃度間で膨潤率に有意差は見られなかった。

ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ／ＰＭＭ－ＳＰｙ_ｘ／アルギン酸塩システムにおいて高速かつ制御可能な架橋反応を実現することができ、１０倍過剰のＴＣＥＰを含むＨＥＰＥＳ緩衝ゲル化浴中で４分以内にカプセルの架橋密度が最大になることが分かった。１．５％ｗ／ｖのポリマー濃度では、ＣＶＳおよびＳＰｙの官能基化率を変えることによって、膨潤率の調整可能性が見られた。光退色実験では、ビーズ全体に共有結合性架橋の存在が示され、１時間後に蛍光が回復しないことが示された。

以下に結論を述べる。システアミンビニルスルホン（ＣＶＳ）を合成して単離し、ポリ（メチルビニルエーテル－ａｌｔ－無水マレイン酸）と反応させることにより、１０～３０ｍｏｌ％のビニルスルホンを含むＣＶＳ官能基化ポリ（メチルビニルエーテル－ａｌｔ－マレイン酸）（ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘ）ポリマーを生成した。ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘとジチオール架橋剤であるα，ω－ジチオ－ポリ（エチレングリコール）（ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨ）との混合水溶液は、ｐＨ、官能基化度およびポリマー導入量に応じて１０秒～４５分以内にマイケル付加反応によりゲル化する。得られたヒドロゲルは、低分子チオールであるシステアミンの段階的添加により後官能基化してもよい。架橋ゲルサンプルに封入された３Ｔ３線維芽細胞のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ蛍光アッセイにより、作製したヒドロゲルの細胞毒性が低いことが明らかとなった。さらに、Ｓ－（２－アミノエチルチオ）－２－チオピリジン（ＳＰｙ）を合成して単離し、ＰＭＭと反応させることにより、１０～３０ｍｏｌ％のピリジン保護チオールを含むＰＭＭ－ＳＰｙ_ｘを生成した。ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘを含むアルギン酸ナトリウム溶液を塩化カルシウムゲル化浴中に押し出し、ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨと接触させることにより架橋反応が起こる。ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘおよびＰＭＭ－ＳＰｙ_ｘの両方を含むアルギン酸ナトリウムは、ＳＰｙ脱保護剤のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンをさらに含む塩化カルシウムゲル化浴中でゲル化する。ＰＭＭ－ＣＶＳ_ｘと、ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨおよびＰＭＭ－ＳＰｙ_ｘ／ＴＣＥＰとを、ポリマー導入量を１～２重量％として組み合わせることにより、複合架橋アルギン酸カルシウム／ポリマービーズが形成される。ＣＶＳとチオール基とのチオール－エンマイケル付加反応により、アルギン酸塩液化後もカプセルが維持される共有結合性架橋が形成される。

Claims (29)

1. 活性化アルケン基で官能基化された親水性骨格を含み、骨格ポリマーが、ポリアクリル酸またはポリメタクリル酸のホモポリマー；アクリル酸またはメタクリル酸と、アニオン性、非荷電性またはカチオン性のモノマーとのコポリマー；アルキルビニルエーテルと酸無水物モノマーとのコポリマー；およびエチレンオキシドオリゴマーのビニルエーテルと酸無水物モノマーとのコポリマーから選択され、かつ、前記活性化アルケン基が、ビニルスルホン基、アクリレート基、メタクリレート基またはアルキニル基である、側鎖官能基化ポリアニオン性骨格ポリマー。
2. 前記骨格ポリマーが、アルキルビニルエーテルと酸無水物モノマーとのコポリマーである、請求項１に記載の側鎖官能基化ポリマー。
3. 前記酸無水物が、マレイン酸、イタコン酸またはシトラコン酸の無水物である、請求項２に記載の側鎖官能基化ポリマー。
4. システアミンビニルスルホンで官能基化されたポリ（メチルビニルエーテル－ａｌｔ－マレイン酸）である、請求項１に記載の側鎖官能基化ポリマー。
5. 親水性骨格ポリマーと、該骨格ポリマーの１０～４５モル％の量の架橋性化合物とを、架橋反応が可能な条件下で組み合わせることを含む、請求項１に記載の側鎖官能基化ポリアニオン性ポリマーの製造方法。
6. 前記架橋性化合物が、２つの活性化アルケン官能基を含む化合物と、アミン末端とチオール末端の間に直鎖状または分岐鎖状のＣ_１－Ｃ_６鎖を含み、任意選択で１以上のヒドロキシル基、エーテル基、またはカルボン酸基を含むチオールアミンとを組み合わせることにより調製される、請求項５に記載の方法。
7. 前記架橋性化合物がシステアミンビニルスルホンまたはシステインビニルスルホンである、請求項５に記載の方法。
8. 請求項１～４のいずれか１項で定義された活性化アルケン基で官能基化された側鎖官能基化骨格ポリマーが、遊離または保護されたチオール含有化合物と架橋を形成した構造を有する架橋ヒドロゲル。
9. 前記チオール含有化合物が、２以上のチオール基を含む極性の水溶性化合物であるか、または保護されたチオール基で官能基化された第２の側鎖官能基化骨格ポリマーである、請求項８に記載の架橋ヒドロゲル。
10. 前記チオール含有化合物が、約２００～１，０００，０００Ｄａの範囲の分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－ジチオールである、請求項９に記載の架橋ヒドロゲル。
11. 前記第２の側鎖官能基化骨格ポリマーが、チオピリジン、ジチオカルバメートまたはチオエステルを含むアミン含有架橋性化合物で官能基化された親水性骨格ポリマーを含む、請求項９に記載の架橋ヒドロゲル。
12. 前記第２の側鎖官能基化骨格ポリマーが、Ｓ－（２－アミノエチルチオ）－２－チオピリジンで官能基化されている、請求項１１に記載の架橋ヒドロゲル。
13. ヒドロゲルマトリックスコアを構成する、請求項８に記載の架橋ヒドロゲル。
14. ヒドロゲルマトリックスシェルを構成する、請求項８に記載の架橋ヒドロゲル。
15. 請求項８に記載の架橋ヒドロゲルが、二価カチオン結合および熱ゲル化によりゲル化可能な水溶性ポリマーマトリックス内に分散された構造を有するヒドロゲルシステム。
16. 前記ポリマーマトリックスが、アルギン酸塩、アガロース、硫酸セルロースおよびそれらの組み合わせから選択される、請求項１５に記載のヒドロゲルシステム。
17. ヒドロゲルシステムの製造方法であって、
    ｉ）請求項１～４のいずれか１項で定義された活性化アルケン基で官能基化された側鎖官能基化骨格ポリマーの水溶液と、アルギン酸塩、アガロース、硫酸セルロースおよびそれらの組み合わせから選択されるポリマーマトリックスとを組み合わせること；ならびに
    ｉｉ）架橋反応可能な条件下で、約２００～１，０００，０００Ｄａの範囲の分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－ジチオールの水溶液を添加すること、
    を含む方法。
18. ヒドロゲルシステムの製造方法であって、
    ｉ）請求項１～４のいずれか１項で定義された活性化アルケン基で官能基化された側鎖官能基化骨格ポリマーと保護されたチオール基で官能基化された第２の側鎖官能基化骨格ポリマーとを含む水溶液と、アルギン酸塩、アガロース、硫酸セルロースおよびそれらの組み合わせから選択されるポリマーマトリックスとを組み合わせること；ならびに
    ｉｉ）得られた溶液に脱保護剤を添加して、前記第２の側鎖官能基化骨格ポリマーのチオール基を露出させること、
    を含む方法。
19. 前記脱保護剤が、ホスフィン、ジチオトレイトール、システアミン、システインおよびアミノ糖から選択される、請求項１８に記載の方法。
20. 前記脱保護剤が、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンまたはトリス（３－ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰＰ）である、請求項１９に記載の方法。
21. システアミンビニルスルホンで官能基化されたポリ（メチルビニルエーテル－ａｌｔ－無水マレイン酸）（ＰＭＭＡ）を含み、システアミンビニルスルホンが、ＰＭＭＡ中に存在する無水物基の５～４０ｍｏｌ％の量で含まれる、請求項１で定義された側鎖官能基化ポリマー。
22. 遊離および保護されたジチオールおよびポリチオールから選択されるマイケルドナーとの架橋反応に適したポリアニオン性の多官能性マイケルアクセプターである、請求項２１に記載の側鎖官能基化ポリマー。
23. ポリ（メチルビニルエーテル－ａｌｔ－無水マレイン酸）と、システアミンビニルスルホントリフルオロアセテートおよびトリエチルアミンとをアセトニトリル中で反応させることを含む、請求項２１に記載の側鎖官能基化ポリマーの調製方法。
24. 請求項２１に記載のポリマーが約０．５～１５重量％含まれる水溶液と、ジチオールポリ（エチレングリコール）またはポリチオールポリ（エチレングリコール）を含む水溶液とを反応させることにより形成される、請求項８で定義された架橋ヒドロゲルであって、該ポリ（エチレングリコール）が、該ポリマー上のシステアミンビニルスルホン基と該ポリ（エチレングリコール）上のチオールとのモル比が１：４～４：１の範囲になるような濃度で存在する架橋ヒドロゲル。
25. Ｓ－（２－アミノエチルチオ）－２－チオピリジンで官能基化されたポリ（メチルビニルエーテル－ａｌｔ－無水マレイン酸）（ＰＭＭＡ）を含み、かつ、Ｓ－（２－アミノエチルチオ）－２－チオピリジンを、ＰＭＭＡ中の無水物基の５～４０ｍｏｌ％の量で含む、保護されたポリチオールポリマーと水溶液中で組み合わせた請求項２１に記載のポリマーを含む、請求項８で定義された架橋ヒドロゲルであって、架橋反応の開始が、トリスカルボキシエチルホスフィンまたはそのナトリウム塩の添加によるものである、架橋ヒドロゲル。
26. ヒドロゲルマトリックスまたはヒドロゲルカプセルに封入された請求項２４に記載の架橋ヒドロゲルを含むヒドロゲルビーズまたはヒドロゲル粒子。
27. 前記ヒドロゲルカプセルがアルギン酸カルシウムからなる、請求項２６に記載のヒドロゲルビーズ。
28. 請求項２６に記載のヒドロゲルビーズの調製方法であって、約１重量％のアルギン酸ナトリウムと、約０．５～２重量％の請求項２１に記載のポリマーおよびＳ－（２－アミノエチルチオ）－２－チオピリジンで官能基化されたポリ（メチルビニルエーテル－ａｌｔ－無水マレイン酸）（ＰＭＭＡ）を含み、かつ、Ｓ－（２－アミノエチルチオ）－２－チオピリジンを、ＰＭＭＡ中の無水物基の５～４０ｍｏｌ％の量で含む、保護されたポリチオールポリマーとを含む溶液を調製すること、２０～１５０ｍＭの塩化カルシウム、塩化ストロンチウムまたは塩化バリウムを含み、任意選択で２０～１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含むゲル化浴に前記溶液を射出して、アルギン酸塩ビーズを形成すること、ならびに前記アルギン酸塩ビーズをトリカルボキシエチルホスフィンと接触させて、前記ポリチオールポリマーの保護されたチオール基を脱保護し、前記ポリマー間の架橋反応を可能にすること、を含む方法。
29. 前記活性化アルケン基の含有量が約１０～３０モル％である、請求項１に記載の側鎖官能基化ポリマー。

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