JP7203385B2 - 抗菌性ポリ（アルキル化イミダゾリウム）塩 - Google Patents

Description

本発明は、ポリ(アルキル化イミダゾリウム)塩化物塩および広範な細菌に対する抗菌剤としてのそれらの使用、ならびに前記ポリマー塩を含む組成物に関する。

本明細書における以前に公開された文献のリストまたは議論は、該文献が最新技術の一部であるか、または一般的な一般知識であるという承認として必ずしも受け取られるべきではない。

治療が困難な多剤耐性病原体の出現と蔓延は、世界の医療システム、研究コミュニティ、臨床医、政府機関および一般の人々にとって大きな懸念事項である。近年、世界保健機関(WHO)は、新しい抗生物質または抗菌剤が緊急に必要とされる細菌のリストを発表している。このリストは、抗菌性医薬に対する世界的な耐性の高まりに対処するためのWHOの取り組みの一環として、新しい抗生物質の研究開発を指導および促進するために作成された。リストの中で最も重要な細菌は、カルバペネム耐性アシネトバクター・バウマニー(CRAB)、カルバペネム耐性シュードモナス・エルギノーサ(CRPA)および拡張スペクトルベータラクタマーゼ(ESBL)産生カルバペネム耐性腸内細菌(CREB)である。ESBL-CREBのいくつかの例として、カルバペネム耐性エシェリキア・コリ、エンテロバクター・アエロゲネス、エンテロバクター・クロアカコンプレックス、肺炎桿菌、クレブシエラ・オキシトカが挙げられる。

抗菌薬の代替クラスは、多剤耐性菌を治療するための有望な候補とみなされる抗菌ペプチド(AMP)である。しかしながら、現在の使用は、哺乳動物細胞に対する高い毒性および/または一般的に高い最小阻害濃度によって制限されることが多い(たとえば、Hancock、R. E.ら、Nat. Biotechnol.、2006. 24、1551-1557を参照)。AMPの例として、ポリミキシンが挙げられ、ポリミキシンは、一般的にグラム陰性菌に対して抗菌選択性を示す環状リポペプチドのグループである。しかしながら、ポリミキシンは、特定のアミノ酸配列を有するため、一般に生産コストが高くなる(Davis、S. D.、Antimicrob. Agents Chemother.、1975、8、50-53)。さらに、コリスチン(ポリミキシンE)の使用は、腎毒性などの負の副作用を引き起こす可能性があるため、他の抗生物質が失敗した場合の最終手段としてのみ使用されると考えられている。

ペプチドに加えて、合成ポリマーは、強力な抗菌効果により消毒剤としても広く応用されているが、それらは一般に、哺乳動物細胞に対してより高い毒性を示す。広く使用されている抗菌性ポリマーのいくつかの例は、ポリヘキサメチレンビグアニド(PHMB)およびポリ(塩化ジアリルジメチルアンモニウム)(PDADMAC)などの第4級アンモニウムポリマーである。報告されている他の有望な抗菌性ポリマーとして：
・第4級アンモニウムポリマー(Liu、S.ら、Biomaterials、2017、127、36-48；King、A.ら、Biomacromolecules、2014、15、456-467)；
・ポリイミダゾリウムポリマー(Zheng、Z.ら、ACS Appl. Mater. Interfaces、2016、8、12684-12692)；
・ポリカーボネート(Nederberg、F.ら、Nat. Chem.、2011、3、409-414；Yang、C.ら、Adv. Healthcare Mater.、2016、5、1272-1281；Chin、W.ら、Macromolecules、2013、46、8797-8807)；
・ポリノルボルネン(Lienkamp、K.ら、J. Am. Chem. Soc.、2008、130、9836-9843；Al-Badri、Z.M.ら、Biomacromolecules、2008、9、2805-2810)；
・キトサン誘導体(Hosseinnejad、M.ら、Int. J. Biol. Macromol.、2016、85、467-475；Li、P.ら、Adv. Mater.、2012、24、4130-4137)；
・ポリメタクリルアミド(Palermo、E. F.ら、Biomacromolecules、2012. 13、1632-1641；Kuroda、K.ら、J. Am. Chem. Soc.、2005、127、4128-4129)；
・他のポリペプチド(Xiong、M.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.、2015. 112、13155-13160；Xi、Y.ら、Biomacromolecules、2016、17、3922-3930)；および
・ポリ(ベータ-ペプチド)(Liu、R.ら、J. Am. Chem. Soc.、2014、136、4410-4418；Mowery、B. P.ら、J. Am. Chem. Soc.、2009、131、9735-9745；Chakraborty、S.ら、J. Am. Chem. Soc.、2014. 136、14530-14535)が挙げられる。

これらのポリマーの大部分は、フリーラジカル重合(FRP)または開環重合によって合成され、その後に官能化が行われる。通常、合成経路には大量の有機溶媒が含まれ、非常に毒性の高い生成物が生成される。さらに、合成は、スケールアップが難しく、このようなポリマーを大量に合成することはできない。

上記を考慮すると、広範囲の微生物に対して高い抗菌活性を示すと同時に、哺乳動物細胞に対して低い毒性を示し、大量生産が容易で安価な新しい抗菌剤が依然として必要である。このような抗菌剤は、細菌感染症用の医薬品として使用される可能性があり、洗浄剤(石鹸、洗剤およびシャンプーなど)、パーソナルケア、衛生製品に有利に組み込むことができる。

発明の概略
本発明を、以下の番号付けされた態様および実施態様に関して、以下に説明する。
1．式(I)：

で示される反復単位を有するポリマー、または式(I)で示される反復単位と式(II)：

で示される反復単位を含むコポリマー、
[式中、
R¹およびR¹⁰は、存在する場合、独立して、C_1-6アルキルを表し；
R²～R⁸およびR¹¹は、それぞれ独立して、HまたはC_1-6アルキルを表し；
R⁹およびR¹²は、それぞれ独立して、CO₂R¹³または、特に、HまたはC_1-6アルキルを表し；
R¹³は、HまたはC_1-6アルキルを表し；
Xは、CR¹⁴R¹⁵、OまたはSを表し；
R¹⁴およびR¹⁵は、独立して、CO₂R¹³または、特に、HまたはC_1-6アルキルを表し；
mは、0～5から選択される数であり；
nは、2～10から選択される数であり；
pは、0～5から選択される数であり；
qは、0～3から選択される数であり；
xは、2～10から選択される数であり；
yは、0～3から選択される数である；
ただし、化合物がコポリマーである場合、式(I)で示される反復単位および式(II)で示される反復単位は同じではない]
およびその溶媒和物。

2．R¹およびR¹⁰が、存在する場合、独立して、C_1-3アルキルを表し；
R²～R⁸およびR¹¹が、それぞれ独立して、Hまたはメチルを表し；
R⁹およびR¹²が、それぞれ独立して、CO₂R¹³または、特に、HまたはC_1-3アルキルを表し；
R¹³が、HまたはC_1-3アルキルを表し；
Xが、CR¹⁴R¹⁵またはOを表し；
R¹⁴およびR¹⁵は、独立して、CO₂R¹³または、特に、HまたはC_1-6アルキルを表し；
mが、0～4から選択される数であり；
nが、2～8から選択される数であり；
pが、0～3から選択される数であり；
qが、0～1から選択される数であり；
xが、2～8から選択される数であり；および
yが、0～1から選択される数である；
条項1に記載のポリマーまたはコポリマー。

3．R²～R⁸およびR¹¹が、それぞれ独立して、Hを表し；
R⁹およびR¹²が、それぞれ独立して、CO₂Hまたは、特に、Hまたはメチルを表し；
Xが、CR¹⁴R¹⁵またはOを表し；
R¹⁴およびR¹⁵が、独立して、CO₂Hまたは、特に、Hまたはメチルを表し；
mが、0～3から選択される数であり；
nが、2～7から選択される数であり；
pが、0～2から選択される数であり；
qおよびyが、0であり；および
xが、2～7から選択される数である；
条項1または条項2に記載のポリマーまたはコポリマー。

4．R²～R⁸およびR¹¹が、それぞれ独立して、Hを表し；
R⁹およびR¹²が、それぞれ独立して、CO₂Hまたは、特に、Hまたはメチルを表し；
Xが、CR¹⁴R¹⁵またはOを表し；
R¹⁴およびR¹⁵が、独立して、CO₂Hまたは、特に、Hまたはメチルを表し；
mが、0～2から選択される数であり；
nが、2～7から選択される数であり；
pが、0～2から選択される数であり；
qおよびyが、0であり；および
xは、2～7から選択される数である；
前記条項のいずれか1つに記載のポリマーまたはコポリマー。

5．数平均分子量が、500～7,000ダルトンである、前記条項のいずれか1つに記載のポリマーまたはコポリマー。

6．ポリマーまたはコポリマーが、式(I)で示される反復単位を有するポリマーである、前記条項のいずれか1つに記載のポリマーまたはコポリマー。

7．R²～R⁸のそれぞれが、Hであり；
R⁹のそれぞれが、CO₂Hまたは、特に、Hまたはメチルを表し；
Xが、CH₂またはOを表し；
mが、0～2から選択される数であり；
nが、2～6から選択される数であり；
pが、0～2から選択される数であり；
qが、0である；
条項6に記載のポリマー。

8．Xが、Oであり、pが、1または2である、前記条項のいずれか1つに記載のポリマーまたはコポリマー。

9．反復単位が、
(i)

(場合により、ポリマーの数平均分子量は、500～2,500ダルトンである)；
(ii)

(場合により、ポリマーの数平均分子量は、500～2,500ダルトンである)；
(iii)

(場合により、ポリマーの数平均分子量は、500～2,500ダルトンである)；
(iv)

(場合により、ポリマーの数平均分子量は、500～2,000ダルトンである)；
(v)

(場合により、ポリマーの数平均分子量は、4,000～5,500ダルトンである)；
(vi)

(場合により、ポリマーの数平均分子量は、4,000～5,000ダルトンである)；および
(vii)

(場合により、ポリマーの数平均分子量は、500～2,000ダルトンである)；
からなる群から選択される、条項1～8のいずれか1つに記載のポリマー。

10．反復単位が、
(i)

(ポリマーの数平均分子量は、500～2,000ダルトンである)；
(ii)

(ポリマーの数平均分子量は、500～2,000ダルトンである)；
(iii)

(ポリマーの数平均分子量は、500～2,000ダルトンである)；
(iv)

(ポリマーの数平均分子量は、500～2,000ダルトンである)；
(v)

(ポリマーの数平均分子量は、4,000～5,500ダルトンである)；および
(vi)

(ポリマーの数平均分子量は、4,000～5,000ダルトンである)；
からなる群から選択される、条項9に記載のポリマー。

11．式(I)および式(II)で示される反復単位が、
(i)式(I)で示される反復単位として、

および式(II)で示される反復単位として、

(場合により、ポリマーの数平均分子量は、1,000～5,000ダルトンである)；ならびに
(ii)式(I)で示される反復単位として、

および式(II)で示される反復単位として、

(場合により、ポリマーの数平均分子量は、1,000～5,000ダルトンである)
からなる群から選択される、条項1～5のいずれか1つに記載のコポリマー。

12．条項1～11のいずれか1つに記載のポリマーまたはコポリマーを含む医薬組成物。

13．医薬としての使用のための、条項1～11のいずれか1つに記載のポリマーまたはコポリマー、あるいは条項12に記載の医薬組成物。

14．有効量の、条項1～11のいずれか1つに記載のポリマーまたはコポリマー、あるいは条項12に記載の医薬組成物を被験者に投与するステップを含む、微生物および/または真菌感染に苦しむ被験者を治療する方法。

15．微生物および/または真菌感染を治療するための医薬の製造における、条項1～11のいずれか1つに記載のポリマーまたはコポリマー、あるいは条項12に記載の医薬組成物の使用。

16．微生物および/または真菌感染の治療における使用のための、条項1～11のいずれか1つに記載のポリマーまたはコポリマー、あるいは条項12に記載の医薬組成物。

17．条項1～11のいずれか1つに記載のポリマーまたはコポリマー；および界面活性剤を含む、抗微生物および/または抗真菌性洗剤組成物。

18．前記組成物が、固体または液体石鹸の形態である、条項17に記載の抗微生物および/または抗真菌性洗剤組成物。

19．前記組成物が、シャンプーの形態である、条項17に記載の抗微生物および/または抗真菌性洗剤組成物。

Debus-Radziszewski反応による、塩酸、ジアミン、ホルムアルデヒドおよびグリオキサールからのPIM 1-7塩化物の合成を示す。 (a) PIM 1；(b) PIM 2；(c) PIM 3；(d) PIM 4；(e) PIM 5；(f) PIM 6；および(g) PIM 7の¹H NMRスペクトル(D₂O中)を示す。 さまざまなマイコバクテリウムにおけるPIM 1塩化物およびポリヘキサメチレンビグアニド(PHMB)の用量反応曲線を示す：(a)カルメット・ゲラン菌(BCG)；(b)マイコバクテリウム・スメグマティス；(c)マイコバクテリウム・アブセサス(ラフ形態型)；および(d)マイコバクテリウム・アブセサス(スムーズ形態型)。 (a-b)PIM 1-7塩化物；および(c)MTTアッセイを使用して3T3線維芽細胞で評価したPIM 1および5塩化物の異なるバッチの毒性。 蛍光プローブとして1-N-フェニルナフチルアミン(NPN)を用いる、(a)EC8739；および(b)PAO1細菌において評価したPIM 1-7塩化物の外膜透過性アッセイを示す。参照としてポリミキシンBを使用した。 蛍光プローブとしてDiSC₃(5)を用いる、(a)MRSA USA300；および(b)EC8739において評価したIM 1-7塩化物の内膜電位アッセイを示す。ポリマーおよびグラミシジン(参照)の濃度は、100 μg/mLであった。 スルホローダミンB-PIM 1およびPIM 5コンジュゲートの合成を示す。 さまざまな濃度のスルホローダミンB-PIM 1コンジュゲートで処理したPAO1のSTED蛍光画像を示す。 さまざまな濃度のスルホローダミンB-PIM 5コンジュゲートで処理したPAO1のSTED蛍光画像を示す。 0.5xMICの濃度のMRSA USA300における(a)PIM 1塩化物および(b)PIM 5塩化物のSTED蛍光画像を示す。 PAO1における(a)PIM 1塩化物および(c)PIM 5塩化物、ならびにMRSA USA300における(b)PIM 1塩化物および(d)PIM 5塩化物の細菌殺傷動態を示す。 MIC未満の濃度のPIM 1塩化物、PIM 5塩化物、オフロキサシン(陽性対照)の存在下での連続継代による黄色ブドウ球菌(スタフィロコッカス・アウレウス)(SA29213)の耐性進化を示す。 さまざまな活性剤および用量の存在下でのPAO1マウス敗血症モデルにおけるマウスの生存率のパーセンテージを示す。感染後0.5時間、4時間、8時間の時点で、異なる試験グループ(5マウス/グループ)に対して、PIM 1塩化物を0.5 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kgの濃度で腹腔内注射により導入した。陽性対照として、コリスチン1 mg/kgを、各投与量でまったく同じ時点で投与した。 さまざまな活性剤および投与量を用いて、(a)PAO1；(b)PAER；および(c)AB-1に感染させたマウス敗血症モデルで使用されたマウスの腹水中の細菌コロニー(CFU)を示す。PIM 1塩化物は、2つの投与計画(感染後1、4、および8時間で2 mg/kgのPIM 1を3回投与するか、または感染後1時間で6 mg/kgを単回投与するかのいずれか)の一方で腹腔内経路を介して投与された。使用した対照抗生物質は、3回投与(感染後1、4、および8時間)で投与された2 mg/kgイミペネムであった。 さまざまな投与処置を用いて、(a)PAO1；(b)PAER；および(c)AB-1に感染させたマウス皮膚感染モデルにおけるマウスの創傷上の細菌コロニーを示す。PIM 1塩化物は、感染後4時間において、1 mg/kg、5 mg/kgおよび10 mg/kgで、感染した創傷に1回投与された。使用された対照抗生物質は、感染後4時間で1回投与される5 mg/kgのイミペネムであった。 異なるジアミンを用いる、PIMコポリマーの合成を示す。

説明
本明細書では、主鎖および疎水性の程度が異なる脂肪族骨格に拘束された電荷を有する一連のカチオン性ポリマー、カチオン性ポリ(アルキル化イミダゾリウム)(PIM)塩化物塩を開示する。これらのPIMは、1ステップのDebus-Radziszewski(DR)反応を使用して、シンプルで安価な出発化学物質(ホルムアルデヒド、グリオキサール、酸、および水)から合成された。驚くべきことに、これらのPIM塩化物塩は、臨床的に重要な一連のESKAPE(エンテロコッカス・フェシウム、黄色ブドウ球菌、肺炎桿菌、アシネトバクター・バウマニー、シュードモナス・エルギノーサ、およびエンテロバクター)の細菌種に対して優れた広域抗菌特性を示す。それらの構造の詳細に関係なく、試験されたPIMは低い溶血を示し、良好な抗菌効能を有するPIMは、ヒト赤血球よりもこれらの病原体に対する選択性が非常に高く(選択性>5,000～10,000)、すなわち、哺乳動物細胞への毒性が低い。対照的に、同じPIM分子の酢酸塩は、哺乳動物細胞に対して有意に高い毒性を示す。さらに、本明細書に開示されているポリマーは、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方に対して活性であることが見いだされている。

「グラム陽性菌」という用語は、ペプチドグリカンを大量に含む細胞壁を有する細菌を示す。グラム陽性菌は、グラム染色プロトコルにおいてクリスタルバイオレットを保持し、ダークブルーまたはバイオレットに染まる傾向によって識別される。

「グラム陰性細菌」という用語は、グラム染色プロトコルにおいてクリスタルバイオレット染色を保持せず、代わりに対比染色、通常サフラニンを保持する、より薄いペプチドグリカン層を有する細菌を示す。グラム陰性菌は、グラム染色プロトコルにおいて赤またはピンクに染まる。

このように、本発明の第1の態様にしたがって、式(I)：

で示される反復単位を有するポリマー、または式(I)で示される反復単位と式(II)：

で示される反復単位を含むコポリマー、
[式中、
R¹およびR¹⁰は、存在する場合、独立して、C_1-6アルキルを表し；
R²～R⁸およびR¹¹は、それぞれ独立して、HまたはC_1-6アルキルを表し；
R⁹およびR¹²は、それぞれ独立して、CO₂R¹³または、特に、HまたはC_1-6アルキルを表し；
R¹³は、HまたはC_1-6アルキルを表し；
Xは、CR¹⁴R¹⁵、OまたはSを表し；
R¹⁴およびR¹⁵は、独立して、CO₂R¹³または、特に、HまたはC_1-6アルキルを表し；
mは、0～5から選択される数であり；
nは、2～10から選択される数であり；
pは、0～5から選択される数であり；
qは、0～3から選択される数であり；
xは、2～10から選択される数であり；
yは、0～3から選択される数である；
ただし、化合物がコポリマーである場合、式(I)で示される反復単位および式(II)で示される反復単位は同じではない]
およびその溶媒和物が提供される。

本明細書における本発明のポリマーまたはコポリマーへの言及(本発明のいかなる態様または実施態様においても)は、そのような化合物自体、そのような化合物の互変異性体、ならびにそのような化合物の薬学的に許容される溶媒和物への言及を包含する。

上述のように、該化合物の溶媒和物およびそれらの塩もまた、本発明のポリマーまたはコポリマーに包含される。好ましい溶媒和物は、本発明の化合物の固体状態構造(たとえば、結晶構造)への非毒性の薬学的に許容される溶媒(以下、溶媒和溶媒と呼ぶ)の分子の取り込みにより形成される溶媒和物である。このような溶媒の例として、水、アルコール(エタノール、イソプロパノールおよびブタノールなど)およびジメチルスルホキシドが挙げられる。溶媒和物は、溶媒和溶媒を含む溶媒または溶媒の混合物で本発明の化合物を再結晶化することにより調製することができる。任意の特定の事例において溶媒和物が形成されたかどうかは、化合物の結晶を、熱重量分析(TGA)、示差走査熱量測定(DSC)およびX線結晶学などのよく知られた標準的な手法を使用して分析することによって決定することができる。

溶媒和物は、化学量論的または非化学量論的溶媒和物でありうる。特に好ましい溶媒和物は、水和物であり、水和物の例として、半水和物、一水和物および二水和物が挙げられる。

溶媒和物およびそれらの作成と特性決定に使用される方法のより詳細な議論については、Brynら、Solid-State Chemistry of Drugs、Second Edition、SSCI, Inc発行、West Lafayette、IN、USA、1999、ISBN 0-967-06710-3を参照。

本発明のポリマーまたはコポリマーは、位置異性体として存在してもよく、互変異性を示してもよい。すべての互変異性体およびそれらの混合物は、本発明の範囲内に含まれる。

本発明のポリマーまたはコポリマーは、1つ以上の不斉炭素原子を含んでいてもよく、したがって、光学異性および/またはジアステレオ異性を示してもよい。ジアステレオマーは、クロマトグラフィーまたは分別結晶化などの従来の手法を使用して分離されうる。さまざまな立体異性体は、従来の、たとえば、分別結晶化またはHPLC、技術を使用して、化合物のラセミ混合物または他の混合物の分離により単離されうる。あるいは、すべて当業者に知られている条件下で、適切な出発物質と、誘導体化(すなわち、動力学的分割などの分割)、たとえば、ホモキラル酸を用い、続いてクロマトグラフィーなどの従来の手段によるか、または適切なキラル試薬またはキラル触媒との反応によるジアステレオマー誘導体の分離により、その後適切な段階で除去されうる「不斉補助剤」との反応により、ラセミ化またはエピマー化を引き起こさない条件下で適切な光学活性出発物質を反応させることにより(すなわち、「キラルプール」法)、所望の光学異性体を作製してもよい。すべての立体異性体およびそれらの混合物は、本発明の範囲内に包含される

本発明の上記の態様における本発明のポリマーまたはコポリマーは、医学的治療の方法に利用することができる。したがって、本発明のさらなる態様によれば、以下が提供される：
(a)薬剤で使用するための本発明のポリマーまたはコポリマー；
(b)微生物および/または真菌感染症の治療に使用するための本発明のポリマーまたはコポリマー；
(c)微生物および/または真菌感染症の治療のための薬剤の製造のための本発明のポリマーまたはコポリマーの使用；および
(d)微生物および/または真菌感染の治療方法(この方法は、本発明のポリマーまたはコポリマーの有効量の投与を含む)。

本明細書で言及されうる実施態様において、本発明のポリマーまたはコポリマーは、微生物感染に関して特に有用でありうる。

「微生物感染」という用語は、対象内または対象上の微生物によって引き起こされる病気または状態を対象とする。微生物感染の例として、マイコバクテリウムに起因する結核、シュードモナス菌などに起因する火傷感染、黄色ブドウ球菌に起因する皮膚感染、シュードモナス菌およびアシネトバクター・バウマニーに起因する創傷感染、および敗血症が挙げられるが、これらに限定されない。「真菌感染症」という用語は、被験者内または被験者上の微生物によって引き起こされるあらゆる疾患または状態を対象とする。微生物感染の例として、足白癬、白癬、酵母感染、およびいんきんたむしが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明のポリマーおよびコポリマーの影響を受けやすい細菌の非限定的なリストには以下が含まれる：アシドサーマス・セルロリティカス、アクチノマイセス・オドントリティカス、アルカリフィルス・メタリレヂゲンス、アルカリフィルス・オレムランジイ、アルスロバクター・アウレッセンス、バチルス・アミロリクエファシエンス、バチルス・クラウシイ、バチルス・ハロデュランス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・プミルス、バチルス・サブティリス、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス、ビフィドバクテリウム・ロンガム、カルディセルロシルプター・サッカロリティカス、カーボキシドサーマス・ハイドロゲノフォルマンス、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキイ、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・セルロリティカム、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・クリュイベリ、クロストリジウム・レプツム、クロストリジウム・ノビイ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、クロストリジウム・テタニ、クロストリジウム・サーモセラム、コリネバクテリウム・ジフテリアエ、コリネバクテリウム・エフィシエンス、コリネバクテリウム・グルタニカム、コリネバクテリウム・ジェイケイウム、コリネバクテリウム・ウレアリティカム、デスルフィトバクテリウム・フラピエリ、デスルホトマクルム・レデュセンス、ユウバクテリウム・ベントリオサム、エキシグオバクテリウム・シビリクム、フィネゴルディア・マグナ、ゲオバチルス・カウストフィルス、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス、ジャニバクター属菌種、キネオコッカス・ラジオトレランス、ラクトバチルス・ファーメンタム、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・イノキュア、リステリア・ウェルシメリー、モーレラ・サーモアセティカ、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・ボビス、マイコバクテリウム・ギルバム、マイコバクテリウム・レプラエ、マイコバクテリウム・パラツベルクローシス、マイコバクテリウム・スメグマティス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・アルセランス、マイコバクテリウム・バンバアレニイ、ノカルディオイデス属菌種、ノカルディア・ファルシニカ、オセアノバチルス・イヘイエンシス、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム、ロドコッカス属菌種、サッカロポリスポラ・エリスラエア、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌種、スタフィロコッカス・アウレウス、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)、スタフィロコッカス・エピデルミディス、メチシリン耐性スタフィロコッカス・エピデルミディス(MRSE)、ストレプトコッカス・アガラクティアエ、ストレプトコッカス・ゴルドニイ、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・オラリス、ストレプトコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・サングイニス、ストレプトコッカス・スイス、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・コエリカラー、サーモアナエロバクター・エタノリカス、サーモアナエロバクター・テングコンゲンシス、およびそれらの組み合わせ。

誤解を避けるために、本発明の文脈において、「治療」という用語は、そのような治療を必要とする患者の治療的または緩和的処置、ならびに関連する病気の状態に影響を受けやすい患者の予防的治療および/または診断への言及を含む。

「患者」および「患者たち」という用語には、哺乳動物(たとえば、ヒト)患者への言及が含まれる。本明細書で使用される「対象」または「患者」という用語は、当技術分野でよく認識されており、イヌ、ネコ、ラット、マウス、サル、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ラクダ、そして最も好ましくはヒトなどの哺乳動物を示すために本明細書で互換的に使用される。いくつかの実施態様では、対象は、治療を必要とする対象または疾患または障害のある対象である。ただし、他の実施態様では、対象は、通常の対象でありうる。この用語は、特定の年齢や性別を示すものではない。したがって、男性であれ女性であれ、成人および新生児の対象は、対象とされることを意図される。

「有効量」という用語は、治療された患者に治療効果を与える(たとえば、疾患を治療または予防するのに十分な)化合物の量を示す。効果は、客観的(すなわち、何らかの試験またはマーカーによって測定可能)または主観的(すなわち、対象が効果の気配を見せるか、または効果を感じる)でありうる。

特に明記しない限り、「アルキル」という用語は、非分枝または分枝の飽和ヒドロカルビルラジカルを示し、これは、置換であっても、非置換であってもよい。「アルキル」という用語がC_1-6アルキルを示す場合、アルキル基は、エチル、プロピル、(たとえば、n-プロピルまたはイソプロピルであってもよい)、ブチル(たとえば、分枝または非分枝ブチル)、ペンチル、またはより好ましくはメチルでありうる。

誤解を避けるために、本発明のポリマーまたはコポリマー中の2つ以上の置換基の同一性が同じ場合、それぞれの置換基の実際の同一性は決して相互依存しない。

言及されうる本発明の実施態様は、
R¹およびR¹⁰が、存在する場合、独立して、C_1-3アルキルを表し；
R²～R⁸およびR¹¹が、それぞれ独立して、Hまたはメチルを表し；
R⁹およびR¹²が、それぞれ独立して、CO₂R¹³または、特に、HまたはC_1-3アルキルを表し；
R¹³が、HまたはC_1-3アルキルを表し；
Xが、CR¹⁴R¹⁵またはOを表し；
R¹⁴およびR¹⁵は、独立して、CO₂R¹³または、特に、HまたはC_1-6アルキルを表し；
mが、0～4から選択される数であり；
nが、2～8から選択される数であり；
pが、0～3から選択される数であり；
qが、0～1から選択される数であり；
xが、2～8から選択される数であり；および
yが、0～1から選択される数である；
本発明のポリマーまたはコポリマーに関連する態様を含む。

言及されうる本発明のさらなる実施態様は、
R¹およびR¹⁰が、存在する場合、独立して、C_1-6アルキルを表し(たとえば、R¹およびR¹⁰が、存在する場合、独立して、C_1-3アルキルを表し)；
R²～R⁸およびR¹¹が、それぞれ独立して、Hを表し；
R⁹およびR¹²が、それぞれ独立して、CO₂Hまたは、特に、Hまたはメチルを表し；
Xが、CR¹⁴R¹⁵またはOを表し；
R¹⁴およびR¹⁵が、独立して、CO₂Hまたは、特に、Hまたはメチルを表し；
mが、0～3から選択される数であり；
nが、2～7から選択される数であり；
pが、0～2から選択される数であり；
qおよびyが、0であり；および
xが、2～7から選択される数である；
本発明のポリマーまたはコポリマーに関連する態様を含む。

言及されうる本発明のさらに別の実施態様は、
R¹およびR¹⁰が、存在する場合、独立して、C_1-6アルキルを表し(たとえば、R¹およびR¹⁰が、存在する場合、独立して、C_1-3アルキルを表し)；
R²～R⁸およびR¹¹が、それぞれ独立して、Hを表し；
R⁹およびR¹²が、それぞれ独立して、CO₂Hまたは、特に、Hまたはメチルを表し；
Xが、CR¹⁴R¹⁵またはOを表し；
R¹⁴およびR¹⁵が、独立して、CO₂Hまたは、特に、Hまたはメチルを表し；
mが、0～3から選択される数であり；
nが、2～7から選択される数であり；
pが、0～2から選択される数であり；
qおよびyが、0であり；および
xが、2～7から選択される数である；
本発明のポリマーまたはコポリマーに関連する態様を含む。

言及されうる本発明のさらに他の別の実施態様は、
R¹およびR¹⁰が、存在する場合、独立して、C_1-6アルキルを表し(たとえば、R¹およびR¹⁰が、存在する場合、独立して、C_1-3アルキルを表し)；
R²～R⁸およびR¹¹が、それぞれ独立して、Hを表し；
R⁹およびR¹²が、それぞれ独立して、CO₂Hまたは、特に、Hまたはメチルを表し；
Xが、CR¹⁴R¹⁵またはOを表し；
R¹⁴およびR¹⁵が、独立して、CO₂Hまたは、特に、Hまたはメチルを表し；
mが、0～2から選択される数であり；
nが、2～7から選択される数であり；
pが、0～2から選択される数であり；
qおよびyが、0であり；および
xが、2～7から選択される数である；
本発明のポリマーまたはコポリマーに関連する態様を含む。

本発明のポリマーおよびコポリマーは、任意の適切な数平均分子量を有しうる。たとえば、本発明のポリマーおよびコポリマーは、500～7,000ダルトン、たとえば、500～5,500ダルトン、たとえば、500～2,500ダルトン(たとえば、500～2,000ダルトン、たとえば、1,000～2,000ダルトン)またはたとえば、4,000～5,500ダルトン(たとえば、4,000～5,000ダルトン)の数平均分子量を有しうる。

言及されうる本発明のさらに他の別の実施態様は、本発明のポリマーが、以下のリスト：
(i)

(場合により、ポリマーの数平均分子量は、500～2,500ダルトン、たとえば、500～2,000ダルトンである)；
(ii)

(場合により、ポリマーの数平均分子量は、500～2,500ダルトン、たとえば、500～2,000ダルトンである)；
(iii)

(場合により、ポリマーの数平均分子量は、500～2,500ダルトン、たとえば、500～2,000ダルトンである)；
(iv)

(場合により、ポリマーの数平均分子量は、500～2,000ダルトンである)；
(v)

(場合により、ポリマーの数平均分子量は、4,000～5,500ダルトンである)；
(vi)

(場合により、ポリマーの数平均分子量は、4,000～5,000ダルトンである)；および
(vii)

(場合により、ポリマーの数平均分子量は、500～2,000ダルトンである)；
から選択される態様を含む。

特定の実施態様では、本発明のポリマーは、上記(i)～(vi)、たとえば、(i)または(ii)から選択されうる。

言及されうる本発明の実施態様は、本発明のコポリマーが、以下のリスト：
(i)式(I)で示される反復単位として、

および
式(II)で示される反復単位として、

(場合により、コポリマーの数平均分子量は、1,000～5,000ダルトンである)；および
(ii)式(I)で示される反復単位として、

および
式(II)で示される反復単位として、

(場合により、コポリマーの数平均分子量は、1,000～5,000ダルトンである)；
から選択される態様を含む。

本明細書において言及されうる本発明の1つの実施態様では、本発明のポリマーまたはコポリマーは、ポリマーであってもよい。

言及されうる本発明のさらなる態様には、本発明のポリマーまたはコポリマーが同位体標識されている態様が含まれる。しかしながら、言及されうる本発明の他の特定の実施態様には、本発明のポリマーまたはコポリマーが同位体標識されていない態様が含まれる。

「同位体標識した」という用語は、本明細書で使用する場合、化合物の1つ以上の位置に非天然同位体(または非天然分布の同位体)が存在する本発明のポリマーまたはコポリマーへの言及を含む。本明細書における「化合物中の1つ以上の位置」への言及は、本発明のポリマーまたはコポリマーの1つ以上の原子を示すことが当業者には理解されるであろう。したがって、「同位体標識した」という用語には、ポリマーまたはコポリマーの1つ以上の位置で同位体的に富化された(isotopically enriched)本発明の化合物への言及が含まれる。

本発明のポリマーまたはコポリマーの同位体標識または富化は、水素、炭素、窒素、酸素、硫黄、フッ素、塩素、臭素および/またはヨウ素のいずれかの放射性または非放射性同位体によるものであってもよい。この点において言及されうる特定の同位体として、 ²H、³H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹³N、¹⁵N、¹⁵O、¹⁷O、¹⁸O、³⁵S、¹⁸F、³⁷CI、⁷⁷Br、⁸²Br and ¹²⁵lが挙げられる。

本発明のポリマーまたはコポリマーが放射性または非放射性同位体で標識または富化されている場合、言及されうる本発明のポリマーまたはコポリマーには、化合物中の少なくとも1つの原子が、問題の原子の放射性または非放射性同位体が天然の放射性または非放射性同位体より少なくとも10％(たとえば、10％～5000％、特に、50％～1000％、およびさらに特に、100％～500％)高いレベルで存在する同位体分布を示すものが含まれる。

上記のように、本発明のポリマーまたはコポリマーは塩化物塩の形態である。驚くべきことに、該塩は酢酸塩よりも効果的であり、驚くべきことに哺乳動物細胞に対する毒性がはるかに低いことも見いだされている。対イオンの変化がこのような大きな効果を生み出すことは予期せぬことである。

上記のように、本発明のポリマーおよびコポリマーは、微生物および真菌感染症の治療に使用することができる。したがって、本発明のポリマーまたはコポリマーおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供される。

本発明のポリマーまたはコポリマーは、任意の適切な経路で投与されうるが、特に、経口、静脈内、筋肉内、皮膚、皮下、経粘膜(たとえば、舌下または頬)、直腸、経皮、鼻、肺(たとえば、気管または気管支)、局所的に、他の非経口経路により、薬学的に許容される剤形の、該化合物を含む医薬製剤の形態で投与されうる。言及されうる特定の投与様式として、経口投与、静脈内投与、皮膚投与、皮下投与、鼻腔内投与、筋肉内投与または腹腔内投与が挙げられる。

本発明のポリマーまたはコポリマーは、一般に、意図される投与経路および標準的な薬務を正当に考慮して選択されうる、薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体と混合した医薬製剤として投与される。そのような薬学的に許容される担体は、活性化合物に対して化学的に不活性である可能性があり、使用条件下で有害な副作用または毒性を有さない可能性がある。適切な医薬製剤は、例えば、Remington The Science and Practice of Pharmacy、19版、Mack Printing Company、Easton、Pennsylvania(1995)に見いだすことができる。非経口投与については、発熱物質を含まず、必要なpH、等張性、および安定性を有する非経口的に許容される水溶液を使用することができる。適切な溶液は、当業者に周知であり、多くの方法が文献に記載されている。薬物送達の方法の簡単なレビューは、たとえば、Langer、Science(1990)249、1527に見いだすこともできる。

あるいは別の方法で、適切な製剤の製造は、当業者が日常的な技術を使用して、および/または標準および/または容認された薬務に従って、日常的に達成されうる。

本発明にしたがって用いられる任意の医薬製剤中の本発明のポリマーまたはコポリマーの量は、治療される状態の重症度、治療される特定の患者、ならびに使用される化合物などのさまざまな因子に依存するであろう。いずれにしても、製剤中の本発明のポリマーまたはコポリマーの量は、当業者によって日常的に決定されうる。

たとえば、錠剤またはカプセル剤などの固形経口組成物は、1～99％(w/w)の活性成分；0～99％(w/w)の希釈剤または充填剤；0～20％(w/w)の崩壊剤；0～5％(w/w)の滑沢剤；0～5％(w/w)の流動補助剤；0～50％(w/w)の造粒剤または結合剤；0～5％(w/w)の抗酸化剤；および0～5％(w/w)の色素を含みうる。放出制御錠剤は、0～90％(w/w)の放出制御ポリマーをさらに含みうる。

非経口製剤(注射用溶液もしくは懸濁液、または輸液用溶液など)は、1～50％(w/w)の活性成分；および50％(w/w)～99％(w/w)の液体または半固体の担体またはビヒクル(たとえば、水などの溶媒)；および0～20％(w/w)の1つ以上の他の賦形剤、たとえば緩衝剤、抗酸化剤、懸濁安定剤、浸透圧調整剤および防腐剤を含みうる。

本発明のポリマーまたはコポリマーは、障害および治療される患者、ならびに投与経路に応じて、それを必要とする患者にさまざまな治療有効用量で投与されうる。

しかしながら、本発明の文脈において、哺乳動物、特にヒトに投与される用量は、妥当な時間枠にわたって哺乳動物の治療反応をもたらすのに十分でなければならない。当業者は、正確な用量および組成および最も適切な送達計画の選択も、とりわけ製剤の薬理学的特性、治療される状態の性質および重症度、およびレシピエントの身体状態および精神的鋭敏さ、ならびに特定の化合物の効力、治療を受ける患者の年齢、症状、体重、性別および反応、ならびに疾患の病期/重症度によって影響されることを認識するであろう。

投与は連続的または断続的(たとえば、ボーラス注射による)でありうる。投与量は、投与のタイミングと頻度によっても決定されうる。経口または非経口投与の場合、投与量は、本発明のポリマーまたはコポリマーの1日あたり約0.01 mg～約1000 mgまで変化しうる。

いずれにしても、医療従事者、または他の当業者は、個々の患者にとって最適な実際の投与量を日常的に決定することができるであろう。上述の投与量は、平均的な症状の例である；もちろん、より高いか、またはより低い投与量範囲に値する個々の場合もありうるが、そのようなものは本発明の範囲内である。

本明細書に記載の本発明の態様(たとえば、上述のポリマーおよびコポリマー、方法および使用)は、本明細書に記載の状態の治療において、該状態の治療などにおいて当該技術分野で知られている類似の化合物、組み合わせ、方法(処置)または使用と比較して、医師や患者にとってより便利でありうる、より効果的でありうる、より毒性が低くありうる、より良い選択性を有する、より広い範囲の活動を有する、彼らはより強力でありうる、より少ない副作用しか起こさない、または他の有用な薬理学的特性を有しうる、という利点を有する。

本発明のポリマーおよびコポリマーは、たとえば、後記の実施例セクションに記載されるように、当業者に周知の技術に従って製造されうる。

本発明の化合物は、従来の技術(たとえば、再結晶、カラムクロマトグラフィー、分取HPLCなど)を使用して、それらの反応混合物から単離されうる。

本発明のポリマーおよびコポリマーは、特に病原性のグラム陽性およびグラム陰性細菌に対して顕著な抗菌作用を示し、したがって、たとえば、コリネバクテリウム・ゼローシス(結膜乾燥症菌)(体臭を引き起こす細菌)などの皮膚細菌叢の細菌に対しても、ならびに酵母およびカビに対しても作用しうる。したがって、それらは、皮膚および粘膜の消毒、外皮の付属器(髪)の消毒にも適しているため、手や傷の消毒にも適している。

上記を考慮すると、本発明のポリマーおよびコポリマーは、パーソナルケア製剤、たとえば、シャンプー、入浴剤、ヘアケア製品、液体および固体石鹸(合成界面活性剤および飽和および/または不飽和脂肪酸ベース)、ローションおよびクリーム、その他の水溶液またはアルコール溶液、たとえば、皮膚の洗浄液中の抗菌性活性成分として使用することができる。

したがって、本発明のポリマーまたはコポリマーおよび界面活性剤を含む抗菌および/または抗真菌洗剤組成物も提供される。組成物は、追加の化粧品的に許容される担体および/またはアジュバントも含みうることが理解されるであろう。前記組成物は、特にシャンプーの形態または固体もしくは液体石鹸の形態でありうるが、上記の他の組成物も企図される(たとえば、他のヘアケア製品、ローションおよびクリームなど)。

洗剤組成物は、0.01～15重量％、たとえば、0.5～10重量％の本発明のポリマーまたはコポリマーを含むことができる。本発明の2つ以上のポリマーおよびコポリマーが、洗剤組成物の一部を形成しうることが理解されるであろう。

洗剤組成物の形態に応じて、本発明のポリマーまたはコポリマーに加えて、それは、さらなる成分、たとえば、金属イオン封鎖剤、着色剤、香油、増粘または固化(稠度調整)剤、皮膚軟化剤、UV吸収剤、皮膚保護剤、抗酸化剤、機械的特性を改善する添加剤、たとえば、ジカルボン酸および/またはC₁₄-C₂₂脂肪酸のAl、Zn、CaおよびMg塩、および任意で防腐剤を含む。

洗剤組成物は、油中水型または水中油型エマルションとして、アルコール製剤またはアルコール含有製剤として、イオン性または非イオン性両親媒性脂質の小胞分散液として、ゲルとして、固体スティックまたはエアゾール製剤としてとして製剤化されうる。

油中水型または水中油型エマルションとして、洗剤組成物は、5～50重量％の油相、5～20重量％の乳化剤、および30～90重量％の水を含んでもよい。油性相は、化粧品製剤に適した任意の油、たとえば、１つ以上の炭化水素油、ワックス、天然油、シリコーン油、脂肪酸エステルまたは脂肪アルコールを含むことができる。好ましいモノまたはポリオールは、エタノール、イソプロパノール、プロピレングリコール、ヘキシレングリコール、グリセロールおよびソルビトールである。

洗剤組成物は、多種多様な製剤中で提供されうる。適切な組成物の例として、スキンケア製剤(たとえば、錠剤形または液体石鹸、合成洗剤または洗浄ペーストの形態の皮膚洗浄およびクレンジング製剤)、入浴剤(たとえば、フォームバス、ミルク、シャワー調剤または固形浴剤などの液体組成物)、シェービング製剤(たとえば、シェービング石鹸、泡立てシェービングクリーム、非泡立てシェービングクリーム、フォームおよびジェル、ドライシェービング用のプレシェーブ製剤、アフターシェーブ剤またはアフターシェーブローション)、美容ヘアトリートメント製剤(たとえば、シャンプーおよびコンディショナーの形態の洗髪剤、ヘアケア製剤、たとえば、プレトリートメント製剤、ヘアトニック、スタイリングクリーム、スタイリングジェル、ポマード、ヘアリンス、 トリートメントパック、集中ヘアトリートメント、整髪製剤、たとえば、パーマネントウェーブ(ホットウェーブ、マイルドウェーブ、コールドウェーブ)のためのヘアウェービング製剤、毛髪矯正用(hair-straightening)製剤、液状ヘアセッティング製剤、ヘアフォーム、ヘアスプレー、脱色製剤；たとえば、過酸化水素溶液、明色化(lightening)シャンプー、脱色クリーム、脱色パウダー、脱色ペーストもしくはオイル、一時的、半永久的もしくは永久的毛髪着色剤、自己酸化型染料含有製剤、または天然の毛髪用着色剤、たとえば、ヘナまたはカモミール)が挙げられるが、これらに限定されない。

抗菌石鹸は、たとえば、以下の組成を有してもよい：
0.01～5重量％の本発明のポリマーまたはコポリマー；
0.3～1重量％の二酸化チタン；
1～10重量％のステアリン酸；および
石鹸ベース、たとえば、獣脂脂肪酸およびココナッツ脂肪酸のナトリウム塩またはグリセロールなどである残りの部分。

シャンプーは、たとえば、以下の組成を有してもよい：
0.01～5重量％の本発明のポリマーまたはコポリマー；
12.0重量％のラウレス-2-硫酸ナトリウム；
4.0重量％のコカミドプロピルベタイン；
3.0重量％のNaCl；および
水で100 従量％にする。

次に、本発明の特定の態様を具体化する非限定的な例を説明する。

実験的
材料および方法
ホルムアルデヒド溶液(37重量％)、グリオキサール溶液(40重量％)およびすべてのジアミンは、Sigma-Aldrichから購入した。酢酸、L-リシン、3-[4,5-ジメチルチアゾイル-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)は、Alfa Aesarから購入した。

使用した細菌は、エシェリキア・コリ(ATCC 8739)、スタフィロコッカス・アウレウス(ATCC 29213)、シュードモナス・エルギノーサ(PAO1)、アシネトバクター・バウマンニイ(ATCC19606)、クレブシエラ・ニューモニアエ(ATCC13883)および薬物耐性スタフィロコッカス・アウレウス菌株MRSA BAA40およびMRSA USA300、エンテロコッカス・フェカーリス(OR1RF)、バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェカーリス(VRE V583)、多剤耐性エシェリキア・コリ(EC958)であり、エンテロバクター・クロアカエ(ATCC13047)はATCCから購入した。カルバペネム耐性(CR)および多剤耐性(MDR)シュードモナス・エルギノーサ(PAER)、CRおよびMDRクレブシエラ・ニューモニアエ、CRおよびMDRアシネトバクター・バウマンニイならびにマイコバクテリウム属菌種の臨床分離株は、Kevin Pethe研究室(南洋理工大学)から入手した。すべてのブロスおよび寒天は、Becton Dickinson(BD)Companyから入手した。

Bruker Avance DPX 300装置を用いてNMRスペクトルを得た。直列の3つのウルトラハイドロゲルカラムおよび酢酸ナトリウム緩衝液(0.5 MのNaOAcおよび0.5 MのAcOH、pH～4.5)を、40℃にて、流速0.5 mL/分の移動相として使用して、2410屈折率検出器(RID)を備えたウォーターズのゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)システムで分子量分布を測定した。システムは、狭い分布のプルラン標準品で較正された。サンプルの蛍光強度を、攪拌機能を備えたLS5 Perkin-Elmerモデル分光蛍光計で記録した。

最小阻害濃度(MIC)
最小阻害濃度(MIC)は、わずかな修正を加えた標準的なブロス希釈法(Wiegand、I.ら、Nat. Protoc.、2008、3、163-175)に従って、測定した。簡単に言えば、細菌株の継代培養物を対数中期まで一晩成長させ、続いて光学濃度(OD)チェックおよび希釈を行い、細菌濃度が5x10⁵ CFU/mLに達するようにした。Mueller Hinton Broth(MHB)培地でのポリマー溶液の2倍連続希釈を96ウェルプレートで実行して、一連の濃度を得た。次に、1つは陽性対照(MHB培地およびポリマーを含まない細菌懸濁液を含む)で、もう1つは陰性対照(滅菌MHB培地のみを含む)である2つのウェルを除き、細菌懸濁液を各ウェルに加えた。37℃のインキュベーターに移す前に、プレートをシェーカーインキュベーターで10分間混合した。プレートを18時間インキュベートした後、OD測定を行った。MIC値は、90％の細菌増殖阻害が観察される最低濃度として記録された。播種菌の濃度を確認するために、寒天プレーティングも行った。

溶血試験
健康なドナーから新鮮なヒト血液を採取し、同じ日に使用した。赤血球を遠心分離により濃縮し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)緩衝液で2回洗浄した後、使用前にPBSで5％ v/vに希釈した。ポリマー溶液の2倍連続希釈を96ウェルプレートで行い、続いて赤血球溶液を添加し、150 rpmで一定に振とうしながら37℃のシェーカー内で1時間インキュベートした。懸濁液を遠心分離し(無傷の赤血球が底部に沈殿した)、80μLの上清を除去し、新しい96ウェルプレートに加えた。次に、サンプルを80μLのPBSと混合し、マイクロプレートリーダーを使用して540 nmにて吸光度を測定した。Triton X-100(PBS緩衝液中1％)を陽性対照に添加し、陰性対照に対してPBS溶液を使用した。溶血の度合いは、次の式を使用して決定された：

溶結パーセンテージを、ポリマー濃度に対してプロットし、線形外挿によりHC₅₀(赤血球の50％が溶解する濃度)を決定した。実験条件ごとに2つの独立したサンプルを測定した。

細胞毒性アッセイ
3T3線維芽細胞株で細胞毒性アッセイを実施した。簡単に言えば、3T3細胞を、10％ウシ胎児血清(FBS)および1％抗生物質(ペニシリン/ストレプトマイシン)を添加したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中、5％ CO₂を供給したインキュベーターで37℃にて培養した。80％コンフルエンスに達した時点で細胞を採取し、血球計を使用して細胞濃度をカウントした。細胞を、96ウェルプレートに1ウェルあたり1x10⁴細胞で播種し、24時間増殖させた。その後、さまざまな濃度のポリマーで細胞を24時間処理した。次いで、細胞生存率を顕微鏡で定性的に評価し、製造者のプロトコルに従ってMTT(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)アッセイで定量した。細胞生存率を、対照(ポリマーで処理されていない細胞)と比較した、ポリマーで処理された細胞集団サイズの比率として表した。データを3回分析し、3回の独立した実験から得た。

IC₅₀(対照に対して細胞集団を50％減少させる濃度)を決定するために、上記のプロトコルを使用して、100 μg/mL～1000 μg/mLの範囲の8つの濃度で各ポリマーを試験し、得られる生存率データを線形回帰し、および/またはシグモイド関数にフィットさせ、内挿してIC₅₀値を取得する。さらなる分析では、プロトコルの残りを維持しながら、8つの濃度の代わりに、2倍に増加した、7.8 μg/mL～2000 μg/mLの範囲の9つの濃度を使用した。

塩化物塩としてのPIM 1-7の合成
イミダゾリウムベースのポリマーの合成の一般的な手順
次の基本手順を使用して、PIM 1-7を調製した。100 mLの丸底フラスコにて、濃塩酸(37重量％、10.0 g、100 mmol)の水溶液を、0℃にてジアミンの水溶液(10 mmolの水中、50 mmol)に滴下した。30分後、ホルムアルデヒド(37重量％水溶液、2.31 g、50 mmol)およびグリオキサール(40重量％水溶液、7.25 g、50 mmol)の混合物を上記の溶液に滴下した。徐々に、溶液の色が無色から黄色に変わった。反応混合物を80℃にてさらに1時間撹拌した。大部分の溶媒と未反応モノマーを除去して、黄色の粘稠油性液体を得、これを水で希釈し、透析バッグ(1 kDaカットオフ)で2日間透析した。

PIM 1塩化物
一般的な手順を使用して、濃塩酸(37重量％、10.0 g、100 mmol)およびジアミノブタン(4.41 g、50 mmol)を、ホルムアルデヒド(37重量％水溶液、2.31 g、50 mmol)およびグリオキサール(40重量％水溶液、7.25 ｇ、50 mmol)で処理して、黄色の粘稠油性液体であるPIM 1を収率93％で得た。¹H NMR(300 MHz、D₂O、25 ℃ [ppm])：δ 8.84(s、1H、イミダゾール-H)、7.50(s、2H、イミダゾール-H)、4.24(m、4H、-CH₂-)、1.91(m、4H、-CH₂-)。

PIM 2塩化物
一般的な手順を使用して、濃塩酸(37重量％、10.0 g、100 mmol)および1,6-ジアミノヘキサン(5.81 g、50 mmol)を、ホルムアルデヒド(37重量％水溶液、2.31 g、50 mmol)およびグリオキサール(40重量％水溶液、7.25 ｇ、50 mmol)で処理して、黄色の粘稠油性液体であるPIM 2を収率94％で得た。¹H NMR(300 MHz、D₂O、25 ℃ [ppm])：δ 8.76(s、1H、イミダゾール-H)、7.47(s、2H、イミダゾール-H)、4.16(t、4H、-CH₂-)、1.85(m、4H、-CH₂-)、1.33(m、4H、-CH₂-)。

PIM 3塩化物
一般的な手順を使用して、濃塩酸(37重量％、10.0 g、100 mmol)および1,8-ジアミノオクタン(7.21 g、50 mmol)を、ホルムアルデヒド(37重量％水溶液、2.31 g、50 mmol)およびグリオキサール(40重量％水溶液、7.25 ｇ、50 mmol)で処理して、黄色の粘稠油性液体であるPIM 3を収率93％で得た。¹H NMR(300 MHz、D₂O、25 ℃ [ppm])：δ 8.76(s、1H、イミダゾール-H)、7.47(s、2H、イミダゾール-H)、4.16(t、4H、-CH₂-)、1.84(m、4H、-CH₂-)、1.28(m、8H、-CH₂-)。

PIM 4塩化物
一般的な手順を使用して、濃塩酸(37重量％、10.0 g、100 mmol)および1,5-ジアミノ-2-メチルペンタンe(5.81 g、50 mmol)を、ホルムアルデヒド(37重量％水溶液、2.31 g、50 mmol)およびグリオキサール(40重量％水溶液、7.25 ｇ、50 mmol)で処理して、黄色の粘稠油性液体であるPIM 4を収率95％で得た。δ 8.82(s、1H、イミダゾール-H)、7.48(s、2H、イミダゾール-H)、4.19(m、2H、-CH₂-)、3.92(m、1H、-CH-)、2.07-1.83(m、4H、-CH₂-)、1,40-1.19(m、2H、-CH₂-)、0.83(s、3H、-CH₃)。

PIM 5塩化物
一般的な手順を使用して、濃塩酸(37重量％、10.0 g、100 mmol)および2,2’-(エチレンジオキシ)ビス(エチルアミン)(7.40 g、50 mmol)を、ホルムアルデヒド(37重量％水溶液、2.31 g、50 mmol)およびグリオキサール(40重量％水溶液、7.25 ｇ、50 mmol)で処理して、黄色の粘稠油性液体であるPIM 5を収率97％で得た。¹H NMR(300 MHz、D₂O、25 ℃ [ppm])：δ 8.86(s、1H、イミダゾール-H)、7.57(s、2H、イミダゾール-H)、4.42(t、4H、-N-CH₂-)、3.90(t、4H、-CH₂-CH₂-O)、3.68(m、4H、-O-CH₂-CH₂-O-)。

PIM 6塩化物
一般的な手順を使用して、濃塩酸(37重量％、10.0 g、100 mmol)および4,7,10-トリオキサ-1,13-トリデカンジアミン(11.0 g、50 mmol)を、ホルムアルデヒド(37重量％水溶液、2.31 g、50 mmol)およびグリオキサール(40重量％水溶液、7.25 ｇ、50 mmol)で処理して、黄色の粘稠油性液体であるPIM 6を収率97％で得た。¹H NMR(300 MHz、D₂O、25 ℃ [ppm])：δ 8.84(s、1H、イミダゾール-H)、7.52(s、2H、イミダゾール-H)、4.30(t、4H、-CH₂-)、3.65(m、8H、-O-CH₂-CH₂-O-)、3.55(t、4H、-CH₂-)、2.15(m、4H、-CH₂-)。

PIM 7塩化物
一般的な手順を使用して、濃塩酸(37重量％、10.0 g、100 mmol)およびL-リシン(7.2 g、50 mmol)を、ホルムアルデヒド(37重量％水溶液、2.31 g、50 mmol)およびグリオキサール(40重量％水溶液、7.25 ｇ、50 mmol)で処理して、黄色の粘稠油性液体であるPIM 7を収率95％で得た。¹H NMR(300 MHz、D₂O、25 ℃ [ppm])：δ 9.11-8.77(m、1H、イミダゾール-H)、7.65-7.46(m、2H、イミダゾール-H)、5.13(m、1H、-CH-)、4.21(m、2H、-CH₂-)、2.32-1.77(m、4H)、1.26(m、2H、
-CH₂-)。

考察
PIM 1-7塩化物は、塩酸、ジアミン、およびホルムアルデヒド(37重量％)とグリオキサール(40重量％)水溶液の混合物から、Debus-Radziszewski反応を介して有機溶媒または不活性ガスを必要とせずに容易に調製された(図1)。重縮合反応は80℃にて効率的に進行し、90分間で原料のジアミンとアルデヒドがほぼ完全に消費された(第1表)。PIM 1-7の¹H NMRスペクトルをD₂O中で記録した。検出されたすべてのピークは、予想される生成物の対応するプロトンに明確に割り当てることができる(図2a-g)。8.75および7.45 ppm付近のピークは、イミダゾリウム環上のプロトンに割り当てられ、カチオン性5員イミダゾリウム環の形成が成功したことが確認された。GPC曲線は、得られたポリマーが、1000～4700Daの範囲の分子量(M_n)と狭い分子量分布(M_w/M_n)(1.13～1.22)を有することを明らかにした。

第1表：塩酸の存在下でのジアミン、ホルムアルデヒドおよびグリオキｓ－ルの重合

^aGPCは、溶離液として0.5 M NaOAcと0.5 M AcOHを含む水で行い、プルラン標準品を使用して較正した。
^bPDI=多分散指数
^cDP=重合度

リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中のPIM 1-7塩化物の粒子サイズおよびゼータ電位
PBS中のポリマーの粒径とゼータ電位値を測定した(第2表)。すべてのPIMの流体力学的サイズは、PBS緩衝液中で、2 nm未満または約2 nmであり、これはポリマーがPBSで凝集せず、個々のポリマー鎖として残っていることを示す。すべてのポリマーは、+1 mV～+15 mVの範囲のゼータ電位で、PBS中で正電荷を示した。PIM 1からPIM 3へのアルキル鎖長の増加に伴い、ゼータ電位のわずかな減少が観察され、これはおそらく、より長いアルキル鎖を持つカチオン性イミダゾリウムの電荷密度の減少によるものである。

第2表：PBS緩衝液中のPIM 1-7の粒子サイズおよびゼータ電位測定値

実験室の細菌株に対するPIM 1-7塩化物の殺菌活性
PIM 1-7塩化物の親水性/疎水性バランスが殺菌活性に及ぼす影響を、上記のMICプロトコルを使用して第3表に示すように調査した。7つのポリマーを、一連のESKAPE細菌(エンテロコッカス・フェシウム、スタフィロコッカス・アウレウス、クレブシエラ・ニューモニアエ、アシネトバクター・バウマンニイ、シュードモナス・エルギノーサ、およびエンテロバクター属菌種)ならびにいくつかの他の細菌で試験した。

PIM 1塩化物は、ESKAPE細菌(たとえば、グラム陽性エンテロコッカス・ファエカリス(OG1RF)およびスタフィロコッカス・アウレウス(ATCC 29213)ならびにグラム陰性クレブシエラ・ニューモニアエ(ATCC 13883およびKPNS-1)、アシネトバクター・バウマンニイ(ATCC 19606)、シュードモナス・エルギノーサ(PAO1、および全感受性PAES-1)、およびエシェリキア・コリ(EC 8739)、ならびにバチルス・サブティリス(ATCC 6633))などの試験したすべての細菌に対して、抗生物質様の低い最小阻害濃度(MIC)(<1～8 μg/mL)を実証した。

PIM 1よりも長いアルキル鎖を持つPIM 2塩化物は、PIM 1よりもわずかに改善された殺菌活性を与えた。これは、以前に報告された抗菌ポリマーシステム(Chin、W.ら、Macromolecules、2013、46、8797-8807；Palermo、E. F.ら、Biomacromolecules、2012、13、1632-1641)と一致している。疎水性の増加は、細菌の膜に挿入するポリマーの能力を高め、したがって、より優れた抗菌特性につながる。

しかしながら、PIM 3のアルキル鎖をさらに増加させても、MIC値は改善されなかった。これは、おそらく、ポリマーの反復単位内の電荷の割合が減少したためであり、結果としてポリマー上の静電荷と細菌との相互作用が減少する。そのため、より長いアルキル鎖スペーサーは静電結合の効率を低下させる可能性がある。

PIM 4塩化物は、PIM 2と同じ数の炭素原子を有するように設計されたが、直鎖アルキル鎖の代わりに分枝メチル基をもつ。それらの能力を比較すると、PIM 4はPIM 2よりも効率が低いことが示されたが、これは、疎水性分枝アルキル基の立体障害による可能性がある。

殺菌効果に対する疎水性の効果を調べるために、PIM 2塩化物と同じ数の炭素原子を含むが、エーテル結合が追加されたPIM 5塩化物が合成された。この相対的に親水性の高いPIM 5(PIM 2と比較して)は、分子量が約2000 Daに保たれた場合に殺菌効果の有意な減少を示した(PIM 5-1；第4表)、これは、PIM 2のそれに非常に近い(第3表)。分子量が4500 Daに増加すると(PIM 5-2；第4表)、PIM 5はより優れた殺菌特性を示した。

同様の効果が、親水性部分が低分子量において不十分な殺菌活性をもたらすPIM 6塩化物でも観察された。PIM 4のメチル基をPIM 7塩化物のカルボキシル基で置換することにより、アルキル基の効果をさらに調査した。この変更により、殺菌効果がほぼ完全に失われ、細菌膜への挿入を促進する疎水性部分の重要性が示された。

第3表：異なる実験室および抗生物質感受性細菌株におけるPIM 1-7塩化物の最小発育阻止濃度(MIC₉₀、μg/mL)。

第4表：さまざまな分子量のPIM 5塩化物のGPCおよびMIC

GPCは、溶離液として0.5 M NaOAcと0.5 M AcOHを含む水で行い、プルラン標準品を使用して較正した。

臨床細菌株に対するPIM 1-7塩化物の殺菌活性
第5表および第6表に示すように、このようなPIMポリマーの臨床適用(特に、広域抗菌薬治療)の可能性を評価するために、PIM 1-7塩化物を、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)、バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェカーリス(VRE V583)、多剤耐性エシェリキア・コリ(EC958)、汎耐性(PAER)およびMDRシュードモナス・エルギノーサ(PAES、PAD25、PAD1およびPAW238)、カルバペネム耐性(CR)クレブシエラ・ニューモニアエおよびCRアシネトバクター・バウマニーなどのさまざまな薬剤耐性株で試験した。

ほとんどのポリマーは、ATCC/実験室菌株と比較して、同様の、または同等の桁での殺傷能力を維持した。PIMは、MRSA、シュードモナス・エルギノーサ(PAO1)およびクレブシエラ・ニューモニアエに対して同様の殺傷能力を保持するが、PIM 1はVRE583に対してわずかに低い効果(同程度の規模であるが)を有した。MICデータは、PIMがグラム陰性菌とグラム陽性菌の両方に対して効果的な広域スペクトルであることを強く示唆する。この性質により、このクラスのポリマーは、グラム陽性菌またはグラム陰性菌のいずれかに対して活性であるが、両方に対してではない、新しく報告された抗菌剤のいくつかよりも優れている(たとえば、Liu、Y.ら、Angew. Chem. Int. Ed. 2017、56、1486-1490；Ling、L. L.ら、Nature、2015、517、455-459；Lam、S. J.ら、Nat. Microbiol.、2016、1、16162を参照)。さらに、PIM 1は、最後の手段の抗菌剤であるコリスチンよりも広範な細菌に匹敵する抗菌効果を示した(Davis、S. D.、Antimicrob. Agents Chemother.、1975、8、50-53；Liu、Y.-Y.ら、Lancet Infect. Dis.、2016、16、161-168)。

第5表：さまざまなグラム陽性臨床細菌株におけるPIM 1-7塩化物の最小発育阻止濃度(MIC₉₀、μg/mL)

第6表：さまざまなグラム陰性臨床細菌株におけるPIM 1-7塩化物の最小発育阻止濃度(MIC₉₀、μg/mL)

さらに、各PIMは、細菌を殺傷するのに効果的に機能すると同時に、哺乳動物細胞に対する毒性が低い(または非毒性)分子量の有効範囲を持っているように見える。これらの重量範囲を、以下の第7表にまとめる。

第7表：PIM 1-7塩化物の分子量の有効範囲

さまざまなマイコバクテリアに対するPIM 1塩化物の殺菌活性
MIC₅₀は、わずかな修正を行って、前述のように決定された。(Nature Communications 1(2010)：57)。簡単に述べると、DI水に溶解した化合物を2倍連続希釈し、Mosquito HTS(TTP LabTech)によって384ウェル透明プレートにスポットし、各化合物の10の希釈物を得た。50μlのマイコバクテリウム・ツベルクローシス培養物(最終OD600が0.02)を各ウェルに加え、アッセイプレートを37℃にて5日間インキュベートした。SpectraMax M2分光光度計を使用してOD600値を記録し、GraphPad Prism 5ソフトウェアを使用してMIC₅₀曲線をプロットした。アッセイ設定では、阻害曲線の直線部分にあるMIC₅₀値は、MIC₉₀よりもロバストで再現性がある。したがって、MIC₅₀値のみを図3a-dに記録する。

哺乳動物細胞に対するPIM 1-7塩化物の溶血特性および毒性
ポリマーの生体適合性は、哺乳動物細胞に対するPIM 1-7塩化物の溶血特性および毒性に基づいて評価された。上記のプロトコルを使用して、50％および10％のヒト赤血球を溶解したポリマーの濃度(それぞれHC₅₀およびHC₁₀)を測定した。注目すべきことに、PIM 1塩化物からPIM 6塩化物までのすべてのポリマーは、10 mg/mLでも溶血しなかった(第8a表および第8b表)。すべての抗菌性PIMの選択性(HC₅₀/MIC)は顕著であり、HC₅₀/MIC値は一部の細菌株で10,000を超えている。ポリマーの疎水性成分が溶血を引き起こすと予想されたが、驚くべきことに、PIM 1-2塩化物およびPIM 4-6塩化物は非溶血性であることが示された。

PIM 1-7塩化物の毒性を、上記で詳細に説明したMTTアッセイを使用して3T3線維芽細胞に対して評価し、結果を第8a表および第8b表ならびに図4のa-cに示す。第8表には、100および200 μg/mLでの試験細胞の細胞生存率も組み込まれている。PIM 1塩化物は、相対的に高いIC₅₀(3T3線維芽細胞の50％を殺傷したポリマー濃度)およびHC₅₀(>10,000 μg/mL)を示した。PIM 3塩化物は、PIM 1塩化物と比較して最も細胞毒性が高いことが示されたが、これは、PIM 3塩化物の主鎖アルキル鎖長の増加による可能性がある。より長い疎水性鎖がカチオン性界面活性剤様イミダゾリウムの膜透過性を高めるため、より長いアルキル鎖長がポリマーの毒性を高めることが知られている(Ranke、J.ら、Ecotoxicol. Environ. Saf.、2004、58、396-404)。一方、PIM 1塩化物は相対的に毒性が低いことが示されており、これは低分子量と哺乳動物細胞への損傷を防ぐ、ポリマーのダングリングのない疎水性アルキルの性質による可能性がある。

ポリマー(PIM 5塩化物およびPIM 6塩化物)の主鎖にエーテル結合を導入すると、抗菌効能をあまり犠牲にすることなく生体適合性も大幅に向上した(細胞への毒性が低い)。これは、PIMの親水性の増加が原因である可能性があり、PIMは細胞膜との相互作用を弱くするため、哺乳動物細胞への毒性が低くなる。

第8a表は、その後、複数の機会で再現された、材料の最初の分析を表し、より代表的なデータを第8b表に示す。

第8a表：ヒト赤血球のPIM1-7塩化物の溶血濃度(HC₅₀)(μg/mL)および3T3線維芽細胞の阻害濃度(HC₅₀)(μg/mL)

第8b表：ヒト赤血球のPIM1-7塩化物の溶血濃度(HC₅₀)(μg/mL)、および3T3線維芽細胞の細胞生存率と阻害濃度(IC₅₀、μg/mL)

細菌におけるPIM 1-7塩化物の外膜透過性
細菌の外膜(OM)の透過化を、プローブとして疎水性1-N-フェニル-ナフチルアミン(NPN)を使用し、ハンコックのプロトコルに若干の変更を加えて調査した(Loh、B.ら、Antimicrob. Agents Chemother.、1984、26、546-551；Hancock、R.ら、Antimicrob. Agents Chemother.、1991、35、1309-1314)。対数期中期の細菌をペレット化し、5 mM HEPES緩衝液(pH = 7.2)に2回再懸濁して、前の培地と栄養分を完全に除去した。ODが0.2である細菌懸濁液を、安定した蛍光強度を得るために、黒色の96ウェル培養プレートのウェルでNPN試薬(HEPES緩衝液で希釈)とともに数分間インキュベートした。各ウェルに、さまざまな濃度のポリマー溶液をすばやく添加し、マルチチャンネルピペットですばやく混合した。Tecanマイクロプレートリーダーを使用して、蛍光強度を記録した。NPNの最終濃度を10 μMに維持し、各ポリマーについて少なくとも6つの濃度を測定した。

ポリマーの死滅メカニズムを、蛍光プローブとして1-N-フェニル-ナフチルアミン(NPN)を用い、上記の細菌外膜(OM)透過性アッセイを使用して検証した。NPNは疎水性で、水性環境では弱い蛍光を発するが、疎水性環境では強い蛍光信号を発する。細菌のOMを透過させる化合物は、NPNの取り込みを促進し、より多くのNPNが疎水性膜内部に分配され、より高い蛍光強度をもたらすことができる(Loh、B.、C. Grant、and R. Hancock、Antimicrob. Agents Chemother.、1984、26、546-551)。PIM塩化物を、2つのグラム陰性菌株、エシェリキア・コリ(EC8739)およびシュードモナス・エルギノーサ(PAO1)に対して試験した(図5a-b)。PIM 1-4塩化物は、MIC濃度付近以上では両方の菌株に対して良好な膜透過性を示したが、サブMIC濃度では不十分になった(図5a-b)。これは、よく研究されている抗生物質であるポリミキシンBと同じ傾向に従う。OMは、膜成分の生合成阻害、物理的損傷、またはリポ多糖類(LPS)の分解などによって乱される可能性がある(Vaara、M.、Microbiol. Rev.、1992、56、395-411)。この場合、PIM 1-4塩化物は、陰イオンLPSに結合してそのOM構造を乱すことができるポリカチオン部分として作用し、NPNの取り込みを促進する。

PIM 5-7塩化物では、濃度依存性の蛍光強度も観察された。ただし、PIM 7の濃度が32 μg/mL以下に低下すると、OMを透過性にする能力がただちにに失われることが注目された。PIM 7塩化物には細菌を殺す活性はないが、OMをかなり透過性にすることができることが注目された。これはおそらく、Mg²⁺およびCa²⁺イオンに結合してLPSを分解し、NPN蛍光プローブの取り込みをもたらす可能性がある主鎖上のペンダントカルボキシル基によるものである。PIM 7主鎖上のカチオン性イミダゾリウム電荷は依然としてLPSに結合できるが、負のカルボキシル基はポリアニオン性LPSを拒絶し、細菌OMに深く浸透するポリマーの能力を低下させる。これにより、LPSの分解が少なくなり、殺菌活性が低下する可能性がある。

細菌上のPIM 1-7塩化物の内膜脱分極
細菌の内膜脱分極に対するポリマーの効果を決定するために、膜電位感受性色素、3,3'-ヨウ化ジプロピルチアジカルボシアニン(DiSC3(5))を、使用した。これは、ハンコックのプロトコルに従って、わずかな修正を加えて実行した(Zhang、L.ら、Antimicrob. Agents Chemother.、2000、44、3317-3321)。中期対数期の細菌細胞を遠心分離によりペレット化し、5mMのHEPESが細胞質および外部K⁺濃度を平衡化するために、100mMのKClで供給される緩衝液中に再懸濁した。ストック細胞懸濁液を、調製されたままの細胞懸濁液を約0.2のODに20倍希釈することにより調製した。次に、DiSC₃(5)溶液を加えて、ストック溶液中に100 nMの濃度のDiSC₃(5)を提供した。2 mLのストック細胞懸濁液を、石英キュベット(光路長1 cm)に入れ、平衡化した後、ポリマー溶液を加えて100 μg/mLのポリマー濃度を提供した。膜電位勾配の破壊による蛍光強度の変化を、Perkin-Elmer LS55モデル蛍光分光計で連続的に記録した。

上記で詳述したDiSC₃(5)蛍光アッセイで、内膜(IM)脱分極を評価した。一般的に、細胞質膜を通過するプロトンの推進力によって生成される電位勾配(-140 mVのΔψ)は安定であるが、イオンに対する膜の不透過性が試験化合物によって損なわれないことを条件とする。これは、DiSC₃(5)を蛍光プローブとして使用して簡単に評価することができる。まず、DiSC₃(5)を細菌懸濁液とともにインキュベートして、電位勾配の大きさに従って細菌IMに吸収させ、その蛍光を自己消光させた。Δψが化合物によって脱分極されると、DiSC₃(5)色素がIMから放出され、蛍光強度が増加する(Zhang、L.ら、Antimicrob. Agents Chemother.、2000、44、3317-3321)。グラム陰性菌の場合、最初に0.2 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を使用してOMを透過処理し、DiSC₃(5)色素をIMに取り込んだ。その後、グラム陽性菌と同様の手順を続けた。

グラム陽性菌MRSA USA300とグラム陰性菌EC8739の両方で、PIM 1-3塩化物はIMを容易に透過性にし、蛍光強度の増加をもたらすことが明らかにされた(図6a-b)。疎水性アルキル鎖の長さが長くなると、Δψを脱分極する能力が高まる。これは、PIM 3塩化物で明らかであり、陽性対照のグラミシジンよりも大きくい、数分以内の蛍光強度の劇的な増加を誘導した。PIM 4塩化物は、PIM 2塩化物(PIM 4と同じ炭素数であるが、直鎖アルキル鎖を有する)と比較して、比較的低いIM破壊を示し、これはそれらの殺菌特性とよく相関する。PIM 5塩化物およびPIM 6塩化物の場合、貧弱なIM破壊は、細菌IMを妨害する能力の低下をもたらす、それらの親水性の増加のためである可能性がある。

スルホローダミンBコンジュゲートPIM 1および5の合成および誘導放出抑制(STED)顕微鏡による細菌との相互作用の評価
ここで使用されるPIM合成スキームは、2A＋B重縮合反応に類似しているため、反応は酸性環境で行われるので、末端基はプロトン化アミンであると予想された。これを確認するために、重水素化DMSO中でのNMRを、PIM 1塩化物を使用して行い、8.36 ppmの明確な新しいピークが得られ、これは、末端アミン塩酸塩に相当する。この末端アミン基を使用して、STEDイメージングのために1つのローダミン誘導体色素分子をPIM 1およびPIM 5にコンジュゲートさせた。

誘導放出抑制(STED)顕微鏡により、ポリマーと微生物の相互作用を直接視覚化するために、図7に示すように、ポリマー鎖のアミン末端をスルホネート基にコンジュゲートさせることにより、スルホローダミンBとPIM 1およびPIM 5のコンジュゲートを合成した。簡単に述べると、PIM 1のDMF溶液に、2.5当量のトリエチルアミン(TEA)を最初に加えて、ポリマー鎖のアミン末端の塩酸を除去した。次に、スルホローダミンB酸塩化物(1.2当量)を上記の溶液に導入し、暗環境で一晩攪拌した。次に、溶液を2日間透析して、塩および残留色素を完全に除去した。これに続いて凍結乾燥を行い、最終的なスルホローダミンB-PIM 1コンジュゲートを得た。スルホローダミンB-PIM 5コンジュゲートの合成は、上記と同様の手順に従う。

視覚化のためのサンプルを調製するために、寒天プレートから単一のコロニーを採取してMHB培地で一晩培養し、続いて、指数増殖期に達するまで継代培養した。細菌をペレット化し、PBSで2回洗浄した後、1x10⁸ CFU/mLの濃度に調整した。次に、これを所望の濃度(すなわち、0.5xMIC、1xMIC、および2xMIC)のスルホローダミンBコンジュゲートポリマーに加え、2時間インキュベートした。次に、標識細菌懸濁液をPBSで1回洗浄した後、4％パラホルムアルデヒドで30分間固定した。次に、細胞をPBSで2回洗浄し、FM1-43FX膜色素とともに氷上で10分間インキュベートした。細胞を再度PBSで2回洗浄した後、STED顕微鏡で画像化する前に、マニキュア液を使用してスライドに密封した。

スルホローダミンB-PIM 1およびPIM 5コンジュゲート(濃度範囲がおよそ0.5x MIC、1x MICおよび2x MIC)で処理および非処理のシュードモナス・エルギノーサ(FM1-43FX膜色素で標識されたPAO1)の蛍光画像を、図8および9に示す。0.5xMICで、スルホローダミンBポリマーコンジュゲートと膜色素の明確な共局在化が観察された。より高い濃度では、PIM 1コンジュゲートは細胞膜を溶解して細胞質に入り、かなりの割合の細胞で細胞質ゾルに実質的に浸透した。このことは、PIM 1が最初に静電相互作用を介して細菌膜に結合し、その後に膜へのさらなる浸透と損傷を引き起こすことを示唆する。

PIM 5コンジュゲートでは、0.5 x MICの低濃度であっても、ポリマーは表面と細菌細胞内の両方に存在することがわかり、細菌膜へのより優れた浸透能力が実証された(図9)。これはおそらく、PAO1の膜脂質との水素結合を促進するPIM 5のエーテル基によるものである。より高い濃度では、ポリマーは膜により大きな損傷を示したため、より多くのコンジュゲートがサイトゾルに侵入した。MRSA USA300による超解像STED顕微鏡検査も実施し(図10)、同様の共局在化効果を観察した。

PAO1およびMRSA USA300細菌におけるPIM 1およびPIM 5塩化物の殺菌速度の評価
最終濃度4x、2x、1x、0.5x MICのPIM 1塩化物およびPIM 5塩化物を、絶えず振とうしながら、指数増殖期のPAO1およびMRSA USA300細胞とともにインキュベートした。懸濁液のアリコートを異なる時点(5、15、30、45、60、90および120分)で採取し、スポットプレーティング法を使用してCFU/mLを決定した。各ポリマー/病原体の組み合わせに対して2つの独立した実験を行った。

図11aおよびcに示すように、細菌殺傷速度は、PIM 1および5塩化物の両方が非常に速い速度でPAO1を殺すことができることを実証した。4xMIC濃度では、PIM 1および5塩化物の両方が5分以内にほとんどすべてのPAO1を除去することができ、これは、そのようなPIMが静菌性ではなく殺菌性であることを示している。PIM 1および5塩化物は、薬剤耐性MRSA USA300をよりゆっくりと殺傷したが、45分未満で99.99％を超える殺傷が観察された(図11bおよびd)。

PIM 1および5塩化物の存在下でのSA29213の耐性進化
連続継代による耐性発現を試験するために、指数期のSA ATCC 29213を異なる濃度のポリマー(2x、1xおよび0.5x MIC)を含む1 mL MHB培地で1x10⁷ CFU/mLに希釈した後、37℃で絶えず振とうしながらインキュベートした(Ling、L.L.ら、Nature、2015、517、455-459)。細菌の増殖を24時間間隔でモニターし、細菌の増殖を可能にする最高濃度(OD₆₀₀>0.2)のポリマーを含んでいる培地からの培養物を、2x、1x、および0.5x MICポリマーを含む新鮮な培地で1：100に希釈した。MIC/MIC_originalの有意に高い値が達成されるまで、耐性を21日間(またはそれ以上)評価した。さまざまな時点での細菌のアリコートをグリセロールに保存し、耐性の発現が観察されるたびにさらなる試験のために-80℃に保った。オフロキサシンを陽性対照として使用した。

耐性の進化は、サブMICレベルのPIM 1塩化物、PIM 5塩化物およびオフロキサシン(陽性対照として)が21日間連続して存在する場合のSA29213の連続継代により決定された(図12)。オフロキサシン対照の場合、耐性は128 MIC倍以上に進化した。PIM 1および5塩化物は、細菌を非特異的に殺傷することができるが、PIM 5塩化物で処理された細菌は10日ですぐに耐性を発現した。一方、PIM 1塩化物で処理した細菌は、10日後にのみ非常に穏やかな耐性を示し、MIC値は低く、臨床用量範囲内であった。細菌が非特異的な殺傷化合物に対する耐性を発現させることが困難であることが知られているので、これは驚くべきことであった。そのため、PIM 1塩化物とPIM 5塩化物は、異なるメカニズムまたはマルチモーダルメカニズムを介して異なる細菌を殺傷すると推定される。

マウス敗血症モデルにおけるPIM 1塩化物のインビボ効能
PIM 1塩化物の優れた細菌殺傷特性および生体適合性を考慮して、マウス敗血症モデルを用いて、このポリマーの治療効能をインビボで試験した(図13)。Balb/c雌性マウス(1週間の隔離とともに7週間)を用いて、PIM 1のPAO1敗血症性ショック保護効能を試験した。PAO1の指数期を採取し、PBSで2回洗浄し、同量のPBSに再懸濁した。敗血症性ショックを誘発するために、3x10⁷ CFUのPAO1を含む300μLの細胞懸濁液を腹腔内注射により各マウスに導入した。マウス(1グループあたり5匹)を、感染後0.5時間、4時間および8時間にて、0.25 mg/kg、0.5 mg/kgおよび1 mg/kg PIM 1の3つの正確なIP投与量で処置した。マウスの陽性対照群と陰性対照群には、同じ時点で、それぞれ1 mg/kgのコリスチンおよび同量のPBSを注射した。マウスの生存率を7日間にわたってモニターした。

陰性対照群のマウスの90％以上がPAO1に感染後24時間以内に死亡した。コリスチンで処理したマウスの生存率は80％であったが、0.5 mg/kgおよび1 mg/kgのPIM 1塩化物で処理したすべてのマウスは、明らかな負の副作用なしに生存した。

別の試験では、PAO1の感染後1時間、4時間、8時間の時点で、マウス(1グループあたり5匹)を、さまざまな用量のPIM 1で処置した。マウスの陽性対照群および陰性対照群に、同じ時点でそれぞれ2 mg/kgのイミペネムおよび同量のPBSを注射した。12時間目に、腹腔内に3.0 mLのPBSを注入することを介して行われる腹膜洗浄により、すべてのマウスを安楽死させ、その後、腹部を1分間マッサージした。その後、約1 mLの腹水を回収し、細菌のCFUの計算、ならびに免疫細胞の定量を行った。細菌負荷を、動物の脾臓、肝臓および腎臓においても評価した。

カルバペネム耐性アシネトバクター・バウマンニイ(CRAB)およびカルバペネム耐性シュードモナス・エルギノーサ(CRPA)敗血症保護モデルについては、同様の手順を慎重に行い、5％ムチンを細菌と一緒に注射して、マウスを免疫不全にした(入院患者と同様の状態がもたらされる)。細菌の量を、一元配置分散分析(ANOVA)およびスチューデントのt検定(Graphpad Prism for Windows、バージョン7)で分析した。治療を行わない感染対照では、動物はすべて瀕死状態であったため、12時間以内に屠殺された。

腹水中のPAO1 CFUの定量化のために、2つの投与計画(2mg/kgのPIM 1塩化物を感染後1、4、8時間にて3回投与、または感染1時間後に6mg/kgの単回投与)のいずれかでPIM 1塩化物を腹腔内経路を介して投与した。使用した対照抗生物質は、イミペネムであり、2mg/kgを3回投与(感染後1、4、および8時間)で投与した。マウスを感染12時間後に安楽死させ、腹水中のPAO1の量を分析した。どちらの処置法でも、PIM 1塩化物は、陰性対照と比較して、腹水中のPAO1細菌集団を5桁減少させた(図14a)。さらに、PIM 1塩化物は、イミペネムと同程度に効果的であることが観察された。

次に、PIM 1塩化物の効能を、インビボ腹膜敗血症モデルを用いてPAER(カルバペネム耐性シュードモナス・エルギノーサ(CRPA)細菌株)に対して試験した。抗生物質対照としてカルバペネム(イミペネムなど)を使用すると、腹水中のCRPA集団の減少は観察されず、マウスは感染後12時間以内に瀕死状態になった(図14b)。PIM 1塩化物では、腹腔内でのCRPAの3.75および5.80桁の優れた細菌クリアランスが、それぞれ6 mg/kg(1回投与)および2 mg/kg(3回投与)を使用して達成された。

PIM 1塩化物の効能を、新しい抗生物質への留意を必要とする重要な細菌であるAB-1(カルバペネム耐性アシネトバクター・バウマニー(CRAB)株)でも試験した。PAERと同様に、陽性対照であるイミペネムは、感染対照と比較して、腹水からのAB-1の除去を示さなかった(図14c)。PIM 1塩化物は、インビボでAB-1を根絶するのに有効であることが示された。イミペネムと同様の投与計画(すなわち、2 mg/kg x 3回投与)の場合、PIM 1塩化物で処置した感染マウスは、腹水において6.46桁の大幅な細菌の減少を示した(図14c)。同様に、単回投与で7.20桁の優れた減少が達成された。

マウス皮膚感染モデルに対するPIM 1塩化物のインビボ効能
局所薬としてのPIM 1塩化物の潜在力も評価した。CRABおよびCRPAは、開放創に関連することが多く、治癒プロセスを劇的に遅くすることが可能である。創傷モデルにおけるPIM 1塩化物の効能を評価するために、細菌を導入する前に、生検パンチを使用して、剃毛したマウスの背中の皮膚の創傷を作成した。10⁶ CFUの細菌(野生型PAO1、CRABまたはCRPA)をピペッティングにより創傷の上部に導入し、ただちにテガダーム(Tegaderm)の層で覆った。4時間目の感染時点で、テガダーム層の下にポリマーまたは抗生物質を注入して抗菌処置を適用し、続いて、別のテガダーム層で傷を覆った。24時間の治療後、中央に傷のある1x1 cmの正方形のマウスの皮膚を採取し、均質化し、続いてプレーティングした。PBSを陰性対照として使用し、イミペネムを陽性対照として使用した。

PIM 1塩化物は、細菌の根絶において低用量でも非常に活性が高かった。PIM 1塩化物を1 mg/kgで1回創傷に直接投与すると、細菌負荷は約99.9％減少した(図15bおよび図15c)。より高い用量は忍容性が高く、CRPA細菌とCRAB細菌の両方に対して強力な抗菌効能を示しました。

これらの結果は、合成ポリマーが敗血症保護モデルおよび局所創傷マウスモデルの両方で、非常に重要なMDRグラム陰性細菌の2つ(CRABとCAPA)に対して効果的(すなわち強力)であることを実証し、このことは、 臨床環境で化合物が有効である可能性が高いことを示す。

アセテート含有PIM 1-7およびコポリマーの合成および特性
アセテート含有PIM 1-7の合成手順は、塩酸の代わりに同じ当量の酢酸を使用したことを除いて、実施例１の手順に従う。反応に使用する酸の選択により、ポリイミダゾリウムの対アニオンが決定される。

アセテート含有コポリマーの合成の手順は、単一のタイプのジアミンの代わりに特定のモルパーセントの2つのジアミンの混合物を使用したことを除いて、実施例１の手順と同様である(図16)。アセテート含有コポリマーを得るために酢酸が使用された。

次いで、アセテート含有PIM 1-7およびコポリマーを、上記のプロトコルを使用して、それぞれ一連の細菌および3T3線維芽細胞において評価されたそれらの殺菌特性および毒性により、特徴決定した(表9)。塩化物含有PIM 1-7(表3-8)と比較して、アセテート含有PIM 1-7は細菌を殺傷する効果が低く、哺乳動物細胞に対してより高い毒性を示したことが明らかである。

第9表：アセテート含有PIMの物理的および生物学的特性

Claims (17)

1. 式(I)：
   

   

   で示される反復単位を有するポリマー、または式(I)で示される反復単位と式(II)：
   

   

   で示される反復単位を含むコポリマー、
   [式中、
   R¹およびR¹⁰は、存在する場合、独立して、C_1-6アルキルを表し；
   R²～R⁸およびR¹¹は、それぞれ独立して、HまたはC_1-6アルキルを表し；
   R⁹は、HまたはC_1-6アルキルを表し；
   R¹²は、H、C_1-6アルキルまたはCO₂R¹³を表し；
   R¹³は、HまたはC_1-6アルキルを表し；
   Xは、CR¹⁴R¹⁵、OまたはSを表し；
   R¹⁴およびR¹⁵は、独立して、CO₂R¹³または、特に、HまたはC_1-6アルキルを表し；
   mは、0～5から選択される数であり；
   nは、2～10から選択される数であり；
   pは、1～5から選択される数であり；
   qは、0～3から選択される数であり；
   xは、2～10から選択される数であり；
   yは、0～3から選択される数であり；
   ポリマーは、鎖末端基として-NH₂または-N=CH₂基を含む；および
   ただし、化合物がコポリマーである場合、式(I)で示される反復単位および式(II)で示される反復単位は同じではない]
   およびその溶媒和物。
2. R¹およびR¹⁰が、存在する場合、独立して、C_1-3アルキルを表し；
   R²～R⁸およびR¹¹が、それぞれ独立して、Hまたはメチルを表し；
   R⁹は、HまたはC_1-6アルキルを表し；
   R¹²は、H、C_1-6アルキルまたはCO₂R¹³を表し；
   R¹³が、HまたはC_1-3アルキルを表し；
   Xが、CR¹⁴R¹⁵またはOを表し；
   R¹⁴およびR¹⁵は、独立して、CO₂R¹³または、特に、HまたはC_1-6アルキルを表し；
   mが、0～4から選択される数であり；
   nが、2～8から選択される数であり；
   pが、1～3から選択される数であり；
   qが、0～1から選択される数であり；
   xが、2～8から選択される数であり；および
   yが、0～1から選択される数である；
   請求項1に記載のポリマーまたはコポリマー。
3. R²～R⁸およびR¹¹が、それぞれ独立して、Hを表し；
   R⁹は、HまたはC_1-6アルキルを表し；
   R¹²は、H、C_1-6アルキルまたはCO₂R¹³を表し；
   Xが、CR¹⁴R¹⁵またはOを表し；
   R¹⁴およびR¹⁵が、独立して、CO₂Hまたは、特に、Hまたはメチルを表し；
   mが、0～3から選択される数であり；
   nが、2～7から選択される数であり；
   pが、1～2から選択される数であり；
   qおよびyが、0であり；および
   xが、2～7から選択される数である；
   請求項1または請求項2に記載のポリマーまたはコポリマー。
4. R²～R⁸およびR¹¹が、それぞれ独立して、Hを表し；
   R⁹は、HまたはC_1-6アルキルを表し；
   R¹²は、H、C_1-6アルキルまたはCO₂R¹³を表し；
   Xが、CR¹⁴R¹⁵またはOを表し；
   R¹⁴およびR¹⁵が、独立して、CO₂Hまたは、特に、Hまたはメチルを表し；
   mが、0～2から選択される数であり；
   nが、2～7から選択される数であり；
   pが、1～2から選択される数であり；
   qおよびyが、0であり；および
   xは、2～7から選択される数である；
   請求項1～3のいずれか1つに記載のポリマーまたはコポリマー。
5. 数平均分子量が、500～7,000ダルトンである、請求項1～4のいずれか1つに記載のポリマーまたはコポリマー。
6. ポリマーまたはコポリマーが、式(I)で示される反復単位を有するポリマーである、請求項1～5のいずれか1つに記載のポリマーまたはコポリマー。
7. R²～R⁸のそれぞれが、Hであり；
   R⁹が、Hまたはメチルを表し；
   Xが、CH₂またはOを表し；
   mが、0～2から選択される数であり；
   nが、2～6から選択される数であり；
   pが、1～2から選択される数であり；
   qが、0である；
   請求項6に記載のポリマー。
8. Xが、Oであり、pが、1または2である、請求項1～7のいずれか1つに記載のポリマーまたはコポリマー。
9. 反復単位が、
   (i)
   

   

   ；
   (ii)
   

   

   ；
   (iii)
   

   

   ；
   (iv)
   

   

   ；
   (v)
   

   

   ；および
   (vi)
   

   

   ；
   からなる群から選択される、請求項1～8のいずれか1つに記載のポリマー。
10. 式(I)および式(II)で示される反復単位が、
    (i)式(I)で示される反復単位として、
    

    

    および式(II)で示される反復単位として、
    

    

    ；ならびに
    (ii)式(I)で示される反復単位として、
    

    

    および式(II)で示される反復単位として、
    

    

    からなる群から選択される、請求項1～5のいずれか1つに記載のコポリマー。
11. 請求項1～10のいずれか1つに記載のポリマーまたはコポリマーを含む医薬組成物。
12. 有効量の、請求項1～10のいずれか1つに記載のポリマーまたはコポリマーを含む、微生物および/または真菌感染を治療するための医薬組成物。
13. 微生物および/または真菌感染を治療するための医薬の製造における、請求項1～10のいずれか1つに記載のポリマーまたはコポリマーの使用。
14. 請求項1～10のいずれか1つに記載のポリマーまたはコポリマー；および界面活性剤を含む、抗微生物および/または抗真菌性洗剤組成物。
15. 前記組成物が、固体または液体石鹸の形態である、請求項14に記載の抗微生物および/または抗真菌性洗剤組成物。
16. 前記組成物が、シャンプーの形態である、請求項15に記載の抗微生物および/または抗真菌性洗剤組成物。
17. (i)反復単位
    

    

    (ポリマーの数平均分子量は、500～2,500ダルトンである)
    を有するポリマー；
    (ii)反復単位
    

    

    (ここで、ポリマーの数平均分子量は、500～2,500ダルトンである)
    を有するポリマー；
    (iii)反復単位
    

    

    (ここで、ポリマーの数平均分子量は、500～2,500ダルトンである)
    を有するポリマー；
    (iv)反復単位
    

    

    (ここで、ポリマーの数平均分子量は、500～2,000ダルトンである)
    を有するポリマー；
    (v)反復単位
    

    

    (ここで、ポリマーの数平均分子量は、4,000～5,500ダルトンである)
    を有するポリマー；
    (vi)反復単位
    

    

    (ここで、ポリマーの数平均分子量は、4,000～5,000ダルトンである)
    を有するポリマー；
    (vii)式(i)および(ii)の反復単位が、
    式(i)の反復単位として
    

    

    および
    式(ii)の反復単位として
    

    

    (ここで、ポリマーの数平均分子量は、1,000～5,000ダルトンである)
    であるコポリマー；ならびに
    (viii)式(i)および(ii)の反復単位が、
    式(i)の反復単位として
    

    

    および
    式(ii)の反復単位として
    

    

    (ここで、ポリマーの数平均分子量は、1,000～5,000ダルトンである)
    であるコポリマー；
    からなる群から選択される、請求項1に記載のポリマーまたはコポリマー。

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