JP7201263B2

JP7201263B2 - Ｃｙｃｌｉｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶

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Publication number: JP7201263B2
Application number: JP2020554017A
Authority: JP
Inventors: 美沙樹 ▲高▼松; 晃 ▲吉▼田; 万里恵松永; 和也石毛
Original assignee: Yamasa Corp
Current assignee: Yamasa Corp
Priority date: 2018-11-01
Filing date: 2019-10-31
Publication date: 2023-01-10
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Description

本発明はアジュバントとして有用な物質になりうると考えられるＣｙｃｌｉｃ－ｄｉ－ＡＭＰのナトリウム塩結晶に関するものである。

Ｃｙｃｌｉｃ－ｄｉ－ＡＭＰ（以下「ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ」と表記）は細菌のセカンドメッセンジャーとして発見された物質である。近年になって本物質は１型インターフェロンを誘発しうることが報告されるなど医薬品としての利用が期待される（非特許文献１）。これまでにｃ－ｄｉ－ＡＭＰの製造方法としては、化学合成法（非特許文献２、３）およびＢａｃｉｌｌｕｓ属やＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属などに由来するジアデニレートシクラーゼを用いた酵素合成法が知られている（非特許文献４、５）。
現在一般的に販売されているｃ－ｄｉ－ＡＭＰは凍結乾燥品であり、また結晶の取得については特許文献1に示す遊離酸結晶についてのみ報告がなされている（特許文献１）。一部には結晶性固体（“ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅｓｏｌｉｄ”）として販売されているものも存在するが、不定形で、かつ、押し潰した際には劈開せずに展延するため、市販の結晶性固体は結晶とは言えなかった（図1）。

国際公開第2015/137469号

Science, 328, 1703-1705(2010) SYNTHESIS, 24, 4230-4236(2006) Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 32, 1-16(2013) Molecular Cell, 30, 167-178(2008) Nagoya J. Med. Sci., 73, 49-57(2011)

ｃ－ｄｉ－ＡＭＰは凍結乾燥品が一般的に知られているが、凍結乾燥品はその製造過程において凍結乾燥機が必要となり、大量生産のためにスケールアップをするにも自ずと限界がある。そこで凍結乾燥機のような特別な装置を使用することなく、かつ簡便に大量に取得できる結晶取得法の開発が望まれていた。

また、本発明者らの検討において、既存のｃ－ｄｉ－ＡＭＰ遊離酸結晶は過酷条件下、たとえば１０５℃条件下において、安定性が低下するという欠点が見出された。

本発明者らは、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰの結晶化に関して鋭意研究を重ねた結果、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰのナトリウム塩結晶を初めて取得し、本発明を完成させた。

本発明者らの検討で、（１）ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液に塩基及び／又は酸を添加し、ｐＨを５．２～１２．０に調整する工程、（２）ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液を測定波長２５７ｎｍにおける吸光度ＯＤ_２５７を５００～２００００とする工程、（３）ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液を３０～７０℃まで加熱する工程、（４）ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液に有機溶媒を添加する工程、（５）ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液を１～３０℃になるまで冷却する工程を経ることで、本発明のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶を取得でき、得られたｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶は、１０５℃の過酷条件下においても極めて安定であることが明らかとなった。さらに、本発明のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶は、既存のｃ－ｄｉ－ＡＭＰ遊離酸結晶と比較して、高い溶解性を示した。

特に、結晶化のためには（１）工程のｐＨが重要で、ｐＨ５．２未満の酸性条件では、結晶化自体が困難であり、仮に結晶を取得できた場合でも収率が低くなることから、好ましいものではない。それに対し、ｐＨが５．２以上の条件では、ナトリウム塩結晶のみを容易に取得することが可能である。したがって、本発明のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶の製造法は、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ塩結晶の大量製造に好適な方法である。

図１は、市販ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ結晶性固体を展延した際の外観写真を示す。図２は、実施例１で得られたｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αの結晶写真を示す。図３は、実施例１で得られたｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αのＸ線回折スペクトルを示す。図４は、実施例１で得られたｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αの赤外線吸収スペクトルを示す。図５は、実施例１で得られたｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αの熱重量測定／示差熱分析結果を示す。図６は、実施例２で得られたｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αの結晶写真を示す。図７は、実施例２で得られたｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αのＸ線回折スペクトルを示す。図８は、実施例２で得られたｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αの赤外線吸収スペクトルを示す。図９は、実施例２で得られたｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αの熱重量測定／示差熱分析結果を示す。図１０は、実施例４で得られたｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶βの結晶写真を示す。図１１は、実施例４で得られたｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶βのＸ線回折スペクトルを示す。図１２は、実施例４で得られたｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶βの赤外線吸収スペクトルを示す。図１３は、実施例４で得られたｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶βの熱重量測定／示差熱分析結果を示す。図１４は、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ遊離酸結晶の結晶写真を示す。図１５は、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ遊離酸結晶のＸ線回折スペクトルを示す。図１６は、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ遊離酸結晶の赤外線吸収スペクトルを示す。図１７は、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ遊離酸結晶の熱重量測定／示差熱分析結果を示す。図１８は、参考例で得られたｃ－ｄｉ－ＡＭＰ遊離酸結晶、実施例１及び実施例２で得られたナトリウム塩結晶α、及び実施例４で得られたナトリウム塩結晶βの過酷条件（１０５℃）下での安定性試験結果を示す。

本発明は、下記の構造式で示されるｃ－ｄｉ－ＡＭＰのナトリウム塩結晶を提供するものである。下記構造式中のＸは、水素原子（Ｈ）又はナトリウム原子（Ｎａ）のいずれかであり、式中にある２つのＸのうち少なくとも一方はナトリウム原子である。

本発明のｃ－ｄｉ－ＡＭＰのナトリウム塩結晶は、調製時のｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液のｐＨに応じて、２つの形態を取り得る。以下においては、調製時のｐＨが６．０～１２．０の範囲であるｃ－ｄｉ－ＡＭＰ結晶を結晶α、調製時のｐＨが５．２～６．０の範囲であるものを結晶βと定義する。

本発明のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αは、原子吸光光度法で分析すると、ナトリウム含量が６．２～６．８％の範囲内となる。このことから、結晶αにおいて、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ１分子に対するナトリウム原子の存在量比は２であることが分かる。

本発明のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αは、柱状結晶として得られる（図２および図６参照）。

また、本発明のナトリウム塩結晶αをＣｕ－Ｋα線を用いた粉末Ｘ線回折装置で分析すると、後述実施例に示すように、回折角（２θ）が、１０．９、２３．９（°）付近に特徴的なピークを示す（図３および図７参照）。

なお一般に、粉末Ｘ線回折における回折角（２θ）は、５％未満の誤差範囲を含む場合があることから、粉末Ｘ線回折におけるピークの回折角が完全に一致する結晶のほか、ピークの回折角が５％未満の誤差で一致する結晶も、本発明のナトリウム塩結晶αに包含される。例えば、粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ）は、１０．９±０．５、２３．９±１．２（°）に特徴的なピークを有する。

本発明のナトリウム塩結晶αは、赤外線吸収スペクトルを測定したとき、３１１８、１６０４、１２２１、１０７４（ｃｍ^-１）付近に特徴的なピークを有する（図４および図８参照）。

なお、赤外線吸収スペクトル測定では、一般に２（ｃｍ^－１）未満の誤差範囲を含む場合があることから、上記数値と赤外線吸収スペクトルにおけるピークの位置が完全に一致する結晶のほか、ピークが２ｃｍ^－１未満の誤差で一致する結晶も、本発明のナトリウム塩結晶αに包含される。例えば、赤外線吸収スペクトルを測定したとき、３１１８±１．９、１６０４±１．９、１２２１±１．９、１０７４±１．９（ｃｍ^-１）に特徴的なピークを有する。

本発明のナトリウム塩結晶αは、熱重量測定／示差熱分析（ＴＧ／ＤＴＡ）装置（昇温速度５℃／分）で分析したとき、２５５℃付近に吸熱ピークを有する（図５および図９参照）。

本発明のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶βは、原子吸光光度法で分析すると、ナトリウム含量が４．７～５．２％の範囲内となる。このことから、結晶βにおいて、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ１分子に対するナトリウム原子の存在量比は１．５であることが分かる。

本発明のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶βは、立方体状結晶として得られる（図１０参照）。

また、本発明のナトリウム塩結晶βをＣｕ－Ｋα線を用いた粉末Ｘ線回折装置で分析すると、後述実施例に示すように、回折角（２θ）が、９．３、２３．６、２４．３（°）付近に特徴的なピークを示す（図１１参照）。

なお一般に、粉末Ｘ線回折における回折角（２θ）は、５％未満の誤差範囲を含む場合があることから、粉末Ｘ線回折におけるピークの回折角が完全に一致する結晶のほか、ピークの回折角が５％未満の誤差で一致する結晶も、本発明のナトリウム塩結晶βに包含される。例えば、粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ）は、９．３±０．５、２３．６±１．２、２４．３±１．２（°）に特徴的なピークを有する。

本発明のナトリウム塩結晶βは、赤外線吸収スペクトルを測定したとき、３１１９、１６０６、１２２２、１０７４（ｃｍ^-１）付近に特徴的なピークを有する（図１２参照）。

なお、赤外線吸収スペクトル測定では、一般に２（ｃｍ^－１）未満の誤差範囲を含む場合があることから、上記数値と赤外線吸収スペクトルにおけるピークの位置が完全に一致する結晶のほか、ピークが２ｃｍ^－１未満の誤差で一致する結晶も、本発明のナトリウム塩結晶βに包含される。例えば、赤外線吸収スペクトルを測定したとき、３１１９±１．９、１６０６±１．９、１２２２±１．９、１０７４±１．９（ｃｍ^-１）に特徴的なピークを有する。

本発明のナトリウム塩結晶βは、熱重量測定／示差熱分析（ＴＧ／ＤＴＡ）装置（昇温速度５℃／分）で分析したとき、２３９℃付近に吸熱ピークを有する（図１３参照）。

本発明のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶は、高速液体クロマトグラフィー法にて純度検定したとき、９７％以上、より好ましくは９９％以上の純度を有する。さらに、本発明のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶は、既存のｃ－ｄｉ－ＡＭＰ遊離酸結晶と比較して、高い溶解性を示す。

次に、本発明のｃ－ｄｉ－ＡＭＰのナトリウム塩結晶の調製法について説明すれば、結晶化に用いるｃ－ｄｉ－ＡＭＰは、酵素合成法や化学合成法など公知の方法によって合成すればよい。合成を行うに当たっては既知の方法に従えばよく、たとえば非特許文献２～５に記載の方法を用いることができる。反応後、反応液中に生成したｃ－ｄｉ－ＡＭＰは、活性炭や逆相クロマトグラフィーなどにより精製することができる。

本発明のナトリウム塩結晶は、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液をｐＨ５．２～１２．０となるよう調整し、有機溶媒を添加することにより、得ることができる。
ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液のｐＨが５．２～６．０である場合には、取得されるナトリウム塩結晶は結晶βとなり、ｐＨが６．０～１２．０である場合には、取得されるナトリウム塩結晶は結晶αとなる。
ｐＨが５．２未満である場合には、高濃度のｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液を調製しようとすると水溶液中に沈殿が生じてしまい、純粋なｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶を取得することが困難となる。沈殿の生成を回避するため、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液の濃度を低濃度とした場合には、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶が全く取得できず、もしくは極微量しか取得できないために、効率的な結晶の製造ができない。結果として、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ塩結晶を工業上利用可能な水準で大量かつ効率的に調製するためには、ｐＨを５．２以上とすることが必須となる。

上記結晶化においては、より高い収率で結晶を得るため、（１）ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液に塩基及び／又は酸を添加し、ｐＨを５．２～１２．０に調整する工程、（２）ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液を測定波長２５７ｎｍにおける吸光度ＯＤ_２５７を５００～２００００とする工程、（３）ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液を３０～７０℃まで加熱する工程、（４）ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液に有機溶媒を添加する工程、（５）ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液を１～３０℃になるまで冷却する工程、を行うことが好ましい。

上記工程（１）におけるｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液のｐＨは、５．２～１２．０の範囲内であればｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶を取得することができるが、高濃度の水溶液の調製が容易であるという観点から、ｐＨは５．４以上であることが好ましく、５．６以上であることが特に好ましい。さらに、結晶を溶解させた際に水溶液のｐＨが中性付近となり利便性が高いことから、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液のｐＨは、好ましくはｐＨ７．０～１１．０であり、より好ましくはｐＨ７．０～１０．０であり、より好ましくはｐＨ７．０～８．５であり、この場合には有機溶媒を添加することによって結晶αが取得される。

上記工程（１）で使用する酸としては、塩酸、硫酸、硝酸を例示することができるが、これらに限定されない。使用する塩基としては、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウムなどを例示することができるが、これらに限定されない。酸又は塩基を急激に添加することによるアモルファス化や急激な結晶析出を防ぐため、添加はゆっくり行うことが好ましい。

上記工程（２）において、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液の測定波長２５７ｎｍにおける吸光度ＯＤ_２５７は、５００以上である場合には有機溶媒の添加によって結晶を取得することができるが、結晶を析出させるために必要な有機溶媒の添加量を低減できることから、１０００以上であることがより好ましく、２０００以上であることがより好ましく、３０００以上であることがより好ましい。一方で、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液が高濃度となる場合には、溶液の粘度が高くなり取扱い性が低下することから、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液の測定波長２５７ｎｍにおける吸光度ＯＤ_２５７は２００００以下であることが好ましく、１５０００以下であることがより好ましく、１００００以下であることがより好ましい。

上記工程（３）においては、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液の温度を３０～７０℃まで加熱する。工程（５）での冷却時と温度差がある程結晶が析出しやすいため、工程（３）での水溶液の温度は４０℃以上であることがより好ましく、５０℃以上であることがより好ましい。

本結晶取得工程に用いる、有機溶媒添加前のｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液には、結晶が析出しない範囲内で有機溶媒を含有こともできる。しかし、予期しない結晶析出を防止する観点から、有機溶媒の含有量は３０％（ｖ／ｖ）以下であることが好ましく、２０％（ｖ／ｖ）以下であることがより好ましく、１０％（ｖ／ｖ）以下であることがより好ましく、５％（ｖ／ｖ）以下であることがより好ましく、有機溶媒を実質的に含まないことがより好ましい。

上記工程（４）で使用する有機溶媒としては、メタノール、エタノール等の炭素数６以下のアルコール類、アセトン等のケトン類、ジオキサン等のエーテル類、アセトニトリル等のニトリル類、ジメチルホルムアミド等のアミド類等を例示することができるが、これらに限定されない。特に、入手容易性及び安全性の観点から、炭素数６以下のアルコール類が好ましく、中でもエタノールを用いることが好ましい。

上記工程（５）においては、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液を１～３０℃になるまで冷却する。工程（３）での加熱時と温度差がある程結晶が析出しやすいため、工程（５）での水溶液の温度は２０℃以下であることがより好ましく、１０℃以下であることがより好ましい。

さらに、上記（１）～（５）の工程は順に行うことが好ましいが、適宜連続する工程を同時に行うこともできる。

上記製法によって得られたｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶は、濾取した後に乾燥させることで、製品とすることができる。乾燥させる際には、減圧乾燥等の方法を適宜利用することができる。

以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないのは明らかである。

（実施例１）ｐＨ８．２におけるｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αの製造
公知の方法により、酵素的にｃ－ｄｉ－ＡＭＰを合成し、精製を行った。
精製して得られたＯＤ_２５７が４７１０、ｐＨ８.２のｃ－ｄｉ－ＡＭＰ溶液（１０２ｍＬ）を４０℃に加温した。そこに撹拌しながら、１４２ｍＬの９９．５％（ｗ／ｗ）エタノールをゆっくり添加したのち、液温が４℃になるまで冷却し、結晶を析出させた。このようにして析出した結晶はバスケット分離機にて濾取し、湿結晶を得た。湿結晶は２時間、３０℃で乾燥して、乾燥結晶９．８ｇを得た。

（Ａ）ナトリウム塩の形態分析
原子吸光光度法で分析したところ、本実施例のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶におけるナトリウム含量は、６．４％であった。このことから、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ１分子に対するナトリウム原子の存在量は２．０となり、本実施例のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αは、２ナトリウム塩の形態を取っていることが明らかとなった。

（Ｂ）純度検定
上記実施例１で得られたｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αの純度を、高速液体クロマトグラフィー法で分析した結果、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ純度は１００％であった。なお、高速液体クロマトグラフィー法は以下の条件で行った。
（条件）
カラム：ＨｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅＣ１８（ＹＭＣ社製）
溶出液：０．１ＭＴＥＡ－Ｐ（ｐＨ６．０）＋４．５％ＡＣＮ
検出法：ＵＶ２６０ｎｍによる検出

（Ｃ）結晶形
本実施例におけるｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αの写真を図２に示す。図２に示すように、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αは柱状の結晶形を示すことが明らかとなった。

（Ｄ）粉末Ｘ線回折
本実施例のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αについて、Ｘ線回折装置Ｘ’ＰｅｒｔＰＲＯＭＰＤ（スペクトリス）を用い、下記の測定条件でＸ線回折スペクトルを測定した。
（測定条件）
ターゲット：Ｃｕ
Ｘ線管電流：４０ｍＡ
Ｘ線管電圧：４５ｋＶ
走査範囲：２θ＝４．０～４０．０°
前処理：めのう製乳鉢を用いて粉砕

図３および表１に示すように、本実施例のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αは、回折角（２θ）が、６．２、１０．９、１２．６、２３．９（°）付近にピークを示し、特に１０．９、２３．９（°）付近に特徴的なピークを示した。

（Ｅ）赤外線吸収スペクトル
本実施例のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αについて、フーリエ変換赤外分光光度計ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｎｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いてＡＴＲ（ＡｔｔｅｎｕａｔｅｄＴｏｔａｌＲｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ、減衰全反射）法によって赤外線吸収スペクトルを測定した。

本実施例のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αは、３１１９、１６０４、１２２０、１０７３（ｃｍ^-１）付近に特徴的なピークを有していた。これらの結果を図４に示す。

（Ｆ）示差走査熱量分析
熱重量測定／示差熱分析（ＴＧ／ＤＴＡ）装置（昇温速度５℃／分）で分析したところ、本実施例のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αは、２５５℃付近に吸熱ピークを有した（図５）。

（実施例２）ｐＨ１０．０におけるｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αの製造
公知の方法により、酵素的にｃ－ｄｉ－ＡＭＰを合成し、精製を行った。
精製して得られたＯＤ_２５７が６６００、ｐＨ１０．０のｃ－ｄｉ－ＡＭＰ溶液（５０ｍＬ）を４０℃に加温した。そこに撹拌しながら、４５ｍＬのエタノールをゆっくり添加したのち、液温が４℃になるまで冷却し、結晶を析出させた。このようにして析出した結晶はメンブレンフィルター（３μｍ）にて濾取し、湿結晶を得た。湿結晶は１時間半、２０℃で乾燥して、乾燥結晶７ｇを得た。

（Ａ）ナトリウム塩の形態分析
原子吸光光度法で分析したところ、本実施例のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αにおけるナトリウム含量は、６．６％であった。このことから、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ１分子に対するナトリウム原子の存在量は２．０となり、本実施例のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αは、２ナトリウム塩の形態を取っていることが明らかとなった。

（Ｂ）純度検定
上記実施例２で得られたｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αの純度を、高速液体クロマトグラフィー法で分析した結果、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ純度は１００％であった。なお、高速液体クロマトグラフィー法は以下の条件で行った。
（条件）
カラム：ＨｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅＣ１８（ＹＭＣ社製）
溶出液：０．１ＭＴＥＡ－Ｐ（ｐＨ６．０）＋４．５％ＡＣＮ
検出法：ＵＶ２６０ｎｍによる検出

（Ｃ）結晶形
本実施例のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム結晶αの写真を図６に示す。図６に示すように、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αは柱状の結晶形を示すことが明らかとなった。

図７および表２に示すように、本実施例のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αは、回折角（２θ）が、１０．９、２４．０（°）付近に特徴的なピークを示した。

本実施例のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αは、３１１８、１６０４、１２２１、１０７４（ｃｍ^-１）付近に特徴的なピークを有していた。これらの結果を図８に示す。

（Ｆ）示差走査熱量分析
熱重量測定／示差熱分析（ＴＧ／ＤＴＡ）装置（昇温速度５℃／分）で分析したところ、本実施例のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αは、２５５℃付近に吸熱ピークを有した（図９）。

（実施例３）低ｐＨ領域（ｐＨ５．０～６．５）におけるｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶の取得試験
ｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶を取得できるｐＨ範囲を決定するために、低ｐＨ領域（ｐＨ５．０～６．５）における結晶の取得試験を実施した。

公知の方法により、酵素的にｃ－ｄｉ－ＡＭＰを合成し、精製を行った。
精製して得られたｃ－ｄｉ－ＡＭＰを用いて、ＯＤ_２５７が２５００、ｐＨが５．０，５．２，５．４，５．６，５．８，６．０又は６．５であるｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液を調製した。得られたＯＤ_２５７が２５００のｃ－ｄｉ－ＡＭＰ溶液（０．２ｍＬ）を３０℃に加温した。そこに、１ｍＬの９９．５％（ｗ／ｗ）エタノールをゆっくり添加したのち、密閉して一晩から数日間３０℃下で静置し、結晶を析出させた。このようにして析出した結晶はメンブレンフィルターにて濾取し、湿結晶を得た。

得られた結果を以下の表３に示す。下記表３中で、「結晶」とあるのは結晶取得可否を表しており、
○：問題なく結晶が取得できた
△：結晶を取得することはできたが、その量は他のｐＨと比べると少量であった
×：水溶液を調製することができず、結晶を取得できなかった
ことを表している。

上記表３に示す通り、ｐＨ５．０においてはｃ－ｄｉ－ＡＭＰの溶解度が低く、そもそもＯＤ_２５７が２５００のｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液を調製することができなかった。希釈することで低濃度のｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液は調製できたものの、以降同様の操作を行っても結晶を取得することはできなかった。ｐＨ５．２においては、結晶を取得することはできたが、析出した結晶の量は、５．４以上に比べて少量であった。ｐＨ５．４以上では、問題なく結晶を取得することができた。

ｐＨ５．４以上６．０未満の範囲で得られたｃ－ｄｉ－ＡＭＰ結晶は、立方体状の外観を示すなどいずれも同様の性状であり、同一の形態であると考えられた。ｐＨ６．０では、結晶として立方体状のものと柱状のものが混在していた。ｐＨ６．０より高いｐＨ領域において得られたｃ－ｄｉ－ＡＭＰ結晶は、柱状の外観を示すなど、実施例１及び２において取得された結晶と同様の性状を示した。以上の結果から、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液のｐＨが５．２～６．０の範囲である場合には本実施例の形態のｃ－ｄｉ－ＡＭＰ結晶βが取得され、ｐＨ６．０～１２．０の範囲である場合にはｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶αが取得されることが明らかとなった。

（実施例４）ｐＨ５．６におけるｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶βの製造
公知の方法により、酵素的にｃ－ｄｉ－ＡＭＰを合成し、精製を行った。
精製して得られたＯＤ_２５７が３０００、ｐＨ５．６のｃ－ｄｉ－ＡＭＰ溶液（１５ｍＬ）を３０℃に加温した。そこに撹拌しながら、１５ｍＬのエタノールをゆっくり添加したのち、液温が４℃になるまで冷却し、結晶を析出させた。このようにして析出した結晶はメンブレンフィルターにて濾取し、湿結晶を得た。湿結晶は２時間、２５℃で乾燥して、乾燥結晶１．０ｇを得た。

（Ａ）ナトリウム塩の形態分析
原子吸光光度法で分析したところ、本実施例のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶βにおけるナトリウム含量は、５．２％であった。このことから、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ１分子に対するナトリウム原子の存在量は１．５であることが分かった。

（Ｂ）純度検定
本実施例で得られたｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶βの純度を、高速液体クロマトグラフィー法で分析した結果、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ純度は１００％であった。なお、高速液体クロマトグラフィー法は以下の条件で行った。
（条件）
カラム：ＹＭＣ－ＴｒｉａｒｔＣ１８（ＹＭＣ社製）
溶出液：０．１ＭＴＥＡ－Ｐ（ｐＨ６．０）＋４．５％ＡＣＮ
検出法：ＵＶ２６０ｎｍによる検出

（Ｃ）結晶形
本実施例におけるｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶βの写真を図１０に示す。図１０に示すように、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶βは、立方体状の結晶形を示すことが明らかとなった。

（Ｄ）粉末Ｘ線回折
本実施例のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶について、Ｘ線回折装置Ｘ’ＰｅｒｔＰＲＯＭＰＤ（スペクトリス）を用い、下記の測定条件でＸ線回折スペクトルを測定した。
（測定条件）
ターゲット：Ｃｕ
Ｘ線管電流：４０ｍＡ
Ｘ線管電圧：４５ｋＶ
走査範囲：２θ＝４．０～４０．０°
前処理：めのう製乳鉢を用いて粉砕

図１１および表４に示すように、本実施例のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶βは、回折角（２θ）が、９．３、２３．６、２４．３（°）付近にピークを示した。

（Ｅ）赤外線吸収スペクトル
本実施例のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶βについて、フーリエ変換赤外分光光度計ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｎｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いてＡＴＲ（ＡｔｔｅｎｕａｔｅｄＴｏｔａｌＲｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ、減衰全反射）法によって赤外線吸収スペクトルを測定した。

本実施例のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶βは、３１１９、１６０６、１２２２、１０７４（ｃｍ^-１）付近に特徴的なピークを有していた。これらの結果を図１２に示す。

（Ｆ）示差走査熱量分析
熱重量測定／示差熱分析（ＴＧ／ＤＴＡ）装置（昇温速度５℃／分）で分析したところ、本実施例のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶βは、２３９℃付近に吸熱ピークを有した（図１３）。

（参考例）ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ遊離酸結晶の製造
公知の方法により、酵素的にｃ－ｄｉ－ＡＭＰを合成し、精製を行った。
精製して得られたｃ－ｄｉ－ＡＭＰ溶液から、特許文献１に記載の方法によってｃ－ｄｉ－ＡＭＰ遊離酸結晶を取得した。すなわち、ＯＤ_２５７が１１４のｃ－ｄｉ－ＡＭＰ溶液（９８０ｍＬ）を５０℃に加温した。そこに、２ＮＨＣｌを少しずつ添加し、ｐＨ１．８まで調製し、液温が４℃になるまで冷却して結晶を析出させた。このようにして析出した結晶はグラスフィルター（Ｇ３）にて濾取し、湿結晶を得た。湿結晶は１時間、２０℃で乾燥して、乾燥結晶２．８ｇを得た。

（Ａ）純度検定
上記参考例で得られたｃ－ｄｉ－ＡＭＰ遊離酸結晶の純度を、高速液体クロマトグラフィー法で分析した結果、ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ純度は１００％であった。なお、高速液体クロマトグラフィー法は以下の条件で行った。
（条件）
カラム：ＨｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅＣ１８（ＹＭＣ社製）
溶出液：０．１ＭＴＥＡ－Ｐ（ｐＨ６．０）＋４．５％ＡＣＮ
検出法：ＵＶ２６０ｎｍによる検出

（Ｂ）結晶形
ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ遊離酸結晶の代表的な写真を図１４に示す。ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ遊離酸結晶は、針状の結晶形を示す。

（Ｃ）粉末Ｘ線回折
ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ遊離酸結晶について、Ｘ線回折装置Ｘ’ＰｅｒｔＰＲＯＭＰＤ（スペクトリス）を用いて、下記の測定条件でＸ線回折スペクトルを測定した。
（測定条件）
ターゲット：Ｃｕ
Ｘ線管電流：４０ｍＡ
Ｘ線管電圧：４５ｋＶ
走査範囲：２θ＝４．０～４０．０°
前処理：めのう製乳鉢を用いて粉砕

図１５および表５に示すように、特許文献１に記載のｃ－ｄｉ－ＡＭＰ遊離酸結晶は、回折角（２θ）が、９．２、１０．２、１０．９、１１．１、１３．７、１５．２、１９．０、２０．６、２２．４、２３．１、２４．３、２６．６、２６．８（°）付近に特徴的なピークを示した。

（Ｄ）赤外線吸収スペクトル
ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ遊離酸結晶を、フーリエ変換赤外分光光度計ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｎｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いてＡＴＲ（ＡｔｔｅｎｕａｔｅｄＴｏｔａｌＲｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ、減衰全反射）法によって赤外線吸収スペクトルを測定した結果について、特許文献１に記載がある。

特許文献１に記載のｃ－ｄｉ－ＡＭＰ遊離酸結晶は、３０８７、１６８６、１６０４、１５０４、１４７３、１４１５、１３２８、１２１３（ｃｍ^－１）付近に特徴的なピークを有していた。これらの結果を図１６に示す。

（Ｅ）示差走査熱量分析
特許文献１に記載のｃ－ｄｉ－ＡＭＰ遊離酸結晶は、熱重量測定／示差熱分析（ＴＧ／ＤＴＡ）装置（昇温速度５℃／分）で分析すると、１９３℃付近に吸熱ピークを有した（図１７）。

（実施例４）１０５℃条件下における取得結晶の安定性試験
上記実施例１、実施例２、実施例４及び参考例にて得られた結晶を、１０５℃条件下で静置した。そこから経時的に結晶を回収し、水溶液を調製し、高速液体クロマトグラフィー法で結晶の純度を分析した。得られた結果を図１８および表６に示す。

表６に示す通り、本発明に属するｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶は、既存のｃ－ｄｉ－ＡＭＰ遊離酸結晶と比べて、１０５℃という過酷条件下においても安定性に優れていることが分かった。さらに、既存のｃ－ｄｉ－ＡＭＰ遊離酸結晶を溶解させる際には撹拌操作が必要であったのに対し、本発明のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶は迅速に溶解した。このことから、本発明のｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶は、既存のｃ－ｄｉ－ＡＭＰ遊離酸結晶と比較して、高い溶解性を示すことが明らかとなった。

Claims

Ｃｙｃｌｉｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶の製造法であって、
前記結晶は、Ｃｕ－Ｋα線を用いた粉末Ｘ線回折の回折角（２θ）として、１０．９±０．５、２３．９±１．２（°）に特徴的なピークを有することを特徴とする、Ｃｙｃｌｉｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶α、又はＣｕ－Ｋα線を用いた粉末Ｘ線回折の回折角（２θ）として、９．３±０．５、２３．６±１．２、２４．３±１．２（°）に特徴的なピークを有することを特徴とする、Ｃｙｃｌｉｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶βであり、
Ｃｙｃｌｉｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液のｐＨを５．２～１２．０に調整し、有機溶媒を添加し、析出する結晶を取得する工程を含む、製造法。
（１）ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液に塩基及び／又は酸を添加し、ｐＨを５．２～１２．０に調整する工程、
（２）ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液を測定波長２５７ｎｍにおける吸光度ＯＤ_２５７を５００～２００００とする工程、
（３）ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液を３０～７０℃まで加熱する工程、
（４）ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液に有機溶媒を添加する工程、
（５）ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ水溶液を１～３０℃になるまで冷却する工程
を含むことを特徴とする、請求項1に記載のＣｙｃｌｉｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶の製造法。