JP7262360B2 - 液体クロマトグラフィ分析システム - Google Patents

Description

本発明は、たとえば血中ヘモグロビンを分離分析する高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）のような液体クロマトグラフィ（ＬＣ）において、液体クロマトグラフィカラム（ＬＣカラム）に溶離液を送出する液体クロマトグラフィ分析システムに関する。

ＨＰＬＣによる検体の分析においては、単一の溶離液を用いて分析することは困難である。そこで複数の溶離液を流路に送液し、溶離液の組成を種々変化させて分析するグラジエント方式が主流である。このとき、複数の溶離液が均一に混ざった混合液が高速液体クロマトグラフィカラム（ＨＰＬＣカラム）に流れるよう、下記特許文献１記載の技術のように流路内にミキサーを設けることが開示されている。

特開２００６－３２０３号公報

一般的に、ＨＰＬＣ分析システムで用いられる溶離液のミキサーは、その容量が大きいほど、溶離液の混合が十分になされる。しかし、その分混合完了までの時間も遅くなる。近年、臨床現場において、多数の検体を短時間に処理するという要請に基づき、ＨＰＬＣにおける分析時間の短縮が計られてきたが、これに伴い、溶離液の混合完了までの時間が分析時間に占める割合が無視できなくなってきた。

本開示の液体クロマトグラフィ分析システムは、ＬＣカラムと、複数種類の溶離液を貯留する複数の貯留槽と、複数の貯留槽と接続する複数の流路が合流する合流部と、ＬＣカラムと合流部とを接続する合流路と、ＬＣカラムに合流路を介して複数種類の溶離液を送出する送液手段と、複数種類の溶離液を、単位時間当たり流量Ｑで、あらかじめ決められた順番でＬＣカラムに送出することを送液周期Ｃｙで繰り返すように送液手段を制御する制御部と、を有し、合流路の長さをＬ及び断面積をＤ、としたとき、Ｍａ＝（Ｑ・Ｃｙ）／（Ｌ・Ｄ）で定義される混合係数Ｍａが、０＜Ｍａ≦１である。

本発明によれば、流路にミキサーを設けずとも、混合した溶離液をＬＣカラムに送出することが可能なシステムが提供される

本開示の送液システムを含むＨＰＬＣ分析システムの第１実施態様を示す模式図。 制御部のハードウェア構成を示すブロック図。 送液周期の一例を示すタイムチャート。 図３の送液周期による合流路における溶離液の送液状態の模式図。 送液周期の別の例を示すタイムチャート。 送液周期のさらに別の例を示すタイムチャート。 本開示の送液システムの第２実施態様を示す模式図。 本開示の送液システムの第３実施態様を示す模式図。 送液周期(Ｃｙ）が０．２５秒の場合の検証における、合流路終点で測定した吸光度を時系列で示すグラフ。 送液周期(Ｃｙ）が０．５秒の場合の検証における、合流路終点で測定した吸光度を時系列で示すグラフ。 送液周期（Ｃｙ）が０．２５秒及び０．５秒の場合についてそれぞれ混合係数（Ｍａ）と吸光度のシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ）との関係を示すグラフ。 実施例において血中ヘモグロビンのクロマトグラムを示す。

本開示の液体クロマトグラフィ分析システムでは、ＨＰＬＣカラムのような液体クロマトグラフィカラム（ＬＣカラム）の上流に位置する合流路に、少なくとも１つの送液手段（たとえばポンプ）によって、複数種類の溶離液があらかじめ定めた順番で送出され、合流路においてこの複数種類の溶離液を所望の比率で実質的に混合することができる。ここで、複数種類の溶離液とは、互いに組成を異にするものであり、検体の種類に応じて適宜選択可能であるとともに、ピークとして溶出したい成分に応じて所望の比率で混合された状態でＬＣカラムに送出される。この液体クロマトグラフィ分析システムとしてのＨＰＬＣ分析システムは、特に、血液ヘモグロビンのうちＨｂＡ１ｃ分画を測定するのに適している。

＜第１実施態様＞
本開示の液体クロマトグラフィ分析システムは、たとえば、図１の模式図に示す第１実施態様のようにＨＰＬＣ分析システム１０として構成することができる。このＨＰＬＣ分析システム１０では、分析対象に応じて種々の担体が充填されたＬＣカラムとしてのＨＰＬＣカラム２０に、送液システム１００によって複数種類の溶離液が周期的に送出される。以下、複数種類の溶離液として、第１液体と第２液体を１：１で混合した混合液を単位時間当たり流量ＱでＨＰＬＣカラムに送出する例を挙げて、第１実施態様の送液周期の第１例を説明する。なお、本開示の送液システム１００は、短時間で分離分析を行うＨＰＬＣ分析システム及びＨＰＬＣカラムに溶離液を送出するものが特に望ましいが、液体クロマトグラフィを原理とするＬＣカラムに溶離液を送出するものであってもよい。

［送液システム］
この第１実施態様の送液システム１００は、以下の構成を備える。この第１実施態様の送液システム１００においては、複数の溶離液として第１液体及び第２液体の２種類が使用される。第１液体は貯留槽としての第１貯留槽１４１に貯留され、第１ポンプ１２１によって第１流路１３１を経て合流路１１０へ送出される。第２液体は貯留槽としての第２貯留槽１４２に貯留され、第２ポンプ１２２によって第２流路１３２を経て合流路１１０へ送出される。換言すると、第１貯留槽１４１と接続する第１流路１３１と、第２貯留槽１４２と接続する第２流路１３２とは合流部１３０で合流している。そして合流路１１０は合流部１３０とＬＣカラムとを接続する。なお、第１ポンプ１２１の上流及び下流並びに第２ポンプ１２２の上流及び下流にはそれぞれ、上流から下流への流れのみが通ることが可能な逆止弁１７０が装着されている。そのため、第１貯留槽１４１から第１流路１３１に送液された第１液体は第２流路１３２には流れず、合流路１１０に流れる。同様に第２貯留槽１４２から第２流路１３２に送液された第２液体は第１流路１３１には流れず、合流路１１０に流れる。

本実施態様において第１ポンプ１２１及び第２ポンプ１２２に用いられるポンプはプランジャーポンプ（シリンダーポンプ）である。なお、第１ポンプ１２１及び第２ポンプ１２２に用いられるポンプは送液及び停止を繰り返し行うことができるものであれば特に種類は限定されないが、送液の立ち上がり及び立ち下がりに要する時間を短くすることができることから、本第１実施態様のようにプランジャーポンプ（シリンダーポンプ）を用いることが望ましい。

なお、第１流路１３１から、第３ポンプ１２３に連絡する第３流路１３３が分岐する。この第３流路１３３の途中には、開閉可能な第１弁１５１が設けられている。第３ポンプ１２３に用いられるポンプは、吸引ができるようなものであれば特に種類は限定されない。

合流路１１０は長さＬ（ｍ）、断面積Ｄ（ｍ^２）の管状を呈し、その途中には開閉可能な第２弁１５２が設けられている。合流路１１０の下流端は、ＨＰＬＣカラム２０の上流端と連結している。なお、合流路１１０にインジェクションバルブなどを別途設けてもよい。その場合、インジェクションバルブ内部の溶離液の流路の長さと断面積の積を合流路１１０の長さＬと断面積Ｄの積に足し合わせた値を、Ｍａを定義する式中の長さＬ（ｍ）と断面積Ｄ（ｍ^２）の積として用いてもよい。

第１弁１５１を開放させ、かつ、第２弁１５２を閉鎖させた状態で、分析開始前に、各流路からの空気抜きが行われる。また、第１弁１５１を閉鎖させ、第２弁１５２を開放させた状態で、検体のＨＰＬＣによる分析が実行される。これらの点については実施例にて後述する。

なお、上記した第１ポンプ１２１、第２ポンプ１２２及び第３ポンプ１２３の作動及び停止、並びに第１弁１５１及び第２弁１５２の開閉は、いずれも制御部１８０による制御に服する。図１中の破線は、制御部１８０による各部分への制御系統を示す。制御部１８０は、図２のハードウェア構成に示すように、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）１８１、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）１８２、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）１８３及びストレージ１８４を有する。各構成は、バス１８９を介して相互に通信可能に接続されている。

ＣＰＵ１８１は、中央演算処理ユニットであり、各種プログラムを実行したり、各部を制御したりする。すなわち、ＣＰＵ１８１は、ＲＯＭ１８２又はストレージ１８４からプログラムを読み出し、ＲＡＭ１８３を作業領域としてプログラムを実行する。ＣＰＵ１８１は、ＲＯＭ１８２又はストレージ１８４に記録されているプログラムに従って、上記各構成の制御を行う。

ＲＯＭ１８２は、各種プログラム及び各種データを格納する。ＲＡＭ１８３は、作業領域として一時的にプログラム又はデータを記憶する。ストレージ１８４は、ＨＤＤ（Ｈａｒｄ Ｄｉｓｋ Ｄｒｉｖｅ）、ＳＳＤ（Ｓｏｌｉｄ Ｓｔａｔｅ Ｄｒｉｖｅ）又はフラッシュメモリにより構成され、オペレーティングシステムを含む各種プログラム、及び各種データを格納する。本第１実施態様では、ＲＯＭ１８２又はストレージ１８４には、測定や判定に関するプログラムや各種データが格納されている。また、ストレージ１８４には、測定データを保存しておくこともできる。

制御部１８０は、上記ハードウェア構成のうちＣＰＵ１８１が、前記したプログラムを実行して送液システム１００を制御することによって、ＨＰＬＣ分析システム１０において検体の分析を実施する。

［送液パターン：第１例］
第１実施態様の送液システム１００による送液パターンの第１例を、図３のタイムチャートを参照しつつ説明する。図３の上段は、プランジャーポンプである第１ポンプ１２１によって第１液体を実際に送出している時間をハッチングにて示し、また、第１液体を送出していない時間を白抜きにて示している。図３の下段は同様に、プランジャーポンプである第２ポンプ１２２によって第２液体を実際に送出している時間を別のハッチングにて示し、第２液体を送出していない時間を白抜きにて示している。

具体的には図３の上段は、第１ポンプ１２１の第１液体を含むシリンジ内にプランジャーを押し込む時間をハッチングにて示し、また、第１ポンプ１２１のシリンジ内に押し込まれたプランジャーをシリンジ内から引き上げる時間を白抜きにて示している。図３の下段は同様に、第２ポンプ１２２の第２液体を含むシリンジ内にプランジャーを押し込む時間を別のハッチングにて示し、また、第２ポンプ１２２のシリンジ内に押し込めれたプランジャーをシリンジ内から引き上げる時間を白抜きにて示している。

まず、制御部１８０は第１ポンプ１２１のシリンジ内にプランジャーを所定時間（ｔ_１）の間押し込み、第１ポンプ１２１のシリンジ内にある第１液体を合流路１１０へ送出させる。その間、制御部１８０は第２ポンプ１２２のシリンジ内からプランジャーを引き上げ、第２液体を第２貯留槽１４２から第２ポンプのシリンジ内に取り込む。つまりその間、第２液体は合流路１１０へは送出されない。

そして、制御部１８０は第１ポンプ１２１を同じ所定時間（ｔ_２）の間第１ポンプ１２１のシリンジ内からプランジャーを引き上げ、第１液体を第１貯留槽１４１から第１ポンプ１２１のシリンジ内に取り込む。つまりその間、第１液体は、合流路１１０へは送出されない。その間、制御部１８０は第２ポンプ１２２のシリンジ内にプランジャーを押し込み、第２ポンプ１２２のシリンジ内にある第２液体を合流路１１０へ送出させる。

すなわち、複数種類の溶離液である第１液体及び第２液体は、それぞれ、送出されている時間と送出されていない時間とが繰り返される。つまり、あらかじめ定めた順番で、第１液体と第２液体との順で交互に合流路１１０に送出することを繰り返す。換言すると、所定の順番として、第１液体と第２液体との順で交互に合流路１１０に送出することを繰り返す、ともいえる。又は、第１液体のみを送出し、続いて第２液体のみを合流路１１０に送出することを繰り返す、ともいえる。又は、第１液体及び第２液体のそれぞれを合流路１１０に周期的に送出する、ともいえる。この合流路１１０へ第１液体、第２液体の送出の繰り返しを送液パターンと称する。この送液パターンの１単位の時間長さ（すなわち、第１液体の送出時間（第２液体の停止時間）であるｔ_１と第２液体の送出時間（第１液体の停止時間）であるｔ_２とを合わせた時間）が送液周期Ｃｙ（秒）である。ここで、１回の送液周期（Ｃｙ）においては、個々の溶離液について、それぞれ送液手段による送出が継続している時間と、この送出が停止している時間とが含まれる。

なお、第１ポンプ１２１の駆動による第１液体の合流路１１０への送出を行う時間（すなわち、第２ポンプ１２２の駆動による第２液体の合流路１１０への送出を停止する時間）であるｔ_１と、第２ポンプ１２２の駆動による第２液体の合流路１１０への送出を行う時間（すなわち、第１ポンプ１２１の駆動により第１液体の合流路１１０への送出を停止する時間）であるｔ_２とは、同じ時間である必要はなく、異なる時間であってもよい。この場合も同様に、この異なる時間の合計（ｔ_１＋ｔ_２）が、送液周期Ｃｙとなる。

この送液周期Ｃｙの１回に要する時間において第１液体と第２液体とが送液手段によって合流路を介して、ＬＣカラムとしてのＨＰＬＣカラム２０に送出する流量の総計を送液周期Ｃｙの１回に要する時間で除したものが、溶離液の単位時間当たり流量（Ｑ）である。換言すると、送液周期Ｃｙの１回の間の第１液体の単位時間当たり流量Ｑ_１と第２液体の単位時間当たり流量Ｑ_２との合計が、第１液体と第２液体との混合液を単位時間当たり流量（Ｑ）となるように、第１液体と第２液体とをＨＰＬＣカラムに送液する。つまり、１回の送液周期Ｃｙ中のｔ_１の間に第１液体を流量Ｖ_１送出し、次いでｔ_２の間に第２液体を流量Ｖ_２送出する場合、第１液体の単位時間当たり流量Ｑ_１は流量Ｖ_１を送液周期（Ｃｙ）で除したものであり、他方の第２液体の単位時間当たり流量Ｑ_２は流量Ｖ_２を送液周期（Ｃｙ）で除したものである。そして、単位時間当たり流量Ｑは、
Ｑ＝Ｑ_１＋Ｑ_２
である。このＱ_１とＱ_２の合計が、ＨＰＬＣカラム２０に送液したいＱとなるように、Ｑ_１とＱ_２を調整する。溶離液が３種類以上の場合も同様である。なお、第１液体と第２液体との混合液を合流路１１０を介してＨＰＬＣカラム２０に均一の圧力で送液するために、換言すると、合流路１１０を流れる際の圧力の脈動を軽減して混合液を送液するために、流量Ｖ_１をｔ_１で除した値である第１液体の送液速度と、流量Ｖ_２をｔ_２で除した値である第２液体の送液速度とを同じにすることが好ましい。

この溶離液の単位時間当たり流量（Ｑ）に対する複数種類の溶離液それぞれの単位当たり流量の割合を変更することで、所望の混合比率の溶離液の混合液を合流路の下流に送液することができる。つまり、第１液体と第２液体とを１：１で混合した混合液を送出する場合は、第１液体の単位時間当たり流量Ｑ_１と流量Ｑ_２とはそれぞれ、単位時間当たり流量Ｑの２分の１にすればよい。たとえば、溶離液１と溶離液２とを３：７で混合した溶離液を単位時間当たり流量Ｑで合流路を介してＨＰＬＣカラム２０に送液する場合、溶離液１の単位時間当たり流量Ｑ_１は単位時間当たり流量Ｑの１０分の３、溶離液２の単位時間当たり流量Ｑ_２は単位時間当たり流量Ｑの１０分の７にすればよい。

このとき、複数種類の溶離液である第１液体と第２液体との単位時間当たり流量Ｑ_１とＱ_２とを変更する場合は、送液周期中で送液する時間であるｔ_１又はｔ_２を変更せずに流量Ｖ_１をｔ_１で除した値である第１液体の送液速度、又は、流量Ｖ_２をｔ_２で除した値である第２液体の送液速度を変更してもよいし、第１液体の送液速度又は第２液体の送液速度は変更せずに送液周期中でその溶離液を送液する時間であるｔ_１又はｔ_２を変更して行ってもよいし、またこれらを組み合わせてもよい。なお、溶離液の単位時間当たり流量（Ｑ）は合流路の下流に設けられたＨＰＬＣカラム２０で検体を分析するために適した流量に適宜設定できる。制御部１８０は送液システム１００を制御して、適宜複数種類の溶離液の混合比率の調整を行うことができる。

図３に示す送液パターンにより、第１流路１３１より送出される第１液体と、第２流路１３２より送出される第２液体とが、図４に示すように、合流路１１０において交互に流れていき、混合された溶離液がＨＰＬＣカラム２０に到達する。このとき、
Ｍａ＝（Ｑ・Ｃｙ）／（Ｌ・Ｄ）
で定義される混合係数Ｍａが、
０＜Ｍａ≦１
となるように、送液システム１００において各パラメータを設定する。すなわち、後述する図１１で示すように、Ｍａを０＜Ｍａ≦１とすることで、Ｓ／Ｎが急激に増加する。つまり、混合された溶離液がＨＰＬＣカラムに送液される。ここで、詳細は後述するが、Ｓ／Ｎの値が高いほど、複数種類の溶離液がよく混合されていることを示す。そのため、合流路１１０において特段の混合手段（たとえば、ミキサー）を用いずとも、複数種類の溶離液が、事実上完全に混合された状態でＨＰＬＣカラム２０に送出される。このＭａを０＜Ｍａ≦１とすることの意義については後述する。

混合係数（Ｍａ）とは、上記した送液周期（Ｃｙ）及び溶離液の単位時間当たり流量（Ｑ）並びに合流路の管長（Ｌ）及び断面積（Ｄ）というパラメータによって、前記した関係式によって定義される無名数である。この混合係数（Ｍａ）が、０を超え、かつ、１以下の値となるように上記各パラメータを調整した送液システムでは、複数種類の溶離液のそれぞれは断続的に合流路を流れる。そしてこの溶離液の断続的な送液によって生じる送液周期（Ｃｙ）１回当たりの溶離液の体積は、合流路の容積に対して十分に小さくなる。そのため、複数種類の溶離液は、合流路を経てＨＰＬＣカラムに到達した段階で、実質的にあらかじめ完全に混合されているのに等しい状態となる。

たとえば、長さＬ（ｍ）、断面積Ｄ（ｍ^２）の合流路１１０を介してＨＰＬＣカラム２０に第１液体と第２液体とを１：１で混合した混合液を単位時間当たり流量Ｑで送液する場合、Ｍａを定義する前記の式にＬ、Ｄ及びＱを代入し、Ｍａが０＜Ｍａ≦１となる送液周期Ｃｙを算出する。そして算出した送液周期Ｃｙで、第１ポンプ１２１と第２ポンプ１２２とで交互にそれぞれ単位時間当たり流量Ｑの２分の１の流量で送液することを繰り返す。これにより、合流路１１０においてミキサーを要さずとも、混合した溶離液をＨＰＬＣカラム２０に送出することができる。

また、ＨＰＬＣ分析システム１０における送液システム１００の流路を変更することは通常困難であることから、合流路１１０の長さＬ（ｍ）、断面積Ｄ（ｍ^２）は所与の数値として定まっている場合が多い。また、分離分析する成分やカラムによって単位時間当たり流量Ｑも定まっている場合が多い。その場合は、送液周期Ｃｙを短くすることで混合係数Ｍａを０＜Ｍａ≦１とする。そのため送液周期Ｃｙは短いほどよく、好ましくは０．５秒以下である。

ここで混合係数Ｍａを０＜Ｍａ≦１とする意義について、以下の送液システム１００の検証にて説明する。

＜送液システムの検証＞
［溶離液の組成］
複数種類の溶離液として、下記表１に示す組成の液体を基に第１液体及び第２液体を調整し使用した。

上記液体に、色素として青色２号（イソジゴカルミン）を０．０１ｇ／Ｌの濃度で添加したものを第１液体とし、色素を添加していない上記液体を第２液体とした。

［装置構成］
前記の第１実施態様（図１参照）のＨＰＬＣカラム２０の替わりに吸光度計を設置し、検証に用いる送液システム１００とした。上記した第１液体及び第２液体をそれぞれ、この構成の送液システム１００の第１貯留槽１４１及び第２貯留槽１４２にそれぞれ充填した。合流路１１０は、下記表２に示すサイズの６種類をそれぞれ用い、合流路の終点に設置した吸光度計にて、波長４２０ｎｍにて溶離液の吸光度を経時的に測定した。なお、第１ポンプ１２１及び第２ポンプ１２２にはいずれもプランジャポンプを用いた。

［測定手順］
図１に示す構成及び符号を参照しつつ、本実施態様における吸光度の測定手順を説明する。

（測定前処理）
測定前処理として、第３流路１３３に設けられている第１弁１５１を開放させ、かつ、第２弁１５２を閉鎖させた状態で、第３ポンプ１２３を駆動させて合流路１１０から空気を吸引した。この状態で第１ポンプ１２１及び第２ポンプを同時に駆動させて、第１貯留槽１４１から第１液体で第１流路１３１から第３流路１３３までを満たし、同時に第２貯留槽１４２から第２液体で第２流路１３２から第３流路１３３までを満たした。

その後、第１弁１５１を閉鎖させ、かつ、第２弁１５２を開放させた状態で、第１ポンプ１２１は停止させて第２ポンプ１２２を駆動させて、色素が添加されていない第２液体で第２流路１３２及び合流路１１０を満たした。

その後、第２ポンプ１２２は停止させて第１ポンプ１２１を駆動させて、色素が添加されている第１液体で、第１流路１３１及び合流路１１０を満たした。

（検証１）
測定前処理に続き、まず、第１液体を流量７．４ｍｌ／分で０．１２５秒送液し、その後０．１２５秒は送液を停止するように第１ポンプ１２１を設定することで、０．２５秒間の第１液体の平均流量である流量Ｑ_１を３．７ｍｌ／分とした。同様に、第２液体を流量７．４ｍｌ／分で０．１２５秒送液し、その後０．１２５秒は送液を停止するように第２ポンプ１２２を設定し、０．２５秒間の第２液体の平均流量である流量Ｑ_２を３．７ｍｌ／分とした。そして、第１ポンプ１２１による第１液体の０．１２５秒の送液と、第２ポンプ１２２による第２液体の０．１２５秒の送液を交互に繰り返すことで、送液周期Ｃｙを０．２５秒とした。この送液周期Ｃｙにおける第１液体及び第２液体を合わせた流量Ｑ（＝Ｑ_１＋Ｑ_２）は、７．４ｍｌ／分（＝１．２３×１０^－７ｍ^３／秒）である。

そして、前記した吸光度計にて、合流路１１０から流出した液体の吸光度（ｍＯ．Ｄ）を５秒間測定した。その結果を図９に示す。なお、合流路１１０の長さは、太い実線が１５０ｍｍ（＝０．１５ｍ）、細い実線が３００ｍｍ（＝０．３０ｍ）、太い破線が４５０ｍｍ（＝０．４５ｍ）、細い破線が９００ｍｍ（＝０．９０ｍ）、太い点線が２０００ｍｍ（＝２．００ｍ）及び細い点線が３０００ｍｍ（＝３．００ｍ）である。

（検証２）
測定前処理に続き、まず、第１液体を流量７．４ｍｌ／分（＝１．２３×１０^－７ｍ^３／秒）で０．２５秒送液し、その後０．２５秒は送液を停止するように第１ポンプ１２１を設定することで、０．５秒間の平均流量である流量Ｑ_１を３．７ｍｌ／分とした。同様に、第２液体を流量７．４ｍｌ／分で０．２５秒送液し、その後０．２５秒は送液を停止するように第２ポンプ１２２を設定することで、０．５秒間の平均流量である流量Ｑ_２を３．７ｍｌ／分とした。そして、第１ポンプ１２１による第１液体の０．２５秒の送液と、第２ポンプ１２２による第２液体の０．２５秒の送液を交互に繰り返すことで、送液周期Ｃｙを０．５秒とした。

そして、前記した吸光度計にて、合流路１１０から流出した液体の吸光度（ｍＯ．Ｄ）を５秒間測定した。その結果を図１０に示す。

ここで、第１液体と第２液体とが完全に混合された混合液を流すと仮定すると、吸光度は時間経過によって一定であり変化しないはずである。そのため、時間経過による吸光度の振れ幅が小さいほど、第１液体と第２液体との混合の度合いが高くなっているといえる。

この考えに基づいて、図９及び図１０を参照すると、図９及び図１０ともに合流路１１０の長さが長くなるほど、吸光度（ｍＯ．Ｄ）の振れ幅は小さくなった。これは、合流路１１０の長さが長くなることで合流路１１０の体積が大きくなり、第１液体と第２液体との混合の度合いが高くなっていることを示す。

また、図９と図１０とを比較すると、同じ合流路１１０の長さであっても送液周期Ｃｙを短くすることで、吸光度の振れ幅は小さくなった。これは、１回の送液周期Ｃｙにおいて送液される体積を小さくすると、第１液体と第２液体との混合の度合いが高くなっていることを示す。

図９及び図１０の測定結果を基に、複数種類の溶離液の混合度合いを示す尺度としてシグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）を定義する。シグナル（Ｓ）については、合流路１１０の各長さの下で同じ送液周期Ｃｙで一定時間（すなわち、５秒間）測定した吸光度の平均と定義する。ノイズ（Ｎ）については、上記一定時間中における吸光度の極大値の平均から、上記一定時間中における吸光度の極小値の平均を差し引いた値、と定義する。

ここで、仮に、第１液体と第２液体とが完全に混合された混合液を流すと、検出部で検出される吸光度は、時間経過によって変化しない。そのため、第１液体と第２液体との混合度合いが高くなると、Ｓ／Ｎは大きくなる。一方、第１液体と第２液体との混合の度合いが低くなると、図９及び図１０に示すように、吸光度は一定の振れ幅で周期的に変化するため、Ｓ／Ｎは小さくなる。

次に、各条件下における、混合の度合いを示すＳ／Ｎと、混合係数Ｍａとを算出した結果を、下記表３に示す。なお、下記表３の他、混合係数Ｍａを算出するのに必要な数値は、流量Ｑが７．４ｍｌ／ｍｉｎ（＝１．２３×１０^－７ｍ^３／秒）及び合流路１１０の断面積Ｄが０．０７０７ｍｍ^３（７．０７×１０^－２ｍ^２）である。

なお、上記表３において、シグナルＳ及びノイズＮは、図９及び図１０に示した吸光度変化の実測値から算出したものである。

上記表３を基に、検証１及び検証２のそれぞれについて、対応する混合係数Ｍａの値とＳ／Ｎの値とを、混合係数ＭａをＸ軸とし、Ｓ／ＮをＹ軸とした二次元平面上にプロットした上で、それぞれ最適なべき関数で近似した近似曲線を併せて図１１に示す。なお、実線の近似曲線は検証１で、破線の近似曲線は検証２である。この近似曲線において、混合係数Ｍａと対応する値が、上記表３におけるＳ／Ｎ近似値である。

その結果、送液周期Ｃｙが０．２５秒の検証１における近似曲線は、送液周期Ｃｙが０．５秒の検証２における近似曲線に近い形状と傾向を示した。これは、送液周期Ｃｙや合流路の長さＬの値に関わらず、混合係数Ｍａによって、混合の度合いであるＳ／Ｎが推定できることを示す。そして、混合の度合いであるＳ／Ｎの値は、Ｍａが１付近へ減少するまでは水平に近く緩やかな曲線を示すが、Ｍａが１以下に減少していくにつれて急激な上昇カーブに転じた。

すなわち、混合係数Ｍａの値としての１とは、Ｘ軸においてＭａが減少していく方向において、水平に近い緩やかな曲線から、急激な上昇カーブに転ずる境界としての意義を有する。

ここで、上記表３中で、各検証において上下に隣接する２通りの合流路の長さＬに対し、Ｓ／Ｎ近似値の差の絶対値を、対応する混合係数Ｍａの差の絶対値で除した値が、上記表３中に示すＳ／Ｎ上昇率である。換言すると、各実施態様において上下に隣接する２つのＳ／Ｎ近似値において、対応する上段の混合係数Ｍａが下段の混合係数Ｍａまで減少する間に、隣接する上段のＳ／Ｎ近似値から下段のＳ／Ｎ近似値まで増加する割合が、当該下段のＳ／Ｎ近似値に対するＳ／Ｎ上昇率である。よって、最上段のＳ／Ｎ近似値に対してはＳ／Ｎ上昇率は定義できないため、そのことを上記表３中の「―」で示している。

このＳ／Ｎ上昇率を基準とすると、検証１においては、Ｌ＝０．４５のときにＭａ＝０．９７とほぼ１となっているが、これを境にＳ／Ｎ上昇率は１．３から３．５へ増加し、以下さらに急激な増加を示している。同様に、検証２においては、Ｌ＝０．９０のときにＭａ＝０．９７とほぼ１となっているが、これを境にＳ／Ｎ上昇率は０．７から１．９へ増加し、以下さらに急激な増加を示している。

これは、混合係数Ｍａが１以下であることによって、第１液体と第２液体とが混合したものと同等とみなすことができることを意味する。

このことから、混合係数Ｍａが１以下となるように第１液体と第２液体とを送液することで、ミキサーのような混合するための構造を用いなくても、第１液体と第２液体とが混合したものと同等の液体を、合流路へ供給することができることが示された。

［送液パターン：第２例］
本実施態様の送液システム１００による送液パターンの第２例を、図５のタイムチャートを参照しつつ説明する。本例は、複数種類の溶離液として、第１液体、第２液体、第３液体を１：１：１で混合した混合液を単位時間当たり流量ＱでＨＰＬＣカラム２０に送出する例である。これに応じて、図１に示す送液システム１００において、第３液体に対応した貯留槽、プランジャーポンプ及び合流路に至る流路が設けられるが、これらについては第１液体及び第２液体に対応したものと同じであり、図示は省略する。

図５の上段及び中段は、それぞれ第１ポンプ１２１及び第２ポンプ１２２の駆動を経時的に示したもので、その表示については上記した第１例と同じである。図５の下段は同様に、第３液体の送出を行うプランジャーポンプの駆動を経時的に示したもので、第３液体を含むシリンジ内にプランジャーを押し込む時間を、第１ポンプ１２１及び第２ポンプ１２２体とは別のハッチングにて示し、シリンジ内に押し込まれたプランジャーをシリンジ内から引き上げる時間を白抜きにて示している。

本例では、第１液体を含む第１ポンプ１２１のシリンジ内にプランジャーを所定時間（ｔ_１１）の間押し込み、第１液体を合流路１１０へ送出する。次に第２液体を含む第２ポンプ１２２のシリンジ内にプランジャーを所定時間（ｔ_２）の間押し込み、第２液体を合流路１１０へ送出する。そして第１液体のみを再び所定時間（ｔ_１２）の間送出し、その後第３液体のみを所定時間（ｔ_３）の間送出することを繰り返す。また、あるプランジャーポンプのプランジャーがシリンジに押し込んでいる間は、他のプランジャーポンプはシリンジ内に押し込まれたプランジャーを引き上げて、貯留槽からシリンジ内に液体を取り込む。

すなわち、本例では、あらかじめ定めた順番として、合流路１１０へ第１液体のみ、第２液体のみ、第１液体のみ、第３液体のみをこの順で送出することの繰り返しが１単位の送液パターンである。そしてこの送液パターンの１単位の時間長さ、すなわち、第１液体の２回にわたる送出時間ｔ_１（＝ｔ_１１＋ｔ_１２）と、第２液体の送出時間ｔ_２と、第３液体の送出時間ｔ_３との合計が、送液周期Ｃｙ（秒）である。この送液周期Ｃｙの間に、第１液体が送出される単位時間当たり流量Ｑ_１（ｍ^３／秒）と、第２液体が送出される単位時間当たり流量Ｑ_２（ｍ^３／秒）と、第３液体が送出される単位時間当たり流量Ｑ_３（ｍ^３／秒）との合計が、この送液周期Ｃｙの１回によって送出される溶離液の単位時間当たり流量Ｑ（ｍ^３／秒）である。本例では第１液体、第２液体、第３液体を１：１：１で混合する。そのため、単位時間当たり流量Ｑ_１、Ｑ_２、Ｑ_３はそれぞれ単位時間あたり流量Ｑの３分の１にする。なお、溶離液の混合液の混合比を変更する場合は第１例と同様である。また本例では第１液体は１回の送液周期中に２回送液される。この２回の送液のそれぞれの流量の合計が流量Ｑ１となるように、第１液体を送液すればよい。この単位時間当たり流量Ｑをパラメータとする混合係数（Ｍａ）の意義については上記第１例と同様である。

［送液パターン：第３例］
本実施態様の送液システム１００による送液パターンの第３例を、図６のタイムチャートを参照しつつ説明する。本例では、複数種類の溶離液として、第１例と同様に第１液体及び第２液体の２種類が使用する。第１液体、第２液体を１：１で混合した混合液を単位時間当たり流量ＱでＨＰＬＣカラムに送出する例である。図６の上段及び下段は、それぞれ第１ポンプ１２１及び第２ポンプ１２２の駆動を経時的に示したもので、その表示については上記した第１例と同じである。

本例では、第１液体及び第２液体はそれぞれ、所定時間ｔ_１の間は合流路１１０へ送出され、次いで別の所定時間ｔ_２の間は合流路１１０への送出が停止されるという送液パターンを繰り返す。本例は、上記した第１例とは、第１液体の送出と第２液体の送出とが同時に行われる時間がある、という点で相違する。つまり、あらかじめ定めた順番として、合流路１１０へ第１液体及び第２液体を同時に送出し、第１液体のみを送出し、再び第１液体及び第２液体を同時に送出し、第２液体のみを送出することを繰り返す。この合流路１１０への第１液体、第２液体の送出の繰り返しが送液パターンである。

ここで、第１液体の送出時間ｔ_１は、第１液体及び第２液体が同時に合流路１１０へ送出される時間であるｔ_４と、第１液体のみが合流路１１０へ送出される時間（すなわち、第２液体の合流路１１０への送出が停止されている時間）であるｔ_２と、再び第１液体及び第２液体が同時に合流路１１０へ送出される時間であるｔ_５との合計である。一方、第２液体の送出時間ｔ_１もまた、第１液体及び第２液体が同時に合流路１１０へ送出される時間であるｔ_５と、第２液体のみが合流路１１０へ送出される時間（すなわち、第１液体の合流路１１０への送出が停止されている時間）であるｔ_２と、再び第１液体及び第２液体が同時に合流路１１０へ送出される時間であるｔ_４との合計である。したがって、本例では、第１液体のみの送出時間ｔ_２と、第２液体のみの送出時間ｔ_２と、第１液体と第２液体を同時に送出する送出時間ｔ_４と送出時間ｔ_５との合計時間が、送液周期Ｃｙ（秒）である。換言すると、第１液体の送出開始時点から、送出停止時間（ｔ_２）を経て次の送出開始時点までを送液周期Ｃｙと捉えることができる。あるいは、第２液体の送出時間ｔ_１と、第１液体の送出が停止されている時間ｔ_２との合計が、送液周期Ｃｙ（秒）ということもできる。また、第２液体の送出開始時点から、送出停止時間（ｔ_２）を経て次の送出開始時点までを送液周期Ｃｙと捉えることもできる。いずれの場合も、この送液周期Ｃｙの間に、第１液体を送出する単位時間当たり流量Ｑ_１（ｍ^３／秒）と、第２液体を送出する単位時間当たり流量Ｑ_２（ｍ^３／秒）との合計が、この送液周期Ｃｙの１回によって送出される溶離液の単位時間当たり流量Ｑ（ｍ^３／秒）である。本例では第１液体、第２液体を１：１で混合する。そのため、単位時間当たり流量Ｑ１、Ｑ２はそれぞれ単位時間あたり流量Ｑの２分の１にする。なお、溶離液の混合液の混合比を変更する場合は第１例と同様である。この単位時間当たり流量Ｑをパラメータとする混合係数（Ｍａ）の意義については上記第１例と同様である。

＜第２実施態様＞
本開示の送液システム１００を含むＨＰＬＣ分析システム１０は、たとえば、図７の模式図に示す第２実施態様のように構成することができる。この第２実施態様の送液システム１００は、弁の導通を切り替えることで合流路１１０に複数の溶離液として第１液体及び第２液体の２種類を順に送液する点で第１実施態様とは送液手段の構成が異なる。具体的には、以下の構成を備える。第１液体は第１貯留槽１４１に貯留され、また、第２液体は第２貯留槽１４２に貯留される。第１貯留槽１４１から第１液体が合流路１１０へ送出される第１流路１３１と、第２貯留槽１４２から第２液体が合流路１１０へ送出される第２流路１３２とが、合流路１１０の直前で合流する合流部１３０には三方弁１６０が設けられている。合流路１１０の途中には、第１液体と第２液体との両方の送出に関与する共通ポンプ１２０が設置されている。共通ポンプ１２０の上流及び下流にはそれぞれ、上流から下流への流れのみが可能な逆止弁１７０が装着されている。共通ポンプ１２０は、持続的な送液が可能なものであれば特に種類は限定されないが、たとえば、ペリスタポンプを用いることが望ましい。

合流路１１０は、共通ポンプ１２０以外の部分は管状を呈し、共通ポンプ１２０を含んだ長さがＬ（ｍ）、管状部分の断面積がＤ（ｍ^２）である。なお、共通ポンプ１２０以外の管状部分の流路の長さ、断面積を合流路１１０の長さＬ（ｍ），断面積Ｄ（ｍ^２）としてもよい。また共通ポンプ１２０内部の流路の長さ、断面積を合流路１１０の長さＬ（ｍ），断面積Ｄ（ｍ^２）としてもよい。また、合流路１１０の管状部分と共通ポンプ１２０内部の流路の断面積が異なる場合は、合流路１１０の管状部分と共通ポンプ１２０内部の流路の長さと断面積の積をそれぞれ算出し、その積の和をＭａを定義する式中の長さＬ（ｍ）と断面積Ｄ（ｍ^２）の積として用いてもよい。合流路１１０の下流端は、ＨＰＬＣカラム２０の上流端と連結している。ＨＰＬＣカラム２０については前記第１実施態様と同様である。

上記した共通ポンプ１２０の作動及び三方弁１６０の流路切り替えは、いずれも制御部１８０による制御に服する。制御部１８０については前記第１実施態様と同様である。

本実施態様の送液システム１００においては、溶離液の送出が行われる間、制御部１８０は共通ポンプ１２０を持続的に作動させる。そして、制御部１８０が、三方弁１６０を制御することで、第１流路１３１と合流路１１０との導通と、第２流路１３２と合流路１１０との導通とを切り替える。すなわち、第１流路１３１と合流路１１０とが導通している間は、共通ポンプ１２０により第１液体が合流路１１０に送出される。また、第２流路１３２と合流路１１０とが導通している間は、共通ポンプ１２０により第２液体が合流路１１０に送出される。

つまり、第１実施態様は第１ポンプ１２１及び第２ポンプ１２２のプランジャーの駆動によって合流路１１０に複数種類の溶離液を順に送液するが、第２実施態様は三方弁１６０の導通を切り替えることで合流路１１０に複数種類の溶離液を順に送液する。第１実施態様の送液パターンの第１例を例に挙げて第２実施態様の送液パターンの第１例を説明する。制御部１８０が、三方弁１６０を制御することで、図３に示す所定時間（ｔ_１）の間、第１流路１３１と合流路１１０とを導通させる。その間、制御部１８０は三方弁１６０を制御し、第２流路１３２と合流路１１０を遮断する。次いで制御部１８０は三方弁１６０を制御することで所定時間（ｔ_２）の間、第１流路１３１と合流路１１０とを遮断する。その間、第２流路１３２と合流路１１０とを導通させる。すなわち、複数種類の溶離液である第１液体及び第２液体は、それぞれ、送出されている時間と送出されていない時間とが繰り返される。この時間ｔ_１（秒）とｔ_２（秒）との合計が、送液周期Ｃｙ（秒）となる。なお、時間ｔ_１（秒）とｔ_２（秒）とは、互いに違う長さであっても、また、同じ長さであってもいずれでもよい。この送液周期Ｃｙの間に、第１液体が送出される流量Ｑ_１（ｍ^３／秒）と、第２液体が送出される流量Ｑ_２（ｍ^３／秒）との合計が、この送液周期Ｃｙの１回によって送出される溶離液の流量Ｑ（ｍ^３／秒）である。

なお、本実施態様においては、第１流路１３１と合流路１１０との導通、第２流路１３２と合流路１１０との導通を切り替えることができればよい。そのため三方弁１６０の替わりに第１流路１３１、第２流路１３２のそれぞれに弁を設け、それぞれの弁の導通を制御部１８０で切り替えてもよい。

第２実施態様の送液パターンの第２例、第３例は、合流路への複数種類の溶離液の送液を弁の導通で切り替えること以外は第１実施態様の送液パターンの第２例、第３例と同様である。

本実施態様においても、前記した混合係数Ｍａの意義については前記した第１実施態様と同様である。

＜第３実施態様＞
本開示の送液システム１００を含むＨＰＬＣ分析システム１０は、たとえば、図８の模式図に示す第３実施態様のように構成することができる。この第３実施態様の送液システム１００は、弁の導通を切り替えることで合流路１１０に複数の溶離液として第１液体及び第２液体の２種類を順に送液する点で第１実施態様とは送液手段の構成が異なる。またポンプを溶離液の種類ごとに設ける点で第２実施態様とも異なる。この第３実施態様の送液システム１００においてもまた、複数の溶離液として第１液体及び第２液体の２種類が使用される。第１液体は第１貯留槽１４１に貯留され、第１ポンプ１２１によって持続的に第１流路１３１を経て合流路１１０へ送出される。第２液体は第２貯留槽１４２に貯留され、第２ポンプ１２２によって持続的に第２流路１３２を経て合流路１１０へ送出される。なお、第１ポンプ１２１の上流及び下流並びに第２ポンプ１２２の上流及び下流にはそれぞれ、上流から下流への流れのみが可能な逆止弁１７０が装着されている。

第１ポンプ１２１及び第２ポンプ１２２に用いられるポンプは、持続的な送液が可能なものであれば特に種類は限定されないが、たとえば、ペリスタポンプを用いることが望ましい。

第１流路１３１と第２流路１３２とが、合流路１１０の直前で合流する合流部１３０には三方弁１６０が設けられている。

合流路１１０は長さＬ（ｍ）、断面積Ｄ（ｍ^２）の管状を呈し、その容積はＬとＤの積である。合流路１１０の下流端は、ＨＰＬＣカラム２０の上流端と連結している。

上記した第１ポンプ１２１及び第２ポンプ１２２の作動並びに三方弁１６０の流路切り替えは、いずれも制御部１８０による制御に服する。制御部１８０については前記第１実施態様と同様である。

本実施態様の送液システム１００においては、溶離液の送出が行われる間、制御部１８０は第１ポンプ１２１及び第２ポンプ１２２を持続的に作動させる。そして、制御部１８０が、三方弁１６０を制御することで、第１流路１３１と合流路１１０との導通と、第２流路１３２と合流路１１０との導通とを切り替える。すなわち、第１流路１３１と合流路１１０とが導通している間は、第１ポンプ１２１により第１液体が合流路１１０に送出される。また、第２流路１３２と合流路１１０とが導通している間は、第２ポンプ１２２により第２液体が合流路１１０に送出される。

つまり、第１実施態様は第１ポンプ１２１及び第２ポンプ１２２のプランジャーの駆動によって合流路１１０に複数種類の溶離液を順に送液するが、第３実施態様は三方弁１６０の導通を切り替えることで合流路１１０に複数種類の溶離液を順に送液する。第１実施態様の送液パターンの第１例を例に挙げて第３実施態様の送液パターンの第１例を説明する。制御部１８０が、三方弁１６０を制御することで、図３に示す所定時間（ｔ_１）の間、第１流路１３１と合流路１１０とを導通させる。その間、制御部１８０は三方弁１６０を制御し、第２流路１３２と合流路１１０を遮断する。次いで制御部１８０は三方弁１６０を制御することで所定時間（ｔ_２）の間、第１流路１３１と合流路１１０とを遮断する。その間、第２流路１３２と合流路１１０とを導通させる。すなわち、複数種類の溶離液である第１液体及び第２液体は、それぞれ、送出されている時間と送出されていない時間とが繰り返されるこの時間ｔ_１（秒）とｔ_２（秒）との合計が、送液周期Ｃｙ（秒）となる。なお、時間ｔ_１（秒）とｔ_２（秒）とは、互いに違う長さであっても、また、同じ長さであってもいずれでもよい。この送液周期Ｃｙの間に、第１液体が送出される流量Ｑ_１（ｍ^３／秒）と、第２液体が送出される流量Ｑ_２（ｍ^３／秒）との合計が、この送液周期Ｃｙの１回によって送出される溶離液の流量Ｑ（ｍ^３／秒）である。

なお、本実施態様においては、第１流路１３１と合流路１１０との導通、第２流路１３２と合流路１１０との導通を切り替えることができればよい。そのため三方弁１６０の替わりに第１流路１３１及び第２流路１３２のそれぞれに弁を設け、それぞれの弁の導通を制御部１８０で切り替えてもよい。

第３実施態様の送液パターンの第２例、第３例は、合流路１１０への複数種類の溶離液の送液を弁の導通で切り替えること以外は第１実施態様の送液パターンの第２例、第３例と同様である。

本実施態様においても、前記した混合係数Ｍａの意義については前記した第１実施態様と同様である。

実施例として、本開示のＨＰＬＣ分析システム１０を用いて第１液体、第１液体と第２液体の混合液を流量３．６ｍＬ／分で合流路１１０を介してＨＰＬＣカラム２０に送液し、血中ヘモグロビンを測定した例を示す。

［溶離液の組成］
表１に記載の成分を含むｐＨ５．２５の溶離液を調製し、第１液体とした。また下記表４に記載の成分を含むｐＨ６．８５の溶離液を調製し、第２液体とした。

［装置構成］
断面が直径０．３ｍｍの円形で合計長さが５３０ｍｍの管の途中に血液検体を導入するためのインジェクションバルブを設けた。管の長さＬ（ｍ）と断面積Ｄ（ｍ^２）の積、つまり管の容積は３７．４ｍｍ^３（３７．４×１０^－９ｍ^３）である。そしてインジェクションバルブ内部の溶離液が流れる流路の長さは１５．３ｍｍ、断面の直径は０．５ｍｍ、断面積は０．１９６ｍｍ^２であり、インジェクションバルブ内部の流路の長さＬ（ｍ）と断面積Ｄ（ｍ^２）の積、つまりインジェクションバルブ内部の流路の容積は３ｍｍ^３（３×１０^－９ｍ^３）である。合流路１１０の下流にヘモグロビン分離用のカラムを設けた。そしてカラムの下流の流路に４１５ｎｍの吸光度を測定してヘモグロビンを検出するための吸光度計を設けた。また、第１ポンプ１２１及び第２ポンプとしてそれぞれプランジャーポンプを用いた。それ以外の構成は第１実施態様と同様である。

［測定手順］
（測定前処理）
測定前処理は送液システムの検証１と同様に行った。

（カラム平衡化）
第１ポンプ１２１で第１貯留槽１４１の第１液体を３．６ｍＬ／分で３分間送液し、カラムを平衡化させた。

（分離分析）
蒸留水で溶血させた血液検体１６μＬをインジェクションバルブを介して合流路１１０に導入した。導入後、第１ポンプ１２１を駆動し、合流路１１０に第１液体を流量３．６ｍＬ／分で１７秒間送液した。

次に、合流路１１０に第１液体及び第２液体を３：７で混合した溶離液を流量３．６ｍＬ／分（６０×１０^（－９）ｍ^３／秒）で７秒間カラムに送液した。ここで合流路１１０の長さＬ（ｍ）と断面積Ｄ（ｍ^２）の積、つまり合流路１１０の容積は、管のＬ（ｍ）と断面積Ｄ（ｍ^２）の積である３７．４ｍｍ^３（３７．４×１０^－９ｍ^３）とインジェクションバルブの長さＬ（ｍ）と断面積Ｄ（ｍ^２）の積である３ｍｍ^３（３×１０^－９ｍ^３）との和である４０．４ｍｍ^３（４０．４×１０^－９ｍ^３）である。そこで合流路１１０の容積である４０．４ｍｍ^３（４０．４×１０^－９ｍ^３）及び単位時間当たり流量３．６ｍＬ／分（６０×１０^（－９）ｍ^３／秒）によってＭａが１となる送液周期Ｃｙを算出したところ、送液周期Ｃｙは０．６７３秒であった。同様にＭａが０となる送液周期Ｃｙを算出すると、送液周期Ｃｙは０秒であった。ここから、Ｍａが０＜Ｍａ≦１とするためには、送液周期Ｃｙを０秒よりも大きく０．６７３秒以下にすればよいことがわかった。換言すると、合流路１１０に第１液体と第２液体を混合した溶離液を流量３．６ｍＬ／分（６０×１０^－６ｍ^３／秒）で送液するためには、第１液体と第２液体とを交互に送液することを０．６７３秒以下の周期で繰り返せばよいことがわかった。そこで第１液体及び第２液体の合流路１１０への送液を０．５秒の周期で繰り返すこととし、第１ポンプ１２１で第１液体を０．２５秒送液して停止し、引き続き、第２ポンプ１２２で第２液体を０．２５秒送液して停止することにした。そして、第１液体と第２液体を３：７で混合した溶離液を送液するために、第１液体の単位時間当たり流量Ｑ_１は合流路１１０への単位時間当たり流量３．６ｍＬ／分（６０×１０^－６ｍ^３／秒）の１０分の３である１．０８ｍＬ／分とした。同じく第２液体の単位時間当たり流量Ｑ_２は合流路１１０への単位時間当たり流量３．６ｍＬ／分（６０×１０^－６ｍ^３／秒）の１０分の７である２．５２ｍＬ／分とした。換言すると、第１ポンプ１２１で第１液体を２．１６ｍＬ／分で０．２５秒送液して停止した。その後第２ポンプ１２２で第２液体を５．０４ｍＬ／分で０．２５秒送液して停止した。この第１ポンプ１２１及び第２ポンプ１２２による合流路１１０への溶離液の送液及び停止の繰り返しを７秒間行った。なお、第１ポンプ１２１又は第２ポンプのいずれか一方が合流路１１０へ溶離液を送液している間、他方のシリンジ内からプランジャーを引き上げて、貯留槽からシリンジ内に溶離液を取り込ませた。

次に、合流路１１０に第１液体と第２液体を１：９で混合した溶離液を流量３．６ｍＬ／分で１６秒間カラムに送液した。上記と同様に合流路１１０に第１液体及び第２液体を１：９で混合した溶離液を流量３．６ｍＬ／分（６０×１０^－６ｍ^３／秒）で送液するためには、第１液体と第２液体とを交互に送液することを０．６７３秒以下の周期で繰り返せばよい。そこで第１液体及び第２液体の送液を０．５秒の周期で繰り返すこととし、第１ポンプ１２１で第１液体を０．２５秒送液して停止し、引き続き、第２ポンプ１２２で第２液体を０．２５秒送液して停止することにした。そして、第１液体及び第２液体を１：９で混合した溶離液を送液するために、第１液体の単位時間当たり流量Ｑ_１は合流路１１０への単位時間当たり流量３．６ｍＬ／分（６０×１０^－６ｍ^３／秒）の１０分の１である０．３６ｍＬ／分とした。同じく第２液体の単位時間当たり流量Ｑ_２は合流路１１０への単位時間当たり流量３．６ｍＬ／分（６０×１０^－６ｍ^３／秒）の１０分の９である３．２４ｍＬ／分とした。換言すると、第１ポンプ１２１で合流路１１０へ第１液体を０．７２ｍＬ／分で０．２５秒送液して停止した。その後第２ポンプ１２２で合流路１１０へ第２液体を６．４８ｍＬ／分で０．２５秒送液して停止した。この第１ポンプ１２１及び第２ポンプ１２２の駆動と停止の繰り返しを１６秒間行った。

インジェクションバルブを切り替えた時点から、カラムの下流の流路に設けた吸光度計で４１５ｎｍの吸光度を経時的に測定し、経過時間（秒）と４１５ｎｍの吸光度とのクロマトグラムを得た。

［測定結果］
本実施例の分離分析で得られた血中ヘモグロビンのクロマトグラムを図１２に示す。なお、図中、Ａで示す区間は第１液体のみを溶離液として送液した時間を示し、Ｂで示す区間は第１液体及び第２液体を３：７で混合した溶離液を送液した時間を示し、Ｃで示す区間は第１液体及び第２液体を１：９で混合した溶離液を送液した時間を示す。経過時間約１３秒の時点でＨｂＡ１ｃのピークが得られた。また経過時間約２２秒の時点にＨｂＡのピークが得られた。このことから合流路にミキサーを設けなくても、血中ヘモグロビンを分離分析することができることが示された。このように、本実施例によって、測定中に、検出したいピークに応じた適切な割合になるよう、溶離液を速やかに調整することができることが示された。

本発明は、ＨＰＬＣに代表される液体クロマトグラフィによる分析システムに利用可能である。

１０ ＨＰＬＣ分析システム
２０ ＨＰＬＣカラム
１００ 送液システム
１１０ 合流路
１２０ 共通ポンプ
１２１ 第１ポンプ
１２２ 第２ポンプ
１２３ 第３ポンプ
１３０ 合流部
１３１ 第１流路
１３２ 第２流路
１３３ 第３流路
１４１ 第１貯留槽
１４２ 第２貯留槽
１５１ 第１弁
１５２ 第２弁
１６０ 三方弁
１７０ 逆止弁
１８０ 制御部
１８１ ＣＰＵ
１８２ ＲＯＭ
１８３ ＲＡＭ
１８４ ストレージ
１８９ バス

Claims (9)

1. 液体クロマトグラフィカラム（ＬＣカラム）と、
   複数種類の溶離液を貯留する複数の貯留槽と、
   前記複数の貯留槽と接続する複数の流路が合流する合流部と、
   前記ＬＣカラムと前記合流部を接続する合流路と、
   前記ＬＣカラムに前記合流路を介して前記複数種類の溶離液を送出する送液手段と、
   前記複数種類の溶離液を、単位時間当たりに前記合流路を流れる前記複数種類の溶離液の流量の合計である流量Ｑで、あらかじめ定めた順番で前記ＬＣカラムに送出することを送液周期Ｃｙで繰り返すように前記送液手段を制御する制御部と、を有し、
   前記合流路の長さをＬ及び断面積をＤ、としたとき、
   Ｍａ＝（Ｑ・Ｃｙ）／（Ｌ・Ｄ）
   で定義される混合係数Ｍａが、
   ０＜Ｍａ≦１
   である、液体クロマトグラフィ分析システム。
2. 前記送液手段は前記複数の流路に設けられた複数のポンプを有し、
   前記制御部は前記複数のポンプをあらかじめ決められた順番で駆動することにより前記複数の溶離液を前記ＬＣカラムへ送出する、請求項１に記載の液体クロマトグラフィ分析システム。
3. 前記複数のポンプはプランジャーポンプを含み、
   前記制御部は前記プランジャーポンプが前記溶離液を前記ＬＣカラムへ送出していない時間に、前記貯留槽から前記プランジャーポンプ内に前記溶離液を取り込むように前記プランジャーポンプを駆動する、請求項２に記載の液体クロマトグラフィ分析システム。
4. 前記送液手段は前記複数種類の溶離液を前記合流路に送液するポンプと、
   前記貯留槽と前記合流路の間に設けられた弁を有し、
   前記制御部は前記弁の導通を切り替えることにより、前記ポンプで送液される前記複数種類の溶離液を予め決められた順番で前記ＬＣカラムに送出する、請求項１に記載の液体クロマトグラフィ分析システム。
5. 前記流量Ｑは、前記送液周期Ｃｙの１回において前記貯留槽に貯留されている前記複数種類の溶離液が前記送液手段によって送出される流量の総計を前記送液周期Ｃｙの１回の時間で除したものである、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィ分析システム。
6. 前記流量Ｑは、前記貯留槽に貯留されている複数種類の溶離液それぞれの送液周期Ｃｙの１回の時間における単位時間当たり流量の和である、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィ分析システム。
7. 前記制御部は、前記ＬＣカラムに送液する前記溶離液の混合比率に基づいて、複数の前記貯留槽に貯留されている溶離液それぞれの単位時間当たり流量を調整する、請求項１から請求項６までのいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィ分析システム。
8. 血液ヘモグロビンのうちＨｂＡ１ｃ分画を測定する、請求項７に記載の液体クロマトグラフィ分析システム。
9. 前記ＬＣカラムはＨＰＬＣカラムである、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィ分析システム。

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