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JP7138301B2 - 微小液滴の容器、微小液滴の容器製造方法、微小液滴敷き詰め方法、微小液滴生成試薬キット、温度制御装置、微小液滴生成用の油相組成物及びその処理方法 - Google Patents

微小液滴の容器、微小液滴の容器製造方法、微小液滴敷き詰め方法、微小液滴生成試薬キット、温度制御装置、微小液滴生成用の油相組成物及びその処理方法 Download PDF

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JP7138301B2 JP2020560538A JP2020560538A JP7138301B2 JP 7138301 B2 JP7138301 B2 JP 7138301B2 JP 2020560538 A JP2020560538 A JP 2020560538A JP 2020560538 A JP2020560538 A JP 2020560538A JP 7138301 B2 JP7138301 B2 JP 7138301B2
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Description

関連出願
本出願は、２０１８年０１月２４日に出願された「デジタルＰＣＲ定量検出方法」という第２０１８１００７０３７７．２号、及び、２０１８年０７月２７日に出願された「微小液滴の容器及びその製造方法」という第２０１８１０８４３２５７．１号の中国特許出願を優先権として主張し、それらのすべてをここで参照として援用する。
本出願は、微小液滴分野に関し、特に、微小液滴の容器、微小液滴の容器製造方法、微小液滴敷き詰め方法、微小液滴生成試薬キット、温度制御装置、微小液滴生成用の油相組成物及びその処理方法に関する。
デジタルＰＣＲ（Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ、ｄＰＣＲ）は、核酸分子の絶対定量に係る技術である。デジタルＰＣＲは、ｑＰＣＲに比べると、ＤＮＡ分子の個数を直接に数えるため、初期試料のコピー数に対する絶対定量である。
近年、デジタルＰＣＲの技術は、速く発展されている。従来のマイクロナノ製造とマイクロフロー制御技術による集積マイクロフロー制御チップ、ミクロ細孔マトリックスチップ及び液滴マイクロフロー制御チップは、使い捨て消耗品に該当し、クロス汚染を避けるように、一度検知に用いられると、捨てられてなければならない。しかしながら、実際の工程では、微小液滴の個数について、依然として制限が存在しており、消耗品としてコストが比較的高い。従来の微小液滴の容器全体は、その液面が円弧形である。その液面が凹形状の液面を呈していることから、複数の微小液滴は、下向きに降下する工程に、微小液滴の容器の中央の箇所に集中して集められることにより、バッチ処理で微小液滴の蛍光画像に干渉を与えてしまうことがある。複数の微小液滴を生成する工程では、従来の油相組成物が使われると、粘度などの物理性質に変化度合いが比較に大きい。また、生成された微小液滴は、体積の大きさの均一性が比較的悪い。また、従来の温度制御装置は、昇降温の速度が遅いことから、核酸を増幅するに必要な時間が長く、デジタルＰＣＲによる検知の効率が悪い。
このことに鑑み、本出願が提供する微小液滴の容器は、底面、前記底面を囲むように配置される第一の環状側面及び環状面を含む。前記第一の環状側面は、前記底面と垂直して接続され、開口を有する収容空間を形成するように囲まれる。前記環状面は、前記開口を取り巻くように配置され、前記第一の環状側面に接続され、前記底面と平行する。前記収容空間は、複数の微小液滴及び油相組成物を収容するために用いられる。前記環状面が前記底面と平行することにより、使用されている際に、前記油相組成物を前記環状面に添加すると、前記微小液滴の容器中の液体表面が水平面であるように確保することができる。前記環状面を配置することにより、前記微小液滴の容器の液面が平面の状態になり、前記微小液滴の容器全体の液面が円弧形であるように確保することができる。従って、前記微小液滴の容器により、前記容器における底板と近い辺縁の箇所に位置する微小液滴の観測に影響を与えることなく、イメージングを便宜に撮影することができ、前記複数の微小液滴の検知の個数が多くなる。
このことに鑑み、本出願が提供する微小液滴の容器は、第一の容器の底板、多角形形状の周辺枠及び容器蓋を含む。前記第一の容器の底板には、複数の多角形形状の突出部が配置されている。前記多角形形状の周辺枠は、第一の収容空間を形成するように囲み、前記第一の容器の底板に接続され、前記複数の多角形形状の突出部は、前記第一の収容空間に配置される。前記容器蓋は、前記多角形形状の周辺枠における前記第一の容器の底板から離れた表面に配置され、前記多角形形状の周辺枠に着脱可能に接続され、前記多角形形状の周辺枠と共に、油類の収容溝を形成するように囲まれる。前記多角形形状の周辺枠は、その両側が前記第一の容器の底板及び前記容器蓋にそれぞれ接続され、前記容器蓋は、前記多角形形状の周辺枠に着脱可能に接続され、前記微小液滴の容器が密封可能である。前記容器蓋は、前記多角形形状の周辺枠と共に、油類の収容溝を形成するように囲まれ、前記容器蓋により前記微小液滴の容器を密封する時に、前記微小液滴の容器における余計な油類物質を前記油類の収容溝に押圧することができ、検知工程に対する微小液滴の上層部分の油類物質の影響を可及的に回避することができ、油類物質による蛍光の背景を解消することができる。また、前記微小液滴の容器における余計な油類物質を前記油類の収容溝に押し出すことにより、前記微小液滴の容器における複数の微小液滴と接触する油類物質が少なくなり、油類物質が水飽和でない場合に、複数の微小液滴の水分が吸収され、微小液滴の水分が蒸発してしまうという問題を解決することができる。前記微小液滴の容器により油性液体を貯蔵すると、気泡が空気の混入により発生し、前記蛍光信号検出装置により、前記複数の微小液滴の蛍光変化イメージをリアルタイムで撮影することに影響を与えてしまうことがある。従って、前記微小液滴の容器を密封することにより、前記微小液滴の容器が３～５度という角度で傾斜する場合に、前記微小液滴の容器からの液体の流出を回避できるに加えて、前記微小液滴の容器から気泡が排出するようにして、撮影により検知する時に、気泡による画像の影響を回避することができる。
このことに鑑み、本出願が提供する微小液滴生成用の油相組成物は、鉱油及び界面活性剤の成分を含む。前記油相組成物において、前記鉱油の体積パーセントが８８％－９８．５％である。前記界面活性剤は、鎖状アルキル基を含むシロキサン鎖非イオン性界面活性剤を含む。上記鉱油と、長鎖アルキル基を含むシロキサン鎖非イオン性界面活性剤と、を含む微小液滴生成用の油相組成物の密度は、１ｇ／ｍｌ未満であると、大部分の種類の第一の液体を液体吐出ピペットチップの出口端から脱離して微小液滴を形成した後に、第二の液体中を降下することができる。鎖状アルキル基を含むシロキサン鎖非イオン性界面活性剤により、数多くの微小液滴の間に融合し合うことを防ぐことができる。
このことに鑑み、本出願が提供する微小液滴敷き詰め方法は、開口を有し、第二の液体を貯留している微小液滴の容器を提供するステップＳ３１１と、第一の液体を提供し、前記第一の液体は、その密度が前記第二の液体のほうよりも大きく、かつ、前記第二の液体と非相溶性を持つものとされ、前記第一の液体を、前記微小液滴の容器の底板に積み重ねられる複数の微小液滴として生成するステップＳ３１２と、前記複数の微小液滴を前記微小液滴の容器の底板に敷き詰めるまで、前記複数の微小液滴に高低温で循環を行うステップＳ３１３と、を含む。前記複数の微小液滴が前記微小液滴の容器の底板に敷き詰められるまで、前記複数の微小液滴に高低温で循環を行う。前記微小液滴敷き詰め方法では、熱膨脹と冷収縮という原理を用いて、敷き詰めを実現することができる。温度の変化について、温度が上がると、試料液滴の粘度が低くなり、体積が収縮する。また、温度が高いほど粘度が低く、試料液滴の形状が最も柔らかい。そして、前記複数の微小液滴が前記微小液滴の容器の底板に敷き詰められるので、撮影による検知に役立つ。
このことに鑑み、本出願が提供する温度制御装置は、フレキシブル回路基板、前記フレキシブル回路基板と間隔配置される加熱基板及び複数の半導体熱電対を含む。前記加熱基板は、対向配置される第一の表面及び第二の表面を含む。前記複数の半導体熱電対は、前記フレキシブル回路基板と前記第一の表面との間に配置され、互いに直列接続され、並列接続され、又は、直並列接続される。前記フレキシブル回路基板は、配線の密度が高く、重さが軽く、厚さが薄く、折り曲げ性が良いという利点を持っている。前記フレキシブル回路基板は、昇降温の工程に、自体の変形により熱応力を解消するので、前記温度制御装置の耐用年数を延ばすことができる。前記複数の微小液滴は、異なる温度範囲内に核酸を増幅する時に、前記フレキシブル回路基板、加熱基板及び複数の半導体熱電対により、僅か数秒時間だけに切り替えを迅速に実現することができる。前記温度制御装置は、瞬間で昇降温を行うことができ、昇降温の工程が短縮化し、高低温で循環を行い、前記デジタルＰＣＲ検出器による検知の時間が短縮化し、検知の効率が向上する。
本出願における実施例、又は、従来技術における態様をより明確に説明するように、以下に実施例又は従来技術を説明するに必要な図面を簡単に説明しておく。下記の説明における図面は、本出願の実施例に過ぎず、創造的労働をしない前提で、提供する図面に基づいて他の図面を得ることも当業者にとって自明である。
本出願が提供するデジタルＰＣＲ検出器の全体構造の模式図である。 本出願が提供するデジタルＰＣＲ検出器の微小液滴生成装置を示す。 本出願の一実施例が提供する液体吐出ピペットチップの出口端が運動する時に力を受ける液滴の模式図である。 本出願の一実施例が提供する液体吐出ピペットチップの出口端の速度変化の模式図である。 本出願の一実施例が提供する液体吐出ピペットチップの出口端が運動する時の微小液滴の生成工程の模式図である。 本出願の他の実施例が提供する液体吐出ピペットチップの出口端が運動する時に力を受ける液滴の模式図である。 本出願の一実施例が提供する液滴随液体吐出ピペットチップの出口端が運動する時の、理想の場合における、粘性抵抗の変化の模式図である。 本出願の一実施例が提供する液体吐出ピペットチップの出口端が二つの運動周期に一つの微小液滴を生成する工程の模式図である。 本出願の一実施例が提供する液体吐出ピペットチップの出口端が一つの運動周期に一つの微小液滴を生成する工程の模式図である。 本出願の一実施例が提供する液体吐出ピペットチップの出口端が一つの運動周期に二つの微小液滴を生成する工程の模式図である。 本出願の一実施例が提供する液体吐出ピペットチップが揺動する時に微小液滴を生成する工程の模式図である。 本出願の一実施例が提供する第二の液体の粘度が変化する時に微小液滴を生成する工程の模式図である。 本出願の一実施例が提供する液体吐出ピペットチップが交換された時に微小液滴を生成する工程の模式図である。 本出願の一実施例が提供する液体吐出ピペットチップの出口端が異なる運動軌跡で微小液滴を生成する工程の模式図である。 本出願の他の実施例が提供する液体吐出ピペットチップの出口端の速度変化の模式図である。 本出願の一実施例が提供する態様において、一つの試験の結果の分布図である。 本出願の一実施例が提供する態様一において、生成された高い均一性を持っている微小液滴の拡大図である。 本出願の一実施例が提供する態様一において、生成された低い均一性を持っている微小液滴の拡大図である。 本出願の一実施例が提供する態様二において、試験の結果の分布の模式図である。 本出願の一実施例が提供する態様二において、生成された高い均一性を持っている微小液滴の拡大図である。 本出願の一実施例が提供する態様二において、生成された低い均一性を持っている微小液滴の拡大図である。 本出願の一実施例が提供する態様二において、生成された高い熱安定性を持つ微小液滴の拡大図である。 本出願の一実施例が提供する態様二において、生成された低い熱安定性を持つ微小液滴の拡大図である。 本出願の一実施例が提供する態様三において、生成された微小液滴の拡大図である。 本出願の一実施例が提供する態様四において、生成された高い均一性を持っている微小液滴の拡大図である。 本出願の一実施例が提供する態様四において、生成された高い熱安定性を持つ微小液滴の拡大図である。 本出願に係る温度制御装置の構造の模式図である 本出願に係温度制御装置の構造の断面構造の模式図である。 本出願に係る温度制御装置の半導体熱電対の電極の接続構造の模式図である。 本出願に係る温度制御装置の瞬間的な性能テストの模式図である。 本出願に係る温度制御装置の定常的な性能テストの模式図である。 本出願に係る微小液滴の容器構造の模式図である。 本出願に係る微小液滴の容器構造の平面構造の模式図である。 本出願に係る微小液滴の容器の反応セル構造の模式図である。 本出願に係る微小液滴の容器の断面構造の模式図である。 本出願に係る微小液滴の容器の断面構造の模式図である。 本出願に係る微小液滴の容器の断面構造の模式図である。 本出願が提供する微小液滴の容器の全体構造の模式図である。 本出願が提供する微小液滴の容器の断面構造の模式図である。 本出願が提供する微小液滴の容器の容器蓋の構造の模式図である。 本出願が提供する微小液滴の容器の多角形形状の容器蓋フレームの構造の模式図である。 本出願が提供する微小液滴の容器の容器蓋の断面構造の模式図である。 本出願が提供する微小液滴の容器の第一の容器の底板の構造の模式図である。 本出願が提供する微小液滴の容器の多角形形状の周辺枠の複数の支持板の構造の模式図である。 本出願が提供する微小液滴の容器の多角形形状の周辺枠の複数の支持板の一部の拡大構造の模式図である。 本出願が提供する微小液滴の容器の多角形形状の周辺枠の複数の第二の支持ロッドの構造の模式図である。 本出願が提供する微小液滴の容器の多角形形状の周辺枠の複数の第二の支持ロッドの一部の拡大構造の模式図である。 本出願が提供する微小液滴の容器の全体構造の装着の模式図である。 本出願に係る微小液滴を敷き詰める方法のフローチャートである。 本出願に係る微小液滴の容器の底板に微小液滴が敷き詰められる模式図である。
以下では、本出願の実施例の添付図面を参照しながら、本出願の実施例の技術的解決手段を明確かつ完全に説明する。当然のことながら、ここで説明する実施例は、本願の実施例の全てではなく一部だけにすぎない。当業者にとって創造的な作業なしに本願の実施例に基づいて得られる全ての他の実施例は、本願の保護範囲に含まれるべきである。
本出願の目的、技術的手段及び利点をさらに明らかにするために、以下に、実施例及び図面を参照しながら、本出願をさらに詳細に説明する。ここで述べた具体的な実施例は本出願を解釈するために用いられ、本出願を限定するためのものではないことを理解するべきである。
図１を参照すると、一実施例では、本出願が提供するデジタルＰＣＲ検出器１は、微小液滴生成装置１０、温度制御装置２０、蛍光信号検出装置３０、定量解析装置４０及び制御器５０を含む。微小液滴生成装置１０は、核酸増幅反応液を微滴化し、複数の微小液滴を形成するために用いられる。温度制御装置２０は、微小液滴生成装置１０にレールを介して接続され、複数の微小液滴を温度制御装置２０に移転し、温度の循環で核酸増幅を実現するために用いられる。蛍光信号検出装置３０は、温度制御装置２０に対向配置され、核酸増幅された複数の微小液滴を撮影して検知するために用いられる。定量解析装置４０は、蛍光信号検出装置３０にデータ線を介して接続され、複数の微小液滴の蛍光情報を伝送して定量解析するために用いられる。制御器５０は、微小液滴生成装置１０、温度制御装置２０、蛍光信号検出装置３０及び定量解析装置４０にそれぞれ接続され、微小液滴生成装置１０、温度制御装置２０、蛍光信号検出装置３０及び定量解析装置４０を制御するために用いられる。
デジタルＰＣＲ検出器１は、微小液滴生成装置１０、温度制御装置２０、蛍光信号検出装置３０及び定量解析装置４０を集積化するため、操作員の自動での操作を実現することができる。デジタルＰＣＲ検出器１は、比較的に高い作業効率を有する。
デジタルＰＣＲ検出器１が稼働する時に、微小液滴生成装置１０は、測定すべき核酸増幅反応液を微滴化し、複数の微小液滴を形成する。温度制御装置２０は、複数の微小液滴に、核酸を増幅する。蛍光信号検出装置３０は、複数の微小液滴に、変化する蛍光のイメージをリアルタイムで撮影する。複数の微小液滴に係る変化する蛍光イメージに基づいて、複数の微小液滴に、変化する蛍光曲線を取得する。変化する蛍光曲線に基づいて、複数の微小液滴のＣｔ値を取得し、Ｃｔ値と初期コピー数との関係に基づいて、初期ＤＮＡの濃度を定量解析することができる。そのうち、Ｃｔ値とは、各微小液滴の蛍光信号が所定の閾値になるまで、経過した巡回数である。
温度制御装置２０は、複数の微小液滴を核酸増幅反応させ、蛍光信号検出装置３０により、核酸増幅反応された複数の微小液滴の産物の信号（例えば、蛍光、紫外線吸収や濁度などの信号）を採集する。前記複数の増幅された微小液滴と増幅されなかった微小液滴との構成の相違により、標的配列増幅が得られた液滴数を解析して、核酸分子への定量解析を最終的に実現することができる。前記複数の微小液滴に係る変化する蛍光のイメージをリアルタイムでモニターすることにより、検出の結果が直接性を有しているため、前記複数の微小液滴における偽陽性と偽陰性という問題を解決することができる。
デジタルＰＣＲ検出器１は、微小液滴生成装置１０、温度制御装置２０、蛍光信号検出装置３０及び定量解析装置４０を集積化するため、前記操作員の自動での操作を実現するだけではなく、作業効率が高まり、反応が急速となり、再度利用性がよく、感度が高く、特異性が強く、また、結果が明確となるという利点を持っている。
図２を参照すると、一実施例では、微小液滴生成装置１０が、液体吐出ピペットチップ１１０、流体駆動機構１２０、運動制御機構１３０及び第一の制御器１７０を含む。液体吐出ピペットチップ１１０は、出口端及び入口端を有し、第一の液体を貯留するために用いられる。微小液滴生成装置１０は、微小液滴の容器と協働して使用される。微小液滴の容器には、第二の液体が貯留されており、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端が第二の液体の液面下に挿入される。
第一の液体と第二の液体は、互いに非相溶を持ち、又は、界面反応を有する任意の二つの液体とされる。第一の液体と第二の液体とは、任意の非相溶を持つ二つの液体とされてもよい。本出願の一実施例では、第一の液体が水溶液であり、第二の液体が、水と互いに非相溶を持つ油性液体、例えば、鉱油（テトラデカンなどを含み）、植物油、シリコーンオイルやパーフルオロアルカンオイルなどであり、生成された液滴が水溶液の液滴となる。又は、第一の液体は、テトラデカンとｎ－ヘキサンなどの有機相であり、第二の液体は、鉱油と互いに非相溶を持つパーフルオロアルカンオイルである。第一の液体と第二の液体は、互いに非相溶を持つ水性両相であってもよい。本出願の他の実施例では、第一の液体が水溶液であり、第二の液体が水と互いに非相溶を持つ水性液体であり、例えば、第一の液体は、デキストラン溶液であり、第二の液体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）水溶液であり、生成された液滴は、デキストラン溶液の液滴となる。
第一の液体及び第二の液体は、界面反応を有する二つの液体とされてもよい。本出願の一実施例では、第一の液体は、アルギン酸ナトリウム水溶液であり、第二の液体は、例えば、質量濃度が１％の酸化カルシウムの水溶液である酸化カルシウム水溶液であり、両者に界面反応を有し、生成された液滴は、アルギン酸カルシウムゲルの微小球となる。本出願では、液体吐出ピペットチップ、又は、液体吐出ピペットチップから流れた第一の液体の成分を交換することにより、順次に、開口とされた容器に複数の異なる成分や体積の液滴を形成してもよい。そして、バッチ処理で微小体積にハイスループットでスクリーニングを実現できると共に、複数のステップにより生化学での超微量反応・検出を実現できるので、幅広い応用の見通しを持っている。
流体駆動機構１２０は、液体吐出ピペットチップ１１０の入口端に接続され、液体吐出ピペットチップ１１０の内部に貯留されている第一の液体を液体吐出ピペットチップ１１０の出口端から排出するために用いられる。運動制御機構１３０は、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端が第二の液体に対して所定軌跡、所定速度、又は、所定加速度に従って対向運動を行い、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端から排出された第一の液体が、表面張力、及び、液体吐出ピペットチップ１１０から受けられた付着力に打ち勝ち、微小液滴を形成するように制御するために用いられる。第一の制御器１７０は、流体駆動機構１２０及び運動制御機構１３０にそれぞれ接続され、流体駆動機構１２０及び運動制御機構１３０が協調して稼働するように制御するために用いられる。
従来において、液体吐出ピペットチップ注射／噴射法に存在している微小液滴を生成する過程が安定ではないという課題について、微小液滴を生成する過程に安定な微小液滴生成方法が提供される。
図３に示されるように、本出願に係る一実施例では、運動制御機構１３０の連動により、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が、第二の液体の液面下に、瞬間加速度運動を含む運動を行うことができ、ただし、加速度の大きさをa１とする。第一の液体は、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出されてから、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２に付着される液滴１９５が形成される。液滴１９５は、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が瞬間加速度運動をする瞬間で、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱離され、微小液滴を形成する。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱離されるまで受けられる微小液滴の作用力は、それぞれ、重力Ｇ、第二の液体の浮力f1、第二の液体の粘性抵抗f2、及び、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との間の最大付着力f3である。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱離されるまで微小液滴の質量をｍとし、加速度をa2とすると、ニュートン運動の第２法則により、
Figure 0007138301000001
液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との間の付着力の最大値ｆ３は、液体吐出ピペットチップ１１０の表面自由エネルギー、液滴１９５の表面張力及び液体吐出ピペットチップ１１０の幾何学的寸法に関連されている。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が瞬間加速度運動を行う時に、液滴１９５に対する液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の付着力の方向及び加速度の方向が同じである。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２に付着される液滴１９５を球状として簡略化する。ストークス（Ｓｔｏｋｅｓ）の式により、第二の液体において運動する時に受けられた液滴１９５の粘性抵抗がf2=6πηｒｖとなり、そのうち、ηが第二の液体の粘性係数であり、ｒが液滴１９５の半径であり、ｖが液滴１９５の運動速度である。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が瞬間加速度運動をする前に、液滴１９５の速度がゼロであることから、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が瞬間加速度運動をする瞬間で、第二の液体に受けられた液滴１９５の粘性抵抗f2は、ゼロ又は極めて小さい。微小液滴を生成する工程では、一般的に、液滴１９５の直径範囲がピコリットルからマイクロリットルのオーダーにあり、しかも、液滴１９５の重力Ｇと第二の液体の浮力f1との方向が反対であることから、液滴１９５の重力Ｇと第二の液体の浮力f1のベクトルの和がほぼゼロとなる。
Figure 0007138301000002
運動制御機構１３０は、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が瞬間加速度運動をする加速度の大きさを正確に制御することができる。従って、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が各瞬間加速度運動をする加速度の値を比較的大きくするように制御すれば、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が瞬間加速度運動をするということだけにより、液滴１９５を効果的に生成することができる。
このことに基づいて、本出願がさらに提供する微小液滴生成方法は、出口端１１２を有し、第一の液体を貯留している液体吐出ピペットチップ１１０を提供し、開口を有し第二の液体を貯留している微小液滴の容器を提供し、そのうち、第一の液体と第二の液体は、互いに非相溶を持ち、又は、界面反応を有する任意の二つの液体とされるステップＳ２０１と、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２を、微小液滴の容器の開口より、第二の液体の液面下に挿入するステップＳ２０２と、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体の液面下に、瞬間加速度運動を含む運動を行いながら、第一の液体を液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出し、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出された第一の液体により、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２に付着された液滴１９５を形成し、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が瞬間加速度運動をする過程において、液滴１９５を液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱離して第二の液体の液面下に、微小液滴を形成するステップＳ２０３と、を含む。
上記微小液滴生成方法では、前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が瞬間加速度運動を行う時に、加速度が比較的大きい。そして、前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２に付着された液滴１９５と前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２との間の付着力は、液滴１９５と前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２とを同期に加速して連動するために十分でないことから、前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２に付着された液滴１９５は、前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱離され、第二の液体の液面下に微小液滴を形成する。本出願が提供する微小液滴生成方法によれば、前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体の液面下に、瞬間加速度運動を行う時に微小液滴が発生するので、前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が運動している時に第二の液体に与えた干渉を低減して、微小液滴を生成する工程に安定性を確保することができる。
選択的に、ステップＳ２０３では、第一の液体を液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出する方式は、連続排出又は間欠排出であってもよい。具体的な排出方式は、実際の状況に応じて相応しい設計されてもよい。本実施例では、ステップＳ２０３に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２を介して各瞬間で加速度運動を十分に使用して微小液滴を形成するように、第一の液体を液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から連続排出する。一実施例では、ステップＳ２０３に、第一の液体を液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から一定の流速で排出することは、同じ時間間隔において、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出される第一の液体の体積が常に同じであるということを意味している。第一の液体を液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から一定の流速で排出することは、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動を制御することにより、微小液滴を生成する制御に役立つことができる。
本出願に係る一実施例では、ステップＳ２０３に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体の液面下に瞬間加速度運動を含む周期的な運動を行う。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体の液面下に周期的な運動を行うことは、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の変位、速度、及び、加速度のいずれも周期的にに変化することを意味している。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が瞬間加速度運動を含む周期的な運動を行い、第一の液体が液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から一定の流速で排出されるように協働して、微小液滴を等時間間隔で生成することを実現することができる。又は、第一の液体吐出液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の流速が変化しているものの、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の一つの運動周期内において、第一の液体吐出液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の体積が同じく保持される。従って、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が瞬間毎に加速度運動を行うまで、液滴１９５の体積を同じくすることにより、体積の一致する微小液滴を形成することを確保することができる。
液体吐出ピペットチップ１１０及び第一の液体が交換されない場合には、液体吐出ピペットチップ１１０の表面自由エネルギー、液体吐出ピペットチップ１１０の幾何学的寸法及び液滴１９５の表面張力が液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との最大付着力f3に影響を与える二つの要素として、変化しない。従って、液体吐出ピペットチップ１１０及び第一の液体が交換されない場合には、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との付着力の最大値f3が、変化しない。第一の液体は、流体駆動機構１２０の連動により、均一な流速で液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から連続排出される。運動制御機構１３０は、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が瞬間で加速度a1に従って加速度運動を行うタイミング及び瞬間の加速度a1を正確に制御することができる。流体駆動機構１２０及び運動制御機構１３０は、互いに協働すると、液滴１９５の体積が一定値になる瞬間で、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が加速度a1に従って瞬間で加速度を行うように駆動して、体積の一致する微小液滴を形成することが実現されやすい。流体駆動機構１２０は、第一の液体を液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から均一かつ連続で排出するように制御することができれば、運動制御機構１３０により、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が等時間間隔に瞬間加速度運動を行うように駆動するということだけで、体積の一致する微小液滴を形成することができる。
複数の液体吐出ピペットチップ１１０により、同時又は順次に微小液滴を生成する際には、液体吐出ピペットチップ１１０の表面自由エネルギー及び液体吐出ピペットチップ１１０の幾何学的寸法が液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との最大付着力f3に影響を与える二つの要素として変化する。しかしながら、多量で加工される場合に、液体吐出ピペットチップ１１０の表面自由エネルギー及び液体吐出ピペットチップ１１０の幾何学的寸法が一定の区間に変化するように制御可能である。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との最大付着力f3に影響を与えるもう一つの要素である液滴１９５の表面張力は、極めて小さい範囲だけに変化する。従って、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との付着力の最大値f3は、極めて小さい区間にのみ波動する。流体駆動機構１２０は、第一の液体を均一な流速で液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から連続排出するように駆動することができる。運動制御機構１３０は、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が瞬間加速度a1に従って運動を行うタイミング及び瞬間で加速度a1を正確に制御することができる。流体駆動機構１２０及び運動制御機構１３０は、互いに協働すると、液滴１９５の体積が一定値になる瞬間で、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が加速度a1に従って瞬間加速度運動を行うように駆動して、体積の一致する微小液滴を生成することが実現され易い。流体駆動機構１２０は、第一の液体を排出液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から均一かつ連続で排出するように制御することができれば、運動制御機構１３０により、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が等時間間隔に瞬間加速度運動を行うように駆動するということだけで、体積の一致する微小液滴を生成することができる。
流体駆動機構１２０は、第一の液体を均一な速度で液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出しながら、運動制御機構１３０と協働して、液滴１９５の体積が所定値になる瞬間で加速度が比較的大きい瞬間加速度運動を行わせるようにする。そして、本出願が提供する微小液滴生成方法は、同じ液体吐出ピペットチップ１１０により、体積が均一な液滴１９５を生成するということを確保することができるだけでなく、複数の液体吐出ピペットチップ１１０により、同時又は順次に生成された微小液滴に体積が均一であるということも確保することができる。本実施例が提供する微小液滴生成方法は、微小液滴に体積が均一であるということを確保することができ、複数の液体吐出ピペットチップ１１０により微小液滴を同時に生成して微小液滴の生成効率を高めることもできる。
さらに、運動制御機構１３０の制御によれば、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の一つの運動周期に、複数の瞬間加速度運動が含まれており、複数の瞬間加速度運動について、それらの加速度が同じであり、しかも、それらのタイミングにより、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の一つの運動周期が平均して分けられる。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動する一つの周期に、複数の瞬間加速度運動が含まれることは、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が一つの運動周期内に複数の微小液滴を生成することに役立つ。好ましくは、ステップＳ２０３では、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体の液面下に運動している軌跡に、直線セグメント、円弧セグメント、多角形形状などの複数の種類の軌跡のうちの一つ又は複数の組み合わせが含まれる。一つの実施可能な形態としては、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の一つの運動周期に二つの瞬間加速度運動が含まれる場合に、液体吐出ピペットチップ１１０の運動軌跡が直線又は円弧のものである。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２による一つの運動周期に、二つ以上の瞬間加速度運動が含まれる場合に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体に、正三角形、正方形、正五角形、正六角形などを含む正多角形の形状で軌跡を行う。
一つの実施可能な形態として、ステップＳ２０３に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体の液面下に周期的に運動する工程に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の速度が長方形の波状に変化する。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の速度が長方形の波状に変化し、加速の段階が終わった直後に均一な速度の段階に移行することは、運動制御機構１３０により液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動状態を正確に制御することに役立つ。好ましくは、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２による運動速度の変化の長方形の波状を示すハイレベルタイミング及びローレベルタイミングは、同等でもよく相違でもよい。さらに、ステップＳ２０３では、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体の液面下に周期的に運動する工程に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の速度が方形の波状に変化する。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２による運動速度の変化の長方形の波状を示すハイレベルタイミングとローレベルタイミングとは、等しい。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２による運動速度の変化を示す長方形の波状がローレベルにある場合に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２は、その速度がセロとなり、又は、ハイレベルにある方向と反対方向の速度を有する。図４に示されるように、さらに、前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が周期的に運動している周期の前半及び後半において、前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の速度は、その大きさが同じであり、かつ、方向が反対している。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の一つの運動周期には、二つの反対方向の瞬間加速度運動が含まれる。
本実施例では、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体の液面下に運動している軌跡は、直線セグメントである。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２は、直線セグメントの一方の端点から瞬間加速度運動を行い、直線セグメントの他方の端点から反対方向に瞬間加速度運動を行う。二つの瞬間加速度運動の加速度は、いずれもa1である。他の実施例では、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体の液面下に運動している軌跡は、円弧セグメント又は多角形形状である。さらに、ステップＳ２０３では、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体の液面下に周期的に運動する周波数は、０．１Ｈｚ～２００Ｈｚの範囲にあることから、プロジェクトでは実現され易い。
図４及び図５に示されるように、本出願に係る一つの具体的な実施例では、流体駆動機構１２０は、第一の液体を一定の流速で液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出するように制御する。運動制御機構１３０は、液体吐出ピペットチップ１１０の出力端が、直線状に運動する軌跡或いは方形の波状に変化する速度で周期的に運動するように制御する。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の速度方向が変更されると、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２は瞬間で加速度が最大値になる。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２に付着された液滴１９５も、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２に瞬間で加速度が最大値になる時に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱離され、微小液滴１９９を形成する。第一の液体が一定流速で液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出されることから、液滴１９５が液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱落したときに、新たな液滴１９５が生成状態に移行する。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が再度、反対方向に加速すると、新しく生成された液滴１９５も液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱落されて新たな微小液滴１９９を形成する。
本実施例では、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が一つの運動周期に二つの微小液滴１９９を生成可能であり、しかも、方形の波状がプロジェクトで実現され易い。他の実施例では、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が一つの運動周期に一つの微小液滴１９９を生成する。実施例において、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２は、第二の液体６９９に、任意方向に沿って直線状の軌跡で速度が方形波状で変化する運動を行うことが好ましい。この運動には、液体吐出ピペットチップ１１０の延在方向と垂直する平面に直線状の軌跡で速度が方形波状で変化する運動、液体吐出ピペットチップ１１０の延在方向と任意角度をなす平面に直線状の軌跡で速度が方形波状で変化する運動、及び、液体吐出ピペットチップ１１０の延在方向に沿って直線状の軌跡で速度が方形波状で変化する運動などが含まれる。本出願に係る他の実施例では、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動軌跡が円弧セグメント又は多角形形状である場合に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体６９９に任意方向に沿って円弧セグメント又は多角形形状の軌跡で速度が方形波状で変化する運動を行う。この運動には、液体吐出ピペットチップ１１０の延在方向と垂直する平面に円弧セグメント又は多角形形状の軌跡で速度が方形波状で変化する運動、液体吐出ピペットチップ１１０の延在方向と任意角度をなす平面に円弧セグメント又は多角形形状の軌跡で速度が方形波状で変化する運動、及び、液体吐出ピペットチップ１１０の延在方向に沿って直線状の軌跡で速度が方形波状で変化する運動などが含まれる。
本出願に係る一実施例では、運動制御機構１３０の連動により、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２は、第二の液体の液面下に周期的に変化する速度で運動を行い、速度が変化している周期の前半及び後半において、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の速度が共に単調変化している。単調変化しているとは、速度が変化している周期の前半及び後半において、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２について、次の時刻の速度が常に先の時刻の速度以上或いは以下であることを意味している。例えば、速度が変化している周期の前半に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の速度が持続的に増加し、或いは、一部分の速度が持続的に増加して一部分の速度が変化しない。一方、速度が変化している周期の後半において、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の速度が持続的に減少し、又は、一部分の速度が持続的に減少して一部分の速度が変化しない。第一の液体は、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出され、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２に付着される液滴１９５を形成する。液滴１９５は、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動速度が、一定の大きさになると、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱離され、微小液滴１９９を形成する。図６に示されるように、微小液滴１９９が液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱離されるまで、受けられた作用力は、それぞれ、重力Ｇ、第二の液体６９９の浮力f1、第二の液体６９９の粘性抵抗f2、及び、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との最大付着力f3である。微小液滴１９９が液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱離されるまで、その質量をｍとし、速度をｖとし、加速度をa2とすると、液滴１９５は、第二の液体６９９の運動工程において、粘性力f2、重力Ｇ、浮力f1及び付着力f3による相乗効果により受けられており、即ち、
Figure 0007138301000003
液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との付着力の最大値f3は、液体吐出ピペットチップ１１０の表面自由エネルギー、液滴１９５の表面張力、及び、液体吐出ピペットチップ１１０の幾何学的寸法に関連されている。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２に付着された液滴１９５を球状として簡略化する。ストークス（Ｓｔｏｋｅｓ）の式によると、わかるように、第二の液体６９９中を運動するときに受けられた液滴１９５の粘性抵抗がf2=6πηｒｖとなり、そのうち、ηが第二の液体６９９の粘性係数であり、ｒが液滴１９５の半径であり、ｖが液滴１９５の運動速度である。微小液滴１９９を生成する工程において、一般的に、液滴１９５の直径範囲は、ピコリットルからマイクロリットルまでのオーダーであり、第二の液体６９９の粘性係数は、一般的に、比較的大きい。
Figure 0007138301000004
このことに鑑み、本出願が提供する微小液滴生成方法は、出口端１１２を有し、第一の液体を貯留している液体吐出ピペットチップ１１０を提供し、開口を有し、第二の液体６９９を貯留している微小液滴容器６０を提供し、第一の液体と第二の液体６９９は、互いに非相溶性を持ち又は界面反応を有する任意の二つの液体とされるステップＳ２１１と、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２を、微小液滴容器６０の開口より第二の液体６９９の液面下に挿入するステップＳ２１２と、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２に、第二の液体６９９の液面下に速度が周期変化する運動を行わせ、速度が変化している周期の前半及び後半において、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の速度が共に単調変化しながら、第一の液体を液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から均一な速度で排出し、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出された第一の液体は、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２に付着された液滴１９５を形成し、液滴１９５は、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が運動している工程に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱離され、第二の液体６９９の液面下に微小液滴１９９を形成するステップＳ２１３と、を含む。
上記の微小液滴生成方法によれば、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２は、第二の液体６９９の液面下に周期的に変化する速度で運動を行い、速度が変化している周期の前半及び後半において、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の速度が共に単調変化する。運動の工程では、液滴１９５に対する第二の液体６９９の粘性力f2も、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の速度が周期的に変化すると伴い周期的に変化する。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との最大付着力f3が液滴１９５に対する第二の液体６９９の粘性力f2よりも小さいと、液滴１９５が液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と同期に運動することができなくなり、前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２に付着された液滴１９５が前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱離され、第二の液体６９９の液面下に微小液滴１９９を形成する。本出願が提供する微小液滴生成方法は、前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体６９９の液面下に周期的に変化する速度で運動を行い、微小液滴１９９を発生することにより、前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が運動している時に第二の液体６９９に与える干渉を低減し、微小液滴１９９を生成する工程に安定性を確保することができる。
本実施例では、ステップＳ２１３に、第一の液体が液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から連続して排出される。さらに、ステップＳ２１３に、第一の液体が液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から一定の流速で排出される。このことは、等時間間隔に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出された第一の液体の体積が常に同じであることを意味している。第一の液体が液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から一定の流速で排出されると、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が周期的に運動するように制御することにより、体積の一致する微小液滴１９９を生成することに役立つ。
第二の液体６９９の中を運動している時に受けられた液滴１９５の粘性抵抗f2に影響を与える要素には、液滴１９５の運動速度ｖのほうが比較的に、制御されやすい。液滴１９５は、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱離され微小液滴１９９を形成するまで、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と同期に運動することが保持される。従って、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動速度を制御することにより、液滴１９５の運動速度ｖを正確に制御することができる。第一の液体を均一な流速で液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出するように制御すると、液滴１９５の半径ｒが一定の時間間隔に周期的に変化する。第二の液体６９９の中を運動している時に受けられた液滴１９５の粘性抵抗f2に影響を与える要素には、第二の液体６９９の粘性係数ηが、使用される工程において、ある範囲に変化するものの、その変化する範囲は極めて小さい。
液体吐出ピペットチップ１１０及び第一の液体が交換されない場合に、液体吐出ピペットチップ１１０の表面自由エネルギー、液体吐出ピペットチップ１１０の幾何学的寸法、及び、液滴１９５の表面張力は、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との最大付着力f3に影響を与える二つの要素として、変化しない。従って、液体吐出ピペットチップ１１０及び第一の液体が交換されない場合に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との付着力の最大値f3が変化しない。複数の液体吐出ピペットチップ１１０により同時又は順次に微小液滴１９９を生成すると、液体吐出ピペットチップ１１０の表面自由エネルギー及び液体吐出ピペットチップ１１０の幾何学的寸法は、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との最大付着力f3に影響を与える二つの要素として、変化する。しかしながら、多量で加工される場合に、液体吐出ピペットチップ１１０の表面自由エネルギー及び液体吐出ピペットチップ１１０の幾何学的寸法が一定の区間に変化するように制御可能である。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との最大付着力f3に影響を与えるもう一つの要素である液滴１９５の表面張力は、極めて小さい範囲だけに変化する。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との付着力の最大値f3は、極めて小さい区間だけに波動する。
従って、第二の液体６９９中を運動している時に受けられた液滴１９５の粘性抵抗f2が液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との付着力の最大値f3の区間値よりも大きいように制御できればよい。同じバッチで微小液滴１９９を生成する工程には、液滴１９５の半径ｒが必ず変化しない。一旦、試験用のパラメータが確定されると、液滴１９５の半径ｒも、それに伴い、確定される。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体６９９の液面下に運動する速度は、変化する。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体６９９の液面下に運動する速度は、v＞f3/6πηrが満たされているときに、液滴１９５が液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱離され、微小液滴１９９を形成する。
液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２は、第二の液体６９９の液面下に周期的に変化する速度で運動を行う。第一の液体を均一な流速で液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出するように制御し、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２に付着される液滴１９５の体積も均一に増大する。一番目の微小液滴１９９が液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から落下したときの微小液滴１９９の半径は臨界半径と呼ばれ、微小液滴１９９の速度は臨界速度と呼ばれる。調整液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動周期、及び、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出された第一の液体の流速を調整することにより、同じ時間間隔（液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動周期の倍数）が経過した後に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２に付着される液滴１９５が同時に臨界半径及び臨界速度になり、新たな微小液滴１９９を形成する。第一の液体が均一な流速で液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出されることから、生成された微小液滴１９９の体積が同じになる。
一つの実施可能な形態としては、ステップＳ２１３では、速度が変化している一つの周期に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の速度が中間時点を中点として中心対称である。さらに、ステップＳ２１３に、第二の液体６９９の液面下に液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の加速度、速度及び運動軌跡が、いずれも周期的に変化する。また、ステップＳ２１３に、第二の液体６９９の液面下に液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の速度が余弦曲線状に変化する。
好ましくは、ステップＳ２１３では、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体６９９の液面下に運動している軌跡は、直線セグメント、円弧セグメント、多角形形状などの複数の種類の軌跡のうち一つ又は複数の組み合わせが含まれる。ステップＳ２１３には、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体６９９の液面下に周期的に運動する周波数が０．１Ｈｚ～２００Ｈｚの範囲にあることから、プロジェクトで実現され易い。
液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２は、第二の液体６９９の液面下に円弧の軌跡で、又は、余弦状に変化する速度で周期的な運動を行うことを例として挙げると、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２は、実際に揺動するように運動し、運動変位が正弦波状の曲線で示される。図７における曲線ａに示されるように、流体制御機構の駆動により、第一の液体が均一な流速で液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出される。仮に液滴１９５が液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱離されないとすると、計算により、第二の液体６９９の中を運動している時に受けられた液滴１９５の粘性抵抗ｆが、時間の経過に伴い、図７における曲線ｂとして示されている。第一の液体が均一な流速で液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出される初期の段階に、液滴１９５の体積が増大するのに伴い、液滴１９５の半径ｒも明らかに増大している。液滴１９５の半径ｒが増大するのに伴い、液滴１９５の体積が均一な速度で増大していることから、液滴１９５の半径ｒが緩く増大していることは余儀無くされる。従って、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が揺動する初期の複数の周期に、第二の液体６９９の中を運動している時に受けられた液滴１９５の粘性抵抗f2の最大値が急速に増加し、その後、緩く増加している。図７に示されるように、第二の液体６９９の中を運動している時に受けられた液滴１９５の粘性抵抗f2も液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の周期的な運動を行うほうと類似する周期性が現れ、即ち、第二の液体６９９の中を運動している時に受けられた液滴１９５の粘性抵抗f2が、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の速度変化に伴い変化する。実際の状況では、第二の液体６９９の中を運動している時に受けられた液滴１９５の粘性抵抗f2が増大し、しかも、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との付着力の最大値f3よりも大きい場合に、液滴１９５が液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱落され、微小液滴１９９を形成する。
本出願に係る一実施例では、図８に示されるように、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が、円弧の軌跡、または、正弦波状の変位で揺動するように制御する。液体吐出ピペットチップ１１０及び第一の液体が交換されない場合に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との付着力の最大値f3が変化しない。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２に付着される液滴１９５の半径ｒが増大するのに伴い、第二の液体６９９の中を運動している時に受けられた液滴１９５の粘性抵抗f2も持続的に増大する。第二の液体６９９の中を運動している時に受けられた液滴１９５の粘性抵抗f2が液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との付着力の最大値f3よりも大きい瞬間に、液滴１９５が液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱落され、図８に示される液滴Iとなるように、微小液滴１９９を形成する。そして、次の微小液滴１９９の生成循環へ移行する。
本実施例では、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との付着力の最大値がf3=1.8x10-4Nとなり、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の揺動周波数が５０Ｈｚである。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が正弦波状に変位して揺動する運動を行う二番目の周期の最後に、図８における液滴Ｉとなるように、一番目の微小液滴１９９を生成する。二番目の微小液滴１９９を生成する初期の段階に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動速度が僅かに減少するが、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２に付着された液滴１９５の半径ｒが速く増加していることから、第二の液体６９９に運動している時に受けられた液滴１９５の粘性抵抗f2が、直ぐに低下することなく、小さい範囲だけに増加する。そして、液滴１９５の半径ｒが緩く増加し、第二の液体６９９の中を運動している時に受けられた液滴１９５の粘性抵抗f2が、主に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動の速度変化に伴い、変化する。
第一の液体を均一な流速で液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出するように制御すると、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が先の一つの微小液滴１９９を生成してからの二つの運動周期の時刻に、図８における液滴ＩＩとなるように、先の一つの微小液滴１９９と等体積の新たな液滴１９５を生成する。しかも、この時、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動速度も、先の二つの運動周期のほうと同じである。先の微小液滴１９９と等体積の新たな液滴１９５が液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱落される。第一の液体が均一な速度で排出されること、及び、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が正弦波状に変位して揺動する運動の両方により、生成された微小液滴１９９の体積に均一性を確保することができる。
本出願に係る一実施例では、図９に示されるように、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が円弧の軌跡で、正弦波状に変位して揺動するように制御する。液体吐出ピペットチップ１１０及び第一の液体が交換されない場合に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との付着力の最大値f3が変化しない。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２に付着される液滴１９５の半径ｒが増大するのに伴い、第二の液体６９９に運動している時に受けられた液滴１９５の粘性抵抗f2も増大する。第二の液体６９９の中を運動している時に受けられた液滴１９５の粘性抵抗f2が液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との付着力の最大値f3よりも大きい瞬間に、液滴１９５が液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱落され、微小液滴１９９を形成する。そして、次の微小液滴１９９の生成循環へ移行する。
本実施例では、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との付着力の最大値がf3=1.5x10-4Nとなり、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の揺動周波数が５０Ｈｚである。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が正弦波状に変位して揺動する運動を行う一番目の周期の最後に、図９における液滴Ｉとなるように、一番目の微小液滴１９９を生成する。二番目の微小液滴１９９を生成する初期の段階に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動速度が僅かに減少するが、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２に付着される液滴１９５の半径ｒが速く増加することから、第二の液体６９９の中を運動しているときに受けられた液滴１９５の粘性抵抗f2が直ぐに低下することなく、小さい範囲に増加する。そして、液滴１９５の半径ｒが緩く増加し、第二の液体６９９の中を運動している時に受けられた液滴１９５の粘性抵抗f2は、主に液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動の速度変化に伴い変化する。
第一の液体を均一な流速で液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出するように制御すると、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が先の一つの微小液滴１９９を生成してから次の一つの運動周期の時刻に先の一つの微小液滴１９９と等体積の新たな液滴１９５を生成し、しかも、この時の液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動速度も先の一つの運動周期のものと同じである。先の一つの微小液滴１９９と等体積の新たな液滴１９５が液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱落され、図９における液滴ＩＩとなる。このように繰り返すと、液滴ＩＩＩと液滴ＩＶなどが生成されることになる。第一の液体が均一な速度で排出されること、及び、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が正弦波状に変位して揺動する運動の両方は、生成された微小液滴１９９の体積に均一性を確保することができる。
本出願に係る一実施例では、図１０及び図１１に示されるように、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が円弧の軌跡で、正弦波状に変位して揺動するように制御する。液体吐出ピペットチップ１１０及び第一の液体が交換されない場合に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との付着力の最大値f3が変化しない。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２に付着される液滴１９５の半径ｒが増大するのに伴い、第二の液体６９９の中を運動している時に受けられた液滴１９５の粘性抵抗f2も持続的に増大する。第二の液体６９９の中を運動している時に受けられた液滴１９５の粘性抵抗f2が液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との付着力の最大値f3よりも大きい瞬間に、液滴１９５が液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱落され、図１０における液滴Ｉとなるように、微小液滴１９９を形成する。次の微小液滴１９９の生成循環へ移行する。
本実施例では、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との付着力の最大値がf3=1.0x10-4Nとなり、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の揺動周波数が５０Ｈｚである。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が正弦波状に変位して揺動する運動の周期の前半の加速段階に、図１０における液滴Ｉとなるように、一番目の微小液滴１９９を生成する。二番目の微小液滴１９９を生成する初期の段階に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動速度が僅かに減少するが、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２に付着される液滴１９５の半径ｒが速く増加することから、第二の液体６９９の中を運動している時に受けられた液滴１９５の粘性抵抗f2が直ぐに低下することなく、小範囲だけに増加する。そして、液滴１９５の半径ｒが緩く増加し、第二の液体６９９の中を運動している時に受けられた液滴１９５の粘性抵抗f2は、主に液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動の速度変化に伴い、変化する。
第一の液体を均一な流速で液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出するように制御すると、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が正弦波状に変位して揺動する運動周期の後半の加速段階で、図１０における液滴ＩＩとなるように、二番目の微小液滴１９９を生成する。次に、液面が微小液滴１９９を生成する段階へ移行する。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が二番目の微小液滴１９９を生成する運動の周期の後半のタイミングで二番目の微小液滴１９９と等体積の新たな液滴１９５を生成し、しかも、この時の液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動速度も前半の運動周期のほうと同じである。二番目の微小液滴１９９と等体積の新たな液滴１９５は、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱落される。このように繰り返すと、図１０に示されるような液滴ＩＩＩ、液滴ＩＶ、液滴Ｖなどが生成されることになる。第一の液体が均一な速度で排出されること、及び、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が正弦波状に変位して揺動する運動の両方は、生成された微小液滴１９９の体積に均一性を確保することができる。
上記から分かるように、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２に付着される液滴１９５が液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱離される（即ち、一つの微小液滴１９９を生成する）条件は、近似すると、
Figure 0007138301000005
第一の液体を均一な流速で液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出するように制御する場合に、生成された微小液滴１９９の体積を均一にすることは、微小液滴１９９が等時間間隔に液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱落されるということを条件としてなされる。
液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との付着力の最大値f3に影響を与える要素には、液体吐出ピペットチップ１１０の表面自由エネルギー、幾何学的寸法及び第一の液体の表面張力が含まれる。液体吐出ピペットチップ１１０及び第一の液体が交換されない場合に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との付着力の最大値f3が変化しない。第二の液体６９９の中を運動している時に受けられた液滴１９５の粘性抵抗f2に影響を与える要素には、第二の液体６９９の粘性係数η、液滴１９５の半径ｒ及び液滴１９５の運動速度ｖが含まれる。第一の液体が均一な速度で液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出される際に、液滴１９５の半径ｒが微小液滴１９９の生成間隔時間により決められる。液滴１９５が液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱離されるまで液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と同期に運動しているため、運動制御機構１３０により液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動速度を正確に制御することができる。第二の液体６９９の粘性係数ηが液滴１９５を生成する工程に、ある範囲内に変化することがある。しかしながら、第二の液体６９９の粘性係数ηの変化範囲が極めて小さい。図１２に示されるように、曲線ａは、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の変位を示し、曲線ｂ及び曲線ｃが共に、第二の液体６９９の粘性係数ηが極めて小さい範囲に変化する時に、微小液滴１９９を生成する工程の曲線を示す。第二の液体６９９の粘性係数ηが極めて小さい範囲に変化する時に、微小液滴１９９の生成時間間隔を変更することなく、極めて小さい範囲だけに、微小液滴１９９の生成タイミングを変更する。図１２に示されるように、曲線ｂ及び曲線ｃにより示される微小液滴１９９を生成する時間間隔は、いずれも半周期t/2であることから、生成された微小液滴１９９の体積に均一性を確保することができる。
図１３に示されるように、液体吐出ピペットチップ１１０が交換され、又は、第一の液体の表面張力が温度変化などにより変化した場合に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との付着力の最大値f3を正確に制御することが難しくなる。従って、生成された微小液滴１９９の体積がある範囲でf3の変化に対して敏感にならないということは、寸法が均一な微小液滴１９９を生成することにとって重要な意味を持っている。図１３に示されるように、曲線ａが液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の変位を示し、曲線ｂ及び曲線ｃが液体吐出ピペットチップ１１０が交換された時に微小液滴１９９の生成工程の曲線を示す。液体吐出ピペットチップ１１０が交換された後に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との付着力の最大値f3が一定の範囲に波動することにより、液滴１９５が脱落される際に液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が異なる速度で運動するおそれがある。しかしながら、微小液滴１９９の生成が安定状態になっていると、液滴１９５が脱落された際に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の速度が各揺動周期内に変化しない。図１３に示されるように、曲線ｂ及び曲線ｃにより示される微小液滴１９９の生成の時間間隔は、いずれも半周期t/2である。従って、微小液滴１９９の生成の間隔時間が変化しないことを確保することができる。第一の液体吐出液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の流速が変化しないと、生成された微小液滴１９９の体積が均一となる。それと同時に、第一の液体吐出液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の流速、及び、第二の液体６９９の中を揺動している液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の周波数を調整することができ、即ち、それと同時に、体積が均一な微小液滴１９９の体積及び生成の速さを制御することができる。
上記の実施例では、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が正弦波状に変位する周期的な運動を行うと、付着力の最大値f3及び粘性抵抗f2の変化について、ある程度の許容性があり、即ち、付着力の最大値f3又は粘性抵抗f2がある範囲に変化する時に、依然として体積が均一な微小液滴１９９を生成することができる。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が正弦波状に変位して周期的な運動を行う時に、体積が均一な微小液滴１９９の生成を確保できることを前提として、付着力の最大値f3を許容できる変化範囲を安定期として呼ぶ。安定期の存在は、液体吐出ピペットチップ１１０の加工及び微小液滴１９９の生成温度の制御にとって重要な意味を持っている。安定期の存在は、液体吐出ピペットチップ１１０の加工精度に対する要求を、ある程度まで低下させることが許可され、即ち、たとえ同じバッチで加工された液体吐出ピペットチップ１１０のそれぞれの表面自由エネルギーに相違が存在しても、体積が均一な微小液滴１９９を生成することができる。同様に、安定期の存在は、微小液滴１９９を生成する工程に温度制御に対する要求をある程度まで低下させることが許可される。
安定期の存在は、液体吐出ピペットチップ１１０の加工精度に対する要求又は、微小液滴１９９を生成する工程の温度制御に対する要求を、ある程度まで低下させることが許可されることにより、さらに、微小液滴１９９を生成する工程における消耗品としてのコスト及び制御用のコストを削減することができる。上記の実施例では、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が各運動周期に二つの微小液滴１９９を生成する。容易に理解され得るのは、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が正弦波状に変位して周期的な運動を行う限り、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動周期ごとに一つの微小液滴１９９を生成し、又は、二つの運動周期ごとに一つの微小液滴１９９を生成する時に、依然として付着力の最大値f3及び粘性抵抗f2の変化について、ある程度の許容性を持ち、安定期が存在しているということである。
微小液滴１９９の生成は、微小液滴１９９の重力及び慣性力からの影響がほぼ受けられない。従って、微小液滴１９９を生成する時には、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体６９９に任意方向に沿って正弦波状に変位して周期的な運動を行うことが可能である。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動軌跡は、弧線、直線又は他の形状の軌跡であってもよい。
図１４（１）に示されるように、本出願の一実施例では、液体吐出ピペットチップ１１０を第二の液体６９９に傾斜して挿入し、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２を第二の液体６９９の液面下に揺動して、微小液滴１９９を生成する。一つの実施可能な形態として、図１４（２）に示されるように、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体６９９に水平の直線軌跡で、正弦波状に変位して周期的な運動を行い、微小液滴１９９を生成する。もう一つの実施可能な形態として、図１４（３）に示されるように、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体６９９に垂直の直線軌跡で、正弦波状に変位して周期的な運動を行い、微小液滴１９９を生成する。
図１５に示されるように、本出願の他の一実施例では、ステップＳ２１３に、速度変化の一つの周期に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が周期の前半及び後半にいずれも、等変速運動を行う。さらに、ステップＳ２１３に、周期の前半及び後半に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の加速度が同じである。第一の液体を均一な流速で液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出するように制御する。第一の液体が連続して排出されるのに伴い、運動の工程において受けられた液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２に付着される液滴１９５の粘性抵抗f2も持続的に増加する。粘性抵抗f2が液滴１９５と液体吐出ピペットチップ１１０との付着力の最大値f3よりも大きい場合に、液滴１９５が液体吐出ピペットチップ１１０から脱離されて微小液滴１９９を形成する。そして、次の微小液滴１９９の生成工程へ移行する。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動周波数及び運動速度が第一の液体の流速に合致するように制御することにより、生成された微小液滴１９９の体積に均一性を確保することができる。
従来の油相組成物は、使用される工程に、粘度などの物理性質に変化が比較的大きく、生成された微小液滴の体積の大きさの均一性が比較的悪い。液体吐出ピペットチップ注射／噴射法に用いられる従来の油相組成物により、生成された微小液滴の体積の大きさの均一性が比較的悪いという課題について、微小液滴の体積の大きさが均一であるということを確保することができる油相組成物及びその処理方法を提供する。本出願が提供する微小液滴を生成するための油相組成物は、つまり、上記の第二の液体６９９は、油相組成物における体積パーセントが８８％－９８．５％である鉱油と、鎖状アルキル基を含むシロキサン鎖非イオン性界面活性剤と、を含む。
上記油相組成物は、その密度が１ｇ／ｍｌ未満であると、大部分の種類の第一の液体を液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱離して微小液滴１９９を形成した後に第二の液体６９９の中を降下するようにすることができる。鎖状アルキル基を含むシロキサン鎖非イオン性界面活性剤により、数多くの微小液滴１９９間に融合し合うことを防ぐことができる。
本出願に係る一実施例では、油相組成物に鎖状アルキル基を含むシロキサン鎖非イオン性界面活性剤の体積パーセントは１．５％－１２％とされる。さらに、鎖状アルキル基を含むシロキサン鎖非イオン性界面活性剤は、ＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０とＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ１８０との一つ又は二つを含む。一実施例では、界面活性剤は、鎖状アルカンエステルをさらに含み、油相組成物において、鎖状アルカンエステルの油相組成物に対する質量－体積比は、０．０１５ｇ／ｍＬ～０．０５ｇ／ｍＬとされる。さらに、鎖状アルカンエステルは、ジポリヒドロキシステアレート（ＰＥＧ－３０）、グリセロールステアレート、ポリエチレングリコール（３０）ジポリヒドロキシステアレート（Ｐ１３５）などの１つまたは複数を含む。具体的には、鎖状アルカンエステルは、ポリエチレングリコール（３０）ジポリヒドロキシステアレート（Ｐ１３５）である。この実施例では、油相組成物において鎖状アルキル基を含むシロキサン鎖非イオン性界面活性剤の体積パーセントは、１．５％～５．０％である。上記の技術的手段では、鎖状アルキル基を含むシロキサン鎖非イオン性界面活性剤がＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０とされる。
気体は、鉱油に、一定量の溶解度を有し、しかも、気体と鉱油の温度に関連する。例えば、室温に、空気が見えないように鉱油に溶解する。鉱油に気体が溶解すると、鉱油の粘度、体積の体積弾性係数（bulk modulus）、熱伝達や境界潤滑などの物理性能に影響を与えて、発泡や空洞という現象が発生してしまう。鉱油における気体の含量が飽和を超えると、見える気泡が形成されて鉱油に浮遊され、鉱油がぼやけてしまう。これは、気体含みと呼ばれる。気泡は、徐々に鉱油の表面まで上昇する。油膜では、気体の気泡により、油膜に連続性が生じ、油膜により他相と接触するように防ぐという能力を低下させることになる。例えば、ＰＣＲ反応工程では、温度が９５℃まで上がることがある。鉱油における気体の溶解度が降下し、鉱油における気体の含量が飽和値を超えると、気泡が発生してしまう。気泡は、鉱油の表面まで上昇すると、最終的に爆発する。しかしながら、この工程では、蛍光信号の採集が気泡に影響されてしまう。また、気泡が発生すると、微小液滴１９９との相互作用により、微小液滴１９９の安定性に影響を与えてしまい、微小液滴１９９間の融合し合う反応に促進することもある。
本出願がさらに提供する油相組成物の処理方法は、上記態様のいずれか一つに記載の油相組成物を処理するために用いられる。油相組成物の処理方法は、油相組成物を加熱しながら、油相組成物を負圧と超音波振動の環境に置くことを含む。負圧の環境に、油相組成物に溶解された空気及びその他の気体を排出させ、できるだけ、油相組成物に溶解された空気及びその他の気体の溶解量を小さくするようにする。超音波は、油相組成物に溶解された気体を排出するように促進する。微小液滴１９９に水相を含むと、微小液滴１９９が生成された後に、引き続き、微小液滴１９９を操作する時に、水分が組成物に溶解される恐れがある。微小液滴１９９の大きさが変えられると、、微小液滴１９９の位置の配列に影響が与えられ、さらに、微小液滴１９９をリアルタイムで検知することにも影響が与えられてしまう。さらに、前記油相組成物の処理方法は、さらに、前記油相組成物を水飽和にするステップを含む。具体的には、前記使油相組成物を水飽和にするステップは、加熱油相組成物を加熱する前に、油相組成物に蒸留水を添加する。油相組成物の加熱工程が終わると、油相組成物を２５℃－３５℃の環境で自然冷却する。蒸留水に油相組成物を添加しながら加熱し、油相組成物が水飽和になるようにする。溶解できない水を室温で排除する。微小液滴１９９を生成する前に、油相組成物が水飽和の状態になったため、可及的に、油相組成物に進入する水相の微小液滴１９９の水分の量を低下させることができる。さらに、冷却された油相組成物を窒素により保護する。窒素は、主に鉱油とされる油相組成物に、溶解度が非常に低い。窒素を保護気体として使うことは、油相組成物を貯留する工程に、環境中の空気又は他の気体が油相組成物に溶解することにより油相組成物の品質を低くさせることを防ぐことができる。一つの実施可能な形態として、油相組成物を貯留する容器に余裕空間があると、余裕な空間内に窒素を充填してもよい。
態様一：異なる成分とされた油相組成物（第二の液体６９９）で生成された微小液滴１９９の体積の大きさについてその均一性を試験により調査する。上記の液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が油相組成物（第二の液体６９９）に周期的に瞬間加速度運動を行う方法に基づいて、液体吐出ピペットチップ１１０内の第一の液体を液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱落し、油相組成物（第二の液体６９９）内に微小液滴１９９を形成する。態様一では、第一の液体が水相であり、油相組成物（第二の液体６９９）の成分は、下表の通りである。
Figure 0007138301000006
図１６及び図１７に示される試験結果によれば、図１６では、点線枠内に微小液滴１９９の体積がよい均一性を持ち、それぞれ、実施例１、実施例２、実施例３及び実施例４に示される油相組成物（第二の液体６９９）の成分と対応している。図１８に示されるように、油相組成物（第二の液体６９９）におけるＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０の体積パーセントが１５％及び１６％まで増加すると、生成された微小液滴１９９の体積の大きさの均一性が悪くなる。そして、油相組成物（第二の液体６９９）中ＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０の体積パーセントが１．５％－１２％であると、生成された微小液滴１９９の体積の大きさは均一性が良い。
態様二：異なる成分の油相組成物（第二の液体６９９）で生成された微小液滴１９９の熱安定性を試験により調査する。微小液滴１９９の生成方法は、実施例１－６に係るものと同じである。微小液滴１９９を含む複数の組の油相組成物（第二の液体６９９）に、それぞれ５０回だけ高低温で循環を行う。高低温で循環を行う工程は、６℃／ｓという昇温の速さで９５℃まで昇温し、１０ｓだけ維持してから６℃／ｓという降温の速さで６５℃まで降温して１０ｓだけ維持する。態様二に係る油相組成物（第二の液体６９９）の成分は下表の通りである。
Figure 0007138301000007
図１９及び図２０に示される試験データによると、図１９では、点線枠内に微小液滴１９９の体積の大きさの均一性が良い。油相組成物（第二の液体６９９）におけるＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０の体積パーセントが１．５％－１２％であり、Ｐ１３５の含量が５％未満であると、図１９及び図２０に示されるように、生成された微小液滴１９９の体積の大きさの均一性が比較的良い。しかしながら、Ｐ１３５の含量が５％を超えると、図１９及び図２１に示されるように、生成された微小液滴１９９の体積に大きさが安定でないという特性が表れる。図１９の実線内の微小液滴１９９の熱安定性が比較的良い。油相組成物（第二の液体６９９）におけるＰ１３５の含量が１．５％－５．０％に該当し、ＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０の体積パーセントが１．５％－５．０％であると、図２２に示されるように、微小液滴１９９の熱安定性が比較的良い。油相組成物（第二の液体６９９）におけるＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０の体積パーセントが５．０％を超えると、図２３に示されるように、微小液滴１９９の熱安定性が比較的悪い。
上記二つの態様に係る２２個の実施例の試験データから分かるように、油相組成物（第二の液体６９９）に鉱油を主な成分として、ＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０の体積パーセントが１．５％－５．０％であり、Ｐ１３５の含量が１．５％－５．０％であると、第一の液体により油相組成物（第二の液体６９９）において生成された微小液滴１９９の体積の大きさが比較的良い均一性を有し、かつ、微小液滴１９９の熱安定性も比較的良い。
態様三：ＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０の潜在的な代替成分を試験により調査する。ＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０とＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ１８０とは、共に鎖状アルキル基を含むシロキサン鎖非イオン性界面活性剤に該当し、態様一の試験条件を用いて、ＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０の全部又は一部をＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ１８０に代替する。態様三に係る油相組成物（第二の液体６９９）の成分は、下表の通りである。
Figure 0007138301000008
図２４に示されるように、上表における実施例２３乃至実施例２８に示される異なる成分の油相組成物（第二の液体６９９）を用いて、微小液滴１９９を生成する試験を行い、生成された微小液滴１９９が、共に、比較的良い体積の均一性を持っていることになる。
態様四は、Ｐ１３５の潜在的な替代成分を試験により調査する。ポリエチレングリコール（３０）、ジポリヒドロキシステアレート（Ｐ１３５）、ジポリヒドロキシステアレート（ＰＥＧ－３０）、及び、ステアリン酸グリセリンは、共に鎖状アルカンエステルに該当する。態様二の試験条件を用いて、Ｐ１３５の全部又は一部をジポリヒドロキシステアレート（ＰＥＧ－３０）、及び、ステアリン酸グリセリンに代替する。態様四に係る油相組成物（第二の液体６９９）の成分は、下表の通りである。
Figure 0007138301000009
図２５及び図２６に示されるように、上表における実施例２９乃至実施例３２に示される異なる成分の油相組成物（第二の液体６９９）を用いて、微小液滴１９９の生成及び熱安定性の試験を行い、生成された微小液滴１９９は、共に、比較的良い体積の均一性及び比較的良い熱安定性を持っていることになる。
一つの具体的な応用環境では、本出願が提供する微小液滴１９９の生成装置及び生成方法が連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）に適用される。
一実施例では、前記微小液滴１９９は、測定すべき核酸増幅反応液であり、前記微小液滴生成装置１０により前記測定すべき核酸増幅反応液を微滴化し、複数の微小液滴を形成し、前記デジタルＰＣＲ検出器１による検知に用いられる。前記測定すべき核酸増幅反応液を、一体化されるデジタルＰＣＲ検出器１の微小液滴生成装置１０を通過して、微滴化の処理を介して、複数の微小液滴１９９に変えて、測定すべき試料における検知断片を多量の複雑な背景から分離し、微小液滴の容器６０に置いて、検知を待機される。微小液滴生成装置１０により、複数の均一な大きさの微小液滴１９９を生成することができる。各前記微小液滴１９９の大きさがミクロンのオーダーにあり、しかも、各前記微小液滴１９９を一つの独立する反応器として見なし、生化学の反応によく使われる試験管と相当できる。前記複数の微小液滴１９９が微小液滴の容器６０に置かれて、検知と観察を便宜にする。また、前記微小液滴生成装置１０により、複数の体積が異なる微小液滴を生成して、医学臨床の検知に用いられてもよい。前記複数の微小液滴１９９は、体積が小さく、数が多く、多くの通常試験管にない優位性を持っている。前記微小液滴生成装置１０により多量の微小液滴１９９を生成し、前記デジタルＰＣＲ検出器１にハイスループットを持たせ、消耗品としてコストが低くなり、背景にノイズが低いという利点を持って、工業化に優れた見通しがある。
従来の温度制御装置は、昇降温の速度が遅く、昇温又は降温度に、数十秒や数十分が必要となり、数十個のＰＣＲ循環を行うと１～２の時間がかかり、核酸を増幅することに必要な時間が長くなり、核酸を増幅する効率が低く、耐用年数も短い。従来の温度制御装置に昇降温の速度が遅いという課題について、昇降温の速度が速く、耐用年数が長い、温度制御装置を提供する。
図２７－２８に示されるように、本出願がさらに提供する温度制御装置２０は、フレキシブル回路基板２２０と、前記フレキシブル回路基板２２０と間隔配置される加熱基板２４０及び複数の半導体熱電対２３０を含む。前記加熱基板２４０は、対向配置される第一の表面２４１及び第二の表面２４２を含む。前記複数の半導体熱電対２３０は、前記フレキシブル回路基板２２０と前記第一の表面２４１との間に配置され、前記複数の半導体熱電対２３０が互いに直列接続され、並列接続され又は直並列接続される。
前記温度制御装置２０は、一般的に、高低温で循環を行う環境に応用されており、温度を急速に昇降させることが必要となるため、前記温度制御装置２０に対する要求が極めて高い。前記温度制御装置２０に応用のニーズを満たせるように、前記温度制御装置２０に、前記フレキシブル回路基板２２０が用いられる。前記フレキシブル回路基板２２０は、配線の密度が高く、重さが軽く、厚さが薄く、折り曲げ性がよい、という利点を有している。前記フレキシブル回路基板２２０は、昇降温の工程において自体の変形により熱応力を解消できる。前記フレキシブル回路基板２２０により、昇降温の工程に存在する熱応力が低減可能であるため、前記温度制御装置２０の耐用年数を延ばすことができる。同時に、前記フレキシブル回路基板２２０により、温度分布が均一でないという問題を解決することができる。前記複数の微小液滴に、異なる温度範囲に核酸を増幅する時に、前記フレキシブル回路基板２２０、加熱基板２４０及び複数の半導体熱電対２３０により、僅か数秒時間に急速に切り替えを実現することができる。そして、前記温度制御装置２０は、瞬間に昇降温を実現することができ、昇降温の工程が短縮化し、高低温の循環が実現され、前記デジタルＰＣＲ検出器１の検出時間が短縮化し、検出効率が向上する。
前記フレキシブル回路基板２２０（Ｆｌｅｘｉｂｌｅ Ｐｒｉｎｔｅｄ Ｃｉｒｃｕｉｔ 、ＦＰＣ）は、ポリイミド（Ｐｏｌｙｉｍｉｄｅ）又はポリエステルフィルムを素材として形成され、高さ確実性、特に優れた可撓性を有する印刷回路基板であってもよい。前記フレキシブル回路基板は、配線の密度が高く、重さが軽く、厚さが薄く、折り曲げ性がよいという利点を有している。前記フレキシブル回路基板は、重さが軽く、厚さが薄く、製品に体積を効果的に省くことができる。そのうち、前記サーモエレクトリック・クーラ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｏｏｌｅｒ、ＴＥＣ）は、半導体材料によりペルチェ効果により製造されたものである。いわゆるペルチェ効果とは、直流電流が二つの半導体材料からなる熱電対を流す時に、その一方端が吸熱し他方端が放熱するという現象である。前記フレキシブル回路基板２２０により、従来のサーモエレクトリック・クーラの一つの基板に代えて、前記サーモエレクトリック・クーラの熱伝導の性能をより良くすることができる。温度が変わったときに、物体に、外部からの制限、及び、内部における各部分間の互いの制限により、完全に自在膨張・収縮できず、応力が生じる。熱応力は、温度の変化による応力とも称する。熱応力とゼロの外部負荷との高度なバランスは、熱変形が約束されて、自体に生じたバランスとなる応力であり、高い温度に圧縮が生じ、低い温度に伸長という変形が生じる。ある条件では、応力を制御することにより、合理的な分布を取り、部品に機械性能や耐用年数を延ばし、有害なものを、利益的なものに変えることができる。
一実施例では、前記加熱基板２４０は、アルミニウム超伝導基板回路であってもよい。
アルミニウム基板は、良い放熱性能を持つ金属ベース銅張板であり、一般的に、片面板は、回路層（銅箔）、絶縁層及び金属基層という三つの層からなる構造である。前記アルミニウム超伝導基板回路は、配線回路板の材料がアルミニウム合金とされ、熱伝導が速い。アルミニウム基板は、熱抵抗が最も低く、極めて優れる熱伝達性能を持ち、膜が厚いセラミック回路に比べると、その機械性能も極めて優れている。
図２９に示されるように、一実施例では、前記半導体熱電対２３０は、一つのＰ型の熱電素子２３１と、前記Ｐ型の熱電素子２３１に間隔配置される一つのＮ型の熱電素子２３２と、を含む。
前記Ｐ型の熱電素子２３１と前記Ｎ型の熱電素子２３２とは、前記フレキシブル回路基板２２０と前記基板２４０との間に溶接される。前記半導体熱電対２３０は、複数の前記Ｐ型の熱電素子２３１と前記Ｎ型の熱電素子２３２とで形成された、対となる熱電対を含み、複数の対となる前記半導体熱電対２３０の間に電極が接続され、前記フレキシブル回路基板２２０と前記第一の表面２４１との間に介在される。電流が流れると、「熱」側及び「冷」側が生じる。冷却するか加熱するか、及び、冷却や加熱の速度についても、その電流方向及び大きさにより決められている。対となる前記半導体熱電対２３０により生成した熱電效応が非常に小さいことから、実際に、生じる熱電效応を大きくするように、数百対の前記半導体熱電対２３０を直列接続することが多い。
一実施例では、前記第一の表面２４１は、間隔配置されている複数の第一の電極片２４３を含み、一つの前記第一の電極片２４３が一つの前記半導体熱電対２３０に対応し、前記半導体熱電対２３０における前記Ｐ型の熱電素子２３１と前記Ｎ型の熱電素子２３２とは、前記第一の電極片２４３を介して直列接続される。
一実施例では、前記フレキシブル回路基板２２０は、間隔配置され、かつ、互いに直列接続される複数の第二の電極片２２１を含み、隣接する二つの前記半導体熱電対２３０は、一つの前記第二の電極片２２１と直列接続される。
前記Ｐ型の熱電素子２３１と前記Ｎ型の熱電素子２３２とが結合された前記半導体熱電対２３０に電流が流れると、両端間に熱量が移転され、熱量が一方端から他方端に移転することにより生じた温度差により冷却・発熱端が形成される。しかしながら、前記Ｐ型の熱電素子２３１と前記Ｎ型の熱電素子２３２は、自体に存在する電気抵抗により、電流が前記Ｐ型の熱電素子２３１と前記Ｎ型の熱電素子２３２とを流すと、熱量が生じることから、熱伝導に影響を与えてしまう。さらに、前記フレキシブル回路基板２２０と前記加熱基板２４０との間の熱量は、空気、及び、前記Ｐ型の熱電素子２３１と前記Ｎ型の熱電素子２３２との材料自体を介して、反対方向に熱伝導をすることもある。冷却・発熱端が一定の温度差になり、この二つの熱伝導量が等しくなると、一つのバランスポイントで、順方向及び逆方向の熱伝導が互いに相殺することになる。この時、冷却・発熱端の温度がこれ以上に変化しない。また、より低い温度を得るために、放熱などの方式で発熱端の温度を低くさせてもよい。
一実施例では、前記温度制御装置２０は、前記第二の表面２４２に配置される熱伝導強化層２５０をさらに含む。
前記熱伝導強化層２５０は、特によい強度、柔軟性、電気伝導性、熱伝導性や光学特性を有している。前記熱伝導強化層２５０は、前記微小液滴容器６０に直接接触することにより、前記複数の微小液滴への熱伝導を均一にするように、温度を制御して核酸を増幅することが実現される。前記熱伝導強化層２５０は、グラファイト熱伝導層又はシリコーングリース熱伝導層であってもよい。そうすると、熱伝導が速く、前記加熱基板２４０の前記第二の表面２４２に温度の均一性が向上し、前記微小液滴容器６０と近い表面に温度が均一となることを確保でき、前記複数の微小液滴への熱伝導を均一にすることができる。また、核酸の増幅が完了し、検出効率が向上し、時間が短縮化する。
一実施例では、前記熱伝導強化層２５０は、その材料にグラフェンが含まれる。前記グラフェンは、平面の薄膜であり、特によい熱伝達の性能を有し、横方向に均一な熱伝導がされる。一実施例では、前記温度制御装置２０は、前記フレキシブル回路基板２２０に電気接続され、電流を制御するための第二の制御器２１０をさらに含む。
一実施例では、前記温度制御装置２０は、前記第二の表面２４２に配置され、前記第二の制御器２１０に電気接続され、前記第二の表面２４２の温度を検知し前記第二の制御器２１０に送信するための温度センサー２６０をさらに含む。前記温度センサー２６０は、前記熱伝導強化層２５０の前記第二の表面２４２に配置され、前記第二の表面２４２の温度をリアルタイムで検知し、温度情報を前記第二の制御器２１０にフィードバックし、前記複数の微小液滴加熱温度に対する制御を実現することができる。前記温度センサー２６０は、金属の電気抵抗変化を検知することにより、前記微小液滴の容器６０の温度を測量し、前記複数の微小液滴を核酸増幅させる工程の温度の変化をリアルタイムで検知し、温度情報を前記第二の制御器２１０にフィードバックすることにより、前記制御回路により温度を調整するように制御し、温度への制御を実現することができ、より良い核酸の増幅が図れる。
一実施例では、前記第二の制御器２１０は、温度制御手段２１２及び制御回路２１４を含む。前記温度制御手段２１２は、前記温度センサー２６０に接続され、前記第二の表面２４２の温度をリアルタイムで検出するために用いられる。前記制御回路２１４は、前記フレキシブル回路基板２２０に接続され、前記複数の半導体熱電対２３０の温度の変化を調整して制御するために用いられる。前記温度制御手段２１２と前記制御回路２１４とは、一つの回路基板に配置される。前記温度制御手段２１２と前記制御回路２１４との関係は、内部アルゴリズムの論理演算の関係に該当し、ＰＩＤクローズループ制御アルゴリズムというＰａｃｋｅｔ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒのクローズループ制御アルゴリズムが採用されてもよい。前記温度制御手段２１２により検出された温度が内部アルゴリズムの入力として、核酸増幅の温度フィードバックとなり、前記制御回路２１４により計算された結果を内部アルゴリズムの出力とすることにより、クローズループという関係が形成される。回路部分の温度フィードバックは、実際に、一つの采様回路とされる。採集されたのは白金抵抗による電気信号であり、温度値に変換されてから制御回路の入力端に送信される。前記温度センサー２６０は、前記温度制御手段２１２に、標準化する白金抵抗三線式で接続される。
一実施例では、前記フレキシブル回路基板２２０は、第一の電極２２２及び第二の電極２２３が配置されている。前記複数の第二の電極片２２１は、直列接続されてから前記第一の電極２２２及び前記第二の電極２２３に直列接続される。前記第一の電極２２２及び前記第二の電極２２３は、前記制御回路にそれぞれ接続される。前記制御回路２１４と前記フレキシブル回路基板２２０とは、前記第一の電極２２２及び前記第二の電極２２３に二つの配線を介してそれぞれ接続される。
一実施例では、前記温度制御装置２０は、放熱装置２７０をさらに含み、前記放熱装置２７０は、基板２７１及び前記基板２７１に接続される放熱フィン２７２を含む。前記フレキシブル回路基板２２０は、前記基板２７１の表面に配置される。前記放熱フィン２７２は、前記基板２７１の表面に配置されていることから、前記基板２７１の面積を少なくしないが熱交換の面積をさらに増加してきたため、前記基板２７１の表面に作用する涼しい風の時間を延ばし、複数の放熱ダクトを形成し、熱交換を速く行うことに役立つのに加えて、より多い熱量を前記基板２７１の表面から逃がして、より理想な放熱効果を達することができる。
一実施例では、前記温度制御装置は、前記放熱フィン２７２の周りを囲むように配置されるファン２７３を含む。前記ファン２７３により、前記放熱装置２７０による放熱を支援してもよい。そのうち、前記ファン２７３は、前記放熱フィン２７３の周りに複数配置されてもよい。そうすると、より優れた放熱の効果が実現され、前記温度制御装置２０への昇降温をより急速に行うことができる。
一実施例では、前記温度制御装置２０に交流電力が流れると、前記第二の制御器２１０により電流の大きさを調整することにより、前記温度制御装置２０に冷却させるか加熱させるか、及び、冷却や加熱の速度を制御することができる。同時に、前記温度センサー２６０により、前記微小液滴容器６０の加熱温度をリアルタイムで検出し、温度の情報を前記温度制御手段２１２にフィードバックする。前記温度制御手段２１２は、温度が変わった旨を前記制御回路２１４にフィードバックし、前記複数の微小液滴の温度を制御する。前記温度制御装置２０により、前記複数の微小液滴に核酸を増幅することができる。ＰＣＲには、三つのステップの原理を元に、変性－アニーリング－伸長という三つの温度点を配置する。標準反応に三つの温度点法を用いることにより、二本鎖ＤＮＡを９０～９５℃で変性させ、再度急速に４０～６０℃まで冷却し、プライマーをアニーリングして標的配列と結合し、次に、急速に７０～７５℃まで昇温し、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの作用により、プライマーの鎖を鋳型に沿って延ばして、適宜な温度範囲に、核酸を増幅する。同時に、核酸増幅の工程では、前記微小液滴容器６０の底部が前記温度制御装置２０にぴったりと貼り合わせられ、両者間に隙間が無くなると、前記デジタルＰＣＲ検出器１に正確性が向上する。
前記複数の微小液滴に、異なる温度範囲に核酸を増幅する時に、前記フレキシブル回路基板２２０、加熱基板２４０及び複数の半導体熱電対２３０により、僅か数秒時間に急速に切り替えを実現することができる。そして、前記温度制御装置２０は、瞬間に昇降温を実現することができ、昇降温の工程が短縮化し、高低温の循環が実現され、前記デジタルＰＣＲ検出器１の検出時間が短縮化し、検出効率が向上する。
一実施例では、前記温度制御装置２０により核算増幅を行う操作方法は、以下の通りである。
まず、前記微小液滴の容器６０を前記温度制御装置２０の前記熱伝導強化層２５０に置く。
次に、前記複数の微小液滴が昇温するように加熱し、温度９５℃の温度まで昇温させ、１０分だけ加熱する。前記複数の微液を９５℃まで加熱し、１０分だけ加熱し、前記複数の微小液滴中の酵素をホットスタートさせるようにする。
次に、前記複数の微小液滴の酵素がホットスタートすると、前記複数の微小液滴を３０ｓだけ変性させる。次に、前記複数の微液が変性すると、５５℃まで降温させ、４５ｓだけアニーリングして伸長し、前記複数の微液を撮影して、４５回だけ循環を行う。最後に、４５回だけ循環を行い、４℃まで降温し前記複数の微液を長時間に渡って保存する。
図３０を参照すると、前記温度制御装置２０については、一般的な場合に、温度制御の性能をテストする主な二つの指標として、それぞれ、瞬間状態と安定状態で、前記温度制御装置２０の昇降温度の変化を検出するということである。前記複数の微小液滴の加熱工程をモニターすることにより、前記温度制御装置２０が前記複数の微小液滴を温度昇降する時に、昇降温の速度が最大で１３．３４４４８℃／ｓとなり、制御の精度が０．０２７２２℃となる。しかも、前記温度制御装置２０の昇温が安定状態になるまで測量された速度が最速で１８．９５３８９４℃／ｓとなることもある。従って、前記温度制御装置２０は、その過渡的なレスポンスが良く、前記温度制御装置２０により、瞬間に昇降温を実現でき、時間が短縮化し、検出の効率が向上する。
図３１を参照すると、前記温度制御装置２０が安定状態にある時に、つまり、安定になった後に、温度が浮動する場合を示す。前記温度制御装置２０が安定状態にある時に、温度の変化が比較的に安定し、温度の浮動が比較的小さい。従って、前記温度制御装置２０は、急速に昇降温による循環を実現でき、しかも、安定された後に温度の浮動が比較的小さいことから、デジタルＰＣＲで溶液試料を検出する時間を省いて、作業効率が向上する。このような昇降温の速度により、核酸の増幅を済ませることに必要な時間を省いて、核酸増幅の効率が向上すると共に、デジタルＰＣＲによる検出システムの正確性が向上する。
前記微小液滴生成装置１０は、前記測定すべき核酸増幅反応液を微滴化し、複数の微小液滴を形成する。そして、前記温度制御装置２０により、前記複数の微小液滴を加熱する工程では、前記蛍光信号検出装置３０を使用し、前記複数の微小液滴に蛍光変化画像をリアルタイムで撮影する。前記定量解析装置４０により、前記複数の微小液滴に、変化する蛍光の画像を解析し、前記複数の微小液滴のＣｔ値を取得し、Ｃｔ値と初期コピー数との関係に基づいて、初期核酸の濃度を定量解析する。
前記微小液滴生成装置１０は、前記測定すべき核酸増幅反応液を微滴化し、複数の微小液滴を形成する。そして、前記温度制御装置２０により、前記複数の微小液滴に核酸を増幅する。同時に、前記蛍光信号検出装置３０を使用し、前記複数の微小液滴に、変化する蛍光イメージをリアルタイムで撮影する。前記複数の微小液滴に係る変化する蛍光のイメージにより、前記複数の微小液滴に、変化する蛍光の曲線を取得する。前記変化する蛍光の曲線に基づいて、前記複数の微小液滴のＣｔ値を取得し、Ｃｔ値と初期コピー数との関係に基づいて、初期ＤＮＡの濃度を定量で解析することができる。そのうち、Ｃｔ値は、各微小液滴の蛍光信号が所定の閾値になるまで経過された巡回数を指す。
前記微小液滴生成装置１０により生成されたのは、均一な大きさの微小液滴であり、温度制御装置３０により、前記複数の微小液滴を核酸増幅反応させ、例えば、蛍光、紫外線吸収、濁度などの産物信号を採集する。前記複数の増幅された微小液滴と増幅されなかった微小液滴との構成の相違により、標的配列増幅が得られた液滴数を解析して、核酸分子への定量解析を最終的に実現することができる。前記複数の微小液滴に係る変化する蛍光のイメージをリアルタイムでモニターすることにより、検出結果が直接性を有するため、前記複数の微小液滴における偽陽性と偽陰性という問題を解決することができる。
一実施例では、前記蛍光信号検出装置３０は、励起光源、蛍光センシングアセンブリ及び第三の制御器を含む。前記励起光源は、前記微小液滴容器６０の検出領域の上方に配置され、前記微小液滴容器６０の検出領域に対して傾斜角度で照射し、傾斜照射光路を形成する。前記蛍光センシングアセンブリは、前記微小液滴容器６０の検出領域の直上に配置され、前記複数の微小液滴に蛍光画像を採集するために用いられる。前記第三の制御器は、前記励起光源及び前記蛍光センシングアセンブリにそれぞれ接続され、前記励起光源及び前記蛍光センシングアセンブリを制御するために用いられる。前記蛍光信号検出装置は、微小液滴に複数の蛍光チャネルでイメージングを行い、明視野・暗視野でイメージングを行うことができる。そのうち、複数の蛍光チャネルによるイメージングは、微小液滴の反応信号を検知するためのものであり、明視野・暗視野によるイメージングは、微小液滴を形成するサイズの情報を検出し、反応工程において液滴状態をモニターするために用いられる。
前記複数の微小液滴の蛍光画像を生成することは、主に、前記蛍光センシングアセンブリにおけるカメラによりなされる。前記蛍光信号検出装置３０は、前記複数の微小液滴蛍光をイメージングし、一回だけ一定数の前記複数の微小液滴の蛍光画像を撮影し、画像処理の技術に基づいて、画像中の液滴蛍光を自動で識別し、液滴の蛍光情報を取得することができる。前記微小液滴の容器６０の上方から、傾斜角度で前記微小液滴の容器６０を照射することにより、前記蛍光信号検出装置３０を用いて前記複数の微小液滴に周期的にに二次元走査を行い、リアルタイムで撮影する。傾斜な照射光路によれば、効果的に誘導光の散乱の背景を低下させ、蛍光検知の感度を向上させることができる。前記微小液滴の容器６０内の前記複数の微小液滴の内部蛍光が誘導され、前記カメラに進入して、前記カメラにより前記複数の微小液滴の蛍光イメージを採集することができる。
従来の微小液滴の容器は、消耗品としてコストが比較的高く、収容される微小液滴の個数が少なく、微小液滴の容器液面が凹形の液面をなすことにより撮影による検知に影響を与えてしまうという課題について、消耗品としてコストが低く、収容された微小液滴の数が多く、撮影による検知に役立つ微小液滴の容器を提供する。
図３２－３７に示されるように、本出願に係る実施例が提供する微小液滴の容器６０は、底面６１１、前記底面６１１を囲むように配置される第一の環状側面６２１及び環状面６４１を含む。前記第一の環状側面６２１は前記底面６１１に接続され、開口６３１を有する収容空間６３０を形成するように囲まれて、前記第一の環状側面６２１は前記底面６１１と垂直する。前記環状面６４１は前記開口６３１を取り巻くように配置され、前記第一の環状側面６２１に接続され、前記環状面６４１が前記底面６１１と平行する。前記環状面６４１が前記底面６１１と平行することにより、前記微小液滴の容器６０における液体表面が水平面であるということを確保することができる。前記環状面６４１に配置されることにより、前記微小液滴の容器６０の液面が平面の状態をなすことができ、前記微小液滴の容器６０の液面全体が円弧形であるということを回避することができる。従って、前記微小液滴の容器６０により、前記容器底板における周縁の箇所に位置する微小液滴を観測することに影響を与えず、カメラにより撮影してイメージングを行うことに役立ち、複数の微小液滴への検知効率が向上する。
一実施例では、前記微小液滴の容器６０は、容器底板６１０、前記容器底板６１０を囲むように配置される第一の環状側板６２０及び環状板６４０をさらに含む。前記容器底板６１０は、その表面が前記底面６１１である。前記第一の環状側板６２０はその内面が前記第一の環状側面６２１であり、前記第一の環状側板６２０が前記容器底板６１０に固定接続され、前記容器底板６１０と共に前記収容空間６３０を形成するように囲まれる。前記環状板６４０は、その表面が前記環状面６４１である。前記環状板６４０は、前記第一の環状側板６２０における前記容器底板６１０から離れた一方端に固定接続され、前記環状板６４０と前記容器底板６１０とが平行する。
前記微小液滴生成装置１０により前記複数の微小液滴を製造する時に、予め前記第二の液体（油相組成物）を前記微小液滴の容器６０に置いておく。前記第二の液体の液面が前記環状面６４１の水平面と面一となると、前記第二の液体の添加を停止する。この時、前記第二の液体の液面が前記環状面６４１の表面と同一水平面に位置することは、前記微小液滴の容器６０中の前記第二の液体の油面が平面であることを確保することができ、しかも、容器底面の上方の油液の天井面が水平面であるということを確保することができ、イメージングが簡便であり、前記微小液滴の容器６０の利用率が向上し、より多い微小液滴の収容が可能となる。
一実施例では、前記環状板６４０の内周は、前記第一の環状側板６２０における前記容器底板６１０から離れた一方端に接続される。前記微小液滴の容器６０は、さらに、第二の環状側板６５０を含む。前記第二の環状側板６５０は、前記環状板６４０を取り巻くように配置され、前記環状板６４０に固定接続され、前記第二の環状側板６５０の半径が前記環状板６４０の内径よりも大きい。
前記環状板６４０、前記第一の環状側板６２０、前記容器底板６１０及び前記第二の環状側板６５０により、前記環状面６４１、前記第一の環状側面６２１が、それぞれ、前記底面６１１と相互に協働して、前記収容空間６３０を形成する。前記収容空間６３０には、前記第二の液体（油相組成物）を収容する。前記第二の液体の液面は、前記環状面６４１の表面と同一水平面に位置すると、前記微小液滴の容器６０中の前記第二の液体の液面が平面であることを確保することができ、しかも、容器の底面の上方の油液の天井面が水平面であることを確保することができ、前記微小液滴の容器の液面全体が円弧形となり、液面が凹形液面をなすという問題を解決することができる。そして、前記蛍光信号検出装置３０により前記複数の微小液滴を蛍光で検知する時に、イメージングがより簡便となり、前記微小液滴の容器６０の利用率が向上し、より多い微小液滴の収容が可能となる。
一実施例では、前記環状板６４０は、その外周が前記第一の環状側板６２０における前記容器底板６１０から離れた一方端に接続される。
一実施例では、前記第一の環状側板６２０は、その外周が前記第一の環状側面６２１に固定接続される。前記環状板６４０を前記第一の環状側板６２０に接続することにより、前記微小液滴の容器６０が一つの水平台を形成することができる。前記微小液滴の容器６０に前記第二の液体を添加すると、前記第二の液体の液面が前記環状面６４１の表面と同一の水平面に位置するため、前記微小液滴の容器６０中の前記第二の液体の油面が平面であることを確保することができ、しかも、容器の底面の上方の油液体の天井面が水平面であることを確保することができ、前記微小液滴の容器の液面全体が円弧形状であり、液面が凹形状の液面を成すという問題を解決することができる。そして、前記蛍光信号検出装置３０により前記複数の微小液滴を蛍光で検知する時に、イメージングがより簡便となり、前記微小液滴の容器６０の利用率が向上し、より多い微小液滴の収容が可能となる。
一実施例では、前記微小液滴の容器６０は、第三の環状側板６６０をさらに含む。前記第三の環状側板６６０は、その一方端が前記底面６１１に固定接続される。前記第三の環状側板６６０は、他方端が前記第一の環状側板６２０の内周に固定接続される。前記第三の環状側板６６０は、前記容器底板６１０と共に前記収容空間６３０を形成するように囲まれる。
一実施例では、前記第三の環状側板６６０は、前記容器底板６１０と垂直する。前記微小液滴の容器６０に前記第三の環状側板６６０を配置することにより、前記第二の液体の液面が前記環状面６４１の表面と同一水平面に位置するようにして、前記微小液滴の容器６０中の液面が平面となり、従来に凹形状の液面の発生を避け、イメージングを簡便にし、前記微小液滴の容器６０の利用率を向上させることができる。
一実施例では、前記微小液滴の容器６０は、、前記底面６１１に間隔配置され、前記底面６１１と共に、一つの微小液滴収容溝６１４を形成するように囲まれる、複数の環状突出部６１３をさらに含む。前記微小液滴収容溝６１４は、生成された前記複数の微小液滴を収容するために用いられ、前記複数の微小液滴は、微小液滴の敷き詰め方法により、前記底面６１１に敷き詰められ、撮影により観察するように、単層の微小液滴を形成する。それと同時に、複数の前記微小液滴収容溝６１４の間のピッチは、前記微小液滴生成装置１０のピンの間の距離に基づいて配置されてもよい。そうすると、一度、複数の前記微小液滴収容溝６１４内に複数の微小液滴を形成することができる。前記微小液滴の容器６０の収容量が向上し、異なる種類の核酸を検知することに用いられえる。
一実施例では、複数の前記環状突出部６１３は、その高さが０．１ｍｍ－１ｍｍである。前記環状突出部６１３の高さを配置することにより、誘導光が側面から照射することにより招致された影を排除することに役立ち、前記カメラにより微小液滴の全ての蛍光情報を取得することができ、前記蛍光検知装置の感度が向上する。
一実施例では、前記微小液滴収容溝６１４の内壁の表面に疎油層が配置されている。前記容器底板６１０の表面を疎油処理することにより、前記底板６１０と前記微小液滴との間の粘度が低下し、表面張力が低下し、ひいては、摩擦力が低下し、落下し易いため、前記微小液滴が自動で拡散しており、前記複数の微小液滴が集まるのを避けることができる。同時に、前記複数の微小液滴が敷き詰める際に、その速度がより速く、前記複数の微小液滴が前記微小液滴の容器の底板６１０に敷き詰めることに役立つ。前記容器の底板の表面張力が前記第二の液体（油類）６９９の表面張力よりも小さい場合に、前記微小液滴と前記底板との抵抗が小さくなり、前記微小液滴が自動で前記微小液滴反応セルの底部に拡散し、敷き詰めが実現される。
前記疎油膜は、疎油層とも呼ばれ、複合の被覆材料であって、機能性を持ち材料の被覆層であり、疎油という機能を具備していることが多い。前記疎油層は、一般的に、ナノ二酸化ケイ素を素材（ＳｉＯ２）として、スプレーの工程を介して、表面に被覆層が形成され、良い透光性と疏水・疎油性を具備している。前記複数の微小液滴は、前記反応セルと接触すると、その接触角度が９０度になり得るため、跡を残すことなく、自動で転がり落ちることが可能であり、前記複数の微小液滴が前記微小液滴の容器底部６１０に敷き詰められることが実現される。
一実施例では、微小液滴生成試薬キットは、上記の実施例に記載の前記微小液滴の容器６０、密封蓋６７０及び油相組成物を含み、前記油相組成物が前記収容空間６３０に置かれ、前記収容空間６３０を密封するように、前記密封蓋６７０が前記開口６３１に配置される。
一実施例では、各反応セル６１２は、各前記環状突出部６１３を含み、各前記環状突出部６１３は、前記底面６１１と共に、一つの微小液滴収容溝６１４を形成するように囲まれる。前記容器底板６１０は、複数の反応セル６１２が配置されており、各反応セル６１２に複数の微小液滴が貯留可能であるため、前記微小液滴の容器６０により、バッチで生産された微小液滴を収容することができるため、実際に検知された液滴の数が遥かに２００００個を超えることが可能となり、前記微小液滴の個数に対する制限が無くなる。
一実施例では、複数の前記反応セル６１２は、その形状が長方形とされる。前記微小液滴の容器６０は、方形や長方形とされる。今まで、圧倒的な多いフィルム及びデジタル感光素子ＣＣＤ／ＣＭＯＳが方形であることから、前記微小液滴の容器６０の形状を方形として設計すると、前記微小液滴の容器の空間の利用率が向上すると共に、形成された蛍光画像を接合することを便宜にし、リアルタイムで追踪を実現できる。
一実施例では、複数の前記反応セル６１２は、等間隔で前記容器底板６１０に配列される。複数の前記反応セル６１２のピンチは、前記微小液滴生成装置１０のピンの間の距離と同じであることから、複数の前記反応セル６１２内に多量の微小液滴を同時に形成することができ、微小液滴を生成する速度が上がり、時間を省くことができる。また、前記微小液滴生成装置１０により、前記複数の反応セル６１２内に複数の体積が異なる微小液滴を生成することができる。
一実施例では、複数の前記環状突出部６１３は、その高さが０．１ｍｍ－１ｍｍである。前記環状突出部６１３の高さを配置することにより、誘導光が側面から照射することにより招致された影を排除することに役立ち、前記カメラにより微小液滴の全ての蛍光情報を取得することができ、前記蛍光検知装置の感度が向上する。
従来のデジタルＰＣＲ検知システムにおける独立する各反応セルは、一般的に、一つの微小液滴が置かれる。また、実際の検知工程では、実際に検知された液滴の数が２００００個に達すなかったため、前記微小液滴の個数に依然として制限が存在している。そして、前記微小液滴の容器６０によれば、上記の問題を解決でき、発生する前記微小液滴の個数に限制がない。
従って、前記容器底板６１０における複数の前記反応セル６１２により、多量の微小液滴を収容でき、前記微小液滴の容器６０の収容量が大きく、２００００個以上の微小液滴を検知し、異なる種類の核酸を検知することができる。前記反応セルの周辺枠により、前記複数の微小液滴が、隣接する反応セル６１２へ落下してしまうことを避けることができる。
一実施例では、前記微小液滴の容器６０の横断面は、長方形とされる。前記微小液滴の容器６０は、方形や長方形とされる。前記微小液滴の容器６０の形状は、カメラレンズの形状と一致すると、前記微小液滴の容器の空間に利用率が向上すると共に、蛍光画像の接合を便宜に形成し、リアルタイムで追踪を行うことができる。
一実施例では、前記環状板６４０は、一つの方形枠である。
前記容器底板６１０の表面に疎油処理を行うことにより、前記底板６１０と与前記微小液滴との間に粘黏性を降低させ、表面張力が降低し、摩擦力が降低し、滑落しやすく、前記微小液滴が自動に拡散し、前記複数の微小液滴の集まりを防ぐすることができる。また、前記複数の微小液滴の敷き詰めをより急速にし、前記複数の微小液滴を前記微小液滴の容器の底板６１０に敷き詰めることに役立つ。前記容器底板の表面張力が前記第二の液体（油類）の表面張力よりも小さい場合に、前記微小液滴と前記底板との抵抗が小さくなり、前記微小液滴が自動で前記微小液滴反応セル底部に拡散して敷き詰める。
前記疎油膜は、疎油層とも呼ばれ、複合の被覆材料であって、機能性を持ち材料の被覆層であり、疎油という機能を具備していることが多い。前記疎油層は、一般的に、ナノ二酸化ケイ素を素材（ＳｉＯ２）として、スプレーの工程を介して、表面に被覆層が形成され、良い透光性と疏水・疎油性を具備している。前記複数の微小液滴は、前記反応セルと接触すると、その接触角度が９０度になり得るため、跡を残すことなく、自動で転がり落ちることが可能であり、前記複数の微小液滴が前記微小液滴の容器底部６１０に敷き詰められることが実現される。
一実施例では、前記第一の環状側板６２０又は前記第二の環状側板６５０は、その高さが５ｍｍ－１５ｍｍである。前記第一の環状側板６２０又は前記第二の環状側板６５０の高さを配置することにより、前記微小液滴生成装置１０が前記複数の微小液滴を製造する工程に、前記複数の微小液滴が引き出されてしまうことが避けられる。また、誘導光が側面から照射することにより招致された影を排除することに役立ち、前記カメラにより微小液滴の全ての蛍光情報を取得することができ、前記蛍光検知装置の感度が向上する。
一実施例では、前記容器底板６１０は、その材質がガラス、石英又はステンレス鋼などである。
一実施例では、前記容器底板６１０は、その材質がガラスであり、価格が安く、消耗品としてコストが低い。
多量の微小液滴を検知すると、前記微小液滴の容器６０にガラス材質を用いて、価格が安く、消耗品としてコストが低く、一回だけ検知に用いると捨てても構わないため、クロス汚染が避けられ、検知時間が短縮化し、前記デジタルＰＣＲ検出器１による検知効率が高い。
一実施例では、前記環状突出部６１３は、前記微小液滴の容器の底板６１０の材料と同じである。工程の技術により、前記微小液滴の容器の底板６１０に複数の前記反応セル６１２を形成する。複数の前記反応セル６１２は、マトリックスの形式で前記微小液滴の容器の底板６１０に形成され、複数の核酸増幅セルを形成する。
一実施例では、前記容器底板６１０の形状・サイズは、２４孔板と９６孔板のほうと一致しているため、前記微小液滴の容器６０を便宜に他の類型の機器へ応用でき、より実用性と交換性を持っている。
一実施例では、前記第一の環状側板６２０又は前記第二の環状側板６５０は、その材質が耐高低温性、耐油性を持ち、蛍光なしの黒いシリコーンゴムとされる。前記黒いシリコーンゴムは、無味で毒性を持たず、耐熱・耐寒性を持つという利点を持っている。しかも、前記黒いシリコーンゴムは、優れた電気絶縁性、耐酸素性及び耐老化性、耐光性及び耐老化性、カビ防止性及び化学的安定性などの利点を持っており、現代医学の分野に注目されている。
前記微小液滴の容器６０に、ガラス又はステンレス鋼材質を用いると、検知のコストを削減することができる。また、前記容器底板６１０における複数の前記反応セル６１２に多量の微小液滴を収容することにより、前記微小液滴の容器の収容量が大きくなり、２００００個の微小液滴を検知し、異なる種類の核酸を検知し、価格が低いという利点を持っている。
誘導光源は、前記微小液滴の容器６０に傾斜して照射すると、前記複数の微小液滴を照射する。前記誘導光源により形成された傾斜な照射光路は、誘導光の散乱の背景を効果的に低下させることができる。それと同時に、前記微小液滴の容器６０の前記第一の環状側板６２０又は前記第二の環状側板６５０の高さを小さくすると、誘導光が側面から照射することにより招致された影を排除することに役立ち、前記蛍光信号検出装置３０のカメラにより微小液滴の全ての蛍光情報を取得することができ、前記蛍光検知装置３０の感度が向上する。
図３８－３９示されるように、一実施例では、本出願が提供する微小液滴の容器６０は、第一の容器の底板６８０、多角形形状の周辺枠６８４及び容器蓋６９０を含む。前記第一の容器の底板６８０には、複数の多角形形状の突出部６８１が配置されている。前記多角形形状の周辺枠６８４は、第一の収容空間６８５を形成するように囲まれ、前記多角形形状の周辺枠６８４が前記第一の容器の底板６８０に接続され、前記複数の多角形形状の突出部６８１が前記第一の収容空間６８５に配置される。前記容器蓋６９０は、前記多角形形状の周辺枠６８４における前記第一の容器の底板６８０から離れた表面に配置され、前記容器蓋６９０と前記多角形形状の周辺枠６８４とが着脱可能に接続され、前記容器蓋６９０と前記多角形形状の周辺枠６８４とが一つの油類の収容溝６９８を形成するように囲まれる。
前記多角形形状の周辺枠６８４は、その両側が、それぞれ、前記第一の容器の底板６８０と前記容器蓋６９０とに接続され、前記容器蓋６９０は、前記多角形形状の周辺枠６８４と着脱可能に接続され、前記微小液滴の容器６０を密封する。前記複数の多角形形状の突出部６８１は、その形状が正方形、長方形や五辺形などの多角形形状であってもよい。前記容器蓋６９０は、前記多角形形状の周辺枠６８４と共に、油類の収容溝６９８を形状するように囲まれ、前記容器蓋６９０により前記微小液滴の容器６０を密封すると、前記微小液滴の容器６０における余計な油類物質を前記油類の収容溝６９８に押し出し、検知工程に対する微小液滴の上層部分の油類物質の影響を可及的に避けることができると共に、油類物質による蛍光の背景を避けることができる。また、前記微小液滴の容器６０における余計な油類物質を前記油類の収容溝６９８に押し出すことにより、前記微小液滴の容器６０における複数の微小液滴と接触する油類物質が少なくなるため、油類物質が水飽和でない場合に複数の微小液滴の水分が吸収され、微小液滴の水分が蒸発してしまうという問題を解決できる。
前記微小液滴の容器６０を用いて油性の液体を貯留すると、空気の混入により気泡が発生することにより、前記蛍光信号検出装置３０を介してリアルタイムで前記複数の微小液滴に変化する蛍光イメージを撮影することに影響を与えるおそれがある。従って、前記微小液滴の容器６０を密封することにより、前記微小液滴の容器６０が３～５度で傾斜されると、前記微小液滴の容器６０からの液体の流出を避けるに加えて、前記微小液滴の容器６０の気泡を排出して撮影で検知する時に、気泡による画像への影響を避けることができる。
図４０乃至４２を参照すると、一実施例では、前記容器蓋６９０は、平板６９１及び多角形形状の容器蓋フレーム６９２を含む。前記平板６９１は、透明状である。前記多角形形状の容器蓋フレーム６９２は、前記平板６９１を装着するための装着空間６９７を形成するように囲まれる。
一実施例では、前記平板６９１がガラス板である。前記平板６９１と前記多角形形状の容器蓋フレーム６９２とは、耐水、耐高温、蛍光なし、毒性なし、ＰＣＲ反応に抑制しないゲルで貼り付けて固定されてもよい。前記平板６９１は、ガラス板であると、価格が安く、消耗品としてコストが低い。多量の微小液滴を検知する際に、前記微小液滴の容器６０をガラスの材質として利用すると、価格が安く、消耗品としてコストが低く、一度検知したと捨てても構わず、クロス汚染を避け、検知の時間を省いて、前記デジタルＰＣＲ検出器による検知の効率を向上させることができる。
一実施例では、前記多角形形状の容器蓋フレーム６９２は、多角形形状のフレーム本体６９３、複数の延在板６９５及び複数の平板装着枠６９６を含む。前記多角形形状のフレーム本体６９３は、複数の周辺枠６９４を含み、前記複数の周辺枠６９４に固定接続される。各前記延在板６９５は、各前記周辺枠６９４に固定接続され、前記装着空間６９７に対して傾斜して延在する。各前記平板装着枠６９６は、各前記延在板６９５に固定接続され、前記多角形形状の周辺枠６８４により囲まれて形成された前記第一の収容空間６８５に延在する。
一実施例では、前記複数の周辺枠６９４は、前記多角形形状のフレーム本体６９３を形成するように固定接続される。各前記周辺枠６９４の表面と各前記延在板６９５の表面とのなす夾角が９０度よりも大きいため、前記容器蓋６９０を前記多角形形状の周辺枠６８４に接続する時に、前記油類の収容溝６９８を形成することができる。前記微小液滴の容器６０における余計な油類物質を前記油類の収容溝６９８に押し出すことにより、検知工程に対する微小液滴の上層部分の油類物質の影響を可及的に避け、油類物質による蛍光の背景を避けることができる。
一実施例では、前記複数の延在板６９５は、環状枠を形成するように順次に固定接続され、前記多角形形状のフレーム本体６９３に固定接続される。前記複数の平板装着枠６９６は、環状枠を形成するように順次に固定接続され、前記複数の延在板６９５により形成された環状枠に固定接続される。前記多角形形状の容器蓋フレーム６９２が一体となる。
一実施例では、各前記延在板６９５の表面と各前記平板装着枠６９６の表面とのなす夾角が９０度よりも大きい。各前記平板装着枠６９６の表面と各前記周辺枠６９４の表面とのなす角度が９０度であるということにより、前記平板装着枠６９６が前記微小液滴の容器６０における油性液体の液面と垂直していることから、前記平板６９１が装着された場合に、長方形の界面が形成され、カメラレンズの形状と同じとなり、前記微小液滴の容器６０の液面が平面の状態にあることになる。そして、前記微小液滴の容器６０の全体の液面が円弧形となることが避けられる。従って、前記微小液滴の容器６０によると、前記第一の容器の底板６８０における辺縁の箇所と近い微小液滴の観測に影響を与えず、カメラにより撮影してイメージングを行うことに役立ち、前記複数の微小液滴への検知効率が向上する。また、前記微小液滴の容器６０によると、前記微小液滴の容器６０の利用効率が向上し、より多量の微小液滴が受容されえる。
前記容器蓋６９０により前記微小液滴の容器６０を密封する時に、前記微小液滴の容器６０における余計な油類物質を前記油類の収容溝６９８に押し出し、検知工程に対する微小液滴上層部分の油類物質の影響をできるだけ避けることができる。
図４３を参照すると、一実施例では、前記第一の容器の底板６８０は、基板６８３をさらに含み、複数の前記多角形形状の突出部６８１が前記基板６８３における前記多角形形状の周辺枠６８４に近い第一の表面にマトリックス状に配置され、各前記多角形形状の突出部６８１は、前記基板６８３における前記多角形形状の周辺枠６８４と近い表面と共に、一つの第一の微小液滴収容溝６８２を形成するように囲まれる。
一実施例では、複数の前記多角形形状の突出部６８１は、長方形である。前記微小液滴の容器６０は、方形又は長方形である。現在まで、圧倒的に多いフィルム及びデジタル感光素子であるＣＣＤ／ＣＭＯＳが共に方形であることから、前記微小液滴の容器６０形状を方形に設計すると、前記微小液滴の容器の空間の利用率を高めるに加えて、形成された蛍光画像の接合を便宜にし、リアルタイムで追踪を行うことが図れる。
複数の前記多角形形状の突出部６８１は、前記基板６８３における前記周辺枠６８４と近い表面にマトリックス状配置され、各前記多角形形状の突出部６８１は、前記基板６８３と共に、一つの第一の微小液滴収容溝６８２を形成するように囲まれる。前記第一の微小液滴収容溝６８２は、生成された前記複数の微小液滴を収容し、かつ前記複数の微小液滴が微小液滴敷き詰め方法により于第一の容器の底板６８０に平らに敷き詰めされ、単層の微小液滴又は多層の微小液滴を形成し、撮影による観察に供する。同時に、複数の前記多角形形状の突出部６８１間のピッチは、前記微小液滴生成装置１０のピンの間の距離に従って配置されてもよい。そして、一次だけ複数の前記第一の微小液滴収容溝６８２内に複数の微小液滴を形成することができ、前記微小液滴の容器６０の収容量が向上し、異なる種類の核酸を検知することもできる。
一実施例では、各前記多角形形状の突出部６８１は、その高さが０．２ミリメートル～０．８ミリメートルである。
各前記多角形形状の突出部６８１は、その高さが０．２ミリメートル～０．８ミリメートルであり、好ましくは０．３ミリメートル～０．５ミリメートルにある。検知工程では、はみ出さないように、複数の微小液滴を、囲まれて形成された前記第一の微小液滴収容溝６８２に貯留するというニーズを満たすために、前記多角形形状の突出部６８１の高さが低く過ぎるにならない。従って、前記多角形形状の突出部６８１の高さは、少なくとも一つの液滴直径以上であるとよい。前記蛍光検知装置３０により微小液滴の画像を採集すると、前記微小液滴の容器６０の前記第一の微小液滴収容溝６８２に両層又は両層以上の微小液滴を形成してもよい。そうすると、デジタルＰＣＲ検出器による検知の範囲を広げ、バッチで生産された微小液滴を処理することに役立つ。前記微小液滴生成装置１０により核酸増幅反応液を微滴化させ、複数の微小液滴を形成すると、各微小液滴の体積が一般的に、場合によってその直径が０．１ミリメートル～０．２ミリメートルの間にある。検知される時に、多層の微小液滴があり、又は、微小液滴が積み重ねる場合に、通常に、前記多角形形状の突出部６８１の高さを２個微小液滴直径以上に配置することにより、前記微小液滴生成装置１０が複数の前記微小液滴を製造する工程に、複数の前記微小液滴が引き出されてしまうことが避けられる。また、誘導光が側面から照射することにより招致された影を排除することに役立ち、前記蛍光信号検出装置３０が微小液滴の全ての蛍光情報を取得できるようにして、前記蛍光検知装置３０の感度が向上する。
また、前記蛍光検知装置３０を使用して複数の微小液滴の画像を採集する時に、各前記多角形形状の突出部６８１の高さが画像の採集に影響しないため、誘導光が側面から照射することにより招致された影を排除することに役たち、前記カメラにより所有微小液滴の蛍光情報を取得し、前記蛍光検知装置３０の感度を向上させる。
一実施例では、複数の前記多角形形状の突出部６８１により囲って形成された前記第一の微小液滴収容溝６８２内壁表面には、疎油層が配置されている。つまり、複数の前記多角形形状の突出部６８１における前記第一の微小液滴収容溝６８２の空間に近い表面に疎油層が配置されている。
前記基板６８３表面に疎油処理を施すことにより、前記基板６８３と前記微小液滴との間の粘黏性が低下し、表面張力が低下し、ひいては、摩擦力が低下し、滑落が容易になり、前記微小液滴が自動に拡散して、複数の微小液滴が聚集されるということを避けることができる。同時に、複数の微小液滴が敷き詰められる時により急速になり、複数の微小液滴が前記基板６８３に敷き詰められるに役立つ。前記基板６８３の表面張力が油類物質の表面張力よりも小さい場合に、微小液滴と前記底板との抵抗が小さくなり、微小液滴が自動に前記第一の微小液滴収容溝６８２の底部に拡散して、敷き詰められる。
前記疎油膜は、疎油層とも言われ、複合塗層材料であって、機能性材料塗層であり、疎油の機能を有することが多い。前記疎油層は、一般的に、ナノ二酸化ケイ素を原材料（ＳｉＯ２）として、スプレーの工程により、表面に塗層を形成し、良い透光性と疏水・疎油性を具備している。前記複数の微小液滴は、前記反応セルと接触する時に、その接触角が９０度になりえるため、跡を残すことなく、自動で転がり落ちることが可能であり、前記複数の微小液滴を前記基板６８３に敷き詰めることが実現される。
一実施例では、前記基板６８３の形状、サイズ及び大きさは、２４孔板と９６孔板のほうと一致していることから、前記微小液滴の容器６０を便宜に他の類型の機器に応用して、良い実用性及び交換性を有する。
複数の前記多角形形状の突出部６８１により囲まれて形成された前記第一の微小液滴収容溝６８２は、複数の微小液滴を置くことから、前記微小液滴の容器６０がバッチ生産で微小液滴を収容し、実際に検知された液滴数量が遥かに２００００個超えて、微小液滴の個数に対する限制が無くなる。
前記容器蓋６９０が前記微小液滴の容器６０を密封する時に、前記平板６９１と前記第一の微小液滴収容溝６８２における微小液滴との距離について、高すぎるにならない。一般的に、距離を１ミリメートル～２ミリメートルの間に配置すると、微小液滴画像に対する微小液滴の上層の油類物質の影響を避け、油類物質による蛍光背景を避け、しかも、複数の微小液滴を前記基板６８３に敷き詰めることに役立ち。しかも、前記微小液滴の容器６０における余計な油類物質を前記油類の収容溝６９８に押し出し、前記微小液滴の容器６０における複数の微小液滴と接触する油類物質が少なくなるため、油類物質が飽和でない場合に複数の微小液滴の水分が吸収されて微小液滴の水分が蒸発してしまうという問題を解決することができる。
図４４－４７を参照すると、一実施例では、前記多角形形状の周辺枠６８４が複数の第一の支持ロッド６８６、複数の支持板６８８及び複数の第二の支持ロッド６８９を含む。各前記第一の支持ロッド６８６が環状に接続される。各前記支持板６８８は、各前記第一の支持ロッド６８６の内壁に固定配置され、前記第一の収容空間６８５に延在され、前記複数の支持板６８８が環状に接続され、前記第一の容器の底板６８０を支持するために用いられる。各前記第二の支持ロッド６８９は、各前記第一の支持ロッド６８６における前記第一の容器の底板６８０から離れた第一の支持ロッド表面６８７に固定配置され、前記複数の第二の支持ロッド６８９が環状に接続され、前記複数の第二の支持ロッド６８９は、前記複数の第一の支持ロッド６８６と共に前記第一の収容空間６８５を形成するように囲まれ、前記複数の第二の支持ロッド６８９は、前記多角形形状のフレーム本体６９３の前記複数の周辺枠６９４に着脱可能に接続される。
各前記支持板６８８は、各前記第一の支持ロッド６８６の内壁に固定配置され、前記第一の収容空間６８５に延在され、前記複数の支持板６８８が環状に接続され、前記第一の容器の底板６８０を支持するために用いられる。前記第一の容器の底板６８０は、前記複数の支持板６８８により形成された環状支持フレームに装着されると共に、前記複数の前記多角形形状の突出部６８１が前記第一の収容空間６８５に配置される。
図４８を参照すると、前記多角形形状の周辺枠６８４と前記容器蓋６９０とが両面テープ６９９を介して貼り合わせられ、言い換えれば、複数の前記第二の支持ロッド６８９により環状接続して形成された多角形形状フレームの表面に、前記両面テープ６９９を貼り合うことにより、前記周辺枠６９４における前記多角形形状の周辺枠６８４と近い第一の表面と接続して前記多角形形状の周辺枠６８４と前記容器蓋６９０とを密封で接続させることを便宜にすることができる。
一実施例では、前記微小液滴の容器６０の前記基板６８３及び前記平板６９１は、共にガラス板であり、デジタルＰＣＲ検出器により検知を行う時に試料容器の消耗品が消費されたという問題を解決し、コストを削減することができる。同時に、前記微小液滴の容器６０は、各素子間の高さを配置することにより、前記微小液滴の容器６０全体の構造が比較的小さい薄いことから、多量微小液滴の再現性が増加して、前記微小液滴の容器６０に対して急速に高低温で循環を行いながら、観察により検知することに役立ち。
一実施例では、各前記第二の支持ロッド６８９は、各前記第一の支持ロッド６８６よりも厚く、しかも、着脱を便宜にするように、前記第一の収容空間６８５から離れて一つの隙間を形成する。
前記多角形形状の周辺枠６８４は、一体成形とされ、前記第二の支持ロッド６８９の側面と前記第一の支持ロッド６８６の側面とが一つの平面に位置していないことから、前記容器蓋６９０と前記多角形形状の周辺枠６８４とが貼り合われた際に余計なゲルがはみ出されてしまうということを避けたり、手や他の箇所に付着されてしまうことを避けたりすることができる。各前記第二の支持ロッド６８９の厚さは、各前記第一の支持ロッド６８６の厚さよりも小さく、前記第一の収容空間６８５から離れて一つの隙間を形成すると、着脱を便宜にすることができる。
一実施例では、微小液滴の容器製造方法は、基板６８３を提供するステップＳ５１０と、前記基板６８３の表面に複数の多角形形状の突出部６８１を製造し、第一の容器の底板６８０を形成するステップＳ５２０と、多角形形状の周辺枠６８４を提供し、前記第一の容器の底板６８０を前記多角形形状の周辺枠６８４に接続するステップＳ５３０と、容器蓋６９０を提供し、前記容器蓋６９０を前記多角形形状の周辺枠６８４における前記第一の容器の底板６８０から離れた表面に貼り付け、密封し、微小液滴の容器を形成するステップＳ５４０と、を含む。
一実施例では、まず、前記基板６８３と前記多角形形状の周辺枠６８４とをゲルにより接続させてもよい。この時、前記基板６８３に複数の前記多角形形状の突出部６８１が配置されていない。次に、油性の液体を前記基板６８３と前記多角形形状の周辺枠６８４とが貼り合われた容器に置く。次に、ディスペンサーにより流体を滴下させ、前記基板６８３における前記多角形形状の周辺枠６８４と近い表面に塗布することにより、三次元・四次元の経路によるディスペンシング、正確な位置決め、ゲルへの正確な制御、糸引きなし、漏れなし、滴下なしが図られるように、複数の前記多角形形状の突出部６８１を形成する。次に、デジタルＰＣＲ検出器の微小液滴生成装置１０により、複数の前記多角形形状の突出部６８１に多量の微小液滴を用意する。最後に、前記多角形形状の周辺枠６８４を前記容器蓋６９０に接続し、接続する時に両面テープで貼り合いを行い、この時に両面テープが多角形形状の形状として配置され、前記多角形形状の周辺枠６８４と前記容器蓋６９０とが十分に貼り合われる。
一実施例では、まず、前記基板６８３における前記多角形形状の周辺枠６８４と近い表面に複数の前記多角形形状の突出部６８１を形成してもよい。複数の前記多角形形状の突出部６８１を製造する時に、ディスペンサー、印刷、スクリーン印刷など方式が採用されてもよい。前記基板６８３における前記多角形形状の周辺枠６８４と近い表面に複数の前記多角形形状の突出部６８１を製造して、マトリックス形式で配列され、前記第一の容器の底板６８０を形成する。次に、前記第一の容器の底板６８０と前記多角形形状の周辺枠６８４と貼り合い接続される。再度、油性液体を前記第一の容器の底板６８０と前記多角形形状の周辺枠６８４を貼り合わせた容器に置く。次に、デジタルＰＣＲ検出器の微小液滴生成装置１０により、複数の前記多角形形状の突出部６８１に多量の微小液滴を用意する。最後に、前記多角形形状の周辺枠６８４と前記容器蓋６９０とを接続させ、接続する時に、両面テープで張り合わせてもよい。この時に、両面テープが多角形形状の形状として配置されて、前記多角形形状の周辺枠６８４と前記容器蓋６９０が十分に貼り合わられてもよい。
一実施例では、前記ステップＳ５２０に、複数の前記多角形形状の突出部６８１を製造する時に、ディスペンサー、スプレー印刷、スクリーン印刷及び熱圧成形など方法が使用されてもよい。
一実施例では、前記多角形形状の突出部６８１の材質が耐高低温性と耐油性を持ち、蛍光なしのポリマーであることから、前記微小液滴に対して高低温で循環を行い蛍光撮影する時に、前記多角形形状の突出部６８１による影響を避けることができる。
一実施例では、前記多角形形状の突出部６８１は、黒いシリコーンゴム又はシリコーンシーラント（ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｓｅａｌａｎｔ）であってもよい。
複数の前記多角形形状の突出部６８１は、その材質が耐高低温性と耐油性を持ち、蛍光なしの黒いシリコーンゴムである。そして、前記微小液滴を蛍光撮影する時に、前記多角形形状の突出部６８１による蛍光影響を避けることができる。前記黒いシリコーンゴムは、無味で毒性がなく、高温・低温に耐えるという特性を持っている。しかも、前記黒いシリコーンゴムは、優れた電気絶縁性、耐酸素性及び耐老化性、耐光性及び耐老化性、カビ防止性及び化学的安定性を持っていることから、現代医学の分野に注目されている。ディスペンサーにより流体を滴下させ、前記基板６８３における前記多角形形状の周辺枠６８４と近い表面に塗布すると、三次元・四次元の経路によるディスペンシング、正確な位置決め、ゲルへの正確な制御、糸引きなし、漏れなし、滴下なしが図られるように、複数の前記多角形形状の突出部６８１を形成する。
前記シリコーンシーラントは、耐候性、耐振性及び乾燥性、を有し、防臭でき、冷熱の変化に適応性が大きく、浸透防止、漏れ止めの効果が明らかであるという特性を持っている。
一実施例では、前記ステップＳ５２０に、複数の前記多角形形状の突出部６８１を製造する時に射出成形や熱圧成形の方式で加工されてもよい。
一実施例では、デジタルＰＣＲ検出器の解析方法は、測定すべき核酸増幅反応液を製造するステップＳ１０と、前記測定すべき核酸増幅反応液を微滴化し、複数の微小液滴を形成するステップＳ２０と、前記複数の微小液滴に核酸増幅を行い、前記複数の微小液滴の蛍光情報をリアルタイムで取得するステップＳ３０と、前記複数の微小液滴の蛍光情報に基づいて、前記複数の微小液滴を定量解析するステップＳ４０を含む。
一実施例では、前記ステップＳ２０に、前記測定すべき核酸増幅反応液を微滴化し、複数の微小液滴を形成することは、瞬間で加速する微小液滴生成方法及び周期的に速度が変化する微小液滴生成方法という二つの微小液滴生成方法が含まれる。前記ステップＳ３０は、前記複数の微小液滴を前記微小液滴の容器に敷き詰めるステップＳ３１０と、敷き詰められた前記複数の微小液滴に核酸増幅を行うステップＳ３２０と、前記複数の微小液滴が核酸増幅されている時に、前記複数の微小液滴をリアルタイムで撮影検知するステップＳ３３０を含む。
微小液滴生成装置１０により製造される複数の微小液滴は、下向きに降下する工程では、微小液滴の容器６０の中間の箇所に集中に集まられ、集まれたと、観察がされにくい。そして、液滴容器底部に集中に集まられる課題について、微小液滴敷き詰め方法を提供する。
図４９を参照すると、一実施例では、前記ステップＳ３０は、前記複数の微小液滴を前記微小液滴の容器に敷き詰めるステップＳ３１０と、敷き詰められた前記複数の微小液滴を核酸増幅させるステップＳ３２０と、前記複数の微小液滴に核酸増幅させる時に、リアルタイムで前記複数の微小液滴を撮影検知するステップＳ３３０と、を含む。
一実施例では、前記ステップＳ３１０は、微小液滴敷き詰め方法が含まれる。前記微小液滴敷き詰め方法は、開口６３１を有し、第二の液体６９９を貯留している前記微小液滴の容器６０を提供するステップＳ３１１と、第一の液体１９０を提供し、前記第一の液体１９０の密度が前記第二の液体６９９のほうよりも大きく、前記第二の液体６９９と互いに相溶性を持たず、前記第一の液体１９０により生成された複数の微小液滴が前記微小液滴の容器の底板６１０に積み重ねられるステップＳ３１２と、前記複数の微小液滴が前記容器底板６１０に敷き詰めるまで、前記複数の微小液滴に高低温で循環を行うをステップＳ３１３とを含む。
前記微小液滴の容器６０に複数の微小液滴を生成し、前記微小液滴の容器６０の前記容器底板６１０に下落して、不規則で敷き詰めされる。多量の微小液滴が前記容器底板６１０に落下するときに、前記容器底板６１０に多層の微小液滴を形成する。しかも、微小液滴生成装置により製造される複数の微小液滴は、下向きに降下する工程では、微小液滴の容器の中間の箇所に集中に集まられ、集まれた観察がされにくい。
一実施例では、前記第二の液体６９９は、油相組成物である。
一実施例では、前記油相組成物は、その成分に鉱油及び界面活性剤を含む。前記油相組成物における鉱油の体積パーセントは、８８％－９８．５％である。前記界面活性剤は、長鎖アルキル基を含むシロキサン鎖非イオン性界面活性剤を含み、前記油相組成物における長鎖アルキル基含有のシロキサン鎖非イオン性界面活性剤の体積パーセントが１．５％－１２％である。
一実施例では、前記第一の液体は、測定すべき核酸増幅反応液である。
一実施例では、前記ステップＳ３１２は、出口端１１２を有し、第一の液体１９０を貯留する液体吐出ピペットチップ１１０を提供するステップＳ３１２２と、前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２を前記第二の液体６９９の液面下に挿入し、速度が周期的に変化する運動を行い、速度が変化している周期の前半及び後半に、前記液体吐出ピペットチップの出口端の速度がいずれも単調に変化するステップＳ３１２４と、周期に変化する前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動により、前記第一の液体１９０が前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出され、在前記第二の液体６９９の液面下で複数の微小液滴が形成され、前記微小液滴の容器の底板６１０に敷き詰めされるステップＳ３１２６と、を含む。
一実施例では、前記ステップＳ３１２４では、前記第二の液体６９９の液面下の前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の速度が余弦曲線状に変化する。
一実施例では、前記ステップＳ３１２４では、前記液体吐出ピペットチップの１１０出口端１１２が第二の液体６９９の液面下で周期的に変化する運動軌跡は、直線セグメント、円弧セグメント、多角形形状などの複数の種類の軌跡のうちの一つ又は複数の組み合わせを含む。
一実施例では、前記ステップＳ３１２は、出口端１１２を有し、第一の液体１９０を貯留している液体吐出ピペットチップ１１０を提供するステップＳ３１２１と、前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２を前記第二の液体６９９の液面下に挿入し、瞬間加速度の運動を行わせるステップＳ３１２３と、前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の瞬間加速度の運動により、前記第一の液体１９０が前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口１１２の一方端から排出され、前記第二の液体６９９の液面下に複数の微小液滴が形成され、前記微小液滴の容器の底板６１０に積み重ねられるステップＳ３１２５と、を含む。
一実施例では、前記ステップＳ３１２３では、前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が瞬間で加速する周期的な運動の周期の前半及び後半に、前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２は、速度の大きさが同じであり、方向が反対している。一実施例では、前記ステップＳ３１２３に瞬間で加速する周期的な運動の運動軌跡には、直線セグメント、円弧セグメント、多角形形状などの複数の種類の軌跡のうちの一つ又は複数の組み合わせが含まれる。
一実施例では、前記ステップＳ３１３は、前記複数の微小液滴を昇温するステップＳ３１３１と、前記複数の微小液滴を降温するステップＳ３１３３と、前記複数の微小液滴が前記微小液滴の容器の底板に敷き詰められたまで、前記複数の微小液滴を高低温で複数回だけ循環を行うステップＳ３１３５と、を含む。
一実施例では、前記微小液滴生成装置１０により、前記複数の微小液滴を製造する時に、予め前記第二の液体６９９を前記微小液滴の容器６０に置いておく。前記第二の液体６９９の液面と前記環状面６４１とが同じになるときに、前記第二の液体６９９の添加を停止する。このとき、前記第二の液体６９９の液面が前記環状面６４１の表面と同じレベルであることから、前記微小液滴の容器６０における前記第二の液体６９９の油面が平面であるということを確保でき、容器底面の上方の油液の天井面が水平面であるということを確保して、イメージングを便宜にすることができる。
前記第二の液体６９９に、前記微小液滴生成装置１０により、測定すべき核酸増幅反応液を微滴化し、多量の微小液滴を形成する。前記複数の微小液滴が前記微小液滴の容器の底板６１０の複数の前記反応セル６１２に落下する。前記環状面６４１と前記容器底板６１０とが平行することにより、前記微小液滴の容器における第二の液体６９９を水平面にすることを確保することができる。各反応セル６１２に複数の微小液滴を置いて、前記微小液滴の容器６０に２００００個以上の微小液滴を収容させるようにする。
一実施例では、前記ステップＳ３１２５に、前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２による瞬間で加速度運動の運動軌跡により、前記複数の微小液滴が前記微小液滴の容器の底板６１０に敷き詰められる。前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２による瞬間で加速度運動の運動軌跡により、前記複数の微小液滴が前記微小液滴の容器６０まで落下する時に、互いにずれるようにして、前記複数の微小液滴が前記微小液滴の容器６０まで落下する時に、互いに敷き詰めされないようにする。そして、前記複数の微小液滴を前記微小液滴の容器６０に敷き詰めて、撮影による観測を便宜にすることができる。
一実施例では、前記微小液滴の容器の底板６１０に疎油層が塗布されている。前記疎油層は、疎油塗層とも称し、複合の被覆材料であって、機能性を持ち材料の被覆層であり、疎油という機能を具備していることが多い。前記疎油層は、一般的に、ナノ二酸化ケイ素を素材として、スプレーの工程により、画面の表面に被覆層が形成され、良い透光性と疏水・疎油性を具備している。
一実施例では、前記温度制御装置２０が、上記の実施例に係る微小液滴敷き詰め方法に用いられる。前記温度制御装置２０は、フレキシブル回路基板２２０、前記フレキシブル回路基板２２０と間隔配置される加熱基板２４０及び前記フレキシブル回路基板２２０と前記加熱基板２４０との間に配置される複数の半導体熱電対２３０と含む。
高低温で循環を行うことにより、高低温で循環を行い、熱膨張収縮の原理に基づいて、敷き詰めを行う。物体は、温度が上がる時に、分子の運動エネルギーが増加し、分子の平均自由行程が増加していることから、熱膨張と表現される。同様に、物体は、温度が下がる時に、分子の運動エネルギーが減少し、分子の平均自由行程が減少していることから、収縮と表現される。温度が変化するのに伴い、温度が上がると、試料の液滴の粘度が低くなり、体積が收縮される。同時に、温度が高いほど粘度が低い。温度が６０℃程度となる時に、試料の液滴の形状が最も柔らかく、この時に、形状が概ね六角形を呈ている一方、他の温度の場合に、試料の液滴の形状が変化しにくく、液滴容器における敷き詰めが形成されにくい。
図５０を参照すると、複数の微小液滴が微小液滴の容器６０に落下し、前記複数の微小液滴が前記微小液滴の容器の底板６１０に敷き詰め、即ち、前記複数の微小液滴が前記微小液滴の容器の底板６１０に多層微小液滴を形成する。蛍光信号検知工程では、前記複数の微小液滴を撮影する時に、多層間に互いに影響を与え前記複数の微小液滴の撮影検知に悪い影響を与えた。従って、前記複数の微小液滴を収容している前記微小液滴の容器６０を高低温で循環させる。記複数の微小液滴が前記微小液滴の容器の底板６１０に敷き詰めるまで、前記複数の微小液滴を高低温で複数循環させ、バッチで生産された前記微小液滴が前記反応セル６１２に敷き詰め、膨大な液滴を大規模で平行して観測することを便宜にすることができる。従って、より正確に、前記複数の微小液滴の核酸増幅反応の関連情報を取得するために、前記複数の微小液滴を前記微小液滴の容器６０に敷き詰めることが必要である。前記複数の微小液滴を前記微小液滴の容器６０に敷き詰めることにより、一層だけ形成し、多層の微小液滴間に互いに影響し合うことを避け、前記蛍光信号検出装置３０により撮影検知して、更加精確地蛍光情報を取得して、定量で解析を便宜にすることができる。
一実施例では、前記ステップＳ３１２に、上記実施例の前記ステップＳ２０１、前記ステップＳ２０２及び前記ステップＳ２０３の前記微小液滴生成方法を使用して微小液滴を生成することは、出口端を有し、第一の液体を貯留している液体吐出ピペットチップを提供するステップＳ３１２１と、前記液体吐出ピペットチップの出口端を前記第二の液体の液面下に挿入し、瞬間で加速し周期的な運動を行わせるステップＳ３１２３と、前記液体吐出ピペットチップの出口端による瞬間加速度運動を行うことにより、前記第一の液体を前記液体吐出ピペットチップの出口端から排出し、前記第二の液体の内部に複数の微小液滴を形成し、前記微小液滴の容器の底板に積み重ねるステップＳ３１２５と、を含む。
一実施例では、前記ステップＳ３１２３では、前記液体吐出ピペットチップの出口端が瞬間で加速するように周期的に運動する周期の前半及び後半に、前記液体吐出ピペットチップの出口端の速度大きさが同じ、方向が反対である。一実施例では、前記ステップＳ３１２３に、瞬間で加速するように周期的に運動する運動軌跡は、直線セグメント、円弧セグメント、多角形形状などの複数の種類軌跡のうちの一つ又は複数の組み合わせが含まれる。
一実施例では、前記ステップＳ３１２に、上記実施例の前記ステップＳ２１１、前記ステップＳ２１２以及び前記ステップＳ２１３の前記微小液滴生成方法を使用し微小液滴を生成することは、出口端を有し、第一の液体を貯留している液体吐出ピペットチップを提供するステップＳ３１２２と、前記液体吐出ピペットチップの出口端を前記第二の液体の液面下に挿入、速度の大きさが周期的に変化する運動を行わせ、速度の大きさが変化する周期の前半及び後半に、前記液体吐出ピペットチップの出口端の速度が共に単調に変化するステップＳ３１２４と、周期に変化する前記液体吐出ピペットチップの出口端の運動に基づいて、前記第一の液体を前記液体吐出ピペットチップの出口端から排出し、前記第二の液体の液面下に複数の微小液滴を形成し、前記微小液滴の容器の底板に并敷き詰めするステップＳ３１２６と、を含む。
一実施例では、前記ステップＳ３１２４では、前記第二の液体の液面下の前記液体吐出ピペットチップの出口端の速度が余弦曲線状に変化する。
一実施例では、前記ステップＳ３１２４では、前記液体吐出ピペットチップの出口端が第二の液体の液面下で周期に変化する運動軌跡は、直線セグメント、円弧セグメント、多角形形状などの複数の種類の軌跡のうちの一つ又は複数の組み合わせを含む。
一実施例では、前記温度制御装置２０により高低温で循環を行うステップは、まず、前記複数の微小液滴を９０℃～９５℃まで昇温するように加熱し、５分～１０分だけ加熱すること、そして、前記複数の微小液滴を４０℃～６０℃まで降温し、３０ｓ～６０ｓだけアニーリングして伸長すること、最後に、順次に複数回だけ循環を行い、０℃～１０℃まで降温し、前記複数の微小液滴を保存することを含む。
一実施例では、前記温度制御装置２０により高低温循環を行うステップは、まず、前記複数の微小液滴を昇温するように加熱し、温度を９５℃まで加熱し、１０分だけ加熱すること、前記複数の微液を９５℃まで加熱し、１０分だけ加熱し、前記複数の微小液滴中の酵素をホットスタートすること、次に、前記複数の微小液滴が酵素ホットスタートされると、前記複数の微小液滴を変性３０ｓすること、次に、前記複数の微液が変性した後に、５５℃まで降温し、４５ｓだけアニーリングして伸長し、前記複数の微液を撮影し、４５回だけ循環を行うこと、最後に、循環が４５回だけ行われたと、４℃まで降温し、前記複数の微液を長時間に渡って保存する、ことをさらに含む。
前記測定すべき核酸増幅反応液は、前記微小液滴生成装置１０により、検知を行うための複数の微小液滴を生成する。前記微小液滴生成装置１０により製造された前記複数の微小液滴は、下向きに降下する工程では、微小液滴の容器６０の中間の箇所に集中に集まれることから、観察に役立たない。故に、前記複数の微小液滴の核酸増幅反応の関連情報をより正確に取得するために、前記複数の微小液滴を前記微小液滴の容器に敷き詰める必要がある。前記複数の微小液滴を前記微小液滴の容器に敷き詰め、一層だけ形成することにより、多層の微小液滴間に互いに影響を与えることを避け、前記蛍光信号検出装置３０により正確な蛍光情報を撮影して検知して取得し、定量で解析を便宜にすることができる。
一実施例では、前記ステップＳ３２０における前記複数の微小液滴を核酸増幅するステップは、以下の通りである。まず、前記微小液滴の容器６０を前記温度制御装置２０の前記加熱基板２４０に置いて、次に、前記複数の微小液滴を昇温するように加熱し、温度を９５℃まで上がり、１０分だけ加熱し、前記複数の微液を９５℃まで加熱し、前記複数の微小液滴中の酵素をホットスタートさせるように１０分だけ加熱する。次に、前記複数の微小液滴に酵素ホットスタートが完了した後に、前記複数の微小液滴を３０ｓだけ変性し、再度、前記複数の微液が変性した後に、５５℃まで降温し、４５ｓだけアニーリングして延在し、４５回だけ循環を行い、最後、４５回だけ循環が行われたと、４℃まで降温して、前記複数の微液を長時間に渡って保存する。
前記温度制御装置２０は、前記フレキシブル回路基板２２０と前記熱伝導強化層２５０により、前記微小液滴の容器６０の温度分布が均一となり、前記半導体致冷器の導熱性能が向上する。前記複数の微小液滴に、異なる温度範囲で核酸の増幅を行う時に、前記熱伝導強化層２５０の表面に配置される温度センサー２６０が前記第二の制御器２１０に接続されているため、前記微小液滴の容器６０のリアルタイムで温度を検知し、温度の情報を前記第二の制御器２１０にフィードバックし、前記複数の微小液滴加熱温度を制御することができる。迅速に数秒時間に切り替えが実現される。前記温度制御装置２０は、瞬間で昇降温を実現できることから、昇降温の工程が短くなり、高低温の循環が実現でき、前記デジタルＰＣＲ検出器１による検知の時間が短くなり、検知の効率が向上する。
以上の前記実施例に係る各技術的特徴は、任意に組み合わせることができ、記述を簡潔にするために、上記実施例における各技術的特徴のすべての可能な組合せを記述していないが、これらの技術的特徴の組合せは矛盾しない限り、本明細書に記載されている範囲に属すると考えられる。
以上の実施例は、本出願の幾つかの実施形態のみを詳細且つ具体的な的に示しているが、本出願の保護範囲を限定するものではないと理解すべきである。当業者にとって、本出願の創造的構想から逸脱しない前提で、幾つかの変形や改良を行うことができ、これらはすべて本出願の保護範囲に属するべきであると理解しなければならない。従って、本出願の保護範囲は、特許請求の範囲に記載された内容を基準とする。
最後に、説明するべきことは、本明細書に、例えば、「第一」、「第二」などという関係に係る技術的な表現が、一つのもの又は操作ともう一つのもの又は操作を区別するためにのみ使用されており、これらのもの又は操作の間に如何なる実際の関係又は順番を要求したり、暗示に示唆したりすることが必ず存在していない。しかも、「包括」や「含む」などの技術的表現又は他の如何なる変形も、非排他的に含まれるという意味を指しており、一連の要素からなる工程、方法、物品又は設備がこれらの要素だけでなく、明確に挙げられない他の要素、並びに、この工程、方法、物品又は設備が固有する要素も含まれているわけである。その以上の限定がない限り、「一つの……を含む」というセンテンスにより限定された要素は、前記要素を含む工程、方法、物品又は設備に存在している他の同様な要素を排除するものではない。
本明細書の各実施例では、段階的に説明を行い、他の実施形態との相違点に着目して、実施例間で同じ又は類似の部分について互いに参照すれば良い。
開示された実施例に対する上記説明により、当業者は、本出願を実施し、又は、使用することができる。これらの実施例に対する様々な変更は、当業者にとって自明である。本明細書で定義された一般的な原理は本出願の趣旨又は範囲を逸脱しない限り、他の実施例でも実施することができる。そのため、本出願は、本明細書に開示された実施例に限定されず、本明細書で開示された原理及び新しい特徴と一致している最も広い範囲に適合するべきである。

Claims (3)

  1. 微小液滴敷き詰め方法であって、
    開口を有し、第二の液体を貯留する微小液滴の容器を提供するステップＳ３１１と、
    密度が前記第二の液体よりも大きく、かつ、前記第二の液体と互いに溶解されない第一の液体を提供し、前記第一の液体により複数の微小液滴を生成し、前記微小液滴の容器の底板に積み重ね、前記複数の微小液滴が前記微小液滴の容器の底板に多層の微小液滴を形成するステップＳ３１２と、
    前記多層の微小液滴中の 前記複数の微小液滴が前記微小液滴の容器の底板に敷き詰められるように、温度制御装置により、前記複数の微小液滴を温度昇降して高低温で循環させて、単層の微小液滴を形成するステップＳ３１３と、を含み、
    前記温度制御装置は、
    フレキシブル回路基板（２２０）と、
    対向配置される第一の表面（２４１）及び第二の表面（２４２）を含み、前記フレキシブル回路基板（２２０）と間隔配置される加熱基板（２４０）と、
    前記フレキシブル回路基板（２２０）と前記第一の表面（２４１）との間に配置された複数の半導体熱電対（２３０）であって、互いに直列接続され、並列接続され、又は、直並列接続される複数の半導体熱電対（２３０）とを含む、ことを特徴とする 微小液滴敷き詰め方法。
  2. 前記ステップＳ３１２は、
    出口端を有し、第一の液体を貯留する液体吐出ピペットチップを提供するステップＳ３１２２と、
    前記液体吐出ピペットチップの出口端を前記第二の液体の液面下に挿入し、周期的に変化する速度で運動するようにし、速度が変化している周期の前半及び後半に、前記液体吐出ピペットチップの出口端の速度がいずれも単調に変化するステップＳ３１２４と、
    前記液体吐出ピペットチップの出口端が周期的に変化する運動に基づいて、前記第一の液体を前記液体吐出ピペットチップの出口端から排出し、前記第二の液体の液面下で複数の微小液滴を形成し、前記微小液滴の容器の底板に積み重ねるステップＳ３１２６と、を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の微小液滴敷き詰め方法。
  3. 前記ステップＳ３１３には、
    前記複数の微小液滴を昇温するステップＳ３１３１と、
    前記複数の微小液滴を降温するステップＳ３１３３と、
    前記複数の微小液滴が前記微小液滴の容器の底板に敷き詰められるまで、前記複数の微小液滴への温度昇降を複数循環するステップＳ３１３５と、を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の微小液滴敷き詰め方法。
JP2020560538A 2018-01-24 2019-01-24 微小液滴の容器、微小液滴の容器製造方法、微小液滴敷き詰め方法、微小液滴生成試薬キット、温度制御装置、微小液滴生成用の油相組成物及びその処理方法 Active JP7138301B2 (ja)

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