JP7170942B1 - タンパク質精製 - Google Patents

Abstract

タンパク質を精製するためのプロセス、特に、ワクチン又は生物学的製剤に有用な、ＨＩＶエンベロープタンパク質などの糖タンパク質を精製するためのプロセスが本明細書に記載される。

Description

世界中で数百万人もの人々がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に冒されており、有効なワクチンによるＨＩＶの予防は、抗レトロウイルス治療が広く行き渡った時代でさえも、非常に高い優先度であり続けている。ＨＩＶ－１の遺伝的変異性が高いことにより、ＨＩＶ－１ワクチンの開発は、前例のない難題となっている。潜在的なＴ細胞エピトープの適用範囲を改善し、細胞応答を改善するために、ＨＩＶグループ抗原（Ｇａｇ）、ポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、及びエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質由来の「モザイク」ＨＩＶ－１ Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＥｎｖ抗原が他の研究者らによって記載されており、これらは潜在的なＴ細胞エピトープの最大限の適用範囲を実現する目的で開発されていた（例えば、Ｂａｒｏｕｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０１０，１６：３１９－３２３）。モザイク抗原は、野生型の天然に存在するＨＩＶ－１抗原と長さ及びドメイン構造が類似している。

ＨＩＶに対する有効なワクチンは、高度にグリコシル化された、例えば、２０個以上のグリコシル化部位を有する１つ以上の免疫原性タンパク質を含み得る。また、（グリコシル化）タンパク質の一部は、生物学的製剤に使用される標準的なモノクローナル抗体よりも著しく大型である場合がある。ワクチン又は他の医薬組成物の活性成分として使用することができるタンパク質、特にグリコシル化された免疫原性タンパク質を生成及び精製するための改善されたプロセスが必要とされている。このプロセスは、収率が向上し、目的のタンパク質の立体構造の安定性が保たれ、タンパク質の許容できる全体的な回収率とタンパク質の高い純度を有しながら、大規模生成及び／又は精製用の既存の設備に容易に適用できるものであることが好ましい。

異なるタンパク質は挙動が異なり、且つ様々なタンパク質について記載されている多くの異なる実行可能な精製方法があるにもかかわらず、どのプロセスが所与のタンパク質に対して上記の条件を満たすのかは本質的に予測不可能である。

本発明は、タンパク質、好ましくはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原タンパク質などのグリコシル化タンパク質、より好ましくは、ＨＩＶ－１クレードＣエンベロープタンパク質などのＨＩＶエンベロープタンパク質、又はＨＩＶ ｇｐ１４０タンパク質などのモザイクエンベロープタンパク質、例えば三量体ＨＩＶクレードＣ ｇｐ１４０タンパク質又は三量体ＨＩＶモザイクｇｐ１４０タンパク質の精製のためのプロセスに関する。

一つの一般的な態様では、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープタンパク質などのタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．タンパク質を含む細胞上清などの細胞試料を得ることと、
ｂ．細胞試料のｐＨを約５．０に調整し、これにより細胞試料中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を沈殿させることと、
ｃ．細胞試料からデプス濾過によって沈殿したＨＣＰを除去し、タンパク質を含む濾液を得ることと、
ｄ．クロマトグラフィーによって濾液からタンパク質を精製することと
を含むプロセスに関する。

いくつかの実施形態では、ＨＩＶエンベロープタンパク質は、ＨＩＶ－１クレードＣ ｇｐ１４０、又はｇｐ１４０モザイクタンパク質である。

いくつかの実施形態では、細胞上清などの細胞試料は、真核生物宿主細胞、好ましくは哺乳動物宿主細胞などの、タンパク質を組み換え発現する宿主細胞由来のものである。特定の実施形態では、宿主細胞は、バイオリアクター内の流加培養プロセスでタンパク質を生成する。特定の実施形態では、バイオリアクターは、約１Ｌ～約２００００Ｌ、例えば、約１０Ｌ～約１６５００Ｌの容積を有する。

特定の実施形態では、宿主細胞は、細胞上清などの細胞試料のｐＨを調整する前に、例えば重力沈降によって、又は好ましくは遠心分離によって、より好ましくは連続遠心分離によって除去される。

特定の実施形態では、宿主細胞は、細胞試料のｐＨを低ｐＨ凝集によって調整した後に、例えば重力沈降によって、又は好ましくは遠心分離によって、より好ましくは連続遠心分離によって除去される。

特定の実施形態では、プロセスは、１回以上の限外濾過及びダイアフィルトレーション（ＵＦＤＦ）工程を更に含む。例えば、工程ｃ）のデプス濾過は、限外濾過及びダイアフィルトレーション（ＵＦＤＦ）工程の後に行ってもよい。

特定の実施形態では、タンパク質は、ＨＩＶエンベロープタンパク質、例えば、ＨＩＶ－１クレードＣ ｇｐ１４０又はＨＩＶ－１モザイクｇｐ１４０であり、クロマトグラフィーには、好ましくは疎水性相互作用特性及び陽イオン交換特性を含むマルチモーダル樹脂（混合モード樹脂とも呼ばれている）を使用した捕捉工程が含まれる。驚くべきことに、そのような樹脂によって良好な精製結果が得られることが見出された。特定の非限定的な例では、マルチモーダル樹脂は、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ又はＣａｐｔｏ ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓである（Ｃｙｔｉｖａから市販されている）。特定の実施形態では、ＨＩＶエンベロープタンパク質を、特定の塩濃度及びｐＨで負荷し、上昇させた塩濃度及び上昇させたｐＨで、負荷した状態と比較してより純度の高い形態で溶出する。

特定の実施形態では、捕捉工程でマルチモーダル樹脂から溶出された、部分的に精製されたＨＩＶエンベロープタンパク質を、第２のクロマトグラフィープロセス工程、例えば、直交クロマトグラフィー工程に供する。特定の好ましい実施形態では、第２のクロマトグラフィー工程は、弱陰イオン交換樹脂（例えば、Ｃａｐｔｏ ＤＥＡＥ）、又は好ましくは強陰イオン交換樹脂（例えば、ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱ）などの陰イオン交換樹脂を含む。好ましくは、ＨＩＶエンベロープタンパク質をこの樹脂と結合させ、続いて、例えば溶出のために上昇させた塩濃度を使用して、負荷した状態と比較してより純度の高い形態で溶出する。

特定の実施形態では、ＨＩＶエンベロープタンパク質含有画分を、リガンドの硫酸デキストラン、例えば、Ｃａｐｔｏ ＤｅＶｉｒＳ（異なる種類のウイルスに対して親和性に似た挙動をするものとして知られている陽イオン媒体）を含む樹脂を使用する、第３のクロマトグラフィー工程に供する。ＨＩＶエンベロープタンパク質をこの樹脂と結合させ、続いて、例えば上昇させた塩濃度を使用して、この樹脂を負荷した状態と比較して更に精製された形態で溶出することができる。この工程は、タンパク質がクレードＣ ｇｐ１４０タンパク質である場合、特に有用である。

特定の実施形態では、リガンドのデキストラン硫酸を含む樹脂が使用されていない場合は第２のクロマトグラフィー工程の後に、又はリガンドの硫酸デキストランを含む樹脂が使用されている場合は第３のクロマトグラフィー工程の後に、例えば、約ｐＨ３．５で約１時間保持し、続いて０．４５～０．２マイクロメートルのフィルターを通して濾過する、低ｐＨウイルス不活化工程を実行する。

特定の実施形態では、第４のクロマトグラフィー工程を実行し（上記で説明したようなリガンドの硫酸デキストランを含む樹脂が使用されていない場合、例えば、モザイクｇｐ１４０タンパク質の場合、第３のクロマトグラフィー工程となる）、前回のクロマトグラフィー工程（上記で説明したような第２又は第３のクロマトグラフィー工程のいずれか）のＨＩＶエンベロープ含有画分を、陰イオン交換機能及び疎水性機能を有する混合モード樹脂、例えば、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ樹脂に加える。本発明の特定の実施形態では、この工程における混合モード樹脂は、結合及び溶出モードで使用される。本発明の別の実施形態では、この樹脂は、フロースルーモードで使用される。当業者は、本開示の観点から、ＨＩＶエンベロープタンパク質を精製するためのポリッシング工程として、そのような樹脂が使用されるいずれかのモードに適切な状態を選択することができる。このクロマトグラフィー工程によって、好ましくは三量体ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０を含むＨＩＶエンベロープタンパク質から、六量体及び宿主細胞タンパク質の不純物を更に減少させることができる。

特定の実施形態では、最後の上記クロマトグラフィー工程から精製されたＨＩＶエンベロープタンパク質を、例えば、Ｖｉｒｏｓａｒｔ ＨＣ又はＰｌａｎｏｖａ ２０Ｎフィルターを使用するウイルス捕捉濾過工程に供する。

特定の実施形態では、精製されたＨＩＶエンベロープタンパク質を、最終的なＵＦＤＦ工程に供する。得られた物質は、例えば、ワクチンとして使用される最終製剤に製剤化することができる。

本発明の態様は、疎水性相互作用特性及び陽イオン交換特性を含むマルチモーダル樹脂上でタンパク質を捕捉し、精製画分を前記樹脂から溶出することを含む、ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を精製するためのプロセスであって、ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質の純度が、捕捉工程中に樹脂に負荷された混合物中のタンパク質と比較して実質的に（substantially）上昇しているプロセスを提供する。そのようなマルチモーダル樹脂は、ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質の精製に特に好適なものであると思われる。

本発明の別の態様では、ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を精製するためのプロセスが提供され、プロセスは、
ｉ）ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質、及び他の所望されないタンパク質、例えば、ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を発現した宿主細胞に由来する宿主細胞タンパク質を含む組成物を提供する工程と、
ｉｉ）疎水性相互作用特性及び陽イオン交換特性を含むマルチモーダル樹脂上でＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を捕捉し、前記樹脂からＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を含む精製画分を溶出する工程と、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の精製画分を陰イオン交換樹脂に加え、ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を結合させ、前記樹脂からＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を含む更に精製された画分を溶出する工程と、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の更に精製された画分を陰イオン交換機能及び疎水性機能を有する混合モード樹脂に供し、更に精製されたＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を溶出する工程とを含む。好ましい実施形態では、本プロセスのＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質は、モザイクｇｐ１４０タンパク質である。

本プロセスの特定の実施形態では、プロセスは、工程ｉｉｉ）のＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質の更に精製された画分をリガンドの硫酸デキストランを含む樹脂に加え、前記樹脂からＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を含む更に精製された画分を溶出した後、この画分を本プロセスの工程ｉｖ）に供する工程を更に含む。これらの実施形態は、ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質がクレードＣ ｇｐ１４０タンパク質である場合、特に有用である。

上述の概要及び下記の本発明の詳細な説明は、添付した図面と共に読むと、より明確に理解されるであろう。本発明は、図面に示す実施形態に厳密に限定されるものではないことを理解すべきである。

図１：図１Ａは、遠心分離後の低ｐＨ凝集及びデプス濾過、並びにカラムクロマトグラフィー（ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質の場合、ｃｈｒｏｍ ＃１は、例えば、疎水性相互作用特性及び陽イオン交換特性を含む混合モード樹脂を使用した捕捉工程であってよい）を含む、タンパク質を精製するためのプロセスを示す。図１Ｂは、酸沈殿中に上昇した生成物の濁度を示す。 （上記の通り。） 図２：図２は、図２Ａに図示されるプロセスを使用して、精製された生成物において所望の最小限の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）レベルを達成したことを示す（図２Ｂ）。ＨＩＶ－１クレードＣ ｇｐ１４０の場合、図示されるクロマトグラフィー工程中に使用されるカラムの例は、ｃｈｒｏｍ ＃１（疎水性相互作用特性及び陽イオン交換特性を含む混合モード樹脂を使用する捕捉工程）、ｃｈｒｏｍ ＃２（陰イオン交換樹脂）、ｃｈｒｏｍ ＃３（リガンドの硫酸デキストランを含む樹脂）、ｃｈｒｏｍ ＃４（陰イオン交換機能及び疎水性機能を有する混合モード樹脂）である。 （上記の通り。） ＨＩＶ－１クレードＣのｇｐ１４０を精製するためのプロセスのフローチャートを図示する。 ｇｐ１４０モザイクタンパク質を精製するためのプロセスのフローチャートを図示する。

背景技術及び本明細書全体を通して、様々な刊行物、論文及び特許が引用又は記載されているが、これらの参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文献、行為、材料、デバイス、物品などの説明は、本発明に関する状況を提供することを目的とするものである。そのような説明は、これらの内容のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されたあらゆる発明に関する先行技術の一部を形成することを認めるものではない。

別途定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関係する分野の当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用する特定の用語は、本明細書で規定されている意味を有する。本明細書に引用されている全ての特許、公開済みの特許出願及び刊行物は、参照により完全に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書で使用する場合、及び添付した特許請求の範囲において、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上別途明白に指示される場合を除き、複数の言及を含むことに留意しなければならない。

本明細書及びそれに続く特許請求の範囲の全体を通して、文脈上別段の解釈を要する場合を除き、「含む」という語句、並びに「含む」及び「含んでいる」などの変形形態は、規定の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を包含するが、任意の他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を除外するものではないことを意味することが理解されよう。本明細書で使用する場合、「含んでいる」という用語は、「含有している」若しくは「包含している」という用語と、又は場合によっては本明細書で使用する場合の「有する」という用語と置き換えることができる。

本明細書で使用する場合、「からなる」は、特許請求の範囲の要素において規定されていない任意の要素、工程又は成分を除外する。本明細書で使用する場合、「本質的に～からなる」は、特許請求の範囲の基本的及び新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程を除外するものではない。上記の「含んでいる」、「含有している」、「包含している」、「有する」という用語のいずれもが、本発明の態様又は実施形態の文脈において本明細書で使用する場合はいつでも、「～からなる」又は「本質的に～からなる」という用語に置き換えて、本開示の範囲を変更することができる。

本明細書で使用する場合、「約」という用語は、数字と共に使用するときに、言及された数字の±１０％、例えば、±５％又は±１％以内の任意の数を指す。例えば、約５．０のｐＨは、４．５～５．５（４．５及び５．５を含む）の任意のｐＨを意味する。

本明細書で使用する場合、多数の列挙された要素の間を接続する「及び／又は」という用語は、個々の選択肢及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものと理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続されている場合、第１選択肢は、第２要素を含まない第１要素を適用することを指す。第２選択肢は、第１要素を含まない第２要素を適用することを指す。第３選択肢は、第１要素及び第２要素を共に適用することを指す。これらの選択肢のいずれか１つは、本明細書で使用する場合、「及び／又は」という用語の意味の範囲内に含まれ、従って「及び／又は」という用語の要件を満たすものと理解される。２つ以上の選択肢を同時に適用することも「及び／又は」という用語の意味の範囲内に含まれ、従って「及び／又は」という用語の要件を満たすものと理解される。

本明細書で使用する場合、「対象」は、本発明の実施形態によるタンパク質又はワクチンが投与されることになるか、又は投与されたあらゆる動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。本明細書で使用する場合、「哺乳動物」という用語は、あらゆる哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなどが挙げられ、より好ましくはヒトが挙げられるがこれらに限定されない。

本発明は一般に、タンパク質、好ましくはグリコシル化タンパク質、より好ましくはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープタンパク質、例えばＨＩＶ－１クレードＣのエンベロープタンパク質又はＨＩＶモザイクエンベロープタンパク質を精製するプロセスに関し、プロセスは、
ａ．タンパク質を含む細胞上清などの細胞試料を得ることと、
ｂ．細胞試料のｐＨを約５．０に調整し、これにより細胞試料の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を沈殿させることと、
ｃ．細胞試料からデプス濾過によって沈殿したＨＣＰを除去し、タンパク質を含む濾液を得ることと、
ｄ．クロマトグラフィーによって濾液中のタンパク質を精製することとを含む。

好ましくは、細胞試料は細胞によって分泌されるタンパク質を含む細胞上清である。細胞試料はまた、細胞によって産生されたタンパク質を含む細胞可溶化物又は処理された細胞可溶化物であってよい。そのような可溶化物は、例えば、細胞膜を分解することによって調製することができる。本出願のプロセスに有用な細胞試料は、本開示の観点から当該技術分野において公知の方法を使用して得ることができる。例えば、細胞上清は、細胞培養物を遠心分離にかけ、細胞を除去することによって得ることができる。細胞可溶化物は、細胞を破壊又は溶解し、細胞片を遠心分離で除去することによって得ることができる。細胞上清又は細胞可溶化物は、本出願のプロセスに直接使用することができるか、又はこれを更に処理した後に使用することができる。好ましくは、本出願のプロセスに有用な細胞試料を得るために、連続遠心分離を使用して、バイオリアクターから生成された細胞を除去する。

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、バイオリアクター内の流加培養プロセスでタンパク質を生成する。

特定の実施形態では、バイオリアクターは、約１Ｌ～約２００００Ｌ、例えば、約１０Ｌ～約１６５００Ｌ、例えば、約１００Ｌ～約１５０００Ｌの容積を有する。

細胞上清などの細胞試料のｐＨは、例えば、細胞試料の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を沈殿させるための好適な量の酸（例えば、１Ｍの酢酸）を細胞試料に添加することによって調整することができる。このプロセスは、場合により「低ｐＨ凝集」とも称される。細胞試料のｐＨを、細胞試料の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を沈殿させるために、約５、例えば、約４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、又はその間の任意の値で調整するが、一方で細胞試料内の十分な量の目的のタンパク質（例えば、ＨＩＶ ｇｐ１４０）が沈殿しないことが好ましい。また、細胞用の培地中のタンパク質などの細胞試料内の他のタンパク質は、約５のｐＨで沈殿させることができる。

いくつかの実施形態では、低ｐＨ凝集のプロセスの間、ＨＣＰを沈殿させるために、細胞試料を、約ｐＨ５で約１５分～約１５時間、例えば、約０．５～１２時間、例えば、約１～３時間、例えば、約３時間、好ましくは約１時間インキュベートする。

いくつかの実施形態では、低ｐＨ凝集は、遠心分離の後に実行することができる。好ましい実施形態では、低ｐＨ凝集は、遠心分離の前に実行される。

タンパク質を含む濾液を得るために、細胞試料から沈殿したＨＣＰをデプス濾過によって除去することができる。本明細書の本開示の観点から、本出願のプロセスでは、様々な種類の媒体（セルロース、ポリアクリル系繊維、ケイ藻土、シリカ、活性炭などの単一層又は多層）及び様々なグレードのデプスフィルターをデプス濾過に使用することができる。本発明に有用なデプスフィルターの例としては、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ社製のＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ファミリー、及びＣｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）デプスフィルターなどの商業的供給源から入手可能なデプスフィルターが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、デプス濾過は、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｃ０ＨＣ、Ｃ０ＳＰ、ＣＥ３５、ＣＥ５０、Ｄ０ＨＣ、Ｄ０ＳＰ、ＤＥ、Ａ１ＨＣ、Ｂ１ＨＣ、Ｆ０ＨＣ、Ｘ０ＨＣ、Ｘ０ＳＰなどのデプスフィルターを使用する。使用前に好適な緩衝液を使用してデプスフィルターを平衡化し、酸によって沈殿した産物（例えば、沈殿したＨＣＰ及び他のタンパク質）をデプスフィルターに通して濾過した後にフィルターを追跡することができる。好ましくは、緩衝液は、約５．０のｐＨを有する。好ましくは、あらゆる汚染微生物を除去するために、例えば、フィルター孔径が０．４５μｍ以下、好ましくは０．２２μｍのデプス濾過によって滅菌濾過する。

特定の実施形態では、クロマトグラフィー工程の前又はその間に、限外濾過及びダイアフィルトレーション（ＵＦＤＦ）工程を使用してＨＣＰを除去し、目的のタンパク質（例えば、ｇｐ１４０）を濃縮する。限外濾過（ＵＦ）は、希釈された生成物流を濃縮するためのプロセスに一般に使用される。これによって、膜の孔径又は分画分子量に基づいて溶液中の分子が分離される。ダイアフィルトレーション（ＤＦ）は、多くの場合、生成物を所望の緩衝液（例えば、溶出緩衝液から最終的な製剤緩衝液）に交換するのに使用される。ＵＦ及びＤＦは、フィードが表面に直角に流れるのではなく、膜表面と平行に流れるタンジェンシャルフロー濾過を典型的に用いる。例えば、酢酸セルロース、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、及びポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）の膜を含む、様々なＵＦ／ＤＦ膜を使用することができる。必要に応じて、ＵＦ／ＤＦに使用される膜は、分画分子量（ＭＷＣＯ）が異なっていてもよい。例えば、ＵＦ／ＤＦのＭＷＣＯは、例えば、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０ｋＤａであってよい。いくつかの実施形態では、ＵＦ／ＤＦは、共に積み重ねられた１つ以上の平板膜によって構成される。ＵＦ／ＤＦプロセスとしては、例えば、衛生化及び使用前試験、平衡化、濃縮、ダイアフィルトレーション、生成物の回収、洗浄及び使用後試験、並びに保存が挙げられる。ＵＦ／ＤＦシステムの完全性は、拡散試験によって確認することができる。本開示の観点から、好適なＵＦ及び／又はＤＦ緩衝液をＵＦ／ＤＦプロセスに使用することができる。例えば、緩衝液は、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、又は８．５のｐＨを有し得る。本開示の観点から、必要に応じて様々なクロスフロー流量及び膜負荷率を使用することができる。

いくつかの実施形態では、本出願のプロセスは、３つ以上のクロマトグラフィーカラム工程を用いる。本開示の観点から、好適なカラムを本発明に使用することができる。このようなカラムの例としては、実施形態に記載され、例えば図３及び図４に図示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。

一実施形態では、本出願のプロセスは、マルチモーダル樹脂（混合モード樹脂とも呼ばれている）を使用する捕捉クロマトグラフィー工程を含む。マルチモーダル又は混合モードクロマトグラフィー樹脂は、本質的にいくつかの異なるタイプの相互作用：例えば、イオン交換、アフィニティー、サイズ排除、及び疎水性の２つ以上の組み合わせを可能にするリガンドによって官能化されている媒体に基づくものである。タンパク質を分離するこれらのモードを統合して利用するこの機能によって、精製プロセスの全体的な選択性を高めることができる。この高められた選択性を使用して、単一のカラム工程で工程不純物を除去することができるが、そうでない場合は複数の除去プロセス工程が必要となる。好ましくは、マルチモーダル樹脂は、疎水性相互作用特性及び陽イオン交換特性を有し、これによって、より耐塩性で、最小限の希釈により又は全く希釈することなくタンパク質を樹脂に結合させることが可能となる。

本発明に有用な樹脂は、異なる構成、例えば、ビーズ、フィルター（膜）、カートリッジなどの、本発明により「樹脂」と見なされる全ての樹脂であってよく、特定の実施形態では、樹脂はカラムに使用可能なビーズの形態であり、本発明により使用可能な樹脂は、例えば、Ｃｙｔｉｖａ（旧ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び／又はその他のベンダーから市販品として入手することができる。いくつかの実施形態では、マルチモーダル樹脂は、主剤に対して異なる選択性を有する２つ以上の種類の官能基を、直接的又は間接的に固定化することによって調製される樹脂であり得る。例えば、マルチモーダル樹脂は、高流動性アガロースのマトリックスを有するマルチモーダル強陰イオン交換クロマトグラフィー材料、及びリガンドとしてのマルチモーダル強陰イオン交換体、又は高流動性アガロースのマトリックス、及びリガンドとしてのマルチモーダル弱陽イオン交換体を含み得る。マルチモーダル樹脂の具体例としては、これらに限定されるものではないが、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ又はＣａｐｔｏ ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓ（Ｃｙｔｉｖａ社製、Ｃａｐｔｏは登録商標）、ＨＥＡ ＨｙｐｅｒＣｅｌ、ＰＰＡ ＨｙｐｅｒＣｅｌ、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ社製、ＨｙｐｅｒＣｅｌは商標）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＭＸ－Ｔｒｐ－６５０Ｍ（東ソー株式会社製）などを挙げることができるが、これらに限定されない。

特定の実施形態では、マルチモーダル捕捉クロマトグラフィーをフロースルーモードで実行する。

好ましい実施形態では、マルチモーダル捕捉クロマトグラフィーを結合及び溶出モードで実行する。

好ましくは、宿主細胞タンパク質及びＤＮＡを除去するために、マルチモーダル捕捉クロマトグラフィーを結合及び溶出モードで実行する。目的のタンパク質を特定の塩濃度及びｐＨでマルチモーダル捕捉樹脂、例えばカラムに負荷してカラムに結合させ、次いで後に溶出溶液により溶出して、プールされた溶出液を得る。目的のタンパク質を、任意の好適な緩衝液（酢酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、又はＴｒｉｓ緩衝液など）及び／又は塩溶液（塩化ナトリウム溶液など）、例えば、任意の好適なｐＨ、例えば、約ｐＨ４～６（例えば、ｐＨ４又は５）で約１５～１００ｍＭ（例えば、２５ｍＭ）の酢酸ナトリウムと、約１０～５０ｍＭ（例えば、２５ｍＭ）の塩化ナトリウムとを含み、任意の好適な導電率、例えば、約１～５０ｍＳ／ｃｍ、例えば、約３～５０ｍＳ／ｃｍ、例えば、約５～５０ｍ／ｃｍ、例えば、約３～４０ｍＳ／ｃｍ、例えば、約６～４０ｍＳ／ｃｍ、好ましくは約３～２０ｍＳ／ｃｍ、例えば、約１０～２０ｍＳ／ｃｍ（例えば、約５ｍＳ／ｃｍ、又は約１５ｍＳ／ｃｍ）の導電率を有する溶液中でカラムに負荷することができる。溶出溶液は、任意の好適な緩衝液（２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液など）及び／又は塩溶液（塩化ナトリウム溶液など）、例えば、約２０～８０ｍＭ（例えば、５０ｍＭ）のＨＥＰＥＳと、約５０～６００ｍＭ、例えば、約１００～６００ｍＭ（例えば、４００ｍＭ）の塩化ナトリウムとを含み、約ｐＨ４～８、例えば、約４．５～７．５（例えば、ｐＨ７）などの任意の好適なｐＨで、任意の好適な導電率、例えば、約１０～６０ｍＳ／ｃｍ（例えば、４０ｍＳ／ｃｍ）の導電率を有する溶液を含み得る。目的のタンパク質を、勾配溶出によってマルチモーダル捕捉カラムから溶出することもできる。

別の実施形態では、本出願のプロセスは、陰イオン交換樹脂から構成される第２のクロマトグラフィーを含む。本工程で使用される陰イオン交換体は、強陰イオン交換体であってもよく、又は弱陰イオン交換体であってもよい。好ましくは、陰イオン交換体は、四級アンモニウム、四級アミノエチル、ジエチルアミノエチル、トリエチルアミノエチル、又はジメチルアミノエチルなどの陰イオン交換リガンドを含む。より好ましくは、陰イオン交換体は、弱陰イオン交換樹脂（例えば、Ｃａｐｔｏ ＤＥＡＥ）、又は強陰イオン交換樹脂（例えば、ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱ）から選択される。陰イオン交換体の他の例としては、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＨＰ及びＦＦ）、ＡＥＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（低置換度及び高置換度）、Ｃａｐｔｏ Ｑ、Ｑ ＸＰ、Ｓｏｕｒｃｅ ３０ Ｑ及び１５ Ｑ、最も好ましくはＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＤＥＡＥ及びＭＰＨＱが挙げられるが、これらに限定されない。

特定の実施形態では、第２のクロマトグラフィーをフロースルーモードで実行する。

好ましい実施形態では、第２のクロマトグラフィーを結合及び溶出モードで実行する。

好ましくは、宿主細胞タンパク質及びＤＮＡを更に除去するために、第２のクロマトグラフィーを結合及び溶出モードで実行する。目的のタンパク質を特定の塩濃度及びｐＨで陰イオン交換樹脂、例えばカラムに負荷してカラムに結合させ、次いで後に溶出溶液により溶出して、プールされた溶出液を得る。目的のタンパク質を、任意の好適な緩衝液（Ｔｒｉｓ緩衝液又はＨＥＰＥＳ緩衝液など）及び／又は塩溶液（塩化ナトリウム溶液など）、例えば、約１５～７５ｍＭ（例えば、２５ｍＭ）のＴｒｉｓと、約０～７５ｍＭ、例えば、約２５～７５ｍＭ（例えば、５０ｍＭ、又は例えば、５ｍＭ）の塩化ナトリウムとを含み、約ｐＨ６～８（例えば、ｐＨ７．５又は８）などの任意の好適なｐＨで、任意の好適な導電率、例えば、約２～８ｍＳ／ｃｍ（例えば、５．５ｍＳ／ｃｍ）の導電率を有する溶液中でカラムに負荷することができる。溶出溶液は、任意の好適な緩衝液（Ｔｒｉｓ緩衝液など）及び／又は塩溶液（塩化ナトリウム溶液など）、例えば、約１５～７５ｍＭ（例えば、２５ｍＭ、又は例えば、５０ｍＭ）のＴｒｉｓと、約５０～５００ｍＭ、例えば、約１００～３００ｍＭ（例えば、１８５ｍＭ、又は例えば、２００ｍＭ）の塩化ナトリウムとを含み、約ｐＨ６～９、（例えば、ｐＨ７．５）などの任意の好適なｐＨで、任意の好適な導電率、例えば、約５～５０ｍＳ／ｃｍ、例えば、約５～４０ｍＳ／ｃｍ（例えば、２０ｍＳ／ｃｍ）の導電率を有する溶液を含み得る。目的のタンパク質を、勾配溶出によって第２のカラムから溶出することもできる。

別の実施形態では、本出願のプロセスは、グリカンに結合するアフィニティー媒体を使用する第３のクロマトグラフィーを含む。アフィニティー媒体樹脂は、リガンドの硫酸塩又は硫酸デキストランを含み得る。アフィニティー媒体の例としては、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ ｍ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ ｃ、Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ ｍ、Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ ｃ、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ ｍ又はＣｅｌｌｕｆｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ ｃ（ＪＮＣ株式会社製）、Ｃｙｔｉｖａ ＣＡＰＴＯ（商標）Ｃｏｒｅ ７００又はＣａｐｔｏ ＤｅＶｉｒＳ（Ｃｙｔｉｖａ社製）などの硫酸セルロース媒体又は硫酸アガロース媒体が挙げられるが、これらに限定されない。

特定の実施形態では、第３のクロマトグラフィーをフロースルーモードで実行する。

好ましい実施形態では、第３のクロマトグラフィーを結合及び溶出モードで実行する。

好ましくは、宿主細胞タンパク質及びＤＮＡを更に除去するために、第３のクロマトグラフィーを結合及び溶出モードで実行する。目的のタンパク質を特定の塩濃度及びｐＨでアフィニティー媒体樹脂、例えばカラムに負荷してカラムに結合させ、次いで後に溶出溶液により溶出して、プールされた溶出液を得る。目的のタンパク質を、任意の好適な緩衝液（Ｔｒｉｓ緩衝液又はＨＥＰＥＳ緩衝液など）及び／又は塩溶液（塩化ナトリウム溶液など）、例えば、約５～２５ｍＭ（例えば、６ｍＭ）のＴｒｉｓ又は約５～５０ｍＭ（例えば、２０ｍＭ）のＨＥＰＥＳ、及び約０～１００ｍＭ、例えば、約２５～７５ｍＭ（例えば、４５ｍＭ、又は５０ｍＭ）の塩化ナトリウムを含み、約ｐＨ４～８、例えば、約５～８（例えば、ｐＨ６．５）などの任意の好適なｐＨで、任意の好適な導電率、例えば、約１～１５ｍＳ／ｃｍ、例えば、約１～１０ｍＳ／ｃｍ（例えば、５ｍＳ／ｃｍ）の導電率を有する溶液中でカラムに負荷することができる。溶出溶液は、任意の好適な緩衝液（Ｔｒｉｓ緩衝液など）及び／又は塩溶液（塩化ナトリウム溶液など）、例えば、約１０～１００ｍＭ、例えば、約１５～７５ｍＭ（例えば、２５ｍＭ）のＴｒｉｓと、約１００～３００ｍＭ（例えば、１８５ｍＭ）の塩化ナトリウムとを含み、約ｐＨ６～９（例えば、ｐＨ７．５）などの任意の好適なｐＨで、任意の好適な導電率、例えば、約１０～３０ｍＳ／ｃｍ、例えば、約１５～２５ｍＳ／ｃｍ（例えば、１９ｍＳ／ｃｍ）の導電率を有する溶液を含み得る。目的のタンパク質を、勾配溶出によって第３のカラムから溶出することもできる。

特定の実施形態では、本出願のプロセスは、約ｐＨ３～４、例えば、ｐＨ約３．５で約１５分～約４時間、例えば、約１時間保持し、続いて０．４５～０．２マイクロメートルのフィルターを通して濾過する、低ｐＨウイルス不活化工程を含む。本工程は、アフィニティー媒体を用いる第３のクロマトグラフィーを使用しない場合は第２のクロマトグラフィー工程の後に、又は第３のクロマトグラフィー工程を実行する場合は第３のクロマトグラフィー工程の後に実行する。次いで、次のプロセス工程の前に、濾液を目標のｐＨ、例えば５～７のｐＨに中和する。低ｐＨウイルス不活化工程によって、ウイルス汚染物質のタンパク質を変性させることができ、次いでこれをその後のカラムクロマトグラフィーで除去することができる。

別の実施形態では、本出願のプロセスは、マルチモーダル樹脂、好ましくは陰イオン交換及び疎水性相互作用クロマトグラフィー機能を含むマルチモーダル樹脂を使用する第４のクロマトグラフィーを含む。マルチモーダル樹脂の具体例としては、これらに限定されるものではないが、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ又はＣａｐｔｏ ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓ（Ｃｙｔｉｖａ社製、Ｃａｐｔｏは登録商標）、ＨＥＡ ＨｙｐｅｒＣｅｌ、ＰＰＡ ＨｙｐｅｒＣｅｌ、ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ社製、ＨｙｐｅｒＣｅｌは商標）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＭＸ－Ｔｒｐ－６５０Ｍ（東ソー株式会社製）などを挙げることができるが、これらに限定されない。本開示の観点から、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅなどの好適なマルチモーダル樹脂を本工程で使用することができる。マルチモーダルクロマトグラフィーを結合及び溶出モードで、又は好ましくはフロースルーモードで実行する。第４のクロマトグラフィーによって、生成物のプール中の六量体及び宿主細胞タンパク質の不純物を更に減少させることができる。

好ましくは、宿主細胞タンパク質及び核酸を除去するために、第４のクロマトグラフィーをフロースルーモードで実行する。目的のタンパク質を、任意の好適な緩衝液（酢酸ナトリウム緩衝液など）及び／又は塩溶液（塩化ナトリウム溶液など）、例えば、約２５～７５ｍＭ（例えば、５０ｍＭ）の酢酸ナトリウムと、約５０～８００ｍＭ、例えば、約２００～８００ｍＭ（例えば、３１７ｍＭ又は６５０ｍＭ）の塩化ナトリウムとを含み、約ｐＨ３～８、例えば、ｐＨ３～５（例えば、ｐＨ３．５又は４．５）などの任意の好適なｐＨで、任意の好適な導電率、例えば、約５～７０ｍＳ／ｃｍの導電率を有する溶液中で樹脂、例えばカラムに負荷することができる。好ましくは、フロースルー溶液は、ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質、例えばｇｐ１４０タンパク質を含む一方で、カラムには一定の不純物が結合したままである。

なお別の実施形態では、本出願のプロセスは、１回以上のナノ濾過（ウイルス捕捉濾過）工程及び最終的なＵＦＤＦ工程を含む。ウイルス捕捉濾過は、サイズ排除原理に基づいて機能する。例えば、ウイルス捕捉濾過のために、最大７５ｎｍの有効な孔径を有するウイルスフィルターを使用することができる。ウイルス捕捉濾過用のフィルターの例としては、Ｖｉｒｏｓａｒｔ ＨＣ、Ｖｉｒｏｓａｒｔ（登録商標）ＨＦ、Ｐｌａｎｏｖａ ２０Ｎフィルターなどが挙げられるが、これらに限定されない。

なお別の実施形態では、本出願のプロセスは、最終的な製剤工程を含み、精製されたタンパク質をワクチン又は免疫原性組成物などの最終生成物に製剤化することができる。本発明の最終生成物は、投与を容易にし、且つ効能を向上させるために、経口（経腸）投与及び非経口注射を含むがこれらに限定されない、対象に投与するのに好適な任意の成分で製剤化することができる。

クロマトグラフィー工程の各々は、本明細書における本開示の観点から好適な条件下で実行することができる。特定の実施形態では、ＨＩＶエンベロープタンパク質などの目的のタンパク質は、特定の塩濃度及びｐＨで負荷され、上昇させた塩濃度及び上昇させたｐＨで、負荷した状態と比較してより純度の高い形態で溶出される。

本発明の態様は、疎水性相互作用特性及び陽イオン交換特性を含むマルチモーダル樹脂上でタンパク質を捕捉し、精製画分を前記樹脂から溶出することを含む、ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を精製するためのプロセスであって、ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質の純度が捕捉工程中に樹脂に負荷された混合物中のタンパク質と比較して実質的に上昇しているプロセスを提供する。そのようなマルチモーダル樹脂は、ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質の精製に特に好適なものであると思われる。

本発明の別の態様では、ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を精製するためのプロセスが提供され、プロセスは、
ｉ）ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質、及び他の所望されないタンパク質、例えば、ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を発現した宿主細胞に由来する宿主細胞タンパク質を含む組成物を提供する工程と、
ｉｉ）疎水性相互作用特性及び陽イオン交換特性を含むマルチモーダル樹脂上でＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を捕捉し、前記樹脂からＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を含む精製画分を溶出する工程と、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の精製画分を陰イオン交換樹脂に加え、ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を結合させ、前記樹脂からＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を含む更に精製された画分を溶出する工程と、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の更に精製された画分を陰イオン交換機能及び疎水性機能を有する混合モード樹脂に供し、更に精製されたＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を溶出する工程とを含む。

特定の実施形態では、ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質は、クレードＣ ｇｐ１４０タンパク質又はモザイクｇｐ１４０タンパク質、好ましくはモザイクｇｐ１４０タンパク質である。

特定の実施形態では、プロセスは、工程ｉｉｉ）のＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質の更に精製された画分を、硫酸デキストランを含む樹脂に加え、前記樹脂からＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を含む更に精製された画分を溶出した後、この画分を本プロセスの工程ｉｖ）に供する工程を更に含む。好ましくは、これらの実施形態におけるＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質は、クレードＣ ｇｐ１４０タンパク質である。

本出願の実施形態によれば、本発明のプロセスは、実験室規模及び商業規模の両方で使用することができる。例えば、このタンパク質精製のプロセスを使用して、調査研究の目的のために、精製したＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を提供することができる。本出願のプロセスを商業規模及び大規模に使用して、大量の精製されたＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を、好ましくは三量体の状態で提供することも可能となる。特に、クレードＣ ｇｐ１４０タンパク質の大規模な精製は、図３に記載されているプロセスを使用して達成することができ、モザイクｇｐ１４０タンパク質の大規模な精製は、図４に記載されているプロセスを使用して達成することができる。

ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）のファミリーの一部であるレンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｉｎａｅ）属のメンバーである。２種のＨＩＶ：ＨＩＶ－１及びＨＩＶ－２がヒトに感染する。ＨＩＶ－１は、ＨＩＶウイルスの最も一般的な株であり、ＨＩＶ－２と比べて病原性が高いことが知られている。本明細書で使用する場合、「ヒト免疫不全ウイルス」及び「ＨＩＶ」という用語は、ＨＩＶ－１及びＨＩＶ－２を指すが、これらに限定されない。

ＨＩＶは、高度な遺伝的分岐を有する複数のクレードに分類される。本明細書で使用する場合、「ＨＩＶクレード」又は「ＨＩＶサブタイプ」という用語は、遺伝的類似性の度合に従って分類された関連するヒト免疫不全ウイルスを指す。現在、３つのグループのＨＩＶ－１分離株：Ｍ、Ｎ、及びＯが存在している。グループＭ（主系統）は、少なくとも１０種のクレードＡ～Ｊからなる。グループＯ（分類外系統）は、同様の数のクレードからなり得る。グループＮは、グループＭ又はＯのいずれにも分類されていない新型のＨＩＶ－１分離株である。

本明細書で使用する場合、「ＨＩＶ抗原ポリペプチド」、「ＨＩＶ抗原タンパク質」、「ＨＩＶ抗原」、及び「ＨＩＶ免疫原」という用語は、免疫応答、例えば、対象におけるＨＩＶに対する体液及び／又は細胞媒介性の応答を誘導することが可能なポリペプチドを指す。抗原ポリペプチド又は抗原は、対象におけるＨＩＶに対して、免疫応答を誘導できるか、又は免疫、例えば防御免疫を生じさせることができるＨＩＶのタンパク質、その断片若しくはエピトープ、又は複数種のＨＩＶタンパク質若しくはその一部分の組み合わせであり得る。

好ましくは、抗原ポリペプチド又は抗原は、宿主中で防御免疫応答を上昇させることが可能であり、例えば、ウイルス性の疾患若しくは感染に対する免疫応答を誘導することが可能であり、且つ／又はウイルス性の疾患若しくは感染から対象を保護する、ウイルス性の疾患若しくは感染に対する免疫を対象に生じさせること（即ち、ワクチン接種）が可能である。例えば、抗原ポリペプチド又は抗原は、ＨＩＶ又はサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）エンベロープであるｇｐ１６０タンパク質、ＨＩＶ又はＳＩＶのマトリックス／カプシドタンパク質、並びにＨＩＶ又はＳＩＶのｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子産物などの、ＳＩＶ又はＨＩＶ由来のタンパク質又はその断片を含み得る。

ＨＩＶ抗原ポリペプチド又はＨＩＶ抗原は、あらゆるＨＩＶ－１若しくはＨＩＶ－２抗原、又はその断片であり得る。ＨＩＶ抗原の例としては、構造タンパク質及び必須酵素をコードするｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子産物が挙げられるが、これらに限定されない。ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子産物はポリタンパク質として合成され、更に多様な他のタンパク質産物にプロセシングされる。ｇａｇ遺伝子の一次タンパク質産物は、ウイルス構造タンパク質であるｇａｇポリタンパク質であり、更にＭＡ、ＣＡ、ＳＰ１、ＮＣ、ＳＰ２、及びＰ６タンパク質産物にプロセシングされる。ｐｏｌ遺伝子は、ウイルス酵素（Ｐｏｌ、ポリメラーゼ）をコードし、その一次タンパク質産物は、更にＲＴ、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＩＮ、及びＰＲタンパク質産物にプロセシングされる。ｅｎｖ遺伝子は、構造タンパク質、特にビリオンエンベロープの糖タンパク質をコードする。ｅｎｖ遺伝子の一次タンパク質産物はｇｐ１６０であり、更にｇｐ１２０及びｇｐ４１にプロセシングされる。ＨＩＶ抗原のその他の例としては、遺伝子調節タンパク質であるＴａｔ及びＲｅｖ；アクセサリータンパク質であるＮｅｆ、Ｖｐｒ、Ｖｉｆ及びＶｐｕ；カプシドタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、並びにｐ２４ウイルスタンパク質が挙げられる。

特定の実施形態では、ＨＩＶ抗原ポリペプチド又はＨＩＶ抗原は、ＨＩＶ Ｇａｇ、Ｅｎｖ、若しくはＰｏｌ抗原、若しくはそのいずれかの抗原部分若しくはエピトープ、又はその組み合わせ、好ましくは、ＨＩＶ－１ Ｇａｇ、Ｅｎｖ、若しくはＰｏｌ抗原、若しくはそのいずれかの抗原部分若しくはエピトープ、又はその組み合わせを含む。

ＨＩＶ抗原ポリペプチドはまた、モザイクＨＩＶ抗原であってもよい。本明細書で使用する場合、「モザイク抗原」は、天然配列の断片から構築された組み換えタンパク質を指す。モザイク抗原は、天然抗原に似ているが、天然配列に見られる潜在的なＴ細胞エピトープの適用範囲を最大化するように最適化されており、それによって免疫応答の広さ及び適用範囲が向上する。モザイクＨＩＶ抗原は、例えば、モザイクＧａｇ、Ｐｏｌ、及び／又はＥｎｖ抗原、並びにより好ましくはモザイクＨＩＶ－１ Ｅｎｖ抗原であってよい。本明細書で使用する場合、「モザイクＨＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及び／又はＥｎｖ抗原」は、特に、ＨＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及び／又はＥｎｖポリタンパク質の配列の１つ以上に由来する複数のエピトープを含むモザイク抗原を指す。

本明細書で使用する場合、「ＨＩＶエンベロープタンパク質」、「ｅｎｖタンパク質」、及び「Ｅｎｖ」という用語の各々は、ＨＩＶビリオンのエンベロープ上に発現し、且つＨＩＶがＨＩＶ感染細胞の原形質膜を標的化して攻撃することを可能にするタンパク質、又はそれらの断片若しくは派生体を指し、それによって免疫応答を誘導し、それを必要とする対象にＨＩＶに対する免疫を生じさせることができる。ＨＩＶ ｅｎｖ遺伝子は前駆体タンパク質ｇｐ１６０をコードしており、このｇｐ１６０がタンパク質分解的に切断されて、２つの成熟エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０及びｇｐ４１となる。切断反応は、レトロウイルスエンベロープ糖タンパク質前駆体内の高度に保存された配列において、宿主細胞のプロテアーゼであるフューリンによって媒介される。より具体的には、ｇｐ１６０が（ｇｐ１６０）_３に三量体化し、次いで切断を受けて、２つの非共有結合したｇｐ１２０及びｇｐ４１となる。続いて、ｇｐ１２０／ｇｐ４１ヘテロ二量体の三量体によってウイルス侵入が媒介される。ｇｐ１２０は受容体結合断片であり、このような受容体を有する標的細胞（例えばヘルパーＴ細胞など）上のＣＤ４受容体に結合する。ｇｐ１２０に非共有結合しているｇｐ４１は融合断片であり、ＨＩＶが細胞に侵入することによって２つの段階をもたらす。Ｇｐ４１は、最初はウイルスエンベロープ内に埋め込まれているが、ｇｐ１２０がＣＤ４受容体に結合すると、ｇｐ１２０はその立体構造を変化させてｇｐ４１を露出させ、これによって宿主細胞との融合を促進することができる。Ｇｐ１４０は、三量体ｇｐ１６０、即ち（ｇｐ１６０）_３の非切断型の外部ドメインであり、天然状態の切断型ウイルススパイクの代用物として使用されている。

本発明の実施形態によれば、「ＨＩＶエンベロープタンパク質」は、ｇｐ１６０、ｇｐ１４０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１タンパク質、その組み合わせ、融合体、トランケーション又は派生体であり得る。例えば、「ＨＩＶエンベロープタンパク質」は、ｇｐ４１タンパク質と非共有結合したｇｐ１２０タンパク質を含み得る。ｇｐ１４０の三量体を安定化する三量体化ドメインを有し得るか又はそれを含むように改変され得る、安定化三量体ｇｐ１４０タンパク質も含み得る。三量体化ドメインの例としては、Ｔ４－フィブリチンの「フォルドン」三量体化ドメイン；ＧＣＮ４に由来するコイルドコイル三量体化ドメイン；及び三量体タグとしての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼの触媒サブユニットが挙げられるが、これらに限定されない。「ＨＩＶエンベロープタンパク質」はまた、外部ドメイン（即ち、細胞外空間に延びるドメイン）のＣ末端トランケーション、ｇｐ４１の膜貫通ドメインのトランケーション、又はｇｐ４１の細胞質ドメインのトランケーションなどの、ｇｐ４１にトランケーションを含むエンベロープタンパク質を含むが、これらに限定されないトランケートされたＨＩＶエンベロープタンパク質であり得る。「ＨＩＶエンベロープタンパク質」は更に、例えば、フューリン切断部位における配列変異、及び／又はいわゆるＳＯＳＩＰ変異を有する天然に存在するＨＩＶエンベロープタンパク質の派生体であり得る。本発明の好ましい実施形態では、ＨＩＶエンベロープタンパク質は、ｇｐ１４０タンパク質、より好ましくはＨＩＶ－１ クレードＣ ｇｐ１４０タンパク質又はＨＩＶ－１モザイクｇｐ１４０タンパク質である。

本明細書で使用する場合、「安定化三量体ｇｐ１４０タンパク質」及び「ｇｐ１４０の安定化三量体」という用語の各々は、三量体構造の安定性を増大させるポリペプチド配列を含むｇｐ１４０ポリペプチドの三量体を指す。ｇｐ１４０ポリペプチドは、ｇｐ１４０の三量体を安定化する三量体化ドメインを有し得るか、又はそれを含むように改変され得る。三量体化ドメインの例としては、Ｔ４－フィブリチンの「フォルドン」三量体化ドメイン；ＧＣＮ４に由来するコイルドコイル三量体化ドメイン；及び三量体タグとしての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼの触媒サブユニットが挙げられるが、これらに限定されない。

抗原ＨＩＶエンベロープポリペプチドの例は、これら全てが参考としてその全体が組み込まれる、Ｎｋｏｌｏｌａ ｅｔ ａｌ ２０１０，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８４（７）；３２７０－３２７９；Ｋｏｖａｃｓ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ ２０１２，１０９（３０）：１２１１１－６；国際公開第２０１０／０４２９４２号パンフレット及び国際公開第２０１４／１０７７４４号パンフレットに記載されるような安定化三量体ｇｐ１４０である。

本発明のいくつかの実施形態では、「エンベロープポリペプチド」又は「エンベロープ糖タンパク質」は、１つ以上のＨＩＶクレードの１つ以上のＥｎｖポリタンパク質配列に由来する複数のエピトープを含有するモザイクエンベロープタンパク質である。例えば、本明細書で使用する場合、「ｇｐ１４０タンパク質」は、１つ以上のＨＩＶクレードの１つ以上のｇｐ１４０タンパク質配列に由来する複数のエピトープを含有する「モザイクｇｐ１４０タンパク質」であり得る。好ましくは、モザイクｇｐ１４０タンパク質は、安定化三量体ｇｐ１４０タンパク質である。

好ましい実施形態では、モザイクｇｐ１４０タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含むモザイクｇｐ１４０タンパク質の安定化三量体である。

本発明のいくつかの実施形態では、「エンベロープポリペプチド」又は「エンベロープ糖タンパク質」は、ＨＩＶクレードＡ、Ｂ、又はＣなどの特定のＨＩＶクレードに由来するエンベロープタンパク質である。例えば、本明細書で使用する場合、「ｇｐ１４０タンパク質」は、ＨＩＶクレードＣに由来するエンベロープタンパク質配列を含有する「クレードＣ ｇｐ１４０タンパク質」であり得る。好ましくは、クレードＣ ｇｐ１４０タンパク質は、安定化三量体クレードＣ ｇｐ１４０タンパク質である。

好ましい実施形態では、クレードＣ ｇｐ１４０タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むクレードＣ ｇｐ１４０タンパク質の安定化三量体である。

本発明の特定の実施形態によれば、安定化三量体ｇｐ１４０タンパク質などのｇｐ１４０ポリペプチドは、ウイルス発現ベクター、例えばアデノウイルス２６（例えば、国際公開第２０１６／０４９２８７号パンフレット、国際公開第２０１７／１０２９２９号パンフレットを参照されたい）と共に投与することができる。

特定の実施形態では、２つのｇｐ１４０タンパク質、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を有するクレードＣ ｇｐ１４０と、配列番号２のアミノ酸配列を有するモザイクｇｐ１４０とを、同一の対象に投与する。これらの２つのｇｐ１４０タンパク質は、１つの医薬組成物にまとめることが可能であり、好ましくはリン酸アルミニウムアジュバントなどのアジュバントと共に投与される。ヒトに投与するためのｇｐ１４０の総量に対する好ましい用量は、１２５～３５０μｇ、例えば１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０μｇ、又はその間の任意の量、好ましくは約２５０μｇである。クレードＣ ｇｐ１４０及びモザイクｇｐ１４０を両方とも投与する場合、好適な用量は、例えば、ヒト対象に投与するためのｇｐ１４０の糖タンパク質の総用量の２５０μｇを提供するには、それぞれの糖タンパク質は約１２５μｇとなる。本明細書で使用する場合、別途指示がない限り、ｇｐ１４０ポリペプチドの量は、糖タンパク質として測定されたｇｐ１４０ポリペプチドの量を指す。

単離したｇｐ１４０タンパク質は、アデノウイルス（例えば、Ａｄ２６）発現ベクター又はＭＶＡなどの他の発現ベクターと組み合わせて共送達又は共投与することができる。好ましい実施形態によれば、ｇｐ１４０タンパク質及びＡｄ２６又は他の発現ベクターは、２つの別個の製剤として別々に投与される。或いは、ｇｐ１４０タンパク質は、Ａｄ２６又は他の発現ベクターと共に、単一製剤で投与することができる。同時投与又は共送達は、同時に、１時間以内に、又は同日中に行うことができる。更に、ｇｐ１４０タンパク質は、アジュバント添加製剤で投与することができる。好適なアジュバントは、例えば、リン酸アルミニウムアジュバント又はサポニンベースのアジュバント、好ましくはリン酸アルミニウムアジュバントであり得る。

ｇｐ１４０などの抗原ポリペプチドを、本開示の観点から、当該技術分野において公知の任意の方法を使用して生成及び単離することができる。例えば、抗原ポリペプチドは、宿主細胞、好ましくは抗原ポリペプチドを生成するのに最適化された組み換え宿主細胞から発現させることができる。本発明の一実施形態によれば、組み換え遺伝子は、切断活性及び融合活性を排除するための変異を含むｇｐ１４０タンパク質、好ましくは対象（例えば、ヒト）の免疫化の際に（例えば、組成物、例えばワクチンに組み込まれた場合に）生じる抗ウイルス免疫応答（例えば、細胞性又は体液性免疫応答）の幅、強度、深さ、又は長さが向上した、最適化されたｇｐ１４０タンパク質を発現させるために使用される。最適化されたｇｐ１４０タンパク質はまた、切断部位変異、第Ｘａ因子部位、及び／又はフォルドン三量体化ドメインを含み得る。最適化されたｇｐ１４０タンパク質のＮ末端にリーダー／シグナル配列を作動可能に連結して、タンパク質発現を最大化することができる。リーダー／シグナル配列は通常、小胞体の内腔に輸送される間に新生ポリペプチドから切断される。目的の宿主細胞に好適な、任意のリーダー／シグナル配列を使用することができる。例示的なリーダー／シグナル配列は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。

好ましくは、「ＨＩＶエンベロープタンパク質」は、「合成ＨＩＶエンベロープタンパク質」である。本明細書で使用する場合、「合成ＨＩＶエンベロープタンパク質」という用語は、それを必要とする対象に１種以上の天然に存在するＨＩＶ株に対する免疫応答を誘導するか、又は免疫を生じさせるように最適化された、天然に存在しないＨＩＶエンベロープタンパク質を指す。モザイクＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質は合成ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の例であり、本発明は、合成ＨＩＶ Ｅｎｖ抗原、例えば、配列番号１又は配列番号２を含むものを提供する。

本出願の一実施形態によるプロセスによって精製される目的のタンパク質は、宿主細胞、好ましくは組み換え宿主細胞によって発現させることができる。特定の実施形態では、ＨＩＶエンベロープタンパク質などの目的のタンパク質は、シグナル配列と共に発現させることが可能であり、このシグナル配列は、小胞体（ＥＲ）の内腔に輸送される際に新生ポリペプチド鎖から切断される。任意の好適なシグナル配列を使用することができる。ＨＩＶ Ｅｎｖシグナル配列又はその変異体を使用することが好ましい。ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質の異なるシグナル配列は、当該技術分野において使用されている（例えば、国際公開第２０１４／１０７７４４号パンフレットを参照されたい）。

好ましい実施形態では、目的のタンパク質は、ＨＩＶエンベロープタンパク質などのタンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターによって形質移入された宿主細胞から、組み換えにより産生される。組み換えタンパク質を発現させるために、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、バクテリオファージなどの非ウイルスベクター、又はアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ＭＶＡベクター、腸内ウイルスベクター、ベネズエラウマ脳炎ウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、タバコモザイクウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない任意の好適な発現ベクターを使用することができる。

合成ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結されていてもよく、このことは、核酸がプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、相同プロモーター（即ち、ベクターと同一の遺伝源に由来する）又は異種プロモーター（即ち、異なるベクター若しくは遺伝源に由来する）であり得る。アデノウイルスベクターに好適なプロモーターの非限定例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターが挙げられる。好ましくは、プロモーターは、発現カセット内の核酸の上流に位置する。

宿主細胞は、典型的には、本発明に使用される十分な量のタンパク質を産生するために使用される。

好ましい実施形態によれば、好適な細胞培養物の細胞を発現ベクターによって形質転換又は形質移入することができる。組み換えタンパク質を発現するために、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ細胞などが挙げられるが、これらに限定されない任意の宿主細胞、好ましくは真核生物宿主細胞、より好ましくは哺乳動物宿主細胞を使用することができ、これらは目的のタンパク質をコードする発現ベクターによって形質移入される。また、発現ベクターは通常、目的のタンパク質を発現する組み換え宿主細胞の同定及び単離を容易にするマーカー遺伝子及び／又は選択遺伝子を含むカセットを含有する。しかしながら、ＰＣＲ技術によって組み換え宿主細胞を同定することもできる。特定の実施形態では、組み換えタンパク質、例えば、ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸が、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。これによって、安定的な宿主細胞株から組み換えタンパク質を産生することが可能となる。

遺伝コードの縮重の観点から、当該技術分野において完全に常用される方法に従って、同じタンパク質をコードするいくつかの核酸配列が設計され得ることを当業者は十分に認識している。ＨＩＶエンベロープタンパク質などの目的のタンパク質をコードする核酸は、確実に宿主細胞で適切に発現させるために、任意選択によりコドンを最適化することができる。コドン最適化は、当該技術分野において広く適用されている技術である。

従って、本発明の方法は、組み換え宿主細胞からＨＩＶ抗原ポリペプチドなどの目的のタンパク質を産生することを更に含み得る。好ましくは、この方法は、本発明のプロセスを使用して、プロモーターに作動可能に連結されたＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターによって宿主細胞を形質移入することと、合成ＨＩＶ抗原ポリペプチドを発現させるのに好適な条件下で形質移入細胞を増殖させることと、細胞から合成ＨＩＶ抗原ポリペプチドを単離することとを含む。組み換えタンパク質発現に使用される手法は、本開示の観点から当業者によく知られている。

本発明の別の一般的な態様は、本発明のプロセスによって精製されるタンパク質及び担体を含む、ワクチン又は免疫原性組成物などの医薬組成物に関する。担体としては、結合剤、崩壊剤、膨張剤、懸濁化剤、乳化剤、湿潤剤、潤滑剤、香味剤、甘味料、防腐剤、染料、可溶化剤及びコーティングなどの１種以上の薬学的に許容される賦形剤を挙げることができる。担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路、例えば筋肉内、皮下、経口、静脈内、皮膚、粘膜内（例えば、腸）、鼻腔内又は腹腔内経路に依存し得る。液体の注射用製剤、例えば、懸濁液及び溶液の場合、好適な担体及び添加剤としては、水、グリコール、油、アルコール、防腐剤、着色剤などが挙げられる。固体の経口剤、例えば粉末、カプセル、カプレット、ジェルキャップ及び錠剤の場合、適切な担体及び添加剤としては、デンプン、糖、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などが挙げられる。鼻腔用スプレー／吸入用混合物の場合、水溶液／水性懸濁液は、好適な担体及び添加剤として、水、グリコール、油、皮膚軟化薬、安定剤、湿潤剤、防腐剤、芳香剤、香味料などを含むことができる。

本発明の組成物は、経口（経腸）投与及び非経口注射を含むがこれらに限定されない、投与を容易にし、且つ効能を高めることができるような、対象に投与するのに好適な任意の成分で製剤化することができる。非経口注射としては、静脈内注射又は静脈内点滴、動脈内注射、皮下注射、筋肉内注射及び関節内注射が挙げられる。本発明の組成物をその他の投与経路用に製剤化することもでき、その他の投与経路としては、経粘膜、眼内、直腸、持続性皮下注入、舌下投与、舌下、門脈循環をバイパスする口腔粘膜から、吸入又は鼻腔内が挙げられる。

本発明の特定の実施形態によれば、組成物は、本発明の方法によって精製される、免疫原性的に有効な量のＨＩＶエンベロープタンパク質などのタンパク質、及び任意選択により１つ以上の追加のＨＩＶ抗原及び／又はアジュバントを含む。前記組成物は、本開示の観点から、当該技術分野において公知の方法に従ってワクチン（「免疫原性組成物」とも称される）として製剤化することができる。一般に、単離された抗原ポリペプチドなどのポリペプチドに関して使用する場合、免疫原性的に有効な量は、例えば、約０．３～約３０００マイクログラム（μｇ）、例えば、１～１０００μｇ、例えば、１０～５００μｇ、例えば、約５０又は２５０μｇの範囲であり得る。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、免疫応答を増強するためのアジュバントを任意選択により更に含み得る。「アジュバント」及び「免疫刺激剤」という用語は、本明細書では同義的に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１つ以上の物質と定義される。本文脈では、アジュバントは、本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質、及び任意選択により１つ以上の追加のＨＩＶ抗原をコードするベクターと組み合わせて使用される、本発明の合成ＨＩＶエンベロープタンパク質、及び任意選択により１つ以上の追加のＨＩＶ抗原及び／又はＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードするベクターに対する免疫応答を増強するのに使用される。

本発明と共に使用するのに好適なアジュバントは、人において潜在的に安全であり、忍容性が良好且つ有効なものでなければならず、例えば、ＱＳ－２１、Ｄｅｔｏｘ－ＰＣ、ＭＰＬ－ＳＥ、ＭｏＧＭ－ＣＳＦ、ＴｉｔｅｒＭａｘ－Ｇ、ＣＲＬ－１００５、ＧＥＲＢＵ、ＴＥＲａｍｉｄｅ、ＰＳＣ９７Ｂ、Ａｄｊｕｍｅｒ、ＰＧ－０２６、ＧＳＫ－Ｉ、ＧｃＭＡＦ、Ｂ－ａｌｅｔｈｉｎｅ、ＭＰＣ－０２６、Ａｄｊｕｖａｘ、ＣｐＧ ＯＤＮ、Ｂｅｔａｆｅｃｔｉｎ、アルミニウム塩（例えば、ＡｄｊｕＰｈｏｓ）、Ａｄｊｕｐｌｅｘ、及びＭＦ５９などである。製剤中の各構成成分の最適な比率は、本開示の観点から、当業者によく知られた技術によって決定することができる。

好ましい実施形態では、アジュバントは、水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム、例えばＡｄｊｕＰｈｏｓなどのアルミニウム塩である。特定の実施形態では、リン酸アルミニウムは、好ましくは、ｇｐ１４０などの単離されたＨＩＶ抗原ポリペプチドを含む組成物中に存在するか、又はそれと共に投与される。

免疫原性組成物の調製及びその使用は、当業者によく知られている。液体医薬組成物としては、一般に、水、石油、動物油若しくは植物油、鉱油若しくは合成油などの液体担体が挙げられる。生理食塩水溶液、ブドウ糖、若しくは他の糖類溶液、又はエチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールなどのグリコールを挙げることもできる。

或いは、ワクチン注射は、製剤中のウイルスを段階的に凍結乾燥することによって調製することができる。特定の実施形態では、製剤は、マンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトース、ポリビニルピロリドン、又は酸化防止剤若しくは不活性ガス、安定剤若しくは組み換えタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）などを含むがこれらに限定されない他の添加剤などの、インビボ投与に好適な追加の添加剤を含有する。次いでアンプルを封止して、これを好適な温度、例えば４℃～室温で数ヵ月間保存することができる。しかしながら、必要がない限り、アンプルは好ましくは－２０℃未満の温度で保存される。

ワクチン接種又は療法に関する様々な実施形態では、凍結乾燥物を０．１～０．５ｍｌの水溶液、好ましくは生理食塩水又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液に溶解し、全身的又は局所的のいずれかで、即ち、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮内、又は任意の他の熟練した施術者に公知の投与経路によって投与する。投与方法、用量、及び投与回数の最適化は、当業者の技術及び知識の範囲内である。

特定の実施形態では、本発明による方法によって作製されたｇｐ１４０タンパク質などのＨＩＶエンベロープタンパク質は、ソルビトール（例えば、２～１５％（ｗ／ｖ）、例えば、５％又は１２％）、ポリソルベート２０（例えば、０．０１～０．０５％（ｗ／ｖ）、例えば、０．０２％）、及びヒスチジン緩衝液（例えば、５～２０ｍＭ、ｐＨ５．５～７．０、例えば、ｐＨ６．５で１０ｍＭ）で構成される組成物に含まれる。例えば、国際公開第２０１７／２１６２８８号パンフレットを参照されたい。そのような組成物は、アジュバント、例えばリン酸アルミニウムを任意選択により更に含み得る（例えば、０．７～４．０ｍｇ／ｍＬ、例えば、０．７～１ｍｇ／ｍＬ、例えば、０．８５ｍｇ／ｍＬ）。ＨＩＶエンベロープタンパク質は、例えば、約０．０５～５ｍｇ／ｍＬ、例えば、０．２ｍｇ／ｍＬ又は１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在してもよい。例えば、そのような組成物は、－８０℃～約２５℃、例えば、約－８０℃、－６０℃、－２０℃、又は好ましくは約２～８℃で保存することができ、これによってワクチンとして投与するのに直接使用することができる安定的な液体組成物が提供される。

本発明はまた、本発明の医薬組成物又はワクチンを使用して、それを必要とする対象に１つ以上のＨＩＶクレードに対する免疫応答を誘導する方法に関する。本発明の実施形態によれば、「免疫応答を誘導する」は、本明細書に記載される方法及び組成物に関して使用する場合、予防目的のためにＨＩＶ感染などの感染に対して対象に防御免疫を提供すること、及び／又はワクチン接種すること、並びに治療目的、即ち治療的ワクチン接種のためにＨＩＶ感染などの感染に対してそれを必要とする対象に所望の免疫応答又は効果を引き起こすことを包含する。また、「免疫応答を誘導する」は、病原性因子、即ちＨＩＶに対する治療のための治療的免疫を提供することを包含する。典型的には、予防ワクチン接種の場合は、これまでにＨＩＶに感染したことのない対象に組成物及びワクチンが投与され、一方で、治療的ワクチン接種の場合は、既にＨＩＶに感染した対象に組成物及びワクチンが投与される。免疫応答は、細胞性免疫応答及び／又は体液性免疫応答であり得る。

本明細書で使用する場合、「防御免疫」又は「防御免疫応答」という用語は、ワクチン接種を受けた対象が、ワクチン接種が行われた病原性因子による感染を防除することが可能であることを意味する。通常、「防御免疫応答」を発現した対象は、軽度から中等度の臨床症状しか発現しないか、又は症状を全く発現しない。通常、ある特定の因子に対する「防御免疫応答」又は「防御免疫」を有する対象は、前記因子による感染の結果として死亡することはない。

本明細書で使用する場合、「治療的免疫」又は「治療的免疫応答」という用語は、ワクチン接種を受けた対象が、ワクチン接種が行われた病原性因子、即ちＨＩＶによる感染を防除することが可能であることを意味する。特定の実施形態では、本発明によって免疫応答を誘導する方法は、治療的ワクチン接種などの治療目的のためのものであり、本明細書に記載される組成物及びワクチンは、既にＨＩＶに感染している対象に投与される。「ＨＩＶ感染」及び「ＨＩＶに感染した」という用語は、本明細書で使用する場合、ＨＩＶによるヒト宿主への侵襲を指す。本明細書で使用する場合、「ＨＩＶに感染した対象」は、ＨＩＶが侵襲し、続いて宿主内で複製及び増殖し、これによって宿主がＨＩＶに感染するか、又はＨＩＶ感染症若しくはその症状を有するようになる対象を指す。他の実施形態では、本発明のタンパク質及び組成物を、予防ワクチン接種の場合に、例えば、対象、好ましくはＨＩＶに感染していないヒト対象に投与することによって使用することができる。

抗原ポリペプチドを含む免疫原性組成物の投与は、典型的に、筋肉内、皮内、又は皮下である。しかしながら、静脈内、直腸、皮膚、経口、経鼻などの他の投与方法も同様に想定され得る。免疫原性組成物の筋肉内投与は、抗原ポリペプチドの懸濁剤を注射するための針を使用することにより行われ得る。代替法としては、組成物又はワクチンを含有する凍結乾燥粉末を投与するための無針注射デバイスの使用（例えばＢｉｏｊｅｃｔｏｒ（商標）の使用）がある。

筋肉内、静脈内、皮膚若しくは皮下注射、又は罹患部位に注射する場合、単離された抗原ポリペプチドは典型的に、好適なｐＨ、等張性、及び安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態となる。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液などの等張媒体を用いて好適な溶液を調製することが十分に可能である。必要に応じて、保存剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤及び／又は他の添加剤が含まれていてもよい。徐放性製剤を使用することもできる。ＨＩＶ ｇｐ１４０タンパク質に好適な製剤の例は、国際公開第２０１７／２１６２８８号パンフレットに示されており、本明細書に参照として組み込まれる。

検出可能な免疫応答を誘導するのに十分な組成物の量は、「免疫原的に有効な用量」又は「免疫原性的に有効な量」と定義される。投与される実際の量、及び投与の速度及び時間経過は、投与を受けるものの性質及び重症度に依存する。治療の処方、例えば、投与量などの決定は、一般開業医や他の医師、又は獣医の場合は獣医師の責任の範囲内であり、典型的に、治療対象の障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、及び開業医に公知のその他の要因を考慮する。上述の手法及びプロトコルの例は、一般的に入手可能な教本及び手引き書に見出すことができる。

組み換えＰＥＲ．Ｃ６細胞株によって発現する組み換えタンパク質（例えば、クレードＣのＨＩＶのｇｐ１４０（配列番号１）又はモザイクＨＩＶ ｇｐ１４０（配列番号２））を生成及び精製するための上流及び下流プロセスを調査した。バイオリアクター内における遺伝子発現及び組み換え宿主細胞の生産能を向上させるために、複数の増殖培地を検証した。例えば、生産能の向上が可能となるように、バイオリアクターへのフィードを２０％濃縮した。

例えば、比較的高収率（例えば、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約１５％の全収率）でありながら、最終的な宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）レベルを最小限に抑え、生成物の変異型レベル及び／又は立体構造を保持し、ＤＮＡ及び他の異物混入を排除することを目標にして、目的のタンパク質（例えば、クレードＣのＨＩＶのｇｐ１４０又はモザイクＨＩＶ ｇｐ１４０）を精製するための様々なプロセス、条件、及びカラムを調査した。本発明のプロセスを使用すると、最終的なｇｐ１４０タンパク質産物のＨＣＰレベルが５０００ｐｐｍ未満、典型的には１０００ｐｐｍ未満に減少し、宿主細胞のＤＮＡは検出レベル未満であった。

組み換え宿主細胞の高い細胞密度及び細胞型により、細胞の産物を濾過することが困難であった。重力ベースの細胞沈降は、目的のタンパク質を大規模生成するには実現可能なものではない。従って、連続遠心分離を使用して、重力沈降工程を置き換えた。

第１の精製カラム（疎水性相互作用特性及び陽イオン交換特性を含む混合モード樹脂であり、驚くべきことに、多種多様な可能性の中で最も好適な捕捉カラムであることが判明した）に負荷するための調製物中における最初の限外濾過の後に、沈殿が生じたことが認められた。フィルター膜が沈殿物によって詰まるのを避けるため、最初の限外濾過の前に、酸沈殿（又は低ｐＨ凝集）及びデプス濾過を使用して、濾液中に十分な量の目的のタンパク質（例えば、ＨＩＶ ｇｐ１４０）を保持したままで、細胞片及び他の沈殿物を除去した。ｐＨを（例えば、１Ｍの酢酸によって）５．０＋／－０．１に調整した、清澄化した産物の濁度は、約３時間のインキュベート後に約７０の比濁法濁度単位（ＮＴＵ）のプラトーに到達したが、最終的なＮＴＵは＞９５％に到達したことが示されている（例えば、図１Ａ及び１Ｂを参照されたい）。酸沈殿中に大きな沈殿物が見られたが、組み換えタンパク質の回収率も、例えばクレードＣ ｇｐ１４０の場合では約１００％と高く、このことは、酸沈殿中のクレードＣ ｇｐ１４０の沈殿又は消失が全くないか又はごくわずかな量であったことを示唆している。フィルターを選択するために、酸沈殿物質を様々なデプスフィルターに通して濾過し、濾過後に濁度を再度測定した。好適なフィルターによって、濁度の著しい減少とＨＣＰの除去とがもたらされたが、組み換えタンパク質が著しく失われるようなことはなかった。

カラム分離前の生成物の濃縮及びバッファー交換のために、限外濾過（ＵＦ）及びダイアフィルトレーション（ＤＦ）を使用した（図１Ａ）。ＵＦ／ＤＦによって次のクロマトグラフィー工程のための生成物を調製した。カラムは多くの場合、異なるｐＨ又はモル濃度条件下で動作し、生成物をクロマトグラフィーで使用するために、ＵＦ及びＤＦによって事前にプライミングする必要がある。本出願における本開示の観点から好適なＵＦ／ＤＦを選択することができる。

本発明のプロセスは、３つ以上のクロマトグラフィーカラム工程を含み、これらを生成物のＵＦ／ＤＦの前に行うことができる。大規模な製造プロセスの際に十分な収率及び高い純度という要件を満たすことを目的に、所与の特定のタンパク質に好適なカラムの組み合わせが予測できないことを考慮して、様々な樹脂をスクリーニング法によって評価した。生成物の不純物結合を評価するために、結合等温線を作成した。異なるカラムを調査し、比較した。最も大きな結合能を有するカラムを「捕捉」カラムであるとした。図２Ａに図示される精製プロセスを使用して、所望の低いＨＣＰレベルを達成した（図２Ｂ）。

生成のスケールアップを最適化するために、プロセスに対して更なる改良を行った。施設の適合性とプロセスの堅牢性とに焦点を当てた開発努力を行った。そのような努力としては、例えば、フィード分散、播種密度、ｐＨ感受性、バイオリアクター温度、ｐＣＯ２変動、リアクター持続時間などが挙げられる。パイロット規模、スケールダウンモデル、及び工学原理を使用して、優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）生産のためのプロセスの即応性を示した。

図３に記載されているプロセスを使用したクレードＣ ｇｐ１４０タンパク質の精製、及び図４に記載されているプロセスを使用したモザイクｇｐ１４０タンパク質の精製に関して優れた結果が見出された。これらのプロセスは、医薬品グレードの生成物の大規模製造に好適であることが見出された。

実施例１．クレードＣ ｇｐ１４０の精製
クレードＣ ｇｐ１４０は、流加細胞培養プロセスによって製造した。細胞の増殖及びクレードＣ ｇｐ１４０の生成は、クレードＣ ｇｐ１４０を発現するＰＥＲ．Ｃ６細胞を使用した段階１（前培養及び播種用バイオリアクター）、及び段階２（１５，０００Ｌ～１６，５００Ｌの容積のバイオリアクター内での生成）を含む、最初の２段階のプロセスで行った。それに続く製剤化バルク（ＦＢ）の精製及び製造を、残りの１１段階で行った。前培養及び増殖から原薬（ＤＳ）までのクレードＣ ｇｐ１４０の原薬製造プロセスのフローチャートを図３に示す。

１５，０００Ｌの生成プロセスの目標とする実行期間は１８日である。次いで、１５，０００Ｌの生成物の内容物を、２５％の酢酸によって目標のｐＨ４．８に調整して凝集させる（段階３、低ｐＨ凝集）。凝集後、遠心分離及びデプス濾過／ポリッシング濾過によって清澄化する（段階４）。続いて５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）及び１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ７．６の溶液中で限外濾過及びダイアフィルトレーション（ＵＦＤＦ）工程（段階５）を実行し、プールされたＵＦＤＦ捕捉物（retentate）を得た。

段階６では、プールされたＵＦＤＦ捕捉物のｐＨを、１Ｍの酢酸で５．０に調整した。次いで、この捕捉物を、５０ｍＭの酢酸ナトリウムを含有するｐＨ５．０の溶液によって既に平衡化されているＣａｐｔｏ ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓのカラムに負荷した。このＣａｐｔｏ ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓカラムクロマトグラフィーを結合及び溶出モードで実行し、宿主細胞タンパク質、及び場合により存在するＤＮＡを除去した。クレードＣ ｇｐ１４０をカラムに結合させ、その後５０ｍＭの２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）及び４００ｍＭの塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．０の溶出溶液で溶出し、プールされた溶出液を得た。

段階７では、上記のＣａｐｔｏ ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓクロマトグラフィー工程から回収した、プールされた溶出液を、１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ９．０）でｐＨ７．５に中和し、次いで注射用に（６ｍＳ／ｃｍ以下の導電率となるまで）水で希釈した。得られたｐＨ調整済みの希釈した溶出液を、２５ｍＭのＴｒｉｓを含有するｐＨ７．５の溶液によって既に平衡化されているＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱのカラムに負荷した。このＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱカラムクロマトグラフィーを結合及び溶出モードで実行し、宿主細胞タンパク質、及び場合によりＤＮＡを更に除去した。クレードＣ ｇｐ１４０をカラムに結合させ、その後２５ｍＭのＴｒｉｓ及び１８５ｍＭの塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．５の溶出溶液（約１９ｍＳ／ｃｍの導電率）で溶出し、プールされた溶出液を得た。

段階８では、上記のＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱクロマトグラフィー工程から回収した、プールされた溶出液を、１Ｍの酢酸でｐＨ６．５に調整し、次いで注射用に（７ｍＳ／ｃｍ以下の導電率となるまで）水で希釈した。得られたｐＨ調整済みの希釈した溶出液を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有するｐＨ６．５の溶液によって既に平衡化されているＣａｐｔｏ ＤｅＶｉｒＳのカラムに負荷した。このＣａｐｔｏ ＤｅＶｉｒＳカラムクロマトグラフィーを、結合及び溶出モードで実行した。クレードＣ ｇｐ１４０をカラムに結合させ、その後２５ｍＭのＴｒｉｓ及び１８５ｍＭの塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．５の溶出溶液（約１９ｍＳ／ｃｍの導電率）で溶出し、プールされた溶出液を得た。

段階９では、上記のＣａｐｔｏ ＤｅＶｉｒＳクロマトグラフィー工程から回収した、プールされた溶出液に５Ｍの塩化ナトリウムを添加して、導電率を６２ｍＳ／ｃｍとなるように調整し、ウイルスを不活化するために１Ｍの酢酸でｐＨ３．５に調整し、１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ９．０）でｐＨ４．５に中和し、次いで注射用に３０ｍＳ／ｃｍの導電率となるまで水で希釈した。

段階１０では、段階９により得られた希釈した溶出液を、５０ｍＭの酢酸ナトリウム及び３１７ｍＭの塩化ナトリウムを含有するｐＨ４．５の溶液によって既に平衡化されているＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅのカラムに負荷した。このＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅカラムクロマトグラフィーは、場合により存在する核酸及び宿主細胞タンパク質を除去するためにフロースルーモードで実行され、このフロースルー溶液には、ｐＨ４．５の５０ｍＭの酢酸ナトリウム及び３１７ｍＭの塩化ナトリウム中にクレードＣ ｇｐ１４０タンパク質が含まれている。

段階１１では、上記のＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィー工程から回収した溶出液（実際にはフロースルー溶出液）を、１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ９．０）でｐＨ６．５に中和し、次いでウイルス捕捉濾過用のＰｌａｎｏｖａ ２０Ｎウイルスフィルターを通して処理した。得られた濾液を、最終的な限外濾過及びダイアフィルトレーション（ＵＦＤＦ）に供し、原薬の製剤緩衝液（段階１２）及び最終製剤とした（段階１３）。

精製プロセスには、製造プロセスの各プロセス段階の間に実施されるプロセス内管理（ＩＰＣ）検査も含まれる。ＩＰＣ検査は、得られたＡＰＩ又は最終生成物が確実にその規格に適合するように、プロセスを監視、及び必要であれば調整するための、製造過程の間に行われる検査、チェック、及び測定であると定義される。残りのプロセス内検査はプロセス監視検査（ＰＭＴ）と定義され、これは、プロセスが確実に制御状態で維持されるように、プロセスを監視するための日常的な生成工程の間に行われる検査、チェック、及び測定のことである。

実施例２．モザイクｇｐ１４０の精製
前培養及び増殖から原薬（ＤＳ）までのモザイクｇｐ１４０の原薬製造プロセスのフローチャートを図４に示す。モザイクｇｐ１４０の大規模製造には、段階１（前培養及び播種用バイオリアクター）、段階２（単回使用バイオリアクター（ＳＵＢ）内における２０００Ｌの生成）、段階３（ｐＨ５での凝集）、及び段階４（清澄化）のプロセスが含まれる。前培養プロセスは、モザイクｇｐ１４０を発現し、バイアル解凍から震盪フラスコ、ウェーブバッグ、及び５００Ｌの播種用バイオリアクターを経ての増殖を必要とするＰＥＲ．Ｃ６細胞株を使用する。播種用バイオリアクターを含む前培養のための段階１の最大期間は４０日である。次いで、接種後にバッチを２０００Ｌの生成ＳＵＢプロセスに移行する（段階２）。２０００Ｌの生成ＳＵＢプロセスの目標となる実行期間は１９日である。２０００Ｌの生成ＳＵＢの内容物を、１Ｍの酢酸によって目標のｐＨ５．０に調整することで凝集させる（段階３）。凝集後、遠心分離、デプス濾過、及びポリッシング濾過によって、又はデプス濾過及びポリッシング濾過のみによって清澄化する（段階４）。

段階５では、得られた濾液を１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ９）及び５Ｍの塩化ナトリウムによって１５ｍＳ／ｃｍの導電率でｐＨ５．２５となるように調整し、次いでｐＨ５．０の５０ｍＭの酢酸ナトリウムによって既に平衡化されているＣａｐｔｏ ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓのカラムに負荷した。このＣａｐｔｏ ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓカラムクロマトグラフィーを結合及び溶出モードで実行し、宿主細胞タンパク質、及び場合により存在するＤＮＡを除去した。モザイクｇｐ１４０をカラムに結合させ、その後５０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び４００ｍＭの塩化ナトリウムを含有するｐＨ７．０の溶出溶液で溶出し、プールされた溶出液を得た。

段階６では、上記のＣａｐｔｏ ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓクロマトグラフィー工程から回収した、プールされた溶出液を、１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ９．０）で中和し、次いで注射用に水で希釈して、５．５ｍＳ／ｃｍの導電率を有するｐＨ８．０のプールされた溶出液を得た。得られたｐＨ調整済みの希釈した溶出液を、５０ｍＭのＴｒｉｓを含有するｐＨ８．０の溶液によって既に平衡化されているＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱのカラムに負荷した。このＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱカラムクロマトグラフィーを結合及び溶出モードで実行し、宿主細胞タンパク質、及び場合により存在するＤＮＡを更に除去した。モザイクｇｐ１４０をカラムに結合させ、その後、勾配長さ＝１１．０ ＣＶを有する６％～４２％の緩衝液Ｂの勾配溶出によって溶出した。緩衝液ＡはｐＨ８．０の５０ｍＭのＴｒｉｓであり、緩衝液Ｂは５０ｍＭのＴｒｉｓ及び５００ｍＭの塩化ナトリウムのｐＨ８．０の混合物であり、導電率は約６～２０ｍＳ／ｃｍに上昇した。

段階７では、５Ｍの塩化ナトリウムに、上記のＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱクロマトグラフィー工程から回収した、プールされた溶出液を添加して、このプールされた溶出液の導電率が５６ｍＳ／ｃｍになるように調整し、ウイルスを不活化するために１Ｍの酢酸でｐＨ３．５に調整した。

段階８では、段階７により得られた溶出液を、５０ｍＭの酢酸ナトリウム及び６５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有するｐＨ３．５の溶液によって既に平衡化されているＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅのカラムに負荷した。このＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅカラムクロマトグラフィーをフロースルーモードで実行し、場合により存在する核酸及び宿主細胞タンパク質を除去した。プールされた溶出液を、１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ９．０）でｐＨ６．５に中和した。

本明細書に記載される実施例及び実施形態は例示の目的のためのものに過ぎず、その広範な発明概念から逸脱することなく上記に記載される実施形態に対する変更が可能であることは理解されよう。従って、本発明は、開示されている特定の実施形態に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の趣旨及び範囲に含まれる変形例を包含することを意図することが理解されよう。
また、本発明は以下を提供する。
［１］
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を含む細胞試料、例えば細胞上清などを得ることと、
ｂ．前記細胞試料のｐＨを約５．０に調整し、これにより前記細胞試料中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を沈殿させることと、
ｃ．前記細胞試料からデプス濾過によって前記沈殿したＨＣＰを除去し、前記ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を含む濾液を得ることと、
ｄ．クロマトグラフィーによって前記濾液から前記ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を精製することと
を含むプロセス。
［２］
前記ＨＣＰを沈殿させるために、前記試料を、約ｐＨ５で、好ましくは約１～３時間、好ましくは約３時間インキュベートする、［１］に記載のプロセス。
［３］
前記クロマトグラフィーが、
ａ．前記タンパク質を含む前記濾液を限外濾過（ＵＦ）及びダイアフィルトレーション（ＤＦ）にかけ、前記ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を含む捕捉物を得ることと、
ｂ．前記捕捉物を第１のカラムに加え、前記ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質を精製することと
を含む、［１］又は［２］に記載のプロセス。
［４］
前記ＨＩＶ Ｅｎｖタンパク質がＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質であり、前記第１のカラムが疎水性相互作用特性及び陽イオン交換特性を含むマルチモーダル樹脂を含む、［３］に記載のプロセス。
［５］
ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を精製するためのプロセスであって、疎水性相互作用特性及び陽イオン交換特性を含むマルチモーダル樹脂上で前記タンパク質を捕捉し、精製画分を前記マルチモーダル樹脂から溶出することを含み、前記ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質の純度が、前記マルチモーダル樹脂に負荷されたときの混合物中の前記タンパク質と比較して実質的に上昇しているプロセス。
［６］
ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を精製するためのプロセスであって、
ｉ）ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質、及び他の所望されないタンパク質、例えば、ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を発現する宿主細胞に由来する宿主細胞タンパク質を含む組成物を提供する工程と、
ｉｉ）疎水性相互作用特性及び陽イオン交換特性を含むマルチモーダル樹脂上で前記ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を捕捉し、前記マルチモーダル樹脂から前記ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を含む精製分画を溶出する工程と、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の前記精製分画を陰イオン交換樹脂に加え、前記ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を結合させ、前記陰イオン交換樹脂から前記ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を含む更に精製された画分を溶出する工程と、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の前記更に精製された画分を陰イオン交換機能及び疎水性機能を有するマルチモーダル樹脂に供し、更に精製されたＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を溶出する工程と
を含むプロセス。
［７］
前記ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質がクレードＣ ｇｐ１４０タンパク質であり、好ましくは配列番号１を含む、［６］に記載のプロセス。
［８］
前記ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質が、工程ｉｉ）で前記マルチモーダル樹脂に結合し、その後溶出される、［６］又は［７］に記載のプロセス。
［９］
工程ｉｖ）の前記マルチモーダル樹脂が、フロースルーモードで使用される、［６］～［８］のいずれか一項に記載のプロセス。
［１０］
工程ｉｉｉ）のＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質の前記更に精製された画分をアフィニティー媒体樹脂に加え、好ましくはこの画分を工程ｉｖ）に供する前に、前記樹脂から前記ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を含む更に精製された画分を溶出する工程を更に含む、［６］～［９］のいずれか一項に記載のプロセス。
［１１］
前記ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質がモザイクｇｐ１４０タンパク質であり、好ましくは配列番号２を含む、［１０］に記載のプロセス。
［１２］
前記アフィニティー媒体樹脂が、リガンドの硫酸塩又は硫酸デキストランを含む、［１０］又は［１１］に記載のプロセス。
［１３］
前記ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質が、前記アフィニティー媒体樹脂に結合し、その後溶出される、［１０］～［１２］のいずれか一項に記載のプロセス。
［１４］
工程ｉ）の前記組成物が、バイオリアクター内の宿主細胞によって生成される、［６］～［１３］のいずれか一項に記載のプロセス。
［１５］
前記バイオリアクターが、約１Ｌ～約２００００Ｌ、好ましくは約１０Ｌ～約１６５００Ｌの容積を有する、［１４］に記載のプロセス。
［１６］
前記プロセスが、前記組成物のｐＨを約５．０に調整し、これにより工程ｉ）の前に前記組成物中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を沈殿させることを更に含む、［６］～［１５］のいずれか一項に記載のプロセス。
［１７］
前記精製されたＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質が、ウイルス捕捉濾過工程に供される、［６］～［１６］のいずれか一項に記載のプロセス。
［１８］
前記精製されたＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質が、限外濾過（ＵＦ）及びダイアフィルトレーション（ＤＦ）に供される、［６］～［１７］のいずれか一項に記載のプロセス。
［１９］
前記精製されたＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質が、最終製剤工程に供される、［６］～［１８］のいずれか一項に記載のプロセス。
［２０］
［１］～［１９］のいずれか一項に記載の方法によって単離されたタンパク質、及び薬学的に許容される担体を含むワクチン。

本明細書に記載される実施例及び実施形態は例示の目的のためのものに過ぎず、その広範な発明概念から逸脱することなく上記に記載される実施形態に対する変更が可能であることは理解されよう。従って、本発明は、開示されている特定の実施形態に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の趣旨及び範囲に含まれる変形例を包含することを意図することが理解されよう。

Claims (14)

1. ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を精製するためのプロセスであって、
   ｉ）ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質、及び他の所望されないタンパク質、例えば、ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を発現する宿主細胞に由来する宿主細胞タンパク質を含む組成物を提供する工程と、
   ｉｉ）疎水性相互作用特性及び陽イオン交換特性を含むマルチモーダル樹脂上で前記ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を捕捉し、前記マルチモーダル樹脂から前記ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を含む精製分画を溶出する工程と、
   ｉｉｉ）工程ｉｉ）の前記精製分画を陰イオン交換樹脂に加え、前記ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を結合させ、前記陰イオン交換樹脂から前記ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を含む更に精製された画分を溶出する工程と、
   ｉｖ）工程ｉｉｉ）の前記更に精製された画分を陰イオン交換機能及び疎水性機能を有するマルチモーダル樹脂に供し、更に精製されたＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を溶出する工程と
   を含むプロセス。
2. 前記ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質がクレードＣ ｇｐ１４０タンパク質であり、好ましくは配列番号１を含む、請求項１に記載のプロセス。
3. 前記ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質が、工程ｉｉ）で前記マルチモーダル樹脂に結合し、その後溶出される、請求項１又は２に記載のプロセス。
4. 工程ｉｖ）の前記マルチモーダル樹脂が、フロースルーモードで使用される、請求項１～３のいずれか一項に記載のプロセス。
5. 工程ｉｉｉ）のＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質の前記更に精製された画分をアフィニティー媒体樹脂に加え、好ましくはこの画分を工程ｉｖ）に供する前に、前記樹脂から前記ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質を含む更に精製された画分を溶出する工程を更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のプロセス。
6. 前記ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質がモザイクｇｐ１４０タンパク質であり、好ましくは配列番号２を含む、請求項５に記載のプロセス。
7. 前記アフィニティー媒体樹脂が、リガンドの硫酸塩又は硫酸デキストランを含む、請求項５又は６に記載のプロセス。
8. 前記ＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質が、前記アフィニティー媒体樹脂に結合し、その後溶出される、請求項５～７のいずれか一項に記載のプロセス。
9. 工程ｉ）の前記組成物が、バイオリアクター内の宿主細胞によって生成される、請求項１～８のいずれか一項に記載のプロセス。
10. 前記バイオリアクターが、約１Ｌ～約２００００Ｌ、好ましくは約１０Ｌ～約１６５００Ｌの容積を有する、請求項９に記載のプロセス。
11. 前記プロセスが、前記組成物のｐＨを約５．０に調整し、これにより工程ｉ）の前に前記組成物中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を沈殿させることを更に含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のプロセス。
12. 前記精製されたＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質が、ウイルス捕捉濾過工程に供される、請求項１～１１のいずれか一項に記載のプロセス。
13. 前記精製されたＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質が、限外濾過（ＵＦ）及びダイアフィルトレーション（ＤＦ）に供される、請求項１～１２のいずれか一項に記載のプロセス。
14. 前記精製されたＨＩＶ－１ ｇｐ１４０タンパク質が、最終製剤工程に供される、請求項１～１３のいずれか一項に記載のプロセス。
    
    

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