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JP7162929B2 - Ｂ７タンパク質をコードする腫瘍溶解性アデノウイルス - Google Patents

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Description

本開示は、少なくともＢ７タンパク質、例えば、ＣＤ８０またはその活性フラグメントをコードする導入遺伝子を含む腫瘍溶解性アデノウイルス、それを含む組成物ならびに治療、特に癌治療へのウイルスおよび組成物の使用に関する。
癌は、患者とその家族の困難および苦痛のほかにも、患者の治療、ケアおよびサポートにかかる金銭的費用の高さの点で現在も大きな社会的負担となっている。現在、健常者では免疫系が日常的に癌性細胞を排除しているものと考えられている。一方、癌患者では、このような排除に関与する１つまたは複数の防衛機序がダウンレギュレートされたり、完全に停止したりする。
現在、腫瘍は、自身が成長できるようその微小環境を変化させることが知られている。このことは、腫瘍が細胞外に放出するシグナルが、例えば腫瘍の血管新生を促進し、かつ／または局所的な免疫抑制もしくは免疫寛容を誘導することによって起こる。
多数の様々な前臨床研究および臨床研究から、腫瘍内の微小環境が抗腫瘍免疫応答の発現および活性を抑制し得ることが明らかにされており、多岐にわたる機序が何らかの役割を果たしている可能性があることが示されている。特に、免疫抑制機序によってＴ細胞が腫瘍細胞に対する殺作用を最終的に媒介しなくなる。抑制機序としては、Ｔ細胞が腫瘍組織に侵入できないようにすること、実際に腫瘍に入るＴ細胞の活性化を阻害することのほか、腫瘍細胞タンパク質を調節してＴ細胞のそのタンパク質に対する認識能または応答能を低下させることを挙げることができる。腫瘍進行を支えるうえでこのような免疫抑制経路が重要であることは、２種類のそのような抑制経路の受容体に対する抗体であるＣＴＬＡ４およびＰＤ－１／ＰＤＬ１が示す臨床効果によって具体的に明らかにされており、これにより、メラノーマをはじめとする癌の治療に対して両抗体の販売が承認されている。
Ｂ７は、活性化抗原提示細胞（ＡＰＣ）にみられる表在性膜タンパク質の一種であり、Ｔ細胞上の表面タンパク質ＣＤ２８またはＣＤ１５２（ＣＴＬＡ－４）と対になると、それぞれ共刺激シグナルまたは共抑制シグナルを発生して、抗原提示細胞（ＡＰＣ）とＴ細胞との間のＭＨＣ－ＴＣＲシグナルの活性を増大または低下させ得る。Ｂ７は活性化ＡＰＣ上に存在することに加え、Ｔ細胞そのものにもみられる。
抗原に対する免疫系の活性化にはいくつかの段階がある。最初にＴ細胞受容体が、その特異的ペプチド抗原（Ａｇ）と主要組織適合複合体（ＭＨＣ）表面タンパク質とが結合した複合体と相互作用しなければならない。Ｔ細胞表面上のＣＤ４タンパク質またはＣＤ８タンパク質がＭＨＣと相互作用して、抗原結合鎖二量体（アルファ／ベータまたはガンマ／デルタ）とＣＤ３シグナル伝達複合体（ガンマ鎖、デルタ鎖、イプシロン鎖およびゼータ鎖を含む）の両方を含むＴ細胞受容体複合体とＭＨＣ／Ａｇとの相互作用を安定化させる。これは「シグナル１」とも呼ばれ、その主な目的は、最初のシグナル伝達を生じさせ、Ｔ細胞活性化の抗原特異性を確保することである。
しかし、ＭＨＣ結合のみではエフェクターＴ細胞の完全な分化および活性化を刺激するのに十分ではない。実際、さらなる刺激シグナルがないと、Ｔ細胞が反応不顕性になり得る。免疫応答を続行させるのに必要な共刺激シグナルは、Ｂ７－ＣＤ２８相互作用およびＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ相互作用から生じ得る。これ以外にも免疫応答に何らかの役割を果たす活性化シグナルがいくつかある。例えば、ＴＮＦ分子ファミリーのうち、Ｔ細胞上のタンパク質４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）はＡＰＣ上の４－１ＢＢＬと結合し得る。
Ｂ７（ＣＤ８０／Ｂ７－１および／またはＣＤ８６／Ｂ７－２）タンパク質はＡＰＣ表面上に存在し、Ｔ細胞表面上のＣＤ２８受容体と相互作用する。これが「シグナル２」の発生源の１つとなる（サイトカインはＴ細胞活性化にも寄与すると考えられ、「シグナル３」と呼ばれることがある）。この相互作用によって標的Ｔ細胞の生存、活性化およびエフェクター細胞への分化を促進する一連の下流シグナルが生じ、これがウイルス感染細胞または腫瘍細胞に対する殺作用および炎症細胞の動員などの免疫応答の諸相を媒介し得る。
Ｔ細胞応答の開始には通常、抗原提示細胞によって刺激シグナルおよび共刺激シグナルがもたらされ、ＣＤ４ Ｔ細胞応答およびＣＤ８ Ｔ細胞応答の両方が誘導される。しかし、エフェクターＣＤ８ Ｔ細胞は、腫瘍細胞を含めたほとんどの有核細胞上に存在するＭＨＣクラスＩ分子と結合したそのＡｇを認識する。それでも本発明者らには、Ｔ細胞を活性化するシグナルが同じ細胞または細胞型に由来するものである必要はないと考える理由がある。したがって、例えば癌細胞の表面上の免疫系に１つまたは複数のこれらのシグナル（すなわち、刺激性シグナルおよび／または共刺激シグナル）を供給するのが有用であると考えられる。
ＰＤ－１（プログラム細胞死タンパク質１）および／またはそのリガンドＰＤＬ１（Ｂ７－Ｈ１としても知られる）の活性が、例えば癌における免疫応答のダウンレギュレーションに重要な役割を果たしていると考えられることから、現在、この経路の阻害に大きな注目が集まっている。
一方、ＣＤ８０（Ｂ７－１）がＴ細胞上のＣＤ２８と結合することによってＴ細胞共刺激因子としての役割を果たすのみならず、例えば同じ細胞膜上に発現すると、ＰＤＬ１に結合し、ＰＤＬ１－ＰＤ１阻害シグナル伝達相互作用を阻止し得ることを示唆する研究もある。このように、ＣＤ８０は、２つの異なる方法で作用することによって、ヒトＴ細胞の活性化を回復または増大させるのに有望でより有用な分子となる可能性を秘めていると思われる。このほか、可溶型ＣＤ８０がＰＤＬ１－ＰＤ１を介するＴ細胞阻害を打ち消すことが可能であると思われ、例えば、Ｈａｉｌｅら，Ｓｏｌｕｂｌｅ ＣＤ８０ Ｒｅｓｔｏｒｅｓ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ Ｌｉｇａｎｄ １－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１３；１９１：２８２９－２８３６を参照されたい。これまでにＣＤ８０－Ｆｃ融合タンパク質が作製され、安全性および有効性の試験の段階にあり、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１４，１９３：３８３５－３８４１を参照されたい。
本発明者らは、Ｂ７タンパク質またはその活性フラグメントを腫瘍溶解性ウイルスによって、例えば癌細胞の表面に送達して発現させれば、患者自身の免疫系を活性化させて癌と戦わせるのに有用であると考える。
さらに、ＣＤ８０などのＢ７タンパク質を単純に全身投与すれば、望ましくない方法で全身の免疫応答を刺激する可能性がある。本発明者らは、有益な治療効果が得られオフターゲット効果が最小限に抑えられる適切な治療域をもたらすには、これらのタンパク質をより洗練された形で送達する必要があるものと考える。
したがって、癌細胞に対する選択性を有する腫瘍溶解性アデノウイルスであって、ウイルスに内在するプロモーターの制御下に導入遺伝子を含み、導入遺伝子が、Ｂ７タンパク質またはその活性フラグメントをコードするＤＮＡ配列を含む、アデノウイルスを提供する。これは、本開示による腫瘍溶解性ウイルスが癌細胞に優先的に感染し、それにより癌が作り出した微小環境に侵入するため、有益なものである。癌細胞内に入ると、ウイルスがコードするＢ７タンパク質が、例えば細胞表面（すなわち、癌細胞表面）に発現し得る。このことは、Ｂ７タンパク質が生物学的な活性を示し得る所望の位置にあることから有利である。
一実施形態では、コードされるＢ７タンパク質は、細胞表面のタンパク質に係留することが可能な配列、例えば膜貫通ドメイン配列、ＧＰＩアンカーなどを含む。
したがって、一実施形態では、特に癌細胞表面でＢ７タンパク質またはＢ７分子を発現する本開示のウイルスを癌細胞に感染させ、ここでは、Ｂ７タンパク質は、少なくとも共刺激シグナル、すなわちシグナル２を発生させてＴ細胞を活性化するのに適しており、かつ／または局所微小環境の癌細胞をはじめとする細胞の表面に発現するＰＤ－Ｌ１と結合してこの活性を阻害し得るものである。
一実施形態では、Ｂ７配列は、Ｂ７タンパク質由来の膜貫通要素、例えば、特定のＢ７タンパク質に天然の膜貫通要素または具体的に発現するものとは「異なる」Ｂ７タンパク質由来の膜貫通ドメインを含む。
Ｂ７タンパク質は表面発現タンパク質であり、ほかにも、例えば少なくともＢ７タンパク質の膜貫通ドメインを追加のタンパク質と結合させた場合、癌細胞表面に追加のタンパク質を運搬するのに用いることができる。
したがって、一態様では、癌細胞に対する選択性を有する複製可能な腫瘍溶解性アデノウイルスであって、ウイルスに内在するプロモーターの制御下に導入遺伝子を含み、導入遺伝子が、Ｂ７タンパク質またはその活性フラグメントをコードするＤＮＡ配列を含む、ウイルスを提供する。
このほか、請求項１に記載の複製可能な腫瘍溶解性ウイルスであって、Ｂ７タンパク質またはその活性フラグメントが、Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７－ＤＣ、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ５およびＢ７－Ｈ６を含む群より独立して選択され、特にＢ７タンパク質がＢ７－１（ＣＤ８０）またはその活性フラグメントである、ウイルスを提供する。
一実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスはＢ群アデノウイルスである。
一実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスはキメラウイルスである。
一実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは、ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ（ＥｎＡｄとも呼ばれる）である骨格を有する。
一実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは式（Ｉ）：
５’ＩＴＲ－Ｂ１－ＢＡ－Ｂ２－ＢＸ－ＢＢ－ＢＹ－Ｂ３－３’ＩＴＲ
（Ｉ）
を有し、
Ｂ１は、Ｅ１Ａ、Ｅ１ＢまたはＥ１Ａ－Ｅ１Ｂを含み；
ＢＡはＥ２Ｂ－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３－Ｅ２Ａ－Ｌ４であり；
Ｂ２は、結合であるか、例えば内在性プロモーターまたは外来プロモーターの下にＥ３または導入遺伝子を含み；
ＢＸは、結合であるか、制限部位、１つもしくは複数の導入遺伝子またはその両方を含むＤＮＡ配列であり；
ＢＢはＬ５を含み；
ＢＹは、Ｂ７タンパク質またはその活性フラグメントをコードする導入遺伝子を含み；
Ｂ３は、結合であるか、Ｅ４を含む。
一実施形態では、請求項１～７のいずれか１項に記載の複製可能な腫瘍溶解性ウイルスにおいて、Ｂ７タンパク質またはその活性フラグメントが、膜貫通配列、例えばＰＤＧＦ受容体由来の膜貫通ドメインまたは細胞膜内にタンパク質もしくはフラグメントを係留するのに適したＧＰＩアンカーを含む。
一実施形態では、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは、例えばサイトカイン、ケモカイン、アンタゴニスト抗体分子またはそのフラグメントおよびアゴニスト抗体分子またはそのフラグメントを含む群より選択されるポリペプチドをコードする、第二の導入遺伝子をさらに含む。
一実施形態では、例えばサイトカイン、ケモカイン、抗体、例えばアンタゴニスト抗体分子もしくはそのフラグメントまたはアゴニスト抗体分子もしくはそのフラグメントなどを含む群より選択される２つの異なるポリペプチドをコードする、第二の導入遺伝子および第三の導入遺伝子。
一実施形態では、第二の導入遺伝子または第三の導入遺伝子は、ＩＬ－２、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、Ｆｌｔ３リガンド、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１５およびＩＬ－１２を含む群より選択されるサイトカインをコードする。
一実施形態では、第二の導入遺伝子または第三の導入遺伝子は、ＭＩＰ１α、ＩＬ－８、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１を含む群より選択されるケモカインをコードする。
一実施形態では、Ｍｉｐ１αとＦｌｔ３リガンドおよびＭＩＰ１αとＩＦＮαを含む群より選択されるサイトカインとケモカインの組合せがウイルスによってコードされる。
一実施形態では、ウイルスは、例えば、細胞膜係留型になるよう膜貫通配列またはＧＰＩアンカーを含むか、例えばＰＤＧＦ受容体由来の膜貫通ドメインを含む、抗体分子またはそのフラグメントをコードする。
一実施形態では、抗体分子またはその結合フラグメントは抗ヒトＣＤ３抗原結合ドメインを含む。
一実施形態では、抗体分子は、例えば、血管新生因子の阻害物質、例えば抗ＶＥＧＦ抗体分子などおよびＴ細胞不活化因子の阻害物質、例えば抗ＣＴＬＡ－４抗体分子などを含む群より選択される、阻害物質である。
一実施形態では、抗体分子は、例えばＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７および４－１ＢＢを含む群より選択される１つまたは複数のものに対するアゴニストである。
一実施形態では、ウイルスがコードする１つまたは複数の外来タンパク質は、癌細胞表面での発現に適した形態である。
Ｔ細胞による抗原提示細胞または腫瘍細胞の認識に関与する重要な分子の一部および応答Ｔ細胞内で誘導されるシグナル伝達事象の一部を示す図である。このほか、ＰＤＬ１の構造およびＰＤ１のＩｇＶドメインとの相互作用が示されている。 Ｂ７ファミリーリガンドおよびＣＤ２８ファミリー受容体の結合パートナーの一部を示す図である。 ヒトＣＤ８０を発現するウイルス（図３Ａ）、ヒトＩＦＮαおよびヒトＣＤ８０を共発現するウイルス（図３Ｂ）、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖおよびヒトＣＤ８０を共発現するウイルス（図３Ｃ）、ヒトＦｌｔ３Ｌ、ヒトＭＩＰ１αおよびヒトＩＦＮαを共発現するウイルス（図３Ｄ）、ヒトＦｌｔ３Ｌ、ヒトＭＩＰ１αおよびヒトＣＤ８０を共発現するウイルス（図３Ｅ）、ヒトＩＦＮα、ヒトＭＩＰ１αおよびヒトＣＤ８０を共発現するウイルス（図３Ｆ）の導入遺伝子カセットの模式図ならびにオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）またはＯＫＴ３ ｓｃＦｖ（図３Ｇ）の模式図である。 ヒトＣＤ８０を発現するウイルス（図３Ａ）、ヒトＩＦＮαおよびヒトＣＤ８０を共発現するウイルス（図３Ｂ）、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖおよびヒトＣＤ８０を共発現するウイルス（図３Ｃ）、ヒトＦｌｔ３Ｌ、ヒトＭＩＰ１αおよびヒトＩＦＮαを共発現するウイルス（図３Ｄ）、ヒトＦｌｔ３Ｌ、ヒトＭＩＰ１αおよびヒトＣＤ８０を共発現するウイルス（図３Ｅ）、ヒトＩＦＮα、ヒトＭＩＰ１αおよびヒトＣＤ８０を共発現するウイルス（図３Ｆ）の導入遺伝子カセットの模式図ならびにオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）またはＯＫＴ３ ｓｃＦｖ（図３Ｇ）の模式図である。 ＥｎＡｄ（ＣｏｌｏＡｄ１）およびヒトＣＤ８０をコードするウイルスＮＧ－３３０のＨＴ－２９腫瘍細胞（図４Ａ）およびＡ５４９腫瘍細胞（図４Ｂ）での複製を示す図である。 ＮＧ－３３０感染後の様々な時間におけるＡ５４９腫瘍細胞（図５Ａ）またはＨＴ－２９腫瘍細胞（図５Ｂ）の膜でのＣＤ８０の発現を蛍光免疫染色によって示す図である。ＥｎＡｄも未感染腫瘍細胞（ＵＩＣ）も細胞膜にＣＤ８０の発現はみられなかった。 ＨＴ－２９細胞毒性アッセイでＥｎＡｄとＮＧ－３３０の腫瘍溶解能が同程度であることを示す図である。したがって、ＮＧ－３３０は、その腫瘍溶解特性を保持すると同時に導入遺伝子も保有している。 ＥｎＡｄとＣＤ８０＋ＩＦＮα発現ＮＧ－３４３ウイルスの腫瘍溶解能が同程度であること（図７Ａ）ならびにＮＧ－３４３を感染させたＨＴ－２９腫瘍細胞およびＡ５４９腫瘍細胞による最大７２時間にわたるＩＦＮαの分泌を示す図である。 感染から４８時間後または７２時間後のＣＤ８０発現および腫瘍細胞殺作用を抗ＣＤ８免疫染色および細胞生存染色を用いたＦＡＣＳ解析によって示す図である。ＮＧ－３４３処理細胞は生存細胞および死滅細胞ともに細胞表面にＣＤ８０を検出することができたが、ＥｎＡｄまたは未感染対照（ＵＩＣ）Ａ５４９腫瘍細胞には検出することができなかった（図８Ａ～８Ｄ）。Ａ５４９腫瘍細胞、ＨＴ－２９腫瘍細胞ともに同程度のＣＤ８０発現がみられた（図８Ｅ）。 感染から４８時間後または７２時間後のＣＤ８０発現および腫瘍細胞殺作用を抗ＣＤ８免疫染色および細胞生存染色を用いたＦＡＣＳ解析によって示す図である。ＮＧ－３４３処理細胞は生存細胞および死滅細胞ともに細胞表面にＣＤ８０を検出することができたが、ＥｎＡｄまたは未感染対照（ＵＩＣ）Ａ５４９腫瘍細胞には検出することができなかった（図８Ａ～８Ｄ）。Ａ５４９腫瘍細胞、ＨＴ－２９腫瘍細胞ともに同程度のＣＤ８０発現がみられた（図８Ｅ）。 ＥｎＡｄ、ＮＧ－３４３ともに腫瘍細胞（ＨＴ－２９）および非腫瘍細胞（ＭＲＣ５細胞、ＷＩ３８細胞および気管支上皮細胞）でのウイルス複製が同程度であることを示す図であり、非腫瘍細胞では、複製のレベルがはるかに低く（図９Ａ）、ＮＧ－３４３感染後のＩＦＮα分泌（図９Ｂ）およびＣＤ８０発現（図９Ｃ）はＨＴ－２９腫瘍細胞にのみ検出された。 ＥｎＡｄ、ＮＧ－３４３ともに腫瘍細胞（ＨＴ－２９）および非腫瘍細胞（ＭＲＣ５細胞、ＷＩ３８細胞および気管支上皮細胞）でのウイルス複製が同程度であることを示す図であり、非腫瘍細胞では、複製のレベルがはるかに低く（図９Ａ）、ＮＧ－３４３感染後のＩＦＮα分泌（図９Ｂ）およびＣＤ８０発現（図９Ｃ）はＨＴ－２９腫瘍細胞にのみ検出された。 ＮＧ－３４３を感染させたＡ５４９腫瘍細胞によって、ＰＢＭＣ共培養物のＤＣ表面のＣＤ８０およびＰＤ－Ｌ１の両方の表面レベルが、ＥｎＡｄ感染腫瘍細胞培養物または未感染腫瘍細胞培養物と比較して増大し得ることを示す図である。 ＮＧ－３４７ウイルスを感染させたＨＴ－２９腫瘍細胞（図１１Ａおよび１１Ｃ）およびＡ５４９腫瘍細胞（図１１Ｂおよび１１Ｃ）によるＩＦＮαおよびＣＤ８０の発現を示す図である。 ＮＧ－３４７ウイルスを感染させたＨＴ－２９腫瘍細胞（図１１Ａおよび１１Ｃ）およびＡ５４９腫瘍細胞（図１１Ｂおよび１１Ｃ）によるＩＦＮαおよびＣＤ８０の発現を示す図である。 ＮＧ－３４５ウイルスを感染させたＡ５４９腫瘍細胞によるＭＩＰ１α（図１２Ａ）、ＩＦＮα（図１２Ｂ）およびＦｌｔ３Ｌ（図１２Ｃ）の発現を示す図である。 ＨＴ－２９細胞傷害性アッセイでＥｎＡｄウイルス、ＮＧ－３４７ウイルスおよびＮＧ－３４８ウイルスの腫瘍溶解能（図１３Ａおよび１３Ｂ）および感染力（図１３Ｃ）が同程度であることを示す図である。 ＮＧ－３４７ウイルスまたはＮＧ－３４８ウイルスを感染させたＡ５４９腫瘍細胞の細胞表面には４８時間後までにＣＤ８０が高発現するが、ＥｎＡｄを感染させてもＣＤ８０はほとんどないし全く発現しないことを示す図である。 ＮＧ－３４７ウイルスまたはＮＧ－３４８ウイルスを感染させたＡ５４９腫瘍細胞の細胞表面には４８時間後までにＣＤ８０が高発現するが、ＥｎＡｄを感染させてもＣＤ８０はほとんどないし全く発現しないことを示す図である。 ＮＧ－３４７ウイルスまたはＮＧ－３４８ウイルスを感染させたＤＬＤ－１腫瘍細胞の細胞表面には４８時間後までにＣＤ８０が高発現するが、ＥｎＡｄを感染させてもＣＤ８０はほとんどないし全く発現しないことを示す図である。 ＮＧ－３４７ウイルスまたはＮＧ－３４８ウイルスを感染させたＤＬＤ－１腫瘍細胞の細胞表面には４８時間後までにＣＤ８０が高発現するが、ＥｎＡｄを感染させてもＣＤ８０はほとんどないし全く発現しないことを示す図である。 ＮＧ－３４８を感染させヒトＣＤ３＋Ｔ細胞と共培養したＥｐＣａｍ＋Ａ５４９細胞にはＣＤ８０が発現するが、ＥｎＡｄを感染させた場合には発現しないことを示す図である。 ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞をＮＧ－３４８感染Ａ５４９細胞と共培養するとＣＤ２５がアップレギュレートされるが、感染がＥｎＡｄによるものである場合（図１７Ａ）、ＣＤ２５＋細胞の割合（図１７Ｂ）も１細胞当たりのＣＤ２５発現レベル（図１７Ｃ）も増大しないことを示す図である。 ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞をＮＧ－３４８感染Ａ５４９細胞と共培養するとＣＤ２５がアップレギュレートされるが、感染がＥｎＡｄによるものである場合（図１７Ａ）、ＣＤ２５＋細胞の割合（図１７Ｂ）も１細胞当たりのＣＤ２５発現レベル（図１７Ｃ）も増大しないことを示す図である。 ＣＤ４＋およびＣＤ４－（主としてＣＤ８）ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞サブセットをＮＧ－３４８感染Ａ５４９細胞と共培養すると、ともにＣＤ２５がアップレギュレートされるが、感染がＥｎＡｄによるものである場合はアップレギュレートされないことを示す図である。 ＣＤ４＋およびＣＤ４－（主としてＣＤ８）ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞サブセットをＮＧ－３４８感染Ａ５４９細胞と共培養すると、ともにＣＤ２５がアップレギュレートされるが、感染がＥｎＡｄによるものである場合はアップレギュレートされないことを示す図である。 ＮＧ－３４８またはＥｎＡｄを感染させたＡ５４９細胞と共培養したヒトＣＤ３＋Ｔ細胞のＨＬＡ－ＤＲ発現レベルが低いことを示す図である。 生存ＣＤ３＋Ｔ細胞をＮＧ－３４８感染Ａ５４９細胞と共培養すると、その表面にＣＤ１０７ａの発現が誘導されるが、感染がＥｎＡｄによるものである場合は誘導されないことを示す図である。 ＣＤ４＋およびＣＤ４－ＣＤ３＋Ｔ細胞サブセットをＮＧ－３４８感染Ａ５４９細胞と共培養すると、ともにその表面にＣＤ１０７ａの発現が誘導されるが、感染がＥｎＡｄによるものである場合は誘導されないことを示す図である。 ＣＤ４＋およびＣＤ４－ＣＤ３＋Ｔ細胞サブセットをＮＧ－３４８感染Ａ５４９細胞と共培養すると、ともにその表面にＣＤ１０７ａの発現が誘導されるが、感染がＥｎＡｄによるものである場合は誘導されないことを示す図である。 ＣＤ３＋Ｔ細胞をＮＧ－３４８感染Ａ５４９細胞と共培養すると、そのＩＬ－２産生（図２２Ａ）およびＩＦＮγ産生（図２２Ｂ）が誘導されるが、感染がＥｎＡｄによるものである場合、ＩＬ－２産生は全くみられず、ＩＦＮγ産生は低レベルにとどまることを示す図である。 ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＣＤ３＋Ｔ細胞をＮＧ－３４８感染Ａ５４９細胞と共培養すると、ともにそのＩＦＮγ産生が誘導される（図２２Ｂ）が、感染がＥｎＡｄによるものである場合、ＩＦＮγ産生は全くみられない（ＣＤ４＋細胞）か低値（ＣＤ８＋細胞）であることを示す図である。 ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞をＮＧ－３４７感染Ａ５４９細胞と共培養した場合、感染がＥｎＡｄによるものである場合よりもＣＤ６９がアップレギュレートされることを示す図である。 ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞をＮＧ－３４７感染Ａ５４９細胞と共培養すると、そのＩＦＮγ産生が誘導されるが、感染がＥｎＡｄによるものである場合は誘導されないことを示す図である。 ＮＧ－３４８Ａ、ＮＧ－４２０およびＮＧ－４２０Ａの導入遺伝子カセットの模式図である。 ＥｎＡｄ、ＮＧ－３４７およびＮＧ－３４８のゲノム複製およびヘキソン遺伝子発現（ｍＲＮＡレベル）をＭＲＣ－５線維芽細胞とＡ５４９腫瘍細胞とで比較したものを示す図である。 ウイルスＮＧ－３４８のＣＤ８０および抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ導入遺伝子のｍＲＮＡならびにＣＤ８０導入遺伝子タンパク質（フローサイトメトリー）の発現をＭＲＣ－５線維芽細胞とＡ５４９腫瘍細胞とで比較したものを示す図である。 ウイルスＮＧ－３４７のＣＤ８０導入遺伝子ｍＲＮＡおよびＣＤ８０導入遺伝子タンパク質をＭＲＣ－５線維芽細胞とＡ５４９腫瘍細胞とで比較したものを示す図である。 ウイルスＮＧ－３４７が産生したＭＩＰ１αおよびＩＦＮαのｍＲＮＡおよび分泌タンパク質のレベルをＭＲＣ－５線維芽細胞とＡ５４９腫瘍細胞とで比較したものを示す図である。 精製ヒトＴ細胞培養物でのＥｎＡｄ、ＮＧ－３４７およびＮＧ－３４８のゲノム複製およびヘキソン遺伝子発現（ｍＲＮＡレベル）を示す図である。 ウイルスＮＧ－３４８のＣＤ８０および抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ導入遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現（フローサイトメトリー）をヒトＴ細胞とＡ５４９腫瘍細胞とで比較したものを示す図である。 ウイルスＮＧ－３４７のＣＤ８０導入遺伝子ｍＲＮＡおよびＣＤ８０導入遺伝子タンパク質を精製ヒトＴ細胞とＡ５４９腫瘍細胞とで比較したものを示す図である。 ウイルスＮＧ－３４７が産生したＩＦＮα導入遺伝子およびＭＩＰ１α導入遺伝子のｍＲＮＡをＴ細胞とＡ５４９腫瘍細胞とで比較したものを示す図である。 ＮＧ－３４７およびＮＧ－３４８のゲノム複製およびヘキソン遺伝子発現をヒトＰＢＭＣとＡ５４９腫瘍細胞とで比較したものを示す図である。 ウイルスＮＧ－３４８が産生したＣＤ８０および抗ＣＤ３ ｓｃＦｖのｍＲＮＡをＰＢＭＣとＡ５４９腫瘍細胞とで比較したものを示す図である。 ウイルスＮＧ－３４７が産生したＣＤ８０、ＩＦＮαおよびＭＩＰ１αのｍＲＮＡをＰＢＭＣとＡ５４９腫瘍細胞とで比較したものを示す図である。 細胞表面でのＣＤ１４発現のダウンレギュレーションおよびＣＤ８０のアップレギュレーションによって測定されるＥｎＡｄウイルス粒子、ＮＧ－３４７ウイルス粒子およびＮＧ－３４８ウイルス粒子によるヒト樹状細胞の活性化が同程度であることを示す図である。 ＮＧ－３４８（Ａ）またはＮＧ－３４７（Ｂ）と培養したＰＢＭＣからの粒子媒介性ＭＩＰ１αタンパク質およびＩＦＮαタンパク質分泌がＥｎＡｄと比較して同程度であることを示す図である。 ＮＧ－３４７またはＮＧ－３４８のゲノム複製をＭＲＣ－５線維芽細胞との共培養物またはＴ細胞またはＰＢＭＣとＡ５４９腫瘍細胞との共培養物とで比較したものを示す図である。 ＰＢＭＣまたはＴ細胞とＭＲＣ－５線維芽細胞との共培養によって分泌されたＩＮＦγをＡ５４９腫瘍細胞およびＥｎＡｄまたはウイルスＮＧ－３４８で処理した同細胞との共培養の場合と比較したものを示す図である。 ＥｎＡｄウイルス粒子、ＮＧ－３４７ウイルス粒子またはＮＧ－３４８ウイルス粒子で処理したヒト樹状細胞によって分泌されたＭＩＰ１αおよびＩＦＮαを示す図である。 ＥｎＡｄ、ＮＧ－３４７またはＮＧ－３４８を感染させたＡ５４９腫瘍細胞と共培養したＪｕｒｋａｔＤｕａｌレポーターＴ細胞でのＮＦκＢレポーター遺伝子およびＩＦＮレポーター遺伝子の活性化を示す図である。 ＥｎＡｄ、ＮＧ－３４７、ＮＧ－３４８またはＮＧ－４２０で処理したＡ５４９腫瘍細胞、ＨＣＴ－１１６腫瘍細胞、ＤＬＤ腫瘍細胞およびＨＴ２９腫瘍細胞と共培養したＪｕｒｋａｔＤｕａｌレポーターＴ細胞にＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポーター活性がみられることを示す図である。 ウイルスＮＧ－３４８およびウイルスＮＧ－４２０を感染させたＡ５４９腫瘍細胞またはＨＴ２９腫瘍細胞と共培養したＪｕｒｋａｔＤｕａｌ細胞に、添加したウイルス粒子数に応じてＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポーター活性がみられることを示す図である。 ＥｎＡｄおよびウイルスＮＧ－３４８の血中薬物動態；ＥｎＡｄまたはウイルスＮＧ－３４８に曝露したときの血中サイトカインレベル；ＣＤ１マウスにＩＶ投与してから６時間後または２４時間後のＥｎＡｄウイルスまたはＮＧ－３４８ウイルスの組織生体内分布を示す図である。 皮下ＨＣＴ－１１６腫瘍異種移植片を担持するＣＢ１７－ＳＣＩＤマウスにＩＶ投与したときのＥｎＡｄウイルス、ＮＧ－３４７ウイルスおよびＮＧ－３４８ウイルスの血中薬物動態を示す図である。 腫瘍担持ＣＢ１７－ＳＣＩＤマウスに静脈内投与してから６時間後のＥｎＡｄウイルス、ＮＧ－３４７ウイルスおよびＮＧ－３４８ウイルスの組織内分布ならびにＥｎＡｄ、ＮＧ－３４７およびＮＧ－３４８の静脈内投与後または腫瘍内投与後第７日および第１４日～２１日のＨＣＴ－１１６腫瘍異種移植片内のウイルスゲノム数を示す図である。 静脈内投与後または腫瘍内投与後第７日または第１４日～２１日にＨＣＴ－１１６腫瘍異種移植片内でＥｎＡｄウイルス、ＮＧ－３４７ウイルスまたはＮＧ－３４８ウイルスによって産生されたウイルスヘキソンｍＲＮＡを示す図である。 ウイルスＮＧ－３４８の静脈内投与後第７日または第２１日のＨＣＴ－１１６腫瘍異種移植片のヘキソンおよびＣＤ８０導入遺伝子のｍＲＮＡレベルを示す図である。 ウイルスＮＧ－３４８のＩＶ投与後第７日または第１４日～２１日のＨＣＴ－１１６腫瘍異種移植片の抗ＣＤ３ ＳｃＦｖをコードする導入遺伝子およびＣＤ８０をコードする導入遺伝子のｍＲＮＡレベルを示す図である。 ウイルスＮＧ－３４７の静脈内投与後第７日または第１４日～２１日のＨＣＴ－１１６腫瘍異種移植片のＭＩＰ１α導入遺伝子およびＩＦＮα導入遺伝子のｍＲＮＡレベルを示す図である。 ウイルスＮＧ－３４８の静脈内投与後第７日および第２１日のＨＣＴ－１１６腫瘍異種移植片でのＣＤ８０タンパク質発現ならびにウイルスＮＧ－３４７の静脈内投与後のＨＣＴ－１１６腫瘍でのＭＩＰ１αタンパク質およびＣＤ８０タンパク質の発現を示す図である。
Figure 0007162929000001
Figure 0007162929000002
（本開示の詳細な説明）
Ｂ７はタンパク質ファミリーの１つである。
本開示の腫瘍溶解性ウイルス内でコードされるＢ７タンパク質は、そのタンパク質ファミリーのメンバーの細胞外ドメインが一般に生物学的機能を調節することから有用なものであり得、例えば、Ｂ７－１細胞外ドメインを用いてＴ細胞をプライムまたは刺激し得る。実際の生物学的機能は、所与の各Ｂ７タンパク質の細胞外ドメインに固有のものである（すなわち、一般にＢ７ファミリーのタンパク質メンバーによって機能が異なる）。Ｂ７－１および／またはＢ７－２などのＢ７タンパク質の機能としてはほかにも、ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ－４と結合する能力のほか、特に、関連する１つまたは複数のシグナル伝達カスケードにシグナルを伝達したり、これを活性化したりする能力を挙げることができる。
上記のものに加えて、またはこれに代えて、Ｂ７タンパク質の膜貫通ドメインを用いて、例えば膜貫通ドメインと関連タンパク質のＣ末端とを融合することによって、本開示のウイルスがコードするタンパク質を癌細胞の表面に導くことができる。
本明細書で使用されるＢ７タンパク質は、文脈上そうでないことが明らかでない限り、Ｂ７ファミリーのタンパク質の完全長配列または同配列との類似性もしくは同一性が少なくとも９５％（例えば関連配列全体との類似性または同一性が９６％、９７％、９８％、９９％または１００％など）である配列を指す。Ｂ７ファミリーとしては、Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７－ＤＣ、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ５、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ７－Ｈ７が挙げられる。完全長タンパク質を用いる場合、一般に、そのタンパク質の正常な生物学的機能が少なくとも１つ存在する。
Ｂ７ファミリーに関して使用される完全長タンパク質は少なくとも細胞外ドメインを指し、これには、キメラＢ７タンパク質であって、キメラの配列がＢ７タンパク質の構造および機能を有し、キメラを構成する配列がＢ７ファミリーのタンパク質から選択されるものである、キメラＢ７タンパク質が含まれる。フラグメントまたは完全長のＢ７タンパク質中の要素は、同じＢ７タンパク質または異なるＢ７タンパク質に由来するものであり得る。したがって、一実施形態では、Ｂ７フラグメントまたはＢ７タンパク質はキメラである。
本明細書で使用されるキメラＢ７タンパク質は、キメラを構成する実質的にすべての配列がＢ７タンパク質に由来するものを指し、例えば、キメラの配列の少なくとも９８％が、互いに融合したＢ７タンパク質のフラグメントである。したがって、本明細書で使用されるキメラフラグメントは、２つ以上の異なるＢ７タンパク質に由来する配列を含むフラグメントを指す。
一実施形態では、完全長Ｂ７タンパク質は細胞外ドメイン、例えば単一のＢ７－１および／またはＢ７－２などのＢ７タンパク質に由来する細胞外ドメインを含む。
一実施形態では、完全長Ｂ７タンパク質は細胞外ドメインと膜貫通ドメイン、例えば同じＢ７タンパク質に由来する細胞外ドメインと膜貫通ドメイン、あるいはＢ７タンパク質（Ｂ７－１および／またはＢ７－２など）に由来する細胞外ドメインと、全く別のタンパク質に由来する膜貫通ドメインまたはこれに相当するもの、例えば脂質膜アンカーなどとを含む。
一実施形態では、完全長キメラＢ７タンパク質は、あるＢ７タンパク質（Ｂ７－１および／またはＢ７－２など）の細胞外ドメインと、別のＢ７タンパク質に由来する膜貫通とを含み得る。
一実施形態では、完全長Ｂ７タンパク質は細胞外ドメインと膜貫通ドメインと細胞内ドメイン、例えばすべて同じＢ７タンパク質に由来するものまたは２つ以上の異なるＢ７タンパク質に由来するものを含む。
本明細書で使用されるＢ７タンパク質の活性フラグメントはＢ７タンパク質の機能、例えば癌細胞表面での発現を促進する機能をはじめとするＢ７タンパク質の生物学的機能を少なくとも１つ有するフラグメントを指す。
一実施形態では、フラグメントは完全長タンパク質の少なくとも５０％の活性、例えば完全長タンパク質の６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の活性を有する。
一実施形態では、活性フラグメントは、Ｂ７細胞外ドメインまたは同ドメインとの類似性もしくは同一性が少なくとも９５％、例えば９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％などである配列を含むか、これよりなるものである。
一実施形態では、Ｂ７フラグメントは、Ｂ７タンパク質、特にＢ７－１などの本明細書に記載されるＢ７タンパク質に由来する膜貫通ドメインを含むか、これよりなるものである。後者を用いることは、細胞表面での発現に寄与するものと考えられる。
一実施形態では、活性Ｂ７フラグメントは細胞外ドメインの一部分であり得る。
活性フラグメント、例えば膜貫通フラグメントまたはより多くＢ７ドメインを含む大きいフラグメントを追加のタンパク質との融合タンパク質に用いて、例えば癌細胞表面での追加のタンパク質の発現を促進し得る。
本明細書で使用される大きいフラグメントは、大きさまたは重量そのものを指すのではなく、配列情報のレパートリーが多く（すなわち、フラグメントが少なくとも２つのＢ７ドメインに由来する配列を含み）、それがより多くの機能をもたらし得ることを指す。
一実施形態では、大きいフラグメントは、関連するＢ７タンパク質の一部の生物活性を含む。一実施形態では、活性Ｂ７フラグメントは、完全長タンパク質の基本的な生物活性、例えばＴ細胞をプライムまたは活性化する能力を保持しているフラグメントである。
所与のタンパク質フラグメントの活性を関連するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで、例えば本明細書の実施例に記載されるアッセイを用いて、例えば完全長タンパク質を対照に用いて分析し得る。活性フラグメントが膜貫通ドメインである場合、例えば本明細書の実施例に記載されるアッセイを用いて、膜貫通ドメインが結合している関連タンパク質の細胞表面での発現を分析することによって、活性を評価することができる。
完全長Ｂ７タンパク質が融合タンパク質の一部分である場合、Ｂ７部分と追加のタンパク質とを、ある配列の終端と次のタンパク質配列の始端との間のアミド結合によって結合させるか、リンカーによって連結させ得る。リンカーの例はのちに記載する。
膜貫通ドメインを含む完全長Ｂ７タンパク質を用いて、Ｂ７タンパク質の細胞外ドメインおよび同ドメインと融合または結合したタンパク質またはフラグメントを感染癌細胞の表面に提示させることができる。この実施形態では一般に、Ｂ７タンパク質が癌細胞の表面に結合し、「もう一方の」タンパク質がＮ末端および癌細胞表面の細胞外側にある。
それでも、タンパク質は所望の通りに配置することができ、例えば、Ｂ７細胞外ドメインをＮ末端側とし、そのＣ末端側に次のタンパク質またはフラグメントを融合または結合させ、次いでそのＣ末端側に膜貫通ドメイン、例えばＢ７タンパク質由来の膜貫通ドメインを融合または結合させることができる。
一般に、融合タンパク質に完全長Ｂ７タンパク質を用いる場合、Ｂ７タンパク質と追加のタンパク質はともに生物学的機能を有する。
本明細書で使用される融合タンパク質は、互いに直接融合しているか、例えばリンカーによって互いに連結している、少なくとも２つのタンパク質もしくはフラグメントまたは少なくとも１つのタンパク質と少なくとも１つのフラグメントの組合せを指す。
本明細書で使用される融合は一般に、あるポリペプチド（またはタンパク質／フラグメント）の終端と次のポリペプチド（またはタンパク質／フラグメント）の始端との間のアミド結合を指す。
結合は、文脈上そうでないことが明らかでない限り、２つの実態、例えば２つのポリペプチド配列などがリンカーを介して連結されていることを指す。リンカーとは、両ポリペプチドに天然には存在しない配列または両ポリペプチドに対してその特定の位置に存在しない配列のことである。
一実施形態では、融合タンパク質はＢ７タンパク質またはその活性フラグメントを含む。本明細書では、Ｂ７フラグメントまたはＢ７タンパク質と追加のタンパク質とを含む融合タンパク質のことをキメラタンパク質とは呼ばない。本明細書で使用される融合タンパク質は一般に、Ｂ７タンパク質またはそのフラグメントと別の非Ｂ７タンパク質／フラグメントとの組合せを指す。
本明細書では上記のように、異なるＢ７タンパク質に由来するフラグメントを含むタンパク質に限りキメラであると言う。
一実施形態では、本開示の融合タンパク質は、Ｂ７タンパク質もその活性フラグメントも含まず、Ｂ７タンパク質またはそのフラグメントに加えて本開示のウイルスによってコードされる。
したがって、本開示のウイルスは、Ｂ７タンパク質または活性フラグメントに加えていくつかの実態をコードし得るものであり、そのような実体としては追加のタンパク質が挙げられる。
Ｂ７ファミリー
一実施形態では、Ｂ７は、Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７－ＤＣ、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ５、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ７－Ｈ７、その活性フラグメントおよびこれらの組合せより独立して選択される。一実施形態では、Ｂ７タンパク質は、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）またはそのいずれかの活性フラグメントおよびこれらの組合せ、特にＢ７－１またはその活性フラグメントである。
Ｂ７タンパク質としてはＢ７－１（ＣＤ８０としても知られる：ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ３３６８１）、Ｂ７－２（ＣＤ８６としても知られる：ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ４２０８１）が挙げられる。これらのタンパク質はＣＤ２８およびＣＴＬＡ－４と結合する。
一実施形態では、ＣＤ８０は以下の配列：
ＭＧＨＴＲＲＱＧＴＳＰＳＫＣＰＹＬＮＦＦＱＬＬＶＬＡＧＬＳＨＦＣＳＧＶＩＨＶＴＫＥＶＫＥＶＡＴＬＳＣＧＨＮＶＳＶＥＥＬＡＱＴＲＩＹＷＱＫＥＫＫＭＶＬＴＭＭＳＧＤＭＮＩＷＰＥＹＫＮＲＴＩＦＤＩＴＮＮＬＳＩＶＩＬＡＬＲＰＳＤＥＧＴＹＥＣＶＶＬＫＹＥＫＤＡＦＫＲＥＨＬＡＥＶＴＬＳＶＫＡＤＦＰＴＰＳＩＳＤＦＥＩＰＴＳＮＩＲＲＩＩＣＳＴＳＧＧＦＰＥＰＨＬＳＷＬＥＮＧＥＥＬＮＡＩＮＴＴＶＳＱＤＰＥＴＥＬＹＡＶＳＳＫＬＤＦＮＭＴＴＮＨＳＦＭＣＬＩＫＹＧＨＬＲＶＮＱＴＦＮＷＮＴＴＫＱＥＨＦＰＤＮＬＬＰＳＷＡＩＴＬＩＳＶＮＧＩＦＶＩＣＣＬＴＹＣＦＡＰＲＣＲＥＲＲＲＮＥＲＬＲＲＥＳＶＲＰＶ（配列番号１１）
を有する。
Ｂ７タンパク質としてはほかにも、Ｂ７－ＤＣ（ＰＤＣＤ１ＬＧ２およびＰＤ－Ｌ２としても知られる：ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ９ＢＱ５１）、Ｂ７－Ｈ１（ＰＤ－Ｌ１およびＣＤ２７４としても知られる：Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ９ＮＺＱ７）が挙げられる。これらのタンパク質はともにＰＤ－１と結合する。
プログラムデスリガンド１（ＰＤ－Ｌ１）は４０ｋＤａの１型膜貫通タンパク質であり、免疫系の抑制に主要な役割を果たすと考えられている。ＰＤ－Ｌ１のアップレギュレーションによって癌が宿主免疫系を回避できるものと思われる。腎細胞癌患者の腫瘍検体１９６例の分析から、腫瘍にＰＤ－Ｌ１が高発現することによって、腫瘍侵襲性が増大し死亡リスクが４．５倍になることがわかっている。卵巣癌では、ＰＤ－Ｌ１の発現が高い患者の方が発現の低い患者よりも予後が有意に不良であった。ＰＤ－Ｌ１発現は上皮内ＣＤ８＋Ｔリンパ球数と逆相関があり、腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１が抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞を抑制する可能性が示唆されている。その作用は腫瘍のタイプによって異なると考えられ、非小細胞肺癌患者を対象にした研究では、ＰＤ－Ｌ１のタンパク質およびｍＲＮＡの発現が高いと、局所リンパ球浸潤が増大し生存期間が長くなることがわかっている。臨床試験では、いくつかの抗ＰＤＬ１抗体が複数の癌の治療に利益があることが明らかにされている。
一実施形態では、本開示のウイルスで使用するＢ７－ＤＣタンパク質および／またはＢ７－Ｈ１タンパク質あるいはそのフラグメントは免疫抑制を刺激するものではなく、例えば、免疫抑制機能が除去されるよう変異している。
あるいは、ＰＤ－Ｌ１のアップレギュレーションによって予後良好／予後改善が得られる肺癌などの場合、非変異型のＢ７－Ｈ１細胞外ドメインをコードするウイルスを用いてしかるべき癌を治療し得る。
一実施形態では、少なくともＢ７－ＤＣおよび／またはＢ７－Ｈ１の細胞質ドメイン（細胞内ドメイン）が欠失しているか非機能的である。理論に束縛されることを望むものではないが、細胞内ドメインを除去すると癌細胞の溶解に対する耐性が低下することを示唆する証拠がある（Ｂｌｏｏｄ ２００８，Ａｐｒｉｌ １；１１１（７）３６３５－３６４３）。
一実施形態では、Ｂ７－ＤＣおよび／またはＢ７－Ｈ１の膜貫通ドメインフラグメントのみを用いる。一実施形態では、以下のタンパク質は、関連する生物活性を有する完全長タンパク質Ｂ７－ＤＣおよびＢ７－Ｈ１として提供されない。
Ｂ７タンパク質としてはほかにも、ＩＣＯＳと結合するＢ７－Ｈ２（ＩＣＯＳＬＧ、Ｂ７ＲＰ１、ＣＤ２７５としても知られる：Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｏ７５１４４）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６としても知られる：Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ５ＺＰＲ３）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１としても知られる：Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ７２７Ｄ３）、Ｂ７－Ｈ５（ＶＩＳＴＡ、血小板受容体Ｇｉ２４、ＳＩＳＰ１としても知られる）、ＮＫｐ３０と結合するＢ７－Ｈ６（ＮＣＲ３ＬＧ１、ＮＲ３Ｌ１としても知られる）、ＣＤ２８Ｈと結合するＢ７－Ｈ７（ＨＨＬＡ２としても知られる）が挙げられる。
一実施形態では、フラグメントは、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ５、Ｂ７－Ｈ６およびＢ７－Ｈ７のいずれか１つの膜貫通ドメインのみを含む。
個々のタンパク質には単一のタンパク質、すなわち、融合タンパク質（キメラタンパク質を含む）の一部分ではないタンパク質またはその活性フラグメントのほか、融合タンパク質も含まれる。一実施形態では、個々のタンパク質は単一のタンパク質（その活性フラグメントを含む）である。
一実施形態では、Ｂ７タンパク質の細胞質ドメインが存在する。一実施形態では、細胞質ドメインは存在しない。細胞質ドメインが存在しないと癌細胞への細胞内シグナル伝達が減少または消失することがあり、このことは、のちに記載する１つまたは複数の実施形態に関連する。
「膜貫通ドメイン」
一実施形態では、Ｂ７タンパク質に由来するもの以外の膜貫通ドメインを用いて、本開示のウイルスによってコードされたタンパク質（融合タンパク質を含む）を感染癌細胞の表面に発現させ、例えば、膜貫通ドメインを用いて、感染癌細胞の表面に活性Ｂ７タンパク質フラグメントまたは目的とする別のタンパク質を提示させることができる。あるいは、膜貫通ドメインを用いて、上記表面に融合タンパク質、例えばＢ７タンパク質またはその活性フラグメントを含む融合タンパク質を提示させることができる。一実施形態では、ＰＤＧＦ受容体またはそのフラグメントに由来する膜貫通ドメインを用いて、癌細胞表面にＢ７タンパク質および／または別のタンパク質を発現させる。
一実施形態では、本開示で使用する膜貫通テザー配列または膜貫通アンカー配列は、ＰＤＧＦＲ ＴＭドメイン（例えば、ａｌａ５１３～ａｒｇ５６１）、例えばＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫＶＶＶＩＳＡＩＬＡＬＶＶＬＴＩＩＳＬＩＩＬＩＭＬＷＱＫＰＲ（配列番号２）などを含む。
一実施形態では、本開示で使用するテザー配列またはアンカー配列はタグ、例えば、ＰＤＧＦ受容体またはそのフラグメント、例えばＰＤＧＦＲ ＴＭドメイン、特に配列番号２などに結合したタグを含む。
適切なタグとしては、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ｃ－ｍｙｃタグなどが挙げられる。より具体的には、テザーまたはアンカーは、例えば配列番号１０６：ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬのｃ－ｍｙｃタグを含んでよく、それに続いて配列番号２：ＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫＶＶＶＩＳＡＩＬＡＬＶＶＬＴＩＩＳＬＩＩＬＩＭＬＷＱＫＫＰＲなどに示すＰＤＧＦＲ ＴＭドメインを使用する（例えば、ａｌａ５１３～ａｒｇ５６１）。
一実施形態では、ｃ－ｍｙｃタグは、例えばｇｓＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬｎ（配列番号１０７；小文字はスペーサーとしてタグに付加されているアミノ酸を表す）のように、３’末端および／または５’末端にスペーサーまたはスペーサーアミノ酸を含む。
一実施形態では、使用するテザー配列またはアンカー配列はｇｓＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬｎＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫＶＶＶＩＳＡＩＬＡＬＶＶＬＴＩＩＳＬＩＩＬＩＭＬＷＱＫＫＰＲ（配列番号１０８；小文字はアミノ酸スペーサーを表す）である。
テザーまたはアンカーを結合させるタンパク質／ポリペプチドは一般に、停止コドンを含まない。
本開示によるウイルスがコードする１つまたは複数の外来タンパク質は一般に、リーダー配列（シグナルペプチドとも呼ばれる）を含む。リーダー配列は、例えば、タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に位置する長さ約５～３０アミノ酸の配列である。
一実施形態では、癌細胞表面に発現させるタンパク質のリーダー配列は、ヒトリーダー配列、例えばＨｕＶＨＳＳである。
一実施形態では、ＯＲＦカセットの構造は以下の通りであり：
ＬＳ－ＰＯＬＹ－ＴＡＧ－ＴＭ＿Ｄ
式中、
ＬＳはリーダー配列、例えばヒトリーダー配列であり；
ＰＯＬＹは、目的のポリペプチドまたはタンパク質、特に本明細書に開示されるものをコードするポリヌクレオチドである；
ＴＡＧはタグ、例えば、ｃ－ｍｙｃ、特に配列番号１００または１０６などの本明細書に開示されるものであり；
ＴＭ＿ＤはＴＭドメイン、例えばＰＤＧＦＲ ＴＭドメイン、例えば配列番号２である。
ポリペプチドがｓｃＦｖである場合、ＯＲＦは以下のものであり得：
ＬＳ－ＶＡＲ１－ＬＩＮＫ－ＶＡＲ２－ＴＡＧ－ＴＭ＿Ｄ
式中、
ＬＳはリーダー配列、例えばヒトリーダー配列であり；
ＶＡＲ１は、ＶＨ領域などの可変領域をコードするポリヌクレオチドであり；
ＬＩＮＫはリンカー、例えば、Ｇ４Ｓの単位に基づくリンカー、特に配列番号１０４：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳなどの本明細書に開示されるリンカーであり；
ＶＡＲ２は、ＶＬ領域などの可変領域をコードするポリヌクレオチドであり；
ＴＡＧはタグ、例えば、ｃ－ｍｙｃ、特に配列番号１００または１０６などの本明細書に開示されるものであり；
ＴＭ＿ＤはＴＭドメイン、例えばＰＤＧＦＲ ＴＭドメイン、例えば配列番号２である。
本開示はほかにも、タグが膜の内側または外側に存在するようにポリペプチド鎖のＮ末端またはＣ末端にタグを含む諸実施形態、特に本明細書に具体的に記載されるものに及ぶ。したがって、膜の内側に位置するＣ末端タグは、ポリペプチドの結合にも機能にも干渉する可能性が低いため有利である。
それでも、表面発現タンパク質のＮ末端にタグを発現させることは、そのタンパク質を発現する細胞の単離、同定および精製しやすくなり得ることを理由に有用な場合もある。
一実施形態では、膜貫通ドメインと分泌シグナル配列の組合せを用いて、ウイルス（例えば、本明細書に記載されるもの）がコードするタンパク質を感染癌細胞の表面に発現させる。本発明者らは、コードされるタンパク質が腫瘍溶解性ウイルスによる感染を許容する細胞、すなわち癌細胞にのみ発現することを明らかにした。
一実施形態では、感染癌細胞の表面にタンパク質を発現させるのに用いるフラグメント（膜貫通フラグメントなど）は、膜貫通αへリックスを形成する約２０～２５個の疎水性アミノ酸、例えば、ＰＤＧＦ受容体、インスリン様成長因子受容体、ＩＬ－６受容体、ＣＤ２８、グリコホリン、ＬＤＬ受容体、インフルエンザＨＡタンパク質、インスリン受容体、アシアロ糖タンパク質受容体、トランスフェリン受容体を含めたタンパク質から選択される。
一実施形態では、感染癌細胞の表面にタンパク質を発現させるのに用いるフラグメント（膜貫通フラグメントなど）は、配列番号９１、９２、９３、９４または９５で示されるＴＭドメイン配列（最小限の部分）を含む群より選択される：
Figure 0007162929000003
一実施形態では、用いる膜貫通ドメインは、Ｇタンパク質共役受容体またはＢ型肝炎のＳ抗原に由来するものである。
一実施形態では、Ｂ７タンパク質が癌細胞表面から遠位にある融合タンパク質末端に位置する、すなわち、細胞外空間に面している癌細胞の外側に位置するように、Ｂ７タンパク質またはＢ７フラグメントの完全長細胞外ドメインのほかにＢ７以外のタンパク質に由来する膜貫通ドメインも含む融合タンパク質を配置する。
ウイルス
内在性プロモーターの制御下でＢ７タンパク質または活性フラグメントをコードするＤＮＡ配列を有することも、タンパク質が構成的に発現するのではなくウイルスの生活環に従って発現することから有利である。構成的に発現する場合、外来プロモーター、例えばＣＭＶプロモーターのような強力なプロモーターの下で継続的に発現することによって、治療効果を得るのに必要とされる以上のＢ７タンパク質が産生され、オフターゲット効果が生じ得る。
感染癌細胞の表面にタンパク質を発現させる膜貫通ドメインに代わるものとしては、細胞外のタンパク質またはフラグメントのＣ末端アミノ酸に結合した糖リン脂質アンカー（ＧＰＩアンカーとも呼ばれる）を用いる方法（Ｌｏｗら，１９８６，Ｃｒｏｓｓ，１９８７，ＬｏｗおよびＳａｌｔｉｅｌ，１９８８，ＦｅｒｇｕｓｏｎおよびＷｉｌｌｉａｍ，１９８８）が挙げられる。本開示に使用するのに適した糖リン脂質アンカーとしては、Ｔｈｙ－１、Ｎ－ＣＡＭおよびＤＡＦに由来するものが挙げられる。
一実施形態では、本開示による腫瘍溶解性ウイルスはアデノウイルス、例えばＢ群アデノウイルスである。一実施形態では、本開示による腫瘍溶解性ウイルスはキメラウイルス、例えばＥｎＡｄである。一実施形態では、アデノウイルスは複製可能なものである。
一実施形態では、ウイルスは複製能が欠損しており、ウイルスベクターとして提供される。
一実施形態では、Ｂ７タンパク質またはその活性フラグメントをコードする配列は、アデノウイルス遺伝子Ｌ５の停止コドンおよびポリＡ認識部位と遺伝子Ｅ４の停止コドンおよびポリＡ認識部位との間に位置する。
一実施形態では、Ｂ７タンパク質またはその活性フラグメントをコードする配列は、例えば配列番号２１に示されるようにＥｎＡｄゲノムの約２９３５６ｂｐと約２９３５７ｂｐとの間の位置またはそれに相当する位置にある。当業者は、位置の絶対値が番号を割る当てる方法によって変化し得ることを理解するであろう。ただし、挿入遺伝子の相対的位置は、用いる絶対値に関係なく同じままである。
一実施形態では、本開示による腫瘍溶解性アデノウイルスは式（Ｉ）を有し：
５’ＩＴＲ－Ｂ１－ＢＡ－Ｂ２－ＢＸ－ＢＢ－ＢＹ－Ｂ３－３’ＩＴＲ （Ｉ）
式中、
Ｂ１は、結合であるか、Ｅ１Ａ、Ｅ１ＢまたはＥ１Ａ－Ｅ１Ｂを含み（特にＥ１Ａ、Ｅ１ＢまたはＥ１Ａ－Ｅ１Ｂ）；
ＢＡはＥ２Ｂ－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３－Ｅ２Ａ－Ｌ４であり；
Ｂ２は、結合であるか、例えば内在性プロモーターまたは外来プロモーターの下にＥ３または導入遺伝子を含み；
ＢＸは、結合であるか、制限部位、１つもしくは複数の導入遺伝子またはその両方を含むＤＮＡ配列であり；
ＢＢはＬ５を含み；
ＢＹは、Ｂ７タンパク質またはその活性フラグメントをコードする導入遺伝子を含み；
Ｂ３は、結合であるか、Ｅ４を含む。
一実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは式（Ｉａ）を有し：
５’ＩＴＲ－Ｂ１－ＢＡ－Ｂ２－ＢＢ－ＢＹ－Ｂ３－３’ＩＴＲ （Ｉａ）
式中、
Ｂ１は、結合であるか、Ｅ１Ａ、Ｅ１ＢまたはＥ１Ａ－Ｅ１Ｂを含み（特にＥ１Ａ、Ｅ１ＢまたはＥ１Ａ－Ｅ１Ｂ）；
ＢＡはＥ２Ｂ－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３－Ｅ２Ａ－Ｌ４であり；
Ｂ２は、結合であるか、Ｅ３を含み；
ＢＢはＬ５を含み；
ＢＹは、Ｂ７タンパク質またはその活性フラグメントをコードする導入遺伝子を含み；
Ｂ３は、結合であるか、Ｅ４を含む。
一実施形態では、式（Ｉ）および／または（Ｉａ）の構築物中のウイルスゲノムはＡｄ１１またはＥｎＡｄ、特にＥｎＡｄに由来するものである。
一実施形態では、Ｂ７タンパク質またはその活性フラグメントをコードする導入遺伝子は内在性プロモーター、例えば主要後期プロモーターの制御下にある。
調節エレメント
一実施形態では、ＢＹは導入遺伝子カセットを含み、前記カセットは、Ｂ７タンパク質またはそのフラグメントをコードする導入遺伝子と、調節エレメントの組合せなどの調節エレメントとを含む。
一実施形態では、調節エレメントはスプライスアクセプター配列である。
一実施形態では、調節エレメントはコザック配列である。
一実施形態、例えば導入遺伝子がポリシストロニックＲＮＡ分子をコードする実施形態では、調節エレメントはＩＲＥＳ配列である。
一実施形態では、調節配列は、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａなどの高効率自己切断型ペプチド配列である。
一実施形態では、調節配列はポリＡテールである。
一実施形態では、少なくとも２つの調節配列、例えば、スプライスアクセプターとコザック配列、スプライスアクセプターとポリＡテール、スプライスアクセプターとＩＲＥＳ配列またはスプライスアクセプターとＰ２Ａ配列が存在する。
一実施形態では、少なくとも３つの調節配列、例えば、スプライスアクセプター配列とコザック配列とポリＡテール、スプライスアクセプター配列とＩＲＥＳ配列もしくは２Ａ配列とポリＡテール；またはスプライスアクセプター配列とコザック配列とＩＲＥＳ配列もしくは２Ａ配列が存在する。
一実施形態では、少なくとも４つの調節配列、例えば、スプライスアクセプター配列とコザック配列とＩＲＥＳ配列または２Ａ配列とポリＡテールが存在し、特にＬ５とＥ４との間にスプライスアクセプター配列、コザック配列、ＩＲＥＳまたは２Ａ配列、ポリＡテールの順序で位置している。
一実施形態では、導入遺伝子は、ＩＲＥＳおよび２Ａ調節配列の両方を含むポリシストロニックＲＮＡ分子をコードする。
ウイルスがコードするタンパク質
一実施形態では、本開示のウイルスは、感染癌細胞の表面に発現するタンパク質を複数コードし、ここでは、少なくとも１つがＢ７タンパク質またはその活性フラグメントであり、例えば、癌細胞表面に発現するか、細胞外空間内に分泌される２つ、３つ、４つまたはそれ以上の異なるタンパク質、特に２つまたは３つのタンパク質がウイルスによってコードされている。この場合のタンパク質には融合タンパク質が含まれる。一実施形態では、本開示のウイルスは、例えばともに癌細胞表面に発現する２つの異なるＢ７タンパク質、その活性フラグメントまたはこれらの組合せをコードする。
一実施形態では、本開示によるウイルスは、細胞表面に発現する１つまたは２つのタンパク質と、細胞表面に係留することができず、例えば、癌細胞とともに作用させることを目的としたり、その細胞から分泌／放出させたりする１つまたは２つのタンパク質とをコードする。
一実施形態では、癌細胞の表面に発現するＢ７タンパク質または活性フラグメントが本開示のウイルスによってコードされるほか、その細胞から放出または分泌される可溶型の同じＢ７タンパク質または異なるＢ７タンパク質（活性フラグメントを含む）もそのウイルスによってコードされる。
一実施形態では、少なくとも２つの異なるＢ７タンパク質または活性フラグメントが本開示のウイルスによってコードされる。
一実施形態では、細胞表面に発現する少なくとも１つのタンパク質がＢ７タンパク質であり、少なくとも１つの非細胞係留タンパク質（例えば、分泌タンパク質）が非Ｂ７タンパク質である。
一実施形態では、複数のタンパク質が、独立してプロセシングされ癌細胞膜に発現する別個のタンパク質として発現するようコードされ得る。癌細胞表面で複数のタンパク質が独立していれば、免疫活性化に良い方向に寄与し得る。理論に束縛されることを望むものではないが、脂質の充填状態が癌細胞膜の脂質二重層の流動性（すなわち、粘度）に影響を及ぼす可能性がある。膜の粘度は膜内でのタンパク質をはじめとする生体分子の回転および配向に影響を及ぼし、それによりこれらの分子の機能に影響を及ぼす可能性がある。したがって、ウイルスによってコードされるタンパク質が別個の独立したタンパク質として感染癌細胞の膜内に存在すれば、脂質二重層の流動性によって、特に適した形式、例えば生物学的機能をもたらす天然の形式とほぼ同じともいえる分子の独立した動きが可能となる。
一実施形態では、独立してプロセシングされ発現するタンパク質は、癌細胞膜の異なる位置、例えば物理的に離れた位置などにある（係留される）。
一実施形態では、ウイルスによってコードされ感染癌細胞の表面に発現する１つまたは複数のタンパク質（例えば、全タンパク質）は融合タンパク質ではない。
上記のように、いくつかの実施形態では、タンパク質は融合タンパク質として発現する。
一実施形態では、本開示のウイルスは、細胞表面に発現する１つまたは複数の別個の独立したタンパク質および細胞表面に発現する１つまたは複数の融合タンパク質をもたらす。
したがって、一実施形態では、本開示によるウイルスは、例えば表面または感染癌細胞に発現する前記複数のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。
したがって、一実施形態では、本開示によるウイルスは、ウイルスゲノムの同じ位置または異なる位置に２つ以上の導入遺伝子を含む。ウイルスゲノムの同じ位置にある場合でもなお、癌細胞の表面では複数のタンパク質が独立して発現する。
一実施形態では、複数のタンパク質（融合タンパク質を含む）がウイルスゲノム内の異なる位置、例えばＥ３、ＢＸおよび／またはＢＹにコードされ、感染癌細胞の表面に別個に発現する。
一実施形態では、例えば、コードされるタンパク質が融合タンパク質としてもたらされ、特に融合タンパク質がＢ７タンパク質またはその活性フラグメントを含む場合、複数のタンパク質（融合タンパク質を含む）がウイルスゲノム内の同じ位置にコードされ、感染癌細胞表面に一緒に発現する。
一実施形態では、融合タンパク質中のＢ７タンパク質は、別の目的タンパク質またはその活性フラグメントと融合または結合した完全長のタンパク質、特にＢ７－１および／またはＢ７－２などの本明細書に記載されるタンパク質である。一実施形態では、融合タンパク質は、Ｂ７タンパク質由来の膜貫通を含む。一実施形態では、Ｂ７は、膜貫通ドメインを除く活性フラグメントである。後者の実施形態では、融合タンパク質が感染癌細胞の表面に確実に提示されるようＢ７タンパク質に由来するもの以外の膜貫通を用い得る。
一実施形態では、複数のタンパク質がウイルス内の同じ位置にコードされ、感染癌細胞の表面に１つまたは複数の融合タンパク質として一緒に発現する。
ウイルス内で目的のタンパク（１つまたは複数）をコードする遺伝子（１つまたは複数）の位置が同じである場合、その遺伝子は、例えばＩＲＥＳ配列または２Ａペプチドによって結合していてよい。
一実施形態では、本開示によるウイルスは、「第二の」導入遺伝子および任意選択で第三の導入遺伝子（すなわち、１つまたは複数の前記複数のタンパク質、例えばサイトカイン、ケモカイン、リガンドのほかアンタゴニスト抗体分子およびアゴニスト抗体分子などの抗体分子を含む群より選択されるポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む。
一実施形態では、追加のタンパク質（１つまたは複数）は、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０およびその組合せと結合し、例えば癌細胞の表面に発現するのに適した形態の抗体、抗体フラグメントまたはタンパク質リガンドを含む群より独立して選択されるものである。
一実施形態では、追加のタンパク質は、例えばムロモナブ－ＣＤ３（ＯＫＴ３としても知られる）、オテリキシズマブ（ＴＲＸ４としても知られる）、テプリズマブ（ｈＯＫＴ３γ１（Ａｌａ－Ａｌａ）としても知られる）またはビジリズマブより独立して選択される、抗ＣＤ３抗体である。
一実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、抗体フラグメント、例えば、別のタンパク質の膜貫通領域、例えばＰＤＧＦ受容体または細胞表面型ＩｇＧ由来の膜貫通ドメインとの融合タンパク質の一部分であるｓｃＦｖの形態である。
一実施形態では、抗体分子は、血管新生因子の阻害物質、例えば抗ＶＥＧＦ抗体分子などおよびＴ細胞不活化因子の阻害物質、例えば抗ＣＴＬＡ－４抗体分子、抗ＰＤ１抗体分子または抗ＰＤＬ１抗体分子などを含む群より独立して選択される阻害物質（アンタゴニスト抗体）である。一実施形態では、抗体分子は、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７および４－１ＢＢに対する抗体を含む群より独立して選択されるアゴニストである。
一実施形態では、追加の導入遺伝子は、ＩＬ－２、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２およびｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を含む群より選択されるサイトカインまたはその可溶性変異型をコードする。このグループの１つまたは複数のタンパク質を特に癌細胞から分泌される遊離タンパク質としてウイルスに発現させるのは、ｉｎ ｖｉｖｏで癌細胞に対する免疫応答を刺激するのに特に適し得るという点で有利である。
一実施形態では、追加の導入遺伝子は、ＭＩＰ１α、ＩＬ－８、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１を含む群より選択されるケモカインをコードする。このグループの１つまたは複数のタンパク質を癌細胞から分泌され得る遊離タンパク質としてウイルスに発現させるのは、ｉｎ ｖｉｖｏで免疫細胞を誘引し癌細胞に対する免疫応答を刺激するのに特に適し得る点で有利である。
一実施形態では、感染癌細胞の表面に少なくともＢ７タンパク質またはその活性フラグメントを発現させることに加え、ほかにも１つまたは複数の分子を表面に発現させ、かつ／または分泌させる。
したがって、一実施形態では、ウイルスはＢ７－１、Ｂ７－２もしくはそのいずれか１つの活性フラグメントまたはこれらの組合せをコードする。
したがって、一実施形態では、特にタンパク質が細胞表面に個々のタンパク質として発現する場合、ウイルスは、感染癌細胞の表面に発現するＢ７－１、Ｂ７－２もしくはそのいずれか１つの活性フラグメントまたはこれらの組合せのほか、同じく癌細胞表面に発現する抗ＣＤ３（アゴニスト）抗体または抗体結合フラグメント（ｓｃＦｖなど）をコードする。
したがって、一実施形態では、ウイルスは、感染癌細胞の表面に発現するＢ７－１、Ｂ７－２もしくはそのいずれか１つの活性フラグメントまたはこれらの組合せのほか、同じく癌細胞の表面に発現するか、例えば分泌によってまたは感染癌細胞の溶解／死後に癌細胞から放出される抗ＶＥＧＦ（アンタゴニスト）抗体またはその結合フラグメントをコードする。
したがって、一実施形態では、ウイルスは、感染癌細胞の表面に発現するＢ７－１、Ｂ７－２もしくはそのいずれか１つの活性フラグメントまたはこれらの組合せのほか、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０と結合し、同じく癌細胞表面に発現するか、例えば感染癌細胞の分泌または溶解／死後の放出によって癌細胞から放出される抗体、抗体フラグメントまたはタンパク質リガンドをコードする。
したがって、一実施形態では、ウイルスは、感染癌細胞の表面に発現するＢ７－１、Ｂ７－２もしくはそのいずれか１つの活性フラグメントまたはこれらの組合せのほか、例えば、特に感染癌細胞の分泌または細胞溶解／死後の放出によって癌細胞から放出される、ＩＬ－２、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２およびＦＬＴ３Ｌから選択されるサイトカインをコードする。
したがって、一実施形態では、ウイルスは、感染癌細胞の表面に発現するＢ７－１、Ｂ７－２もしくはそのいずれか１つの活性フラグメントまたはこれらの組合せのほか、例えば、特に感染癌細胞の分泌または細胞溶解／死後の放出によって癌細胞から放出される、ＭＩＰ１α、ＩＬ－８、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１から選択されるケモカインをコードする。
したがって、一実施形態では、ウイルスは、感染癌細胞の表面に発現するＢ７－１、Ｂ７－２もしくはそのいずれか１つの活性フラグメントまたはこれらの組合せのほか、同じく癌細胞表面に発現する（特に、タンパク質が細胞表面に個々のタンパク質として発現する場合）抗ＣＤ３（アゴニスト）抗体または抗体結合フラグメント（ｓｃＦｖなど）をコードし、さらに、例えば、特に分泌によってまたは感染癌細胞の細胞溶解／死後に癌細胞から放出される、ＩＬ－２、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＦＬＴ３Ｌ、ＭＩＰ１α、ＩＬ－８、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１から選択されるサイトカインまたはケモカインをコードする。
したがって、一実施形態では、ウイルスは、感染癌細胞の表面に発現するＢ７－１、Ｂ７－２もしくはそのいずれか１つの活性フラグメントまたはこれらの組合せのほか、同じく癌細胞表面に発現する（特に、タンパク質が細胞表面に個々のタンパク質として発現する場合）抗ＣＤ３（アゴニスト）抗体または抗体フラグメント（ｓｃＦｖなど）をコードし、さらに、同じく癌細胞表面に発現するか、例えば感染癌細胞の分泌または溶解／死後の放出によって癌細胞から放出される、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０と結合する抗体、抗体フラグメントもしくはタンパク質リガンドまたは抗ＶＥＧＦ（アンタゴニスト）抗体をコードする。
したがって、一実施形態では、ウイルスは、感染癌細胞の表面に発現するＢ７－１、Ｂ７－２もしくはそのいずれか１つの活性フラグメントまたはこれらの組合せのほか、例えば、特に感染癌細胞の細胞溶解／死後の分泌によって癌細胞から放出される、ＩＬ－２、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１５およびＩＬ－１２、ＦＬＴ３Ｌ、ＭＩＰ１α、ＩＬ－８、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１から選択される２つ異なるサイトカインまたはケモカインをコードする。
したがって、一実施形態では、ウイルスは、感染癌細胞の表面に発現するＢ７－１、Ｂ７－２もしくはそのいずれか１つの活性フラグメントまたはこれらの組合せのほか、同じく癌細胞表面に発現する（特に、タンパク質が細胞表面に個々のタンパク質として発現する場合）抗ＣＤ３（アゴニスト）抗体または抗体結合フラグメント（ｓｃＦｖなど）をコードし、さらに、特に感染癌細胞の細胞溶解／死前の分泌および細胞溶解／死後の放出によって癌細胞から放出され得る、ＩＬ－２、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１５およびＩＬ－１２より独立して選択されるサイトカインおよびまたはＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）、ＭＩＰ１α（ＬＤ７８α（ＣＣＬ３）またはＬＤ７８β（ＣＣＬ３Ｌ１）アイソフォーム）、ＭＩＰ１βから選択されるケモカインをコードする。
特に上記のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一実施形態では、ウイルスはさらに抗ＰＤ－１抗体（アンタゴニスト）をコードする。
一実施形態では、導入遺伝子カセット内でコードされ細胞膜に発現するタンパク質（１つまたは複数）はほかにも、膜貫通ドメインと細胞外リガンド結合ドメインとの間にペプチドリンカーまたはスペーサーを含み得る。このようなリンカーまたはスペーサーは、細胞表面発現タンパク質に柔軟性を加え、タンパク質が例えば隣接する細胞上でその標的分子と相互作用する能力を増大させ得る。このようなリンカーまたはスペーサーはこのほか、ジスルフィド結合形成またはタンパク質間相互作用を介して細胞表面でのタンパク質の二量体化または三量体化を促進するよう設計または選択され得る。例えば、免疫グロブリン分子またはＣＤ８のヒンジ領域を用いて、柔軟性および二量体化の両方を増大させ得る。
一実施形態では、導入遺伝子カセット内でコードされるタンパク質（１つまたは複数）はほかにも、ペプチドタグを含み得る。ペプチドタグとしてはｃ－ｍｙｃ、ポリ－ヒスチジン、Ｖ５タグまたはＦＬＡＧタグが挙げられ、細胞内、細胞外を問わずポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に位置していても、タンパク質内の例えば細胞外ループ内または膜貫通ドメインと細胞外ドメインとの間にコードされていてもよい。ペプチドタグは、異なるタンパク質ドメインの間、例えば膜貫通ドメインと細胞外ドメインの間のスペーサーまたはリンカーとして使用することができるほか、タンパク質またはタンパク質を発現する細胞の検出、精製または検出に使用することができる。
一実施形態では、１つまたは複数の追加の導入遺伝子（Ｂ７タンパク質またはそのフラグメントをコードする遺伝子以外）は、外来プロモーターまたは内在性プロモーター、例えば内在性プロモーターの制御下にある。一実施形態では、Ｅ３領域（Ｂ２）内の導入遺伝子が外来プロモーターの制御下にある。
一実施形態では、１つまたは複数の追加の導入遺伝子遺伝子は、アデノウイルスゲノムのＥ３領域とファイバーＬ５との間、例えば、式（Ｉ）の構築物の特に外来プロモーターの制御下にある位置ＢＸにある。したがって、一実施形態では、ＢＸ内の導入遺伝子は外来の制御下にある。
一実施形態では、１つまたは複数の追加の導入遺伝子遺伝子は、アデノウイルスゲノムのＥ４領域とファイバーＬ５との間、例えば、式（Ｉ）または（Ｉａ）の構築物の特に主要後期プロモーターなどの内在性プロモーターの制御下にある位置ＢＹにある。これは、領域ＢＹ内にコードされるＢ７タンパク質またはその活性フラグメントに追加されたものであり得る。
一実施形態では、本開示による腫瘍溶解性アデノウイルスを含む組成物、例えば、特に希釈剤または担体などの薬学的に許容される添加剤を含む、医薬組成物を提供する。
一実施形態では、治療に使用する、特に癌の治療に使用する、本開示による腫瘍溶解性アデノウイルスまたはそれを含む組成物を提供する。
一実施形態では、必要とする患者を治療する方法であって、治療有効量の本開示による腫瘍溶解性ウイルスまたはそれを含む医薬組成物などの組成物を投与することを含む方法を提供する。
一実施形態では、癌、特に癌腫、例えば結腸直腸癌、肺癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、乳癌または卵巣癌の治療のための薬剤の製造への本開示による腫瘍溶解性アデノウイルスまたはそれを含む組成物の使用を提供する。
一実施形態では、本開示によるウイルスの少なくとも５０％（例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）のゲノム配列と、Ｂ７タンパク質またはその活性フラグメント、例えばＢ７－１またはその活性フラグメントなどの本明細書に開示されるＢ７タンパク質をコードする配列とを含む、ポリヌクレオチドを提供する。一実施形態では、ポリヌクレオチド配列はプラスミドの形態である。
一実施形態では、本開示による腫瘍溶解性ウイルスまたは本開示によるポリヌクレオチド配列を含む、宿主細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞またはその派生物などの哺乳動物細胞を提供する。
一実施形態では、本開示による腫瘍溶解性アデノウイルスを調製する工程であって、Ｂ７タンパク質またはその活性フラグメントをコードするポリヌクレオチドを腫瘍溶解性アデノウイルスに挿入する段階を含む工程を提供する。
一実施形態では、本開示によるウイルスを複製する工程であって、複製に適した条件下、ウイルスの存在下で宿主細胞を培養する段階を含む工程を提供する。この方法は一般に、例えば上清から、または宿主細胞の溶解後にウイルスを回収するさらなる段階を含む。
定義
本明細書で使用され癌細胞に対する選択性を有する腫瘍溶解性ウイルスは、例えば、癌細胞に優先的に感染することおよび／またはウイルス生活環が調節不全を起こしたｐ５３、例えば癌細胞に過剰発現するｐ５３などの遺伝子に依存することを理由に、癌細胞を優先的に死滅させるウイルスを指す。一実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、例えばＥｎＡｄのように、癌細胞に優先的に感染し、次いでそのゲノムを複製し、キャプシドタンパク質を産生して新たなウイルス粒子を生じる。
癌細胞に対する選択性（治療指数）は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００５／１１８８２５号に記載されている通りに試験することができる。
本明細書で使用される導入遺伝子は、アデノウイルスのゲノム配列に挿入された遺伝子であって、ウイルスに非天然のもの（外来性）であるか、ウイルスの特定の位置に通常みられないものである遺伝子を指す。本明細書に導入遺伝子の例が記載されている。本明細書で使用される導入遺伝子にはこのほか、遺伝子の一部分であって、挿入して完全長遺伝子の機能またはその大部分、例えばその機能の５０％以上を発揮させるのに適した部分である、遺伝子の機能的フラグメントが含まれる。
本明細書では、導入遺伝子とコード配列は、ウイルスゲノムに挿入するという文脈において、文脈上そうでないことが明らかでない限り互換的に使用される。本明細書で使用されるコード配列は、例えば機能性ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列を意味する。コード配列は通常、目的とする機能性ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする導入遺伝子のｃＤＮＡである。目的とする機能性ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質についてはのちに記載する。
一実施形態では、本明細書で使用される導入遺伝子は、ある生物体から単離され異なる生物体、すなわち本開示のウイルスに導入される遺伝子またはｃＤＮＡ配列を含む、ＤＮＡのセグメントを指す。一実施形態では、この非天然のＤＮＡセグメントは一般に、機能性ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を産生する能力を保持している。使用される導入遺伝子は、例えば、単一タンパク質もしくはその活性フラグメント、キメラタンパク質または融合タンパク質をコードするものであり得る。
ウイルスゲノムにＤＮＡのコード配列が含まれているのは明らかである。ウイルスのゲノム配列に内在するもの（天然の遺伝子）は、本明細書の文脈内では、組換え技術によって改変されている場合、例えば非天然の位置または非天然の環境に存在する場合などを除き、導入遺伝子であるとは見なされない。
したがって、一実施形態では、挿入する導入遺伝子はヒトまたはヒト化タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする。
一実施形態では、導入遺伝子は、Ｂ７タンパク質またはその活性フラグメントをコードするＤＮＡ配列を含む。本開示は、Ｂ７タンパク質またはその活性化フラグメントが、融合タンパク質、単一Ｂ７タンパク質またはその活性フラグメントより独立して選択される１つまたは複数の形式で提供され得ることを提供する。
本明細書で使用される単一Ｂ７タンパク質またはその活性フラグメントは、実質的に野生型タンパク質であるタンパク質、例えば、融合タンパク質の一部分ではなく、関連する既知のタンパク質、特に既知のヒトタンパク質と同一の配列または類似した配列を有するタンパク質を指す。このほか、関連するタンパク質の全長にわたってアミノ酸の１０％が置換または欠失しているものが単一遺伝子に含まれる。
本明細書で使用されるＧＰＩアンカーは、翻訳後修飾時にタンパク質のＣ末端に付加され得る糖脂質を指す。ＧＰＩアンカーは、ホスファチジルイノシトール基が炭水化物含有リンカー（イノシトール残基とグリコシド結合したグルコサミンおよびマンノース）および成熟タンパク質のＣ末端のアミノ酸とのエタノールアミンリン酸（ＥｔＮＰ）架橋を介して結合したものからなる。疎水性ホスファチジル－イノシトール基内の２つの脂肪酸によってタンパク質が細胞膜に係留される。
ＧＰＩアンカー化された（Ｇｌｙｐｉａｔｅｄ）（ＧＰＩが結合した）タンパク質は一般に、シグナルペプチドを含み、そのため小胞体（ＥＲ）内に誘導される。Ｃ末端は、ＥＲ膜に挿入されて留まる疎水性アミノ酸からなる。次いで疎水性末端が切り離され、ＧＰＩアンカーに置き換わる。タンパク質が分泌経路を進む際には、それが小胞によってゴルジ装置まで運搬され、最終的には細胞外空間に到達し、そこで細胞膜の外膜に付着して留まる。ＧＰＩアンカー化（ｇｌｙｐｉａｔｉｏｎ）はこのようなタンパク質が膜に付着する唯一の手段であるため、この基がホスホリパーゼに切断されることによって、膜からのタンパク質の解離が制御される。後者の機序はｉｎ ｖｉｔｒｏで利用される。すなわち、酵素アッセイで膜から解離する膜タンパク質は、ＧＰＩアンカー化されたタンパク質である。
ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）は、ＧＰＩアンカー化タンパク質にみられるホスホ－グリセロール結合を切断することが知られている酵素である。ＰＬＣで処理することにより、細胞膜の外膜からＧＰＩ結合タンパク質が解離する。Ｔ細胞マーカーのＴｈｙ－１およびアセチルコリンエステラーゼならびに腸および胎盤の両方のアルカリホスファターゼがＧＰＩ結合型であることが知られており、ＰＬＣで処理することによって解離する。ＧＰＩ結合タンパク質は脂質ラフトに優先的に位置すると考えられており、細胞膜マイクロドメイン内に高レベルの組織化があることが示唆される。
Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ第２版の第１１章には、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ、ＫｉｎｏｓｈｉｔａおよびＨａｒｔが著したＧＰＩアンカーに関する総説が掲載されている。
ウイルス
本明細書の文脈における複製可能なウイルスは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの細胞内で、すなわちパッケージング細胞系による補助がなくても複製するのに必要な機構をすべて備えているウイルスを指す。ウイルスベクター、例えば少なくともＥ１Ａ領域が欠損し、補完的なパッケージング細胞系で複製可能なウイルスベクターは、本明細書の文脈では複製可能なウイルスではない。
ウイルスベクターとは、複製に（導入遺伝子を含む）パッケージング細胞系を必要とする複製能欠損ウイルスのことである。
本明細書で使用される複製可能なウイルスは、複製可能なウイルスまたは複製が癌細胞内の因子、例えばアップレギュレートされたｐ５３もしくはこれに類似したものなどの因子に依存するウイルスを指す。
一実施形態では、アデノウイルスはヒトアデノウイルスである。本明細書で使用される「アデノウイルス」、「血清型」または「アデノウイルス血清型」は、現時点で知られておりサブグループＡ～Ｆに分類される５０を超えるアデノウイルス血清型のいずれかに割り振られ得る任意のアデノウイルスを指し、さらには、未だ同定も分類もされていないアデノウイルス血清型に及ぶ。例えば、表１に示すように、Ｔｈｅ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ）の「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ」（Ｓｔｒａｕｓｓ），ｅａ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．４５１－５９６（１９８４）およびＦｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２巻，第４版（Ｋｎｉｐｅ）の「Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」（Ｓｈｅｎｋ），３５ｅａ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，ｐｐ．２２６５－２２６７（２００１）を参照されたい。
Figure 0007162929000004
アデノウイルスは、そのキャプシドに基づいて分類される。
一実施形態では、アデノウイルスはＢ亜群、例えばＡｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４およびＡｄ５１を含むかこれよりなる群より独立して選択されるもの、例えばＡｄ１１、特にＡｄ１１ｐ（Ｓｌｏｂｉｔｓｋｉ株）などである。一実施形態では、本発明のアデノウイルスはＢ亜群アデノウイルス、例えばＡｄ１１、特にＡｄ１１ｐなどのキャプシド、例えばヘキソンおよび／またはファイバーなどを有する。一実施形態では、アデノウイルスは、Ａｄ１１ｐなどのＡｄ１１であるか、そのファイバー、ヘキソンおよび／またはペントンを有するものである。
一実施形態では、本開示のウイルスはＡ群ウイルスではない。
一実施形態では、本開示のウイルスはアデノデスタンパク質（ＡＤＰ）を含まない。
一実施形態では、本開示のウイルスはＣ群ウイルスではない。
一実施形態では、本開示のウイルスは、Ａｄ５ウイルスのより多くの部分および一部分のフラグメントを含まない。
ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ（ＥｎＡｄ）は、以前はＣｏｌｏＡｄ１（国際公開第２００５／１１８８２５号）として知られていたキメラ腫瘍溶解性アデノウイルスであり、Ａｄ１１ｐ由来のファイバー、ペントンおよびヘキソンを有することから、Ｂ亜群ウイルスである。同ウイルスは、Ａｄ１１ｐおよびＡｄ３由来のＤＮＡを含むキメラＥ２Ｂ領域を有する。ＥｎＡｄは、Ｅ３領域のほぼ全体とＥ４領域の一部が欠失している。このため、ゲノムには、追加の遺伝物質を収容すると同時に生存可能な状態が保たれるだけの大きなスペースがある。さらに、ＥｎＡｄはＢ亜群アデノウイルスであるため、ヒトに免疫が既に存在する頻度は、例えばＡｄ５よりも低い。Ａｄ１１のファイバー、ペントンおよびヘキソンを有するキメラ腫瘍溶解性ウイルスの例としてはほかにも、ＯｖＡｄ１およびＯｖＡｄ２が挙げられる（国際公開第２００６／０６０３１４号を参照されたい）。
ＥｎＡｄは、腫瘍細胞に優先的に感染し、その細胞内で急速に複製して細胞溶解を引き起こすものと思われる。次いで、これが炎症性免疫応答を生じさせ、それにより身体も癌と戦うよう刺激し得る。ＥｎＡｄの成功の一部は、このウイルスのｉｎ ｖｉｖｏでの複製速度が速いことと関係があるものと考えられる。
重要なのは、ＥｎＡｄを（例えば、静脈内または腹腔内への注射または注入によって）全身投与し、次いで腫瘍細胞に選択的に感染させ、その中でタンパク質を発現させることが可能であることが臨床的に明らかにされていることである。ＥｎＡｄのこの特性は、Ａｄ１１ｐをはじめとするＢ群アデノウイルス、特にＡｄ１１ｐのキャプシドタンパク質を発現するウイルス（本明細書に記載されるウイルスなど）にも共通してみられ得るものであり、この特性によって、導入遺伝子を腫瘍内に直接注射するという多くの癌で実現不可能なことを必要とせずに、癌細胞の表面にタンパク質を発現させることが可能になる。
ＥｎＡｄは腫瘍細胞を選択的に溶解させると同時に、さらなる有益な特性を導入すること、例えば、細胞シグナル伝達タンパク質もしくは抗体をコードする導入遺伝子または細胞シグナル伝達タンパク質（１つまたは複数）を刺激する実体をコードする導入遺伝子などの導入遺伝子をウイルスに備えさせることによって、その治療活性を増大させたり副作用を軽減したりすることが可能であり得る。
癌細胞内で発現させることが可能な特定のタンパク質をコードするＤＮＡをウイルスに備えさせるのは、例えば、細胞を免疫系に見えやすくしたり、治療遺伝子／タンパク質を標的腫瘍細胞に優先的に送達したりすることによって、身体そのものの防御力を用いて腫瘍細胞とより効率的に戦うことが可能となり得る点で有利である。
一実施形態では、本開示の腫瘍溶解性アデノウイルスは、例えば癌が免疫応答を抑制する能力を低下させることによって、患者の免疫系が腫瘍を戦うのを刺激する。
一実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、同じ血清型、例えばＡｄ１１、特にＡｄ１１ｐに由来し、例えば、ヌクレオチドの位置をＧｅｎｂａｎｋ ＩＤ ２１７３０７３９９（アクセッション番号：ＧＣ６８９２０８）と比較して後者のゲノム配列の３０８１２～３１７８９位、１８２５４～２１１００位および１３６８２～１５３６７位にみられる、ファイバータンパク質、ヘキソンタンパク質およびペントンタンパク質を有する。
一実施形態では、アデノウイルスはｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ（ＥｎＡｄおよび旧ＣｏｌｏＡｄ１としても知られる）である。本明細書で使用されるｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖは配列番号２１のキメラアデノウイルスを指す。同ウイルスは、野生型アデノウイルスよりも治療特性が増強された複製可能な腫瘍溶解性キメラアデノウイルスである（国際公開第２００５／１１８８２５号を参照されたい）。ＥｎＡｄは、Ａｄ１１ｐおよびＡｄ３に由来するＤＮＡを特徴とするキメラＥ２Ｂ領域を有するほか、Ｅ３／Ｅ４の欠失がある。ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖの構造を変化させることによって、Ａｄ１１ｐよりも約３．５ｋｂ小さいゲノムが得られ、それにより導入遺伝子を挿入するための追加の「スペース」が生じる。
使用される抗体分子は、完全長の重鎖および軽鎖を有する完全な抗体分子、完全長抗体を含む二重特異性抗体フォーマットまたは特に限定されないが、上記のもののいずれかのＦａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ、ＶＬもしくはＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二価抗体、三価抗体、もしくは四価抗体、ビス－ｓｃＦｖ、二特異性抗体、三特異性抗体、四特異性抗体およびエピトープ結合フラグメントを含めたいずれか１つのフラグメントを含み得る（例えば、ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６－１１３６；ＡｄａｉｒおよびＬａｗｓｏｎ，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ－Ｏｎｌｉｎｅ ２（３），２０９－２１７を参照されたい）。これらの抗体フラグメントを作出および製造する方法は当該技術分野で周知である（例えば、Ｖｅｒｍａら，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５－１８１を参照されたい）。本発明で使用される抗体フラグメントとしてはほかにも、国際特許出願第２００５／００３１６９号、同第２００５／００３１７０号および同第２００５／００３１７１号に記載されているＦａｂフラグメントおよびＦａｂ’フラグメントが挙げられる。多価抗体は、複数の特異性を備えたもの、例えば二特異性であっても、単一特異性であってもよい（例えば、国際公開第９２／２２８５３号、同第０５／１１３６０５号、同第２００９／０４０５６２号および同第２０１０／０３５０１２号を参照されたい）。
本明細書で使用される抗体は、文脈上そうでないことが明らかでない限り、完全長抗体を指す。
抗体結合フラグメントは、抗体が結合する標的抗原に対する特異性を保持しているＶＨおよび／またはＶＬなどの結合ドメインを含むフラグメントのほか、例えば上記のもののいずれかのＦａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ、ＶＬまたはＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二価抗体、三価抗体、または四価抗体、ビス－ｓｃＦｖ、二特異性抗体、三特異性抗体、四特異性抗体およびエピトープ結合フラグメントを指す。
リンカー
本開示の融合タンパク質に使用するのに適したリンカーとしては以下のものが挙げられる：
Figure 0007162929000005
Figure 0007162929000006
Figure 0007162929000007
配列３７～４１の（Ｓ）は任意選択である。
固いリンカーの例としては、ペプチド配列ＧＡＰＡＰＡＡＰＡＰＡ（配列番号７５）、ＰＰＰＰ（配列番号７６）およびＰＰＰが挙げられる。
その他のリンカーを表４に示す：
Figure 0007162929000008
式（Ｉ）および（Ｉａ）に関連する定義
結合は、あるＤＮＡ配列と別のＤＮＡ配列とを連結している共有結合、例えばウイルスゲノムのある区画と別の区画とを連結している共有結合を指す。したがって、本明細書の式（Ｉ）および（Ｉａ）の可変物が結合を表す場合、その結合によって表される特徴または要素は存在しない、すなわち欠失している。
アデノウイルスの構造は一般に類似しているため、以下の要素は、当業者に公知の構造要素およびそれを指すのに一般的に使用される命名法の観点から論じられる。本明細書である要素に言及する場合、それはアデノウイルスのその要素をコードするＤＮＡ配列またはその要素の同じ構造タンパク質をコードするＤＮＡ配列を指す。後者は、ＤＮＡコードに冗長性があることから重要なものである。最適な結果を得るため、コドン使用頻度に関するウイルスの選好性を考慮に入れる必要があり得る。
本開示のウイルスに使用するアデノウイルスの構造要素はいずれも、天然の配列を含むか、これよりなるものであってよく、また少なくとも９５％、例えば９６％、９７％、９８％、９９％または１００％などの所与の長さにわたる類似性を有するものであってもよい。元の配列を改変して、遺伝物質の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％を削除してもよい。当業者には、改変する際にウイルスのリーディングフレームが破壊されて構造タンパク質の発現が破壊されることがあってはならないことがわかる。
一実施形態では、所与の要素は完全長配列、すなわち完全長遺伝子である。本明細書で使用される完全長遺伝子は、少なくとも遺伝子のコード配列全体を指すが、任意の付随する非コード領域、特にその遺伝子の機能に関連するものがこれに含まれ得る。
一実施形態では、所与の要素は、完全長に満たず、かつ完全長配列と同じまたはこれに相当する機能を保持している。
本開示の構築物において任意選択である所与の要素に関する一実施形態では、ＤＮＡ配列は、完全長未満であり、かつ機能性のないものであってよく、例えば、Ｅ３領域が全部または一部欠失していてもよい。しかし、実質的にＥ３領域全体を欠失させると、導入遺伝子の挿入に利用できるスペースが最大になるため有用であると思われる。
アデノウイルスの構造タンパク質または機能性タンパク質をコードする構造遺伝子は一般に、ＤＮＡの非コード領域によって結合している。したがって、本開示のウイルスに導入遺伝子を挿入するという目的には、目的の構造要素のゲノム配列を「切る」場所（特にその非コード領域）に関していくぶん柔軟性がある。したがって、本明細書の目的には、その要素は、目的にかなっており異物をコードしない限りは参照構造要素であると見なす。したがって、必要に応じて、例えばウイルスの天然の構造にみられるように、遺伝子に適切な非コード領域が付随する。
したがって、一実施形態では、制限部位および／または導入遺伝子をコードするＤＮＡなどのインサートをゲノムウイルスＤＮＡの非コード領域、例えばイントロン配列または遺伝子間配列などに挿入する。それでも、アデノウイルスの非コード領域のなかには、例えば選択的スプライシング、転写調節または翻訳調節に何らかの機能を有するものもあり、このことを考慮に入れる必要があることもある。
本明細書で明らかにされるＬ５領域に付随する部位は、複雑な実体、例えばＲＮＡｉ、サイトカイン、抗体などの一本鎖タンパク質または多量体タンパク質などをコードする様々なＤＮＡ配列を収容するのに適したものである。
本明細書で使用される遺伝子は、コード配列およびそれに付随する任意の非コード配列、例えばイントロンおよび付随するエキソンを指す。一実施形態では、遺伝子は不可欠な構造構成要素、例えばコード領域のみを含むか、これのみよりなるものである。
以下でアデノウイルスの具体的な構造要素に関して論じる。
逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）配列はあらゆる既知のアデノウイルスに共通するものであり（その対称性が理由でそう呼ばれる）、ウイルス染色体の複製起点となっている。この配列のまた別の特性としてヘアピン形成能がある。
本明細書で使用される５’ＩＴＲは、アデノウイルスの５’末端に由来するＩＴＲの一部または全部であって、アデノウイルスのしかるべき位置に組み込めばＩＴＲの機能が保持されるものを指す。一実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号２１の約１ｂｐ～１３８ｂｐの配列またはその全長にわたって同配列と９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一の配列、特に配列番号２１の約１ｂｐ～１３８ｂｐからなる配列を含むか、これよりなるものである。
本明細書で使用される３’ＩＴＲは、アデノウイルスの３’末端に由来するＩＴＲの一部または全部であって、アデノウイルスのしかるべき位置に組み込めばＩＴＲの機能が保持されるものを指す。一実施形態では、３’ＩＴＲは、配列番号２１の約３２１８９ｂｐ～３２３２６ｂｐの配列またはその全長にわたって同配列と９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一の配列、特に配列番号２１の約３２１８９ｂｐ～３２３２６ｂｐからなる配列を含むか、これよりなるものである。
本明細書で使用されるＢ１は、アデノウイルス由来のＥ１Ａの一部または全部をコードするＤＮＡ配列、アデノウイルスのＥ１Ｂ領域の一部または全部をコードするＤＮＡ配列ならびにアデノウイルスのＥ１Ａ領域およびＥ１Ｂ領域の一部または全部を別々にコードするＤＮＡ配列を指す。
Ｂ１が結合である場合、Ｅ１Ａ配列およびＥ１Ｂ配列は、ウイルスから削除されることになる。一実施形態では、Ｂ１は結合であり、したがって、ウイルスはベクターである。
一実施形態では、Ｂ１は導入遺伝子をさらに含む。Ｅ１領域は、Ｅ１領域を分断する形で（すなわち、配列の「中央」に）挿入され得る導入遺伝子を収容することが可能であること、あるいはＥ１領域の一部または全部を削除して遺伝物質を収容する余地を広げ得ることが当該技術分野で公知である。
本明細書で使用されるＥ１Ａは、アデノウイルスＥ１Ａ領域の一部または全部をコードするＤＮＡ配列を指す。後者はここでは、ポリペプチド／タンパク質のＥ１Ａを指す。必要に応じてこれを変異させ、Ｅ１Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質が、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換（例えば、全長でアミノ酸１個、２個、３個、４個または５個の置換、付加および／または欠失）を有し、野生型（すなわち、対応する非変異タンパク質）と同じ機能をもち；野生型タンパク質に比して機能が増大し；野生型タンパク質に比して機能が低下し、例えば機能がなくなり；または野生型タンパク質に比して新たな機能をもち、あるいはこれらを組み合わせが生じるようにしてもよい。
本明細書で使用されるＥ１Ｂは、アデノウイルスＥ１Ｂ領域（すなわち、ポリペプチドまたはタンパク質）の一部または全部をコードするＤＮＡ配列を指し、必要に応じてこれを変異させ、Ｅ１Ｂ遺伝子／領域によってコードされるタンパク質が、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換（例えば、全長でアミノ酸１個、２個、３個、４個または５個の置換、付加および／または欠失）を有し、野生型（すなわち、対応する非変異タンパク質）と同じ機能をもち；野生型タンパク質に比して機能が増大し；野生型タンパク質に比して機能が低下し、例えば機能がなくなり；または野生型タンパク質に比して新たな機能をもち、あるいはこれらを組み合わせが起こるようにしてもよい。
したがって、Ｂ１は、野生型Ｅ１領域、例えば野生型のＥ１Ａおよび／またはＥ１Ｂなどに比して改変してもしなくてもよい。当業者であれば、Ｅ１Ａおよび／またはＥ１Ｂが存在するか、（一部が）欠失または変異しているかどうかを容易に確認することができる。
本明細書で使用される野生型は、既知のアデノウイルスまたは既知のアデノウイルスに由来する配列を指す。既知のアデノウイルスとは、配列情報が入手可能であるかどうかに関係なく、既に同定および命名されているアデノウイルスのことである。
一実施形態では、Ｂ１は配列番号２１の１３９ｂｐ～３９３２ｂｐの配列を有する。
本明細書で使用されるＢＡは、Ｅ２Ｂ－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３－Ｅ２Ａ－Ｌ４領域をコードし、必要に応じて任意の非コード配列（特にアデノウイルス由来の天然の配列に対応するもの）を含む、ＤＮＡ配列を指す。この配列は一般に導入遺伝子を含まない。一実施形態では、この配列は、既知のアデノウイルス、例えば表１に示される血清型、特にＢ群ウイルス、例えばＡｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ５１またはその組合せ、例えばＡｄ３、Ａｄ１１またはその組合せなどに由来する連続する配列と実質的にほぼ同じであるか一致する。一実施形態では、Ｅ２Ｂ－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３－Ｅ２Ａ－Ｌ４は、これらの諸要素のほかにもこの領域に付随する構造要素を含むことを表し、例えば、ＢＡは一般に、例えばＩＶ２Ａ ＩＶ２ａ－Ｅ２Ｂ－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３－Ｅ２Ａ－Ｌ４のように、タンパク質ＩＶ２ａをコードする配列を含む。
一実施形態では、Ｅ２Ｂ領域はキメラである。つまり、２つ以上の異なるアデノウイルス血清型、例えばＡｄ３およびＡｄ１１ｐなどのＡｄ１１に由来するＤＮＡ配列を含む。一実施形態では、Ｅ２Ｂ領域は、配列番号２１の５０６８ｂｐ～１０３５５ｂｐの配列またはその全長に対して同配列と９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一の配列を有する。
一実施形態では、構成要素ＢＡのＥ２Ｂは、配列番号２２（国際公開第２００５／１１８８２５号に開示される配列番号３に対応する）で示される配列を含む。
一実施形態では、ＢＡは配列番号２１の３９３３ｂｐ～２７１８４ｂｐの配列を有する。
本明細書で使用されるＥ３は、アデノウイルスＥ３領域（すなわち、タンパク質／ポリペプチド）の一部または全部をコードするＤＮＡ配列を指し、必要に応じてこれを変異させ、Ｅ３遺伝子によってコードされるタンパク質が、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換（例えば、全長でアミノ酸１個、２個、３個、４個または５個の置換、付加および／または欠失）を有し、野生型（対応する非変異タンパク質）と同じ機能をもち；野生型タンパク質に比して機能が増大し；野生型タンパク質に比して機能が低下し、例えば機能がなくなり；または野生型タンパク質に比して新たな機能をもち、あるいはこれらの組み合わせが起こるようにしてもよい。
一実施形態では、Ｅ３領域は、表１に示されるアデノウイルス血清型またはその組合せ、特にＢ群血清型、例えばＡｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１１（特にＡｄ１１ｐ）、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ５１またはその組合せ、例えばＡｄ３、Ａｄ１１（特にＡｄ１１ｐ）またはその組合せなどに由来するものである。一実施形態では、Ｅ３領域は配列番号２３で示される配列を有する。
一実施形態では、Ｅ３領域は一部が欠失している、例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％欠失している。
一実施形態では、Ｂ２は結合であり、Ｅ３領域をコードするＤＮＡが存在しない。
一実施形態では、Ｅ３領域をコードするＤＮＡが導入遺伝子によって置換または分断されていてよい。本明細書で使用される場合、本明細書で使用される導入遺伝子によって置換された「Ｅ３領域」は、Ｅ３領域の一部または全部が導入遺伝子に置き換わったものを含む。
一実施形態では、Ｂ２領域は配列番号２４の２７１８５ｂｐ～２８１６５ｂｐの配列を含む。
一実施形態では、Ｂ２は配列番号２４の２７１８５ｂｐ～２８１６５ｂｐの配列からなる。
本明細書で使用されるＢＸは、ＢＢのＬ５遺伝子の５’末端に近接するＤＮＡ配列を指す。本明細書で使用されるＬ５遺伝子の５’末端に近接または隣接するとは、Ｌ５遺伝子またはそれに本来付随する非コード領域の５’末端に隣接している（連続している）こと、すなわち、Ｌ５遺伝子またはそれに本来付随する非コード領域の５’プライム末端に隣接している、または連続していることを指す。あるいは、近接または隣接するとは、Ｌ５遺伝子に近い位置にあり、ＢＸ領域とＬ５遺伝子の５’末端との間にコード配列が存在しないことを指すこともある。
したがって、一実施形態では、ＢＸは、例えばＬ５遺伝子のコード配列の始まりを表す、Ｌ５の塩基と直接連結している。
したがって、一実施形態では、ＢＸは、例えば非コード配列の始まりを表すＬ５の塩基と直接連結しているか、Ｌ５に天然に付随する非コード領域と直接連結している。本明細書で使用されるＬ５に天然に付随する非コード領域は、Ｌ５遺伝子の一部であるかそれに連続しているが、別の遺伝子の一部ではない非コード領域の一部または全部を指す。
一実施形態では、ＢＸは配列番号２４の配列を含む。この配列は人工非コード配列であり、例えば導入遺伝子（または導入遺伝子カセット）、制限部位またはその組合せを含むＤＮＡ配列をその中に挿入し得る。この配列は、導入遺伝子の正確な位置にいくぶん柔軟性を与えると同時にウイルスの安定性および生存能に対する破壊的作用を最小限に抑えるという点で緩衝的な役割を果たすため有利である。
インサート（１つまたは複数）は、配列番号２４内の５’末端、３’末端または１ｂｐ～２０１ｂｐの間の任意の地点のいずれに存在してもよく、例えば、塩基対１／２、２／３、３／４、４／５、５／６、６／７、７／８、８／９、９／１０、１０／１１、１１／１２、１２／１３、１３／１４、１４／１５、１５／１６、１６／１７、１７／１８、１８／１９、１９／２０、２０／２１、２１／２２、２２／２３、２３／２４、２４／２５、２５／２６、２６／２７、２７／２８、２８／２９、２９／３０、３０／３１、３１／３２、３２／３３、３３／３４、３４／３５、３５／３６、３６／３７、３７／３８、３８／３９、３９／４０、４０／４１、４１／４２、４２／４３、４３／４４、４４／４５、４５／４６、４６／４７、４７／４８、４８／４９、４９／５０、５０／５１、５１／５２、５２／５３、５３／５４、５４／５５、５５／５６、５６／５７、５７／５８、５８／５９、５９／６０、６０／６１、６１／６２、６２／６３、６３／６４、６４／６５、６５／６６、６６／６７、６７／６８、６８／６９、６９／７０、７０／７１、７１／７２、７２／７３、７３／７４、７４／７５、７５／７６、７６／７７、７７／７８、７８／７９、７９／８０、８０／８１、８１／８２、８２／８３、８３／８４、８４／８５、８５／８６、８６／８７、８７／８８、８８／８９、８９／９０、９０／９１、９１／９２、９２／９３、９３／９４、９４／９５、９５／９６、９６／９７、９７／９８、９８／９９、９９／１００、１００／１０１、１０１／１０２、１０２／１０３、１０３／１０４、１０４／１０５、１０５／１０６、１０６／１０７、１０７／１０８、１０８／１０９、１０９／１１０、１１０／１１１、１１１／１１２、１１２／１１３、１１３／１１４、１１４／１１５、１１５／１１６、１１６／１１７、１１７／１１８、１１８／１１９、１１９／１２０、１２０／１２１、１２１／１２２、１２２／１２３、１２３／１２４、１２４／１２５、１２５／１２６、１２６／１２７、１２７／１２８、１２８／１２９、１２９／１３０、１３０／１３１、１３１／１３２、１３２／１３３、１３３／１３４、１３４／１３５、１３５／１３６、１３６／１３７、１３７／１３８、１３８／１３９、１３９／１４０、１４０／１４１、１４１／１４２、１４２／１４３、１４３／１４４、１４４／１４５、１４５／１４６、１４６／１４７、１４７／１４８、１４８／１４９、１５０／１５１、１５１／１５２、１５２／１５３、１５３／１５４、１５４／１５５、１５５／１５６、１５６／１５７、１５７／１５８、１５８／１５９、１５９／１６０、１６０／１６１、１６１／１６２、１６２／１６３、１６３／１６４、１６４／１６５、１６５／１６６、１６６／１６７、１６７／１６８、１６８／１６９、１６９／１７０、１７０／１７１、１７１／１７２、１７２／１７３、１７３／１７４、１７４／１７５、１７５／１７６、１７６／１７７、１７７／１７８、１７８／１７９、１７９／１８０、１８０／１８１、１８１／１８２、１８２／１８３、１８３／１８４、１８４／１８５、１８５／１８６、１８６／１８７、１８７／１８８、１８９／１９０、１９０／１９１、１９１／１９２、１９２／１９３、１９３／１９４、１９４／１９５、１９５／１９６、１９６／１９７、１９７／１９８、１９８／１９９、１９９／２００または２００／２０１の間に存在し得る。
一実施形態では、ＢＸは、２７ｂｐと２８ｂｐとの間または配列番号２４の位置２８１９２ｂｐと位置２８１９３ｂｐとの間に対応する場所にＤＮＡ配列が挿入された配列番号２４を含む。
一実施形態では、ＢＸは配列番号２１の２８１６６ｂｐ～２８３６６ｂｐの配列を有する。一実施形態では、ＢＸは結合である。
本明細書で使用されるＢＢは、Ｌ５領域をコードするＤＮＡ配列を指す。本明細書で使用されるＬ５領域は、文脈上必要に応じて、ファイバーポリペプチド／タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列を指す。ファイバー遺伝子／領域は、アデノウイルスの主要なキャプシド構成要素であるファイバータンパク質をコードする。ファイバーは、受容体認識に機能し、アデノウイルスが細胞に選択的に結合し感染する能力に寄与する。
本開示のウイルスでは、ファイバーは任意のアデノウイルス血清型由来のものであってよく、血清型の異なるアデノウイルスのファイバーを改変して得られるキメラのアデノウイルスも本開示で想定される。一実施形態では、ファイバーはＢ群ウイルス、特にＡｄ１１ｐなどのＡｄ１１に由来するものである。
一実施形態では、ＢＢは配列番号２１の２８３６７ｂｐ～２９３４４ｂｐの配列を有する。
本明細書で使用されるＢＹに関連するＤＮＡ配列は、ＢＢのＬ５遺伝子の３’末端に近接するＤＮＡ配列を指す。本明細書で使用されるＬ５遺伝子の３’末端に近接または隣接するとは、Ｌ５遺伝子またはそれに本来付随する非コード領域の３’末端に隣接している（連続している）こと、すなわち、Ｌ５遺伝子またはそれに本来付随する非コード領域（すなわち、Ｌ５に内在する非コード配列の全部または一部）の３’プライム末端に隣接している、または連続していることを指す。あるいは、近接または隣接するとは、Ｌ５遺伝子に近い位置にあり、ＢＹ領域とＬ５遺伝子の３’末端との間にコード配列が存在しないことを指すこともある。
したがって、一実施形態では、ＢＹは、コード配列の「終わり」を表すＬ５の塩基と直接連結している。
したがって、一実施形態では、ＢＹは、非コード配列の「終わり」を表すＬ５の塩基と直接連結しているか、Ｌ５に天然に付随する非コード領域と直接連結している。
本来と天然には、本明細書では互換的に使用される。一実施形態では、ＢＹは配列番号２５の配列を含む。この配列は非コード配列であり、例えば導入遺伝子（または導入遺伝子カセット）、制限部位またはその組合せを含むＤＮＡ配列をその中に挿入し得る。この配列は、導入遺伝子の正確な位置にいくぶん柔軟性を与えると同時にウイルスの安定性および生存能に対する破壊的作用を最小限に抑えるという点で緩衝的な役割を果たすため有利である。
インサート（１つまたは複数）は、配列番号２２内の５’末端、３’末端または１ｂｐ～３５ｂｐの間の任意の地点のいずれに存在してもよく、例えば、塩基対１／２、２／３、３／４、４／５、５／６、６／７、７／８、８／９、９／１０、１０／１１、１１／１２、１２／１３、１３／１４、１４／１５、１５／１６、１６／１７、１７／１８、１８／１９、１９／２０、２０／２１、２１／２２、２２／２３、２３／２４、２４／２５、２５／２６、２６／２７、２７／２８、２８／２９、２９／３０、３０／３１、３１／３２、３２／３３、３３／３４または３４／３５の間に存在し得る。
一実施形態では、ＢＹは、位置１２ｂｐと位置１３ｂｐとの間または配列番号２１の２９３５６ｂｐおよび２９３５７ｂｐに対応する場所にＤＮＡ配列が挿入された配列番号２５を含む。一実施形態では、インサートは制限部位インサートである。一実施形態では、制限部位インサートは１つまたは２つの制限部位を含む。一実施形態では、制限部位は、２つの制限部位を含む１９ｂｐの制限部位インサートである。一実施形態では、制限部位インサートは、１つの制限部位を含む９ｂｐの制限部位インサートである。一実施形態では、制限部位インサートは、１つまたは２つの制限部位と少なくとも１つの導入遺伝子、例えば、１つ、２つまたは３つの導入遺伝子、例えば１つまたは２つの導入遺伝子などとを含む。一実施形態では、制限部位は、２つの制限部位と少なくとも１つの導入遺伝子、例えば１つまたは２つの導入遺伝子とを含む、１９ｂｐの制限部位インサートである。一実施形態では、制限部位インサートは、１つの制限部位と少なくとも１つの導入遺伝子、例えば１つまたは２つの導入遺伝子とを含む、９ｂｐの制限部位インサートである。一実施形態では、（例えば、導入遺伝子カセット内で）２つの制限部位が１つまたは複数の導入遺伝子、例えば２つの導入遺伝子などを挟んでいる。一実施形態では、ＢＹが２つの制限部位を含む場合、前記制限部位は互いに異なるものである。一実施形態では、ＢＹの前記１つまたは複数の制限部位は、それが挿入されている特定のアデノウイルスゲノムには天然にみられないもの（独自のものなど）である。一実施形態では、ＢＹの前記１つまたは複数の制限部位は、アデノウイルスゲノムのほかの場所に位置する別の制限部位とは異なるものである、例えば、天然の制限部位またはＢＸなどのゲノムの別の部分に導入された制限部位とは異なるものである。したがって、一実施形態では、制限部位（１つまたは複数）によって区画内のＤＮＡを特異的に切り取ることが可能になる。
一実施形態では、ＢＹは配列番号２１の２９３４５ｂｐ～２９３７９ｂｐの配列を有する。一実施形態では、ＢＹは結合である。
一実施形態では、インサートは配列番号２５の１２ｂｐの後ろにある。
一実施形態では、インサートは配列番号２１の約２９３５６ｂｐの位置にある。
一実施形態では、インサートは、１つまたは複数の導入遺伝子、例えば、１つ、２つまたは３つ、例えば１つまたは２つなどの導入遺伝子を含む導入遺伝子カセットである。
本明細書で使用されるＥ４は、アデノウイルスＥ４領域（すなわち、ポリペプチド／タンパク質領域）の一部または全部をコードするＤＮＡ配列を指し、必要に応じてこれを変異させ、Ｅ４遺伝子によってコードされるタンパク質が、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換（例えば、アミノ酸１個、２個、３個、４個または５個の置換、付加および／または欠失）を有し、野生型（対応する非変異タンパク質）と同じ機能をもち；野生型タンパク質に比して機能が増大し；野生型タンパク質に比して機能が低下し、例えば機能がなくなり；または野生型タンパク質に比して新たな機能をもち、あるいはこれらを組み合わせが生じるようにしてもよい。
一実施形態では、Ｅ４領域は一部が欠失している、例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％欠失している。一実施形態では、Ｅ４領域は配列番号２１の３２１８８ｂｐ～２９３８０ｂｐの配列を有する。
一実施形態では、Ｅ４は、欠失しているＥ４ｏｒｆ４領域以外が存在する。
一実施形態では、Ｂ３は結合である、すなわちＥ４が存在しない。
一実施形態では、Ｂ３は、配列番号２１の３２１８８ｂｐ～２９３８０ｂｐからなる配列を有する。
本明細書で使用される数値範囲には端点が含まれる。
当業者であれば、本明細書の式（Ｉ）、（Ｉａ）などの式の要素は連続したものであり、非コードＤＮＡ配列のほか本明細書で言及される遺伝子およびコードＤＮＡ配列（構造的特徴）を具体的に表し得ることが理解されよう。１つまたは複数の実施形態では、本開示の式は、アデノウイルスゲノムに天然に存在する配列を記載することを試みるものである。この場合、その式は、ゲノムの関連する区画を特徴付ける主要な要素を表しており、ＤＮＡの一続きのゲノムを網羅的に表すことを意図するものではないことが当業者には明らかであろう。
本明細書で使用されるＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ３およびＥ４はそれぞれ独立して、野生型のほか、各領域が本明細書に記載されるように変異または部分的に欠失したその同等物、特に既知のアデノウイルスに由来する野生型配列を指す。
本明細書で使用される「インサート」は、５’末端もしくは３’末端に挿入されるか、所与のＤＮＡ配列の参照区画内にその参照配列を分断する形で挿入されるＤＮＡ配列を指す。インサートが位置する地点に対する参照地点として使用される参照配列。本開示の場合、インサートは一般に、配列番号２４または配列番号２５の中に存在する。インサートは、制限部位インサート、導入遺伝子カセットまたはその両方であり得る。ウイルスは、配列によって分断されてもなお元の配列を含んでいるが、それは一般に、インサートを挟む２つのフラグメントとして存在することになる。
一実施形態では、導入遺伝子または導入遺伝子カセットは、バイアスのない挿入トランスポゾン、例えばＴＮ７トランスポゾンまたはその一部分を含まない。本明細書で使用されるＴｎ７トランスポゾンは、国際公開第２００８／０８０００３号に記載されているバイアスのない挿入トランスポゾンを指す。
一実施形態では、導入遺伝子または導入遺伝子カセットは調節エレメントまたは調節配列をさらに含む。
その他の調節配列
本明細書で使用される「遺伝子発現調節因子」（または調節因子／調節エレメント）は、通常は転写または翻訳を開始または増大させることによって、遺伝子発現に何らかの役割を果たす、プロモーター配列、エンハンサー配列またはスプライスアクセプター配列などの遺伝子要素を指す。
本明細書で使用される「スプライスアクセプター配列」、「スプライスアクセプター」または「スプライス部位」は、スプライセオソーム複合体の核内低分子リボ核タンパク質によってｍＲＮＡ分子が認識される時点を決定する調節配列を指す。スプライセオソームが会合すると、これがｍＲＮＡ分子のスプライスアクセプター部位と上流のスプライスドナー部位との間のスプライシングを触媒し、翻訳されて単一のポリペプチドまたはタンパク質を生じ得る成熟ｍＲＮＡ分子が生じる。
本発明には様々な大きさのスプライスアクセプター配列を用いてよく、これらは短いスプライスアクセプター（小）、スプライスアクセプター（中）および分岐スプライスアクセプター（大）と表され得る。
本明細書で使用されるＳＳＡは、通常はスプライス部位のみを含む、例えば４ｂｐの短いスプライスアクセプターを指す。本明細書で使用されるＳＡは、通常は短いスプライスアクセプターとポリピリミジントラクトとを含む、例えば１６ｂｐのスプライスアクセプターを指す。本明細書で使用されるｂＳＡは、通常は短いスプライスアクセプターとポリピリミジントラクトと分岐点とを含む、例えば２６ｂｐの分岐スプライスアクセプターを指す。
一実施形態では、本開示の構築物に使用するスプライスアクセプターは、ＣＡＧＧまたは配列番号３もしくは４である。一実施形態では、ＳＳＡは配列番号ＣＡＧＧのヌクレオチド配列を有する。一実施形態では、ＳＡは配列番号２３のヌクレオチド配列を有する。一実施形態では、ｂＳＡはｃａｇｇのヌクレオチド配列を有する。一実施形態では、スプライスアクセプター配列は、ｔｇｃｔａａｔｃｔｔ ｃｃｔｔｔｃｔｃｔｃ ｔｔｃａｇｇ（配列番号４）、ｔｔｔｃｔｃｔｃｔｔ ｃａｇｇ（配列番号３）およびｃａｇｇを含む群より独立して選択される。
一実施形態では、スプライス部位のすぐ後にＣＣＡＣＣを含む共通のコザック配列が続く（すなわち、５’から３’方向に向かって続く）。一実施形態では、スプライス部位とコザック配列との間に最大１００ｂｐ以下の間隔がある（隔てられている）。一実施形態では、コザック配列はＣＣＡＣＣのヌクレオチド配列を有する。
通常、内在性プロモーターまたは外来プロモーター（例えば内在性プロモーターなど）の制御下にある場合、コード配列の直前にコザック配列がある。コード領域の始まりは開始コドン（ＡＵＧ）によって示され、例えば配列（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧｇ［配列番号１０５］の場合、コード配列の開始部分の始まりは、太字の塩基によって示される。小文字は、この位置によくみられる（ただし、異なる場合もある）塩基を表し、大文字は高度に保存された塩基を表し、すなわち、「ＡＵＧＧ」配列は不変であるか、仮に変化するとしてもまれである。「Ｒ」は、この位置には通常、プリン（アデニンまたはグアニン）がみられることを表し、括弧内の配列（ｇｃｃ）は意義が明らかにされていない。したがって、一実施形態では、開始コドンＡＵＧをコザック配列に組み込む。
本明細書で使用される内部リボソーム進入ＤＮＡ配列は、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）をコードするＤＮＡ配列を指す。本明細書で使用されるＩＲＥＳは、ｍＲＮＡ配列内で始まる開始を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列の翻訳の開始を可能にするヌクレオチド配列を意味する。これは、カセットがポリシストロニックｍＲＮＡをコードする場合に特に有用である。ＩＲＥＳを使用するとポリシストロニックｍＲＮＡが生じ、これが複数の個々のタンパク質またはペプチドに翻訳される。一実施形態では、内部リボソーム進入ＤＮＡ配列は配列番号６のヌクレオチド配列を有する。一実施形態では、ゲノム内で特定のＩＲＥＳを１回のみ使用する。このことは、ゲノムの安定性の点で有益であり得る。
本明細書で使用される「高自己切断効率２Ａペプチド」または「２Ａペプチド」は、翻訳後に効率的に切断されるペプチドを指す。適切な２Ａペプチドとしては、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｅ２ＡおよびＴ２Ａが挙げられる。本発明者らは、所与の２Ａペプチドをコードする特定のＤＮＡ配列を１回使用すると、２回目に同じ特定のＤＮＡ配列を使用してはいけないことに気付いた。しかし、ＤＮＡコードの冗長性を利用して、同じ２Ａペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列を作製し得る。２Ａペプチドの使用は、カセットがポリシストロニックｍＲＮＡをコードする場合に特に有用である。２Ａペプチドを使用すると単一のポリペプチド鎖が生じ、これが翻訳され、さらに翻訳後修飾を受けて複数の個々のタンパク質またはペプチドが生じる。
一実施形態では、使用する被コードＰ２Ａペプチドは配列番号７のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、使用する被コードＦ２Ａペプチドは配列番号８のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、使用する被コードＥ２Ａペプチドは配列番号９のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、使用する被コードＴ２Ａペプチドは配列番号１０のアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、導入遺伝子がコードする１つのｍＲＮＡまたは各ｍＲＮＡは、通常、ｍＲＮＡ配列の末端などに、例えば配列番号５に示されるポリアデニル化シグナル配列を含む。したがって、一実施形態では、導入遺伝子または導入遺伝子カセットは、ポリアデニル化シグナル配列をコードする配列を少なくとも１つ含む。
本明細書で使用される「ＰｏｌｙＡ」、「ポリアデニル化シグナル」または「ポリアデニル化配列」は、通常、ＡＡＴＡＡＡ部位を含み、転写された後、その新生ｍＲＮＡ分子を切断しポリアデニル化する多タンパク質複合体によって認識され得る、ＤＮＡ配列を意味する。
一実施形態では、ポリアデニル化配列は配列番号５のヌクレオチド配列を有する。
一実施形態では、構築物はポリアデニル化配列を含まない。一実施形態では、遺伝子発現調節因子はスプライスアクセプター配列である。
一実施形態では、抗体または抗体結合フラグメントなどのタンパク質／ポリペプチド／ペプチドをコードする配列は、ポリアデニル化シグナルをさらに含む。
一実施形態では、本明細書に開示される配列を有するウイルスまたは構築物、例えば、ＮＧ－３３０（配列番号１６）；ＮＧ－３３４（配列番号１７）；ＮＧ－３４５（配列番号１８）；ＮＧ－３４６（配列番号１９）；ＮＧ－３４７（配列番号２０）およびＮＧ－３４８（配列番号９６）から選択されるウイルスを提供する。
一実施形態では、ウイルスはＮＧ－３４７（配列番号２０）またはＮＧ－３４８（配列番号９６）である。
製剤
本開示はこのほか、本明細書に記載されるウイルスの医薬製剤に及ぶ。
一実施形態では、本開示による複製可能な腫瘍溶解性の例えば注入または注射用の液体非経口製剤であって、ウイルス粒子の投与量が１投与体積当たり１×１０１０～１×１０１４個の範囲内にある製剤を提供する。
非経口製剤は、ＧＩ管から送達しないように設計された製剤を意味する。典型的な非経口送達経路としては、注射、埋植または注入が挙げられる。一実施形態では、製剤をボーラス送達用の形態で提供する。
一実施形態では、非経口製剤は注射剤の形態である。注射剤としては、静脈内注射剤、皮下注射剤、腫瘍内注射剤または筋肉内注射剤が挙げられる。本明細書で使用される注射は、シリンジから体内に液体を挿入することを意味する。一実施形態では、本開示の方法は腫瘍内注射を含まない。
一実施形態では、非経口製剤は注入剤の形態である。
本明細書で使用される注入は、点滴、注入ポンプ、シリンジポンプまたはそれに相当する装置によって比較的遅い速度で液体を投与することを意味する。一実施形態では、注入を１．５分～１２０分の範囲の時間、例えば約３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、６５分、８０分、８５分、９０分、９５分、１００分、１０５分、１１０分または１１５分にわたって実施する。
一実施形態では、例えば、シリンジポンプによって投与する１００ｍｌ未満、例えば３０ｍｌの製剤の１回用量。
一実施形態では、注射を低速注射として例えば１．５～３０分の時間にわたって実施する。
一実施形態では、製剤は静脈内（ｉ．ｖ．）投与用のものである。この経路は、器官および組織の大部分に短時間で到達させることが可能であることから、腫瘍溶解性ウイルスの送達に特に効果的であるほか、転移、例えば確立された転移、特に肝臓および肺などの血管に富む領域にある転移の治療に特に有用である。
治療剤は通常、製造および保管の条件下で無菌かつ安定である。組成物は、ヒトへの投与に適した液剤、マイクロエマルション剤、リポソーム剤をはじめとする非経口製剤として製剤することが可能であり、特に単回用量でシリンジまたはバイアルなどの予め充填した装置として製剤化してもよい。
製剤は一般に、薬学的に許容される希釈剤または担体、例えば、ウイルスと適合性があり、中のウイルスが必要とされる期間にわたって安定である無毒性の等張な担体を含む。
担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびその適切な混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、分散剤または界面活性剤、例えばレシチンまたはポリソルベート８０もしくはポリソルベート４０などの非イオン性界面活性剤などの使用によって維持することができる。分散液中では、界面活性剤の存在によって、必要とされる粒子径の維持が補助され得る。等張剤の例としては、組成物中の糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトールなどまたは塩化ナトリウムが挙げられる。
一実施形態では、使用する非経口製剤は、緩衝剤、例えば４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸、リン酸緩衝剤および／またはトリス緩衝剤、糖、例えばデキストロース、マンノース、スクロースまたはこれに類似するもの、塩、例えば塩化ナトリウム、塩化マグネシウムまたは塩化カリウムなど、界面活性剤、例えばｂｒｉｊ、ＰＳ－８０、ＰＳ－４０またはこれに類似するものなどの非イオン性界面活性剤などのうちの１つまたは複数のものを含み得る。製剤はこのほか、起こり得る分解の１つまたは複数の経路を阻害すると考えられるＥＤＴＡもしくはエタノールまたはＥＤＴＡとエタノールの組合せなどの保存剤を含み得る。
一実施形態では、製剤は、精製された本開示による腫瘍溶解性ウイルス、例えば、１用量当たり１×１０１０～１×１０１４個のウイルス粒子、例えば１用量当たり１×１０１０～１×１０１２個のウイルス粒子を含む。一実施形態では、製剤中のウイルスの濃度は２×１０８～２×１０１４ｖｐ／ｍｌの範囲内、例えば２×１０１２ｖｐ／ｍｌなどである。
一実施形態では、非経口製剤はグリセロールを含む。
一実施形態では、製剤は、本明細書に記載される腫瘍溶解性アデノウイルスと、ＨＥＰＥＳ（Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸）と、グリセロールと、緩衝剤とを含む。
一実施形態では、非経口製剤は、本開示のウイルスと、ＨＥＰＥＳ（例えば、５ｍＭ）と、グリセロール（例えば、５～２０％（ｖ／ｖ））と、塩酸（例えば、ｐＨを７～８の範囲に調整するためのもの）と、注射用水とからなる。
一実施形態では、濃度２×１０１２ｖｐ／ｍＬの本開示のウイルス０．７ｍＬを、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０％グリセロールを用いて最終ｐＨ７．８で製剤化する。
薬学的に許容される担体については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、ニュージャージー州、１９９１）で徹底的に論じられている。
一実施形態では、吸入を含めた局所投与用の製剤として製剤を提供する。
適切な吸入製剤としては、吸入粉末剤、噴射ガスを含有する定量式エアゾール剤または噴射ガスを含まない吸入液剤が挙げられる。本開示による吸入粉末剤は一般に、本明細書に記載されるウイルスを生理的に許容される添加剤とともに含有する。
このような吸入粉末剤は、単糖（例えば、グルコースまたはアラビノース）、二糖（例えば、ラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ糖および多糖（例えば、デキストラン）、ポリアルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）または上記のもの同士の混合物を含み得る。ラクトースまたはグルコースなどの単糖または二糖は、限定されるわけではないが、特にその水和物の形態で使用するのに適している。
肺に沈着させる粒子は、１０ミクロン未満、例えば１～９ミクロン、例えば０．１～５μｍ、特に１～５μｍなどの粒子径が必要である。ウイルスを運搬する粒子の大きさはもっとも重要なものであり、このため一実施形態では、本開示によるウイルスを粒子、例えば所与の大きさのラクトース粒子などの上に吸着または吸収させ得る。
吸入エアゾール剤の調製に使用し得る噴射ガスは当該技術分野で公知である。適切な噴射ガスは、ｎ－プロパン、ｎ－ブタンまたはイソブタンなどの炭化水素のほか、ハロゲン化炭化水素、例えばメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパンまたはシクロブタンの塩素化誘導体および／またはフッ素化誘導体などのなかから選択される。上記の噴射ガスは単独で使用しても、その混合物として使用してもよい。
特に適した噴射ガスは、ＴＧ １１、ＴＧ １２、ＴＧ １３４ａおよびＴＧ２２７のなかから選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上記のハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２－テトラフルオロエタン）およびＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３－ヘプタフルオロプロパン）ならびにその混合物が特に適している。
噴射ガス含有吸入エアゾール剤はほかにも、他の成分、例えば共溶媒、安定剤、界面活性剤、抗酸化剤、滑沢剤およびｐＨ調整手段などを含有し得る。上記の成分はいずれも当該技術分野で公知のものである。
本発明による噴射剤ガス含有吸入エアゾール剤は、活性物質を最大５重量％含有し得る。本発明によるエアゾール剤は、有効成分を例えば、０．００２～５重量％、０．０１～３重量％、０．０１５～２重量％、０．１～２重量％、０．５～２重量％または０．５～１重量％含有する。
あるいは、肺への局所投与は、例えば、噴霧器などの装置、例えば圧縮機と接続した噴霧器（例えば、バージニア州リッチモンドのＰａｒｉ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ社製のＰａｒｉ Ｍａｓｔｅｒ（登録商標）圧縮機と接続したＰａｒｉ ＬＣ－Ｊｅｔ Ｐｌｕｓ（登録商標）噴霧器）などを用いる、液状の液剤または懸濁剤の投与によるものであってもよい。
本発明のウイルスを、例えば非経口製剤に関して既に上に記載したように、溶媒に分散させて、例えば溶液または懸濁液の形態で送達することができる。本発明のウイルスをしかるべき生理溶液、例えば、生理食塩水をはじめとする薬学的に許容される溶媒または緩衝溶液に懸濁させることができる。当該技術分野で公知の緩衝溶液は、ｐＨが約４．０～５．０になるよう水１ｍｌ当たりエデト酸二ナトリウムを０．０５ｍｇ～０．１５ｍｇ、ＮａＣｌを８．０ｍｇ～９．０ｍｇ、ポリソルベートを０．１５ｍｇ～０．２５ｍｇ、無水クエン酸を０．２５ｍｇ～０．３０ｍｇおよびクエン酸ナトリウムを０．４５ｍｇ～０．５５ｍｇ含有するものであり得る。
治療用の懸濁剤または液剤はほかにも、１つまたは複数の添加剤を含有し得る。添加剤は当該技術分野で周知のものであり、緩衝剤（例えば、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤および炭酸水素緩衝剤）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールがこれに含まれる。液剤または懸濁剤をリポソームまたは生分解性マイクロスフェアに封入することができる。製剤は一般に、無菌製造工程を用いて実質的に無菌の形態で提供される。
これには、当業者によく知られた方法による、製剤に使用する緩衝溶媒／溶液のろ過による生産および滅菌、無菌緩衝溶媒溶液への抗体の無菌懸濁ならびに製剤の無菌の入れ物への分注が含まれ得る。
本開示による噴霧製剤を、例えばホイル製の包装材料に包装した単回用量単位（例えば、密封したプラスチック製の容器またはバイアル）として提供し得る。各バイアルには、一定体積、例えば２ｍＬの溶媒／溶液緩衝剤に単回用量を溶かしたものが含まれている。
本開示はほかにも、例えば国際公開第２００９／０６８８７７号および米国特許出願公開第２００４／０１５３０３３号（ともに参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている装置を用いて鼻腔内に送達する、液状の液剤または懸濁剤に及ぶ。
治療
さらなる態様では、本開示は治療、特に癌治療に使用するための本明細書に記載されるウイルスまたはその製剤に及ぶ。
一実施形態では、治療方法は腫瘍の治療に用いるものである。
本明細書で使用される腫瘍は、制御不能で進行性の過剰な細胞分裂によって生じ、新生物とも呼ばれる、異常な組織の塊を指すものとする。腫瘍は良性（非癌性）であっても悪性であってもよい。腫瘍にはあらゆる形態の癌および転移が包含される。一実施形態では、腫瘍は癌性である。
一実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。固形腫瘍は局在性であっても転移性であってもよい。
一実施形態では、腫瘍は上皮起源のものである。
一実施形態では、腫瘍は悪性腫瘍、例えば結腸直腸癌、肝細胞癌、前立腺癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、甲状腺癌、腎臓癌、膀胱癌、頭頸部癌または肺癌などである。
一実施形態では、腫瘍は結腸直腸悪性腫瘍である。
本明細書で使用される悪性腫瘍は癌性細胞を指す。
一実施形態では、腫瘍溶解性アデノウイルスを転移の治療または予防に用いる。
一実施形態では、本明細書の方法または製剤を薬剤耐性癌の治療に用いる。
一実施形態では、ウイルスをさらなる癌治療または癌治療法の実施と組み合わせて投与する。
一実施形態では、癌治療、例えば上記の癌の治療のための薬剤の製造に使用する、本開示によるウイルスまたは製剤を提供する。
さらなる態様では、癌を治療する方法であって、必要とする患者、例えばヒト患者に治療有効量の本開示によるウイルスまたは製剤を投与することを含む方法を提供する。
一実施形態では、本明細書の腫瘍溶解性ウイルスまたは製剤を別の治療法と組み合わせて投与する。
本明細書で使用される「組み合わせて」は、腫瘍溶解性ウイルスを癌治療または癌治療法の前に、これと同時に、かつ／またはこれの後に投与する場合を包含するものとする。しかし、一般に、併用療法（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａ）の治療レジメン。
癌治療法としては、外科手術、放射線療法、標的療法および／または化学療法が挙げられる。
本明細書で使用される癌治療は、治療用化合物もしくは生物学的薬剤、例えば癌の治療を目的とする抗体による治療および／または癌の維持療法を指す。
一実施形態では、癌治療は、化学療法剤；抗体薬物コンジュゲートなどの標的化抗癌剤；放射線療法、放射性同位体療法またはその組合せを含めた他の任意の抗癌療法から選択される。
一実施形態では、腫瘍溶解性アデノウイルスなどの本開示のウイルスを外科手術などの治療法の前治療として用いて（ネオアジュバント療法）、腫瘍を縮小させ、転移を治療し、かつ／または転移もしくはさらなる転移を予防し得る。腫瘍溶解性アデノウイルスを外科手術などの治療法の後に用いて（アジュバント療法）、転移を治療し、かつ／または転移もしくはさらなる転移を予防し得る。
一実施形態では、本開示のウイルスまたは製剤を維持療法に用いる。
本明細書で使用される同時とは、腫瘍溶解性アデノウイルス製剤と同時またはほぼ同時に追加の癌治療剤を投与することである。治療剤は、同じ製剤中に含まれるものであっても、別個の製剤として投与するものであってもよい。
一実施形態では、ウイルスを化学療法剤の投与と組み合わせて投与する。
本明細書で使用される化学療法剤は、悪性の細胞および組織を選択的に破壊する特異的な抗悪性腫瘍性の化学物質または薬物を指すものとする。例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤をはじめとする抗腫瘍剤。特異的化学療法剤の例としては、ドキソルビシン、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、パクリタキセル、カペシタビン、イリノテカンのほか、シスプラチンおよびオキサリプラチンなどのプラチンが挙げられる。用量は、治療する癌の性状に基づいて実施者が選択し得る。
一実施形態では、治療剤は、免疫応答および／または腫瘍血管形成の制御を補助し得るガンシクロビルである。
一実施形態では、本明細書の方法に用いる１つまたは複数の治療法は、低用量の抗癌薬による継続的治療または高頻度治療であり、ほかの治療方法と併用されることが多いメトロノミック療法である。
Ｂ亜群腫瘍溶解性アデノウイルス、特にＡｄ１１およびＥｎＡｄなどのその派生物は、アポトーシスとはほぼ無関係な作用機序を有し、主として壊死性の機序によって癌細胞を死滅させると思われるため、特に化学療法剤との相乗効果を示し得る。さらに、化学療法実施時に起こる免疫抑制が、腫瘍溶解性ウイルスをさらに効率的に機能させ得る。
本明細書で使用される治療用量は、適切な治療レジメンで用いて目的とする治療効果を得るのに適する、例えば、特に用量を制限する副作用を引き起こさずに、疾患の症状または状態を改善する、腫瘍溶解性アデノウイルスなどのウイルスの量を指す。ある用量について、そのウイルス粒子の数が腫瘍もしくは転移の成長の遅延もしくは停止、腫瘍もしくは転移の大きさの縮小の所見および／または患者の寿命の延長をもたらすのに十分なものである場合、それは癌または転移の治療における治療用量であると見なされ得る。適切な治療用量は一般に、治療効果と許容される毒性との間のバランス、例えば、治療法によって得られる利益を考慮に入れて副作用と毒性が許容される場合である。
一実施形態では、単回治療サイクルで本開示による腫瘍溶解性アデノウイルスの非経口製剤を複数用量、全身に投与することを提供し、ここでは、例えば、投与毎に投与する総用量が１用量当たり１×１０１０～１×１０１４個のウイルス粒子の範囲内にある。
一実施形態では、ウイルス粒子の送達速度が２×１０１０個／分～２×１０１２個／分の範囲内になるよう１用量または複数用量（例えば、各用量）のウイルスまたはそれを含む組成物を投与する。
一実施形態では、本開示によるウイルスまたは治療用構築物（これらを含む製剤を含む）を毎週投与する、例えば、第１週は第１日、第３日、第５日に投与し、その後、毎週１回投与する。
一実施形態では、本開示によるウイルスまたは治療用構築物（これらを含む製剤を含む）を２週間毎または３週間毎に投与する、例えば、第１週は第１日、第３日および第５日に投与し、第２週または第３週もその第１日、第３日および第５日に投与する。この投与レジメンを必要に応じて何度も繰り返してよい。
一実施形態では、本開示によるウイルスまたは治療用構築物（これらを含む製剤を含む）を例えば治療サイクルの中で、または維持療法として毎月投与する。
一実施形態では、本開示のウイルスおよび構築物を組換え技術によって調製する。当業者であれば、ゲノムまたはそのゲノム全体の一部を含むプラスミドを完全に合成することを含めた他の技術的手段によって、武装アデノウイルスゲノムを製造することが可能であることが理解されよう。当業者であれば、ゲノムを合成する場合、制限部位ヌクレオチドはクローン化法を用いて遺伝子を挿入した際にアーチファクトとなることから、挿入領域にそれを含めてはならないことが理解されよう。
一実施形態では、武装アデノウイルスゲノムを、例えば配列番号１８、２０、９６、１０１、１０２、１０３の導入遺伝子カセットとともに用いた配列番号１０９のように、完全に合成により製造する。
本明細書の開示はさらに、導入遺伝子または導入遺伝子カセットの挿入によって得られた、またはそれにより入手可能な式（Ｉ）またはその副次式のアデノウイルスに及ぶ。
本明細書で使用される「ｉｓ」はｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇを意味する。
本明細書においては、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」として解釈するべきである。
特定の特徴／要素を含む本発明の実施形態はほかにも、当該要素／特徴「よりなる」またはそれ「より実質的になる」代替的実施形態に及ぶものとする。
技術的に適切である場合、本発明の実施形態を組み合わせてもよい。
特許および出願などの技術参考文献は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に具体的かつ明確に記載される実施形態はいずれも、単独で、または１つまたは複数のさらなる実施形態とともに、放棄の土台をなし得る。
本明細書の見出しは、文書をいくつかの節に分けるために使用されるものであって、本明細書に記載される開示の意味の解釈に用いられることを意図するものではない。
本発明について、以下の実施例で単なる説明を目的としてさらに記載する。
実施例
実施例１：Ｔ細胞活性化抗原ＣＤ８０を発現するＥｎＡｄウイルスの作製
プラスミドｐＥｎＡｄ２．４を用いて、ヒトＴ細胞活性化抗原ＣＤ８０（配列番号１１）をコードするカセットを直接挿入することによりプラスミドｐＮＧ－３３０を作製した。ｐＮＧ－３３０カセットは、５’の短いスプライスアクセプター配列ＣＡＧＧ、ヒトＣＤ８０のｃＤＮＡ配列および３’ポリアデニル化配列（配列番号５）を含むものである。挿入した導入遺伝子カセットの模式図を図３Ａに示す。ＤＮＡシーケンシングによりプラスミドの構築を確認した。
ウイルスの作製および特徴付け
本明細書でＮＧ－３３０－００などのウイルスに言及する場合、それは単に特定の１回分にまとめた「００」のウイルスＮＧ－３３０に言及したことになる。ほかのウイルスにも同様の命名法が使用され得る。プラスミドｐＮＧ－３３０を酵素ＡｓｃＩで制限消化することによって直線化し、ウイルスゲノムＮＧ－３３０（配列番号１６）を作製した。消化したＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出によって精製し、分子生物学グレードの９５％超エタノール３００μｌおよび３Ｍ酢酸ナトリウム１０μｌ中、－２０℃で１６時間沈殿させた。沈殿したＤＮＡを１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによってペレット化し、７０％エタノール５００μｌで洗浄した後、再び１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。清浄なＤＮＡペレットを風乾させ、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬１５μｌを含有するＯｐｔｉＭＥＭ ５００μｌに再懸濁させ、室温で３０分間インキュベートした。次いで、集密度７０％まで増殖させた２９３細胞の入ったＴ－２５フラスコにトランスフェクション混合物を滴加した。細胞とトランスフェクション混合物を５％ＣＯ２、３７℃で２時間インキュベートした後、細胞に細胞培地（グルタミンを含み２％ＦＢＳを添加した高グルコースＤＭＥＭ）４ｍｌを加え、フラスコを５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。
トランスフェクトした２９３細胞を２４時間毎にモニターし、４８～７２時間毎に追加の培地を補充した。細胞単層での顕著な細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察することによってウイルスの産生をモニターした。盛んなＣＰＥが観察された後、３回の凍結融解サイクルによって２９３細胞からウイルスを回収した。ウイルスストックを増幅するため、回収したウイルスを用いて２９３細胞を再感染させた。細胞単層での顕著なＣＰＥを観察することによって、増幅時の生存ウイルス産生を確認した。ＣＰＥが観察された後、３回の凍結融解サイクルによって２９３細胞からウイルスを回収した。増幅したストックを用いてさらに増幅した後、二重の塩化セシウムバンド形成によってウイルスを精製し、ＮＧ－３３０ウイルスストックを得た。
実施例２：癌細胞系を用いてＥｎＡｄと比較したＮＧ－３３０ウイルス活性の特徴付け
結腸癌細胞系ＨＴ－２９および肺癌細胞系Ａ５４９を用いてＮＧ－３３０ウイルスまたはＥｎＡｄウイルスの複製（ｑＰＣＲにより評価した）およびＣＤ８０の膜発現（フローサイトメトリーにより評価した）（図４および５）を比較した。ＮＧ－３３０は、ＥｎＡｄに由来し、ＥｎＡｄ後期遺伝子Ｌ５（ファイバー）の後にヒトＴ細胞活性化抗原ＣＤ８０をコードする導入遺伝子カセットを含むウイルスである。挿入されているカセットの模式図を図３Ａに示す。ＮＧ－３３０ウイルスの作製については実施例１に詳述されている。Ａ５４９癌細胞系またはＨＴ－２９癌細胞系を６ウェルプレートに７．５ｅ５細胞／ウェル（Ａ５４９細胞）または２．ｅ６細胞／ウェル（ＨＴ－２９細胞）の細胞密度で播いた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした後、細胞にＥｎＡｄウイルス粒子またはＮＧ－３３０ウイルス粒子を１細胞当たり１００個（ｐｐｃ）感染させるか、感染させずにおいた。感染から２４時間後、４８時間後または７２時間後にアッセイを実施した。
ｑＰＣＲによるウイルス複製の評価
１００ｐｐｃのＥｎＡｄまたはＮＧ－３３０を２４時間、４８時間または７２時間、感染させるか感染させずにおいたＨＴ－２９細胞系およびＡ５４９細胞系をｑＰＣＲによるウイルスＤＮＡの定量化に用いた。細胞上清を収集し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって清澄化した。Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｅｌｕｔｅ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを製造業者のプロトコル通りに用いて上清１０μｌからＤＮＡを抽出した。ＥｎＡｄウイルス粒子（２．５ｅ１０～２．５ｅ５ｖｐ）を用いた標準曲線も作成し、Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｅｌｕｔｅ Ｋｉｔを用いて抽出した。ＥｎＡｄ Ｅ３遺伝子特異的プライマー－プローブセットを用いたｑＰＣＲにより、各抽出試料または標準物質を分析した。
検出された１細胞当たりのウイルスゲノム数の定量化から、ＮＧ－３３０ウイルスとＥｎＡｄウイルスの複製はＨＴ－２９細胞系（図４Ａ）、Ａ５４９細胞系（図４Ｂ）ともに同程度であることがわかった。未感染細胞にはウイルスゲノムを検出することができなかった（データ不掲載）。
フローサイトメトリーによるＣＤ８０の細胞表面発現の評価
１００ｐｐｃのＥｎＡｄまたはＮＧ－３３０を２４時間、４８時間または７２時間、感染させるか感染させずにおいたＨＴ－２９細胞系およびＡ５４９細胞系を細胞表面でのＣＤ８０導入遺伝子発現の解析に用いた。トリプシン処理によって腫瘍細胞をプレート表面から剥がし、遠心分離した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳに再懸濁させた。次いで、試料を緩衝液、Ｃｙ５とコンジュゲートしたマウスアイソタイプ対照抗体またはＣｙ５とコンジュゲートした抗ヒトＣＤ８０抗体（クローン２Ｄ１０）と５℃で１時間インキュベートした。生存細胞を識別するため、全試料にＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ ｌｉｖｅ／ｄｅａｄによる共染色も実施した。試料を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで３回洗浄した後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ、Ａｔｔｕｎｅ）による細胞生存率および細胞表面のＣＤ８０タンパク質発現の解析に供した。解析では、Ａ５４９細胞（図５Ａ）、ＨＴ－２９（図５Ｂ）細胞ともに、ＮＧ－３３０で処理した細胞の表面にはＣＤ８０を検出することができるが、ＥｎＡｄで処理した細胞、未処理の細胞のいずれもＣＤ８０を検出することができないことがわかった。
ウイルス腫瘍溶解能の比較
ＨＴ－２９結腸癌細胞を２．５ｅ４細胞／ウェルの細胞密度で９６ウェルプレートに播いた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした後、感染密度が１細胞当たり１００～０．３９粒子（ｐｐｃ）の範囲のＥｎＡｄウイルス粒子またはＮＧ－３３０ウイルス粒子を細胞に感染させた。感染から７２時間後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｒｅ ９６ＭＴＳ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社：Ｇ３５８１）を用いてＨＴ－２９細胞の生存率を評価した。各感染密度での細胞の生存％を定量化することにより、ＨＴ２９細胞でのＮＧ－３３０の腫瘍溶解能がＥｎＡｄと同程度であることが明らかになった（図６）。
実施例３：Ｔ細胞活性化抗原ＣＤ８０およびサイトカインＩＦＮαを発現するＥｎＡｄウイルスの作製
プラスミドｐＥｎＡｄ２．４を用いて、ヒトＴ細胞活性化抗原ＣＤ８０（配列番号１１）およびヒトサイトカインのインターフェロンα（ＩＦＮα、配列番号１２）をコードするカセットを直接挿入することによりプラスミドｐＮＧ－３４３を作製した。ｐＮＧ－３４３カセットは、５’の短いスプライスアクセプター配列ＣＡＧＧ；ヒトＩＦＮαのｃＤＮＡ；高効率自己切断型Ｐ２Ａペプチド配列（配列番号７）；ヒトＣＤ８０のｃＤＮＡ配列および３’ポリアデニル化配列（配列番号５）を含むものである。挿入した導入遺伝子カセットの模式図を図３Ｂに示す。ＤＮＡシーケンシングによりプラスミドの構築を確認した。
ウイルスの作製および特徴付け
プラスミドｐＮＧ－３４３を酵素ＡｓｃＩで制限消化することによって直線化し、ウイルスゲノムＮＧ－３４３（配列番号１７）を作製した。実施例１で詳述した方法に従ってウイルスＮＧ－３４３を増幅し精製する。
実施例４：ＦＭＳ様チロシンキナーゼ－３リガンドの細胞外ドメイン、ケモカインＭＩＰ１αおよびサイトカインＩＦＮαを発現するＥｎＡｄウイルスの作製
プラスミドｐＥｎＡｄ２．４を用いて、可溶性変異型のＦＭＳ様チロシンキナーゼ－３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ、配列番号１３）、ＭＩＰ１α（アイソフォームＬＤ７８β、配列番号１４）およびＩＦＮα（配列番号１２）をコードするカセットを直接挿入することによってプラスミドｐＮＧ－３４５を作製する。ｐＮＧ－３４５カセットには、５’の短いスプライスアクセプター配列ＣＡＧＧ；ヒトＦｌｔ３ＬのｃＤＮＡ；高効率自己切断型Ｐ２Ａペプチド配列（配列番号７）；ヒトＭＩＰ１αのｃＤＮＡ；高効率自己切断型Ｔ２Ａペプチド配列（配列番号１０）；ヒトＩＦＮαのｃＤＮＡおよび３’ポリアデニル化配列（配列番号５）が含まれている。挿入した導入遺伝子カセットの模式図を図３Ｄに示す。ＣＤＮＡシーケンシングによりプラスミドの構築を確認する。
ウイルスの作製および特徴付け
プラスミドｐＮＧ－３４５を酵素ＡｓｃＩで制限消化することによって直線化し、ウイルスゲノムＮＧ－３４５（配列番号１８）を作製する。実施例１で詳述した方法に従ってウイルスＮＧ－３４５を増幅し精製する。
実施例５：Ｔ細胞活性化抗原ＣＤ８０、ケモカインＭＩＰ１αおよびＦｌｔ３リガンドを発現するＥｎＡｄウイルスの作製
プラスミドｐＥｎＡｄ２．４を用いて、ヒトＴ細胞活性化抗原ＣＤ８０（配列番号１１）、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ１α、配列番号１４）およびヒトＦｌｔ３リガンド（配列番号１３）をコードするカセットを直接挿入することによってプラスミドｐＮＧ－３４６を作製した。ｐＮＧ－３４６カセットには、５’の短いスプライスアクセプター配列ＣＡＧＧ；ヒトＩＦＮαのｃＤＮＡ；高効率自己切断型Ｐ２Ａペプチド配列（配列番号７）；ヒトＭＩＰ１αのｃＤＮＡ（アイソフォームＬＤ７８β）；高効率自己切断型Ｔ２Ａペプチド配列（配列番号１０）；ヒトＦｌｔ３リガンドのｃＤＮＡ配列および３’ポリアデニル化配列（配列番号５）が含まれている。挿入した導入遺伝子カセットの模式図を図３Ｅに示す。ＤＮＡシーケンシングによりプラスミドの構築を確認する。
ウイルスの作製および特徴付け
プラスミドｐＮＧ－３４６を酵素ＡｓｃＩで制限消化することによって直線化し、ウイルスゲノムＮＧ－３４６（配列番号１９）を作製する。実施例１で詳述した方法に従ってウイルスＮＧ－３４６を増幅し精製する。
実施例６：Ｔ細胞活性化抗原ＣＤ８０、ケモカインＭＩＰ１αおよびサイトカインＩＦＮαを発現するＥｎＡｄウイルスの作製
プラスミドｐＥｎＡｄ２．４を用いて、ヒトＴ細胞活性化抗原ＣＤ８０（配列番号１１）、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ１α、配列番号１４）およびヒトサイトカインのインターフェロンα（ＩＦＮα、配列番号１２）をコードするカセットを直接挿入することによってプラスミドｐＮＧ－３４７を作製した。ｐＮＧ－３４７カセットには、５’の短いスプライスアクセプター配列ＣＡＧＧ；ヒトＩＦＮαのｃＤＮＡ；高効率自己切断型Ｐ２Ａペプチド配列（配列番号７）；ヒトＭＩＰ１αのｃＤＮＡ（アイソフォームＬＤ７８β）；高効率自己切断型Ｔ２Ａペプチド配列（配列番号１０）；ヒトＣＤ８０のｃＤＮＡ配列および３’ポリアデニル化配列（配列番号５）が含まれている。挿入した導入遺伝子カセットの模式図を図３Ｆに示す。ＤＮＡシーケンシングによりプラスミドの構築を確認する。
ウイルスの作製および特徴付け
プラスミドｐＮＧ－３４７を酵素ＡｓｃＩで制限消化することによって直線化し、ウイルスゲノムＮＧ－３４７（配列番号２０）を作製する。実施例１で詳述した方法に従ってウイルスＮＧ－３４７を増幅し精製する。
実施例７：Ｔ細胞活性化抗原ＣＤ８０およびヒトＣＤ３複合体のε鎖（ＣＤ３ε）に対する膜係留型一本鎖Ｆｖフラグメント抗体を発現するＥｎＡｄウイルスの作製
プラスミドｐＥｎＡｄ２．４を用いて、ヒトＴ細胞活性化抗原ＣＤ８０（配列番号１１）および膜係留キメラ型の一本鎖Ｆｖ抗ヒトＣＤ３ｅ（配列番号１５）をコードするカセットを直接挿入することによってプラスミドｐＮＧ－３４８を作製した。ｐＮＧ－３４８カセットには、５’の短いスプライスアクセプター配列ＣＡＧＧ；膜係留型抗ヒトＣＤ３ｅ ｓｃＦｖのｃＤＮＡ；高効率自己切断型Ｐ２Ａペプチド配列（配列番号７）；ヒトＣＤ８０のｃＤＮＡ配列および３’ポリアデニル化配列（配列番号５）が含まれている。挿入した導入遺伝子カセットの模式図を図３Ｃに示す。ＤＮＡシーケンシングによりプラスミドの構築を確認する。
ウイルスの作製および特徴付け
プラスミドｐＮＧ－３４８を酵素ＡｓｃＩで制限消化することによって直線化し、ウイルスゲノムＮＧ－３４８（配列番号９６）を作製する。実施例１で詳述した方法に従ってウイルスＮＧ－３４８を増幅し精製する。
実施例８：２つの導入遺伝子；Ｔ細胞活性化抗原ＣＤ８０およびサイトカインＩＦＮαを発現するＥｎＡｄウイルス、ＮＧ－３４３の活性
癌細胞系を用いてＥｎＡｄと比較したＮＧ－３４３ウイルス活性の特徴付け
結腸癌細胞系ＨＴ－２９または肺癌細胞系Ａ５４９を用いてＮＧ－３４３ウイルスまたはＥｎＡｄウイルスの複製（ｑＰＣＲにより評価した）、ＣＤ８０導入遺伝子発現（フローサイトメトリーにより評価した）またはＩＦＮα導入遺伝子発現（ＥＬＩＳＡにより評価した）を比較した。ＮＧ－３４３は、ＥｎＡｄに由来し、ＥｎＡｄ後期遺伝子Ｌ５（ファイバー）の後に位置するヒトＴ細胞活性化抗原ＣＤ８０およびヒトサイトカインのインターフェロンα２ｂをコードする導入遺伝子カセットを含むウイルスである。挿入したカセットの模式図を図３Ｂに示す。ＮＧ－３４３ウイルスの作製については実施例３に詳述されている。Ａ５４９癌細胞系またはＨＴ－２９癌細胞系を１２ウェルプレートに７．５×１０５細胞／ウェル（Ａ５４９細胞）または１．４×１０６細胞／ウェル（ＨＴ－２９細胞）の細胞密度で播いた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした後、細胞にＥｎＡｄまたはＮＧ－３４３を１細胞当たり１００ウイルス粒子（ｐｐｃ）で感染させるか、感染させずにおいた。感染から２４時間後、４８時間後または７２時間後にアッセイを実施した。
ｑＰＣＲによるウイルス複製の評価
１００ｐｐｃのＥｎＡｄまたはＮＧ－３４３を２４時間、４８時間または７２時間、感染させるか感染させずにおいたＨＴ－２９細胞をｑＰＣＲによるウイルスＤＮＡの定量化に用いた。細胞上清を収集し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって清澄化した。Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｅｌｕｔｅ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを製造業者のプロトコル通りに用いて上清１０μｌからＤＮＡを抽出した。ＥｎＡｄウイルス粒子（２．５×１０１０～２．５×１０５ｖｐ）を用いた標準曲線も作成し、Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｅｌｕｔｅ Ｋｉｔを用いて抽出した。ＥｎＡｄ Ｅ３遺伝子特異的プライマー－プローブセットを用いたｑＰＣＲにより、各抽出試料または標準物質を分析した。
検出された１細胞当たりのウイルスゲノム数の定量化から、ＮＧ－３４３ウイルスとＥｎＡｄウイルスの複製は、分析した全時点で同程度であることがわかった（図７Ａ）。未感染細胞にはウイルスゲノムを検出することができなかった（データ不掲載）。
ＥＬＩＳＡによるＩＦＮα発現の分析
１０ｐｐｃのＥｎＡｄまたはＮＧ－３４３を２４時間、４８時間または７２時間、感染させるか感染させずにおいたＨＴ－２９細胞系またはＡ５４９細胞系の上清について、分泌ＩＦＮαの発現をＥＬＩＳＡにより分析した。各ウェルから培養上清を取り出し、１２００ｒｐｍで５分間遠心して細胞残屑を除去した。上清を５％ＢＳＡ／ＰＢＳアッセイ緩衝液で希釈（１：２、１：５０または１：１００）し、Ｖｅｒｉｋｉｎｅ Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ ａｌｐｈａ Ｋｉｔ（Ｐｂｌ ａｓｓａｙ ｓｃｉｅｎｃｅ社）を製造業者のプロトコル通りに用いてＥＬＩＳＡを実施した。
標準曲線から内挿法により分泌ＩＦＮαの濃度を求めた。ＨＴ－２９細胞系、Ａ５４９細胞系ともに、感染の経過とともに細胞上清にＩＦＮα発現の増大が検出された（図７Ｂ）。
フローサイトメトリーによるＣＤ８０の細胞表面発現の評価
１０ｐｐｃのＥｎＡｄまたはＮＧ－３４３を４８時間または７２時間、感染させるか感染させずにおいたＡ５４９細胞系を細胞表面でのＣＤ８０導入遺伝子発現の解析に用いた。感染後のしかるべき時点で、トリプシン処理によってＡ５４９細胞をプレート表面から剥がし、遠心分離した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳに再懸濁させた。次いで、試料を緩衝液、Ｃｙ５とコンジュゲートしたマウスアイソタイプ対照抗体またはＣｙ５とコンジュゲートした抗ヒトＣＤ８０抗体（クローン２Ｄ１０）と５℃で１時間インキュベートした。生存細胞を識別するため、全試料にＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ ｌｉｖｅ／ｄｅａｄによる共染色も実施した。試料を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで３回洗浄した後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ、Ａｔｔｕｎｅ）による細胞生存率および細胞表面でのＣＤ８０タンパク質発現の解析に供した。ＣＤ８０発現対Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染色の解析から、感染から４８時間、７２時間後ともに、ＮＧ－３４３で処理した細胞には細胞表面にＣＤ８０を検出することができるが、ＥｎＡｄ未感染対照（ＵＩＣ）細胞には検出することができないことがわかった（図８）。ウイルス処理から７２時間後の細胞生存率は包括的なＣＤ８０発現解析を実施するのに十分なものではなかったが、ＮＧ－３４３で処理した細胞では生存細胞、死滅細胞ともに、この時点で高レベルのＣＤ８０を検出することができた（図８Ｄ、下パネル）。
次いで、１００ｐｐｃで感染させてから４８時間後のＣＤ８０タンパク質発現をＨＴ－２９細胞とＡ５４９細胞とで比較した。試料を回収し、上記の通りに染色した後、細胞生存率および細胞表面でのＣＤ８０タンパク質発現の解析に供した。生存細胞として染色された細胞のみこの時点でのＣＤ８０発現を解析したところ、ＮＧ－３４３で処理したＨＴ－２９細胞の約９１％およびＮＧ－３４３で処理したＡ５４９細胞の約９８％の表面にＣＤ８０を検出することができるが、ＥｎＡｄで処理した対照には検出することができないことがわかった。
実施例９：癌細胞系、間質線維芽細胞系および上皮細胞系でのＮＧ－３４３ウイルス活性および導入遺伝子発現の選択性。
ＮＧ－３４３ウイルスによってコードされるＩＦＮαおよびＣＤ８０の導入遺伝子が、ＮＧ－３４３感染またはＥｎＡｄ感染を許容する細胞にのみ選択的に発現することを示すため、ＥｎＡｄ感染を許容することが知られている癌細胞（ＨＴ－２９）、許容性でないことが既に特徴付けられている線維芽細胞系（ＷＩ－３８およびＭＲＣ－５）およびＥｎＡｄ感染にごくわずかな許容を示す気管支上皮細胞系（ＢＥ）でのウイルス複製（ｑＰＣＲにより評価した）、ＩＦＮα発現（ＥＬＩＳＡにより評価した）およびＣＤ８０発現（フローサイトメトリーにより評価した）を測定した。簡潔に述べれば、１２ウェルプレートに細胞を播き、播種から１８時間後、ＷＩ３８細胞、ＭＲＣ５細胞またはＢＥ細胞には１００ｐｐｃのＮＧ－３４３ウイルスまたはＥｎＡｄウイルスを感染させ、ＨＴ－２９細胞には１０ｐｐｃのＮＧ－３４３ウイルスまたはＥｎＡｄウイルスを感染させた。細胞をウイルス粒子と４時間インキュベートした後、細胞から感染培地を除去し、新鮮な培地と交換した。４時間にわたる感染から１時間後または７２時間後、細胞上清を回収してｑＰＣＲ分析またはＥＬＩＳＡ分析に供し、細胞をトリプシンで処理してプレートから剥がし、フローサイトメトリーによる解析に供した。
ＮＧ－３４３選択的およびＥｎＡｄ選択的ウイルス複製
ｑＰＣＲには、細胞上清を収集し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって清澄化した。Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｅｌｕｔｅ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを製造業者のプロトコル通りに用いて上清１０μｌからＤＮＡを抽出した。ＥｎＡｄウイルス粒子（２．５×１０１０～２．５×１０５ｖｐ）を用いた標準曲線も作成し、Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｅｌｕｔｅ Ｋｉｔを用いて抽出した。ＥｎＡｄ Ｅ３遺伝子特異的プライマー－プローブセットを用いたｑＰＣＲにより、各抽出試料または標準物質を分析した。
検出された１細胞当たりのウイルスゲノム数の定量化から、分析したいずれの細胞系も、ＮＧ－３４３ウイルスとＥｎＡｄウイルスの複製が同程度であることが明らかになった（図９Ａ）。
ＮＧ－３４３選択的導入遺伝子発現
ＩＦＮα発現の検出には、細胞上清を収集し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって清澄化した。上清を５％ＢＳＡ／ＰＢＳアッセイ緩衝液で希釈（１：２、１：５０または１：１００）し、Ｖｅｒｉｋｉｎｅ Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ ａｌｐｈａ Ｋｉｔ（Ｐｂｌ ａｓｓａｙ ｓｃｉｅｎｃｅ社）を製造業者のプロトコル通りに用いてＥＬＩＳＡを実施した。
標準曲線から内挿法により分泌ＩＦＮαの濃度を求めた。ＩＦＮα発現をＮＧ－３４３感染ＨＴ－２９細胞の上清にのみ検出することができたが、線維芽細胞系、気管支上皮細胞系には検出されなかった（定量下限値未満［＜ＬＬＯＱ］）（図９Ｂ）。
ＣＤ８０の細胞表面発現に関しては、次いで細胞を緩衝液、Ｃｙ５とコンジュゲートしたマウスアイソタイプ対照抗体またはＣｙ５とコンジュゲートした抗ヒトＣＤ８０抗体（クローン２Ｄ１０）と５℃で１時間インキュベートした。生存細胞を識別するため、全試料にＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ ｌｉｖｅ／ｄｅａｄによる共染色も実施した。試料を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで３回洗浄した後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ、Ａｔｔｕｎｅ）による細胞生存率および細胞表面でのＣＤ８０タンパク質発現の解析に供した。ＩＦＮα発現データと同じく、ＨＴ－２９細胞にのみＣＤ８０発現を検出することができ、線維芽細胞系、気管支上皮細胞系には検出可能な発現はみられなかった（図９Ｃ）。
以上のデータから、ＩＦＮα導入遺伝子およびＣＤ８０導入遺伝子ともに、ＥｎＡｄウイルス感染を許容する細胞、すなわち癌細胞に選択的に発現し、導入遺伝子をコードすることによってＮＧ－３４３ウイルスの選択性が親ＥｎＡｄウイルスと比較して変化することはないことが明らかになった。
実施例１０：免疫細胞活性化に対するＮＧ－３４３導入遺伝子発現の活性
腫瘍細胞をＮＧ－３４３ウイルスで処理することによって自然免疫細胞応答が未処理またはＥｎＡｄ処理と比較して増強されるかどうかを明らかにするため、新たに単離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）と、ＮＧ－３４３もしくはＥｎＡｄを感染させた腫瘍細胞または未感染の腫瘍細胞とを共培養した。自然免疫細胞集団のフローサイトメトリー解析または共培養上清のＥＬＩＳＡ分析により免疫細胞活性化を評価した。簡潔に述べれば、Ａ５４９肺癌細胞を１２ウェルプレートに４×１０５細胞／ウェルの密度で播いた。２０時間後、細胞に１０ｐｐｃのＥｎＡｄウイルスまたはＮＧ－３４３ウイルスを感染させるか感染させずにおいた後、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。次いで、健常ヒトドナーから密度勾配遠心分離により単離したＰＢＭＣを、ＰＢＭＣとＡ５４９細胞の比が５：１になるようＡ５４９培養ウェルに加えた。ＰＢＭＣの添加から４８時間後、プレートから共培養上清を回収した。この時点での樹状細胞活性化を分析するため、細胞を緩衝液、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、ＰＥ、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５、ＢＶ６０５もしくはＢＶ４１２とコンジュゲートしたマウスアイソタイプ対照抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８とコンジュゲートした抗ＣＤ１４抗体、ＰＥとコンジュゲートした抗ＣＤ８０抗体、ＰｅｒＣＰ．Ｃｙ５．５とコンジュゲートした抗ＨＬＡ－ＤＲ、ＢＶ６０５とコンジュゲートした抗ＣＤ３またはＢＶ４２１とコンジュゲートした抗ＰＤ－Ｌ１抗体と５℃で１時間インキュベートした。生存細胞を識別するため、全試料にＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ ｌｉｖｅ／ｄｅａｄによる共染色も実施した。試料を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで３回洗浄した後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ、Ａｔｔｕｎｅ）による解析に供した。染色がＣＤ１４、ＣＤ３ともに陰性であるが、ＨＬＡ－ＤＲが陽性である生存細胞を樹状細胞集団と定義した。この集団についてＤＣ活性化マーカーのＣＤ８０およびＰＤ－Ｌ１の発現を比較した（図１０）。以上の解析から、ＮＧ－３４３を感染させた腫瘍細胞は、ＤＣ表面でのＣＤ８０およびＰＤ－Ｌ１の両方の表面レベルをＥｎＡｄ感染腫瘍細胞培養物または未感染腫瘍細胞培養物よりも上昇させ得ることが明らかになった。
実施例１１：３つの導入遺伝子；Ｔ細胞活性化抗原ＣＤ８０、ケモカインＭＩＰ１αおよびサイトカインＩＦＮαを発現するＥｎＡｄウイルス、ＮＧ－３４７の活性
癌細胞系を用いてＥｎＡｄと比較したＮＧ－３４７ウイルス活性の特徴付け
ＣＤ８０導入遺伝子発現（フローサイトメトリーにより評価した）およびＩＦＮαまたはＭＩＰ１α（ＣＣＬ３）の導入遺伝子発現（ＥＬＩＳＡにより評価した）を、結腸癌細胞系ＨＴ－２９または肺癌細胞系Ａ５４９をＮＧ－３４７で処理したものとＥｎＡｄで処理したものとで比較した。ＮＧ－３４７は、ＥｎＡｄに由来し、ヒトＴ細胞活性化抗原ＣＤ８０、ヒトサイトカインのインターフェロンα２ｂおよびヒトケモカインＭＩＰ１α（ＬＤ７８βアイソフォーム）をコードする導入遺伝子カセットを含むウイルスである。導入遺伝子の発現はウイルス内在性主要後期プロモーターの制御下にある。挿入したカセットの模式図を図３Ｆに示す。ＮＧ－３４７ウイルスの作製については実施例６に詳述されている。Ａ５４９癌細胞系またはＨＴ－２９癌細胞系を１２ウェルプレートに７．５×１０５細胞／ウェル（Ａ５４９細胞）または１．４×１０６細胞／ウェル（ＨＴ－２９細胞）の細胞密度で播いた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした後、細胞に１細胞当たり１００個（ｐｐｃ）のＥｎＡｄウイルス粒子またはＮＧ－３４７ウイルス粒子を感染させるか、感染させずにおいた。感染から２４時間後、４８時間後または７２時間後にアッセイを実施した。
ＥＬＩＳＡによるＩＦＮα発現またはＭＩＰ１α発現の分析
１００ｐｐｃのＥｎＡｄまたはＮＧ－３４７を２４時間、４８時間または７２時間感染させるか感染させずにおいたＨＴ－２９細胞系またはＡ５４９細胞系の上清について、分泌ＩＦＮαまたは分泌ＭＩＰ１αの発現をＥＬＩＳＡにより分析した。
実施例９で詳述した方法に従って培養上清を調製した。Ｖｅｒｉｋｉｎｅ Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ ａｌｐｈａ Ｋｉｔ（Ｐｂｌ ａｓｓａｙ ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いてＩＦＮαに関するＥＬＩＳＡを実施し、Ｈｕｍａｎ ＣＣＬ３ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてＭＩＰ１αに関するＥＬＩＳＡを実施した。両アッセイとも製造業者のプロトコル通りに実施した。
標準曲線から内挿法により分泌ＩＦＮαまたは分泌ＭＩＰαの濃度を求めた。ＨＴ－２９細胞系、Ａ５４９細胞系ともに、感染の経過とともに細胞上清中のＩＦＮαおよびＭＩＰ１αの発現の増大が検出された（図１１Ａおよび図１１Ｂ）。
フローサイトメトリーによるＣＤ８０発現の解析
感染から４８時間後のＨＴ－２９細胞およびＡ５４９細胞の表面でのＣＤ８０タンパク質発現を比較した。細胞を回収し、実施例９で詳述した方法に従って染色した。細胞を、細胞生存率および細胞表面でのＣＤ８０タンパク質発現についてフローサイトメトリーによって解析した。生存細胞のこの時点におけるＣＤ８０発現の解析から、ＮＧ－３４７で処理したＨＴ－２９細胞の約９６％およびＮＧ－３４７で処理したＡ５４９細胞の約９９％の表面にＣＤ８０を検出することができるが、ＥｎＡｄ処理対照には染色が検出されないことがわかった（図１１Ｃ）。
実施例１２：３つの導入遺伝子；サイトカインＦｌｔ３リガンド、ケモカインＭｉｐ１αおよびサイトカインＩＦＮαを発現するＥｎＡｄウイルス、ＮＧ－３４５の活性。
癌細胞系を用いてＥｎＡｄと比較したＮＧ－３４５ウイルス活性の特徴付け
Ｆｌｔ３リガンド導入遺伝子、ＩＦＮα導入遺伝子およびＭＩＰ１α導入遺伝子の発現（ＥＬＩＳＡにより評価した）を、結腸癌細胞系ＨＴ－２９または肺癌細胞系Ａ５４９をＮＧ－３４５で処理したものとＥｎＡｄで処理したものとで比較した。ＮＧ－３４５は、ＥｎＡｄに由来し、可溶性変異型のヒトＦｌｔ－３リガンド、ヒトサイトカインのインターフェロンα２ｂおよびヒトケモカインＭＩＰ１α（ＬＤ７８βアイソフォーム）をコードする導入遺伝子カセットを含むウイルスである。導入遺伝子の発現はウイルス内在性主要後期プロモーターの制御下にある。挿入したカセットの模式図を図３Ｄに示す。ＮＧ－３４５ウイルスの作製については実施例４で詳述されている。Ａ５４９癌細胞系またはＨＴ－２９癌細胞系を１２ウェルプレートに７．５×１０５細胞／ウェル（Ａ５４９細胞）または１．４×１０６細胞／ウェル（ＨＴ－２９細胞）の細胞密度で播いた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした後、細胞に１細胞当たり１００個（ｐｐｃ）のＥｎＡｄウイルス粒子またはＮＧ－３４５ウイルス粒子を感染させるか、感染させずにおいた。感染から２４時間後、４８時間後または７２時間後にアッセイを実施した。
ＥＬＩＳＡによるＦＬｔ－３リガンド、ＩＦＮαまたはＭＩＰ１αの発現の解析
１００ｐｐｃのＥｎＡｄまたはＮＧ－３４５を２４時間、４８時間または７２時間、感染させるか感染させずにおいたＨＴ－２９細胞系またはＡ５４９細胞系の上清について、分泌Ｆｌｔ３－リガンド、分泌ＩＦＮαまたは分泌ＭＩＰ１αの発現をＥＬＩＳＡにより分析した。
実施例９で詳述した方法に従って培養上清を調製した。Ｖｅｒｉｋｉｎｅ Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ ａｌｐｈａ Ｋｉｔ（Ｐｂｌ ａｓｓａｙ ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いてＩＦＮαに関するＥＬＩＳＡを実施し、Ｈｕｍａｎ ＣＣＬ３ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてＭＩＰ１αに関するＥＬＩＳＡを実施し、Ｆｌｔ３Ｌ ｈｕｍａｎ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ社）を用いてＦｌｔ３Ｌに関するＥＬＩＳＡを実施した。いずれのアッセイも製造業者のプロトコル通りに実施した。
標準曲線から内挿法により分泌ＩＦＮα、分泌ＭＩＰαまたは分泌ＦＬｔ３Ｌの濃度を求めた。ＨＴ－２９細胞系、Ａ５４９細胞系ともに、感染の経過とともに細胞上清中のＩＦＮα、ＭＩＰ１αおよびＦｌｔ３Ｌの発現の増大が検出された（図１２Ａ～１２Ｃ）。
実施例１３．結腸癌細胞でのＮＧ－３４７ウイルスおよびＮＧ－３４８ウイルスの腫瘍溶解活性および感染力
ウイルスの腫瘍溶解能
ＨＴ－２９結腸癌細胞を９６ウェルプレートに２．５ｅ４細胞／ウェルの細胞密度で播いた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした後、感染密度が１細胞当たり１００～０．３９粒子（ｐｐｃ）の範囲のＥｎＡｄウイルス粒子、ＮＧ－３４７ウイルス粒子またはＮＧ－３４８ウイルス粒子を細胞に感染させた。感染から７２時間後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｒｅ ９６ ＭＴＳ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社：Ｇ３５８１）を用いてＨＴ－２９細胞の生存率を評価した。各感染密度での細胞の生存％を定量化することにより、ＮＧ－３４７およびＮＧ－３４８の腫瘍溶解能がＥｎＡｄと同程度であることが明らかになった（図１３Ａおよび１３Ｂ）。
ウイルス粒子の感染力
ＨＴ－２９結腸癌細胞を１２ウェルプレートに４ｅ５細胞／ウェルの細胞密度で播いた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした後、感染密度が１．６ｅ７～２ｅ６ｖｐ／ｍＬの範囲のＥｎＡｄウイルス粒子、ＮＧ－３４７ウイルス粒子またはＮＧ－３４８ウイルス粒子を細胞に感染させた。ウイルスタンパク質であるヘキソンの抗体染色によりＨＴ－２９細胞の感染を検出した。各被検希釈物について６つ組のウェルの１ウェル当たり６視野を手作業でカウントすることにより染色細胞を定量化した。ウイルス力価から各ウイルスの粒子／感染力比（Ｐ：Ｉ）を算出したところ、ＮＧ－３４７およびＮＧ－３４８の両方は感染力比がＥｎＡｄ参照対照と同程度であることが明らかになった（図１３Ｃ）。
実施例１４．ＮＧ－３４７感染癌細胞系およびＮＧ－３４８感染癌細胞系におけるＴ細胞活性化抗原ＣＤ８０の細胞表面発現
ＣＤ８０導入遺伝子発現（フローサイトメトリーにより評価した）を、結腸癌細胞系ＤＬＤ－１または肺癌細胞系Ａ５４９をＮＧ－３４７で処理したものとＮＧ－３４８で処理したものとＥｎＡｄで処理したもので比較した。Ａ５４９癌細胞系またはＤＬＤ－１癌細胞系を１２ウェルプレートに７．５ｅ５細胞／ウェルの細胞密度で播いた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした後、細胞に１細胞当たり１０個（ｐｐｃ）のＥｎＡｄウイルス粒子、ＮＧ－３４８ウイルス粒子またはＮＧ－３４７ウイルス粒子を感染させるか、感染させずにおいた。感染から２４時間後、４８時間後、７２時間後または９６時間後のＡ５４９細胞またはＤＬＤ－１細胞の表面でのＣＤ８０タンパク質発現を比較した。各時点で細胞を回収し、実施例９で詳述した方法に従って染色した。細胞を、細胞生存率および細胞表面でのＣＤ８０タンパク質発現についてフローサイトメトリーにより解析した。感染から７２時間後のＡ５４９細胞におけるＣＤ８０発現の解析から、ＮＧ－３４７処理細胞またはＮＧ－３４８処理細胞の９５％超の表面にＣＤ８０を検出することができることがわかった（図１４Ａおよび１４Ｂ）。感染から９６時間後、Ａ５４９細胞の大部分がウイルス処理によって溶解していたため、ＦＡＣＳ解析は実施しなかった。ＤＬＤ－１細胞については、９６時間後までに、ＮＧ－３４８による処理では５０％超の細胞に、ＮＧ－３４７処理では７０％超の細胞に発現を検出することができた（図１５Ａおよび１５Ｂ）。ＥｎＡｄにも未処理対照にも染色は検出されなかった。
実施例１５．ＮＧ－３４８感染癌細胞系が媒介するＴ細胞の活性化および脱顆粒
ＮＧ－３４８ウイルス粒子またはＥｎＡｄウイルス粒子を感染させるか感染させずにおいたＡ５４９肺癌細胞と、ヒトＰＢＭＣドナーから単離したＴ細胞とを共培養した。Ａ５４９細胞およびＴ細胞の両方の表面について、ＮＧ－３４８ウイルスがコードするＣＤ８０での発現の選択性をフローサイトメトリーにより評価した。細胞表面活性化マーカー（フローサイトメトリーによる）、脱顆粒のマーカーとしてのＣＤ１０７ａ細胞表面発現（フローサイトメトリーによる）ならびに刺激性サイトカインであるＩＬ－２およびＩＦＮγの分泌（ＥＬＩＳＡによる）を解析することによってＴ細胞活性化を評価した。
Ａ５４９細胞を１２ウェルプレートに５ｅ５細胞／ウェルの密度で播いた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした後、細胞に１細胞当たり１０個（ｐｐｃ）のＥｎＡｄウイルス粒子またはＮＧ－３４８ウイルス粒子を感染させるか、感染させずにおいた。感染から４８時間後、ＰＢＭＣ（ＭＡＣ）からネガティブ選択によって単離したＣＤ３＋Ｔ細胞を、Ｔ細胞と腫瘍細胞の比が８：１になるようＡ５４９細胞単層に加えた。共培養を１６時間実施し、その時点の後、ＥＬＩＳＡ分析用に細胞上清を収集し、フローサイトメトリー解析用に腫瘍細胞およびＴ細胞を回収した。
共培養ウェルから非付着細胞を含む培地を取り出し、遠心分離した（３００×ｇ）。上清を慎重に取り出し、ＰＢＳ／５％ＢＳＡで２倍に希釈し、ＥＬＩＳＡ分析用に保管した。付着細胞単層をＰＢＳで１回洗浄した後、トリプシンを用いて分離させた。完全培地を用いてトリプシンを不活化し、培養上清から収集した細胞ペレットに細胞を加えた。細胞を遠心分離し（３００×ｇ）、上清を捨て、細胞ペレットをＰＢＳ ２００μＬで洗浄した。細胞を再び遠心分離した後、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈ社）を含有するＦＡＣｓ緩衝液（５％ＢＳＡ／ＰＢＳ）５０μＬに室温で１５分間再懸濁させた。細胞をＦＡＣｓ緩衝液で１回洗浄した後、直接コンジュゲートした抗体のパネル、すなわち、ＢＶ６０５とコンジュゲートした抗ＣＤ３；ＢＶ４２１とコンジュゲートした抗ＣＤ２５；ＦＩＴＣとコンジュゲートした抗ＣＤ１０７ａ；ＰＥとコンジュゲートした抗ＥｐＣａｍまたはＰＥとコンジュゲートした抗ＣＤ４；およびＰＥ／Ｃｙ５とコンジュゲートした抗ＣＤ８０またはＰＥ／Ｃｙ５とコンジュゲートした抗ＨＬＡ－ＤＲで染色した。ほかにも、各共培養条件で得られた細胞の試料を関連するアイソタイプ対照抗体で染色した。染色はいずれも、総体積５０μＬ／ウェルのＦＡＣｓ緩衝液中、４℃で１５分間実施した。次いで、細胞をＦＡＣｓ緩衝液（２００μＬ）で洗浄した後、ＦＡＣｓ緩衝液２００μＬに再懸濁させ、フローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ）により解析した。
ＣＤ８０の選択的発現
実施例１４で示した結果と同じように、ＮＧ－３４８を感染させたＥｐＣａｍ＋Ａ５４９細胞の８０％超の表面にＣＤ８０発現を検出することができたが、ＥｎＡｄを感染させた細胞にも未感染対照細胞にもＣＤ８０発現を検出することができなかった（図１６）。これに対し、ＣＤ３＋Ｔ細胞では細胞表面に検出可能なＣＤ８０の発現はみられず、少なくとも上記の実験条件下では、導入遺伝子発現が共培養した腫瘍細胞に選択性を示すことが示された。
Ｔ細胞活性化マーカーのアップレギュレーション
Ｔ細胞活性化マーカーであるＣＤ２５およびＨＬＡ－ＤＲの生存ＣＤ３＋単一細胞での発現によって、Ｔ細胞活性化のフローサイトメトリー解析を評価した。これらのデータから、ＣＤ２５を発現するＴ細胞の数（図１７Ａおよび１７Ｂ）もＴ細胞表面でのＣＤ２５発現レベルの平均値（図１７Ｃ）も、ＮＧ－３４８を感染させたＡ５４９細胞と培養したＴ細胞の方がＥｎＡｄまたは未感染対照よりも有意に高いことがわかった。具体的には、未処理対照とＥｎＡｄ（ＣＤ２５発現Ｔ細胞はそれぞれ２６．９％±３．４％および２５．３±３．５％）との比較ではＴ細胞の活性化状態に差がみられなかったのに対し、ＮＧ－３４８と共培養した細胞の大部分にＣＤ２５のアップレギュレーションがみられた（８３．２±１．５％）。ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞のサブセットについても、そのＣＤ４の発現に基づきＣＤ３＋Ｔ細胞にゲートをかけることによりＣＤ２５発現を解析した。これらの解析から、ＮＧ－３４８で処理した共培養物中のＣＤ４＋Ｔ細胞サブセット、ＣＤ４＿Ｔ細胞サブセットともに、ＥｎＡｄおよび未感染対照と比較してＣＤ２５発現が有意にアップレギュレートされることがわかった（図１８）。
ＣＤ２５とは対照的に、ＨＬＡ－ＤＲを発現する細胞の数は、全被験条件で５％未満という低値であった（図１９Ａ）。これは、共培養後にフローサイトメトリー解析を実施した時点が早かったことに起因するものと思われる。しかし、ＮＧ－３４８処理共培養物のＣＤ３＋ＨＬＡ－ＤＲ＋細胞のＨＬＡ－ＤＲ染色の平均蛍光強度は、対照と比較してわずかであるが有意な増大がみられた（図１９Ｂ）。
Ｔ細胞脱顆粒の刺激
生存ＣＤ３＋Ｔ細胞表面でのＣＤ１０７ａ発現の解析から、Ａ５４９細胞にＮＧ－３４８を感染させた場合（細胞の８．３％±１．７％）、脱顆粒したためにＣＤ１０７ａで染色されたＴ細胞の数がＥｎＡｄ（細胞の０．６％±０．２％）または未処理対照（細胞の０．１％±０．０２％）と比較して有意に増大することがわかった（図２０）。ＣＤ２５のアップレギュレーションと同じく、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセット、ＣＤ４＿Ｔ細胞サブセットともに、ＥｎＡｄまたはＡ５４９対照と比較してＣＤ１０７ａ発現の有意な増大がみられた（図２１）。
刺激性サイトカインであるＩＬ－２およびＩＦＮγの分泌
ＩＬ－２またはＩＦＮγの発現の検出には、共培養上清を５％ＢＳＡ／ＰＢＳアッセイ緩衝液で希釈し（１：１００～１：１０００の範囲）、Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２ Ｒｅａｄｙ Ｓｅｔ ｇｏ Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）またはＨｕｍａｎ ＩＦＮ ｇａｍｍａ Ｒｅａｄｙ ｓｅｔ ｇｏ ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を製造業者のプロトコル通りに用いてＥＬＩＳＡを実施した。
標準曲線から内挿法により分泌ＩＬ－２または分泌ＩＦＮγの濃度を求めた。ＩＬ－２の発現を、ＮＧ－３４８感染Ａ５４９細胞を用いた共培養の上清にのみ検出することができ、ＥｎＡｄおよび未処理対照には検出することができなかった（図２２Ａ）。ＮＧ－３４８感染Ａ５４９細胞の共培養上清にはＩＦＮγの発現も極めて高レベル（３００ｎｇ／ｍＬ超）で検出することができ、この値はＥｎＡｄまたは未処理対照よりも有意に高かった（図２２Ｂ）。
実施例１６．ＣＤ４ Ｔ細胞とＣＤ８ Ｔ細胞の活性化はＮＧ－３４８感染癌細胞系によって独立して媒介され得る
ＮＧ－３４８ウイルス粒子またはＥｎＡｄウイルス粒子を感染させるか感染させずにおいたＡ５４９肺癌細胞と、ヒトＰＢＭＣドナーから単離したＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞とを共培養した。培養上清中への刺激性サイトカインＩＦＮγの分泌によりＴ細胞活性化を評価した。
実施例１４で詳述した方法に従って、Ａ５４９細胞を播き、ＮＧ－３４８ウイルス粒子またはＥｎＡｄウイルス粒子を感染させるか感染させずにおいた。感染から４８時間後、ＰＢＭＣドナーからネガティブ選択によって単離したＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｔ細胞と腫瘍細胞の比が８：１になるようＡ５４９細胞単層に加えた。１６時間共培養した後、上清を回収し、実施例１４で詳述した方法に従ってＩＦＮγを評価した。
ＣＤ４＋Ｔ細胞では、ＮＧ－３４８を感染させたＡ５４９細胞の共培養物の上清にのみＩＦＮγ発現が検出され、ＥｎＡｄにも未処理対照にもＩＦＮγ発現を検出することができなかった（図２３Ａ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞では、ＮＧ－３４８を感染させたＡ５４９細胞の方がＥｎＡｄまたは未処理対照よりも有意に高いレベルでＩＦＮγ発現が検出され（図２３Ｂ）、ＣＤ８細胞、ＣＤ４細胞ともに、腫瘍細胞系でのＮＧ－３４８ウイルス活性によって活性化されＩＦＮγを分泌できることが示された。
実施例１７．ＮＧ－３４７感染癌細胞系が媒介するＴ細胞活性化
ＮＧ－３４７ウイルス粒子またはＥｎＡｄウイルス粒子を感染させるか感染させずにおいたＡ５４９肺癌細胞と、ヒトＰＢＭＣドナーから単離したＴ細胞とを共培養した。細胞表面活性化マーカー（フローサイトメトリーによる）および刺激性サイトカインＩＦＮγの分泌（細胞上清のＥＬＩＳＡ分析による）を分析することによりＴ細胞活性化を評価した。
Ａ５４９細胞を１２ウェルプレートに５ｅ５細胞／ウェルの密度で播いた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした後、細胞に１細胞当たり１０個（ｐｐｃ）のＥｎＡｄウイルス粒子またはＮＧ－３４７ウイルス粒子を感染させるか、感染させずにおいた。感染から２４時間後、ＰＢＭＣ（ＭＡＣ）からネガティブ選択によって単離したＣＤ３＋Ｔ細胞を、Ｔ細胞と腫瘍細胞の比が５：１になるようＡ５４９細胞単層に加えた。共培養を４８時間実施した後、実施例１５で詳述した方法に従って、ＥＬＩＳＡ分析用に細胞上清を収集し、フローサイトメトリー解析用に腫瘍細胞およびＴ細胞を回収した。
回収した細胞を、直接コンジュゲートした抗体、すなわち、ＢＶ６０５とコンジュゲートした抗ＣＤ３およびＢＶ４２１とコンジュゲートした抗ＣＤ６９で染色した。このほか、各共培養条件で得られた細胞の試料を関連するアイソタイプ対照抗体で染色した。染色はいずれも、総体積５０μＬ／ウェルのＦＡＣｓ緩衝液中、４℃で１５分間実施した。次いで、細胞をＦＡＣｓ緩衝液（２００μＬ）で洗浄した後、ＦＡＣｓ緩衝液２００μＬに再懸濁させ、フローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ）により解析した。
Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９のアップレギュレーション
Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９の生存ＣＤ３＋単一細胞での発現によって、Ｔ細胞活性化のフローサイトメトリー解析を評価した。これらのデータから、ＣＤ６９を発現するＴ細胞の数は、ＮＧ－３４７を感染させたＡ５４９細胞と培養したＴ細胞の方がＥｎＡｄまたは未感染対照よりも有意に高いことがわかった（図２４）。
刺激性サイトカインＩＦＮγの分泌
ＩＬ－２またはＩＦＮγの発現の検出には、共培養上清を５％ＢＳＡ／ＰＢＳアッセイ緩衝液で希釈し（１：１００～１：１０００の範囲）、Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ ｇａｍｍａ Ｒｅａｄｙ ｓｅｔ ｇｏ ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を製造業者のプロトコル通りに用いてＥＬＩＳＡを実施した。
標準曲線から内挿法により分泌ＩＦＮγの濃度を求めた。ＩＦＮγの発現を、ＮＧ－３４７感染Ａ５４９細胞を用いた共培養の上清にのみ検出することができ、ＥｎＡｄおよび未処理対照には検出することができなかった（図２５）。
実施例１８：Ｔ細胞活性化抗原ＣＤ８０およびヒトＣＤ３複合体のε鎖（ＣＤ３ε）に対する膜係留型一本鎖Ｆｖフラグメント抗体を発現するＥｎＡｄウイルスの作製
プラスミドｐＥｎＡｄ２．４を用いて、ヒトＴ細胞活性化抗原ＣＤ８０（配列番号１１）およびＣ末端Ｖ５タグを有する膜係留キメラ型の一本鎖Ｆｖ抗ヒトＣＤ３ｅ（配列番号９９）をコードするカセットを直接挿入することによってプラスミドｐＮＧ－３４８Ａを作製した。ｐＮＧ－３４８カセットには、５’の短いスプライスアクセプター配列（配列番号２）；膜係留型抗ヒトＣＤ３ｅ ＳｃＦｖのｃＤＮＡ；Ｃ末端Ｖ５タグ（配列番号１００）；高効率自己切断型Ｐ２Ａペプチド配列（配列番号７）；ヒトＣＤ８０のｃＤＮＡ配列および３’ポリアデニル化配列（配列番号５）が含まれている。ＮＧ－３４８Ａ導入遺伝子カセットの模式図を図２６Ａに示す。ＤＮＡシーケンシングによりプラスミドの構築を確認する。
ウイルスの作製および特徴付け
プラスミドｐＮＧ－３４８Ａを酵素ＡｓｃＩで制限消化することによって直線化し、ウイルスゲノムＮＧ－３４８Ａ（配列番号１０１）を作製する。実施例１で詳述した方法に従ってウイルスＮＧ－３４８Ａを増幅し精製する。
実施例１９：ＥｎＡｄウイルスヒトＣＤ３複合体のε鎖（ＣＤ３ε）に対する膜係留型一本鎖Ｆｖフラグメント抗体の作製
プラスミドｐＥｎＡｄ２．４を用いて、Ｃ末端Ｖ５タグを有する膜係留キメラ型の一本鎖Ｆｖ抗ヒトＣＤ３ｅ（配列番号９９）またはＶ５タグを有さない同Ｆｖ抗ヒトＣＤ３ｅ（配列番号１５）をコードするカセットを直接挿入することによってプラスミドｐＮＧ－４２０およびｐＮＧ－４２０Ａを作製した。ｐＮＧ－４２０カセットには、５’の短いスプライスアクセプター配列ＣＡＧＧ；膜係留型抗ヒトＣＤ３ｅ ｓｃＦｖのｃＤＮＡおよび３’ポリアデニル化配列（配列番号５）が含まれている。ｐＮＧ－４２０Ａカセットには、５’の短いスプライスアクセプター配列ｃａｇｇ；膜係留型抗ヒトＣＤ３ｅ ＳｃＦｖのｃＤＮＡ；Ｃ末端Ｖ５タグ（配列番号１００）および３’ポリアデニル化配列（配列番号５）が含まれている。ＮＧ－４２０遺伝子導入カセットおよびＮＧ－４２０Ａ導入遺伝子カセットの模式図を図２６Ｂおよび２６Ｃに示す。ＤＮＡシーケンシングにより各プラスミドの構築を確認する。
ウイルスの作製および特徴付け
プラスミドｐＮＧ－４２０およびｐＮＧ－４２０Ａを酵素ＡｓｃＩで制限消化することによって直線化し、ウイルスゲノムＮＧ－４２０（配列番号１０２）およびＮＧ－４２０Ａ（配列番号１０３）を作製する。実施例１で詳述した方法に従ってウイルスＮＧ－４２０およびＮＧ－４２０Ａを増幅し精製する。
実施例２０
Ａ５４９ヒト肺癌細胞およびＭＲＣ５ヒト線維芽細胞をＥｎＡｄウイルス、ＮＧ－３４７ウイルスまたはＮＧ－３４８ウイルス（１０ｐｐｃ）と培養して、これらの細胞型によるウイルスゲノム複製、ウイルスヘキソン発現および導入遺伝子発現を比較した。７２時間培養した後、細胞を表面マーカーまたは上清のＦＡＣＳ解析用に染色し、ヘキソン発現または導入遺伝子発現のウイルスゲノム複製（ｑＰＣＲ）解析またはｍＲＮＡ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）解析用に細胞溶解物を調製した。
ウイルスＮＧ－３４７およびＮＧ－３４８を有する２つの導入遺伝子のウイルスゲノム複製およびヘキソンｍＲＮＡ発現は、親ウイルスのＥｎＡｄのものと同程度であった（図２７）。ＮＧ－３４８（図２８）については、Ａ５４９腫瘍細胞でＣＤ８０導入遺伝子および抗ヒトＣＤ３－ｓｃＦｖ導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルが高く、非腫瘍ＭＲＣ５細胞のシグナルは低レベルにとどまった。ＦＡＣＳによって評価した細胞表面でのＣＤ８０タンパク質発現は、ＮＧ－３４８で処理したＡ５４９細胞の大部分に検出されたが、ＭＲＣ５細胞には検出することができず、処理せずにおいた細胞型にも、ＥｎＡｄで処理した細胞型にもＣＤ８０は検出されなかった。同様に、ＮＧ－３４７処理後のＣＤ８０導入遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現は、Ａ５４９腫瘍細胞に選択的に検出され、ＭＲＣ５細胞には検出されなかった（図２９）。
ＥｎＡｄで処理した細胞培養物およびＮＧ－３４７で処理した細胞培養物について、細胞溶解物中のＭＩＰ１αおよびＩＦＮαのｍＲＮＡならびに上清中の分泌タンパク質のレベルをそれぞれＲＴ－ｑＰＣＲおよび特異的ＥＬＩＳＡ測定した。データ（図３０）から、両導入遺伝子ともＡ５４９腫瘍細胞に特異的に発現し、ＭＲＣ５上清中にはＭＩＰ１αケモカインもＩＦＮαサイトカインも検出することができないことがわかる。
実施例２１
単離ＣＤ３＋Ｔ細胞を５００ｐｐｃまたは５０００ｐｐｃのＥｎＡｄウイルス、ＮＧ－３４７ウイルスおよびＮＧ－３４８ウイルスと３日間培養することにより、各ウイルスのヒトＴ細胞に対する選択性／活性を評価した。選択性／活性は、ａ）ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ８０、ＣＤ２５およびＣＤ３を標的とする抗体で染色したＴ細胞のフローサイトメトリー解析、ｂ）ヒトＭＩＰ１αタンパク質、ＩＦＮαタンパク質およびＩＦＮγタンパク質の分泌に関するＥＬＩＳＡ分析、ｃ）ウイルス複製のｑＰＣＲ解析ならびにｄ）遺伝子発現のＲＴ－ｑＰＣＲ解析によって評価した。
図３１からわかるように、いずれの被験ウイルスもＴ細胞がウイルスゲノム複製を支持することはなく、ウイルスヘキソンのＲＴ－ｑＰＣＲアッセイではバックグラウンドシグナルのみがみられた。Ａ５４９腫瘍細胞は高レベルのヘキソンｍＲＮＡ発現を支持した。Ｔ細胞による導入遺伝子ｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ解析では、ＮＧ－３４７、ＮＧ－３４８ともに、ウイルス曝露量が多い場合（５０００ｐｐｃ）でも、ＣＤ８０のシグナルはバックグラウンドのみ（１コピー／細胞未満）がみられ、同様にＮＧ－３４８でも抗ＣＤ３－ＳｃＦｖ ｍＲＮＡの有意な発現はみられなかった。処理（１０ｐｐｃ）を実施したＡ５４９腫瘍細胞には、両導入遺伝子の高レベルな発現が検出された（図３２および３３）。ＩＦＮα導入遺伝子およびＭＩＰ１α導入遺伝子のｍＲＮＡ発現も、（ＥｎＡｄではなく）ＮＧ－３４７（１０ｐｐｃ）で処理したＡ５４９腫瘍細胞に選択的に検出され、５０００ｐｐｃで処理したＴ細胞には検出されなかった（図３４）。さらに、ＣＤ８０の細胞表面タンパク質発現を、ＮＧ－３４７、ＮＧ－３４８ともにＡ５４９細胞でのみで検出することができ、Ｔ細胞では検出することができなかった（図３２および３３）。いずれの細胞型でも、ＥｎＡｄ処理によってＣＤ８０が発現することはなく、Ａ５４９細胞の死滅（色素取込みによる評価）は全３種類のウイルスで同じように高かったほか、実験に使用したウイルス粒子が極めて濃度であったため、いずれのウイルスでも低レベルの非特異的Ｔ細胞死が誘導された（図３２および３３）。５００ｐｐｃのウイルスを使用した場合も、導入遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現に関してほぼ同じデータが得られた（データ不掲載）。
腫瘍細胞の不在下では、精製ヒトＴ細胞は、いずれのウイルスと培養しても、活性化されて活性化マーカーのＣＤ２５およびＣＤ６９をアップレギュレートすることはなかった（表５）。
Figure 0007162929000009
実施例２２
精製Ｔ細胞ではなく未分離ヒトＰＢＭＣを用いて同じ活性評価の実施を含むことにより、実施例２１に記載したものと同様のウイルス選択性実験を実施した。実施例２１のヒトＴ細胞の場合と同じく、この実験のデータ全体から、ヒトＰＢＭＣによるウイルス複製および導入遺伝子発現はみられなかったことがわかる。図３５～３７には５０００ｐｐｃのＥｎＡｄ、ＮＧ－３４７またはＮＧ－３４８を用いたデータが示されているが、５００ｐｐｃを用いても同様のデータが得られた（不掲載）。図３５にはウイルスゲノム複製およびヘキソンｍＲＮＡ発現が示されており、図３６および３７には導入遺伝子のｍＲＮＡ発現が示されている。アッセイのバックグラウンドは、培地に各ウイルスを添加した後、細胞溶解物試料の場合と同じように処理したアッセイで得られたシグナルに従って設定した。ウイルスを加えた上記のＰＢＭＣ培養物はいずれも、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４０＋細胞（主としてＢ細胞）ともにＣＤ８０導入遺伝子の検出可能な発現はみられなかった（不掲載）。
ＣＤ１４発現のダウンレギュレーションのほか、ＨＬＡ－ＤＲおよび内因性細胞表面ＣＤ８０ならびにＭＩＰ１αおよびＩＦＮαの分泌のアップレギュレーションを示した図３８ならびに３９からわかるように、ＰＢＭＣ培養物でＮＧ－３４７ウイルス粒子およびＮＧ－３４８ウイルス粒子が媒介する自然免疫細胞（単球、ＤＣ）の活性化は、ＥｎＡｄのものと同程度であった（ＮＧ－３４７がそのゲノム内にこれらの分子を両方コードしているにもかかわらず、産生レベルが導入遺伝子をコードしていないＥｎＡｄおよびＮＧ－３４８を上回ることはなかったことに注目されたい）。
実施例２３
この実施例は、実施例１５～１７、２１および２２の実験とほぼ同じデザインであるが、今回の実験では、ヒトＰＢＭＣまたは精製Ｔ細胞と、ウイルスで前処理した（４８時間）Ａ５４９腫瘍細胞またはＭＲＣ５線維芽細胞とを共培養した。Ａ５４９細胞またはＭＲＣ５細胞を１０ｐｐｃのＥｎＡｄ、ＮＧ－３４７、ＮＧ－３４８で処理するか、処理せずにおき（ＵＴＣ）、４８時間培養して、ウイルス複製および任意の導入遺伝子発現が起こるのに十分な時間をとった。次いで、この培養物にＰＢＭＣまたはＴ細胞を加えて２４時間または４８時間放置し、ウイルス処理細胞がＴ細胞を活性化することができるかどうかを評価した。
図４０にはウイルスゲノム複製に関するデータが示されており、このデータから、ＰＢＭＣまたはＴ細胞の両細胞型との共培養物中での３種類のウイルスの複製は同程度であり、複製レベルはＡ５４９腫瘍細胞で高く、ＭＲＣ５線維芽細胞で低いことがわかる。
ＣＤ２５の表面発現およびＣＤ８エフェクターＴ細胞脱顆粒のアップレギュレーションおよび細胞表面でのＣＤ１０７ａのアップレギュレーションによって測定されるＴ細胞活性化ならびに細胞内サイトカイン染色によって測定されるＩＦＮγ産生はいずれも、ＮＧ－３４８で処理したＡ５４９細胞によって選択的にＥｎＡｄよりも刺激され、ＭＲＣ共培養物では刺激の媒介はみられなかった（表６）。
Figure 0007162929000010
このほか、共培養上清中へのＩＦＮγ分泌をＥＬＩＳＡにより定量化した。このデータ（図４１）からも同じく、ＮＧ－３４８で処理したＡ５４９腫瘍細胞と共培養したＴ細胞が選択的に活性化され、ＭＲＣ５線維芽細胞ではアッセイに使用した精製Ｔ細胞もＰＢＭＣも活性化されないことがわかる。
このほか、精製Ｔ細胞またはＰＢＭＣと、Ａ５４９腫瘍細胞またはＭＲＣ５線維芽細胞との共培養物のＴ細胞のＣＤ６９レベルを測定することによって、ＮＧ－３４７がＴ細胞を活性化することができるかどうかを評価した。表Ｚからわかるように、Ａ５４９腫瘍細胞をＮＧ－３４７で処理することによって、ＥｎＡｄと比較してＣＤ６９陽性Ｔ細胞がわずかに増強されたことがわかり、その増強自体がこの初期活性化マーカーのアップレギュレーションを引き起こす。ＭＲＣ５共培養物ではこのような効果はみられなかった。Ｔ細胞にＣＤ８０発現は検出されなかった（不掲載）。
Figure 0007162929000011
別の実験では、ＮＧ－３４７で処理しヒトＣＤ３＋Ｔ細胞と共培養したＡ５４９細胞により、Ｔ細胞上のＣＤ６９活性化マーカーのアップレギュレーションおよびＩＦＮγの分泌が引き起こされた（図２４および２５を参照されたい）。
実施例２４
ＣＤ１４＋単球細胞を抗体コート磁気ビーズによる分離によってＰＢＭＣから単離し、ヒトＩＬ－４およびＧＭ－ＣＳＦと培養して樹状細胞に分化させた。３日間培養した後、細胞を５０００ｐｐｃのＥｎＡｄ、ＮＧ－３４７またはＮＧ－３４８で処理するか、処理せずにおいた。陽性活性化対照として、一部の細胞をＬＰＳで刺激した。２日後、上清を採取してサイトカインＥＬＩＳＡに供し、細胞に表面活性化マーカー発現をみる染色を実施してフローサイトメトリーにより解析した。表８に示されるように、いずれのウイルスも共刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６のアップレギュレーションを誘導し、上で確認された粒子媒介性自然免疫細胞活性化効果が、ＮＧ－３４７およびＮＧ－３４８のゲノムに導入遺伝子を組み込むことによって変化することはないことがわかった。このほか、いずれのウイルスもＭＩＰ１αおよびＩＦＮαの同レベルの分泌を刺激した（図４２）。
Figure 0007162929000012
実施例２５
１組の実験では、ＥｎＡｄを陰性対照とし、ＮＧ－３４７ウイルス、ＮＧ－３４８ウイルスおよびＮＧ－４２０ウイルスによる導入遺伝子発現の機能を評価するＴ細胞活性化レポーターアッセイとして、ＪｕｒｋａｔＤｕａｌ細胞を腫瘍細胞との共培養に用いた。ＪｕｒｋａｔＤｕａｌ細胞は、２つの異なるレポーター遺伝子、すなわち、Ｔ細胞受容体複合体を介するシグナル伝達に応答する分泌型ルシフェラーゼを産生するＮＦκＢレポーター遺伝子およびＩＦＮα応答性分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を安定に発現する。Ａ５４９細胞を１０ｐｐｃのウイルスと２日間前培養した後、ＪｕｒｋａｔＤｕａｌ細胞を加えて一晩（１８～２４時間）共培養し、次いで、上清を収集してルシフェラーゼ活性およびＳＥＡＰ活性のアッセイに供した。図４３に示されるように、ＮＧ－３４７を感染させたＡ５４９細胞は、そのＩＦＮαの産生と一致するＳＥＡＰ産生を選択的に誘導した（図１１を参照されたい）が、ルシフェラーゼ活性は誘導しなかった。これに対し、膜抗ＣＤ３－ＳｃＦｖを発現してＴ細胞受容体複合体を活性化するＮＧ－３４８は、ルシフェラーゼを誘導したが、ＳＥＡＰは誘導しなかった。
別の実験では、Ａ５４９肺癌細胞ならびに結腸癌細胞ＨＣＴ－１１６、ＨＴ－２９およびＤＬＤを１０ｐｐｃのＥｎＡｄウイルス、ＮＧ－３４７ウイルス、ＮＧ－３４８ウイルスまたはＮＧ－４２０ウイルスと４８時間前培養した後、ＪｕｒｋａｔＤｕａｌ細胞と一晩共培養し、上清のルシフェラーゼのレベルを試験して、誘導された活性化のレベルを明らかにした。図４４に示されるように、細胞表面抗ＣＤ３－ＳｃＦｖをコードするＮＧ－３４８ウイルスまたはＮＧ－４２０ウイルスと培養した腫瘍細胞型では４種類ともＪｕｒｋａｔＤｕａｌ細胞が活性化されたのに対し、ＥｎＡｄおよびＮＧ－３４７では活性化されず、ルシフェラーゼのレベルは未感染腫瘍細胞対照（ＵＩＣ）のものと同程度であった。
また別の実験では、Ａ５４９腫瘍細胞またはＨＴ－２９腫瘍細胞を量の異なるＮＧ－３４８またはＮＧ－４２０と前培養した後、ＪｕｒｋａｔＤｕａｌ細胞を加え、そのルシフェラーゼ分泌を測定した。図４５のデータから、ＪｕｒｋａｔＤｕａｌ細胞のＮＦκＢ活性の活性化は、腫瘍細胞の処理に用いたウイルスの量に依存することがわかる。
実施例２６
ＥｎＡｄおよびＮＧ－３４８を免疫適格ＣＤ１マウスにＩＶ投与した後のｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態、生体内分布および粒子媒介性全身サイトカイン誘導活性を比較した。５×１０９個のＥｎＡｄ粒子またはＮＧ－３４８粒子をマウスの静脈内に投与し、投与から２分後、１０分後、３０分後、６０分後および１２０分後に採血した。全血のＤＮＡを抽出し、ウイルスゲノムのレベルをみるｑＰＣＲによって解析した（図４６）。両ウイルスの血液からのクリアランスはほぼ同じ動態を示した。同様に、ＭＣＰ－１サイトカイン応答（肝クッパー細胞などの自然免疫の粒子媒介性活性化の尺度）の誘導も両ウイルスで同程度であり、組織生体内分布パターンもほぼ同じであった（図４６）。
実施例２７
ＣＢ１７ ＳＣＩＤマウスの皮下にＨＣＴ１１６細胞を移植し、腫瘍が７０ｍｍ３を超えてからＥｎＡｄウイルス、ＮＧ－３４７ウイルスもしくはＮＧ－３４８ウイルス（ウイルス粒子数５×１０９個）または対照を腫瘍内（ＩＴ）または静脈内（ＩＶ）に注射した。ＩＶ投与マウスでは、ＩＶ投与から３分後、１５分後および３０分後に各グループ３匹のマウスから血液試料を採取し、ＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲにより血中のウイルスゲノムレベルを評価した（薬物動態［ＰＫ］解析）。データ（図４７）から、ＮＧ－３４７とＮＧ－３４８のＰＫはＥｎＡｄ（および互い）に類似していることがわかる。６時間後、各グループ３匹のマウスから腫瘍、肝臓、肺および脾臓を摘出した。ホモジナイズした組織からＤＮＡを抽出し、ｑＰＣＲによりウイルスゲノムレベルを解析した（生体内分布解析）。データ（図４８Ａ）から、ウイルスの組織生体内分布が３種類とも類似していることがわかる。７日または１４～２１日後、各グループ３匹のマウスから腫瘍を摘出し、ホモジナイズして腫瘍溶解物とし、これを用いてＤＮＡおよびＲＮＡの両方を調製した。抽出したＤＮＡのｑＰＣＲ解析によって、２つの時点での腫瘍中のウイルスゲノムレベルを測定した。データ（図４８Ｂ）から、ＩＶ投与マウス、ＩＴ投与マウスともに腫瘍のウイルスゲノムレベルが投与したウイルス量よりも高く、ウイルスが組織内で複製されたことがわかり、第７日のゲノムレベルはＩＶ投与よりもＩＴ投与の方が高いが、第１４日～２１日の時間枠ではともに同程度に高い。ウイルスは３種類とも同等のレベルまで複製された。
同様に、ＲＴ－ｑＰＣＲによって検出した腫瘍溶解物中のウイルスヘキソンｍＲＮＡのレベルは、試験したいずれの時点でも、ＥｎＡｄ、ＮＧ－３４７およびＮＧ－３４８の間で差はみられなかった（図４９および５０）。ＮＧ－３４８処理では両時点および両投与経路で抗ＣＤ３－ＳｃＦｖおよびＣＤ８０のｍＲＮＡがほぼ同じレベルで検出され、ＥｎＡｄ投与ではアッセイバックグラウンドのみが読み取れた（図５０および５１）。ＭＩＰ１αおよびＩＦＮαのｍＲＮＡレベルも、ＩＴ、ＩＶを問わずＮＧ－３４７を投与した場合に選択的に検出された（図５２）。
特異的ＥＬＩＳＡを用いて、ＮＧ－３４７、ＮＧ－３４８がともにコードするＣＤ８０タンパク質ならびにＮＧ－３４７がコードするＭＩＰ１ａタンパク質の腫瘍溶解物中のレベルを測定した。図５３のデータから、単回ＩＶウイルス投与後、この２つのタンパク質も腫瘍抽出物中に選択的に検出されたことがわかる。同じマウスの血液試料にはいずれのタンパク質も検出されなかった。
実施例２８
ｉｎ ｖｉｖｏのＮＧ－３４８ウイルスの活性および腫瘍細胞依存性を評価するため、ヒトＰＢＭＣ（５×１０７個）、Ａ５４９ヒト腫瘍細胞（５×１０６個）およびＥｎＡｄまたはＮＧ－３４８（５×１０９ｐｐｃ）を様々に組み合わせて免疫不全ＳＣＩＤベージュマウスの腹膜内に注射し、細胞を注射してから１５分以内にウイルスまたは対照（生理食塩水）を投与した。３日後、腹膜腔を生理食塩水５ｍＬで洗浄し、回収した細胞をＴ細胞活性化マーカーのパネル（ＣＤ２５、ＣＤ６９およびＨＬＡ－ＤＲ）を用いたフローサイトメトリー解析によって解析し、ＣＤ３＋Ｔ細胞集団にゲートをかけた後のＴ細胞活性化のレベルを評価した。２つの独立した実験で得られたデータ（表９）から、ＮＧ－３４８がｉｎ ｖｉｖｏでヒトＴ細胞活性化を選択的に腫瘍細胞依存性に引き起こすことがわかる。
Figure 0007162929000013

Claims (6)

  1. 配列番号２０、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号１０１、配列番号１０２、および配列番号１０３から選択される配列を含む、複製可能な腫瘍溶解性Ｂ群アデノウイルス。
  2. 配列番号２０を含む、請求項１に記載の複製可能な腫瘍溶解性ウイルス。
  3. 請求項１～２のいずれか１項に記載の複製可能なウイルスと、薬学的に許容される添加剤と、を含む医薬組成物。
  4. 治療における使用のための、請求項１または２に記載の複製可能なウイルス、または請求項３に記載の医薬組成物。
  5. 癌の治療における使用のための、請求項１または２に記載の複製可能なウイルス、または請求項３に記載の医薬組成物。
  6. 前記癌が、結腸直腸癌、肺癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、肝臓癌、頭頸部癌、乳癌、および卵巣癌から選択される、請求項５に記載の複製可能なウイルスまたは医薬組成物。
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