JP7160652B2

JP7160652B2 - 歯周病予防用組成物

Info

Publication number: JP7160652B2
Application number: JP2018223460A
Authority: JP
Inventors: 英史小畠; 舞亜山下; 敏秀冠木; 智子落合; 良喜小林
Original assignee: Megmilk Snow Brand Co Ltd
Current assignee: Megmilk Snow Brand Co Ltd
Priority date: 2018-11-29
Filing date: 2018-11-29
Publication date: 2022-10-25
Anticipated expiration: 2038-11-29
Also published as: JP2023002622A; JP7410250B2; JP2020080785A

Description

IPOD

FERM BP-5445

本発明は、歯周病予防用組成物に関する。特にラクトバチルス・ヘルベティカスを有効成分とする歯周病予防用組成物に関する。

歯周病は、ポルフィロモナス・ジンジバリスやアグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンスなどの歯周病菌により引き起こされる歯周組織に発生する炎症性疾患の総称である。歯周組織の炎症が慢性化し、歯周病が進行すると、最終的には歯槽骨が吸収されることで歯牙の喪失を招く。また、歯周病は慢性炎症による歯周組織の破壊のみならず、動脈硬化や糖尿病などの生活習慣病の発症とも関連していることが報告されており、歯周病を予防することは、単に口腔内の健康だけでなく、生活の質を向上させるためにも重要である。
従来、歯周病の予防および改善には、殺菌・抗菌剤を含有するうがい薬などを用いて歯周病菌を直接殺菌する方法や、歯周病菌が形成するプラークを直接取り除く外科的手法、または抗生物質の服用による薬物投与法などの方法により行われてきた。
特許文献１は、バイオフィルムを形成する主要な口腔内細菌に対して共凝集を引き起こす口腔用組成物を提供することを課題とし、その解決手段としてロイコノストック属の乳酸菌を含有する口腔疾患の予防および／または治療のために用いられる口腔用組成物を開示している。また、チューインガム、トローチ、キャンディーなどへの応用が開示されている。
特許文献２は、通常時（摂食時以外）の口腔内で、う蝕予防、歯周病予防・治療、口臭改善・予防、口腔内のバイオフィルム形成抑制に有用な乳酸菌、又はこの乳酸菌の培養物、培養上清、これらの中和物、及びこれらを含有する組成物等を提供することを課題とし、その解決手段としてう蝕、歯周病又は口臭の原因となる口腔細菌との糖不含培地での共培養において、上記口腔細菌の生育及び／又は上記口腔細菌によって形成されたバイオフィルムの形成を抑制する性質を有する乳酸菌およびその培養由来物を開示している。
特許文献３は、口腔内に留めておく必要がなく、簡便な方法で歯周病を予防することができる口腔内疾患予防剤を提供することを課題とし、その解決手段としてラクトバチルス属に属する乳酸菌が腸管内で定着することで、口腔内で産生した抗菌ペプチドにより口腔内疾患を予防する、ラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５を有効成分とする口腔内疾患予防剤を開示している。
しかしながら、本願の提供する解決手段はいずれの文献にも開示も示唆もされていない。

特開２０１０－５３０６２号公報特許第５９０４０２８号公報特許第６２８５６８７号公報

本発明の課題は、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１を有効成分とする新規な歯周病予防用組成物を提供することである。

上記課題を解決するため、本発明には以下の構成が含まれる。
（１）ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１（ＦＥＲＭＢＰ－５４４５）を有効成分とする歯周病予防用組成物。
（２）（１）に記載の歯周病予防用組成物を含む歯周病予防用飲食品、歯周病予防剤又は歯周病予防用飼料。
（３）ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１（ＦＥＲＭＢＰ－５４４５）を有効成分とする抗菌ペプチド産生促進用組成物。
（４）抗菌ペプチドがβディフェンシンである（３）に記載の抗菌ペプチド産生促進用組成物。
（５）（３）又は（４）に記載の抗菌ペプチド産生促進用組成物を含む抗菌ペプチド産生促進用飲食品、抗菌ペプチド産生促進剤又は抗菌ペプチド産生促進用飼料。

ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１菌体を含む組成物を摂取することにより、口腔内のポルフィロモナス・ジンジバリスを減少させ、歯周病予防効果を得ることが期待できる。

ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１菌体の投与の有無における、歯槽骨の染色の様子を示したデジタルＨＤマイクロスコープの写真である。ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１菌体の投与の有無における、歯槽骨吸収量を示した図である。ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１菌体の投与の有無における、歯肉組織中のポルフィロモナス・ジンジバリス由来ＤＮＡ検出量を示した図である。ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１菌体の投与の有無における、歯肉組織中のＴＮＦα遺伝子発現量を示した図である。ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１菌体の投与の有無における、歯肉組織中のβ－ディフェンシン遺伝子発現量を示した図である。

本発明は、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１を有効成分として含む新規な歯周病予防用組成物を提供するものである。本発明の歯周病予防用組成物について以下に詳細に説明する。
本発明は、経口摂取により歯周病予防効果を示す菌株として、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１（ＦＥＲＭＢＰ－５４４５）、またはラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１（ＦＥＲＭＢＰ－５４４５）と実質的に同等の変異株を用いる。
実質的に同等の変異株とは、経口摂取により歯周病予防効果を示し、その１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９８％以上、好ましくは９９％以上、より好ましくは１００％の相同性を有し、且つ、好ましくはラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１と同一の菌学的性質を有するものである。さらに、本発明の効果が損なわれない限り、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１又はそれと実質的に同等の菌株から、変異処理、遺伝子組換え、自然変異株の選択等によって育種された菌株であってもよい。
このラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１は新規なラクトバチルス属の菌株として報告されており（特開平７－２７４９４９号公報）、ＦＥＲＭＢＰ－５４４５として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。また、新規アミノペプチダーゼを産生することや新規エンドペプチダーゼを産生すること等が報告されている（特開平８－９９７３号公報、特開平８－２９８９８７号公報、特開平９－２０６０７４号公報）。また、多糖を産生し、低脂肪硬質ナチュラルチーズの製造に適していることが報告されている（特開平１１－１５５４８１号公報）。
本発明の歯周病予防用組成物の経口摂取により歯周病予防効果を示す作用は、必ずしも明らかではないが、摂取したラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１が生体内において歯周病菌に対する抗菌ペプチド産生促進作用などの感染防御機能を強化し、歯周病菌の増殖を抑制したと考えられる。

（歯周病予防用組成物の調製）
ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１の菌体は、乳酸菌培養の常法に従ってラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１を培養し、得られた培養物から遠心分離等の集菌手段によって分離することにより得ることができる。ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１を含む組成物は、純粋に分離された菌体だけでなく、培養物や懸濁物といった菌体含有物、さらにこれらの乾燥物、濃縮物、ペースト状物等を用いて調製することができる。

（歯周病予防用飲食品）
本発明の歯周病予防用組成物の一態様である飲食品の形態について説明する。
本発明の歯周病予防用飲食品の形態は歯周病予防効果を妨げないものであればどのようなものでもよい。本発明の歯周病予防用飲食品の形態として、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１の菌体や菌体を含む培養物、およびラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１を含む乳酸菌を用いて調製した発酵乳やチーズ等の発酵食品、さらに、上記の菌体、菌体を含む培養物、発酵乳、チーズ等の発酵食品を含むパン、スナック菓子、ケーキ、プリン飲料、麺類、ソーセージ等の加工食品、さらには、各種粉乳、乳幼児食品、サプリメント等を例示することができる。

（歯周病予防用医薬品、歯周病予防用動物飼料）
本発明の歯周病予防用組成物の一態様である医薬品及び動物飼料の形態について説明する。
医薬品を調製する場合は、製剤化に際しては製剤上許可されている賦型剤、安定剤、矯味剤などを適宜混合して用いることができ、本発明の効果を妨げない範囲で、賦型剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、懸濁剤、コーティング剤、その他の任意の薬剤を混合して製剤化することもできる。剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤などが可能であり、これらを経口的に投与する。動物飼料に含まれる場合は、これを摂取した動物も同様の効果が期待できる。

（摂取量）
本発明の歯周病予防効果を発揮させるためには、成人の場合、乳酸菌体重量で１～１,０００ｍｇ／日摂取することが望ましい。
本発明のラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１を配合した歯周病予防用飲食品などを調製する場合、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１の含有割合は特に限定されず、製造の容易性や好ましい一日投与量等に合わせて適宜調節すればよい。例えば形状が液体の場合には、１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ～１×１０^１０ｃｅｌｌｓ／ｍｌとすることが好ましく、固体の場合には、１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｇ～１×１０^１０ｃｅｌｌｓ／ｇとすることが好ましい。
上記歯周病予防用組成物は、その作用から抗菌ペプチド産生促進用組成物としても利用することができ、その場合、上記調製方法、摂取量、飲食品、医薬品、動物飼料において歯周病予防用組成物を抗菌ペプチド産生促進用組成物と読み替えるものとする。

以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

〔試験例１〕本発明乳酸菌のマウス歯周炎に対する抑制効果の確認
１．ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１菌体の調製
本試験に用いたラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１菌体の調製例を以下に示す。
ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１をＭＲＳ液体培地１００ｍＬで３７℃、１６時間培養後、遠心分離（８，０００×ｇ、４℃、１０分間）にて菌体を回収し、生理食塩水で２回、滅菌ＭｉｌｌｉＱ水で１回洗浄し、菌体を得た。

２．マウス実験的歯周炎に対する乳酸菌の抑制効果
２－１．実験的歯周炎の惹起方法
生後７週齢の雌性ＢＡＬＢ/ｃマウスを２試験群Ａ、Ｂに分け、試験群Ａには２５％トレハロース溶液のみを胃内投与した。試験群Ｂには２５％トレハロース水溶液に混合したラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１（１０^９ｃｆｕ／２００μｌ）を、ゾンデを用いて３週間連日胃内に強制投与した。その後、２試験群それぞれのマウスに対して実験的に歯周炎を惹起させるために、５％カルボキシメチルセルロース溶液で調製したポルフィロモナス・ジンジバリス３８１株の菌液（１０^９ｃｆｕ／１００μｌ）を、２週間連日口腔内に強制接種した。ポルフィロモナス・ジンジバリス菌の投与中も、試験群Ｂには２５％トレハロース溶液に混合したラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１（１０^９ｃｆｕ／２００μｌ）の投与を続け、試験群Ａには２５％トレハロース溶液のみを胃内投与した。

２－２．歯槽骨の吸収量
（１）評価方法
両試験群共にポルフィロモナス・ジンジバリス菌の口腔接種後３０日目にマウスを炭酸ガスにて安楽死させ、頭蓋骨を２気圧下で１０分間加熱後、３％次亜塩素酸ナトリウム溶液に浸漬して軟組織を除去し、１％メチレンブルー溶液で歯槽骨を染色乾燥させた試料をデジタルＨＤマイクロスコープにて観察した。観察結果を図１に示す。
また、下顎臼歯部のセメントエナメル境から歯槽骨頂までの距離を７カ所測定し、測定値を平均し個体当たりの歯槽骨吸収量とした。結果を図２に示す。
（２）評価結果
図１はデジタルＨＤマイクロスコープの写真であり、上は試験群Ａを下は試験群Ｂを示す。試験群Ｂの歯槽骨は試験群Ａの歯槽骨と比較し、染色部が少ないことから、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１の投与により、ポルフィロモナス・ジンジバリス菌感染による炎症及び歯槽骨吸収が顕著に抑制されたことが分かる。
図２は、縦軸に平均歯槽骨吸収量（μｍ）を表した。左側が試験群Ａで右側が試験群Ｂである。試験群Ｂは、試験群Ａと比較し平均骨吸収量が低いことから、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１の投与により、ポルフィロモナス・ジンジバリス菌感染による炎症及び歯槽骨吸収が顕著に抑制されたことが分かる。

２－３．組織中のポルフィロモナス・ジンジバリス菌のＤＮＡの検出
（１）評価方法
ポルフィロモナス・ジンジバリス菌の口腔接種後３０日目に両試験群のマウスから歯肉組織を採取し、組織中のポルフィロモナス・ジンジバリス菌のＤＮＡをＰＣＲで増幅し、アガロースゲル電気泳動にて検出した。結果を図３に示す。
（２）評価結果
試験群Ｂは、試験群Ａと比較し、ポルフィロモナス・ジンジバリス菌のＤＮＡに由来するバンドが薄いことから、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１の投与により、口腔内のポルフィロモナス・ジンジバリス菌が減少したことが分かる。

２－４．組織中のＴＮＦα特異的ｍＲＮＡの発現量の測定
（１）評価方法
ポルフィロモナス・ジンジバリス菌の口腔接種後１日目に両試験群のマウスから歯肉組織を採取し、Ｔｒｉｚｏｌ(登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。抽出したトータルＲＮＡ溶液から、ＧｅｎｅＡｍｐＲＮＡＰＣＲＫｉｔ（タカラバイオ）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られた逆転写反応液をｔｅｍｐｌａｔｅｃＤＮＡとしてリアルタイムＰＣＲに供した。
リアルタイムＰＣＲにはＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。プライマーはＴＮＦα（Ｆｏｒｗａｒｄ：５’－ＧＧＣＡＧＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＧＡＡ－３’、Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＧＡＡＧＧＣＣＴＡＡＧＧＴＣＣＡＣＴＴＧＴＧＴ－３’）、Ｇａｐｄｈ（Ｆｏｒｗａｒｄ：５’－ＴＧＴＧＴＣＣＧＴＣＧＴＧＧＡＴＣＴＧＡ－３’、Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣＧＣＡＧＧＡＧ－３’）を使用した。反応にはＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＤｉｃｅ(登録商標）ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲｓｙｓｔｅｍを使用した。組織中のＴＮＦα特異的ｍＲＮＡ発現量測定結果を図４に示す。
（２）評価結果
試験群Ｂが試験群Ａと比較してＴＮＦαの発現が低いことから、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１の投与により、ポルフィロモナス・ジンジバリス菌の感染による歯肉での炎症が抑制されたことが分かる。

２－５．組織中のβ－ディフェンシン濃度特異的ｍＲＮＡ発現量の測定
（１）評価方法
ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１もしくはトレハロース水溶液の３週間投与後、ポルフィロモナス・ジンジバリス菌の口腔接種前に、両試験群のマウスから歯肉組織を採取し、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて細胞からトータルＲＮＡを抽出した。抽出したトータルＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で濃度を測定した。
抽出したトータルＲＮＡ溶液から、ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅｑＰＣＲＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘｗｉｔｈｇＤＮＡＲｅｍｏｖｅｒ（東洋紡）を用いてｃＤＮＡを合成した。逆転写反応には、ＴａＫａＲａＰＣＲＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＤｉｃｅ(登録商標）Ｇｒａｄｉｅｎｔ（タカラバイオ）を使用した。得られた逆転写反応液をｔｅｍｐｌａｔｅｃＤＮＡとしてリアルタイムＰＣＲに供した。
リアルタイムＰＣＲにはＴａｑＭａｎ(登録商標）ＦａｓｔＡｄｖａｎｃｅｄＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃４４４４５５６）およびＴａｑＭａｎＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｓｓａｙ（Ｄｅｆｂ４：Ｍｍ００７３１７６８＿ｍ１、Ｄｅｆｂ１４：Ｍｍ００８０６９７９＿ｍ１、Ｇａｐｄｈ：Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。反応には３８４ウェルプレート（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃４３０９８４９）を用い、ＶｉｉＡ^TM７（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。遺伝子発現はΔΔＣｔ法によって試験群Ａに対する相対発現量として評価した。
組織中のβ－ディフェンシン（Ｄｅｆｂ４、Ｄｅｆｂ１４）特異的ｍＲＮＡ発現量測定結果を図５に示す。
（２）評価結果
試験群Ｂが試験群Ａと比較してβ－ディフェンシンの発現が高いことから、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１の投与により、β－ディフェンシン産生が顕著に亢進し、歯周病菌感染による症状を抑制したことがわかる。

（食品への配合例）
ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１菌体１００ｍｇに、脱脂粉乳３０ｇ、ビタミンＣとクエン酸の等量混合物４０ｇ、グラニュー糖１００ｇ、コーンスターチと乳糖の等量混合物６０ｇを加えて混合した。混合物をスティック状袋に詰め、本発明の歯周病予防用スティック状健康食品を製造した。

（飼料への配合例）
ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１菌体２０ｇを３９８０ｇの脱イオン水に懸濁し、４０℃まで加熱後、ＴＫホモミクサー（ＭＡＲＫＩＩ１６０型；特殊機化工業社製）にて、３，６００ｒｐｍで２０分間撹拌混合して２ｇ／４ｋｇの菌体溶液を得た。この菌体溶液２ｋｇに大豆粕１ｋｇ、脱脂粉乳１ｋｇ、大豆油０．４ｋｇ、コーン油０．２ｋｇ、パーム油２．３ｋｇ、トウモロコシ澱粉１ｋｇ、小麦粉０．９ｋｇ、ふすま０．２ｋｇ、ビタミン混合物０．５ｋｇ、セルロース０．３ｋｇ、ミネラル混合物０．２ｋｇを配合し、１２０℃、４分間加熱殺菌して、本発明の歯周病予防用飼料１０ｋｇを製造した。

（医薬品への配合例）
ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１の液体培養物を、４℃、７，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、滅菌水による洗浄と遠心分離を３回繰り返して行い、洗浄菌体を得た。この洗浄菌体を凍結乾燥処理して菌体粉末を得た。この菌体粉末１部に脱脂粉乳４部を混合し、この混合粉末を打錠機により１ｇずつ常法により打錠して、本発明の歯周病予防用錠剤を調製した。

ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１を有効成分とする素材を体内に摂取することにより、歯周病予防作用を得ることが期待できる。

Claims

ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１（ＦＥＲＭＢＰ－５４４５）を有効成分とする歯周病予防用組成物。
請求項１に記載の歯周病予防用組成物を含む歯周病予防用飲食品。
請求項１に記載の歯周病予防用組成物を含む歯周病予防剤。
請求項１に記載の歯周病予防用組成物を含む歯周病予防用飼料。