[go: up one dir, main page]

JP7033113B2 - Factors involved in fatigue and their utilization - Google Patents

Factors involved in fatigue and their utilization Download PDF

Info

Publication number
JP7033113B2
JP7033113B2 JP2019212285A JP2019212285A JP7033113B2 JP 7033113 B2 JP7033113 B2 JP 7033113B2 JP 2019212285 A JP2019212285 A JP 2019212285A JP 2019212285 A JP2019212285 A JP 2019212285A JP 7033113 B2 JP7033113 B2 JP 7033113B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
fatigue
eif
amount
candidate
phosphorylation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2019212285A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JP2020058355A (en
Inventor
一博 近藤
伸行 小林
直美 岡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Virus Ikagaku Kenkyusho Inc
Original Assignee
Virus Ikagaku Kenkyusho Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Virus Ikagaku Kenkyusho Inc filed Critical Virus Ikagaku Kenkyusho Inc
Publication of JP2020058355A publication Critical patent/JP2020058355A/en
Application granted granted Critical
Publication of JP7033113B2 publication Critical patent/JP7033113B2/en
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/05—Animals modified by non-integrating nucleic acids, e.g. antisense, RNAi, morpholino, episomal vector, for non-therapeutic purpose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
    • G01N2333/4706—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/30—Psychoses; Psychiatry
    • G01N2800/306—Chronic fatigue syndrome

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

本発明は、ヒトの疲労度を評価する方法およびその利用法、疲労度を評価するためのキット、ならびに抗疲労物質または抗疲労法の抗疲労力測定方法、および疲労モデル動物に関する。 The present invention relates to a method for assessing human fatigue and its use, a kit for assessing fatigue, an anti-fatigue substance or anti-fatigue method anti-fatigue measuring method, and a fatigue model animal.

疲労は、日常生活において非常に身近な問題であり、ストレスの多い現代人の中では、さまざまな疲労に悩む人が多い。疲労には、「生理的疲労」と呼ばれる、健常者において心身に運動や労働などの負荷が生じた際に発現する疲労と、「病的疲労」と呼ばれる、何らかの原疾患に付随する疲労がある。最近では、「病的疲労」の中でも特に、慢性疲労症候群(CFS)やうつ病などの中枢神経系の疾患による疲労は、脳に異常な疲労感が生じるもので、「pathological fatigue」として、生理的疲労や末梢臓器や末梢組織の疾患による病的疲労と区別される。生理的疲労とpathological fatigue以外の病的疲労は、合わせて「nonpathological fatigue」と呼ばれ、末梢の臓器や組織に対する疲労負荷が何らかの方法で脳に伝わり、脳が疲労を感じることで発生する。これに対し、pathological fatigueは、末梢には原因はなく、脳に何らかの異常が生じていることで疲労感を感じるものである(非特許文献1)。すなわち、nonpathological fatigueは末梢臓器や末梢組織に原因がある疲労、pathological fatigueは脳の疾患による疲労と言える。なお、pathological fatigueとnonpathological fatigueには今のところ適切な邦訳がないため、本明細書では英語での名称をそのまま使用する。 本明細書におけるnonpathological fatigueは、生理的疲労のすべてと、末梢臓器や末梢組織の疾患が疲労の原因となる病的疲労を含んだ疲労を表す。また、特に断っていない場合は、本明細書における疲労はnonpathological fatigueを示す。 Fatigue is a very familiar problem in daily life, and many stressful modern people suffer from various fatigues. Fatigue includes fatigue called "physiological fatigue", which occurs when a healthy person is physically and mentally stressed by exercise or labor, and fatigue associated with some underlying disease called "morbid fatigue". .. Recently, among "morbid fatigue", fatigue caused by diseases of the central nervous system such as chronic fatigue syndrome (CFS) and depression causes abnormal fatigue in the brain, and is referred to as "pathological fatigue". It is distinguished from fatigue and pathological fatigue caused by diseases of peripheral organs and tissues. Physiological fatigue and pathological fatigue other than pathological fatigue are collectively called "nonpathological fatigue" and occur when the fatigue load on peripheral organs and tissues is transmitted to the brain in some way and the brain feels fatigue. On the other hand, pathological fatigue has no peripheral cause and causes a feeling of fatigue due to some abnormality in the brain (Non-Patent Document 1). That is, it can be said that nonpathological fatigue is fatigue caused by peripheral organs and tissues, and pathological fatigue is fatigue caused by brain diseases. Since there is no appropriate Japanese translation for pathological fatigue and nonpathological fatigue so far, the names in English are used as they are in this specification. As used herein, nonpathological fatigue refers to fatigue including all physiological fatigue and pathological fatigue in which diseases of peripheral organs and tissues cause fatigue. Unless otherwise specified, fatigue in the present specification indicates nonpathological fatigue.

疲労が大きな社会問題であるにも関わらず、疲労に関する科学的・医学的研究は、断片的に行われていたに過ぎず、疲労をいかに定量的・客観的に表すかという決定的手段または定量尺度については、確立されていない。本発明者らの先行特許である唾液中ヒトヘルペスウイルスによる疲労測定法（特許文献１、２）では、客観的な疲労(特にnonpathological fatigueの)測定が可能であるが、測定対象が中長期的な疲労の測定に限られ、疲労負荷試験などの急性の疲労の測定には不向きであった。また、疲労のメカニズムを解明していない点や、ヒトにのみ適用可能であり動物モデルによる疲労の研究や試験への応用ができないといった問題点もあった。疲労のメカニズムの理解や、負荷試験や動物実験は、抗疲労物質のスクリーニングや、疲労の予防法や回復法の開発に不可欠な要因であるため、これらの疑問に答え、疲労を客観的に測定する方法は強く求められていた。 Despite the fact that fatigue is a major social problem, scientific and medical research on fatigue has been conducted only in fragments, and it is a decisive means or quantitative method of how to express fatigue quantitatively and objectively. The scale has not been established. The fatigue measurement method using human herpes virus in saliva (Patent Documents 1 and 2), which is the prior patent of the present inventors, can objectively measure fatigue (particularly nonpathological fatigue), but the measurement target is medium- to long-term. It was limited to the measurement of fatigue and was not suitable for the measurement of acute fatigue such as fatigue load test. In addition, there are problems that the mechanism of fatigue has not been elucidated, and that it can be applied only to humans and cannot be applied to research and testing of fatigue using animal models. Understanding the mechanism of fatigue, load testing and animal experiments are indispensable factors for screening anti-fatigue substances and developing methods for preventing and recovering from fatigue. Therefore, we answer these questions and measure fatigue objectively. There was a strong need for a way to do it.

疲労のメカニズムに関しては、少し前まで「疲労」の代表的な例として、筋肉疲労が主に研究されており、その指標として、筋肉中の乳酸産生量の増加が注目されていた。一般に「疲労物質」イコール乳酸であるという説が広まったのはこのことによる。しかし、本来乳酸は重要なエネルギー源であり、乳酸が筋肉活動を阻害するという説は、現在では否定的に捉えられている。その他、筋肉疲労にともなって、pHが低下する現象が知られている。しかし、これらは筋肉への負荷（運動負荷）という一定のストレスを与えたときには確かにみられる現象であるが、筋肉という局所にとどまる現象であると考えられる。「疲労」は、生体に現れるもっと幅広い大きな生理現象と考えられ、これら以外のメカニズムの解明が必要であると考えられる様になった（非特許文献２）。 Regarding the mechanism of fatigue, muscle fatigue has been mainly studied as a typical example of "fatigue" until a while ago, and an increase in lactic acid production in muscle has been attracting attention as an index. This is the reason why the theory that "fatigue substance" is equal to lactic acid has become widespread. However, lactic acid is originally an important energy source, and the theory that lactic acid inhibits muscle activity is now regarded as negative. In addition, it is known that the pH decreases with muscle fatigue. However, although these are phenomena that are certainly seen when a certain stress of load on muscles (exercise load) is applied, they are considered to be phenomena that remain locally in the muscles. "Fatigue" is considered to be a broader and larger physiological phenomenon that appears in living organisms, and it has become necessary to elucidate mechanisms other than these (Non-Patent Document 2).

次に、疲労のメカニズムとして熱心に研究されたのが、慢性疲労症候群(CFS)であった。CFS研究からは、疲労のメカニズムとして、酸化ストレス、炎症性サイトカイン、自律神経機能障害、免疫異常などが上げられ、これらが疲労、特に慢性的な疲労のバイオマーカーとして有力視されてきた。しかし、その一方で、CFSの疲労はpathological fatigueであるため、脳の疾患が関係しない条件における疲労を代表するものではないことが指摘されている。さらに、CFS自体に関しても、何らかの感染による神経疾患であるとする説や、うつ病の一種と考えるのが適切であるとする説が有力となりつつあり、CFSのバイオマーカーとして得られた指標がそのまま疲労の指標として使用可能であるかどうかは、疑問視される様になった。 Next, chronic fatigue syndrome (CFS) was enthusiastically studied as a mechanism of fatigue. From CFS studies, oxidative stress, inflammatory cytokines, autonomic dysfunction, immune disorders, etc. have been raised as the mechanisms of fatigue, and these have been regarded as promising biomarkers for fatigue, especially chronic fatigue. However, on the other hand, it has been pointed out that CFS fatigue is pathological fatigue and does not represent fatigue under conditions not related to brain disease. Furthermore, regarding CFS itself, the theory that it is a neurological disease due to some kind of infection and the theory that it is appropriate to consider it as a type of depression are becoming influential, and the index obtained as a biomarker for CFS remains as it is. Whether it can be used as an indicator of fatigue has become questionable.

疲労の動物実験においても、CFSに類似の慢性疲労状態を再現することに重点が置かれ、非生理的な強い過労における疲労のメカニズムが検討されている。また、疲労メカニズムの研究においては、感染モデルと呼ばれるウイルス感染を模したモデルが用いられることもある。しかし何れの動物モデルも、CFSと類似の慢性化した病的な疲労状態を再現したものとなっている。この様な状況により、生理的な条件による疲労のメカニズムは、ほとんど解明されていない（非特許文献３、４）。 Animal experiments on fatigue have also focused on reproducing a chronic fatigue condition similar to CFS, and the mechanism of fatigue in non-physiologically intense overwork has been investigated. In addition, in the study of fatigue mechanism, a model that imitates viral infection called an infection model may be used. However, both animal models reproduce chronic morbid fatigue similar to CFS. Under such circumstances, the mechanism of fatigue due to physiological conditions has hardly been elucidated (Non-Patent Documents 3 and 4).

疲労のメカニズムを研究する際に説明すべき、疲労、特に生理的疲労の重要な特徴として、休息によって容易に回復するという性質(可逆性または易回復性と呼ばれる)が挙げられる。この性質は、疲労という生理現象を定義する際の重要な要素であり、疲労のメカニズムの解明にも必要な要素であると考えられる。 An important feature of fatigue, especially physiological fatigue, that should be explained when studying the mechanism of fatigue is the property of being easily recovered by rest (called reversibility or easy recovery). This property is an important factor in defining the physiological phenomenon of fatigue, and is considered to be a necessary factor for elucidating the mechanism of fatigue.

疲労の発生機構は何らかのストレス応答と関係すると考えられるが、ストレス応答の種類やシグナル伝達経路は非常に多く、疲労に特異的なメカニズムやシグナル伝達経路を絞り込むことは非常に難しい。さらに、DNAマイクロアレイを用いた研究によって、疲労刺激に反応して1,000種類を超える遺伝子の発現が変化することが知られており、このことからも疲労のメカニズムやシグナル伝達経路の同定が極めて困難であることが予想された。
また、DNAマイクロアレイによる疲労の分子バイオマーカー検索は、疲労による発現量の変化によってスクリーニングを行うことが多い。シグナル伝達においては、変化の大きいものが必ずしも特異的な変化を反映するとは限らないため、この様な検索方法で、正しく疲労特異的な分子バイオマーカーが検索可能であるかには疑問があった。
このため、疲労の分子バイオマーカーには、疲労負荷によって増加するという条件の他に、実験動物への導入によって疲労を誘導できること、当該分子の機能阻害によって疲労が減弱できること、可能な限りシグナル伝達経路の上流にあること、疲労の原因となる物質との関係が示されること、などの条件が要求される（非特許文献５）。 Although the mechanism of fatigue generation is considered to be related to some kind of stress response, there are many types of stress responses and signal transduction pathways, and it is very difficult to narrow down the mechanism and signal transduction pathway specific to fatigue. Furthermore, studies using DNA microarrays have shown that the expression of more than 1,000 genes changes in response to fatigue stimuli, which also makes it extremely difficult to identify the mechanism of fatigue and signal transduction pathways. It was expected that there would be.
In addition, molecular biomarker searches for fatigue using DNA microarrays are often screened based on changes in the expression level due to fatigue. In signal transduction, large changes do not always reflect specific changes, so it was doubtful that such a search method could correctly search for fatigue-specific molecular biomarkers. ..
Therefore, in addition to the condition that the molecular biomarker of fatigue is increased by fatigue load, fatigue can be induced by introduction into experimental animals, fatigue can be attenuated by functional inhibition of the molecule, and a signal transduction pathway as much as possible. Conditions such as being upstream of the above and showing the relationship with substances that cause fatigue are required (Non-Patent Document 5).

上述のように、筋肉疲労やCFSに関する疲労のメカニズムや測定法は提案されているが、日常生活における生理的疲労は、先に述べたように、多くの現代人が感じているものであるにも関わらず、そのメカニズムや客観的な評価方法について、ほとんど報告がなされていない。さらに、生理的疲労と病的疲労の判別や、pathological fatigueと nonpathological fatigueの判別が可能なバイオマーカーも明らかでなく、これらを評価したり判別したりする方法も確立されていない。日常生活における疲労は、たとえ生理的疲労であっても、そのまま放置すると精神疾患などの健康障害や過労死に直結するおそれもある。過労・疲労による精神疾患の問題や過労死の問題は医学的、経済的、社会的にも非常に重要であると認識されているにもかかわらず、肝心な疲労の科学的メカニズムについてほとんど解明されていない。このため、近年、社会問題化しているこれらの問題を防止するためにも疲労のメカニズムに基づく客観的な疲労度の評価方法が必要とされている。 As mentioned above, the mechanism and measurement method of muscle fatigue and fatigue related to CFS have been proposed, but as mentioned above, physiological fatigue in daily life is felt by many modern people. Despite this, few reports have been made on its mechanism or objective evaluation method. Furthermore, biomarkers capable of discriminating between physiological fatigue and pathological fatigue and pathological fatigue and nonpathological fatigue have not been clarified, and a method for evaluating or discriminating them has not been established. Fatigue in daily life, even if it is physiological fatigue, may directly lead to health problems such as mental illness and death from overwork if left as it is. Although the problems of mental illness and death from overwork due to overwork and fatigue are recognized to be of great medical, economic and social importance, most of the essential scientific mechanism of fatigue has been elucidated. Not. Therefore, in order to prevent these problems, which have become social problems in recent years, an objective method for evaluating the degree of fatigue based on the mechanism of fatigue is required.

さらに、市場に氾濫する栄養ドリンクなどの医薬品または健康食品等の多くは、抗疲労効果を売り物としたものであるため、その機能性に対する科学的な裏づけが消費者のみならず市場・社会全体において広く求められている。また、疲労や疲労の影響や障害を予防あるいは抑制する、または回復させる効果を総称して抗疲労効果と呼ぶが、抗疲労効果には、疲労を予防または防止する効果(疲労予防効果)と、生じた疲労や疲労の影響を回復または抑制する効果(疲労回復効果)が含まれる。抗疲労物質や抗疲労法を効率良く利用するには、これらが疲労予防効果と疲労回復効果のどちらを有するかなどの作用機序を評価し、適切に使用することが必要である。 Furthermore, many of the medicines such as energy drinks or health foods that flood the market are for sale because of their anti-fatigue effect, so the scientific support for their functionality is not only for consumers but also for the market and society as a whole. Widely sought after. In addition, the effect of preventing, suppressing, or recovering from the effects of fatigue and fatigue is collectively called the anti-fatigue effect, and the anti-fatigue effect includes the effect of preventing or preventing fatigue (fatigue prevention effect). It includes the effect of recovering or suppressing the fatigue and the effects of fatigue (fatigue recovery effect). In order to efficiently use anti-fatigue substances and anti-fatigue methods, it is necessary to evaluate the mechanism of action such as whether they have a fatigue prevention effect or a fatigue recovery effect, and use them appropriately.

この様な状況を背景に、本発明者らは客観的疲労測定法の開発や、疲労のメカニズムに関する研究を行った(非特許文献６～１２)。この研究で得た発明者しか知り得ない未発表のノウハウを利用して、本特許明細書にある発明を得た。 Against this background, the present inventors have developed an objective fatigue measurement method and studied the mechanism of fatigue (Non-Patent Documents 6 to 12). Utilizing the unpublished know-how that only the inventor obtained in this study can know, the invention described in the present patent specification was obtained.

以上のように、疲労による障害の可能性を評価し、これに対し適切な防止策を講じるためには、疲労を定量的に測定するに留まらず、疲労が生理的疲労であるのか病的疲労であるのか、pathological fatigueであるのかnonpathological fatigueであるのかなど、疲労の種類を客観的に評価し、これらに適切に対処することが可能な抗疲労物質や抗疲労法を利用することが必要である。このため、簡便かつ客観的に疲労の質および量を評価することができる方法およびその利用法の開発が強く求められている。 As described above, in order to evaluate the possibility of injury due to fatigue and take appropriate preventive measures against it, it is not limited to quantitatively measuring fatigue, but whether fatigue is physiological fatigue or pathological fatigue. It is necessary to objectively evaluate the type of fatigue, such as whether it is pathological fatigue or nonpathological fatigue, and to use anti-fatigue substances and anti-fatigue methods that can appropriately deal with these. be. Therefore, there is a strong demand for the development of a method and a method of using the method that can easily and objectively evaluate the quality and quantity of fatigue.

「疲労度評価方法およびその利用」特許第4218842号公報（2009年2月4日発行)"Fatigue Evaluation Method and Its Use" Patent No. 4218842 (issued February 4, 2009) 「疲労度評価方法およびその利用」特許第4812708号公報（2011年11月9日発行)"Fatigue Evaluation Method and Its Use" Patent No. 4812708 (issued on November 9, 2011)

What is fatigue? Pathological and nonpathological fatigue. Jason LA, Evans M, Brown M, Porter N. PM&R. 2010;2(5):327-31.What is fatigue? Pathological and nonpathological fatigue. Jason LA, Evans M, Brown M, Porter N. PM & R. 2010; 2 (5): 327-31. 「疲労のメカニズム」渡辺恭良（医学のあゆみ 2009; 228 (6): 598-604）"Mechanism of fatigue" Yasuyoshi Watanabe (Ayumi of Medicine 2009; 228 (6): 598-604) 「過労モデル動物を用いた研究からわかってきた疲労のメカニズム」田中雅彰（医学のあゆみ 2009; 228 (6): 610-4）"Mechanism of fatigue revealed from research using overwork model animals" Masaaki Tanaka (Ayumi of Medicine 2009; 228 (6): 610-4) 「免疫学的疲労モデルにおける疲労の分子神経メカニズム」片渕俊彦（医学のあゆみ 2009; 228 (6): 615-9）"Molecular Neural Mechanism of Fatigue in Immunological Fatigue Model" Toshihiko Katabuchi (Ayumi of Medicine 2009; 228 (6): 615-9) 「末梢血遺伝子発現プロファイルからみたイミダゾールジペプチドの抗疲労効果の検証」中村誠二, 杉野友啓, 梶本修身, 松原謙一, 的場亮、第33回日本分子生物学会(2010年、神戸)、http://www.dna-chip.co.jp/research/pdf/r4_MBSJ2010.pdf"Verification of the anti-fatigue effect of imidazole dipeptide from the viewpoint of peripheral blood gene expression profile" Seiji Nakamura, Tomohiro Sugino, Osamu Kajimoto, Kenichi Matsubara, Ryo Matoba, 33rd Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan (2010, Kobe), http: //www.dna-chip.co.jp/research/pdf/r4_MBSJ2010.pdf 厚生労働科学研究費補助金（障害者対策総合研究事業）分担研究報告書（平成21-23年度）、自律神経機能異常を伴い慢性的な疲労を訴える患者に対する客観的な疲労診断法の確立と慢性疲労診断指針の作成、「慢性疲労患者における唾液の生物学的評価」、近藤一博Welfare and Labor Science Research Grant (Comprehensive Research Project for Measures for Persons with Disabilities) Shared Research Report (2009-23), Establishment of an objective fatigue diagnosis method for patients who complain of chronic fatigue with autonomic dysfunction Preparation of Chronic Fatigue Diagnostic Guidelines, "Biological Evaluation of Saliva in Chronic Fatigue Patients", Kazuhiro Kondo 厚生労働科学研究費補助金（障害者対策総合研究事業）分担研究報告書（平成25年度）、慢性疲労症候群の病因病態の解明と画期的診断・治療法の開発、「唾液中HHV-6、HHV-7による慢性疲労症候群と労働による疲労の鑑別」、近藤一博Health and Labor Sciences Research Grant (Comprehensive Research Project for Measures for Persons with Disabilities) Shared Research Report (2013), Elucidation of the etiology and pathophysiology of chronic fatigue syndrome, development of epoch-making diagnosis and treatment, "HHV-6 in saliva" , HHV-7 Chronic Fatigue Syndrome and Labor Fatigue ", Kazuhiro Kondo 「Identification of Novel HHV-6 Latent Protein associated with Mood Disorders and Molecular Mechanism of Fatigue due to Overwork」、Kazuhiro Kondo et al.、国際疲労学会（International Conference on Fatigue Science 2008）抄録 S2-03"Identification of Novel HHV-6 Latent Protein associated with Mood Disorders and Molecular Mechanism of Fatigue due to Overwork", Kazuhiro Kondo et al., Abstract of the International Conference on Fatigue Science 2008 S2-03 「Identification of a novel molecular mechanism and a major cause of fatigue」、Kazuhiro Kondo、第36回国際生理学会世界大会（The 36th Congress of the International Union of Physiological Sciences 2009）抄録 RS LB-52-1"Identification of a novel molecular mechanism and a major cause of fatigue", Kazuhiro Kondo, Abstract of The 36th Congress of the International Union of Physiological Sciences 2009 RS LB-52-1 「新しい疲労のみかた」、近藤一博、小林伸行、岡直美、第68回日本体力医学会（2013年）抄録 特別講演2"New Fatigue", Kazuhiro Kondo, Nobuyuki Kobayashi, Naomi Oka, 68th Japanese Society of Physical Fitness and Fitness (2013) Abstract Special Lecture 2 「疲労のバイオマーカー: 客観的な疲労の測定法」、近藤一博、Medical Technology誌 2013年 41(6) 583-584ページ"Biomarkers of Fatigue: An Objective Measurement of Fatigue", Kazuhiro Kondo, Medical Technology, 2013 41 (6) pp. 583-584 「心身相関の源流にある「疲労」を科学する」、近藤一博、心身医学 2014年 54巻9号828-833ページ"Science of" Fatigue "at the Source of Psychosomatic Correlation", Kazuhiro Kondo, Psychosomatic Medicine 2014 Vol. 54, No. 9, pp. 828-833

疲労の測定法は、一見客観的に見えても、実際には脳における疲労感の認識機構が介在していることが多く、生理的疲労を含むnonpathological fatigueにおける末梢臓器や末梢組織の疲労を直接測定することは困難であった。 Although the method of measuring fatigue seems to be objective, in many cases, the recognition mechanism of fatigue in the brain actually intervenes, and the fatigue of peripheral organs and tissues in nonpathological fatigue including physiological fatigue is directly measured. It was difficult to measure.

nonpathological fatigueの原因は主として末梢組織にあり、pathological fatigueの原因は脳にあるため、その予防法や治療法に大きな違いがあると考えられる。このため、客観的疲労測定法は、これらの疲労を簡便に判別できるべきである。 Since the cause of nonpathological fatigue is mainly in peripheral tissues and the cause of pathological fatigue is in the brain, it is considered that there is a big difference in the preventive and therapeutic methods. Therefore, the objective fatigue measurement method should be able to easily discriminate these fatigues.

また、唾液中ヒトヘルペスウイルスによる疲労測定法は、疲労を客観的に測定できる数少ない方法の一つであるが、測定には1週間以上の疲労の蓄積を待つ必要があった。抗疲労物質や抗疲労法の効率的なスクリーニングには、短時間の疲労負荷における疲労測定が可能であることが要求される。 In addition, the method of measuring fatigue by human herpesvirus in saliva is one of the few methods that can objectively measure fatigue, but it was necessary to wait for the accumulation of fatigue for one week or more for the measurement. Efficient screening of anti-fatigue substances and anti-fatigue methods requires the ability to measure fatigue under a short-term fatigue load.

さらに、唾液中ヒトヘルペスウイルスによる疲労測定法は、ヒトにおいてのみ測定が可能であった。抗疲労物質や抗疲労法の効率的なスクリーニングには、実験動物においても使用可能な客観的疲労測定法が必要である。 Furthermore, the method for measuring fatigue caused by human herpesvirus in saliva could be measured only in humans. Efficient screening of anti-fatigue substances and anti-fatigue methods requires an objective fatigue measurement method that can also be used in experimental animals.

抗疲労物質や抗疲労法を開発するためには、疲労の動物モデルが必要であり、様々な負荷を与えることで動物を疲労させることが行われている。しかし、実験動物はヒトと異なり、自分の状態を訴えることができないため、与えた負荷によって疲労以外の現象が生じているかどうかは判別できない。そこで、疲労物質や疲労シグナル伝達、または抗疲労効果に関係する物質やシグナル伝達を動物に導入することで、純粋に疲労に関係する現象のみを生じさせる疲労モデル動物が必要である。 In order to develop anti-fatigue substances and anti-fatigue methods, animal models of fatigue are needed, and animals are fatigued by applying various loads. However, unlike humans, experimental animals cannot complain about their own condition, so it is not possible to determine whether or not a phenomenon other than fatigue is caused by the applied load. Therefore, there is a need for fatigue model animals that produce only phenomena that are purely related to fatigue by introducing fatigue substances and fatigue signal transduction, or substances and signal transductions related to anti-fatigue effects into animals.

本発明者らは、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、疲労という現象（nonpathological fatigueまたは生理的疲労）の本態の重要な部分が以下の現象、すなわち、（１）臓器を構成する細胞のタンパク質合成機構をになう真核生物翻訳開始因子2α(eukaryotic initiation factor-2 alpha subunit: eIF-2α)のリン酸化、（２）eIF-2αのリン酸化によって生じる臓器細胞や血液細胞におけるeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子（eIF-2αリン酸化シグナルを伝達する因子）の増加、特にactivating transcription factor (ATF)4、ATF3、C/EBP-homologous protein (CHOP)の増加、（３）ATF3およびCHOPを介したTNF-αなどの炎症性サイトカインの増加とこれらの炎症性サイトカインの増加によって生じる脳での疲労感の認識、によって構成されることを独自に見出し、これらを評価する実験系を利用して日常生活における疲労度を測定することができる本発明を完成させるに至った。 As a result of diligent studies in view of the above problems, the present inventors have found that an important part of the true nature of the phenomenon of fatigue (nonpathological fatigue or physiological fatigue) is the following phenomenon, that is, (1) proteins of cells constituting organs. Phosphorylation of eukaryotic initiation factor-2 alpha cytokine (eIF-2α), which forms a synthetic mechanism, (2) eIF-2α in organ cells and blood cells caused by phosphorylation of eIF-2α Increased phosphorylation signaling factors (factors that transmit eIF-2α phosphorylation signals), especially activating transcription factor (ATF) 4, ATF3, increased C / EBP-homologous protein (CHOP), (3) ATF3 and CHOP We independently found that it was composed of an increase in inflammatory cytokines such as TNF-α and recognition of fatigue in the brain caused by the increase in these inflammatory cytokines, and used an experimental system to evaluate these. We have completed the present invention that can measure the degree of fatigue in daily life.

eIF-2αのリン酸化は、タンパク合成が抑制される現象であり、ATF3は通常、炎症性サイトカインの産生を抑制する機能が有名である。このため、炎症性サイトカインの産生増加を特徴とする疲労現象と、eIF-2αリン酸化やATF3産生が関係するシグナル伝達経路とを結びつけて考えることは難しかった。 Phosphorylation of eIF-2α is a phenomenon in which protein synthesis is suppressed, and ATF3 is usually famous for its function of suppressing the production of inflammatory cytokines. For this reason, it was difficult to link the fatigue phenomenon, which is characterized by increased production of inflammatory cytokines, with the signal transduction pathways involved in eIF-2α phosphorylation and ATF3 production.

さらに本発明者らは、疲労の際には、eIF-2αのリン酸化やこれに伴うシグナル伝達を抑制する因子(eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子)、特にgrowth arrest and DNA damage-inducible protein 34 (GADD34)、non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein (Nck)1、Nck2、constitutive repressor of eIF-2α phosphorylation (CReP)、zinc finger protein 36 homolog (ZFP36)、glucocorticoid-induced leucine zipper (GILZ)などの産生が亢進することを見出した。
これらのeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子は、疲労によるeIF-2αのリン酸化に伴って誘導されることから、eIF-2αのリン酸化シグナル抑制因子の増加は、現時点よりも少し過去に疲労の増加が生じていたことを示す。また、eIF-2αのリン酸化シグナル抑制因子は、疲労の本態であるeIF-2αのリン酸化またはeIF-2αリン酸化によって誘導される疲労のシグナル伝達を抑制することで、疲労を回復または抑制する作用を持つ。このため、eIF-2αのリン酸化シグナル抑制因子が強く誘導されることは、疲労回復力が強いことを意味する。したがって、eIF-2αのリン酸化シグナル抑制因子の量を指標として被験対象生物の抗疲労力（疲労回復力）を評価することもでき、そのような方法も本発明に含まれる。かかる抗疲労力評価方法は、好適には、eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量が、eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量から予測される量よりも有意に多ければ、被験対象生物の抗疲労力が高いと評価することを特徴とする。換言すれば、本発明の抗疲労力評価方法は、eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量に対するeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量の割合が所定の基準値より高い場合に、被験対象生物の抗疲労力が高いと評価することを特徴とする。上記基準値は、具体的なeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子とeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の組合せごとに予め設定された基準値であってもよく、例えば、抗疲労物質候補を摂取する前または抗疲労法候補を実施する前の、当該eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量に対するeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量の割合を基準値とすることができる。一方、抗疲労物質候補を摂取した後または抗疲労法候補を実施した後の、当該eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量に対するeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量の割合が抗疲労物質候補の摂取前または抗疲労法候補前の値よりも高い値を示す被験対象生物は、抗疲労物質候補または抗疲労法候補によって抗疲労力が高くなったと評価することができる。
なお、本明細書において、「疲労の回復」とは「疲労負荷によって生じる疲労のシグナル伝達およびその効果を、疲労負荷が無くなってから減少させる働き」を意味し、「疲労負荷によって生じる疲労のシグナル伝達およびその効果を、疲労負荷がある時点で減少させる働き」については「疲労の抑制」と表現する。また、「疲労の発生を防止したり、疲労を回復させる力や疲労を抑制する力を高めることで、疲労の影響を軽減すること」を「疲労の予防」と称し、疲労の回復、抑制、および予防の総称として「抗疲労」と表現する。なお、疲労を回復させる力と疲労を抑制する力を合わせて疲労回復力と表現する場合がある。本発明のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子は、疲労負荷時に作用すれば疲労を抑制し、疲労負荷終了後に作用すれば疲労を回復する。また、この因子の作用を上昇させることは疲労の予防につながる。 Furthermore, the present inventors, in the event of fatigue, a factor that suppresses the phosphorylation of eIF-2α and the signal transduction associated therewith (eIF-2α phosphorylation signal transduction factor), particularly growth arrest and DNA damage-inducible protein 34. (GADD34), non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein (Nck) 1, Nck2, constitutive repressor of eIF-2α phosphorylation (CReP), zinc finger protein 36 homolog (ZFP36), glucocorticoid-induced leucine zipper (GILZ), etc. It was found that production was enhanced.
Since these eIF-2α phosphorylation signal suppressors are induced by the phosphorylation of eIF-2α due to fatigue, the increase in the phosphorylation signal suppressor of eIF-2α is a little earlier than the present time. Indicates that an increase was occurring. In addition, the phosphorylation signal inhibitor of eIF-2α recovers or suppresses fatigue by suppressing the signal transduction of fatigue induced by phosphorylation of eIF-2α or eIF-2α phosphorylation, which is the main cause of fatigue. Has an effect. Therefore, the strong induction of the phosphorylation signal inhibitor of eIF-2α means that the fatigue recovery ability is strong. Therefore, the anti-fatigue (fatigue recovery) of the test subject organism can be evaluated using the amount of the phosphorylation signal inhibitor of eIF-2α as an index, and such a method is also included in the present invention. Such an anti-fatigue assessment method preferably comprises a subject organism if the amount of eIF-2α phosphorylation signaling inhibitor is significantly higher than the amount predicted from the amount of eIF-2α phosphorylation signaling factor. It is characterized by being evaluated as having high anti-fatigue power. In other words, the anti-fatigue force evaluation method of the present invention is a test subject organism when the ratio of the amount of eIF-2α phosphorylation signal transduction factor to the amount of eIF-2α phosphorylation signal transduction factor is higher than a predetermined reference value. It is characterized by being evaluated as having high anti-fatigue power. The above reference value may be a reference value preset for each specific combination of eIF-2α phosphorylation signal transduction factor and eIF-2α phosphorylation signal inhibitor, and for example, an anti-fatigue substance candidate is ingested. The ratio of the amount of the eIF-2α phosphorylation signal transduction factor to the amount of the eIF-2α phosphorylation signal transduction factor before or before the anti-fatigue method candidate can be used as a reference value can be used as a reference value. On the other hand, the ratio of the amount of the eIF-2α phosphorylation signal inhibitor to the amount of the eIF-2α phosphorylation signal transduction factor after ingesting the anti-fatigue substance candidate or after performing the anti-fatigue method candidate is the anti-fatigue substance candidate. It can be evaluated that the test subject organism showing a value higher than the value before ingestion or the value before the anti-fatigue method candidate has increased anti-fatigue power by the anti-fatigue substance candidate or the anti-fatigue method candidate.
In addition, in this specification, "recovery of fatigue" means "the function of reducing the signal transmission of fatigue caused by fatigue load and its effect after the fatigue load disappears", and "the signal of fatigue caused by fatigue load". "The function of reducing the fatigue load at a certain point in time" is expressed as "suppression of fatigue". In addition, "reducing the effects of fatigue by preventing the occurrence of fatigue, increasing the ability to recover from fatigue and suppressing fatigue" is called "prevention of fatigue", and recovery and suppression of fatigue, And it is expressed as "anti-fatigue" as a general term for prevention. In addition, the power to recover from fatigue and the power to suppress fatigue may be collectively referred to as fatigue recovery power. The eIF-2α phosphorylation signal inhibitor of the present invention suppresses fatigue if it acts during fatigue loading, and recovers fatigue if it acts after fatigue loading. In addition, increasing the action of this factor leads to prevention of fatigue.

eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子のうち、GADD34およびCRePは、eIF-2αのリン酸化を解除する（リン酸化されたeIF-2αの脱リン酸化を促進する）機構により抗疲労効果を発揮し、Nck1およびNck2は、PKR等によるeIF-2αのリン酸化を抑制する機構により抗疲労効果を発揮する。これらの因子の抗疲労効果は、本発明者らが本発明における疲労のメカニズムと疲労シグナル伝達経路を明らかにするまで知られていなかった。
また、eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子のうち、ZFP36、GILZも同様に、疲労の回復・抑制に関与する。これらのうちZFP36は、別名Tristetraprolinとも呼ばれ、ARE（AU-rich element）に結合するタンパク質であり、ARE-RNAの不安定化を促進する。ZFP36は、この機能によってTNFαのmRNAを不安定化させその産生を低下させる細胞内蛋白である。また、GILZは、別名TSC22D3とも呼ばれ、グルココルチコイドより誘導されるロイシンジッパー含有タンパクである。GILZは転写因子AP-1とNF-kappaBのDNA結合を阻害することで、これらの転写因子が関与するシグナル伝達を妨害し、マクロファージや樹状細胞の抗炎症シグナルを抑制することが知られている。両者は免疫現象に影響を与えることで抗疲労効果を発揮する（免疫機構を抑制して抗疲労効果を発揮する）が、この様な疲労との関係は本発明者らが本発明における疲労シグナル伝達経路を発見するまで明らかではなかった。 Among the eIF-2α phosphorylation signal suppressors, GADD34 and CReP exert an anti-fatigue effect by a mechanism that releases phosphorylation of eIF-2α (promotes dephosphorylation of phosphorylated eIF-2α). Nck1 and Nck2 exert an anti-fatigue effect by a mechanism that suppresses phosphorylation of eIF-2α by PKR and the like. The anti-fatigue effect of these factors was unknown until the present inventors clarified the mechanism of fatigue and the pathway of fatigue signal transduction in the present invention.
Of the eIF-2α phosphorylation signal suppressors, ZFP36 and GILZ are also involved in the recovery and suppression of fatigue. Of these, ZFP36, also known as Tristetraprolin, is a protein that binds to ARE (AU-rich element) and promotes destabilization of ARE-RNA. ZFP36 is an intracellular protein that destabilizes TNFα mRNA by this function and reduces its production. GILZ, also known as TSC22D3, is a leucine zipper-containing protein derived from glucocorticoids. GILZ is known to inhibit the DNA binding of transcription factors AP-1 and NF-kappaB, thereby interfering with signal transduction involving these transcription factors and suppressing anti-inflammatory signals in macrophages and dendritic cells. There is. Both exert an anti-fatigue effect by affecting the immune phenomenon (suppresses the immune mechanism and exerts an anti-fatigue effect), but the relationship with such fatigue is the fatigue signal in the present invention by the present inventors. It was not clear until the discovery of the transmission route.

本発明者らが検討した結果、動物にATF3を導入することによって疲労を発生させることができた。また、逆に干渉RNAを用いて動物のATF3産生を抑制することによって、疲労を減弱させることができた。このことは、ATF3が疲労の発生を司る因子であることを示している。また、ATF3に代表されるeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の導入によって筋肉の運動や、臓器の負担などの影響なしに、純粋に疲労が生体機能、特に脳機能に与える影響を検討可能な動物モデルが確立できたことを示している。さらに、ATF3に代表されるeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子を抑制することで、疲労を減弱できることも示している。このように、ATF3に代表されるeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子は、「疲労の発生に関係する因子」として作用し得る。 As a result of the study by the present inventors, it was possible to cause fatigue by introducing ATF3 into animals. On the contrary, by suppressing the production of ATF3 in animals using interfering RNA, fatigue could be reduced. This indicates that ATF3 is a factor that controls the occurrence of fatigue. In addition, by introducing eIF-2α phosphorylation signal transduction factor represented by ATF3, it is possible to examine the effect of pure fatigue on biological function, especially brain function, without the influence of muscle movement and organ burden. It shows that the model has been established. Furthermore, it has been shown that fatigue can be attenuated by suppressing the eIF-2α phosphorylation signaling factor represented by ATF3. Thus, the eIF-2α phosphorylation signaling factor represented by ATF3 can act as a “factor involved in the development of fatigue”.

また本発明者らは、疲労の発生に関係する因子であるeIF-2αのリン酸化シグナルを、薬剤によって阻害することによって抗疲労効果が得られることを見いだした。
eIF2のαのリン酸化は、integrated stress response(ISR)と呼ばれるストレス応答に関係する因子でもある。ストレス応答に関係するシグナル伝達経路や因子は、熱ショックタンパク、視床下部-下垂体-副腎-軸(HPA axis)、カテコラミン、酸化ストレス、エピジェネティックな応答、細胞膜の変化、脂質の変化、等々、非常に多くの種類が知られている。このため、疲労とストレスが関係することは知られているものの、何れのストレス応答が疲労との関係を持つかは、本発明者らが発見するまで知られていなかった。また、確実な証拠が得られていたわけではないが、多くの研究グループは、疲労と関係するストレス応答として、酸化ストレスやHPA axisを有力視していた。これらの理由から、ISRと疲労との関係は注目されなかった。また、ISRに関しては、免疫疾患、精神疾患、認知証、ガンなどの重要な疾患との関係が注目され、疲労、特に本発明の対象である生理的な疲労との関係を考察する上での阻害要因となっていた。 The present inventors have also found that an anti-fatigue effect can be obtained by inhibiting the phosphorylation signal of eIF-2α, which is a factor involved in the occurrence of fatigue, with a drug.
Phosphorylation of α in eIF2 is also a factor involved in stress response called integrated stress response (ISR). Signal transduction pathways and factors involved in stress response include hypothalamic-pituitary-adrenal-axis (HPA axis), catecholamine, oxidative stress, epigenetic response, cell membrane changes, lipid changes, etc. So many types are known. Therefore, although it is known that fatigue is related to stress, it was not known until the present inventors discovered which stress response was related to fatigue. Also, although no convincing evidence was obtained, many research groups viewed oxidative stress and the HPA axis as predominant stress responses associated with fatigue. For these reasons, the relationship between ISR and fatigue was not noted. In addition, regarding ISR, attention has been paid to the relationship with important diseases such as immune disease, psychiatric disorder, recognition certificate, and cancer, and in considering the relationship with fatigue, especially physiological fatigue, which is the subject of the present invention. It was an obstacle.

また、本発明者らは、eIF-2αの脱リン酸化を阻害する薬剤であるsalubrinalによって疲労の増強や疲労回復の遅延が生じることを見いだした。このことは、eIF-2αのリン酸化やeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子が疲労の発生に関係することや、eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子が疲労の回復や抑制に関与することを改めて証明する証拠であると考えられる。さらに、eIF-2αの脱リン酸化を阻害する薬剤が疲労の増強や疲労回復の遅延を生じさせるという事実は、逆にeIF-2αの脱リン酸化を促進する物質が抗疲労効果を持つことを示す。さらに、eIF-2αの脱リン酸化を促進する効果をもって、抗疲労法や抗疲労物質の候補の効果判定が可能になることも示している。 In addition, the present inventors have found that salubrinal, a drug that inhibits dephosphorylation of eIF-2α, enhances fatigue and delays recovery from fatigue. This reiterates that eIF-2α phosphorylation and eIF-2α phosphorylation signal transduction factors are involved in the development of fatigue, and that eIF-2α phosphorylation signal suppressors are involved in recovery and suppression of fatigue. It is considered to be evidence of doing so. Furthermore, the fact that drugs that inhibit eIF-2α dephosphorylation cause increased fatigue and delayed recovery from fatigue, conversely, the fact that substances that promote eIF-2α dephosphorylation have anti-fatigue effects. show. Furthermore, it has been shown that the effect of promoting dephosphorylation of eIF-2α makes it possible to determine the effects of anti-fatigue methods and anti-fatigue substance candidates.

また本発明者らは、通常の疲労におけるeIF-2αのリン酸化を誘導する因子(eIF-2αリン酸化誘導因子)が、主として、干渉RNAを構成するsmall interfering RNA(siRNA)やmicroRNA（miRNA）といった細胞機能調節に関わるRNA分子であり、これらがprotein kinase RNA-activated (PKR)を介してeIF-2αリン酸化を生じさせることを見出した。また、siRNAやmiRNAに関わる遺伝子(干渉RNA関連因子)、特にDiGeorge Syndrome Critical Region Gene 8 (Dgcr8)、Droshaといった因子も疲労によって増加することを見出した。
また、eIF-2αのリン酸化の原因として、小胞体ストレスも疲労の際のeIF-2αリン酸化誘導因子となり得ることを見出し、小胞体ストレスに関連する因子、特にglucose-regulated protein 78kDa (GRP78)やX-box binding protein 1 (XBP-1)といった因子も疲労によって増加することを見出した。本明細書では、干渉RNAに関連したeIF-2αリン酸化誘導因子と、eIF-2αリン酸化を誘導する小胞体ストレスなどの他のストレスに関係する因子とを、まとめてeIF-2αリン酸化誘導関連因子と呼ぶ。eIF-2αリン酸化誘導関連因子は、eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子を活性化することで疲労の発生に関係し、干渉RNA関連因子は、eIF-2αリン酸化誘導関連因子を間接的に測定するための指標となる。すなわち、eIF-2αリン酸化誘導関連因子および干渉RNA関連因子は、ATF3に代表されるeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子と同様に「疲労の発生に関係する因子」として作用し得る。 In addition, the present inventors mainly consider the factors that induce phosphorylation of eIF-2α in normal fatigue (eIF-2α phosphorylation-inducing factor), such as small interfering RNA (siRNA) and microRNA (miRNA) that constitute interfering RNA. It was found that these are RNA molecules involved in the regulation of cell functions, and these cause eIF-2α phosphorylation via protein kinase RNA-activated (PKR). We also found that genes related to siRNA and miRNA (interfering RNA-related factors), especially factors such as DiGeorge Syndrome Critical Region Gene 8 (Dgcr8) and Drosha, also increase with fatigue.
We also found that endoplasmic reticulum stress can also be an eIF-2α phosphorylation-inducing factor during fatigue as a cause of eIF-2α phosphorylation, and factors related to endoplasmic reticulum stress, especially glucose-regulated protein 78kDa (GRP78). We also found that factors such as and X-box binding protein 1 (XBP-1) also increase with fatigue. In the present specification, eIF-2α phosphorylation-inducing factors associated with interfering RNA and other stress-related factors such as endoplasmic reticulum stress that induces eIF-2α phosphorylation are collectively referred to as eIF-2α phosphorylation induction. Called a related factor. eIF-2α phosphorylation induction-related factors are involved in the development of fatigue by activating eIF-2α phosphorylation signaling factors, and interfering RNA-related factors indirectly measure eIF-2α phosphorylation induction-related factors. It becomes an index to do. That is, the eIF-2α phosphorylation induction-related factor and the interfering RNA-related factor can act as “factors related to the occurrence of fatigue” in the same manner as the eIF-2α phosphorylation signal transduction factor represented by ATF3.

疲労の際に観察される干渉RNAの増加やprotein kinase RNA-activated (PKR)の活性化は、インフルエンザなどの遺伝子にRNAを持つウイルスの感染時や、Poly(I:C)投与による疑似感染モデルなどに生じる二重鎖RNAに対する反応にも共通している。しかし、ウイルス感染の症状は発熱、数日間続く倦怠感、食欲低下が主要なものであり、生理的疲労の性質である、発熱がない、休息によって速やかに疲労感が改善する、食欲はむしろ上昇するなどといった特徴とは非常に異なったものとなっている。またCFSの原因はウイルス感染によると考えられているため、感染モデルによる疲労は、CFSの疲労に近いと考えられている。CFSの疲労と生理的疲労とは異なる機序によって生じると考えられるため、上記の情報は、細胞内に存在するRNAと生理的疲労とを結びつける障害となりうるものであった。
実際には、干渉RNAの増加が疲労の原因となっているものの、これに続いて、eIF-2αのリン酸化によるタンパク合成阻害および過剰なサイトカイン産生を阻害する因子であるATF3の増加、eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の増加といった、発明者が今回初めて疲労との関係を明らかにした現象によって、発熱を伴わない、易回復性であるなどの生理的疲労の特徴が説明される。しかし、これは発明者の今回の発明があって初めて説明が可能な現象であり、既知の情報からはRNAと生理的疲労とを結びつけることは困難である。 The increase in interfering RNA and activation of protein kinase RNA-activated (PKR) observed during fatigue are a pseudo-infection model during infection with a virus that has RNA in a gene such as influenza, or by administration of Poly (I: C). It is also common to the reaction to double-stranded RNA that occurs in such cases. However, the main symptoms of viral infection are fever, fatigue that lasts for several days, and loss of appetite, which are the nature of physiological fatigue, no fever, a rapid improvement in fatigue by rest, and an increase in appetite. It is very different from the characteristics such as doing. In addition, since the cause of CFS is thought to be viral infection, fatigue from the infection model is thought to be close to that of CFS. The above information could be an obstacle linking intracellular RNA to physiological fatigue, as it is thought to be caused by a different mechanism of CFS fatigue and physiological fatigue.
In fact, an increase in interfering RNA causes fatigue, followed by an increase in ATF3, a factor that inhibits the inhibition of protein synthesis and excessive cytokine production by phosphorylation of eIF-2α, eIF-. The phenomenon that the inventor clarified the relationship with fatigue for the first time, such as an increase in 2α phosphorylation signal inhibitor, explains the characteristics of physiological fatigue such as no fever and easy recovery. However, this is a phenomenon that can be explained only with the present invention of the inventor, and it is difficult to link RNA and physiological fatigue from known information.

すなわち、本発明にかかる疲労度評価方法は、上記の課題を解決するために、臓器中または血液の細胞中における、リン酸化されたeIF-2αおよびeIF-2αのリン酸化によって誘導されるシグナル分子（eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子）、eIF-2αのリン酸化やこれに伴うシグナル伝達を抑制する因子（eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子）、eIF-2αのリン酸化を誘導する因子および当該誘導に関連する因子（eIF-2αリン酸化誘導関連因子）、ならびに干渉RNAの調節に関わる分子（干渉RNA関連因子）からなる群より選択される少なくとも1種の上記の因子の量を指標として疲労度を評価することを特徴とする。また、eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子は、疲労のバイオマーカーとして利用可能であると同時に、これらの因子の誘導能の多寡が疲労回復力の強弱と関係する。上記の方法では簡便かつ客観的にヒトおよび実験動物の疲労度および疲労回復力を評価でき、疲労回復又は抑制効果を持つ医薬品をはじめ、栄養ドリンクや健康食品といった栄養補助食品などの抗疲労物質や抗疲労法の効果効能を定量的に求めることも可能である。さらに、短時間の疲労負荷などで引き起こされる即時的な疲労を簡便、客観的かつ高感度に定量することも可能である。 That is, the method for evaluating the degree of fatigue according to the present invention is a signal molecule induced by phosphorylation of phosphorylated eIF-2α and eIF-2α in an organ or in blood cells in order to solve the above-mentioned problems. (EIF-2α phosphorylation signal transduction factor), factors that suppress eIF-2α phosphorylation and associated signal transduction (eIF-2α phosphorylation signal transduction factor), factors that induce eIF-2α phosphorylation, and the relevant factors. Fatigue using the amount of at least one of the above factors selected from the group consisting of factors related to induction (eIF-2α phosphorylation induction-related factors) and molecules involved in the regulation of interfering RNA (interfering RNA-related factors) as an index. It is characterized by evaluating the degree. In addition, the eIF-2α phosphorylation signal inhibitor can be used as a biomarker for fatigue, and at the same time, the amount of inducing ability of these factors is related to the strength of fatigue recovery. With the above method, the degree of fatigue and fatigue recovery ability of humans and experimental animals can be evaluated easily and objectively, and anti-fatigue substances such as nutritional supplements such as nutritional drinks and health foods, as well as pharmaceuticals having a fatigue recovery or suppression effect, and It is also possible to quantitatively determine the efficacy and efficacy of the anti-fatigue method. Furthermore, it is also possible to easily, objectively and highly sensitively quantify the immediate fatigue caused by a short-term fatigue load.

本発明で同定した疲労のシグナル伝達経路に基づく疲労測定法は、生理的疲労を含むnonpathological fatigue、すなわち末梢に原因のある疲労を測定する方法であるため、対象者において問題となっている疲労現象の原因が、末梢にあるか脳や精神的なものにあるかを事前に判別しておくことによって、疲労測定の効率や精度が高くなると考えられる。
本発明者らは、以前に発明者が発明した唾液中ヒトヘルペスウイルス7(HHV-7)を利用した疲労測定法「疲労度評価方法およびその利用」(登録番号 特許第4812708号)による測定で、疲労していないと判定されたヒトでは、疲労感として認識される自覚症状の強さ、すなわち疲労感のVisual Analog Scale(VAS) が、うつ症状の強さと強く相関することを見出した。一方、この検査によって、疲労していると判別されたヒトでは、疲労感とうつ症状との間に相関関係はなかった。このことにより、疲労のVASと唾液中ヒトヘルペスウイルス7(HHV-7)の組合せによる、うつ状態の簡易診断法という新たな診断法が見出された。 The fatigue measurement method based on the fatigue signal transduction pathway identified in the present invention is a method for measuring nonpathological fatigue including physiological fatigue, that is, fatigue caused in the periphery, and thus is a fatigue phenomenon that has become a problem for subjects. It is considered that the efficiency and accuracy of fatigue measurement can be improved by determining in advance whether the cause of this is peripheral or brain or mental.
The present inventors have measured by the fatigue measurement method "fatigue degree evaluation method and its use" (registration number Patent No. 4812708) using human herpesvirus 7 (HHV-7) in saliva previously invented by the inventor. We found that in humans judged not to be tired, the intensity of subjective symptoms perceived as fatigue, that is, the Visual Analog Scale (VAS) of fatigue, strongly correlates with the intensity of depressive symptoms. On the other hand, in humans determined to be tired by this test, there was no correlation between fatigue and depressive symptoms. As a result, a new diagnostic method called a simple diagnostic method for depressed state was found by combining VAS of fatigue and human herpesvirus 7 (HHV-7) in saliva.

本発明にかかる疲労評価キットは、上記の課題を解決するために、上述の疲労度評価方法を実施するためのものであることを特徴としている。 The fatigue evaluation kit according to the present invention is characterized in that it is for carrying out the above-mentioned fatigue degree evaluation method in order to solve the above-mentioned problems.

本発明にかかる抗疲労物質および疲労回復法の効果の測定方法は、上記の課題を解決するために、上述の疲労度評価方法および疲労度評価キットのいずれかを用いて、動物およびヒトにおいて抗疲労物質および疲労回復法の抗疲労力を測定することを特徴としている。 The method for measuring the effect of the anti-fatigue substance and the fatigue recovery method according to the present invention is anti-fatigue in animals and humans by using any of the above-mentioned fatigue degree evaluation method and fatigue degree evaluation kit in order to solve the above-mentioned problems. It is characterized by measuring the anti-fatigue power of fatigue substances and fatigue recovery methods.

すなわち、上記の課題を解決するために、より具体的には下記の発明が提供される。
〔１〕細胞中の真核生物翻訳開始因子2α(eIF-2α)リン酸化関連因子の量を指標として、被験対象生物の疲労度を評価することを特徴とする、疲労度評価方法。
〔２〕上記eIF-2αリン酸化関連因子の量が多ければ、疲労度が高いと評価することを特徴とする、〔１〕に記載の疲労度評価方法。
〔３〕上記eIF-2αリン酸化関連因子の量を、eIF-2αリン酸化関連因子のmRNA発現量またはタンパク産生量として測定する、〔２〕に記載の疲労度評価方法。
〔４〕上記eIF-2αリン酸化関連因子の量が多ければ、被験対象生物にnonpathological fatigueが生じていると評価することを特徴とする、〔１〕ないし〔３〕のいずれかに記載の疲労度評価方法。
〔５〕上記eIF-2αリン酸化関連因子が、eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子、eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子、eIF-2αリン酸化誘導関連因子および干渉RNA関連因子からなる群より選択される、〔１〕ないし〔４〕のいずれかに記載の疲労度評価方法。
〔６〕上記eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子が、リン酸化されたeIF-2α、activating transcription factor (ATF)3、ATF4、およびC/EBP-homologous protein (CHOP) からなる群から選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする、〔５〕に記載の疲労度評価方法。
〔７〕上記eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子が、growth arrest and DNA damage-inducible protein 34 (GADD34)、non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein (Nck)1、Nck2、constitutive repressor of eIF-2α phosphorylation (CReP)、zinc finger protein 36 homolog (ZFP36)、およびglucocorticoid-induced leucine zipper (GILZ)からなる群から選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする、〔５〕に記載の疲労度評価方法。
〔８〕上記eIF-2αリン酸化誘導関連因子が、干渉RNAを構成するSmall interfering RNA(siRNA)およびmicroRNA（miRNA）を含む細胞機能調節に関わるRNA分子、protein kinase RNA-activated (PKR)、ならびにglucose-regulated protein 78kDa (GRP78)およびX-box binding protein 1 (XBP-1)を含むeIF-2αのリン酸化を誘導する小胞体ストレスに関係する因子からなる群から選ばれる少なくとも一種であり、上記干渉RNA関連因子が、DiGeorge Syndrome Critical Region Gene 8 (Dgcr8)、およびDroshaからなる群から選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする、〔５〕に記載の疲労度評価方法。
〔９〕上記細胞が、血液、肝臓、心臓、筋肉、脳、皮膚および膵臓から選ばれる少なくとも一種類であることを特徴とする、〔１〕ないし〔８〕のいずれかに記載の疲労度評価方法。
〔１０〕上記〔1〕ないし〔９〕のいずれかに記載の疲労度評価方法を実施するための手段を含む、疲労度評価キット。
〔１１〕採取した細胞中のeIF-2αリン酸化関連因子の量を指標として被験対象生物の疲労度を評価するために前記キットを使用できることが表示されている、〔１０〕に記載のキット。
〔１２〕細胞中のeIF-2αリン酸化関連因子の量を指標として、被験対象生物の疲労がnonpathological fatigueであるかpathological fatigueであるかを評価することを特徴とする、疲労の質を評価する方法。
〔１３〕上記eIF-2αリン酸化関連因子が、eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子またはeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子である、〔１２〕に記載の疲労の質を評価する方法。
〔１４〕（i） 被験対象生物が抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をする前に当該被験対象生物の細胞から採取された細胞中のeIF-2αリン酸化関連因子の量を測定する、摂取前eIF-2αリン酸化関連因子量測定工程と、
（ii） 被験対象生物が抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をした後に当該被験対象生物から採取された細胞中のeIF-2αリン酸化関連因子の量を測定する、摂取後eIF-2αリン酸化関連因子量測定工程と、
（iii） （i）の摂取前eIF-2αリン酸化関連因子量測定工程、及び（ii）の摂取後eIF-2αリン酸化関連因子量測定工程によって得られた、当該抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施の前後におけるeIF-2αリン酸化関連因子量の変化の測定結果に基づき、当該抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施前後における細胞中のeIF-2αリン酸化関連因子量の変化を算出する、eIF-2αリン酸化関連因子量変化算出工程と、
（iv） （iii）のeIF-2αリン酸化関連因子量変化算出工程によって得られた当該抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施の前後における細胞中のeIF-2αリン酸化関連因子量の変化に基づき、当該抗疲労物質候補または抗疲労法候補の生体における抗疲労力を測定する、抗疲労力測定工程と
を含む、抗疲労物質候補または抗疲労法候補の抗疲労効果評価方法。
〔１５〕（i） 抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をした被験対象生物と、抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をしなかった被験対象生物から採取されたそれぞれの細胞中のeIF-2αリン酸化関連因子の量を測定するeIF-2αリン酸化関連因子量測定工程と、
（ii） （i）のeIF-2αリン酸化関連因子量測定工程によって得られた、当該抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施の有無によるeIF-2αリン酸化関連因子量の変化の測定結果に基づき、当該抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施の有無による細胞中のeIF-2αリン酸化関連因子量の変化を算出する、eIF-2αリン酸化関連因子量変化算出工程と、
（iii） （ii）のeIF-2αリン酸化関連因子量変化算出工程によって得られた当該抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施の有無による細胞中のeIF-2αリン酸化関連因子の量変化に基づき、当該抗疲労物質候補または抗疲労法候補の生体における抗疲労力を測定する抗疲労力測定工程と
を含む、抗疲労物質候補または抗疲労法候補の抗疲労効果評価方法。
〔１６〕上記〔１〕ないし〔９〕のいずれかに記載の疲労度評価方法および〔１０〕または〔１１〕のいずれかに記載の疲労度評価キットのいずれかを用いて、抗疲労物質候補または抗疲労法候補の抗疲労効果を測定することを特徴とする、〔１４〕または〔１５〕のいずれかに記載の抗疲労効果評価方法。
〔１７〕抗疲労物質または抗疲労法をスクリーニングするための、〔１４〕ないし〔１６〕のいずれかに記載の抗疲労効果評価方法。
〔１８〕細胞中の〔７〕に記載のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量を指標として、被験対象生物の抗疲労力を評価することを特徴とする抗疲労力評価方法。
〔１９〕上記eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量が、〔６〕に記載のeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量から予測される量よりも多ければ、抗疲労力が高いと評価することを特徴とする、〔１８〕に記載の抗疲労力評価方法。
〔２０〕上記eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量と上記eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量を、eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子のmRNA発現量またはタンパク産生量として測定する、〔１９〕に記載の抗疲労力評価方法。
〔２１〕（i） 被験対象生物が抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をする前に当該被験対象生物から採取された細胞中のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量を測定する、摂取前測定工程と、
（ii） 被験対象生物が抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をした後に当該被験対象生物から採取された細胞中のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量を測定する、摂取後測定工程と、
（iii） （i）の摂取前測定工程、及び（ii）の摂取後測定工程によって得られた、当該抗疲労物質候補の摂取または当該抗疲労法候補の実施前後におけるeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量の変化の測定結果に基づき、当該抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施前後における細胞中のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の変化を算出する、算出工程と、
（iv） （iii）の算出工程によって得られた当該抗疲労物質候補の摂取または当該抗疲労法候補の実施前後における細胞中のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量の変化に基づき、当該抗疲労物質候補または抗疲労法候補の生体における抗疲労力を測定する、抗疲労力測定工程と
を含む、抗疲労物質候補または抗疲労法候補の抗疲労効果評価方法。
〔２２〕（i） 被験対象生物が抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をした被験対象生物と、しなかった被験対象生物の細胞から採取されたそれぞれの細胞中のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量を測定する、測定工程と、
（ii） （i）の測定工程によって得られた、当該抗疲労物質候補の摂取または当該抗疲労法候補の実施の有無によるeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量の変化の測定結果に基づき、当該抗疲労物質候補の摂取または当該抗疲労法候補の有無による細胞中のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量の変化を算出する、算出工程と、
（iii） （ii）の算出工程によって得られた当該抗疲労物質候補の摂取または当該抗疲労法候補の実施の有無による細胞中のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量の変化に基づき、当該抗疲労物質候補の摂取または当該抗疲労法候補の生体における抗疲労力を測定する、抗疲労力測定工程と
を含む、抗疲労物質候補または抗疲労法候補の抗疲労効果評価方法。
〔２３〕〔６〕または〔８〕のいずれかに記載の遺伝子のうちの少なくとも一種またはその遺伝子産物を導入して疲労を生じさせることを特徴とする、疲労モデル動物。
〔２４〕eIF-2αリン酸化によって疲労を生じさせることを特徴とする、疲労モデル動物。
〔２５〕ATF3遺伝子またはその遺伝子産物を導入して疲労を生じさせることを特徴とする、疲労モデル動物。
〔２６〕〔７〕に記載の遺伝子のうちの少なくとも一種またはその遺伝子産物を導入して抗疲労能を付与することを特徴とする、抗疲労モデル動物。
〔２７〕eIF-2αリン酸化やこれに伴うシグナル伝達を抑制することによって抗疲労能を付与することを特徴とする、抗疲労モデル動物。
〔２８〕〔７〕に記載の遺伝子のうちの少なくとも一種の遺伝子産物の機能を阻害して抗疲労効果を抑制することを特徴とする、疲労モデル動物。
〔２９〕細胞中のeIF-2αリン酸化関連因子の量を指標として、被験者の疲労がnonpathological fatigueであるかpathological fatigueであるかを判定することを特徴とする、疲労の質を評価する方法。
〔３０〕上記被験者の自覚的疲労感が強いにも関わらず、上記被験者から採取した細胞中の〔６〕ないし〔８〕のいずれかに記載のeIF-2αリン酸化関連因子の量が通常に比して多くなければ、上記被験者の疲労がpathological fatigueであると判定することを特徴とする、〔２９〕に記載の疲労の質を評価する方法。
〔３１〕唾液中のヒトヘルペスウイルスの量を指標として、被験者の精神状態および/または自覚的疲労感の原因を評価することを特徴とする、被験者の精神状態および/または自覚的疲労感の原因を評価する方法。
〔３２〕上記被験者の自覚的疲労感に比して、上記被験者の唾液中のヒトヘルペスウイルス量が少なければ、上記被験者の自覚的疲労感がうつ症状によると評価することを特徴とする、〔３１〕に記載の方法。
〔３３〕上記被験者が健常な被験者であり、上記被験者が、上記被験者の唾液中のヒトヘルペスウイルス量による疲労測定によって疲労していないと判定されれば、上記被験者の疲労感はうつ症状によるものと判定されることを特徴とする、〔３１〕ないし〔３２〕に記載の方法。
〔３４〕上記被験者が健常な被験者であり、上記被験者が、上記被験者の唾液中のヒトヘルペスウイルス量による疲労測定によって疲労していないと判定されるにも関わらず、自覚的疲労感が強い場合に、上記被験者がうつ状態にあると判定されることを特徴とする、〔３１〕ないし〔３３〕のいずれかに記載の方法。
〔３５〕上記ヒトヘルペスウイルス量を、ヒトヘルペスウイルスDNA量またはヒトヘルペスウイルスタンパク量として測定する、〔３１〕ないし〔３４〕のいずれかに記載の方法。
〔３６〕上記ヒトヘルペスウイルスが、ヒトヘルペスウイルス6とヒトヘルペスウイルス7から選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする、〔３１〕ないし〔３５〕のいずれかに記載の方法。
〔３７〕eIF-2αリン酸化が関係するシグナル伝達経路の効果を抑制することによって抗疲労効果を発揮する、抗疲労物質または抗疲労法。
〔３８〕eIF-2αのリン酸化が関係するシグナル伝達経路の効果を抑制する効果の強さを指標として抗疲労効果の強さを評価することを特徴とする、抗疲労物質候補または抗疲労法候補の抗疲労効果評価方法。
〔３９〕eIF-2αの脱リン酸化を促進することによって抗疲労効果を発揮する、抗疲労物質または抗疲労法。
〔４０〕eIF-2αの脱リン酸化を促進する効果の強さを指標として抗疲労効果の強さを評価することを特徴とする、抗疲労物質候補または抗疲労法候補の抗疲労効果評価方法。
〔４１〕以下からなる群より選択される物質を有効成分として含有する、抗疲労剤（疲労回復剤、疲労抑制剤、または疲労予防剤）：
（i）〔６〕または〔８〕に記載の因子のうちの少なくとも一種の発現または機能を阻害する物質；
（ii）〔７〕に記載の因子のうちの少なくとも一種；および
（iii）〔７〕に記載の因子のうちの少なくとも一種の発現または機能を増強する物質。
〔４２〕以下からなる群より選択される物質を有効成分として含有する、抗疲労剤（疲労回復剤、疲労抑制剤、または疲労予防剤）：
（a）eIF-2αのリン酸化を阻害する物質（eIF-2αリン酸化阻害剤）；
（b）eIF-2αの脱リン酸化を促進する物質（eIF-2α脱リン酸化促進剤）；および
（c）eIF-2αのリン酸化によって誘導されるシグナル伝達経路の活性を抑制する物質（eIF-2αリン酸化シグナル阻害剤）。
〔４３〕上記疲労が、生理的疲労を含むnonpathological fatigueである、〔４１〕または〔４２〕に記載の抗疲労剤。
〔４４〕上記疲労が、末梢臓器または末梢組織に原因がある疲労である、〔４１〕または〔４２〕に記載の抗疲労剤。
〔４５〕上記疲労が、睡眠不足による精神疲労または肉体疲労である、〔４１〕または〔４２〕に記載の抗疲労剤。
〔４６〕以下からなる群より選択される工程を含む、疲労を軽減する（疲労を回復させるかまたは抑制する）方法：
（i）〔６〕または〔８〕に記載の因子のうちの少なくとも一種の発現または機能を阻害する効果を発揮する抗疲労物質を摂取するかまたは当該効果を発揮する抗疲労法を実施する工程；および
（ii）〔７〕に記載の因子のうちの少なくとも一種の発現または機能を増強する効果を発揮する抗疲労物質を摂取するかまたは当該効果を発揮する抗疲労法を実施する工程。
〔４７〕以下からなる群より選択される効果を発揮する抗疲労物質を摂取するかまたは当該効果を発揮する抗疲労法を実施する工程を含む、疲労を軽減する（疲労を回復させるかまたは抑制する）方法：
（a）eIF-2αのリン酸化を阻害する；
（b）eIF-2αの脱リン酸化を促進する；および
（c）eIF-2αのリン酸化によって誘導されるシグナル伝達経路の活性を抑制する。
〔４８〕上記疲労が、生理的疲労を含むnonpathological fatigueである、〔４６〕または〔４７〕に記載の方法。
〔４９〕上記疲労が、末梢臓器や末梢組織に原因がある疲労である、〔４６〕または〔４７〕に記載の方法。
〔５０〕上記疲労が、睡眠不足による精神疲労または肉体疲労である、〔４６〕または〔４７〕に記載の方法。
〔５１〕抗疲労剤（疲労回復剤または疲労抑制剤）の製造における、以下からなる群より選択される抗疲労物質の使用：
（i）〔６〕または〔８〕に記載の因子のうちの少なくとも一種の発現または機能を阻害する物質；
（ii）〔７〕に記載の因子のうちの少なくとも一種；および
（iii）〔７〕に記載の因子のうちの少なくとも一種の発現または機能を増強する物質。
〔５２〕抗疲労剤（疲労回復剤または疲労抑制剤）の製造における、以下からなる群より選択される抗疲労物質の使用：
（a）eIF-2αのリン酸化を阻害する物質（eIF-2αリン酸化阻害剤）；
（b）eIF-2αの脱リン酸化を促進する物質（eIF-2α脱リン酸化促進剤）；および
（c）eIF-2αのリン酸化によって誘導されるシグナル伝達経路の活性を抑制する物質（eIF-2αリン酸化シグナル阻害剤）。
〔５３〕疲労の軽減（疲労の回復または抑制）において用いるための、以下からなる群より選択される抗疲労物質：
（i）〔６〕または〔８〕に記載の因子のうちの少なくとも一種の発現または機能を阻害する物質；
（ii）〔７〕に記載の因子のうちの少なくとも一種；および
（iii）〔７〕に記載の因子のうちの少なくとも一種の発現または機能を増強する物質。
〔５４〕疲労の軽減（疲労の回復または抑制）において用いるための、以下からなる群より選択される抗疲労物質：
（a）eIF-2αのリン酸化を阻害する物質（eIF-2αリン酸化阻害剤）；
（b）eIF-2αの脱リン酸化を促進する物質（eIF-2α脱リン酸化促進剤）；および
（c）eIF-2αのリン酸化によって誘導されるシグナル伝達経路の活性を抑制する物質（eIF-2αリン酸化シグナル阻害剤）。
〔５５〕以下の工程のいずれかを含む、抗疲労物質（例えば抗疲労剤）または抗疲労法を実施するための抗疲労器具の製造方法：
（1）当該抗疲労物質または当該抗疲労法による、eIF-2αのリン酸化を阻害する効果の強さを評価する工程；
（2）当該抗疲労物質または当該抗疲労法による、eIF-2αの脱リン酸化を促進する効果の強さを評価する工程；
（3）当該抗疲労物質または当該抗疲労法による、eIF-2αのリン酸化が関係するシグナル伝達経路の効果を抑制する効果の強さを評価する工程；あるいは
（4）〔１４〕ないし〔１６〕または〔２１〕または〔２２〕のいずれかに記載の方法によって、当該抗疲労物質または当該抗疲労法の抗疲労効果を評価する工程。 That is, in order to solve the above problems, the following inventions are provided more specifically.
[1] A method for evaluating a degree of fatigue, which comprises evaluating the degree of fatigue of a test subject organism using the amount of eukaryotic initiation factor 2α (eIF-2α) phosphorylation-related factor in cells as an index.
[2] The fatigue level evaluation method according to [1], wherein if the amount of the above eIF-2α phosphorylation-related factor is large, the fatigue level is evaluated to be high.
[3] The fatigue degree evaluation method according to [2], wherein the amount of the eIF-2α phosphorylation-related factor is measured as the mRNA expression level or the protein production amount of the eIF-2α phosphorylation-related factor.
[4] The fatigue according to any one of [1] to [3], which is characterized by evaluating that nonpathological fatigue has occurred in the test subject organism if the amount of the above eIF-2α phosphorylation-related factor is large. Degree evaluation method.
[5] The above eIF-2α phosphorylation-related factor is selected from the group consisting of eIF-2α phosphorylation signal transduction factor, eIF-2α phosphorylation signal inhibitor, eIF-2α phosphorylation induction-related factor and interfering RNA-related factor. The fatigue degree evaluation method according to any one of [1] to [4].
[6] The above eIF-2α phosphorylation signaling factor is at least one selected from the group consisting of phosphorylated eIF-2α, activating transcription factor (ATF) 3, ATF4, and C / EBP-homologous protein (CHOP). The fatigue degree evaluation method according to [5], which is characterized by the above.
[7] The above eIF-2α phosphorylation signal inhibitor is growth arrest and DNA damage-inducible protein 34 (GADD34), non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein (Nck) 1, Nck2, constitutive repressor of eIF-2α phosphorylation. The fatigue degree evaluation method according to [5], wherein the method is at least one selected from the group consisting of (CReP), zinc finger protein 36 homolog (ZFP36), and glucocorticoid-induced leucine zipper (GILZ).
[8] The above eIF-2α phosphorylation induction-related factors are RNA molecules involved in cell function regulation including Small interfering RNA (siRNA) and microRNA (miRNA) constituting interfering RNA, protein kinase RNA-activated (PKR), and It is at least one selected from the group consisting of factors related to follicular stress that induces the phosphorylation of eIF-2α, including glucose-regulated protein 78kDa (GRP78) and X-box binding protein 1 (XBP-1). The fatigue degree evaluation method according to [5], wherein the interfering RNA-related factor is at least one selected from the group consisting of DiGeorge Syndrome Critical Region Gene 8 (Dgcr8) and Drosha.
[9] The fatigue degree evaluation according to any one of [1] to [8], wherein the cell is at least one type selected from blood, liver, heart, muscle, brain, skin and pancreas. Method.
[10] A fatigue degree evaluation kit comprising means for carrying out the fatigue degree evaluation method according to any one of the above [1] to [9].
[11] The kit according to [10], wherein it is indicated that the kit can be used to evaluate the degree of fatigue of the test subject organism using the amount of eIF-2α phosphorylation-related factor in the collected cells as an index.
[12] To evaluate the quality of fatigue, which is characterized by evaluating whether the fatigue of the test subject organism is nonpathological fatigue or pathological fatigue, using the amount of eIF-2α phosphorylation-related factors in cells as an index. Method.
[13] The method for evaluating the quality of fatigue according to [12], wherein the eIF-2α phosphorylation-related factor is an eIF-2α phosphorylation signal transduction factor or an eIF-2α phosphorylation signal inhibitor.
[14] (i) The amount of eIF-2α phosphorylation-related factor in the cells collected from the cells of the test subject organism before the test subject organism ingests the anti-fatigue substance candidate or implements the anti-fatigue method candidate. The step of measuring the amount of eIF-2α phosphorylation-related factors before ingestion, and
(Ii) After ingestion of the anti-fatigue substance candidate or implementation of the anti-fatigue method candidate, the amount of eIF-2α phosphorylation-related factor in the cells collected from the test subject organism is measured. -2α Phosphorylation-related factor amount measurement step and
(Iii) Ingestion or intake of the anti-fatigue substance candidate obtained by the step of measuring the amount of eIF-2α phosphorylation-related factor before ingestion of (i) and the step of measuring the amount of eIF-2α phosphorylation-related factor after ingestion of (ii). Based on the measurement results of changes in the amount of eIF-2α phosphorylation-related factors before and after the implementation of the anti-fatigue method candidate, ingestion of the anti-fatigue substance candidate or eIF-2α phosphorylation-related in cells before and after the implementation of the anti-fatigue method candidate The eIF-2α phosphorylation-related factor amount change calculation process for calculating the factor amount change,
(Iv) Amount of eIF-2α phosphorylation-related factor in cells before and after ingestion of the anti-fatigue substance candidate or implementation of anti-fatigue method candidate obtained by the step of calculating the amount of eIF-2α phosphorylation-related factor in (iii). A method for evaluating an anti-fatigue effect of an anti-fatigue substance candidate or an anti-fatigue method candidate, which comprises an anti-fatigue force measuring step of measuring the anti-fatigue force of the anti-fatigue substance candidate or the anti-fatigue method candidate in a living body based on the change in the above.
[15] (i) Collected from the test subject organisms that ingested the anti-fatigue substance candidate or implemented the anti-fatigue method candidate and the test target organisms that did not ingest the anti-fatigue substance candidate or implement the anti-fatigue method candidate. An eIF-2α phosphorylation-related factor amount measuring step for measuring the amount of eIF-2α phosphorylation-related factor in each cell, and an eIF-2α phosphorylation-related factor amount measuring step.
(Ii) Changes in the amount of eIF-2α phosphorylation-related factors obtained by the step of measuring the amount of eIF-2α phosphorylation-related factors in (i) depending on the intake of the anti-fatigue substance candidate or the implementation of the anti-fatigue method candidate. Based on the measurement results, the eIF-2α phosphorylation-related factor amount change calculation step for calculating the change in the amount of eIF-2α phosphorylation-related factor in cells depending on the intake of the anti-fatigue substance candidate or the implementation of the anti-fatigue method candidate. When,
(Iii) Intracellular eIF-2α phosphorylation-related factors depending on the intake of the anti-fatigue substance candidate obtained by the eIF-2α phosphorylation-related factor amount change calculation step of (ii) or the implementation of the anti-fatigue method candidate. A method for evaluating an anti-fatigue effect of an anti-fatigue substance candidate or an anti-fatigue method candidate, which comprises an anti-fatigue force measuring step of measuring the anti-fatigue force of the anti-fatigue substance candidate or the anti-fatigue method candidate in a living body based on a change in quantity.
[16] Anti-fatigue substance candidate using any of the fatigue degree evaluation method according to any one of [1] to [9] above and the fatigue degree evaluation kit according to any one of [10] or [11]. The method for evaluating an anti-fatigue effect according to any one of [14] and [15], which comprises measuring the anti-fatigue effect of a candidate for an anti-fatigue method.
[17] The method for evaluating an anti-fatigue effect according to any one of [14] to [16] for screening an anti-fatigue substance or an anti-fatigue method.
[18] An anti-fatigue evaluation method for evaluating the anti-fatigue power of a test subject organism using the amount of the eIF-2α phosphorylation signal inhibitor according to [7] in cells as an index.
[19] If the amount of the eIF-2α phosphorylation signal inhibitor is larger than the amount predicted from the amount of the eIF-2α phosphorylation signal transduction factor described in [6], it is evaluated that the anti-fatigue power is high. The anti-fatigue force evaluation method according to [18], which is characterized by the above.
[20] The amount of the above-mentioned eIF-2α phosphorylation signal inhibitor and the amount of the above-mentioned eIF-2α phosphorylation signal transduction factor, the mRNA expression level of the eIF-2α phosphorylation signal inhibitor and the eIF-2α phosphorylation signal transduction factor, or The anti-fatigue ability evaluation method according to [19], which is measured as the amount of protein produced.
[21] (i) The amount of eIF-2α phosphorylation signal inhibitor and eIF in cells collected from the test subject organism before the test subject organism ingests the anti-fatigue substance candidate or implements the anti-fatigue method candidate. -A pre-ingestion measurement step to measure the amount of α-phosphorylation signaling factor,
(Ii) Amount of eIF-2α phosphorylation signal inhibitor and eIF-2α phosphorylation in cells collected from the test subject organism after ingestion of anti-fatigue substance candidate or implementation of anti-fatigue method candidate. Post-ingestion measurement steps to measure the amount of signaling factors,
(Iii) Suppression of eIF-2α phosphorylation signal before and after ingestion of the anti-fatigue substance candidate or implementation of the anti-fatigue method candidate obtained by the pre-intake measurement step of (i) and the post-intake measurement step of (ii). Based on the measurement results of changes in the amount of the factor and the amount of the eIF-2α phosphorylation signal transduction factor, the eIF-2α phosphorylation signal inhibitor in the cells before and after the intake of the antifatigue substance candidate or the implementation of the antifatigue method candidate. A calculation step that calculates changes in the amount and eIF-2α phosphorylation signaling factor,
(Iv) Amount of eIF-2α phosphorylation signal inhibitor and eIF-2α phosphorylation signal in cells before and after ingestion of the anti-fatigue substance candidate obtained by the calculation step of (iii) or implementation of the anti-fatigue method candidate. Anti-fatigue of an anti-fatigue substance candidate or anti-fatigue method candidate, including an anti-fatigue force measuring step, which measures the anti-fatigue force of the anti-fatigue substance candidate or anti-fatigue method candidate in a living body based on a change in the amount of a transmission factor. Effect evaluation method.
[22] (i) eIF-2α in each cell collected from the cells of the test target organism in which the test target organism ingested the anti-fatigue substance candidate or performed the anti-fatigue method candidate and the test target organism in which the test target organism did not ingest the anti-fatigue substance candidate. A measurement step for measuring the amount of phosphorylation signal inhibitor and the amount of eIF-2α phosphorylation signal transduction factor,
(Ii) The amount of eIF-2α phosphorylation signal inhibitor and eIF-2α phosphorylation signal transduction depending on the ingestion of the anti-fatigue substance candidate or the implementation of the anti-fatigue method candidate obtained by the measurement step of (i). Based on the measurement results of changes in the amount of factors, the amount of eIF-2α phosphorylation signal inhibitor and the eIF-2α phosphorylation signal transduction factor in cells depending on the intake of the anti-fatigue substance candidate or the presence or absence of the anti-fatigue method candidate. A calculation process that calculates changes in quantity,
(Iii) The amount of eIF-2α phosphorylation signal inhibitor and eIF-2α phosphorylation in cells depending on the intake of the anti-fatigue substance candidate obtained by the calculation step of (ii) or the implementation of the anti-fatigue method candidate. Anti-fatigue candidate or anti-fatigue method, including an anti-fatigue measuring step, which measures the ingestion of the anti-fatigue candidate or the anti-fatigue force of the anti-fatigue method candidate in a living body based on a change in the amount of a signal transmitting factor. Candidate anti-fatigue effect evaluation method.
[23] A fatigue model animal, characterized in that at least one of the genes described in any one of [6] or [8] or a gene product thereof is introduced to cause fatigue.
[24] A fatigue model animal characterized in that fatigue is caused by eIF-2α phosphorylation.
[25] A fatigue model animal characterized by introducing the ATF3 gene or a gene product thereof to cause fatigue.
[26] An anti-fatigue model animal, which is characterized by introducing at least one of the genes described in [7] or a gene product thereof to impart anti-fatigue ability.
[27] An anti-fatigue model animal characterized by imparting anti-fatigue ability by suppressing eIF-2α phosphorylation and signal transduction associated therewith.
[28] A fatigue model animal characterized by inhibiting the function of at least one gene product among the genes described in [7] and suppressing the anti-fatigue effect.
[29] A method for evaluating the quality of fatigue, which comprises determining whether a subject's fatigue is nonpathological fatigue or pathological fatigue using the amount of eIF-2α phosphorylation-related factor in cells as an index.
[30] Despite the strong subjective fatigue of the subject, the amount of the eIF-2α phosphorylation-related factor according to any one of [6] to [8] in the cells collected from the subject is usually high. The method for evaluating the quality of fatigue according to [29], wherein the subject's fatigue is determined to be pathological fatigue if the amount is not relatively large.
[31] The cause of the subject's mental state and / or subjective fatigue, which comprises evaluating the cause of the subject's mental state and / or subjective fatigue using the amount of human herpesvirus in saliva as an index. How to evaluate.
[32] If the amount of human herpesvirus in the saliva of the subject is smaller than that of the subject's subjective feeling of fatigue, it is evaluated that the subject's subjective feeling of fatigue is due to depressive symptoms. 31].
[33] If the subject is a healthy subject and it is determined that the subject is not fatigued by the fatigue measurement based on the amount of human herpesvirus in the saliva of the subject, the feeling of fatigue of the subject is due to depressive symptoms. The method according to [31] to [32], wherein the method is determined to be.
[34] When the subject is a healthy subject and the subject has a strong sense of subjective fatigue even though it is determined that the subject is not fatigued by the fatigue measurement based on the amount of human herpesvirus in the saliva of the subject. The method according to any one of [31] to [33], wherein the subject is determined to be in a depressed state.
[35] The method according to any one of [31] to [34], wherein the amount of human herpesvirus is measured as the amount of human herpesvirus DNA or the amount of human herpesvirus protein.
[36] The method according to any one of [31] to [35], wherein the human herpesvirus is at least one selected from human herpesvirus 6 and human herpesvirus 7.
[37] An anti-fatigue substance or anti-fatigue method that exerts an anti-fatigue effect by suppressing the effects of signal transduction pathways associated with eIF-2α phosphorylation.
[38] An anti-fatigue substance candidate or an anti-fatigue method, which comprises evaluating the strength of an anti-fatigue effect using the strength of the effect of suppressing the effect of a signal transduction pathway related to phosphorylation of eIF-2α as an index. Candidate anti-fatigue effect evaluation method.
[39] An anti-fatigue substance or anti-fatigue method that exerts an anti-fatigue effect by promoting dephosphorylation of eIF-2α.
[40] A method for evaluating an anti-fatigue effect of an anti-fatigue substance candidate or an anti-fatigue method candidate, which comprises evaluating the strength of the anti-fatigue effect using the strength of the effect of promoting dephosphorylation of eIF-2α as an index. ..
[41] An anti-fatigue agent (fatigue recovery agent, fatigue inhibitor, or fatigue preventive agent) containing a substance selected from the group consisting of the following as an active ingredient:
(I) A substance that inhibits the expression or function of at least one of the factors described in [6] or [8];
(Ii) At least one of the factors described in [7]; and (iii) A substance that enhances the expression or function of at least one of the factors described in [7].
[42] An anti-fatigue agent (fatigue recovery agent, fatigue inhibitor, or fatigue preventive agent) containing a substance selected from the group consisting of the following as an active ingredient:
(A) A substance that inhibits the phosphorylation of eIF-2α (eIF-2α phosphorylation inhibitor);
(B) Substances that promote dephosphorylation of eIF-2α (eIF-2α dephosphorylation promoters); and (c) Substances that suppress the activity of signal transduction pathways induced by phosphorylation of eIF-2α (eIF). -2α phosphorylation signal inhibitor).
[43] The anti-fatigue agent according to [41] or [42], wherein the fatigue is nonpathological fatigue including physiological fatigue.
[44] The anti-fatigue agent according to [41] or [42], wherein the fatigue is fatigue caused by a peripheral organ or a peripheral tissue.
[45] The anti-fatigue agent according to [41] or [42], wherein the fatigue is mental fatigue or physical fatigue due to lack of sleep.
[46] A method for reducing fatigue (recovering or suppressing fatigue), which comprises a step selected from the group consisting of the following:
(I) A step of ingesting an anti-fatigue substance that exerts an effect of inhibiting the expression or function of at least one of the factors described in [6] or [8], or carrying out an anti-fatigue method that exerts the effect. ; And (ii) A step of ingesting an anti-fatigue substance that exerts an effect of enhancing the expression or function of at least one of the factors described in [7], or carrying out an anti-fatigue method that exerts the effect.
[47] Reducing fatigue (recovering or suppressing fatigue), including the step of ingesting an anti-fatigue substance exhibiting an effect selected from the group consisting of the following or implementing an anti-fatigue method exhibiting the effect. how to:
(A) Inhibits phosphorylation of eIF-2α;
(B) Promotes dephosphorylation of eIF-2α; and (c) Suppresses the activity of signaling pathways induced by phosphorylation of eIF-2α.
[48] The method according to [46] or [47], wherein the fatigue is nonpathological fatigue including physiological fatigue.
[49] The method according to [46] or [47], wherein the fatigue is fatigue caused by a peripheral organ or a peripheral tissue.
[50] The method according to [46] or [47], wherein the fatigue is mental fatigue or physical fatigue due to lack of sleep.
[51] Use of an anti-fatigue substance selected from the following group in the production of an anti-fatigue agent (fatigue recovery agent or fatigue inhibitor):
(I) A substance that inhibits the expression or function of at least one of the factors described in [6] or [8];
(Ii) At least one of the factors described in [7]; and (iii) A substance that enhances the expression or function of at least one of the factors described in [7].
[52] Use of an anti-fatigue substance selected from the following group in the production of an anti-fatigue agent (fatigue recovery agent or fatigue inhibitor):
(A) A substance that inhibits the phosphorylation of eIF-2α (eIF-2α phosphorylation inhibitor);
(B) Substances that promote dephosphorylation of eIF-2α (eIF-2α dephosphorylation promoters); and (c) Substances that suppress the activity of signal transduction pathways induced by phosphorylation of eIF-2α (eIF). -2α phosphorylation signal inhibitor).
[53] An anti-fatigue substance selected from the following group for use in reducing fatigue (recovering or suppressing fatigue):
(I) A substance that inhibits the expression or function of at least one of the factors described in [6] or [8];
(Ii) At least one of the factors described in [7]; and (iii) A substance that enhances the expression or function of at least one of the factors described in [7].
[54] An anti-fatigue substance selected from the following group for use in reducing fatigue (recovering or suppressing fatigue):
(A) A substance that inhibits the phosphorylation of eIF-2α (eIF-2α phosphorylation inhibitor);
(B) Substances that promote dephosphorylation of eIF-2α (eIF-2α dephosphorylation promoters); and (c) Substances that suppress the activity of signal transduction pathways induced by phosphorylation of eIF-2α (eIF). -2α phosphorylation signal inhibitor).
[55] A method for manufacturing an anti-fatigue substance (eg, an anti-fatigue agent) or an anti-fatigue device for carrying out an anti-fatigue method, which comprises any of the following steps:
(1) A step of evaluating the strength of the effect of inhibiting the phosphorylation of eIF-2α by the anti-fatigue substance or the anti-fatigue method;
(2) A step of evaluating the strength of the effect of the anti-fatigue substance or the anti-fatigue method on promoting dephosphorylation of eIF-2α;
(3) A step of evaluating the strength of the effect of the anti-fatigue substance or the anti-fatigue method on suppressing the effect of the signal transduction pathway related to phosphorylation of eIF-2α; or (4) [14] to [16]. ] Or [21] or [22], a step of evaluating the anti-fatigue substance or the anti-fatigue effect of the anti-fatigue method.

本発明にかかる疲労度評価方法、疲労度評価キット、その利用方法、及び抗疲労物質と抗疲労法の抗疲労力（抗疲労効果）測定方法は、被験者の臓器、血液または唾液を採取することにより、被験者のnonpathological fatigueが定量的に評価できるという効果を奏する。また、nonpathological fatigueとpathological fatigueの判別を行うことも可能となる。さらに、本発明にかかる方法及びキットは、いずれも簡便であるだけでなく、長時間にわたる拘束も必要としないため、被験者にとっては苦痛やわずらわしさを感じさせることがない。また、方法等も実施者にとっても簡便であり、被験者及び実施者の両者にとって非常に取り扱いやすいものであるという効果を奏する。それゆえ、抗疲労物質や抗疲労法のスクリーニング方法や、抗疲労能を謳った食品等のin vivo評価およびin vitro評価に利用することができ、非常に有用な技術である。 The fatigue degree evaluation method, the fatigue degree evaluation kit, the method of using the fatigue degree evaluation method, and the anti-fatigue force (anti-fatigue effect) measurement method of the anti-fatigue substance and the anti-fatigue method according to the present invention are to collect the organ, blood or saliva of the subject. This has the effect that the nonpathological fatigue of the subject can be quantitatively evaluated. It is also possible to discriminate between nonpathological fatigue and pathological fatigue. Further, the methods and kits according to the present invention are not only simple, but also do not require long-term restraint, so that the subject does not feel any pain or annoyance. In addition, the method and the like are also simple for the practitioner, and have the effect of being very easy to handle for both the subject and the practitioner. Therefore, it can be used for screening methods for anti-fatigue substances and anti-fatigue methods, and for in vivo evaluation and in vitro evaluation of foods claiming anti-fatigue ability, and is a very useful technique.

本発明の中で、eIF-2αリン酸化関連の分子バイオマーカーを利用した方法は、ヒトと同様に動物さらには、培養細胞にも使用が可能である。また本発明は、生理的疲労を専門的に解析可能な動物モデルも提供する。これにより、抗疲労物質や抗疲労法のスクリーニングがヒトでの試験において行うよりもはるかに効率良く行え、より良い製品の開発に貢献することが可能となる。 In the present invention, the method using a molecular biomarker related to eIF-2α phosphorylation can be used for animals as well as cultured cells as in humans. The present invention also provides an animal model capable of professionally analyzing physiological fatigue. This makes it possible to screen for anti-fatigue substances and anti-fatigue methods much more efficiently than in human tests, and to contribute to the development of better products.

本発明にかかる疲労度評価キットによれば、例えば、被験者から採取された血液中のeIF-2αリン酸化関連因子の量を測定し、その量を算出することで、疲労抑制又は回復効果がある医薬品、食品および抗疲労法の効果効能を評価できる。さらに、変化したeIF-2αリン酸化関連因子の種類と量を総合的に測定することで、当該物質や方法が疲労発生のどの段階で作用するのか、疲労抑制効果をもつのか、疲労回復効果をもつのかなどの詳細な検討が可能となる。すなわち、疲労抑制又は回復効果がある医薬品又は食品の生体における効果効能を簡便かつ定量的に求めることができる。 According to the fatigue degree evaluation kit according to the present invention, for example, by measuring the amount of eIF-2α phosphorylation-related factor in blood collected from a subject and calculating the amount, there is an effect of suppressing or recovering from fatigue. The efficacy and efficacy of medicines, foods and anti-fatigue methods can be evaluated. Furthermore, by comprehensively measuring the types and amounts of changed eIF-2α phosphorylation-related factors, it is possible to determine at what stage of fatigue development the substance or method acts, whether it has a fatigue suppressing effect, and the fatigue recovery effect. It is possible to make a detailed examination of whether or not it has. That is, it is possible to easily and quantitatively determine the effect and efficacy of a drug or food having a fatigue suppressing or recovering effect in a living body.

本発明の方法によれば、ヒトの疲労症状に対して、抗疲労物質や抗疲労法が疲労の発生機構のどの段階に作用して、どの程度改善効果を有するのか、すなわち、抗疲労物質や抗疲労法の有する抗疲労力について、簡便かつ確実、さらに定量的に、測定することができる。このことにより、異なったメカニズムで抗疲労効果を発揮する抗疲労物質や抗疲労法を複合的に使用することによって、より強力で確実な抗疲労効果を科学的に得ることが可能となる。 According to the method of the present invention, to what stage of the fatigue generation mechanism the anti-fatigue substance or anti-fatigue method acts on human fatigue symptoms and to what extent it has an improving effect, that is, the anti-fatigue substance or The anti-fatigue power of the anti-fatigue method can be measured easily, reliably, and quantitatively. This makes it possible to scientifically obtain a stronger and more reliable anti-fatigue effect by using an anti-fatigue substance and an anti-fatigue method that exert an anti-fatigue effect by different mechanisms in combination.

本発明は、日常生活における疲労度を簡便かつ定量的に測定・評価するための方法、キット及びその利用法を提供するものである。このため、本発明によれば、日常生活において、疲労度を客観的に知ることができ、疲労が知らず知らずのうちに蓄積して引き起こされる種々の疾患の発生を回避できる。さらに、疲労の蓄積による最大の死因の一つである自殺の引き金になる、うつ症状を簡便に判定することも可能となるので、疲労を意識せずに働き続けることにより発生する過労死や自殺の発生率を低下させることもできる。 The present invention provides a method, a kit, and a method of using the same for simply and quantitatively measuring and evaluating the degree of fatigue in daily life. Therefore, according to the present invention, the degree of fatigue can be objectively known in daily life, and the occurrence of various diseases caused by unknowingly accumulating fatigue can be avoided. In addition, it is possible to easily determine the depressive symptoms that trigger suicide, which is one of the biggest causes of death due to the accumulation of fatigue, so overwork death and suicide caused by continuing to work without being aware of fatigue. It is also possible to reduce the incidence of.

さらに、本発明によれば、市場に数多く供給される、疲労回復、滋養強壮・栄養補給を謳う医薬品や食品さらには疲労回復効果を謳った健康器具や電化製品などがどの程度生体において抗疲労力を発揮するのか、といった情報を消費者及び社会に提供することができる。これらの情報は、消費者にとって、疲労の予防や、滋養強壮に有効な抗疲労食品や医薬品、健康器具などを選択する際の一つの目安として利用することができるものであり、これらの点において、本発明は非常に有用かつ社会的インパクトの強い発明である。 Further, according to the present invention, to what extent in the living body, a large number of medicines and foods that claim to recover from fatigue, nutritional tonicity and nutrition, as well as health appliances and electrical appliances that claim to have a fatigue recovery effect, are supplied to the market. It is possible to provide consumers and society with information such as whether or not they will exert their abilities. This information can be used by consumers as a guide for preventing fatigue and selecting anti-fatigue foods, medicines, health appliances, etc. that are effective for nutrition and tonicity, and in these respects. The present invention is very useful and has a strong social impact.

実施例１における疲労によるeIF-2α、PKRのリン酸化とATF4タンパク産生の亢進を示すウェスタンブロッティングの写真および各バンドを定量化したグラフである。It is a photograph of Western blotting showing the phosphorylation of eIF-2α and PKR and the enhancement of ATF4 protein production due to fatigue in Example 1, and the graph which quantified each band. 実施例２における精神疲労による各種臓器でのATF3の増加を示す図である。It is a figure which shows the increase of ATF3 in various organs by mental fatigue in Example 2. FIG. 実施例３における肉体疲労による各種臓器でのATF3の増加を示す図である。It is a figure which shows the increase of ATF3 in various organs by physical fatigue in Example 3. FIG. 実施例４におけるヒトの末梢血液を用いたATF3による肉体疲労の測定を示す図である。It is a figure which shows the measurement of the physical fatigue by ATF3 using the human peripheral blood in Example 4. FIG. 実施例５における肉体疲労と精神疲労による肝臓でのCHOPの増加を示す図である。It is a figure which shows the increase of CHOP in the liver by physical fatigue and mental fatigue in Example 5. 実施例６におけるヒトの末梢血液を用いたCHOPによる肉体疲労の測定を示す図である。It is a figure which shows the measurement of the physical fatigue by CHOP using the human peripheral blood in Example 6. 実施例７におけるATF3導入による疲労の誘導を示す図である。It is a figure which shows the induction of fatigue by the introduction of ATF3 in Example 7. 実施例８におけるATF3の発現抑制による疲労の軽減効果を示す図である。It is a figure which shows the effect of reducing fatigue by suppressing the expression of ATF3 in Example 8. 実施例９におけるATF3導入によるATF3と炎症性サイトカインの遺伝子発現を示す図である。It is a figure which shows the gene expression of ATF3 and inflammatory cytokine by the introduction of ATF3 in Example 9. 図９－１の続きを示す図である。It is a figure which shows the continuation of FIG. 9-1. 実施例１０における疲労による干渉RNAの誘導を示す図である。It is a figure which shows the induction of the interference RNA by fatigue in Example 10. 図１０－１の続きを示す図である。It is a figure which shows the continuation of FIG. 10-1. 実施例１１における疲労による干渉RNA関連分子の誘導を示す図である。It is a figure which shows the induction of the interference RNA-related molecule by fatigue in Example 11. 実施例１２におけるヒトの血液中の干渉RNA関連分子による疲労の測定を示す図である。It is a figure which shows the measurement of the fatigue by the interfering RNA-related molecule in the human blood in Example 12. 実施例１３におけるヒトの血液中の小胞体ストレス関連分子による疲労の測定を示す図である。It is a figure which shows the measurement of the fatigue by the endoplasmic reticulum stress-related molecule in the human blood in Example 13. 実施例１４におけるPoly(I:C)の腹腔投与によるATF3の遺伝子発現がほとんどないことを示す図である。It is a figure which shows that there is almost no gene expression of ATF3 by abdominal administration of Poly (I: C) in Example 14. 実施例１５における精神疲労と肉体疲労による各種臓器でのeIF-2αリン酸化抑制因子の増加を示す図である。It is a figure which shows the increase of the eIF-2α phosphorylation inhibitor in various organs by mental fatigue and physical fatigue in Example 15. 図１５－１の続きを示す図である。It is a figure which shows the continuation of FIG. 15-1. 実施例１６におけるヒトの血液中のeIF-2αリン酸化抑制因子による疲労の測定を示す図である。It is a figure which shows the measurement of the fatigue by the eIF-2α phosphorylation inhibitor in the human blood in Example 16. 実施例１７におけるeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子とeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子を用いた疲労回復法と抗疲労成分の効果判定を示す図である。It is a figure which shows the fatigue recovery method using the eIF-2α phosphorylation signal transduction factor and the eIF-2α phosphorylation signal inhibitor, and the effect determination of an anti-fatigue component in Example 17. 実施例１８における慢性疲労症候群患者の疲労関連因子による疲労測定を示す図である。It is a figure which shows the fatigue measurement by the fatigue-related factor of the chronic fatigue syndrome patient in Example 18. 実施例１９におけるうつ病性障害患者の疲労測定結果を示す図である。It is a figure which shows the fatigue measurement result of the depressive disorder patient in Example 19. 実施例２０における疲労のVASと唾液中ヒトヘルペスウイルス7(HHV-7)の組合せによる、うつ状態の簡易診断法を示す図である。It is a figure which shows the simple diagnostic method of the depressive state by the combination of the fatigue VAS and the human herpesvirus 7 (HHV-7) in saliva in Example 20. 実施例２１における精神疲労による各臓器でのZFP36の増加を示す図である。It is a figure which shows the increase of ZFP36 in each organ by mental fatigue in Example 21. 実施例２２における精神疲労による各臓器でのTSC22D3の増加を示す図である。It is a figure which shows the increase of TSC22D3 in each organ by mental fatigue in Example 22. 実施例２３における肉体疲労による各臓器でのZFP36の増加を示す図である。It is a figure which shows the increase of ZFP36 in each organ by the physical fatigue in Example 23. 実施例２４における肉体疲労による各臓器でのTSC22D3の増加を示す図である。It is a figure which shows the increase of TSC22D3 in each organ by the physical fatigue in Example 24. 実施例２５における精神疲労によるヒトの末梢血でのZFP36の増加を示す図である。It is a figure which shows the increase of ZFP36 in the human peripheral blood by mental fatigue in Example 25. 実施例２６におけるeIF-2αリン酸化シグナル阻害剤ISRIBによるマウスの強制水泳移動距離の増加を示す図である。It is a figure which shows the increase in the forced swimming distance of a mouse by the eIF-2α phosphorylation signal inhibitor ISRIB in Example 26. 実施例２７におけるeIF-2αの脱リン酸化阻害剤salubrinalによるマウスの強制水泳移動距離の減少を示す図である。It is a figure which shows the decrease of the forced swimming movement distance of a mouse by the dephosphorylation inhibitor salubrinal of eIF-2α in Example 27.

以下、本発明にかかる疲労度評価方法、キット、及び利用法について説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。 Hereinafter, the fatigue degree evaluation method, the kit, and the usage method according to the present invention will be described, but the present invention is not limited thereto.

本明細書における「疲労」とは、身体的あるいは精神的負荷を連続して与えられたときにみられる一時的な身体的・精神的機能および体力の質的あるいは量的な低下現象で、生理的疲労と病的疲労に分類される。本明細書における「生理的疲労」とは、健康な人が、身体的あるいは精神的負荷を連続して与えられたときにみられる一時的な身体的および精神的作業能力の質的あるいは量的な低下現象を意味する。「病的疲労」とは、慢性疲労症候群、精神疾患、中枢神経系疾患、心臓病、肝炎、貧血、各種感染症、悪性腫瘍などの疾患にともなう疲労を意味する。 As used herein, "fatigue" is a phenomenon of temporary qualitative or quantitative deterioration of physical and mental functions and physical strength that occurs when a person is continuously subjected to physical or mental load. It is classified into mental fatigue and morbid fatigue. As used herein, "physiological fatigue" refers to the qualitative or quantitative ability of a healthy person to have temporary physical and mental work capacity when continuously subjected to physical or mental stress. It means a decrease phenomenon. "Medical fatigue" means fatigue associated with diseases such as chronic fatigue syndrome, psychiatric disorders, central nervous system disorders, heart diseases, hepatitis, anemia, various infectious diseases, and malignant tumors.

「病的疲労」の中でも特に、慢性疲労症候群(CFS)やうつ病などの中枢神経系の疾患による疲労は、特に疲労の負荷がないにも関わらず脳が異常な疲労感を感じるもので、「pathological fatigue」として生理的疲労や他の病的疲労と区別される。生理的疲労やpathological fatigue以外の病的疲労は「nonpathological fatigue」と呼ばれ、末梢の臓器や組織における疲労が何らかの方法で脳に伝わり、脳が疲労を感じることで生じる。これに対し、pathological fatigueは、末梢には原因はなく、脳に異常が生じていることで疲労感を感じるものである。すなわち、nonpathological fatigueは末梢臓器や末梢組織に原因がある疲労、pathological fatigueは脳の疾患による疲労と言える。本明細書におけるnonpathological fatigueは、生理的疲労のすべてと、末梢臓器や末梢組織が疲労の原因となる病的疲労を含んだ疲労を表す。 Among "morbid fatigue", fatigue caused by diseases of the central nervous system such as chronic fatigue syndrome (CFS) and depression causes the brain to feel abnormal fatigue even though there is no particular load of fatigue. It is distinguished from physiological fatigue and other pathological fatigue as "pathological fatigue". Physiological fatigue and pathological fatigue other than pathological fatigue are called "nonpathological fatigue" and occur when fatigue in peripheral organs and tissues is transmitted to the brain in some way and the brain feels fatigue. On the other hand, pathological fatigue has no peripheral cause and causes a feeling of fatigue due to an abnormality in the brain. That is, it can be said that nonpathological fatigue is fatigue caused by peripheral organs and tissues, and pathological fatigue is fatigue caused by brain diseases. Nonpathological fatigue as used herein refers to fatigue including all physiological fatigue and pathological fatigue in which peripheral organs and tissues cause fatigue.

「生理的疲労」はさらに、「急性疲労」と「持続的疲労」に分類される。本明細書における「急性疲労」とは、適切な休息によって回復する一過性の疲労を意味する。また、「持続的疲労」とは、日々の回復が不完全なために疲労が蓄積した、長期間にわたる疲労を意味する。本明細書における中長期的疲労とは、上記持続的疲労に至る前の急性疲労を意味する。 "Physiological fatigue" is further classified into "acute fatigue" and "sustained fatigue". As used herein, "acute fatigue" means transient fatigue that recovers with proper rest. In addition, "sustained fatigue" means long-term fatigue in which fatigue has accumulated due to incomplete daily recovery. The medium- to long-term fatigue in the present specification means acute fatigue before the above-mentioned continuous fatigue.

「急性疲労」、及び「持続的疲労」はそれぞれ、「精神疲労」と「肉体疲労」に分類される。本明細書における「精神疲労」とは、複雑な計算や記憶、または思考などの心理活動ばかりでなく、我慢や緊張または時間に追われて作業をすることの焦操感など、感情や意思の活動が過度に要求された場合に生じる、睡眠不足、眼精疲労、心的ストレスを含む疲労を意味する。また、本明細書における「肉体疲労」とは、肉体的作業の遂行や運動によって起こる疲労を意味する。さらに、本明細書における「疲労負荷」とは、上記疲労を与えることを意味する。 "Acute fatigue" and "sustained fatigue" are classified into "mental fatigue" and "physical fatigue", respectively. As used herein, "mental fatigue" refers to not only psychological activities such as complicated calculations, memories, or thoughts, but also emotions and intentions such as patience, tension, or the impatience of working in a time-consuming manner. It means fatigue including lack of sleep, eye exhaustion, and psychological stress that occurs when activity is excessively demanded. Further, the term "physical fatigue" as used herein means fatigue caused by the performance of physical work or exercise. Further, the "fatigue load" in the present specification means to give the above fatigue.

本明細書における「疲労度」とは、上記に挙げた各種の「疲労」の結果生じた、過度の肉体的、精神的な活動または、疾患の影響により生じた「疲労感」を伴う身体・精神機能および体力の減弱状態の度合いをいう。 The term "fatigue" as used herein refers to the body and body with "fatigue" caused by excessive physical and mental activities or the effects of illness as a result of the various "fatigues" listed above. The degree of weakness in mental function and physical fitness.

本明細書における「疲労感」とは、上記に挙げた各種の「疲労」の結果生じた、脳が疲労を感じる感覚で、「疲れ」や「倦怠感」などの独特の不快感と休養を求める欲求を伴う感覚である。 The term "fatigue" as used herein is a sensation that the brain feels tired as a result of the various "fatigues" mentioned above, and it causes peculiar discomfort and rest such as "tiredness" and "malaise". It is a feeling with a desire to seek.

本発明は、上記に挙げた各種の「疲労」の全てを対象とするものであるが、なかでも、nonpathological fatigueであることが好ましい。nonpathological fatigueの中でも急性疲労または中長期疲労であることが好ましい。なお、nonpathological fatigueには、ガン患者の疲労など、病気による疲労も含まれ、このような疲労の測定も本発明の重要な使用法の一つである。また、本発明の対象は、うつ症状や精神疾患にともなう、病的疲労のうちのpathological fatigueが好ましい。 The present invention covers all of the various "fatigues" listed above, with nonpathological fatigue being preferred. Among nonpathological fatigue, acute fatigue or medium- to long-term fatigue is preferable. In addition, nonpathological fatigue includes fatigue due to illness such as fatigue of cancer patients, and measurement of such fatigue is also one of the important uses of the present invention. Further, the subject of the present invention is preferably pathological fatigue among pathological fatigue associated with depressive symptoms and mental illness.

本発明を実施するために最適な疲労に関連する因子（疲労関連因子）の条件としては、ヒトおよび動物のnonpathological fatigueに関連する因子であること、および測定することが簡単に行えることが挙げられる。 The conditions of the optimal fatigue-related factor (fatigue-related factor) for carrying out the present invention include that it is a factor related to nonpathological fatigue in humans and animals, and that it can be easily measured. ..

上記条件を満たす疲労関連因子としては、eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子(リン酸化されたeIF-2α、ATF3、ATF4、CHOP)、eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子(GADD34、Nck1、Nck2、CReP、ZFP36、GILZ)、eIF-2αリン酸化誘導関連因子(siRNA、miRNAなどの干渉RNA、PKR、 GRP78、XBP-1)、および干渉RNA関連因子(Dgcr8、Drosha)などのeIF-2αリン酸化関連因子、ならびに、ヒトヘルペスウイルス(HHV-6、HHV-7)が好適であると考えられる。なお、本明細書において、これらの因子について用いる「遺伝子」なる用語は、当該因子であるタンパク質もしくは干渉RNA分子またはそれらをコードするポリヌクレオチドのいずれをも含む概念を意味し、当該タンパク質もしくは干渉RNA分子と、当該ポリヌクレオチドとの両方について言及する場合には、当該因子について「遺伝子または遺伝子産物」と表現する場合がある。 Fatigue-related factors that satisfy the above conditions include eIF-2α phosphorylation signal transduction factors (phosphorylated eIF-2α, ATF3, ATF4, CHOP) and eIF-2α phosphorylation signal suppressors (GADD34, Nck1, Nck2, CReP). , ZFP36, GILZ), eIF-2α phosphorylation-related factors (interfering RNA such as siRNA, miRNA, PKR, GRP78, XBP-1), and eIF-2α phosphorylation-related factors such as interfering RNA-related factors (Dgcr8, Drosha) Factors as well as human herpesviruses (HHV-6, HHV-7) are considered suitable. In addition, in this specification, the term "gene" used for these factors means a concept including any of the protein or interfering RNA molecule which is the factor or the polynucleotide which encodes them, and the protein or interfering RNA. When referring to both a molecule and the polynucleotide, the factor may be referred to as a "gene or gene product."

また、これらの因子は疲労負荷によって細胞中でのmRNA量またはタンパク量（当該因子がsiRNAやmiRNAなどの干渉RNA分子である場合、当該RNAの量）が増加するので、ヒトでは血液細胞中のmRNA量またはタンパク量（あるいは干渉RNAの量）を、動物モデルでは、血液や各種臓器中のmRNA量またはタンパク量（あるいは干渉RNAの量）を測定すれば、疲労に伴う変化を簡単に測定することができる。ヒトヘルペスウイルスに関しては、唾液中にウイルスDNAが放出されることが知られているので、唾液中のウイルスDNAを測定すれば、簡便に測定することができる。 In addition, since these factors increase the amount of mRNA or protein in cells (the amount of RNA when the factor is an interfering RNA molecule such as siRNA or miRNA) due to fatigue load, in humans, the amount of mRNA in blood cells By measuring the amount of mRNA or protein (or the amount of interfering RNA), and in the animal model, the amount of mRNA or protein (or the amount of interfering RNA) in blood or various organs, changes with fatigue can be easily measured. be able to. Since it is known that viral DNA is released into saliva with respect to human herpesvirus, it can be easily measured by measuring the viral DNA in saliva.

さらに、eIF2αおよび一部のeIF-2αリン酸化関連因子には、リン酸化によって疲労の発生を誘導し、脱リン酸化によって抗疲労効果と関係する因子がある。ヒトでは血液やバイオプシー、病理標本、法医学標本における各種臓器中でのリン酸化の度合いを、動物モデルでは血液や各種臓器中でのリン酸化の度合いを測定すれば、疲労に伴う変化を簡単に測定することができる。 In addition, eIF2α and some eIF-2α phosphorylation-related factors include factors that induce fatigue by phosphorylation and are associated with anti-fatigue effects by dephosphorylation. In humans, the degree of phosphorylation in various organs in blood, biopsy, pathological specimens, and forensic specimens can be measured, and in animal models, the degree of phosphorylation in blood and various organs can be measured to easily measure changes associated with fatigue. can do.

以下に、本発明の概要を簡単に説明する。ここで述べる方法の概要は、後述するキット及び利用方法にも共通する部分が多分に存在する。 The outline of the present invention will be briefly described below. The outline of the method described here has a lot in common with the kit and the usage method described later.

（１）疲労度評価方法
本発明者らは、ヒトにおいては被験者から採取された血液について、動物においては採取された血液または各種臓器や組織について細胞中に存在する上記疲労関連因子の量を測定することにより、ヒトおよび動物の疲労度を簡便かつ定量的に測定することができることを見出した。なおヘルペスウイルスに関しては、ヒトのみが適応となり、唾液を測定に用いる。この方法は、大掛かりな装置が必要ないだけでなく、ヒトにおける血液の採取時間が短いことから、被験者にとって時間的拘束が少なく、また、方法の実施者にとっても非常に簡便な方法である。 (1) Fatigue evaluation method In humans, the present inventors measure the amount of the above-mentioned fatigue-related factors present in the cells of blood collected from a subject in humans, blood collected in animals, or various organs and tissues. By doing so, it was found that the degree of fatigue of humans and animals can be measured easily and quantitatively. For herpesvirus, only humans are indicated, and saliva is used for measurement. Not only does this method not require a large-scale device, but also because the blood collection time in humans is short, there is little time constraint for the subject, and it is a very convenient method for the practitioner of the method.

本発明の対象となる疲労関連因子としては、eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子(リン酸化されたeIF-2α、ATF3、ATF4、CHOP)、eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子(GADD34、Nck1、Nck2、CReP、ZFP36、GILZ)、eIF-2αリン酸化誘導関連因子(siRNA、miRNAなどの干渉RNA、PKR、GRP78、XBP-1)、干渉RNA関連因子(Dgcr8、Drosha)、ヒトヘルペスウイルス(HHV-6、HHV-7)が好適である。 The fatigue-related factors targeted by the present invention include eIF-2α phosphorylation signal transduction factors (phosphorylated eIF-2α, ATF3, ATF4, CHOP) and eIF-2α phosphorylation signal suppressors (GADD34, Nck1, Nck2). , CReP, ZFP36, GILZ), eIF-2α phosphorylation induction related factors (interfering RNA such as siRNA, miRNA, PKR, GRP78, XBP-1), interfering RNA related factors (Dgcr8, Drosha), human herpesvirus (HHV- 6, HHV-7) is suitable.

本発明の対象となる細胞は血液および各種臓器や組織から選ばれる少なくとも一種以上であればよいが、ヒトでは血液が、実験動物では各種臓器が好適である。 The cell to be the subject of the present invention may be at least one selected from blood and various organs and tissues, but blood is suitable for humans and various organs are suitable for experimental animals.

血液の採取方法は、mRNAによる測定の利便性を考慮して、Paxgene RNA採血管による採血が好適である。動物モデルでは、RNA保護剤を用いる方法が望ましい。 As a method for collecting blood, considering the convenience of measurement by mRNA, blood collection using a Paxgene RNA blood collection tube is preferable. In animal models, methods using RNA protectants are preferred.

細胞中の上記疲労関連因子の量の測定は従来公知の方法であればよく、具体的な手法、条件などは、当業者であれば適宜設定可能である。mRNA、siRNA、miRNAなどのRNA分子の量を測定する方法やタンパク質の量を測定する方法などがある。 The amount of the fatigue-related factor in the cell may be measured by a conventionally known method, and specific methods, conditions and the like can be appropriately set by those skilled in the art. There are methods for measuring the amount of RNA molecules such as mRNA, siRNA, and miRNA, and methods for measuring the amount of protein.

上記疲労関連因子のmRNAの量を測定する方法としては、例えば、血液細胞からRNAを精製し、それぞれの疲労関連因子に特異的なリアルタイムPCR（Real-time PCR）用のプライマーとプローブを用いて、mRNA量をReal-time PCR法により測定する方法等が挙げられる。siRNAやmiRNAなどのRNA分子の量についても同様に、当該RNA分子に特異的なリアルタイムPCR（Real-time PCR）用のプライマーとプローブを用いて発現量を測定することができる。ウイルスDNAに関しては、唾液中のDNAを精製し、ウイルス特異的なReal-time PCR法により測定する方法（参考資料：特許第4218842号、特許第4812708号）等が挙げられる。本発明においては、リアルタイムPCR法 (Real-time PCR) が好適である。 As a method for measuring the amount of mRNA of the fatigue-related factor, for example, RNA is purified from blood cells, and a primer and a probe for real-time PCR specific for each fatigue-related factor are used. , A method of measuring the amount of mRNA by a real-time PCR method and the like. Similarly, the expression level of the amount of RNA molecules such as siRNA and miRNA can be measured by using a primer and a probe for real-time PCR specific to the RNA molecule. As for viral DNA, a method of purifying saliva DNA and measuring it by a virus-specific real-time PCR method (reference materials: Patent No. 4218842, Patent No. 4812708) and the like can be mentioned. In the present invention, the real-time PCR method is suitable.

上記疲労関連因子タンパクの量を測定する方法としては、例えば、ウイルスタンパクに対する抗体を用いた免疫測定法（イムノアッセイ法）がある。代表的な免疫測定法として、例えばサンドイッチELISA法などが挙げられる（参考文献：J. Clin. Microbiol. 1983 May;17(5):942-4.「Typing of herpes simplex virus isolates by enzyme-linked immunosorbent assay: comparison between indirect and double-antibody sandwich techniques.」Gerna G, Battaglia M, Revello MG, Gerna MT.）。 As a method for measuring the amount of the fatigue-related factor protein, for example, there is an immunoassay method using an antibody against a viral protein. A typical immunoassay method includes, for example, the sandwich ELISA method (reference: J. Clin. Microbiol. 1983 May; 17 (5): 942-4. "Typing of herpes simplex virus isolates by enzyme-linked immunosorbent". assay: comparison between indirect and double-antibody sandwich techniques. ”Gerna G, Battaglia M, Revello MG, Gerna MT.).

また、本発明に係る疲労度測定方法においては、被験対象生物から採取された細胞中の疲労関連因子の量がより多いかまたは少なければ当該生物の疲労度がより高いと評価することができるが、細胞中の上記疲労関連因子の量がより多ければ被験者および被験動物の疲労度がより高いと評価することが好適である。これは、後述する実施例に示すように、被験者および被験動物の疲労度が高まれば、それに応じて上記疲労関連因子の細胞中の発現量が上昇することから導かれる。細胞中の上記疲労関連因子の量は、所定の基準値（対照値）と比較して評価することが好適である。すなわち、好適には、本発明に係る疲労度測定方法は、被験対象生物から採取された細胞中の上記疲労関連因子の量が所定の基準値より有意に多ければ、当該被験対象生物の疲労度が高いと評価することを特徴とする。本発明の一態様において、上記基準値は、疲労負荷を受ける前、十分な休息をとった後（好ましくは休息の直後）、抗疲労物質を摂取した後、または抗疲労法を実施した後の被験対象生物から採取された細胞中の上記疲労関連因子の量である。あるいは、上記基準値は、当該被験対象生物と同一の生物種であって、疲労負荷を与えられていない、休息をとった、抗疲労物質を摂取した、または抗疲労法を実施した生物から採取された細胞中の上記疲労関連因子の量であってもよく、当該基準値は予め測定された値であってもよい。
ヒトヘルペスウイルスの場合は、後述する実施例に示すように、自覚的疲労感との比較が重要である。 Further, in the fatigue degree measuring method according to the present invention, it can be evaluated that the fatigue degree of the organism is higher when the amount of the fatigue-related factor in the cells collected from the test subject organism is larger or smaller. It is preferable to evaluate that the degree of fatigue of the subject and the test animal is higher when the amount of the fatigue-related factor in the cells is larger. This is derived from the fact that as the degree of fatigue of the subject and the test animal increases, the expression level of the fatigue-related factor in the cells increases accordingly, as shown in Examples described later. It is preferable to evaluate the amount of the fatigue-related factor in the cell in comparison with a predetermined reference value (control value). That is, preferably, in the method for measuring the degree of fatigue according to the present invention, if the amount of the fatigue-related factor in the cells collected from the subject organism is significantly larger than the predetermined reference value, the degree of fatigue of the subject organism is preferred. Is characterized by being evaluated as high. In one aspect of the present invention, the reference value is set before receiving a fatigue load, after taking sufficient rest (preferably immediately after rest), after ingesting an anti-fatigue substance, or after performing an anti-fatigue method. The amount of the fatigue-related factor in cells collected from the subject organism. Alternatively, the above reference value is collected from an organism that is the same species as the subject organism and has not been subjected to a fatigue load, has taken a rest, has ingested an anti-fatigue substance, or has undergone an anti-fatigue method. It may be the amount of the fatigue-related factor in the cells, and the reference value may be a value measured in advance.
In the case of human herpesvirus, it is important to compare it with the feeling of subjective fatigue, as shown in the examples described later.

さらに、本発明にかかる疲労度評価方法の一部あるいは全部をコンピュータ等の従来公知の演算装置（情報処理装置）を利用して行うことも可能であることは、当業者には明らかである。例えば、本発明にかかる疲労度評価方法は、血液細胞中の上記疲労関連因子の量を測定する測定工程と、血液細胞中の疲労関連因子の量の測定結果に応じて被験者の疲労度を評価する評価工程とを含むと換言できるが、この中でも、特に評価工程に演算装置を利用することができる。 Further, it is clear to those skilled in the art that a part or all of the fatigue degree evaluation method according to the present invention can be performed by using a conventionally known arithmetic unit (information processing unit) such as a computer. For example, the fatigue degree evaluation method according to the present invention evaluates the fatigue degree of a subject according to a measurement step of measuring the amount of the fatigue-related factor in blood cells and the measurement result of the amount of fatigue-related factor in blood cells. In other words, it can be said that the evaluation process is included, but among these, a calculation device can be used particularly for the evaluation process.

（２）疲労度評価キット
次に、本発明にかかる疲労度評価キットについて説明する。本発明にかかる疲労度評価キットは、ヒトまたは動物における疲労度を評価するキットである。すなわち、上記（１）欄で説明した本発明にかかる疲労度評価方法を実施するためのキットであればよい。詳細には、被験生物の細胞中の上記疲労関連因子の量を測定する手段を含むキットであればよい。本発明における細胞中の上記疲労関連因子の量を測定する手段としては、従来公知の測定方法を実施するために必要な手段であればよい。従来公知の測定方法を実施するために必要な手段とは、具体的には、例えば、上記（１）欄で説明した細胞中の上記疲労関連因子の量を測定する方法を実施するために必要な試薬、器具、装置、触媒その他のものをいい、好ましくは本発明の対象となる疲労関連因子の量を特異的に測定するためのプローブ、プライマー、または抗体等が挙げられる。本発明にかかる疲労度評価キットは、被験生物の細胞を採取するための手段を含んでいてもよい。また、その包装材に付されたラベル又は添付された文書に、細胞中の上記疲労関連因子のうち少なくとも一種の量を指標として被験者の疲労度を評価するために使用できることが表示されていてもよい。 (2) Fatigue Evaluation Kit Next, the fatigue evaluation kit according to the present invention will be described. The fatigue degree evaluation kit according to the present invention is a kit for evaluating the fatigue degree in humans or animals. That is, it may be a kit for carrying out the fatigue degree evaluation method according to the present invention described in the above column (1). Specifically, it may be a kit containing a means for measuring the amount of the fatigue-related factor in the cells of the test organism. As the means for measuring the amount of the fatigue-related factor in the cells in the present invention, any means necessary for carrying out a conventionally known measuring method may be used. The means necessary for carrying out the conventionally known measuring method is specifically, for example, necessary for carrying out the method for measuring the amount of the fatigue-related factor in the cells described in the above column (1). Reagents, instruments, devices, catalysts and others, preferably probes, primers, antibodies and the like for specifically measuring the amount of fatigue-related factors of interest in the present invention. The fatigue evaluation kit according to the present invention may include means for collecting cells of a test organism. Further, even if the label attached to the packaging material or the attached document indicates that the amount of at least one of the above fatigue-related factors in cells can be used as an index to evaluate the degree of fatigue of the subject. good.

さらに本発明にかかる疲労度評価キットを用いる疲労度評価には、コンピュータなどの従来公知の演算装置を使用してもよい。 Further, a conventionally known arithmetic unit such as a computer may be used for the fatigue degree evaluation using the fatigue degree evaluation kit according to the present invention.

（３）疲労度評価方法及び疲労度評価キットの利用法
以上のように、本発明にかかる疲労度評価方法、疲労度評価キットを用いて、被験生物が抗疲労物質を摂取する前後または抗疲労法を実施する前後において、被験生物の細胞中の上記疲労関連因子の量を測定することで、当該抗疲労物質または抗疲労法候補の被験生物生体内における抗疲労力（抗疲労効果）を定量的に測定・評価することができる。さらに、かかる方法、キットはいずれも簡便であるだけでなく、大掛かりな装置や長時間における拘束が必要ないため、被験者及び実施者の両者にとって非常に取り扱いやすいものであるという利点がある。 (3) Fatigue Evaluation Method and Usage of Fatigue Evaluation Kit As described above, using the fatigue evaluation method and fatigue evaluation kit according to the present invention, before and after the subject organism ingests the anti-fatigue substance or anti-fatigue. By measuring the amount of the fatigue-related factors in the cells of the test organism before and after the method is performed, the anti-fatigue power (anti-fatigue effect) in the test organism of the anti-fatigue substance or anti-fatigue method candidate is quantified. Can be measured and evaluated in a targeted manner. Further, both the method and the kit are not only simple, but also have an advantage that they are very easy to handle for both the subject and the practitioner because they do not require a large-scale device or restraint for a long time.

このため、本発明にかかる疲労度評価方法、疲労度評価キットのいずれかを用いて、抗疲労物質候補または抗疲労法候補の抗疲労力（抗疲労効果）を測定する方法も本発明に含まれる。かかる抗疲労物質候補または抗疲労法候補の抗疲労力測定方法は、例えば、
（i） 被験対象生物が抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をする前に当該被験対象生物から採取された細胞中の上記疲労関連因子の量を測定する摂取前上記疲労関連因子量測定工程と、
（ii） 被験対象生物が抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をした後に当該被験対象生物から採取された細胞中の上記疲労関連因子の量を測定する摂取後上記疲労関連因子量測定工程と、
（iii） （i）の摂取前上記疲労関連因子量測定工程、及び（ii）の摂取後上記疲労関連因子量測定工程によって得られた、当該抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施前後における上記疲労関連因子量の変化の測定結果に基づき、当該抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施前後における細胞中の上記疲労関連因子量の変化を算出する上記疲労関連因子量変化算出工程と、
（iv） （iii）の上記疲労関連因子量変化算出工程によって得られた当該抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施前後における細胞中の上記疲労関連因子量変化に基づき、当該抗疲労物質候補または抗疲労法候補の生体における抗疲労力を測定する抗疲労力測定工程と
を含む方法と換言することもできる。 Therefore, the present invention also includes a method of measuring the anti-fatigue force (anti-fatigue effect) of an anti-fatigue substance candidate or an anti-fatigue method candidate by using either the fatigue degree evaluation method or the fatigue degree evaluation kit according to the present invention. Is done. The method for measuring the anti-fatigue force of the anti-fatigue substance candidate or the anti-fatigue method candidate is, for example,
(I) The above-mentioned fatigue-related factors before ingestion to measure the amount of the above-mentioned fatigue-related factors in the cells collected from the subject organism before the subject organism ingests the anti-fatigue substance candidate or implements the anti-fatigue method candidate. The quantity measurement process and
(Ii) Measure the amount of the fatigue-related factor in the cells collected from the test subject organism after ingesting the anti-fatigue substance candidate or implementing the anti-fatigue method candidate. After ingestion, the fatigue-related factor amount. Measurement process and
(Iii) Ingestion of the anti-fatigue substance candidate or implementation of the anti-fatigue method candidate obtained by the fatigue-related factor amount measurement step before ingestion of (i) and the fatigue-related factor amount measurement step after ingestion of (ii). Based on the measurement result of the change in the amount of the fatigue-related factor before and after, the change in the amount of the fatigue-related factor in the cell before and after the intake of the anti-fatigue substance candidate or the implementation of the anti-fatigue method candidate is calculated. Calculation process and
(Iv) The anti-fatigue is based on the change in the amount of the fatigue-related factor in the cells before and after the intake of the anti-fatigue substance candidate or the implementation of the anti-fatigue method candidate obtained by the calculation step of the fatigue-related factor amount change in (iii). It can be paraphrased as a method including an anti-fatigue force measuring step for measuring an anti-fatigue force in a living body of a substance candidate or an anti-fatigue method candidate.

本発明の抗疲労物質候補または抗疲労法候補の抗疲労力を測定する方法においては、さらに、かかる抗疲労物質候補の投与または抗疲労法候補の実施をした被験生物と、当該抗疲労物質候補を投与しなかった、または抗疲労法候補を実施しなかった被験生物において、上記抗疲労力測定方法を実施する方法とすることもできる。 In the method for measuring the anti-fatigue power of the anti-fatigue substance candidate or the anti-fatigue method candidate of the present invention, further, the test organism to which the anti-fatigue substance candidate is administered or the anti-fatigue method candidate is carried out, and the anti-fatigue substance candidate. It is also possible to carry out the above-mentioned anti-fatigue force measuring method in a test organism to which the above-mentioned anti-fatigue method candidate has not been carried out.

被験生物における抗疲労物質候補の摂取方法、または抗疲労法候補の実施方法は、当業者であれば適宜設定可能である。本明細書における「摂取」とは、被験生物における当該物質の飲食品としての摂取のみならず、当該物質の経口投与、及び非経口投与のいずれをも意味する。 The method of ingesting the anti-fatigue substance candidate in the test organism or the method of implementing the anti-fatigue method candidate can be appropriately set by those skilled in the art. As used herein, the term "ingestion" means not only ingestion of the substance as a food or drink in a subject organism, but also oral administration or parenteral administration of the substance.

本明細書における「抗疲労」とは、疲労の回復、抑制、または予防効果を意味する。抗疲労のメカニズムは、結果として疲労を軽減するものであればよく、疲労を予防するものでもよいし、疲労の回復または抑制を促進するものでもよい。抗疲労効果は、抗疲労物質の摂取の他、抗疲労法の実施によってももたらされる。「抗疲労物質」とは、疲労を回復、抑制または予防する効果を有する何らかの方法で体内に摂取可能な分子であり、薬剤、栄養成分、香り成分、気体分子、液体分子、及び生体機能補完物質を含む。「生体機能補完物質」とは、生体のバランスを整える物質を意味し、免疫機能を高める機能を有する物質等を含む。「抗疲労法」とは、疲労を回復、抑制または予防する効果を有する、体操などの運動法、マッサージ、鍼灸などを含む施術、アロマテラピーや催眠術を含む民間療法、寝具などを含む家具、健康器具、照明、エアーコンディショナー、パソコンなどの電化製品を含む抗疲労器具の使用を含む。 As used herein, "anti-fatigue" means a recovery, suppression, or preventive effect of fatigue. The anti-fatigue mechanism may be one that reduces fatigue as a result, may prevent fatigue, or may promote recovery or suppression of fatigue. The anti-fatigue effect is brought about by ingestion of anti-fatigue substances as well as by implementing anti-fatigue methods. An "anti-fatigue substance" is a molecule that can be ingested into the body in some way that has the effect of relieving, suppressing or preventing fatigue, such as drugs, nutritional components, scent components, gas molecules, liquid molecules, and biological function complementary substances. including. The "biological function complementary substance" means a substance that adjusts the balance of the living body, and includes a substance having a function of enhancing an immune function and the like. "Anti-fatigue method" means exercise methods such as gymnastics, massage, treatments including acupuncture and moxibustion, folk remedies including aromatherapy and hypnosis, furniture including bedding, etc., which have the effect of recovering, suppressing or preventing fatigue. Includes the use of anti-fatigue equipment, including appliances such as health appliances, lighting, air conditioners, and personal computers.

また、本発明にかかる疲労度評価方法、疲労度評価キットは、例えば、抗疲労物質や抗疲労法のスクリーニング方法に利用することができる。すなわち、本発明にかかる抗疲労物質や抗疲労法のスクリーニング方法は、上記疲労度評価方法、疲労度評価キットのいずれかを利用して、抗疲労物質や抗疲労法をスクリーニングする方法であればよく、その具体的な方法、条件などは限定されるものではない。 Further, the fatigue degree evaluation method and the fatigue degree evaluation kit according to the present invention can be used, for example, as a screening method for an anti-fatigue substance or an anti-fatigue method. That is, the method for screening an anti-fatigue substance or an anti-fatigue method according to the present invention is a method for screening an anti-fatigue substance or an anti-fatigue method using either the above-mentioned fatigue degree evaluation method or the fatigue degree evaluation kit. Often, the specific method, conditions, etc. are not limited.

上記スクリーニング方法によれば、例えば、抗疲労食品として利用可能と思われる食品を被験生物に経口摂取させて、実際にin vivoで優れた抗疲労能を示す食品を簡便かつ客観的に選択することができる。したがって、上記スクリーニング方法により得られた抗疲労物質や抗疲労食品は、生体における効果が証明されたものであり、市場において高い評価を獲得することができる。抗疲労法も同様にin vivoでの選択が可能で、市場において高い評価を獲得することができる。 According to the above screening method, for example, a food that seems to be usable as an anti-fatigue food is orally ingested by a test organism, and a food that actually exhibits excellent anti-fatigue ability in vivo is simply and objectively selected. Can be done. Therefore, the anti-fatigue substance and the anti-fatigue food obtained by the above screening method have been proved to have an effect in a living body and can be highly evaluated in the market. The anti-fatigue method can also be selected in vivo and can be highly evaluated in the market.

本発明にかかる新規抗疲労物質や新規抗疲労法は、上記スクリーニング方法により取得されたものであればよく、上記のスクリーニング方法により取得された抗疲労物質や抗疲労法も本発明に含まれる。そのような抗疲労物質や抗疲労法は、好ましくは、（i）eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子、eIF-2αリン酸化誘導関連因子または干渉RNA関連因子（すなわち、疲労の発生に関係する因子）のうちの少なくとも一種の発現または機能を阻害し；かつ／あるいは（ii）eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子（すなわち、疲労の回復または抑制に関係する因子）のうちの少なくとも一種の発現または機能を増強することによって抗疲労効果を発揮することができる。 The novel anti-fatigue substance and the novel anti-fatigue method according to the present invention may be those obtained by the above screening method, and the anti-fatigue substance and the anti-fatigue method obtained by the above screening method are also included in the present invention. Such anti-fatigue substances and anti-fatigue methods preferably include (i) eIF-2α phosphorylation signaling factors, eIF-2α phosphorylation induction-related factors or interfering RNA-related factors (ie, factors involved in the development of fatigue). ) And / or (ii) expression or function of at least one of the eIF-2α phosphorylation signal suppressors (ie, factors involved in recovery or suppression of fatigue). It is possible to exert an anti-fatigue effect by enhancing.

抗疲労効果は、好ましくは、eIF-2αリン酸化が関係するシグナル伝達経路の効果を抑制することによって発揮され、例えば、eIF-2αのリン酸化を阻害する、eIF-2αの脱リン酸化を促進する、またはeIF-2αリン酸化によって誘導されるシグナル伝達経路の活性を抑制することによって発揮される。したがって、本発明にかかる抗疲労物質や抗疲労法の抗疲労効果の強さは、当該抗疲労物質や抗疲労法による、eIF-2αのリン酸化が関係するシグナル伝達経路の効果を抑制する効果の強さを指標として評価することができる。そのような効果を発揮する抗疲労物質は抗疲労剤として有用であり得、例えば、eIF-2αのリン酸化によって誘導されるシグナル伝達経路の活性を抑制する物質（eIF-2αリン酸化シグナル阻害剤）であるISRIB、eIF-2αのリン酸化を阻害する物質（eIF-2αリン酸化阻害剤）であるGSK2606414等を挙げることができるが、eIF-2αのリン酸化が関係するシグナル伝達経路の効果を抑制する物質を有効成分として含有する限りにおいて特に限定されない。 The anti-fatigue effect is preferably exerted by suppressing the effects of signal transduction pathways involving eIF-2α phosphorylation, for example promoting dephosphorylation of eIF-2α, which inhibits phosphorylation of eIF-2α. Or by suppressing the activity of signaling pathways induced by eIF-2α phosphorylation. Therefore, the strength of the anti-fatigue effect of the anti-fatigue substance and the anti-fatigue method according to the present invention is the effect of suppressing the effect of the signal transduction pathway related to the phosphorylation of eIF-2α by the anti-fatigue substance and the anti-fatigue method. Can be evaluated using the strength of. Anti-fatigue substances that exert such effects can be useful as anti-fatigue agents, for example, substances that suppress the activity of signal transduction pathways induced by phosphorylation of eIF-2α (eIF-2α phosphorylation signal inhibitors). ), ISRIB, GSK2606414, which is a substance that inhibits phosphorylation of eIF-2α (eIF-2α phosphorylation inhibitor), etc., but the effect of the signal transduction pathway related to phosphorylation of eIF-2α can be mentioned. There is no particular limitation as long as the inhibitory substance is contained as an active ingredient.

また、本発明は、eIF-2αのリン酸化が関係するシグナル伝達経路の効果を抑制する（例えば、eIF-2αのリン酸化を阻害する、eIF-2αの脱リン酸化を促進する、またはeIF-2αリン酸化によって誘導されるシグナル伝達経路の活性を抑制する）効果を発揮する抗疲労物質を摂取するかまたは当該効果を発揮する抗疲労法を実施する工程を含む、疲労を軽減する（疲労を回復させるかまたは抑制する）方法にも関する。本発明にかかる抗疲労物質や抗疲労法、および本発明にかかる疲労を軽減する（疲労を回復させるかまたは抑制する）方法が対象とする疲労は、好ましくは、生理的疲労を含むnonpathological fatigue、すなわち末梢臓器や末梢組織に原因がある疲労であり、例えば、睡眠不足による精神疲労または肉体疲労が挙げられる。 The present invention also suppresses the effects of signal transduction pathways involving phosphorylation of eIF-2α (eg, inhibits phosphorylation of eIF-2α, promotes dephosphorylation of eIF-2α, or eIF-. Reducing fatigue (reducing fatigue), including the step of ingesting an anti-fatigue substance that exerts an effect (suppressing the activity of signal transduction pathways induced by 2α phosphorylation) or implementing an anti-fatigue method that exerts that effect. It also concerns how to recover or suppress). The fatigue targeted by the anti-fatigue substance and anti-fatigue method according to the present invention and the method for reducing (recovering or suppressing fatigue) according to the present invention is preferably nonpathological fatigue, including physiological fatigue. That is, fatigue caused by peripheral organs and tissues, and examples thereof include mental fatigue or physical fatigue due to lack of sleep.

また、疲労が社会問題化されるにつれて、抗疲労機能を謳った抗疲労物質、抗疲労食品、抗疲労法が種類、数量とともに増加してきており、これらの食品や方法の抗疲労力を適切に評価する方法の開発も強く求められているが、本発明にかかる疲労度評価方法、疲労度評価キットおよびその利用法によれば、この要求にも応えることができる。 In addition, as fatigue becomes a social problem, anti-fatigue substances, anti-fatigue foods, and anti-fatigue methods that claim anti-fatigue function are increasing with the type and quantity, and the anti-fatigue power of these foods and methods is appropriately adjusted. The development of an evaluation method is also strongly demanded, but according to the fatigue degree evaluation method, the fatigue degree evaluation kit and the usage method thereof according to the present invention, this requirement can be met.

さらに、本発明で示される疲労度評価方法は、nonpathological fatigueとpathological fatigueとを判別する方法（疲労の質を評価する方法）、すなわち、疲労現象の原因が末梢にあるか脳や精神的なものにあるかを判別する方法として利用することができる。また、当該方法をVASなどの自覚的疲労度の測定と組合せることによって、健常者におけるうつ状態を検出することが可能であり、労働者のメンタルヘルスやメンタルケアにおける簡便で客観的な評価方法となる。 Further, the fatigue degree evaluation method shown in the present invention is a method for discriminating between nonpathological fatigue and pathological fatigue (method for evaluating the quality of fatigue), that is, whether the cause of the fatigue phenomenon is peripheral or brain or mental. It can be used as a method of determining whether or not it is present. In addition, by combining this method with the measurement of subjective fatigue level such as VAS, it is possible to detect the depressed state in a healthy person, and it is a simple and objective evaluation method in the mental health and mental care of workers. It becomes.

以下、添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。 Hereinafter, examples will be shown with reference to the attached drawings, and embodiments of the present invention will be described in more detail. Of course, the present invention is not limited to the following examples, and it goes without saying that various aspects are possible for details. Further, the present invention is not limited to the above-described embodiment, and various modifications can be made, and embodiments obtained by appropriately combining the disclosed technical means are also included in the technical scope of the present invention. ..

本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。 All prior art references cited herein are incorporated herein by reference.

マウスに疲労負荷を与えることによって、肝臓細胞のeIF-2αのリン酸化とその関連因子の変化を検討した。 We investigated the phosphorylation of eIF-2α in liver cells and changes in related factors by applying a fatigue load to mice.

（１）方法
水を1cm張ったケージにマウス(C57BL/6NCrSlc)を24時間置いた。負荷直後のマウス及び対照群として負荷を与えていないマウスから肝臓を摘出し、凍結した。Cell Lysateの中で肝臓を超音波破砕し、そのライセートをUltra-15 遠心式フィルターユニット Ultracel-100 (MILLIPORE)にて遠心、flow throughをUltra-15 遠心式フィルターユニット Ultracel-30 (MILLIPORE)にて遠心し、ライセートを濃縮した。ライセートをSDS-PAGEで分離し、PKR (phospho T451) antibody (ab4818) (abcam) (希釈倍率：1/1000), Anti-PKR antibody [YE350] (ab32052) (abcam) (希釈倍率：1/1000), Phospho-eIF-2α(Ser51) (119A11) antibody (Cell Signaling) (希釈倍率：1/1000), Anti-EIF2S1 (Bio Matrix Research Inc) (希釈倍率：1/100), Anti-ATF4 antibody (ProteinTech Group, Inc) (希釈倍率：1/100), Anti-ACTB (Bio Matrix Research Inc) (希釈倍率：1/200)を1次抗体として、VECTASTAIN ABC キット (VECTOR)を利用して、X線フィルムで検出した。X線フィルム画像における各バンドのdensityをImageJ 1.38(National Institutes of Health)にて定量化した。 (1) Method A mouse (C57BL / 6NCrSlc) was placed in a cage filled with 1 cm of water for 24 hours. Livers were removed from mice immediately after loading and mice not loaded as a control group and frozen. Ultrasonically crush the liver in Cell Lysate, centrifuge the lysate with the Ultra-15 centrifugal filter unit Ultracel-100 (MILLIPORE), and flow through with the Ultra-15 centrifugal filter unit Ultracel-30 (MILLIPORE). Centrifugal and concentrated lysate. The lysate was separated by SDS-PAGE, and PKR (phospho T451) antibody (ab4818) (abcam) (dilution ratio: 1/1000), Anti-PKR antibody [YE350] (ab32052) (abcam) (dilution ratio: 1/1000). ), Phospho-eIF-2α (Ser51) (119A11) antibody (Cell Signaling) (dilution ratio: 1/1000), Anti-EIF2S1 (Bio Matrix Research Inc) (dilution ratio: 1/100), Anti-ATF4 antibody ( X-ray using VECTASTAIN ABC kit (VECTOR) with ProteinTech Group, Inc) (dilution ratio: 1/100), Anti-ACTB (Bio Matrix Research Inc) (dilution ratio: 1/200) as the primary antibody. Detected on film. The density of each band in the X-ray film image was quantified by ImageJ 1.38 (National Institutes of Health).

（２）結果
24時間の疲労負荷によって、肝臓細胞のeIF-2αのリン酸化（図１中、P-eIF2）とeIF-2αのリン酸化によって誘導されるシグナル因子であるATF4の産生が亢進することが判った。eIF-2αのリン酸化の亢進の原因には、小胞体ストレス、紫外線刺激、酸化ストレスなどの要因が挙げられるが、Protein kinase RNA-activated (PKR)のリン酸化（図１中、P-PKR）が同時に観察されたことから、何らかのRNAがeIF-2αのリン酸化に関与していることが示された（図１）。
疲労は生体の危険を知らせるアラームであると考えられているが、その内容は、生体の働き過ぎや休息不足を知らせ、生体に「休め」と指令するシグナルである。eIF-2αのリン酸化は、細胞のタンパク合成を強制的に停止させる「休め」のシグナルであり、疲労シグナルが細胞レベルでも発揮されるというこの発見は、疲労の概念と良く一致しており、疲労の根元をなすものと考えられる。 (2) Result
It was found that 24-hour fatigue loading enhances the phosphorylation of eIF-2α in liver cells (P-eIF2 in FIG. 1) and the production of ATF4, which is a signaling factor induced by the phosphorylation of eIF-2α. .. Factors such as endoplasmic reticulum stress, UV stimulation, and oxidative stress can be cited as causes of enhanced phosphorylation of eIF-2α. Phosphorylation of Protein kinase RNA-activated (PKR) (P-PKR in FIG. 1). Was observed at the same time, indicating that some RNA is involved in the phosphorylation of eIF-2α (Fig. 1).
Fatigue is considered to be an alarm that signals the danger of the living body, but its content is a signal that informs the living body of overwork and lack of rest and commands the living body to "rest". The finding that phosphorylation of eIF-2α is a "rest" signal that forces cell protein synthesis to stop, and that fatigue signals are also exerted at the cellular level, is in good agreement with the concept of fatigue. It is thought to be the root of fatigue.

マウスの不眠モデルを用いて、不眠による精神的疲労による臓器中のATF3の増加を測定した。 A mouse insomnia model was used to measure the increase in ATF3 in organs due to mental fatigue due to insomnia.

（１）方法
水を1cm張ったケージにマウス(C57BL/6NCrSlc)を置き、負荷直後のマウス（4h, 6h, 8h, 12h, 24h, 36h負荷）及び対照群として負荷を与えていないマウス（0h）から経時的に臓器を摘出(n=2～14)し、凍結した。凍結した臓器をホモジナイズし、BioRobot EZ1 workstationとEZ1 RNA Universal Tissue Kit (QIAGEN, Inc.)を用いてRNAを精製し、PrimeScript RT reagent Kit (Takara Bio, Inc.)を用いてcDNA を合成した。ATF3、GAPDHのmRNAをApplied Biosystems 7300 real-time PCR System (Applied Biosystems)を利用して測定した。測定はduplicateで下記の条件で行った。
リアルタイムPCR条件：FastStart TaqMan Probe Master (ROX) (Roche Diagnostics) 12.5 μl、PCR forward primer (100 μM) 0.225 μl、PCR reverse primer (100 μM) 0.225 μl、TaqManプローブ (10 μM) 0.625 μl、cDNA 2 μl、PCR-grade water 9.425 μlの計25 μl。初期ステップ 95℃ 10 分、次に95℃ 10秒、60℃ 31 秒を45 サイクル。
プローブ及びプライマーの配列は下記の通り。
ATF3 probe, 5'-FAM- CGCCTCAGACTTGGTGACTGACATCTCCA-TAMRA-3'（配列番号：１）
ATF3 forward primer, 5'- AGTCAGTTACCGTCAACAACAGA- 3'（配列番号：２）
ATF3 reverse primer, 5'- CCGCCTCCTTTTCCTCTCATC- 3'（配列番号：３）
GAPDH probe, 5'-FAM- TGGTCACCAGGGCTGCCATTTGCA-TAMRA-3'（配列番号：４）
GAPDH forward primer, 5'- TGAAGGTCGGTGTGAACGG- 3'（配列番号：５）
GAPDH reverse primer, 5'- CCATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG- 3'（配列番号：６）
データの解析はSequence Detection Software version 1.4 (Applied Biosystems)を用いた。図の値は平均±標準誤差で示した。 (1) Method Place mice (C57BL / 6NCrSlc) in a cage filled with 1 cm of water, mice immediately after loading (4h, 6h, 8h, 12h, 24h, 36h loaded) and mice not loaded as a control group (0h). ), The organ was removed over time (n = 2-14) and frozen. Frozen organs were homogenized, RNA was purified using the BioRobot EZ1 workstation and EZ1 RNA Universal Tissue Kit (QIAGEN, Inc.), and cDNA was synthesized using the PrimeScript RT reagent Kit (Takara Bio, Inc.). ATF3 and GAPDH mRNA were measured using Applied Biosystems 7300 real-time PCR System (Applied Biosystems). The measurement was duplicated under the following conditions.
Real-time PCR conditions: FastStart TaqMan Probe Master (ROX) (Roche Diagnostics) 12.5 μl, PCR forward primer (100 μM) 0.225 μl, PCR reverse primer (100 μM) 0.225 μl, TaqMan probe (10 μM) 0.625 μl, cDNA 2 μl , PCR-grade water 9.425 μl for a total of 25 μl. Initial step 95 ° C for 10 minutes, then 95 ° C for 10 seconds, 60 ° C for 31 seconds for 45 cycles.
The sequences of probes and primers are as follows.
ATF3 probe, 5'-FAM- CGCCTCAGACTTGGTGACTGACATCTCCA-TAMRA-3' (SEQ ID NO: 1)
ATF3 forward primer, 5'-AGTCAGTTACCGTCAACAACAGA-3'(SEQ ID NO: 2)
ATF3 reverse primer, 5'-CCCGCCTCCTTTTCCTCTCATC-3'(SEQ ID NO: 3)
GAPDH probe, 5'-FAM- TGGTCACCAGGGCTGCCATTTGCA-TAMRA-3' (SEQ ID NO: 4)
GAPDH forward primer, 5'-TGAAGGTCGGTGTGAACGG-3'(SEQ ID NO: 5)
GAPDH reverse primer, 5'-CCATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG-3' (SEQ ID NO: 6)
Sequence Detection Software version 1.4 (Applied Biosystems) was used for data analysis. The values in the figure are shown as mean ± standard error.

（２）結果
ATF3は、8時間程度の不眠においても増加し、日常的に経験する精神的な労働の疲労の測定に利用可能であることがわかった。また、ATF3の増加は、脳、筋肉、心臓、肝臓と多岐にわたり、これらの臓器における疲労の度合いを個別に評価できることがわかった (図２)。 (2) Result
It was found that ATF3 increased even after about 8 hours of insomnia and could be used to measure the mental labor fatigue experienced on a daily basis. It was also found that the increase in ATF3 was wide-ranging in the brain, muscles, heart, and liver, and the degree of fatigue in these organs could be evaluated individually (Fig. 2).

マウスの強制水泳モデルを用いて、肉体疲労直後と休息後の各種臓器でのATF3の増加を測定した。 Using a mouse forced swimming model, we measured the increase in ATF3 in various organs immediately after physical fatigue and after rest.

（１）方法
足が着かない程の充分な深さの水を張ったプール(直径22cm)でマウス(C57BL/6NCrSlc)を強制的に泳がせ、負荷直後のマウス（30分, 1時間, 2時間負荷）及び対照群として負荷を与えていないマウス（0時間）から経時的に臓器を摘出(n=2～12)し、凍結した。さらに、強制水泳（FS）を2時間行った後、通常のケージで2時間休息を与えた後に臓器を摘出し、凍結した（図３中、FS 2h + 休息2h）。実施例2で示した実験と同様の方法で、ATF3、GAPDHのmRNAをTaqMan PCR法にて定量した。図の値は平均±標準誤差で示した。 (1) Method Forcibly swim the mouse (C57BL / 6NCrSlc) in a pool (22 cm in diameter) filled with water deep enough to prevent the feet from reaching, and immediately after loading the mouse (30 minutes, 1 hour, 2 hours). Organs were removed (n = 2-12) over time from mice (loaded) and unloaded mice (0 hours) as a control group and frozen. Furthermore, after performing forced swimming (FS) for 2 hours, the organs were removed and frozen after being rested for 2 hours in a normal cage (FS 2h + rest 2h in Fig. 3). ATF3 and GAPDH mRNA were quantified by the TaqMan PCR method in the same manner as in the experiment shown in Example 2. The values in the figure are shown as mean ± standard error.

（２）結果
水泳1時間および2時間において、脳、筋肉、心臓、肝臓といった様々な臓器で、ATF3の増加が観察された。また、2時間程度の休息によって、ATF3は急速に減少した。このことは、ATF3の測定によって各種臓器における肉体疲労と回復が定量的に測定可能であることを示している。また、この疲労モデルにおける水泳は、重りなどの負荷をかけていない状態で行っているため、日常の運動負荷のレベルを逸脱しない疲労負荷であると考えられる(図３)。 (2) Results An increase in ATF3 was observed in various organs such as the brain, muscles, heart, and liver during 1 and 2 hours of swimming. In addition, ATF3 decreased rapidly after resting for about 2 hours. This indicates that physical fatigue and recovery in various organs can be quantitatively measured by measuring ATF3. In addition, since swimming in this fatigue model is performed without applying a load such as a weight, it is considered that the swimming is a fatigue load that does not deviate from the level of daily exercise load (Fig. 3).

ヒトの末梢血検体を使用して、ATF3による疲労測定を行った。 Fatigue was measured by ATF3 using human peripheral blood samples.

（１）方法
健常者(n=2)にサイクルエルゴメーター (Aerobike 75XL2 ME; Combi Wellness Co.)を用いて、無酸素性作業閾値 (Anaerobics Threshold;AT）80%の強度で自転車漕ぎを4 時間行った。負荷前後に血液をPAXgene Blood RNA 採血管 (日本BD)に採取した。血液RNAをPAXgene Blood RNA Kit (QIAGEN, Inc.)を用いて精製し、PrimeScript RT reagent Kit (Takara Bio, Inc.)を用いて、cDNA を合成した。血液中ATF3とβ-アクチンのmRNAをApplied Biosystems QuantStudio real-time PCR System (Applied Biosystems)を用いて、TaqMan Arrayで以下条件のduplicateで定量した。プローブ、プライマーセット：ATF3 (Hs00231069_m1), ACTB (Hs01060665_g1); 1 portあたり、TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems) 50 μl、cDNA 10 μl、PCR-grade water 40 μl。PCR条件: 初期ステップ：50℃ 2分、次に95℃ 10 分、95℃ 15 秒、60℃ 1 分を40サイクル。データの解析はExpressionSuite Software version v1.0.3 (Applied Biosystems)を用いた。図の値は平均±標準誤差で示した。 (1) Method Using a cycle ergometer (Aerobike 75XL2 ME; Combi Wellness Co.) for a healthy person (n = 2), ride a bicycle for 4 hours at an intensity of 80% anaerobics threshold (AT). went. Blood was collected in the PAX gene Blood RNA collection tube (Japan BD) before and after loading. Blood RNA was purified using the PAX gene Blood RNA Kit (QIAGEN, Inc.), and cDNA was synthesized using the PrimeScript RT reagent Kit (Takara Bio, Inc.). Blood ATF3 and β-actin mRNAs were quantified by TaqMan Array using Applied Biosystems QuantStudio real-time PCR System (Applied Biosystems) under the following conditions. Probe, primer set: ATF3 (Hs00231069_m1), ACTB (Hs01060665_g1); TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems) 50 μl, cDNA 10 μl, PCR-grade water 40 μl per port. PCR conditions: Initial step: 50 ° C for 2 minutes, then 95 ° C for 10 minutes, 95 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 1 minute for 40 cycles. Expression Suite Software version v1.0.3 (Applied Biosystems) was used for data analysis. The values in the figure are shown as mean ± standard error.

（２）結果
運動疲労負荷によってヒトの末梢血検体中のATF3が増加していることが確認された。これにより、ヒトの末梢血液を利用した検査において、ATF3による疲労測定が可能であることが示された(図４)。 (2) Results It was confirmed that ATF3 in human peripheral blood samples increased due to exercise fatigue load. This showed that fatigue can be measured by ATF3 in a test using human peripheral blood (Fig. 4).

マウスの不眠モデルを用いた不眠による精神的疲労と強制水泳モデルを用いた肉体疲労を、肝臓中のCHOPの発現増加によって測定した。 Mental fatigue due to insomnia using a mouse insomnia model and physical fatigue using a forced swimming model were measured by increased expression of CHOP in the liver.

（１）方法
実施例２及び３で示した実験と同様の方法で、疲労負荷をかけたマウス肝臓(n=2～4)でのCHOP及びGAPDHのmRNAを定量した。プローブ及びプライマーの配列は下記の通り。
CHOP probe, 5'-FAM-TCCTCTGTCAGCCAAGCTAGGGACGC-TAMRA-3'（配列番号：７）
CHOP forward primer, 5'-CCTATATCTCATCCCCAGGAAACG- 3'（配列番号：８）
CHOP reverse primer, 5'-TGTGCGTGTGACCTCTGTTG- 3'（配列番号：９）
図の値は平均±標準誤差で示した。 (1) Method The mRNAs of CHOP and GAPDH in mouse livers (n = 2 to 4) subjected to fatigue loading were quantified by the same method as the experiments shown in Examples 2 and 3. The sequences of probes and primers are as follows.
CHOP probe, 5'-FAM-TCCTCTGTCAGCCAAGCTAGGGACGC-TAMRA-3' (SEQ ID NO: 7)
CHOP forward primer, 5'-CCTATATCTCATCCCCAGGAAACG-3'(SEQ ID NO: 8)
CHOP reverse primer, 5'-TGTGCGTGTGACCTCTGTTG-3'(SEQ ID NO: 9)
The values in the figure are shown as mean ± standard error.

（２）結果
水泳2時間（図５左側グラフにおけるFS 2h）ならびに不眠8時間および24時間（図５右側グラフにおける8hおよび24h）において、肝臓におけるCHOP発現量の増加が観察された。このことは、CHOP発現量の測定によって臓器における肉体疲労と精神疲労が定量的に測定可能であることを示している (図５)。 (2) Results Increased CHOP expression in the liver was observed at 2 hours of swimming (FS 2h in the graph on the left side of FIG. 5) and 8 hours and 24 hours of insomnia (8h and 24h in the graph on the right side of FIG. 5). This indicates that physical fatigue and mental fatigue in organs can be quantitatively measured by measuring the expression level of CHOP (Fig. 5).

ヒトの末梢血検体を使用して、CHOPによる疲労測定を行った。 Fatigue was measured by CHOP using human peripheral blood samples.

（１）方法
実施例４で示した実験と同様の方法で、自転車漕ぎ負荷前後(n=2)の血液中CHOP(プローブ、プライマーセット：Hs00358796_g1)及びACTBのmRNAを測定した。図の値は平均±標準誤差で示した。 (1) Method The mRNAs of CHOP (probe, primer set: Hs00358796_g1) and ACTB in blood before and after the bicycle rowing load (n = 2) were measured by the same method as the experiment shown in Example 4. The values in the figure are shown as mean ± standard error.

（２）結果
運動疲労負荷によってヒトの末梢血検体中のCHOP発現量が増加していることが確認された。これにより、ヒトの末梢血液を利用した検査において、CHOPによる疲労測定が可能であることが示された(図６)。 (2) Results It was confirmed that the CHOP expression level in human peripheral blood samples increased due to exercise fatigue load. This showed that it is possible to measure fatigue by CHOP in a test using human peripheral blood (Fig. 6).

ATF3によって疲労が誘導されることを確認した。 It was confirmed that ATF3 induces fatigue.

（１）方法
i) ATF3発現プラスミドベクターの構築
Codon Usageをマウスに最適化したマウスATF3(Mm ATF3)の合成遺伝子（Mm ATF3-opt（配列番号：６４））を作製し、GFPコード領域を除去したpEGFP-N1発現ベクター（pEGFP(-)-N1）に組み込み、得られたプラスミドをMm ATF3-opt/ pEGFP(-)-N1とした。 (1) Method
i) Construction of ATF3 expression plasmid vector
A pEGFP-N1 expression vector (pEGFP (-)- It was integrated into N1), and the obtained plasmid was designated as Mm ATF3-opt / pEGFP (-)-N1.

ii) Hydrodynamic delivery systemによるATF3の生体内一過性発現
マウスの生体内でATF3を一過性発現させるために、TransIT(r) Hydrodynamic Delivery System（TaKaRa）を使用した。方法は標準プロトコールに従った。ATF3発現プラスミドはMm ATF3-opt/ pEGFP(-)-N1を使用した。 ii) Transient expression of ATF3 in vivo by Hydrodynamic delivery system TransIT (r) Hydrodynamic Delivery System (TaKaRa) was used to transiently express ATF3 in vivo in mice. The method followed the standard protocol. As the ATF3 expression plasmid, Mm ATF3-opt / pEGFP (-)-N1 was used.

iii) ATF3生体内一過性発現マウスの行動試験
ATF3発現プラスミドMm ATF3-opt/ pEGFP(-)-N1のマウス生体内投与から0, 4, 8, 16時間後に10分間のオープンフィールド試験を行い、移動距離をTopScan（CleverSys社）で測定した。統計学的有意（*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001）はWelch's t testを用いて算出した。 iii) Behavioral test of ATF3 transiently expressed mice in vivo
A 10-minute open field test was performed 0, 4, 8, 16 hours after in vivo administration of the ATF3 expression plasmid Mm ATF3-opt / pEGFP (-)-N1 to mice, and the distance traveled was measured by TopScan (CleverSys). Statistical significance (* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001) was calculated using Welch's t test.

（２）結果
ATF3発現マウスはプラスミド導入後4, 8時間で自発行動が有意に低下し、導入後16時間で自発運動量の回復が観察された。従って、ATF3の発現によってマウスには疲労が生じ、脳が疲労感を感じ、このために自発運動が低下したことが示された。また、ATF3によって誘導された疲労は短時間で回復し、生理的疲労の特徴を有していることが示された(図７)。 (2) Result
In ATF3-expressing mice, spontaneous activity was significantly reduced 4 to 8 hours after the introduction of the plasmid, and recovery of locomotor activity was observed 16 hours after the introduction. Therefore, it was shown that the expression of ATF3 caused fatigue in the mice, and the brain felt tired, which resulted in decreased locomotor activity. It was also shown that the fatigue induced by ATF3 recovered in a short time and had the characteristics of physiological fatigue (Fig. 7).

ATF3特異的な干渉RNAによるATF3の発現抑制によって疲労が軽減されるかどうかを検討した。 We investigated whether suppression of ATF3 expression by ATF3-specific interfering RNA reduced fatigue.

（１）方法
マウス(C57BL/6NCrSlc)を回転滑車付きケージ (日本クレア)にて飼育した。滑車の回転数は1回転を3カウントとして、コンピューターシステム(日本クレア)により記録した。午前中にATF3に対するStealth RNAi siRNA (MSS273298) (Life Technologies) 40 μgとTKプロモーターで発現するLuciferase発現ベクター(pLuc-TK) 1μgをTransIT-QR Hydrodynamic Delivery Solution (Mirus Bio LCC.)を利用して、ハイドロダイナミック法で導入した(n=6)。対照として、発現抑制効果を認めないStealth RNAi siRNA Negative Control Hi GC (12935-400) 40 μg (Life Technologies)とpLuc-TK 1μgを導入した(n=2)。導入後、水を1cm張ったケージにマウスを8時間置いた後に、回転ケージに戻し、自発運動量を測定した。負荷当日の夜間運動量を前日との比率で算出した。自発運動測定後、マウスから肝臓を摘出、超音波破砕し、Luciferase Reporter Assay System (Promega)により、Luciferase活性を測定した。Luciferase活性を認めないマウスはハイドロダイナミック法による遺伝子導入に失敗したものとして解析から除いた。図の値は平均±標準誤差で示した(図８)。 (1) Method Mice (C57BL / 6NCrSlc) were bred in a cage with a rotary pulley (Claire Japan). The number of revolutions of the pulley was recorded by a computer system (Claire Japan) with 1 revolution as 3 counts. In the morning, use Stealth RNAi siRNA (MSS273298) (Life Technologies) 40 μg for ATF3 and 1 μg of Luciferase expression vector (pLuc-TK) expressed by the TK promoter using TransIT-QR Hydrodynamic Delivery Solution (Mirus Bio LCC.). Introduced by the hydrodynamic method (n = 6). As a control, 40 μg (Life Technologies) of Stealth RNAi siRNA Negative Control Hi GC (12935-400) and 1 μg of pLuc-TK were introduced (n = 2). After the introduction, the mice were placed in a cage filled with 1 cm of water for 8 hours, and then returned to the rotating cage to measure the locomotor activity. The amount of night exercise on the day of the load was calculated as a ratio to the previous day. After the measurement of locomotor activity, the liver was removed from the mouse, ultrasonically disrupted, and the Luciferase activity was measured by the Luciferase Reporter Assay System (Promega). Mice lacking Luciferase activity were excluded from the analysis as having failed gene transfer by the hydrodynamic method. The values in the figure are shown as mean ± standard error (Fig. 8).

（２）結果
マウスの自発運動量を測定した結果、ATF3に対する特異的な干渉RNA(siRNA)を導入したものにおいて自発運動量が多いことがわかった。この結果は、ATF3の産生を阻害すると疲労が抑制されることを示しており、疲労の本態においてATF3が重要な働きをしていることを示している(図８)。 (2) Results As a result of measuring the locomotor activity of mice, it was found that the locomotor activity was high in the one in which the specific interfering RNA (siRNA) to ATF3 was introduced. This result indicates that inhibition of ATF3 production suppresses fatigue, indicating that ATF3 plays an important role in the nature of fatigue (Fig. 8).

ATF3導入による疲労関連因子の変化を観察した。 We observed changes in fatigue-related factors due to the introduction of ATF3.

（１）方法
実施例７と同様のMm ATF3-opt/ pEGFP(-)-N1のHydrodynamic Delivery Systemによる生体内形質転換後0, 4, 8, 16時間のマウス各4匹の肝臓を採取し、ATF3および炎症関連因子の遺伝子発現量を比較した。図９は、A) 内在性ATF3の遺伝子発現、B) 炎症性サイトカインIL-1βの遺伝子発現、C)炎症性サイトカインIL-6の遺伝子発現、D)炎症性サイトカインTNF-αの遺伝子発現をそれぞれ示している。棒グラフは平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。統計学的有意（*p<0.05）はWelch's t testを用いて算出した。
プライマー、プローブの配列は、以下の通り。
ATF3：
Probe: 5'-TCCTCAATCTGGGCCTTCAGCTCAGCAT-3'（配列番号：１０）
Primer-F : 5'-TGTCGAAACAAGAAAAAGGAGAAGA-3'（配列番号：１１）
Primer-R: 5'-GCAGGTTGAGCATGTATATCAAATG-3'（配列番号：１２）
IL-1β：
Probe; 5'-TGCTCTCATCAGGACAGCCCAGGTCA-3'（配列番号：１３）
Primer-F: 5'-CCTGAACTCAACTGTGAAATGCC-3'（配列番号：１４）
Primer-R: 5'-CTGCTGCGAGATTTGAAGCTG-3'（配列番号：１５）
IL-6：
Probe: 5'-ACCACTCCCAACAGACCTGTCTATACCACT-3'（配列番号：１６）
Primer-F: 5'-CCGGAGAGGAGACTTCACAGA-3'（配列番号：１７）
Primer-R: 5'-GTTGTTCATACAATCAGAATTGCCATT-3'（配列番号：１８）
TNF-α：
Probe: 5'-ATTCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCACG-3'（配列番号：１９）
Primer-F: 5'-CCAGACCCTCACACTCAGATCAT-3'（配列番号：２０）
Primer-R: 5'-CCTCCACTTGGTGGTTTGCTAC-3'（配列番号：２１） (1) Method The livers of 4 mice each 0, 4, 8, 16 hours after in vivo transformation of Mm ATF3-opt / pEGFP (-)-N1 by the Hydrodynamic Delivery System in the same manner as in Example 7 were collected. The gene expression levels of ATF3 and inflammation-related factors were compared. FIG. 9 shows A) gene expression of endogenous ATF3, B) gene expression of inflammatory cytokine IL-1β, C) gene expression of inflammatory cytokine IL-6, and D) gene expression of inflammatory cytokine TNF-α, respectively. Shows. The bar graph shows the mean value and the error bars show the standard error. Statistical significance (* p <0.05) was calculated using Welch's t test.
The sequence of primers and probes is as follows.
ATF3:
Probe: 5'-TCCTCAATCTGGGCCTTCAGCTCAGCAT-3' (SEQ ID NO: 10)
Primer-F: 5'-TGTCGAAACAAGAAAAAGGAGAAGA-3' (SEQ ID NO: 11)
Primer-R: 5'-GCAGGTTGAGCATGTATATCAAATG-3'(SEQ ID NO: 12)
IL-1β:
Probe; 5'-TGCTCTCATCAGGACAGCCCAGGTCA-3' (SEQ ID NO: 13)
Primer-F: 5'-CCTGAACTCAACTGTGAAATGCC-3' (SEQ ID NO: 14)
Primer-R: 5'-CTGCTGCGAGATTTGAAGCTG-3'(SEQ ID NO: 15)
IL-6:
Probe: 5'-ACCACTCCCAACAGACCTGTCTATACCACT-3' (SEQ ID NO: 16)
Primer-F: 5'-CCGGAGAGGAGACTTCACAGA-3' (SEQ ID NO: 17)
Primer-R: 5'-GTTGTTCATACAATCAGAATTGCCATT-3' (SEQ ID NO: 18)
TNF-α:
Probe: 5'-ATTCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCACG-3' (SEQ ID NO: 19)
Primer-F: 5'-CCAGACCCTCACACTCAGATCAT-3'(SEQ ID NO: 20)
Primer-R: 5'-CCTCCACTTGGTGGTTTGCTAC-3'(SEQ ID NO: 21)

（２）結果
ATF3-optとマウスの内在性ATF3は、タンパクのアミノ酸配列は同じであるが、DNAの塩基配列が異なるため、Real-time PCR法によって、ATF3がATF3を誘導する能力があるかどうかを検討することが可能である。この検討の結果、図８Aに示される様に、ATF3がATF3の発現を誘導することと、その効果が比較的短時間であることが判った。このことは、ATF3がポジティブ・フィードバックによって一時的に大きなATF3発現誘導効果を発揮するものの、その効果は速やかに解消され、疲労が短時間で回復するという生理的疲労としての性質を有していることを示している。 (2) Result
Since ATF3-opt and mouse endogenous ATF3 have the same amino acid sequence of protein but different base sequences of DNA, we will examine whether ATF3 has the ability to induce ATF3 by Real-time PCR method. It is possible. As a result of this study, it was found that ATF3 induces the expression of ATF3 and its effect is relatively short, as shown in FIG. 8A. This means that although ATF3 temporarily exerts a large effect of inducing ATF3 expression by positive feedback, the effect is quickly eliminated and fatigue recovers in a short time, which is a property of physiological fatigue. It is shown that.

また、疲労を脳に伝え、疲労感を発生させると考えられている炎症性サイトカインに関しては、ATF3が関与する生理的疲労では、TNF-αが主として働いていることが判った。また、CFSの疲労感において主要な働きをすると考えられているIL-1βやIL-6は、むしろ低下していることが判った。ATF3は、IL-1βやIL-6に関しては抑制的に働くことが知られており、CFSにおける慢性的に持続する疲労の原因となるIL-1βやIL-6を抑制することで、生理的疲労の特徴である易回復性や可逆性をもたらしていると考えられる(図９)。 In addition, regarding inflammatory cytokines that are thought to transmit fatigue to the brain and cause a feeling of fatigue, it was found that TNF-α mainly works in physiological fatigue involving ATF3. It was also found that IL-1β and IL-6, which are considered to play a major role in the fatigue of CFS, are rather decreased. ATF3 is known to act suppressively on IL-1β and IL-6, and by suppressing IL-1β and IL-6, which cause chronic and persistent fatigue in CFS, it is physiological. It is considered to bring about the easy recovery and reversibility that are the characteristics of fatigue (Fig. 9).

全身的な生理的疲労の原因となる疲労物質はこれまでに同定されていなかった。疲労物質は、生体の働き過ぎや休息不足を生体に知らせるアラームであるので、疲労のアラームのトリガーは、生命活動によって生体内に蓄積される老廃物または代謝物であると考えられる。また、実施例１から、この現象にRNAが関係している可能性が考えられたので、生体調節に重要な働きを持つ干渉RNAを疲労物質の候補として検討した。干渉RNAにはsiRNAやmiRNAがあるが、多くの分子種があり、通常はmRNAに特異的に結合して効果を発揮する。今回発明者が着目したのは、この様な本来の干渉RNAの機能とは無関係な、干渉RNAの細胞内の総量である。疲労によって干渉RNAの総量が増加し、PKRを介してeIF-2αのリン酸化を生じさせる可能性を検討した。 Fatigue substances that cause systemic physiological fatigue have not been identified so far. Since the fatigue substance is an alarm that informs the living body of overwork or lack of rest, it is considered that the trigger of the fatigue alarm is a waste product or a metabolite accumulated in the living body by life activity. In addition, since it was considered from Example 1 that RNA may be related to this phenomenon, interfering RNA having an important function in bioregulation was examined as a candidate for a fatigue substance. Interfering RNA includes siRNA and miRNA, but there are many molecular species, and they usually exert their effects by specifically binding to mRNA. This time, the inventor focused on the total amount of interfering RNA in cells, which is irrelevant to the function of such original interfering RNA. We investigated the possibility that fatigue increases the total amount of interfering RNA and causes phosphorylation of eIF-2α via PKR.

（１）方法
実施例２及び３で示した実験と同様の方法で疲労負荷をかけたマウス心臓及び肝臓(n=1)から、micro RNA (miRNA)を含むRNAをmiRNeasy 分離 Kit (Qiagen)を用いて精製した。RT2 miRNA First Strand Kit (SABioscoences)を用いて、それぞれの臓器RNA 100 ngに含まれるmiRNAから逆転写を行い、標準プロトコールに従い、cDNAを計10 μl合成した。そのcDNAにRNase-free water 90 μlを加えた希釈cDNA 100 μl、2X RT2 SYBR Green PCR Master Mix 5.0 ml、およびwater 4.9 mlからなる計10mlの反応液を調製した。反応液を25 μlずつRT2 miRNA PCR Array(SABioscoences)に分注し、以下の条件で網羅的にmiRNAを定量化した。
PCR条件：初期ステップ：95℃ 10分、次に95℃ 15秒、60℃ 31 秒、72℃ 30秒を40サイクル。
PCR Array Data Analysis Web Portal (http://www.sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php)にて、データを解析した。 (1) Method From mouse heart and liver (n = 1) subjected to fatigue loading by the same method as the experiments shown in Examples 2 and 3, RNA containing microRNA (miRNA) was separated into miRNeasy separation kit (Qiagen). Purified using. Using the RT2 miRNA First Strand Kit (SABioscoences), reverse transcription was performed from the miRNA contained in 100 ng of each organ RNA, and a total of 10 μl of cDNA was synthesized according to the standard protocol. A total of 10 ml of reaction solution was prepared consisting of 100 μl of diluted cDNA obtained by adding 90 μl of RNase-free water to the cDNA, 5.0 ml of 2X RT2 SYBR Green PCR Master Mix, and 4.9 ml of water. 25 μl of the reaction solution was dispensed into RT2 miRNA PCR Array (SA Bioscoences), and miRNA was comprehensively quantified under the following conditions.
PCR conditions: Initial step: 95 ° C for 10 minutes, then 95 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 31 seconds, 72 ° C for 30 seconds for 40 cycles.
Data was analyzed on the PCR Array Data Analysis Web Portal (http://www.sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php).

（２）結果
図１０では、各種の干渉RNAの解析結果の代表例を示しているが、肝臓（図１０－１）においても心臓（図１０－２）においても、疲労負荷における各種干渉RNAの増加が示された。同時に計算された干渉RNAの総量も同様に増加していた。また、干渉RNAの増加は、運動疲労（図１０におけるFS 2h）においても精神的疲労（図１０における8hおよび24h）においても観察された。このことより、生理的疲労の最初のトリガーとなる疲労原因物質は干渉RNAであることが示された(図１０)。 (2) Results Fig. 10 shows typical examples of the analysis results of various interfering RNAs, but in both the liver (Fig. 10-1) and the heart (Fig. 10-2), various interfering RNAs in fatigue loading An increase was shown. The total amount of interfering RNA calculated at the same time also increased. Increased interfering RNA was also observed in both exercise fatigue (FS 2h in FIG. 10) and mental fatigue (8h and 24h in FIG. 10). From this, it was shown that the fatigue-causing substance that first triggers physiological fatigue is interfering RNA (Fig. 10).

干渉RNAは測定に手間と費用がかかるため、干渉RNAの増加を正確に反映し、簡便に測定が可能な分子バイオマーカーの検索を行った。候補としたのは、干渉RNAの産生に関わる酵素であるDgcr8とDroshaである。 Since interfering RNA requires labor and cost to measure, we searched for molecular biomarkers that can be easily measured by accurately reflecting the increase in interfering RNA. The candidates were Dgcr8 and Drosha, which are enzymes involved in the production of interfering RNA.

（１）方法
実施例２及び３で示した実験と同様の方法で、疲労負荷をかけたマウス肝臓(n=2)のDgcr8、Drosha及びGAPDHのmRNAを定量した。プローブ及びプライマーの配列は下記の通り。
Dgcr8 probe, 5'-FAM- TGCGAAGAATAAAGCTGCCCGAGCCA-TAMRA-3'（配列番号：２２）
Dgcr8 forward primer, 5'- CGGATCTGGAACTGCAAGCA- 3'（配列番号：２３）
Dgcr8 reverse primer, 5'- GTTCTTCACTGTCTTTAGGCTTCTC- 3'（配列番号：２４）
Drosha probe, 5'-FAM- AGTTCCTCTGCTACCTTGGCTTGCGT-TAMRA-3'（配列番号：２５）
Drosha forward primer, 5'- ACAGAGTACTTGTTCATTCATTTCCC - 3'（配列番号：２６）
Drosha reverse primer, 5'- TGTCGTTGGTGATGGCATACTC- 3'（配列番号：２７）
図の値は平均±標準誤差で示した。 (1) Method The mRNAs of Dgcr8, Drosha and GAPDH in mouse liver (n = 2) subjected to fatigue loading were quantified by the same method as in the experiments shown in Examples 2 and 3. The sequences of probes and primers are as follows.
Dgcr8 probe, 5'-FAM- TGCGAAGAATAAAGCTGCCCGAGCCA-TAMRA-3' (SEQ ID NO: 22)
Dgcr8 forward primer, 5'-CGGATCTGGAACTGCAAGCA-3'(SEQ ID NO: 23)
Dgcr8 reverse primer, 5'-GTTCTTCACT GTCTTTAGGCTTCTC-3'(SEQ ID NO: 24)
Drosha probe, 5'-FAM- AGTTCCTCTGCTACCTTGGCTTGCGT-TAMRA-3' (SEQ ID NO: 25)
Drosha forward primer, 5'-ACAGAGTACTTGTTCATTCATTTCCC --3' (SEQ ID NO: 26)
Drosha reverse primer, 5'-TGTCCGTTGGTGATGGCATACTC-3'(SEQ ID NO: 27)
The values in the figure are shown as mean ± standard error.

（２）結果
干渉RNAの産生に関わる酵素であるDGCR8とDroshaの発現量が、運動疲労（図１１中、FS 2h）と精神的疲労（図１１中、8h、12h、24h）によって増加することが判った。この結果、これらも生理的疲労の測定に使用可能なバイオマーカーとなることが示された(図１１)。 (2) Results The expression levels of DGCR8 and Drosha, which are enzymes involved in the production of interfering RNA, are increased by exercise fatigue (FS 2h in Fig. 11) and mental fatigue (8h, 12h, 24h in Fig. 11). I found out. As a result, it was shown that these are also biomarkers that can be used for measuring physiological fatigue (Fig. 11).

ヒトの末梢血検体を使用して、Dgcr8とDroshaによる疲労測定を行った。 Fatigue measurements with Dgcr8 and Drosha were performed using human peripheral blood samples.

（１）方法
実施例４で示した実験と同様の方法で、自転車漕ぎ負荷前後(n=2)の血液中Dgcr8 (プローブ、プライマーセット：Hs00256062_m1)、Drosha (プローブ、プライマーセット：Hs00203008_m1)及びACTBのmRNAを定量した。図の値は平均±標準誤差で示した。 (1) Method Dgcr8 (probe, primer set: Hs00256062_m1), Drosha (probe, primer set: Hs00203008_m1) and ACTB in blood before and after the bicycle rowing load (n = 2) by the same method as the experiment shown in Example 4. MRNA was quantified. The values in the figure are shown as mean ± standard error.

（２）結果
運動疲労負荷によってヒトの末梢血検体中のDgcr8とDroshaが増加していることが確認された。これにより、ヒトの末梢血液を利用した検査において、Dgcr8またはDroshaによる疲労測定が可能であることが示された(図１２)。 (2) Results It was confirmed that Dgcr8 and Drosha in human peripheral blood samples increased due to exercise fatigue load. This showed that fatigue measurement with Dgcr8 or Drosha is possible in tests using human peripheral blood (Fig. 12).

ヒトの末梢血検体を使用して、GRP78とXBP-1による疲労測定を行った。 Fatigue measurements with GRP78 and XBP-1 were performed using human peripheral blood samples.

（１）方法
実施例４で示した実験と同様の方法で、自転車漕ぎ負荷前後(n=2)の血液中GRP78 (probe、プライマーセット：Hs00607129_gH)、XBP1 (probe、プライマーセット：Hs00231936_m1)及びACTB mRNAを定量した。図の値は平均±標準誤差で示した。 (1) Method By the same method as the experiment shown in Example 4, blood GRP78 (probe, primer set: Hs00607129_gH), XBP1 (probe, primer set: Hs00231936_m1) and ACTB in the blood before and after the bicycle rowing load (n = 2). The mRNA was quantified. The values in the figure are shown as mean ± standard error.

（２）結果
運動疲労負荷によってヒトの末梢血検体中のGRP78とXBP-1の発現量が増加していることが確認された。これにより、ヒトの末梢血液を利用した検査において、GRP78やXBP-1を利用した疲労測定が可能であることが示された(図１３)。 (2) Results It was confirmed that the expression levels of GRP78 and XBP-1 in human peripheral blood samples increased due to exercise fatigue load. This showed that fatigue measurement using GRP78 and XBP-1 is possible in tests using human peripheral blood (Fig. 13).

ATF3発現によって、生理的疲労と、感染やCFSによる疲労のモデルとされるPoly(I:C)腹腔投与モデルとの区別が可能かどうかを検討した。 We investigated whether ATF3 expression makes it possible to distinguish between physiological fatigue and the Poly (I: C) peritoneal administration model, which is a model of infection and fatigue due to CFS.

（１）方法
Poly(I:C)のマウス腹腔投与から６時間後のマウス各3匹の肝臓を採取し、ATF3の遺伝子発現量を比較した。また、２時間の強制水泳を行ったマウス４匹のATF3遺伝子発現をFS 2hrとして示した。 (1) Method
Livers of 3 mice each 6 hours after intraperitoneal administration of Poly (I: C) were collected and the gene expression level of ATF3 was compared. In addition, the ATF3 gene expression of 4 mice that had been forced to swim for 2 hours was shown as FS 2 hr.

Poly(I:C)の腹腔投与：
マウスにPoly(I:C)を腹腔投与するために、Poly(I:C)ナトリウム塩（Sigma-Aldrich）をエンドトキシンフリー生理食塩水（大塚製薬）で希釈し、0, 1, 2 mg/ml Poly(I:C)水溶液を調製した。６週齢のC57BL/6NCrSlcマウスの腹腔に、0, 5, 10 mg/kgとなるようにPoly(I:C)水溶液を投与した（約100μl）。腹腔投与後のマウスは飼育ケージに戻した。 Abdominal administration of Poly (I: C):
For intraperitoneal administration of Poly (I: C) to mice, Poly (I: C) sodium salt (Sigma-Aldrich) was diluted with endotoxin-free saline (Otsuka Pharmaceutical) and 0, 1, 2 mg / ml. An aqueous solution of Poly (I: C) was prepared. Aqueous Poly (I: C) solution was administered to the abdominal cavity of 6-week-old C57BL / 6NCrSlc mice at a dose of 0, 5, 10 mg / kg (about 100 μl). After intraperitoneal administration, the mice were returned to the rearing cage.

Poly(I:C)腹腔投与マウスの遺伝子発現解析：
Poly(I:C)腹腔投与後の時間経過に伴うATF3遺伝子発現量を確認した結果、６時間後に発現量が最大となることが判明した（データ示さず）。そこで、Poly(I:C)のマウス腹腔投与から６時間後にマウスの肝臓を採取した。肝臓のRNAを精製し、ATF3のmRNA量をreal-time RT-PCRで定量した。リファレンス遺伝子としてβ-アクチン遺伝子を用いた。また、比較のため、２時間の強制水泳（FS）を実施したマウスのATF3発現量も測定した。real-time RT-PCRで使用したプライマープローブの配列は、以下の通り。
ATF3：
Probe: 5'-TCCTCAATCTGGGCCTTCAGCTCAGCAT-3'（配列番号：１０）
Primer-F : 5'-TGTCGAAACAAGAAAAAGGAGAAGA-3'（配列番号：１１）
Primer-R: 5'-GCAGGTTGAGCATGTATATCAAATG-3'（配列番号：１２）
棒グラフは平均値を示し、エラーバーは標準誤差を示す。統計学的有意（**p<0.01）はWelch's t testを用いて算出した。統計学的有意（*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001）はWelch's t testを用いて算出した。 Gene expression analysis of Poly (I: C) abdominal cavity-administered mice:
As a result of confirming the expression level of the ATF3 gene with the passage of time after intraperitoneal administration of Poly (I: C), it was found that the expression level reached the maximum after 6 hours (data not shown). Therefore, the liver of the mouse was collected 6 hours after the intraperitoneal administration of Poly (I: C) to the mouse. Liver RNA was purified and the amount of ATF3 mRNA was quantified by real-time RT-PCR. The β-actin gene was used as a reference gene. For comparison, the ATF3 expression level of mice subjected to forced swimming (FS) for 2 hours was also measured. The sequence of the primer probe used in real-time RT-PCR is as follows.
ATF3:
Probe: 5'-TCCTCAATCTGGGCCTTCAGCTCAGCAT-3' (SEQ ID NO: 10)
Primer-F: 5'-TGTCGAAACAAGAAAAAGGAGAAGA-3' (SEQ ID NO: 11)
Primer-R: 5'-GCAGGTTGAGCATGTATATCAAATG-3'(SEQ ID NO: 12)
The bar graph shows the mean value and the error bars show the standard error. Statistical significance (** p <0.01) was calculated using Welch's t test. Statistical significance (* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001) was calculated using Welch's t test.

（２）結果
２時間のFSによりATF3は強く誘導されるが、Poly(I:C)腹腔投与６時間後のATF3発現量はこれに比べて著しく低かった。別の試験によって、Poly(I:C)腹腔投与後に誘導されるATF3は、６時間後が最高値であることは確認してある。また、他の実施例により精神的疲労においてもATF3は２時間のFSと同程度に上昇することが判っている。このため、CFSやウイルス感染のモデルであると考えられているPoly(I:C)腹腔投与モデルで観察される疲労は生理的疲労とは異なることが示された（図１４）。 (2) Results ATF3 was strongly induced by FS for 2 hours, but the expression level of ATF3 6 hours after intraperitoneal administration of Poly (I: C) was significantly lower than this. Another study confirmed that ATF3 induced after intraperitoneal administration of Poly (I: C) was highest after 6 hours. It has also been found from other examples that ATF3 increases to the same extent as 2-hour FS in mental fatigue. Therefore, it was shown that the fatigue observed in the Poly (I: C) peritoneal administration model, which is considered to be a model of CFS and viral infection, is different from physiological fatigue (Fig. 14).

精神疲労や肉体疲労が、各種臓器でのeIF-2αリン酸化抑制因子の増加によって評価できるかどうかを検討した。 We investigated whether mental fatigue and physical fatigue could be evaluated by increasing eIF-2α phosphorylation inhibitor in various organs.

（１）方法
実施例２及び３で示した実験と同様の方法で、疲労負荷をかけたマウス心臓及び肝臓 (n=2～4)のGADD34、Nck1、Nck2、CReP及びGAPDHのmRNAを定量した。プローブ及びプライマーの配列は下記の通り。
ADD34 probe, 5'-FAM- TCTCAGCGAAGTGTACCTTCCGAGCT-TAMRA-3'（配列番号：２８）
GADD34 forward primer, 5'- GGCGGCTCAGATTGTTCAAAG- 3'（配列番号：２９）
GADD34 reverse primer, 5'- CAGCAAGGAAATGGACTGTGAC- 3'（配列番号：３０）
Nck1 probe, 5'-FAM- CACCAGGCACCAGGCAGAAATGGCAT-TAMRA-3'（配列番号：３１）
Nck1 forward primer, 5'- GCTGGCAATCCTTGGTATTATGG- 3'（配列番号：３２）
Nck1 reverse primer, 5'- CCCTTGTGCTTTTAGTGATACTGAG- 3'（配列番号：３３）
Nck2 probe, 5'-FAM- TCCTCGCCCAGTGACTTCTCCGTGT-TAMRA-3'（配列番号：３４）
Nck2 forward primer, 5'- CGACTTCCTCATTAGGGACAGC- 3'（配列番号：３５）
Nck2 reverse primer, 5'- CACCTTGAAGTGCTTGTTTCTCC- 3'（配列番号：３６）
CReP probe, 5'-FAM- AGGCTCTTGCTGGAGAAAGATACACCCA-TAMRA-3'（配列番号：３７）
CReP forward primer, 5'- AAGAAGATAATTGTCCAGGCTGTG- 3'（配列番号：３８）
CReP reverse primer, 5'- CTCATCACCACTTATATAATACTCAGTAAC- 3'（配列番号：３９）
図の値は平均±標準誤差で示した。 (1) Method The mRNAs of GADD34, Nck1, Nck2, CReP and GAPDH of mouse heart and liver (n = 2-4) subjected to fatigue load were quantified by the same method as the experiments shown in Examples 2 and 3. .. The sequences of probes and primers are as follows.
ADD34 probe, 5'-FAM- TCTCAGCGAAGTGTACCTTCCGAGCT-TAMRA-3' (SEQ ID NO: 28)
GADD34 forward primer, 5'-GGCGGCTCAGATTGTTCAAAG-3'(SEQ ID NO: 29)
GADD34 reverse primer, 5'-CAGCAAGGAAATGGACTGTGAC-3' (SEQ ID NO: 30)
Nck1 probe, 5'-FAM- CACCAGGCACCAGGCAGAAATGGCAT-TAMRA-3' (SEQ ID NO: 31)
Nck1 forward primer, 5'-GCTGGCAATCCTTGGTATTATGG-3' (SEQ ID NO: 32)
Nck1 reverse primer, 5'-CCCTTGTGCTTTTAGTGATACTGAG-3'(SEQ ID NO: 33)
Nck2 probe, 5'-FAM- TCCTCGCCCAGTGACTTCTCCGTGT-TAMRA-3' (SEQ ID NO: 34)
Nck2 forward primer, 5'-CGACTTCCTCATTAGGGACAGC-3'(SEQ ID NO: 35)
Nck2 reverse primer, 5'-CACCTTGAAGTGCTTGTTTCTCC-3'(SEQ ID NO: 36)
CReP probe, 5'-FAM- AGGCTCTTGCTGGAGAAAGATACACCCA-TAMRA-3' (SEQ ID NO: 37)
CReP forward primer, 5'-AAGAAGATAATTGTCCAGGCTGTG-3'(SEQ ID NO: 38)
CReP reverse primer, 5'-CTCATCACCACTTATATAATACTCAGTAAC-3' (SEQ ID NO: 39)
The values in the figure are shown as mean ± standard error.

（２）結果
精神疲労（図１５中、FS 2h）および運動疲労（図１５中、8h、12h、24h）の負荷によって、マウスの心臓及び肝臓でのeIF-2αリン酸化抑制因子（GADD34、Nck1、Nck2、CReP）の発現量が増加することが判った。このことより、eIF-2αリン酸化抑制因子によって精神疲労および肉体疲労の評価ができることが示された（図１５）。 (2) Results EIF-2α phosphorylation inhibitor (GADD34, Nck1) in the heart and liver of mice due to the load of mental fatigue (FS 2h in Fig. 15) and exercise fatigue (8h, 12h, 24h in Fig. 15). , Nck2, CReP) was found to increase. From this, it was shown that the eIF-2α phosphorylation inhibitor can evaluate mental fatigue and physical fatigue (Fig. 15).

被験者の疲労が血液細胞中のeIF-2αリン酸化抑制因子の増加によって評価できるかどうかを検討した。 We investigated whether subject fatigue could be assessed by an increase in eIF-2α phosphorylation inhibitor in blood cells.

（１）方法
実施例４で示した実験と同様の方法で、自転車漕ぎ負荷前後(n=2)の血液中GADD34 (プローブ、プライマーセット：Hs00169585_m1)、Nck1 (プローブ、プライマーセット：Hs01592377_m1)、Nck2 (プローブ、プライマーセット：Hs02561903_s1)、CReP (プローブ、プライマーセット：Hs00262481_m1)、及びACTBのmRNAを定量した。図の値は平均±標準誤差で示した。 (1) Method In the same method as the experiment shown in Example 4, GADD34 (probe, primer set: Hs00169585_m1), Nck1 (probe, primer set: Hs01592377_m1), Nck2 in blood before and after the bicycle rowing load (n = 2). (Probe, primer set: Hs02561903_s1), CReP (probe, primer set: Hs00262481_m1), and ACTB mRNA were quantified. The values in the figure are shown as mean ± standard error.

（２）結果
運動疲労の負荷によって、ヒトの血液細胞中のeIF-2αリン酸化抑制因子（GADD34、CReP、Nck1）が増加することが判った。このことより、eIF-2αリン酸化抑制因子によって精神疲労および肉体疲労の評価ができることが示された（図１６）。 (2) Results It was found that the load of exercise fatigue increases eIF-2α phosphorylation inhibitor (GADD34, CReP, Nck1) in human blood cells. From this, it was shown that the eIF-2α phosphorylation inhibitor can evaluate mental fatigue and physical fatigue (Fig. 16).

eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の代表としてATF3を、eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の代表としてGADD34を用いて、eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子またはeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子、あるいは両者の組合せによる、抗疲労物質や抗疲労法の効果判定が可能であるかどうかを検討した。
早い山登りにおいては疲労が生じるのに対し、ハイキングは疲労回復の方法として良く知られている抗疲労法である。また、イミダペプチドは、鳥のムネ肉から抽出された高濃度のイミダゾールジペプチドを含む製剤で、様々な検討から抗疲労効果があることが確認されている抗疲労物質である。この様な抗疲労物質および抗疲労法の効果がeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子ATF3と、eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子GADD34によってどの様に判定されるかを検討した。 Using ATF3 as a representative of eIF-2α phosphorylation signal transduction factor and GADD34 as a representative of eIF-2α phosphorylation signal inhibitor, eIF-2α phosphorylation signal transduction factor, eIF-2α phosphorylation signal transduction factor, or both. It was examined whether it is possible to judge the effects of anti-fatigue substances and anti-fatigue methods by the combination of.
Hiking is a well-known anti-fatigue method as a method of relieving fatigue, whereas early mountain climbing causes fatigue. In addition, imidazole peptide is a pharmaceutical product containing a high concentration of imidazole dipeptide extracted from chicken breast meat, and is an anti-fatigue substance that has been confirmed to have an anti-fatigue effect from various studies. We investigated how the effects of such anti-fatigue substances and anti-fatigue methods are determined by the eIF-2α phosphorylation signal transduction factor ATF3 and the eIF-2α phosphorylation signal inhibitor GADD34.

（１）方法
山をオーバーペース気味に登った群(早い山登り群)(n=5)及び休憩を入れながらゆっくり歩いて登った群(ハイキング群)(n=8)において、山登り前後で採血し、実施例４で示した実験と同様の方法で、山登り前後の血液中RNAを精製し、cDNAを合成した。
また、健常者(n=6)にイミダペプチド240 (日本予防医薬) 1本/日を1週間摂取させた群では、摂取2週間前と摂取後で採血し、血液中RNAを精製し、cDNAを合成した。
ATF3、GADD34及びGAPDHのmRNA量をApplied Biosystems 7300 real-time PCR System (Applied Biosystems)を利用して測定した。測定はduplicateで下記の条件で行った。
リアルタイムPCR条件：FastStart TaqMan Probe Master (ROX) (Roche Diagnostics) 12.5 μl、PCR forward primer (100 μM) 0.225 μl、PCR reverse primer (100 μM) 0.225 μl、TaqManプローブ (10 μM) 0.625 μl、cDNA 2 μl、PCR-grade water 9.425 μlの計25 μl。初期ステップ 95℃ 10 分、次に95℃ 10秒、60℃ 31 秒を45 サイクル。
プローブ及びプライマーの配列は下記の通り。
ATF3 probe, 5'-FAM-CCCTCGGGGTGTCCATCACAAAAGCC-TAMRA-3'（配列番号：４０）
ATF3 forward primer, 5'-CGCTGGAATCAGTCACTGTCAG- 3' （配列番号：４１）
ATF3 reverse primer, 5'-CCTTCTTCTTGTTTCGGCACTTTG- 3' （配列番号：４２）
GADD34 probe, 5'-FAM- GCCTTTAGGGGAGTCTCAGGGTCCG-TAMRA-3' （配列番号：４３）
GADD34 forward primer, 5'-GCCCAGAAACCCCTACTCATG- 3' （配列番号：４４）
GADD34 reverse primer, 5'-AGGAAATGGACAGTGACCTTCTC- 3' （配列番号：４５）
GAPDH probe, 5'-FAM-CGCCCAATACGACCAAATCCGTTGACTCC-TAMRA-3' （配列番号：４６）
GAPDH forward primer, 5'- CACCATGGGGAAGGTGAAGG- 3' （配列番号：４７）
GAPDH reverse primer, 5'-CAATATCCACTTTACCAGAGTTAAAAGC- 3' （配列番号：４８）
データの解析はSequence Detection Software version 1.4 (Applied Biosystems)を用いた。図の値は平均±標準誤差で示した。 (1) Method Blood was collected before and after mountain climbing in the group that climbed the mountain at an over pace (fast mountain climbing group) (n = 5) and the group that slowly walked up with a break (hiking group) (n = 8). , RNA in blood before and after mountain climbing was purified and cDNA was synthesized by the same method as the experiment shown in Example 4.
In addition, in the group in which a healthy subject (n = 6) was ingested 1 bottle of Imida Peptide 240 (Japanese preventive drug) for 1 week, blood was collected 2 weeks before and after ingestion, blood RNA was purified, and cDNA was obtained. Synthesized.
The mRNA levels of ATF3, GADD34 and GAPDH were measured using the Applied Biosystems 7300 real-time PCR System (Applied Biosystems). The measurement was duplicated under the following conditions.
Real-time PCR conditions: FastStart TaqMan Probe Master (ROX) (Roche Diagnostics) 12.5 μl, PCR forward primer (100 μM) 0.225 μl, PCR reverse primer (100 μM) 0.225 μl, TaqMan probe (10 μM) 0.625 μl, cDNA 2 μl , PCR-grade water 9.425 μl for a total of 25 μl. Initial step 95 ° C for 10 minutes, then 95 ° C for 10 seconds, 60 ° C for 31 seconds for 45 cycles.
The sequences of probes and primers are as follows.
ATF3 probe, 5'-FAM-CCCTCGGGGTGTCCATCACAAAAGCC-TAMRA-3' (SEQ ID NO: 40)
ATF3 forward primer, 5'-CGCTGGAATCAGTCACTGTCAG-3' (SEQ ID NO: 41)
ATF3 reverse primer, 5'-CCTTCTTCTTGTTTCGGCACTTTG-3'(SEQ ID NO: 42)
GADD34 probe, 5'-FAM- GCCTTTAGGGGAGTCTCAGGGTCCG-TAMRA-3' (SEQ ID NO: 43)
GADD34 forward primer, 5'-GCCCAGAAACCCCTACTCATG-3'(SEQ ID NO: 44)
GADD34 reverse primer, 5'-AGGAAATGGACAGTGACCTTCTC-3'(SEQ ID NO: 45)
GAPDH probe, 5'-FAM-CGCCCAATACGACCAAATCCGTTGACTCC-TAMRA-3' (SEQ ID NO: 46)
GAPDH forward primer, 5'-CACCATGGGGAAGGTGAAGG-3' (SEQ ID NO: 47)
GAPDH reverse primer, 5'-CAATATCCACTTTACCAGAGTTAAAAGC-3'(SEQ ID NO: 48)
Sequence Detection Software version 1.4 (Applied Biosystems) was used for data analysis. The values in the figure are shown as mean ± standard error.

（２）結果
eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子ATF3単独での判定では、ハイキングとイミダペプチドによって、ATF3の比率が開始当初よりも低下していることが判った。このことから、使用前後でATF3の低下がみられれば、該当する抗疲労物質候補や抗疲労法候補に抗疲労効果があると判定できることが判った。eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子GADD34単独でも、イミダペプチドの抗疲労効果と対応して、GADD34の強い誘導がみられた。
eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子ATF3とeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子GADD34の総合的判断では、早い山登りでは、GADD34の強い誘導がみられるものの、ATF3の効果を打ち消すに至っていないが、ハイキングでは、GADD34の効果がATF3の効果を上回ることで、ATF3を低下させ、抗疲労効果を発揮することが示された。また、イミダペプチドにおいては、イミダペプチドがGADD34を強く誘導し、かつATF3を強く抑制することで、強い抗疲労効果を発揮することが示された(図１７)。 (2) Result
Judgment of the eIF-2α phosphorylation signaling factor ATF3 alone revealed that hiking and imidapeptides reduced the proportion of ATF3 from the beginning. From this, it was found that if ATF3 decreases before and after use, it can be determined that the corresponding anti-fatigue substance candidate or anti-fatigue method candidate has an anti-fatigue effect. The eIF-2α phosphorylation signal inhibitor GADD34 alone also showed strong induction of GADD34 in response to the anti-fatigue effect of imidapeptide.
Comprehensive judgment of eIF-2α phosphorylation signal transduction factor ATF3 and eIF-2α phosphorylation signal inhibitor GADD34 shows that GADD34 is strongly induced in early mountain climbing, but the effect of ATF3 is not canceled, but in hiking. , It was shown that the effect of GADD34 exceeds the effect of ATF3, thereby lowering ATF3 and exerting an anti-fatigue effect. In addition, it was shown that imidazole peptide exerts a strong anti-fatigue effect by strongly inducing GADD34 and strongly suppressing ATF3 (FIG. 17).

疲労関連因子によるpathological fatigueの評価をCFS患者を例にあげて示す。 The evaluation of pathological fatigue by fatigue-related factors is shown by taking a CFS patient as an example.

（１）方法
CFS患者(n=79)及び健常者(n=69)より採血し、実施例１７で示した実験と同様の方法で、ATF3,CHOP、GADD34、Nck1、Nck2、CReP及びGAPDHのmRNAを定量した。CHOP、Nck1、Nck2、CRePのプローブ、プライマー配列は以下の通り。
CHOP probe, 5'-FAM-TCCTCCTCAGTCAGCCAAGCCAGAGA-TAMRA-3'（配列番号：４９）
CHOP forward primer, 5'-CCTATGTTTCACCTCCTGGAAATG- 3'（配列番号：５０）
CHOP reverse primer, 5'-GTGACCTCTGCTGGTTCTGG- 3'（配列番号：５１）
Nck1 probe, 5'-FAM- CATCAGCAGGAGATGCAGAATCTGGCACAC-TAMRA-3'（配列番号：５２）
Nck1 forward primer, 5'- GCTCGGAAAGCATCTATTGTGAAA- 3'（配列番号：５３）
Nck1 reverse primer, 5'- ATGTTGAGGTCATAGAGACGTTCC- 3'（配列番号：５４）
Nck2 probe, 5'-FAM- TCTCCCCGTGCTCGCTGGTGAAGAT-TAMRA-3'（配列番号：５５）
Nck2 forward primer, 5'- GAGCGGAAGAACAGCCTGAAG- 3'（配列番号：５６）
Nck2 reverse primer, 5'- GGCCCTGACGAGGTAGAGC- 3'（配列番号：５７）
CReP probe, 5'-FAM- TGTGTCTTCCTCCAGAAAGAACGTCACGCT-TAMRA-3'（配列番号：５８）
CReP forward primer, 5'- GAAAGTGAATGTCCAGACTCGGTA- 3'（配列番号：５９）
CReP reverse primer, 5'- ACTCAGTAACTTCTTCAAGGAAGGT- 3'（配列番号：６０）
図の値は中央値で示した。2群間の比較はMann-WhitneyのU検定で行った。 (1) Method
Blood was collected from CFS patients (n = 79) and healthy subjects (n = 69), and the mRNAs of ATF3, CHOP, GADD34, Nck1, Nck2, CReP and GAPDH were quantified by the same method as the experiment shown in Example 17. .. The CHOP, Nck1, Nck2, CReP probes and primer sequences are as follows.
CHOP probe, 5'-FAM-TCCTCCTCAGTCAGCCAAGCCAGAGA-TAMRA-3' (SEQ ID NO: 49)
CHOP forward primer, 5'-CCTATGTTTCACCTCCTGGAAATG-3' (SEQ ID NO: 50)
CHOP reverse primer, 5'-GTGACCTCTGCTGGTTCTGG-3'(SEQ ID NO: 51)
Nck1 probe, 5'-FAM-CATCAGCAGGAGATGCAGAATCTGGCACAC-TAMRA-3'(SEQ ID NO: 52)
Nck1 forward primer, 5'-GCTCGGAAAGCATCTATTGTGAAA-3' (SEQ ID NO: 53)
Nck1 reverse primer, 5'-ATGTTGAGGTCATAGAGACGTTCC-3'(SEQ ID NO: 54)
Nck2 probe, 5'-FAM- TCTCCCCGTGCTCGCTGGTGAAGAT-TAMRA-3' (SEQ ID NO: 55)
Nck2 forward primer, 5'-GAGCGGAAGAACAGCCTGAAG-3'(SEQ ID NO: 56)
Nck2 reverse primer, 5'-GGCCCTGACGAGGTAGAGC-3'(SEQ ID NO: 57)
CReP probe, 5'-FAM- TGTGTCTTCCTCCAGAAAGAACGTCACGCT-TAMRA-3' (SEQ ID NO: 58)
CReP forward primer, 5'-GAAAGTGAATGTCCAGACTCGGTA-3'(SEQ ID NO: 59)
CReP reverse primer, 5'-ACTCAGTAACTTCTTCAAGGAAGGT-3' (SEQ ID NO: 60)
The values in the figure are shown in median. The comparison between the two groups was performed by the Mann-Whitney U test.

（２）結果
CFS患者は何れも強い自覚的疲労感を訴えているにも関わらず、生理的疲労の場合とは異なり、血液細胞中の疲労関連因子の増加は観察されなかった。eIF-2αリン酸化抑制因子であるGADD34とNck1に関しては、生理的疲労と逆に有為な減少が観察された。このことは、疲労関連因子の測定が、生理的疲労とpathological fatigueの区別に有用であることを示している（図１８）。 (2) Result
Although all CFS patients complained of strong subjective fatigue, no increase in fatigue-related factors in blood cells was observed, unlike in the case of physiological fatigue. For the eIF-2α phosphorylation inhibitors GADD34 and Nck1, a significant decrease was observed as opposed to physiological fatigue. This indicates that the measurement of fatigue-related factors is useful for distinguishing between physiological fatigue and pathological fatigue (Fig. 18).

疲労関連因子によるpathological fatigueの評価を、うつ病患者を例にあげて示す。 The evaluation of pathological fatigue by fatigue-related factors is shown by taking a depressed patient as an example.

（１）方法
うつ病性障害患者(Dep)(n=19)及び健常者(n=18)より採血し、実施例４で示した実験と同様の方法で、血液中ATF3、GADD34及びGAPDH (プローブ、プライマーセット：Hs99999905_m1) のmRNAを定量した。図の値は中央値で示した。2群間の比較はMann-WhitneyのU検定で行った。 (1) Method Blood was collected from a depressive disorder patient (Dep) (n = 19) and a healthy subject (n = 18), and blood ATF3, GADD34 and GAPDH (ATF3, GADD34 and GAPDH) were collected by the same method as in the experiment shown in Example 4. Probe, primer set: Hs99999905_m1) mRNA was quantified. The values in the figure are shown in median. The comparison between the two groups was performed by the Mann-Whitney U test.

（２）結果
うつ病患者も、自覚的疲労感を訴える場合が非常に多いにも関わらず、生理的疲労の場合とは異なり、血液細胞中の疲労関連因子の増加は観察されなかった。eIF-2αリン酸化抑制因子であるGADD34に関しては、生理的疲労と逆に有為な減少が観察された。このことは、うつ病においても、疲労関連因子の測定が、生理的疲労とpathological fatigueの区別に有用であることを示している（図１９）。 (2) Results Depressed patients also complained of subjective fatigue very often, but unlike the case of physiological fatigue, no increase in fatigue-related factors in blood cells was observed. Regarding GADD34, which is an eIF-2α phosphorylation inhibitor, a significant decrease was observed as opposed to physiological fatigue. This indicates that the measurement of fatigue-related factors is also useful in the distinction between physiological fatigue and pathological fatigue in depression (Fig. 19).

生活、とくに労働にともなう疲労では、疲労とうつ病の関係や、疲労によるうつ症状による作業効率の低下が問題となっている。本発明者らは客観的な疲労の評価方法として唾液中ヒトヘルペスウイルスによる客観的疲労判定法をすでに発明している。この方法によって、健常労働者の精神状態に関する情報を得ることが可能であるかどうかを検討した。 In fatigue associated with daily life, especially labor, the relationship between fatigue and depression and the decrease in work efficiency due to depressive symptoms due to fatigue have become problems. The present inventors have already invented an objective method for determining fatigue by human herpesvirus in saliva as an objective method for evaluating fatigue. We examined whether it is possible to obtain information on the mental state of healthy workers by this method.

（１）方法
健常労働者(n=41)から唾液を唾液採取用チューブSalivette (Sarstedt AG & Co.)に採取した。採取後、4℃ で1,700 g、5～15分間遠心し、flow-throughを解析まで-80℃で保存した。解凍し、唾液400 μlから、BioRobot EZ1 workstation及びEZ1 virus mini kit v2.0 (QIAGEN, Inc.)を用いて、ウイルスDNAを精製した。DNAはelution buffer 90 μlに溶出した。唾液中HHV-7 DNAはApplied Biosystems 7300 real-time PCR System (Applied Biosystems) を使用して、TaqMan PCR法にてduplicateで定量した。PCR条件は以下の通り：Premix Ex Taq (Perfect Real Time) (Takara Bio Inc.) 25 μl、PCR forward primer (100 μM) 0.45 μl、PCR reverse primer (100 μM) 0.45 μl、TaqManプローブ (10 μM) 1.25 μl、Rox reference dye 1 μl、ウイルスDNA 5 μl、PCR-grade water 16.85 μlの計50 μl。初期ステップ 95℃ 30秒、次に95℃ 5秒、60℃ 31 秒を50 サイクル。
HHV-7を定量するプローブ及びプライマーの配列は下記の通り。
HHV-7 probe, 5′-FAM-CCTCGCAGATTGCTTGTTGGCCATG-TAMRA-3′（配列番号：６１）
HHV-7 forward primer, 5′-CGGAAGTCACTGGAGTAATGAC-3′（配列番号：６２）
HHV-7 reverse primer, 5′-CCAATCCTTCCGAAACCGAT-3′（配列番号：６３）
データの解析はSequence Detection Software version 1.4 (Applied Biosystems)を用いた。
疲労度の低い群と高い群は、唾液中HHV-7 DNA量を、100,000コピー/mlまたは40,000コピー/mlで境界線を引くことで分けた。うつ症状をBeck Depression Inventory (BDI)、自覚的疲労度をvisual analogue scale (VAS)で評価した。 (1) Method Saliva was collected from a healthy worker (n = 41) into a saliva collection tube Salivatte (Sarstedt AG & Co.). After collection, the sample was centrifuged at 1700 g at 4 ° C for 5 to 15 minutes, and the flow-through was stored at -80 ° C until analysis. After thawing, virus DNA was purified from 400 μl of saliva using BioRobot EZ1 workstation and EZ1 virus mini kit v2.0 (QIAGEN, Inc.). DNA was eluted in 90 μl of solution buffer. HHV-7 DNA in saliva was quantified in duplicate by the TaqMan PCR method using the Applied Biosystems 7300 real-time PCR System (Applied Biosystems). The PCR conditions are as follows: Premix Ex Taq (Perfect Real Time) (Takara Bio Inc.) 25 μl, PCR forward primer (100 μM) 0.45 μl, PCR reverse primer (100 μM) 0.45 μl, TaqMan probe (10 μM) 1.25 μl, Rox reference dye 1 μl, viral DNA 5 μl, PCR-grade water 16.85 μl, total 50 μl. 50 cycles of initial step 95 ° C 30 seconds, then 95 ° C 5 seconds, 60 ° C 31 seconds.
The sequences of probes and primers for quantifying HHV-7 are as follows.
HHV-7 probe, 5'-FAM-CCTCGCAGATTGCTTGTTGGCCATG-TAMRA-3' (SEQ ID NO: 61)
HHV-7 forward primer, 5'-CGGAAGTCACTGGAGTAATGAC-3'(SEQ ID NO: 62)
HHV-7 reverse primer, 5'-CCAATCCTTCCGAAACCGAT-3' (SEQ ID NO: 63)
Sequence Detection Software version 1.4 (Applied Biosystems) was used for data analysis.
The low and high fatigue groups were separated by demarcating salivary HHV-7 DNA levels at 100,000 copies / ml or 40,000 copies / ml. Depressive symptoms were evaluated by the Beck Depression Inventory (BDI), and subjective fatigue was evaluated by the visual analogue scale (VAS).

（２）結果
疲労度の低い群(図２０左)と高い群(図２０右)における、自覚的疲労度(VAS)と、うつ状態を表すスコア(BDI)との相関を検討した(図２０は、100,000コピー/mlを境界とした例を示す)。
その結果、驚くべきことに、唾液中のHHV-7による疲労測定法において、疲労度が低いと判定された群では、被験者のうつ症状が病的な状態に至らない状態においても、被験者の自覚的疲労度とうつ症状にかなり強い相関があることが判った。相関係数は、境界線が40,000コピー/ml の場合は、相関係数0.73、p<0.01、境界線が100,000コピー/ml の場合は相関係数 0.69、p<0.001であった。疲労が高い場合は、何れの場合も、自覚的疲労度とうつ症状には相関関係がなかった(図２０)。
健康な労働者の精神状態が客観的に観察されたことは、疲労評価法の研究を含む従来の研究からは予測し得なかった成果であり、尚且つ、唾液検査と自覚症状だけの検査項目で、非常に簡便で専門家の診断を必要としない、うつ症状やうつ病のスクリーニング法になりうるものと考えられた（図２０）。 (2) Results We examined the correlation between the subjective fatigue level (VAS) and the score (BDI) representing depression in the group with low fatigue level (Fig. 20 left) and the group with high fatigue level (Fig. 20 right) (Fig. 20). Shows an example with 100,000 copies / ml as the boundary).
As a result, surprisingly, in the group determined to have a low degree of fatigue by the HHV-7 fatigue measurement method in saliva, the subject's awareness even when the depressive symptoms of the subject did not reach a morbid state. It was found that there was a fairly strong correlation between the degree of fatigue and depressive symptoms. The correlation coefficient was 0.73, p <0.01 when the boundary line was 40,000 copies / ml, and 0.69, p <0.001 when the boundary line was 100,000 copies / ml. In all cases of high fatigue, there was no correlation between subjective fatigue and depressive symptoms (Fig. 20).
The objective observation of the mental state of healthy workers is a result that could not be predicted from conventional studies including studies on fatigue evaluation methods, and it is a test item only for saliva test and subjective symptoms. Therefore, it was considered that it could be a screening method for depressive symptoms and depression, which is very simple and does not require expert diagnosis (Fig. 20).

マウスの不眠モデルを用いて、不眠による精神的疲労による臓器中のZFP36の増加を測定した。 A mouse insomnia model was used to measure the increase in ZFP36 in organs due to mental fatigue due to insomnia.

(1) 方法
実施例2で示した実験装置と同様の装置で、疲労負荷をかけたマウス(C57BL/6NCrSlc)の肝臓、心臓、筋肉(n=4)および脳(n=6)のZFP36及びβ-アクチン(ACTB)のmRNAをTaqMan PCR法を用いて定量した。疲労負荷の時間は、肝臓は2時間または24時間、心臓、筋肉は、4時間または24時間、脳は4時間または8時間で行った。各遺伝子のmRNA発現は、β-アクチンmRNA量との比率で評価した。プローブ及びプライマーの配列は下記の通り。
ZFP36 probe, 5'-FAM- TGAGCCATGACCTGTCATCCGACCACG -TAMRA-3'（配列番号：６５）
ZFP36 forward primer, 5'- TCTGCCATCTACGAGAGCCTC -3'（配列番号：６６）
ZFP36 reverse primer, 5'- GAGTCCGAGTTTATGTTCCAAAGTC -3'（配列番号：６７）
ACTB probe, 5'-FAM- CACACCCGCCACCAGTTCGCCATG -TAMRA-3'（配列番号：６８）
ACTB forward primer, 5'- CGCGAGCACAGCTTCTTTG -3'（配列番号：６９）
ACTB reverse primer, 5'- CGACCAGCGCAGCGATATC -3'（配列番号：７０） (1) Method Using the same device as the experimental device shown in Example 2, the liver, heart, muscle (n = 4) and brain (n = 6) ZFP36 and brain (n = 6) of mice (C57BL / 6NCrSlc) subjected to fatigue loading. Beta-actin (ACTB) mRNA was quantified using the TaqMan PCR method. The time of fatigue load was 2 hours or 24 hours for the liver, 4 hours or 24 hours for the heart and muscles, and 4 hours or 8 hours for the brain. The mRNA expression of each gene was evaluated by the ratio to the amount of β-actin mRNA. The sequences of probes and primers are as follows.
ZFP36 probe, 5'-FAM- TGAGCCATGACCTGTCATCCGACCACG -TAMRA-3' (SEQ ID NO: 65)
ZFP36 forward primer, 5'-TCTGCCATCTACGAGAGCCTC -3'(SEQ ID NO: 66)
ZFP36 reverse primer, 5'-GAGTCCGAGTTTATGTTCCAAAGTC -3'(SEQ ID NO: 67)
ACTB probe, 5'-FAM- CACACCCGCCACCAGTTCGCCATG -TAMRA-3' (SEQ ID NO: 68)
ACTB forward primer, 5'-CGGCGAGCACAGCTTCTTTG -3'(SEQ ID NO: 69)
ACTB reverse primer, 5'-CGACCAGCGCAGCGATATC -3'(SEQ ID NO: 70)

(2) 結果
ZFP36は、2時間～24時間程度の不眠においても有意に増加し、日常的に経験する精神的な労働の疲労の際に、ZFP36が増加していることが判った。このことから、精神的疲労において、疲労によるeIF-2αのリン酸化に伴うシグナル伝達をZFP36が抑制することで、抗疲労効果を発揮することが判った。また、ZFP36は、精神的疲労のバイオマーカーとして、疲労の測定に利用可能であることもわかった。また、ZFP36の増加は、肝臓、心臓、筋肉、脳と多岐にわたり、これらの臓器における疲労抑制効果や疲労の度合いを個別に評価できることがわかった。統計学的有意はt検定で行い、何れの臓器においても、コントロール群(睡眠)と精神疲労負荷群(不眠)間においてp<0.05であった (図21A：肝臓、心臓、筋肉、図21B：脳)。 (2) Result
It was found that ZFP36 increased significantly even in insomnia of about 2 to 24 hours, and that ZFP36 increased during the mental labor fatigue experienced on a daily basis. From this, it was found that ZFP36 exerts an anti-fatigue effect by suppressing the signal transduction associated with the phosphorylation of eIF-2α due to fatigue in mental fatigue. It was also found that ZFP36 can be used to measure fatigue as a biomarker of mental fatigue. It was also found that the increase in ZFP36 is wide-ranging in the liver, heart, muscles, and brain, and the fatigue-suppressing effect and the degree of fatigue in these organs can be evaluated individually. Statistical significance was measured by t-test, and in all organs, p <0.05 between the control group (sleep) and the mental fatigue load group (insomnia) (Fig. 21A: liver, heart, muscle, Fig. 21B: brain).

マウスの不眠モデルを用いて、不眠による精神的疲労による臓器中のTSC22D3（GILZ）の増加を測定した。 An increase in TSC22D3 (GILZ) in organs due to mental fatigue due to insomnia was measured using a mouse insomnia model.

(1) 方法
実施例２１で示した実験と同様の方法で、疲労負荷をかけたマウスの疲労負荷をかけたマウス(C57BL/6NCrSlc)の肝臓、心臓、筋肉(n=4)のTSC22D3及びβ-アクチン(ACTB)のmRNAをTaqMan PCR法を用いて定量した。TSC22D3のプローブ及びプライマーの配列は下記の通り。
TSC22D3 probe, 5'-FAM- TTCTTCACGAGGTCCATGGCCTGCTCA -TAMRA-3'（配列番号：７１）
TSC22D3 forward primer, 5'- GTGGTGGCCCTAGACAACAAG -3'（配列番号：７２）
TSC22D3 reverse primer, 5'- CCTCTCTCACAGCGTACATCAG -3'（配列番号：７３） (1) Method TSC22D3 and β of the liver, heart, and muscle (n = 4) of the fatigue-loaded mouse (C57BL / 6NCrSlc) of the fatigue-loaded mouse by the same method as the experiment shown in Example 21. -Actin (ACTB) mRNA was quantified using the TaqMan PCR method. The sequence of the probe and primer of TSC22D3 is as follows.
TSC22D3 probe, 5'-FAM- TTCTTCACGAGGTCCATGGCCTGCTCA -TAMRA-3' (SEQ ID NO: 71)
TSC22D3 forward primer, 5'-GTGGTGGCCCTAGACAACAAG -3'(SEQ ID NO: 72)
TSC22D3 reverse primer, 5'-CCTCTCTCACAGCGTACATCAG -3'(SEQ ID NO: 73)

(2) 結果
TSC22D3は、4時間および24時間の不眠においても有意に増加し、日常的に経験する精神的な労働の疲労の際に、TSC22D3が増加していることが判った。このことから、精神的疲労において、疲労によるeIF-2αのリン酸化に伴うシグナル伝達をTSC22D3が抑制することで、抗疲労効果を発揮することが判った。また、TSC22D3は、精神的疲労のバイオマーカーとして、疲労の測定に利用可能であることもわかった。また、TSC22D3の増加は、肝臓、心臓、筋肉、と多岐にわたり、これらの臓器における疲労抑制効果や疲労の度合いを個別に評価できることがわかった。統計学的有意はt検定で行い、何れの臓器においても、コントロール群(睡眠)と精神疲労負荷群(不眠)間においてp<0.05であった (図22)。 (2) Result
It was found that TSC22D3 was also significantly increased in 4-hour and 24-hour insomnia, and that TSC22D3 was increased during the mental labor fatigue experienced on a daily basis. From this, it was found that TSC22D3 exerts an anti-fatigue effect by suppressing the signal transduction associated with the phosphorylation of eIF-2α due to fatigue in mental fatigue. It was also found that TSC22D3 can be used to measure fatigue as a biomarker for mental fatigue. It was also found that the increase in TSC22D3 is wide-ranging in the liver, heart, and muscles, and the fatigue-suppressing effect and the degree of fatigue in these organs can be evaluated individually. Statistical significance was measured by t-test, and p <0.05 was found between the control group (sleep) and the mental fatigue load group (insomnia) in all organs (Fig. 22).

マウスの強制水泳モデルを用いて、肉体疲労直後のZFP36の増加を測定した。 An increase in ZFP36 immediately after physical fatigue was measured using a mouse forced swimming model.

(1) 方法
実施例3で示した実験と同様の方法で、疲労負荷をかけたマウス (C57BL/6NCrSlc)の肝臓、心臓、脳、末梢血(n=6)のZFP36及びβ-アクチン(ACTB)のmRNAをTaqMan PCR法を用いて定量した。疲労負荷の時間は、肝臓、心臓、脳は1時間、末梢血は30分間で行った。各遺伝子のmRNA発現は、β-アクチンmRNA量との比率で評価した。プローブ及びプライマーの配列は実施例21の通り。 (1) Method ZFP36 and β-actin (ACTB) of liver, heart, brain, peripheral blood (n = 6) of mouse (C57BL / 6NCrSlc) subjected to fatigue load by the same method as the experiment shown in Example 3. ) MRNA was quantified using the TaqMan PCR method. The fatigue load time was 1 hour for the liver, heart, and brain, and 30 minutes for peripheral blood. The mRNA expression of each gene was evaluated by the ratio to the amount of β-actin mRNA. The sequences of the probe and primer are as in Example 21.

(2) 結果
ZFP36は、30分間～1時間程度の運動負荷においても有意に増加し、日常的に経験する肉体労働の疲労の際に、ZFP36が増加していることが判った。このことから、肉体疲労において、疲労によるeIF-2αのリン酸化に伴うシグナル伝達をZFP36が抑制することで、抗疲労効果を発揮することが判った。また、ZFP36は、肉体疲労のバイオマーカーとして、疲労の測定に利用可能であることもわかった。また、ZFP36の増加は、肝臓、心臓、脳、末梢血と多岐にわたり、これらの臓器における疲労抑制効果や疲労の度合いを個別に評価できることがわかった。統計学的有意はt検定で行い、何れの臓器においても、運動前群と運動後群間においてp<0.05であった (図23A：肝臓、心臓、図23B：末梢血、脳)。 (2) Result
It was found that ZFP36 increased significantly even with an exercise load of about 30 minutes to 1 hour, and that ZFP36 increased during the fatigue of physical labor experienced on a daily basis. From this, it was found that ZFP36 exerts an anti-fatigue effect by suppressing signal transduction associated with phosphorylation of eIF-2α due to fatigue in physical fatigue. It was also found that ZFP36 can be used to measure fatigue as a biomarker of physical fatigue. It was also found that the increase in ZFP36 is wide-ranging in the liver, heart, brain, and peripheral blood, and the fatigue-suppressing effect and the degree of fatigue in these organs can be evaluated individually. Statistical significance was measured by t-test, and p <0.05 between the pre-exercise group and the post-exercise group in all organs (Fig. 23A: liver, heart, Fig. 23B: peripheral blood, brain).

マウスの強制水泳モデルを用いて、肉体疲労直後のTSC22D3の増加を測定した。 An increase in TSC22D3 immediately after physical fatigue was measured using a mouse forced swimming model.

(1) 方法
実施例23で示した実験と同様の方法で、疲労負荷をかけたマウス (C57BL/6NCrSlc)の心臓、脳、末梢血(n=6)のTSC22D3及びβ-アクチン(ACTB)のmRNAをTaqMan PCR法を用いて定量した。疲労負荷の時間は、心臓、脳は1時間、末梢血は30分間で行った。各遺伝子のmRNA発現は、β-アクチンmRNA量との比率で評価した。プローブ及びプライマーの配列は実施例22の通り。 (1) Method In the same manner as in the experiment shown in Example 23, TSC22D3 and β-actin (ACTB) in the heart, brain, and peripheral blood (n = 6) of mice (C57BL / 6NCrSlc) subjected to fatigue loading. mRNA was quantified using the TaqMan PCR method. The fatigue load time was 1 hour for the heart and brain, and 30 minutes for peripheral blood. The mRNA expression of each gene was evaluated by the ratio to the amount of β-actin mRNA. The sequences of the probe and primer are as shown in Example 22.

(2) 結果
TSC22D3は、30分間～1時間程度の運動負荷においても有意に増加し、日常的に経験する肉体労働の疲労の際に、TSC22D3が増加していることが判った。このことから、肉体疲労において、疲労によるeIF-2αのリン酸化に伴うシグナル伝達をTSC22D3が抑制することで、抗疲労効果を発揮することが判った。また、TSC22D3は、肉体疲労のバイオマーカーとして、疲労の測定に利用可能であることもわかった。また、TSC22D3の増加は、心臓、脳、末梢血と多岐にわたり、これらの臓器における疲労抑制効果や疲労の度合いを個別に評価できることがわかった。統計学的有意はt検定で行い、何れの臓器においても、運動前群と運動後群間においてp<0.05であった (図24)。 (2) Result
It was found that TSC22D3 increased significantly even with an exercise load of about 30 minutes to 1 hour, and that TSC22D3 increased during daily physical labor fatigue. From this, it was found that TSC22D3 exerts an anti-fatigue effect by suppressing signal transduction associated with phosphorylation of eIF-2α due to fatigue in physical fatigue. It was also found that TSC22D3 can be used to measure fatigue as a biomarker of physical fatigue. It was also found that the increase in TSC22D3 is wide-ranging in the heart, brain, and peripheral blood, and the fatigue-suppressing effect and the degree of fatigue in these organs can be evaluated individually. Statistical significance was measured by t-test, and p <0.05 between the pre-exercise group and the post-exercise group in all organs (Fig. 24).

ヒトの末梢血検体を使用して、ZFP36の測定を行った。 ZFP36 was measured using human peripheral blood samples.

(1) 方法
睡眠不足による精神的疲労が顕著であると考えられる、睡眠時無呼吸症候群(SAS)と診断された患者(図25: A, B, n=56; C, n=13)及び健常者(図25: A, B, n=21; C, n=18)を対象とした。血液をPAXgene Blood RNA 採血管 (日本BD)に採取した。血液RNAをPAXgene Blood RNA Kit (QIAGEN, Inc.)を用いて精製し、PrimeScript RT reagent Kit (Takara Bio, Inc.)を用いて、cDNA を合成した。血液中ATF3、Nck1、ZFP36とβ-アクチン(ACTB)のmRNAをApplied Biosystems QuantStudio real-time PCR System (Applied Biosystems)を用いて、TaqMan Arrayで以下条件のduplicateで定量した。プローブ、プライマーセット：ATF3 (Hs00231069_m1), Nck1 (Hs01592377_m1), ZFP36 (Hs00185658_m1), ACTB (Hs01060665_g1); 1 portあたり、TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems) 50 μl、cDNA 10 μl、PCR-grade water 40 μl。PCR条件: 初期ステップ：50℃ 2分、次に95℃ 10 分、95℃ 15 秒、60℃ 1 分を40サイクル。データの解析はExpressionSuite Software version v1.0.3 (Applied Biosystems)を用いた。図25の値は平均±標準誤差で示した。* P < 0.05, *** P < 0.001, **** P < 0.0001, Welch's t test. (1) Method Patients diagnosed with sleep apnea syndrome (SAS) (Fig. 25: A, B, n = 56; C, n = 13) and mental fatigue due to lack of sleep are considered to be significant. The subjects were healthy subjects (Fig. 25: A, B, n = 21; C, n = 18). Blood was collected in a PAX gene Blood RNA collection tube (Japan BD). Blood RNA was purified using the PAX gene Blood RNA Kit (QIAGEN, Inc.), and cDNA was synthesized using the PrimeScript RT reagent Kit (Takara Bio, Inc.). Blood ATF3, Nck1, ZFP36 and β-actin (ACTB) mRNA were quantified by TaqMan Array using Applied Biosystems QuantStudio real-time PCR System (Applied Biosystems) under the following conditions. Probe, primer set: ATF3 (Hs00231069_m1), Nck1 (Hs01592377_m1), ZFP36 (Hs00185658_m1), ACTB (Hs01060665_g1); TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems) 50 μl, cDNA 10 μl, PCR-grade water 40 per port μl. PCR conditions: Initial step: 50 ° C for 2 minutes, then 95 ° C for 10 minutes, 95 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 1 minute for 40 cycles. Expression Suite Software version v1.0.3 (Applied Biosystems) was used for data analysis. The values in FIG. 25 are shown as mean ± standard error. * P <0.05, *** P <0.001, **** P <0.0001, Welch's t test.

(2) 結果
SASでは、ヒトの末梢血検体中のATF3、Nck1及びZFP36が健常者（対照）と比べて増加していることが確認された。これにより、睡眠不足や精神的疲労を生じているヒトの末梢血液を利用した検査において、ATF3、Nck1及びZFP36による疲労測定が可能であることが示された(図25)。 (2) Result
In SAS, it was confirmed that ATF3, Nck1 and ZFP36 in human peripheral blood samples were increased as compared with healthy subjects (controls). This showed that it is possible to measure fatigue with ATF3, Nck1 and ZFP36 in tests using peripheral blood of humans suffering from sleep deprivation and mental fatigue (Fig. 25).

ISRIBによるeIF-2αのリン酸化が関係するシグナル伝達経路の阻害による抗疲労効果の測定
低分子化合物Integrated Stress Response inhibitor (ISRIB)はISRの経路を阻害することで、記憶の増強などの効果を発揮することが知られていた。本発明者らは、本発明者らによる発見の裏付けと、抗疲労薬の開発を目的とし、ISRIBなどのISR阻害機能をもつ物質が抗疲労効果を持つかどうかを検討した。 Measurement of anti-fatigue effect by inhibiting signal transduction pathway related to phosphorylation of eIF-2α by ISRIB Small molecule compound Integrated Stress Response inhibitor (ISRIB) exerts effects such as memory enhancement by inhibiting ISR pathway. Was known to do. The present inventors examined whether a substance having an ISR inhibitory function such as ISRIB has an anti-fatigue effect for the purpose of supporting the findings by the present inventors and developing an anti-fatigue drug.

(1) 方法
ISRIBを2.5mg/kg腹腔注射したマウス(n=4)と、溶媒のみ注射した対照マウス(n=4)において、実施例3と同様のマウスの強制水泳実験装置を用いて、強制水泳50分後から10分間のマウスの移動距離（強制水泳開始後50分～60分の移動距離）をTopScan（CleverSys社）で測定した。 (1) Method
In the mouse (n = 4) in which ISRIB was injected intraperitoneally at 2.5 mg / kg and the control mouse (n = 4) in which only the solvent was injected, forced swimming 50 minutes using the same mouse forced swimming experimental device as in Example 3. After that, the movement distance of the mouse for 10 minutes (the movement distance of 50 to 60 minutes after the start of forced swimming) was measured by TopScan (CleverSys).

(2) 結果
ISRIBを腹腔注射したマウスと、溶媒のみ注射した対照マウスの、強制水泳50分後から10分間の移動距離は、ISRIB群の方が有意に長かった。この結果より、ISRIBによって強制水泳の疲労が減少し、50分後においても、より長距離の水泳が可能となったことが判る。統計学的有意はマン=ホイットニーのU検定で行い、コントロール群とISRIB群間においてp<0.05であった (図26)。 (2) Result
The distance traveled between 50-minute and 10-minute forced swimming between mice injected intraperitoneally with ISRIB and control mice injected with solvent only was significantly longer in the ISRIB group. From this result, it can be seen that ISRIB reduced the fatigue of forced swimming and enabled longer-distance swimming even after 50 minutes. Statistical significance was measured by the Mann-Whitney U test with p <0.05 between the control group and the ISRIB group (Fig. 26).

このことは、eIF-2αのリン酸化が疲労の増加をもたらすことを示すとともに、eIF-2αのリン酸化が関係するシグナル伝達経路を抑制する物質が抗疲労薬等の抗疲労物質として有用であることや、eIF-2αのリン酸化が関係するシグナル伝達経路を抑制する効果をもって、抗疲労薬等の抗疲労物質、抗疲労器具の実施等の抗疲労法の候補の抗疲労効果判定が可能であることを示すと考えられる。 This indicates that phosphorylation of eIF-2α causes an increase in fatigue, and a substance that suppresses the signal transduction pathway related to phosphorylation of eIF-2α is useful as an anti-fatigue substance such as an anti-fatigue drug. In addition, it has the effect of suppressing the signal transmission pathway related to phosphorylation of eIF-2α, and it is possible to judge the anti-fatigue effect of anti-fatigue agents such as anti-fatigue drugs and anti-fatigue method candidates such as implementation of anti-fatigue equipment. It is thought to indicate that there is.

SalubrinalによるeIF-2αの脱リン酸化の阻害による疲労回復機構の抑制
前述のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子であるGADD34およびCrePが関係する疲労回復機構であるeIF-2αの脱リン酸化を阻害する薬剤salubrinalによる、疲労増強効果を見いだした。 Suppression of fatigue recovery mechanism by inhibition of eIF-2α dephosphorylation by Salubrinal Inhibits eIF-2α dephosphorylation, which is a fatigue recovery mechanism related to the aforementioned eIF-2α phosphorylation signal inhibitor GADD34 and CreP. We found the fatigue-enhancing effect of the drug salubrinel.

(1) 方法
DMSO 3mlに20mg/ml のsalubrinal stock solutionを37.5μlを入れたもの100μlを腹腔注射したマウス(salubrinal)と、溶媒であるDMSOのみを100μl腹腔注射したマウス(対照)の、強制水泳開始10分後から10分間の移動距離（強制水泳開始後10分～20分の移動距離）を、実施例26と同様の実験系を用いて測定した。 (1) Method
10 minutes after the start of forced swimming in mice in which 100 μl of DMSO containing 37.5 μl of 20 mg / ml salubrinal stock solution was intraperitoneally injected (salubrinal) and mice in which 100 μl of DMSO as a solvent was intraperitoneally injected (control). The 10-minute travel distance (10 to 20-minute travel distance after the start of forced swimming) was measured using the same experimental system as in Example 26.

(2) 結果
Salubrinalを腹腔注射したマウスと、溶媒のみ注射した対照マウスの、強制水泳10分後から10分間の移動距離は、salubrinal群の方が有意に短かった。この結果より、salubrinalによって強制水泳の疲労抑制・回復が抑制され、強制水泳における移動距離が減少したものと考えられる。統計学的有意はt検定で行い、コントロール群とsalubrinal群間においてp<0.05であった (図27)。
この結果は、eIF-2αの脱リン酸化が抗疲労効果、とくに疲労抑制・回復効果をもつことを示すとともに、eIF-2αの脱リン酸化を促進する物質が抗疲労薬等の抗疲労物質として有用であることや、eIF-2αの脱リン酸化の効果をもって、抗疲労薬等の抗疲労物質、抗疲労器具の実施等の抗疲労法の候補の抗疲労効果判定が可能であることを示すものと考えられる。 (2) Result
The distance traveled between the mice injected intraperitoneally with Salubrinal and the control mice injected with solvent only from 10 minutes to 10 minutes after forced swimming was significantly shorter in the salubrinal group. From this result, it is considered that salubrinal suppressed fatigue suppression / recovery of forced swimming and reduced the distance traveled in forced swimming. Statistical significance was measured by t-test, and p <0.05 between the control group and the salubrinal group (Fig. 27).
This result shows that dephosphorylation of eIF-2α has an anti-fatigue effect, especially a fatigue suppressing / recovery effect, and a substance that promotes dephosphorylation of eIF-2α is used as an anti-fatigue substance such as an anti-fatigue drug. It is shown that it is useful and that the dephosphorylation effect of eIF-2α makes it possible to judge the anti-fatigue effect of anti-fatigue agents such as anti-fatigue drugs and anti-fatigue method candidates such as the implementation of anti-fatigue equipment. It is considered to be.

本発明にかかる疲労度評価方法は、ストレスや疲労メカニズムの解明に利用することができ、ストレス解消方法の開発、疲労の程度評価、疲労にともなうメンタル面の評価をすることができる。また、本発明を利用することにより、市場に出回る抗疲労を謳う健康食品、特定保健用食品、栄養ドリンクおよび生体機能補完物質や、電化製品、家具、民間療法などの効果の定量化（評価）が可能になる。よって本発明は、医療業、製薬業、健康食品産業、健康機器産業等の広範な分野に利用が可能である。 The fatigue degree evaluation method according to the present invention can be used for elucidating stress and fatigue mechanism, and can develop a stress relieving method, evaluate the degree of fatigue, and evaluate the mental aspect associated with fatigue. In addition, by using the present invention, quantification (evaluation) of the effects of health foods, foods for specified health use, energy drinks and biological function complements on the market, electrical appliances, furniture, folk remedies, etc. Will be possible. Therefore, the present invention can be used in a wide range of fields such as the medical industry, the pharmaceutical industry, the health food industry, and the health equipment industry.

Claims (21)

細胞中におけるリン酸化された真核生物翻訳開始因子2α（eIF-2α）の量を指標として被験対象生物の疲労度を評価することを特徴とする疲労度評価方法であって、ここで、該リン酸化されたeIF-2αの量が基準値より高ければ、該被験対象生物の疲労度が高いと評価し、さらにここで、該基準値は、
(i) 疲労負荷を受ける前、休息をとった後、抗疲労物質を摂取した後、または抗疲労法を実施した後の被験対象生物から採取された細胞中のリン酸化されたeIF-2αの量である、または
(ii) 該被験対象生物と同一の生物種であって、疲労負荷を与えられていない、休息をとった後、抗疲労物質を摂取した後、または抗疲労法を実施した後の生物から採取された細胞中のリン酸化されたeIF-2αの量である、
疲労度評価方法。 A method for evaluating a degree of fatigue, which comprises evaluating the degree of fatigue of a test subject organism using the amount of phosphorylated eukaryotic initiation factor 2α (eIF-2α) in cells as an index. If the amount of phosphorylated eIF-2α is higher than the reference value, it is evaluated that the test subject organism has a high degree of fatigue, and here, the reference value is
(i) Phosphorylated eIF-2α in cells collected from the subject organism before under fatigue load, after resting, after ingesting anti-fatigue substances, or after performing anti-fatigue methods. Is a quantity, or
(ii) Collected from the same species as the subject organism, which has not been subjected to fatigue load, has taken a rest, has ingested an anti-fatigue substance, or has undergone an anti-fatigue method. The amount of phosphorylated eIF-2α in the cells that have been
Fatigue evaluation method. 細胞中におけるeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量を指標とする、抗疲労物質候補又は抗疲労法候補の抗疲労効果評価方法であって、上記eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子が、growth arrest and DNA damage-inducible protein 34 (GADD34)、non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein (Nck)1、Nck2、constitutive repressor of eIF-2α phosphorylation (CReP)、zinc finger protein 36 homolog (ZFP36)、およびglucocorticoid-induced leucine zipper (GILZ)からなる群から選ばれる少なくとも一種であり、
抗疲労物質候補の摂取又は抗疲労法候補の実施により、これらの摂取又は実施を行わない場合と比べて上記eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量が増加したときに、上記抗疲労物質候補又は抗疲労法候補が抗疲労効果を有すると評価することを特徴とする、抗疲労効果評価方法。 It is a method for evaluating the anti-fatigue effect of an anti-fatigue substance candidate or an anti-fatigue method candidate using the amount of the eIF-2α phosphorylation signal inhibitor in cells as an index, and the above-mentioned eIF-2α phosphorylation signal inhibitor is a growth arrest. and DNA damage-inducible protein 34 (GADD34), non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein (Nck) 1, Nck2, constitutive repressor of eIF-2α phosphorylation (CReP), zinc finger protein 36 homolog (ZFP36), and glucocorticoid- At least one selected from the group consisting of induced leucine zipper (GILZ),
When the amount of the eIF-2α phosphorylation signal inhibitor increases due to the intake of the anti-fatigue substance candidate or the implementation of the anti-fatigue method candidate as compared with the case where these are not ingested or implemented, the anti-fatigue substance candidate or the above-mentioned anti-fatigue substance candidate or An anti-fatigue effect evaluation method, characterized in that a candidate for an anti-fatigue method is evaluated to have an anti-fatigue effect. 上記細胞が、血液、肝臓、心臓、筋肉、脳、皮膚および膵臓から選ばれる少なくとも一種類であることを特徴とする、請求項1に記載の疲労度評価方法。 The fatigue degree evaluation method according to claim 1, wherein the cells are at least one type selected from blood, liver, heart, muscle, brain, skin and pancreas. 上記細胞が、血液、肝臓、心臓、筋肉、脳、皮膚および膵臓から選ばれる少なくとも一種類であることを特徴とする、請求項2に記載の抗疲労効果評価方法。 The method for evaluating an anti-fatigue effect according to claim 2, wherein the cells are at least one type selected from blood, liver, heart, muscle, brain, skin and pancreas. 上記請求項1に記載の疲労度評価方法を実施するための手段を含む、疲労度評価キットであって、リン酸化されたeIF-2αに対する抗体を構成要素として含む、キット。 A fatigue evaluation kit comprising means for carrying out the fatigue evaluation method according to claim 1, which comprises an antibody against phosphorylated eIF-2α as a component . 上記請求項2に記載の抗疲労効果評価方法を実施するための手段を含む、抗疲労効果評価キットであって、前記eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量を測定するためのプローブ、プライマー、または抗体を構成要素として含む、キット。 An anti-fatigue effect evaluation kit comprising the means for carrying out the anti-fatigue effect evaluation method according to claim 2 , wherein a probe, a primer, and a primer for measuring the amount of the eIF-2α phosphorylation signal inhibitory factor. Or a kit containing an antibody as a component . 下記抗疲労力評価方法を実施するための手段を含む、抗疲労力評価キット：
細胞中の真核生物翻訳開始因子2α(eIF-2α)リン酸化シグナル抑制因子の量を指標として、被験対象生物の抗疲労力を評価することを特徴とする抗疲労力評価方法であって、当該eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量が、eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量から予測される量よりも多ければ、抗疲労力が高いと評価することを特徴とする、抗疲労力評価方法；
ここで、当該eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子が、growth arrest and DNA damage-inducible protein 34 (GADD34)、non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein (Nck)1、Nck2、constitutive repressor of eIF-2α phosphorylation (CReP)、zinc finger protein 36 homolog (ZFP36)、およびglucocorticoid-induced leucine zipper (GILZ)からなる群から選ばれる少なくとも一種であり、当該eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子が、リン酸化されたeIF-2α、activating transcription factor (ATF)3、ATF4、およびC/EBP-homologous protein (CHOP) からなる群から選ばれる少なくとも一種である；
さらにここで、前記キットは、前記eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量を測定するためのプローブ、プライマー、または抗体を構成要素として含む。 Anti-fatigue evaluation kit, including means for implementing the following anti-fatigue evaluation methods:
It is an anti-fatigue ability evaluation method characterized by evaluating the anti-fatigue ability of a test subject organism using the amount of eukaryotic translation initiation factor 2α (eIF-2α) phosphorylation signal inhibitor in cells as an index. If the amount of the eIF-2α phosphorylation signal inhibitor is larger than the amount predicted from the amount of the eIF-2α phosphorylation signal transduction factor, the anti-fatigue power is evaluated as high. Evaluation methods;
Here, the eIF-2α phosphorylation signal inhibitor is growth arrest and DNA damage-inducible protein 34 (GADD34), non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein (Nck) 1, Nck2, constitutive repressor of eIF-2α phosphorylation. It is at least one selected from the group consisting of (CReP), zinc finger protein 36 homolog (ZFP36), and glucocorticoid-induced leucine zipper (GILZ), and the eIF-2α phosphorylation signaling factor is phosphorylated eIF-. At least one selected from the group consisting of 2α, activating transcription factor (ATF) 3, ATF4, and C / EBP-homologous protein (CHOP) ;
Further, here, the kit includes as a component a probe, a primer, or an antibody for measuring the amount of the eIF-2α phosphorylation signal inhibitor . 採取した細胞中のリン酸化されたeIF-2αの量を指標として被験対象生物の疲労度を評価するために前記キットを使用できることが表示されている、請求項5に記載のキット。 The kit according to claim 5, wherein it is indicated that the kit can be used to evaluate the degree of fatigue of the test subject organism using the amount of phosphorylated eIF-2α in the collected cells as an index. 採取した細胞中のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量を指標として被験対象生物の抗疲労効果もしくは抗疲労力を評価するために前記キットを使用できることが表示されている、請求項6または7に記載のキット。 It is indicated that the kit can be used to evaluate the anti-fatigue effect or anti-fatigue power of the test subject organism using the amount of the eIF-2α phosphorylation signal inhibitor in the collected cells as an index, claim 6 or 7. The kit described in. （i） 被験対象生物が抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をする前に当該被験対象生物の細胞から採取された細胞中のリン酸化されたeIF-2αの量を測定する、摂取前リン酸化eIF-2量測定工程と、
（ii） 被験対象生物が抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をした後に当該被験対象生物から採取された細胞中のリン酸化されたeIF-2αの量を測定する、摂取後リン酸化eIF-2α量測定工程と、
（iii） （i）の摂取前リン酸化eIF-2α量測定工程、及び （ii）の摂取後リン酸化eIF-2α量測定工程によって得られた、当該抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施の前後におけるリン酸化されたeIF-2αの量の変化の測定結果に基づき、当該抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施前後における細胞中のリン酸化eIF-2α量の変化を算出する、リン酸化eIF-2α量変化算出工程と、
（iv） （iii）のリン酸化eIF-2α量変化算出工程によって 得られた当該抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施の前後における細胞中のリン酸化されたeIF-2αの量の変化に基づき、抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をした後の被験対象生物から採取された細胞中のリン酸化されたeIF-2αの量が減少したときに、当該抗疲労物質候補または抗疲労法候補の生体における抗疲労効果が高いと判定する、抗疲労効果判定工程
とを含む、抗疲労物質候補または抗疲労法候補の抗疲労効果評価方法。 (I) Measure the amount of phosphorylated eIF-2α in cells collected from the cells of the subject organism before ingesting the anti-fatigue substance candidate or implementing the anti-fatigue method candidate. Pre-intake phosphorylated eIF-2 amount measurement process and
(Ii) Post-ingestion phosphorus, which measures the amount of phosphorylated eIF-2α in cells collected from the test subject organism after the subject organism has ingested the anti-fatigue substance candidate or implemented the anti-fatigue method candidate. Oxidation eIF-2α amount measurement process and
(Iii) Ingestion of the anti-fatigue substance candidate or anti-fatigue method candidate obtained by the step of measuring the amount of phosphorylated eIF-2α before ingestion of (i) and the step of measuring the amount of phosphorylated eIF-2α after ingestion of (ii). Based on the measurement results of the change in the amount of phosphorylated eIF-2α before and after the implementation of, the change in the amount of phosphorylated eIF-2α in the cells before and after the intake of the anti-fatigue substance candidate or the implementation of the anti-fatigue method candidate. Phosphorylated eIF-2α amount change calculation process and
(Iv) The amount of phosphorylated eIF-2α in the cells before and after ingestion of the anti-fatigue substance candidate or implementation of the anti-fatigue method candidate obtained by the phosphorylated eIF-2α amount change calculation step of (iii). Based on the change, when the amount of phosphorylated eIF-2α in the cells collected from the subject organism after ingestion of the anti-fatigue candidate or the implementation of the anti-fatigue method candidate decreases, the anti-fatigue substance is concerned. A method for evaluating an anti-fatigue effect of an anti-fatigue substance candidate or an anti-fatigue method candidate, which comprises an anti-fatigue effect determination step of determining that the candidate or the anti-fatigue method candidate has a high anti-fatigue effect in a living body. （i） 抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をした被験対象生物と、抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をしなかった被験対象生物から採取されたそれぞれの細胞中のリン酸化されたeIF-2αの量を測定するリン酸化eIF-2α量測定工程と、
（ii） （i）のリン酸化eIF-2α量測定工程によって得られた、当該抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施の有無によるリン酸化されたeIF-2αの量の変化の測定結果に基づき、当該抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施の有無による細胞中のリン酸化されたeIF-2αの量の変化を算出する、リン酸化eIF-2α量変化算出工程と、
（iii） （ii）のリン酸化eIF-2α量変化算出工程によって得られた当該抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施の有無による細胞中のリン酸化されたeIF-2αの量変化に基づき、抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をした被験対象生物から採取された細胞中のリン酸化されたeIF-2αの量が減少したとき、当該抗疲労物質候補または抗疲労法候補の生体における抗疲労効果が高いと判定する抗疲労効果判定工程
とを含む、抗疲労物質候補または抗疲労法候補の抗疲労効果評価方法。 (I) Cells collected from the test subject organisms that ingested the anti-fatigue substance candidate or implemented the anti-fatigue method candidate and the test subject organisms that did not ingest the anti-fatigue substance candidate or implement the anti-fatigue method candidate. A phosphorylated eIF-2α amount measuring step for measuring the amount of phosphorylated eIF-2α in the cell,
(Ii) Measurement of changes in the amount of phosphorylated eIF-2α depending on the intake of the anti-fatigue substance candidate or the implementation of the anti-fatigue method candidate obtained by the phosphorylated eIF-2α amount measurement step of (i). Based on the results, a phosphorylated eIF-2α amount change calculation step for calculating the change in the amount of phosphorylated eIF-2α in the cell depending on whether or not the anti-fatigue substance candidate is ingested or the anti-fatigue method candidate is implemented, and
(Iii) Changes in the amount of phosphorylated eIF-2α in cells depending on whether or not the anti-fatigue substance candidate is ingested or the anti-fatigue method candidate is implemented in the phosphorylated eIF-2α amount change calculation step of (ii). When the amount of phosphorylated eIF-2α in the cells collected from the subject organism that ingested the anti-fatigue substance candidate or performed the anti-fatigue method candidate decreased, the said anti-fatigue substance candidate or anti-fatigue A method for evaluating an anti-fatigue effect of an anti-fatigue substance candidate or an anti-fatigue method candidate, which comprises an anti-fatigue effect determination step for determining that the anti-fatigue effect of the method candidate is high in a living body. 請求項1に記載の疲労度評価方法、または、請求項5もしくは8に記載の疲労度評価キットのいずれかを用いて、抗疲労物質候補または抗疲労法候補の抗疲労効果を測定することを特徴とする、請求項10または11に記載の抗疲労効果評価方法。 Measuring the anti-fatigue effect of an anti-fatigue substance candidate or anti-fatigue method candidate using either the fatigue evaluation method according to claim 1 or the fatigue evaluation kit according to claim 5 or 8. The anti-fatigue effect evaluation method according to claim 10 or 11. 抗疲労物質または抗疲労法をスクリーニングするための、請求項10ないし12のいずれか一項に記載の抗疲労効果評価方法。 The anti-fatigue effect evaluation method according to any one of claims 10 to 12, for screening an anti-fatigue substance or an anti-fatigue method. （i） 被験対象生物が抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をする前に当該被験対象生物から採取された細胞中のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量を測定する、摂取前測定工程と、
（ii） 被験対象生物が抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をした後に当該被験対象生物から採取された細胞中のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量を測定する、摂取後測定工程と、
（iii） （i）の摂取前測定工程、及び（ii）の摂取後測定工程によって得られた、当該抗疲労物質候補の摂取または当該抗疲労法候補の実施前後におけるeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量の変化の測定結果に基づき、当該抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施前後における細胞中のeIF2αリン酸化シグナル抑制因子の量とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の変化を算出する、算出工程と、
（iv） （iii）の算出工程によって得られた当該抗疲労物質候補の摂取または当該抗疲労法候補の実施前後における細胞中のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量の変化に基づき、抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をした後の被験対象生物から採取された細胞中のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量が増加したとき、または、eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量が減少したとき、当該抗疲労物質候補または抗疲労法候補の生体における抗疲労効果が高いと判定する、抗疲労効果判定工程
とを含む、抗疲労物質候補または抗疲労法候補の抗疲労効果評価方法であって、
ここで、該eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子が、growth arrest and DNA damage-inducible protein 34 (GADD34)、non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein (Nck)1、Nck2、constitutive repressor of eIF-2α phosphorylation (CReP)、zinc finger protein 36 homolog (ZFP36)、およびglucocorticoid-induced leucine zipper (GILZ)からなる群から選ばれる少なくとも一種であり、
該eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子が、リン酸化されたeIF-2α、または、C/EBP-homologous protein (CHOP)である、抗疲労効果評価方法。 (I) The amount of eIF-2α phosphorylation signal inhibitor and eIF-2α phosphorus in cells collected from the test subject organism before ingestion of the anti-fatigue substance candidate or implementation of the anti-fatigue method candidate. Pre-ingestion measurement steps to measure the amount of oxidative signaling factors,
(Ii) Amount of eIF-2α phosphorylation signal inhibitor and eIF-2α phosphorylation in cells collected from the test subject organism after ingestion of anti-fatigue substance candidate or implementation of anti-fatigue method candidate. Post-ingestion measurement steps to measure the amount of signaling factors,
(Iii) Suppression of eIF-2α phosphorylation signal before and after ingestion of the anti-fatigue substance candidate or implementation of the anti-fatigue method candidate obtained by the pre-intake measurement step of (i) and the post-intake measurement step of (ii). Based on the measurement results of changes in the amount of factors and the amount of eIF-2α phosphorylation signal transduction factor, the amount of eIF2α phosphorylation signal inhibitor in cells before and after ingestion of the anti-fatigue substance candidate or implementation of anti-fatigue method candidate. eIF-2α Phosphorylation signal transduction factor changes in the calculation process and
(Iv) Amount of eIF-2α phosphorylation signal inhibitor and eIF-2α phosphorylation signal in cells before and after ingestion of the anti-fatigue substance candidate obtained by the calculation step of (iii) or implementation of the anti-fatigue method candidate. When the amount of eIF-2α phosphorylation signal inhibitor in cells collected from the subject organism after ingestion of anti-fatigue substance candidate or implementation of anti-fatigue method candidate is increased based on the change in the amount of transmission factor. Or, when the amount of the eIF-2α phosphorylation signaling factor decreases, the anti-fatigue effect determination step of determining that the anti-fatigue substance candidate or the anti-fatigue method candidate has a high anti-fatigue effect in the living body is included. It is a method for evaluating the anti-fatigue effect of a fatigue substance candidate or an anti-fatigue method candidate.
Here, the eIF-2α phosphorylation signal inhibitor is growth arrest and DNA damage-inducible protein 34 (GADD34), non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein (Nck) 1, Nck2, constitutive repressor of eIF-2α phosphorylation. At least one selected from the group consisting of (CReP), zinc finger protein 36 homolog (ZFP36), and glucocorticoid-induced leucine zipper (GILZ).
A method for evaluating an anti-fatigue effect, wherein the eIF-2α phosphorylation signaling factor is phosphorylated eIF-2α or C / EBP-homologous protein (CHOP). （i） 被験対象生物が抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をした被験対象生物と、しなかった被験対象生物の細胞から採取されたそれぞれの細胞中のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量を測定する、測定工程と、
（ii） （i）の測定工程によって得られた、当該抗疲労物質候補の摂取または当該抗疲労法候補の実施の有無によるeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量の変化の測定結果に基づき、当該抗疲労物質候補の摂取または当該抗疲労法候補の有無による細胞中のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量の変化を算出する、算出工程と、
（iii） （ii）の算出工程によって得られた当該抗疲労物質候補の摂取または当該抗疲労法候補の実施の有無による細胞中のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量とeIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量の変化に基づき、抗疲労物質候補の摂取または抗疲労法候補の実施をした被験対象生物から採取された細胞中のeIF-2αリン酸化シグナル抑制因子の量が増加したとき、または、eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子の量が減少したとき、当該抗疲労物質候補の摂取または当該抗疲労法候補の生体における抗疲労効果が高いと判定する、抗疲労効果判定工程
とを含む、抗疲労物質候補または抗疲労法候補の抗疲労効果評価方法であって、
ここで、該eIF-2αリン酸化シグナル抑制因子が、growth arrest and DNA damage-inducible protein 34 (GADD34)、non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein (Nck)1、Nck2、constitutive repressor of eIF-2α phosphorylation (CReP)、zinc finger protein 36 homolog (ZFP36)、およびglucocorticoid-induced leucine zipper (GILZ)からなる群から選ばれる少なくとも一種であり、
該eIF-2αリン酸化シグナル伝達因子が、リン酸化されたeIF-2α、または、C/EBP-homologous protein (CHOP)である、抗疲労効果評価方法。 (I) eIF-2α phosphorylation signal in each cell collected from the cells of the test subject organism in which the test subject organism ingested the anti-fatigue substance candidate or performed the anti-fatigue method candidate and the test target organism in which the test subject organism did not ingest the anti-fatigue method candidate. A measurement step that measures the amount of inhibitory factor and the amount of eIF-2α phosphorylation signaling factor,
(Ii) The amount of eIF-2α phosphorylation signal inhibitor and eIF-2α phosphorylation signal transduction depending on the ingestion of the anti-fatigue substance candidate or the implementation of the anti-fatigue method candidate obtained by the measurement step of (i). Based on the measurement results of changes in the amount of factors, the amount of eIF-2α phosphorylation signal inhibitor and the eIF-2α phosphorylation signal transduction factor in cells depending on the intake of the anti-fatigue substance candidate or the presence or absence of the anti-fatigue method candidate. A calculation process that calculates changes in quantity,
(Iii) The amount of eIF-2α phosphorylation signal inhibitor and eIF-2α phosphorylation in cells depending on the intake of the anti-fatigue substance candidate obtained by the calculation step of (ii) or the implementation of the anti-fatigue method candidate. When the amount of eIF-2α phosphorylation signal inhibitor in cells collected from the subject organism that ingested the anti-fatigue substance candidate or performed the anti-fatigue method candidate based on the change in the amount of signaling factor, Alternatively, it includes an anti-fatigue effect determination step in which it is determined that the intake of the anti-fatigue substance candidate or the anti-fatigue effect in the living body of the anti-fatigue method candidate is high when the amount of the eIF-2α phosphorylation signal transduction factor decreases. , An anti-fatigue substance candidate or anti-fatigue method candidate anti-fatigue effect evaluation method,
Here, the eIF-2α phosphorylation signal inhibitor is growth arrest and DNA damage-inducible protein 34 (GADD34), non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein (Nck) 1, Nck2, constitutive repressor of eIF-2α phosphorylation. At least one selected from the group consisting of (CReP), zinc finger protein 36 homolog (ZFP36), and glucocorticoid-induced leucine zipper (GILZ).
A method for evaluating an anti-fatigue effect, wherein the eIF-2α phosphorylation signaling factor is phosphorylated eIF-2α or C / EBP-homologous protein (CHOP). Salubrinalの投与により疲労を生じさせることを特徴とする、非ヒト動物の疲労モデル動物としての使用。 Use as a fatigue model animal for non-human animals , characterized by causing fatigue by administration of Salubrinal . ATF3遺伝子またはその遺伝子産物を導入することを特徴とする、遺伝子改変非ヒト動物の疲労モデル動物としての使用。 Use as a fatigue model animal for genetically modified non-human animals , characterized by the introduction of the ATF3 gene or its gene product. ATF3遺伝子の発現または該遺伝子の遺伝子産物の機能を阻害して抗疲労能を付与することを特徴とする、遺伝子改変非ヒト動物の抗疲労モデル動物としての使用。 Use as an anti-fatigue model animal of a genetically modified non-human animal , which is characterized by inhibiting the expression of the ATF3 gene or the function of the gene product of the gene to impart anti-fatigue ability. ISRIBの投与により抗疲労能を付与することを特徴とする、非ヒト動物の抗疲労モデル動物としての使用。 Use as an anti-fatigue model animal of non-human animals , which is characterized by imparting anti-fatigue ability by administration of ISRIB . 細胞中のリン酸化されたeIF-2αの量を指標として、被験者の疲労がnonpathological fatigueであるかpathological fatigueであるかを判定することを特徴とする、疲労の質を評価する方法であって、ここで、上記被験者の自覚的疲労感が強いにも関わらず、上記被験者から採取した細胞中のリン酸化されたeIF-2αの量が基準値より高ければ、上記被験者の疲労がnonpathological fatigueであると判定し、基準値より高くなければ、上記被験者の疲労がpathological fatigueであると判定し、さらにここで、該基準値は、健常者から採取された細胞中のリン酸化されたeIF-2αの量である、疲労の質を評価する方法。 A method for evaluating the quality of fatigue, which comprises determining whether a subject's fatigue is nonpathological fatigue or pathological fatigue using the amount of phosphorylated eIF-2α in cells as an index. Here, if the amount of phosphorylated eIF-2α in the cells collected from the subject is higher than the reference value even though the subject has a strong sense of subjective fatigue, the subject's fatigue is nonpathological fatigue. If it is not higher than the reference value, it is determined that the subject's fatigue is pathological fatigue, and here, the reference value is that of phosphorylated eIF-2α in cells collected from a healthy subject. A method of assessing the quality of fatigue, which is a quantity. eIF-2αリン酸化が関係するシグナル伝達経路の効果を抑制する物質を含む、抗疲労薬であって、該物質がISRIBである、抗疲労薬。 An anti-fatigue drug comprising a substance that suppresses the effect of a signal transduction pathway involving eIF-2α phosphorylation, wherein the substance is ISRIB.
JP2019212285A 2014-08-27 2019-11-25 Factors involved in fatigue and their utilization Active JP7033113B2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014172962 2014-08-27
JP2014172962 2014-08-27

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016545433A Division JP6623162B2 (en) 2014-08-27 2015-08-13 Factors involved in fatigue and their use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2020058355A JP2020058355A (en) 2020-04-16
JP7033113B2 true JP7033113B2 (en) 2022-03-09

Family

ID=55399478

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016545433A Active JP6623162B2 (en) 2014-08-27 2015-08-13 Factors involved in fatigue and their use
JP2019212285A Active JP7033113B2 (en) 2014-08-27 2019-11-25 Factors involved in fatigue and their utilization

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016545433A Active JP6623162B2 (en) 2014-08-27 2015-08-13 Factors involved in fatigue and their use

Country Status (2)

Country Link
JP (2) JP6623162B2 (en)
WO (1) WO2016031581A1 (en)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016031581A1 (en) * 2014-08-27 2016-03-03 株式会社ウイルス医科学研究所 Factor involved in fatigue and use of same

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002173442A (en) 2000-12-04 2002-06-21 Yaizu Suisankagaku Industry Co Ltd Antifatigue composition
JP2007330263A (en) 2004-07-14 2007-12-27 Virus Ikagaku Kenkyusho Inc Fatigue degree evaluation method and use thereof
WO2009041501A1 (en) 2007-09-27 2009-04-02 Virus Ikagaku Kenkyusho Inc. Factor involved in latent infection with herpesvirus, and use thereof
JP2012019784A (en) 2010-06-18 2012-02-02 Taisho Pharmaceutical Co Ltd How to judge fatigue
JP2013150558A (en) 2012-01-24 2013-08-08 Kyushu Univ Method for evaluating fatigue state and stress state
JP6623162B2 (en) 2014-08-27 2019-12-18 株式会社ウイルス医科学研究所 Factors involved in fatigue and their use

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002173442A (en) 2000-12-04 2002-06-21 Yaizu Suisankagaku Industry Co Ltd Antifatigue composition
JP2007330263A (en) 2004-07-14 2007-12-27 Virus Ikagaku Kenkyusho Inc Fatigue degree evaluation method and use thereof
WO2009041501A1 (en) 2007-09-27 2009-04-02 Virus Ikagaku Kenkyusho Inc. Factor involved in latent infection with herpesvirus, and use thereof
JP2012019784A (en) 2010-06-18 2012-02-02 Taisho Pharmaceutical Co Ltd How to judge fatigue
JP2013150558A (en) 2012-01-24 2013-08-08 Kyushu Univ Method for evaluating fatigue state and stress state
JP6623162B2 (en) 2014-08-27 2019-12-18 株式会社ウイルス医科学研究所 Factors involved in fatigue and their use

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Allen-Jennings, A. E. et al.，The roles of ATF3 in liver dysfunction and the regulation of phosphoenolpyruvate carboxykinase gene expression，J. Biol. Chem.，2002年，Vol. 277(22)，pp. 20020-20025
Delfino, D. V. et al.，Decrease of Bcl-xL and augmentation of thymocyte apoptosis in GILZ overexpressing transgenic mice，Blood，2004年，Vol. 104(13)，pp. 4134-4141
Leu, C. M. et al.，Nck, a missing adaptor between the B-cell receptor complex and the BCAP/PI3K/Akt pathway，Cell Mol. Immunol.，2013年，Vol. 11(2)，pp. 120-122
Ma, T. et al.，Suppression of eIF2α kinases alleviates AD-related plasticity and memory deficits，Nat. Neurosci.，2013年，Vol. 16(9)，pp. 1299-1305
Saxena, S. et al.，A role for motoneuron subtype-selective ER stress in disease manifestations of FALS mice，Nat. Neurosci.，2009年，Vol. 12(5)，pp. 627-636
渡辺恭良，疲労研究の最前線 ～疲労克服戦略～，特定非営利活動法人近畿アグリハイテクホームページ[online]，2006年，pp. 1,3-15
近藤一博，ヘルペスウイルスの再活性化を用いた評価法，日本臨床，2007年06月01日，Vol.65(6)，pp.1043-1048
近藤一博ほか，新しい疲労のみかた，体力科学，2014年01月24日，Vol.63(1)，p.3

Also Published As

Publication number Publication date
JP2020058355A (en) 2020-04-16
JP6623162B2 (en) 2019-12-18
WO2016031581A1 (en) 2016-03-03
JPWO2016031581A1 (en) 2017-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Thorburn et al. Evidence that asthma is a developmental origin disease influenced by maternal diet and bacterial metabolites
Gibney et al. Inhibition of stress-induced hepatic tryptophan 2, 3-dioxygenase exhibits antidepressant activity in an animal model of depressive behaviour
CN108348517B (en) Nonselective metabotropic glutamate receptor activators for attention deficit disorder and 22Q syndrome
O'Connor et al. MxA gene expression in juvenile dermatomyositis peripheral blood mononuclear cells: association with muscle involvement
KR102621064B1 (en) Analysis and prediction of traumatic brain injury and concussion symptoms
US20160068918A1 (en) Methods for assessing fatigue level and applications thereof
JP7653229B2 (en) How to assess the placebo effect
JP7033113B2 (en) Factors involved in fatigue and their utilization
JP4812708B2 (en) Fatigue degree evaluation method and use thereof
Hu Microarray analysis of PBMC after Plasmodium falciparum infection: Molecular insights into disease pathogenesis
Kim et al. Association between common genetic variants of α2A-, α2B-and α2C-adrenoceptors and the risk of silent brain infarction
WO2022232446A1 (en) Methods for assessing infection using mitochondrial cell-free dna
Slevin et al. Intestinal expression of LAG-3 correlates with inflammatory activity and response to biological therapy in ulcerative colitis
Chhabra et al. Concurrent sensitization to Aspergillus fumigatus in tropical pulmonary eosinophilia
WO2013012038A1 (en) Method for determining depression, kit for analyzing serotonin transporter, and kit for analyzing ubiquitinated serotonin transporter in blood
Radin et al. The association of cortisol with prevalent and incident type 2 diabetes in older community-dwelling adults
Yun et al. OGG1-driven pathogenesis in Kawasaki disease: Identification and pharmacological regulation of a molecular marker validated in transgenic mice and clinical models
Chrysanthopoulou et al. P065 REDD1/autophagy-driven NETosis promotes IL-1β-mediated inflammation in active ulcerative colitis
Shahi et al. The relationship between neurodevelopmental disorders (NDDs) and NLRP3 inflammasome
WO2025016918A1 (en) Prediction of an outcome of a subject suffering from a glioma
Bessette et al. AB0634 PREDICTORS OF CDAI TRAJECTORIES IN RHEUMATOID ARTHRITIS PATIENTS TREATED WITH ABATACEPT: A REAL-WORLD STUDY
Thomas Psoriasis: a closer look
Orbai et al. AB0741 Multidimensional Health Related Quality of Life Assessment Using PROMIS (Patient Reported Outcome Measurement Information System) Measures in Psoriatic Arthritis Flares
De León et al. ORAL PRESENTATION
Wheaton Novel Mechanisms Impacting MAPK and CREB Signaling in the Mammalian Suprachiasmatic Nucleus

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20191217

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20191217

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20210125

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210317

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20210611

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20210830

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20211005

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20220224

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20220225

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7033113

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250