JP7027521B2 - 被験試料の評価方法 - Google Patents
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Description
本発明は、被験試料の評価方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、被験物質がサイトカイン産生抑制作用を有するかどうかを評価するための被験試料の評価方法およびサイトカイン産生抑制剤に関する。
皮膚に生じた炎症は、ニキビ痕、シミ、シワなどが生じる原因となる。そこで、皮膚に生じた炎症を抑制する抗炎症剤を含む化粧料などが提案されている（例えば、特許文献１参照）。しかし、前記抗炎症剤は、皮膚に既に発生している炎症を鎮静化するものであることから、炎症の原因因子の一つであるサイトカインの産生を抑制することにより、炎症の発症を抑制することができる炎症予防用化粧料、炎症予防剤などの開発が望まれている。
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、被験試料が皮膚細胞におけるサイトカイン産生を抑制する作用を有するかどうかを容易に評価することができる被験試料の評価方法および皮膚細胞におけるサイトカイン産生を効果的に抑制することができるサイトカイン産生抑制剤を提供することを目的とする。
本発明は、
（１）被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価する被験試料の評価方法であって、ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料とを接触させ、被験試料によってＴＲＰＭ４を介して引き起こされる生理学的事象を測定し、当該生理学的事象に基づき、前記被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価する際に、前記ＴＲＰＭ４発現細胞としてサイトカイン発現能を有する角化細胞を用い、前記生理学的事象としてサイトカイン産生を用い、
（Ａ１）サイトカイン発現能を有する角化細胞と被験試料とサイトカイン産生促進物質とを接触させ、前記サイトカイン発現能を有する角化細胞におけるサイトカインおよび／またはその遺伝子の発現量を測定するステップ、
（Ａ２）サイトカイン発現能を有する角化細胞とサイトカイン産生促進物質とを接触させ、前記サイトカイン発現能を有する角化細胞におけるサイトカインおよび／またはその遺伝子の発現量を測定するステップ、
（Ａ３）前記サイトカイン発現能を有する角化細胞におけるＴＲＰＭ４の機能が欠損したＴＲＰＭ４欠損細胞と被験試料とサイトカイン産生促進物質とを接触させ、前記ＴＲＰＭ４欠損細胞におけるサイトカインおよび／またはその遺伝子の発現量を測定するステップ、
（Ａ４）前記サイトカイン発現能を有する角化細胞におけるＴＲＰＭ４の機能が欠損したＴＲＰＭ４欠損細胞とサイトカイン産生促進物質とを接触させ、前記ＴＲＰＭ４欠損細胞におけるサイトカインおよび／またはその遺伝子の発現量を測定するステップ、および
（Ａ５）ステップ（Ａ１）～（Ａ４）で測定された発現量に基づき、前記被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価するステップ
を行なうことを特徴とする被験試料の評価方法、
（２）被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価する被験試料の評価方法であって、ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料とを接触させ、ＴＲＰＭ４活性を測定し、当該ＴＲＰＭ４活性に基づき、前記被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価する際に、前記ＴＲＰＭ４発現細胞としてサイトカイン発現能を有する角化細胞を用い、
（Ｂ１）前記サイトカイン発現能を有する角化細胞と被験試料とを接触させ、被験試料の接触前後のサイトカイン発現能を有する角化細胞におけるＴＲＰＭ４活性の変化を測定するステップ、および
（Ｂ２）ステップ（Ｂ１）で測定されたＴＲＰＭ４活性の変化に基づき、前記被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価するステップ
を行なうことを特徴とする被験試料の評価方法、
（３）前記サイトカインがインターロイキン－１α、インターロイキン－１β、インターロイキン－２、インターロイキン－６、インターロイキン－８または腫瘍壊死因子である前記（１）または（２）に記載の被験試料の評価方法、および
（４）前記サイトカイン産生がＴＲＰＭ４の活性化によるサイトカイン産生である前記（１）～（３）のいずれかに記載の被験試料の評価方法
に関する。
（１）被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価する被験試料の評価方法であって、ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料とを接触させ、被験試料によってＴＲＰＭ４を介して引き起こされる生理学的事象を測定し、当該生理学的事象に基づき、前記被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価する際に、前記ＴＲＰＭ４発現細胞としてサイトカイン発現能を有する角化細胞を用い、前記生理学的事象としてサイトカイン産生を用い、
（Ａ１）サイトカイン発現能を有する角化細胞と被験試料とサイトカイン産生促進物質とを接触させ、前記サイトカイン発現能を有する角化細胞におけるサイトカインおよび／またはその遺伝子の発現量を測定するステップ、
（Ａ２）サイトカイン発現能を有する角化細胞とサイトカイン産生促進物質とを接触させ、前記サイトカイン発現能を有する角化細胞におけるサイトカインおよび／またはその遺伝子の発現量を測定するステップ、
（Ａ３）前記サイトカイン発現能を有する角化細胞におけるＴＲＰＭ４の機能が欠損したＴＲＰＭ４欠損細胞と被験試料とサイトカイン産生促進物質とを接触させ、前記ＴＲＰＭ４欠損細胞におけるサイトカインおよび／またはその遺伝子の発現量を測定するステップ、
（Ａ４）前記サイトカイン発現能を有する角化細胞におけるＴＲＰＭ４の機能が欠損したＴＲＰＭ４欠損細胞とサイトカイン産生促進物質とを接触させ、前記ＴＲＰＭ４欠損細胞におけるサイトカインおよび／またはその遺伝子の発現量を測定するステップ、および
（Ａ５）ステップ（Ａ１）～（Ａ４）で測定された発現量に基づき、前記被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価するステップ
を行なうことを特徴とする被験試料の評価方法、
（２）被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価する被験試料の評価方法であって、ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料とを接触させ、ＴＲＰＭ４活性を測定し、当該ＴＲＰＭ４活性に基づき、前記被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価する際に、前記ＴＲＰＭ４発現細胞としてサイトカイン発現能を有する角化細胞を用い、
（Ｂ１）前記サイトカイン発現能を有する角化細胞と被験試料とを接触させ、被験試料の接触前後のサイトカイン発現能を有する角化細胞におけるＴＲＰＭ４活性の変化を測定するステップ、および
（Ｂ２）ステップ（Ｂ１）で測定されたＴＲＰＭ４活性の変化に基づき、前記被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価するステップ
を行なうことを特徴とする被験試料の評価方法、
（３）前記サイトカインがインターロイキン－１α、インターロイキン－１β、インターロイキン－２、インターロイキン－６、インターロイキン－８または腫瘍壊死因子である前記（１）または（２）に記載の被験試料の評価方法、および
（４）前記サイトカイン産生がＴＲＰＭ４の活性化によるサイトカイン産生である前記（１）～（３）のいずれかに記載の被験試料の評価方法
に関する。
本発明によれば、被験試料が皮膚細胞におけるサイトカイン産生を抑制する作用を有するかどうかを容易に評価することができる被験試料の評価方法および皮膚細胞におけるサイトカイン産生を効果的に抑制することができるサイトカイン産生抑制剤が提供される。
１．被験試料の評価方法
本発明の被験試料の評価方法は、被験試料が有する皮膚細胞におけるサイトカイン産生抑制作用を評価する被験試料の評価方法であって、ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料とを接触させ、被験試料によってＴＲＰＭ４発現細胞におけるＴＲＰＭ４を介して引き起こされる生理学的事象を測定し、当該生理学的事象に基づき、被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価することを特徴とする。
本発明の被験試料の評価方法は、被験試料が有する皮膚細胞におけるサイトカイン産生抑制作用を評価する被験試料の評価方法であって、ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料とを接触させ、被験試料によってＴＲＰＭ４発現細胞におけるＴＲＰＭ４を介して引き起こされる生理学的事象を測定し、当該生理学的事象に基づき、被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価することを特徴とする。
本発明の被験試料の評価方法によれば、被験試料によってＴＲＰＭ４発現細胞におけるＴＲＰＭ４を介して引き起こされる生理学的事象を測定し、当該生理学的事象に基づき、被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価するという操作が採られているので、被験試料が皮膚細胞におけるＴＲＰＭ４の活性化によるサイトカイン産生を抑制するかどうかを的確に評価することができる。したがって、本発明の被験試料の評価方法によれば、被験試料が皮膚細胞におけるサイトカイン産生を抑制する作用を有するかどうかを容易に評価することができる。また、本発明の被験試料の評価方法によれば、ＴＲＰＭ４発現細胞が用いられているので、被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用の評価を再現性よく、しかも同一条件下に同時に何回も行なうことができる。
被験試料は、サイトカイン産生抑制作用を有するかどうかの評価対象の試料である。被験試料としては、例えば、無機化合物、有機化合物、植物抽出物、細胞培養物、細胞抽出物などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。被験試料は、液体である場合、そのまま用いてもよく、必要に応じて溶媒で希釈して用いてもよい。また、被験試料は、固体である場合、溶媒に溶解させて用いることができる。
溶媒は、被験試料の種類、測定対象の生理学的事象の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、被験試料の種類、測定対象の生理学的事象の種類などに応じて決定することが好ましい。溶媒としては、例えば、エタノール、生理的食塩水、リン酸緩衝生理的食塩水、精製水、培地、カルシウム含有溶液〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭ２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕、カルシウム不含溶液〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭグリコールエーテルジアミン四酢酸、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）〕などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。培地は、ＴＲＰＭ４発現細胞が生育するのに適した培地成分を含有する。培地成分としては、例えば、グルコース、アミノ酸、ペプトン、ビタミン、細胞増殖促進因子、血清、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。培地は、基本培地に培地成分を補うことによって製造された培地であってもよく、商業的に入手可能な培地であってもよい。基本培地としては、特に限定されないが、イーグル最小培地（以下、「ＭＥＭ」という）、ダルベッコ改変イーグル培地（以下、「ＤＭＥＭ」という）、ＲＰＭＩ－１６４０培地などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。培地は、ＴＲＰＭ４発現細胞の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、ＴＲＰＭ４発現細胞の種類などに応じて決定することが好ましい。
ＴＲＰＭ４発現細胞は、野生型ＴＲＰＭ４を発現する細胞と同等の生理学的機能を発現する細胞である。野生型ＴＲＰＭ４を発現する細胞と同等の生理学的機能としては、例えば、ＴＲＰＭ４アゴニストによる化学刺激などの刺激による細胞外から細胞内へのカリウムイオンおよびナトリウムイオンの透過などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ＴＲＰＭ４発現細胞は、内因性ＴＲＰＭ４を発現する内因性ＴＲＰＭ４発現細胞であってもよく、外因性ＴＲＰＭ４発現細胞であってもよい。
内因性ＴＲＰＭ４発現細胞としては、例えば、正常ヒト表皮角化細胞、ＨａＣａＴ細胞、ＮＣＴＣ２５４４などの角化細胞；ヒト心筋細胞、ヒトＴ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＭＯＬＴ－４細胞、Ｕ－９３７細胞などのＴ細胞；ヒト肥満細胞、ＨＭＣ－１などの肥満細胞；ヒト単球細胞、ＴＨＰ－１などの単球細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
外因性ＴＲＰＭ４発現細胞は、外因性ＴＲＰＭ４を過剰発現している細胞であればよい。外因性ＴＲＰＭ４細胞は、宿主細胞に導入された核酸が染色体外要素として存在し、一過的にＴＲＰＭ４を発現する細胞であってもよく、宿主細胞に導入された核酸が当該宿主細胞の染色体に組み込まれた細胞であってもよい。なお、外因性ＴＲＰＭ４発現細胞は、本発明の目的を妨げない範囲で、内因性ＴＲＰＭ４を発現していてもよい。外因性ＴＲＰＭ４発現細胞は、例えば、ＴＲＰＭ４をコードする核酸を保持するＴＲＰＭ４発現ベクターを宿主細胞に導入することなどによって得ることができる。
ＴＲＰＭ４をコードする核酸としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１７６３６に示されるｍＲＮＡ、当該ｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ＴＲＰＭ４をコードする核酸の具体例としては、例えば、配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、配列番号：１に示される配列に対する配列同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、ＴＲＰＭ４活性を示す変異型ポリペプチドをコードする核酸などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。なお、「配列同一性」は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムに基づくＰＲＯＴＥＩＮ ＢＬＡＳＴをデフォルト値で用い、配列番号：１に示されるアミノ酸配列（参照配列）に対して、評価対象のアミノ酸配列（クエリー配列）をアライメントして算出された値をいう。配列同一性は、ＴＲＰＭ４活性を発現させる観点から、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上であり、その上限値は１００％である。
ＴＲＰＭ４活性としては、例えば、細胞におけるカリウムイオン流束およびナトリウムイオン流束の調節活性、細胞における膜電位の調節活性などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらのＴＲＰＭ４活性は、例えば、ＴＲＰＭ４アゴニストによってＴＲＰＭ４が活性化されることによって発現する。
宿主細胞は、内因性ＴＲＰＭ４を発現する細胞であってもよく、内因性ＴＲＰＭ４を発現しない細胞であってもよい。宿主細胞としては、例えば、ヒト細胞、サル細胞、マウス細胞、チャイニーズハムスター細胞などの哺乳動物細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ヒト細胞としては、例えば、ＨＥＫ２９３細胞などのヒト腎臓細胞；Ｈｅｌａ細胞などのヒトがん細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。サル細胞としては、例えば、ＣＯＳ－７細胞などのサル腎臓細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。マウス細胞としては、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などのマウス胎児皮膚線維芽細胞などのマウス細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。チャイニーズハムスター細胞としては、例えば、ＣＨＯ細胞などのチャイニーズハムスター卵巣細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの宿主細胞のなかでは、優れた取り扱い性を確保し、ディッシュ、プレートなどの培養容器、観察用カバーグラスなどへの接着性を確保し、外因性ＴＲＰＭ４遺伝子の発現効率を向上させる観点から、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ－７細胞およびＮＩＮ３Ｔ３細胞が好ましく、ＨＥＫ２９３細胞がより好ましい。ＴＲＰＭ４発現ベクターは、ＴＲＰＭ４をコードする核酸をベクターと連結させることなどにより得られる。ベクターは、宿主細胞の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、宿主細胞の種類などに応じて決定することが好ましい。得られた細胞が外因性ＴＲＰＭ４発現細胞であることの確認方法としては、例えば、細胞をＴＲＰＭ４アゴニストと接触させ、細胞内カルシウムイオン濃度を指標として細胞外から細胞内に取り込まれたナトリウムイオンの流入によるカルシウムイオン濃度の減少量を測定する方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ＴＲＰＭ４アゴニストの接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度がＴＲＰＭ４アゴニストと接触させていない細胞の細胞内カルシウムイオン濃度よりも小さい場合、得られた細胞が外因性ＴＲＰＭ４発現細胞であると判断することができる。既知のＴＲＰＭ４アゴニストとしては、例えば、Ｎ－［４－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾール－１－イル］フェニル］－４－メチル－１，２，３－チアジアゾール－５－カルボキサミド）（以下、「ＢＴＰ２」という）、１－（６－［（１７β－３－メトキシエストラ－１，３，５（１０）－トリエン－１７－イル）アミノ］ヘキシル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン（以下、「Ｕ－７３１２２」という）、デカバナジウム酸塩などが挙げられるが、本発明は、特に限定されるものではない。
ＴＲＰＭ４発現細胞は、被験試料がサイトカイン産生抑制作用を有するかどうかを高い精度で評価する観点から、好ましくはサイトカイン発現能を有するＴＲＰＭ４発現細胞である。サイトカイン発現能を有するＴＲＰＭ４発現細胞としては、例えば、ＨａＣａＴ細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
ＴＲＰＭ４を介して引き起こされる生理学的事象としては、例えば、ＴＲＰＭ４の活性化に起因するサイトカイン遺伝子の発現量の減少、ＴＲＰＭ４の活性化に起因するサイトカインの発現量の減少、ＴＲＰＭ４自体の活性の発現などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
ＴＲＰＭ４を介して引き起こされる生理学的事象として、ＴＲＰＭ４の活性化に起因するサイトカイン遺伝子の発現量の減少を用いる場合、本発明の被験試料の評価方法の具体例としては、以下の評価法１などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
＜評価法１＞
生理学的事象がサイトカイン産生であり、ＴＲＰＭ４発現細胞としてサイトカイン発現能を有するＴＲＰＭ４発現細胞を用い、前記生理学的事象を測定し、当該生理学的事象に基づき、前記被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価する際の操作が、
（Ａ１）サイトカイン発現能を有するＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料とサイトカイン産生促進物質とを接触させ、当該ＴＲＰＭ４発現細胞におけるサイトカインおよび／またはその遺伝子の発現量を測定するステップ、
（Ａ２）サイトカイン発現能を有するＴＲＰＭ４発現細胞とサイトカイン産生促進物質とを接触させ、当該ＴＲＰＭ４発現細胞におけるサイトカインおよび／またはその遺伝子の発現量を測定するステップ、
（Ａ３）前記ＴＲＰＭ４発現細胞におけるＴＲＰＭ４の機能が欠損したＴＲＰＭ４欠損細胞と被験試料とサイトカイン産生促進物質とを接触させ、当該ＴＲＰＭ４欠損細胞におけるサイトカインおよび／またはその遺伝子の発現量を測定するステップ、
（Ａ４）前記ＴＲＰＭ４発現細胞におけるＴＲＰＭ４の機能が欠損したＴＲＰＭ４欠損細胞とサイトカイン産生促進物質とを接触させ、当該ＴＲＰＭ４欠損細胞におけるサイトカインおよび／またはその遺伝子の発現量を測定するステップ、および
（Ａ５）ステップ（Ａ１）～（Ａ４）で測定された発現量に基づき、被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価するステップ
を含む方法。
生理学的事象がサイトカイン産生であり、ＴＲＰＭ４発現細胞としてサイトカイン発現能を有するＴＲＰＭ４発現細胞を用い、前記生理学的事象を測定し、当該生理学的事象に基づき、前記被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価する際の操作が、
（Ａ１）サイトカイン発現能を有するＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料とサイトカイン産生促進物質とを接触させ、当該ＴＲＰＭ４発現細胞におけるサイトカインおよび／またはその遺伝子の発現量を測定するステップ、
（Ａ２）サイトカイン発現能を有するＴＲＰＭ４発現細胞とサイトカイン産生促進物質とを接触させ、当該ＴＲＰＭ４発現細胞におけるサイトカインおよび／またはその遺伝子の発現量を測定するステップ、
（Ａ３）前記ＴＲＰＭ４発現細胞におけるＴＲＰＭ４の機能が欠損したＴＲＰＭ４欠損細胞と被験試料とサイトカイン産生促進物質とを接触させ、当該ＴＲＰＭ４欠損細胞におけるサイトカインおよび／またはその遺伝子の発現量を測定するステップ、
（Ａ４）前記ＴＲＰＭ４発現細胞におけるＴＲＰＭ４の機能が欠損したＴＲＰＭ４欠損細胞とサイトカイン産生促進物質とを接触させ、当該ＴＲＰＭ４欠損細胞におけるサイトカインおよび／またはその遺伝子の発現量を測定するステップ、および
（Ａ５）ステップ（Ａ１）～（Ａ４）で測定された発現量に基づき、被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価するステップ
を含む方法。
評価法１では、ステップ（Ａ３）および（Ａ４）にＴＲＰＭ４欠損細胞が用いられているので、被験試料によってＴＲＰＭ４発現細胞に引き起こされる生理学的事象が、ＴＲＰＭ４を介して引き起こされる生理学的事象であるかどうかを確認することができる。このことから、評価法１に用いられるＴＲＰＭ４発現細胞は、ＴＲＰＭ４を発現する点を除き、ＴＲＰＭ４欠損細胞を用いたときと同じ条件下に当該確認を行なう観点から、内因性ＴＲＰＭ４発現細胞が好ましい。また、ＴＲＰＭ４発現細胞は、被験試料がサイトカイン産生抑制作用を有するかどうかを高い精度で評価する観点から、好ましくはサイトカイン発現能を有するＴＲＰＭ４細胞である。サイトカイン発現能を有する内因性ＴＲＰＭ４発現細胞としては、例えば、ＨａＣａＴ細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
ステップ（Ａ１）では、サイトカイン発現能を有するＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料とサイトカイン産生促進物質とを接触させ、当該ＴＲＰＭ４発現細胞におけるサイトカインおよび／またはその遺伝子の発現量を測定する。
サイトカインとしては、例えば、インターロイキン－１α（以下、「ＩＬ－１α」という）、インターロイキン－１β（以下、「ＩＬ－１βという」、インターロイキン－２（以下、「ＩＬ－２」という）、インターロイキン－６（以下、「ＩＬ－６」という）、インターロイキン－８（以下、「ＩＬ－８」という）、腫瘍壊死因子（以下、「ＴＮＦ」という）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらのサイトカインのなかでは、皮膚における炎症の発症を抑制する作用を的確に評価する観点から、ＩＬ－１αおよびＩＬ－８が好ましい。サイトカイン遺伝子としては、例えば、ＩＬ－１α遺伝子、ＩＬ－１β遺伝子、ＩＬ－２遺伝子、ＩＬ－６遺伝子、ＩＬ－８遺伝子、ＴＮＦ遺伝子などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらのサイトカイン遺伝子のなかでは、皮膚における炎症の発症を抑制する作用を的確に評価する観点から、ＩＬ－１α遺伝子およびＩＬ－８遺伝子が好ましい。
サイトカイン産生促進物質としては、例えば、腫瘍壊死因子α（以下、「ＴＮＦα」という）、リポポリサッカライド、ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート（以下、「ＰＭＡ」という）、インターフェロンγ（以下、「ＩＦＮγ」という）、ＩＬ－１７、ＩＬ－２２、ＩＬ－３３、ヒスタミンなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料とサイトカイン産生促進物質とを接触させる順序としては、例えば、（ａ１）ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料とを接触させた後、当該ＴＲＰＭ４発現細胞とサイトカイン産生促進物質と接触させる順序、（ａ２）ＴＲＰＭ４発現細胞に被験試料およびサイトカイン産生促進物質を同時に接触させる順序、（ａ３）ＴＲＰＭ４発現細胞とサイトカイン産生促進物質とを接触させた後、当該ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料とを接触させる順序などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
ステップ（Ａ１）において、（ａ１）の順序を採用する場合、ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料との接触方法としては、例えば、被験試料中において、ＴＲＰＭ４発現細胞をインキュベーションする方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。また、ＴＲＰＭ４発現細胞とサイトカイン産生促進物質との接触方法としては、インキュベーション後の被験試料とＴＲＰＭ４発現細胞との混合物にサイトカイン産生促進物質を添加し、得られた混合物をインキュベーションする方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料との接触の際およびＴＲＰＭ４発現細胞とサイトカイン産生促進物質との接触の際には、測定対象の生理学的事象の測定に用いられる試薬を用いてもよい。
ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料との接触温度およびＴＲＰＭ４発現細胞とサイトカイン産生促進物質との接触温度は、ＴＲＰＭ４発現細胞の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、ＴＲＰＭ４発現細胞の種類などに応じて決定することが好ましい。ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料との接触温度およびＴＲＰＭ４発現細胞とサイトカイン産生促進物質との接触温度は、ＴＲＰＭ４発現細胞におけるＴＲＰＭ４活性の発現に適した温度条件を確保する観点から、通常、好ましくは３５～４０℃である。また、ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料との接触時間は、ＴＲＰＭ４発現細胞の種類、被験試料の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、ＴＲＰＭ４発現細胞の種類、被験試料の種類などに応じて決定することが好ましい。ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料との接触時間は、ＴＲＰＭ４活性への被験試料の影響を的確に評価する観点から、通常、好ましくは１分間～２４時間である。ＴＲＰＭ４発現細胞とサイトカイン産生促進物質との接触時間は、ＴＲＰＭ４発現細胞の種類、サイトカイン産生促進物質の種類、発現量の測定対象物質の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、ＴＲＰＭ４発現細胞の種類、サイトカイン産生促進物質の種類、発現量の測定対象物質の種類などに応じて決定することが好ましい。ＴＲＰＭ４発現細胞とサイトカイン産生促進物質との接触時間は、ＴＲＰＭ４活性への被験試料の影響を的確に評価する観点から、サイトカインの発現量を評価する場合、通常、好ましくは６～７２時間であり、サイトカイン遺伝子の発現量を評価する場合、通常、好ましくは１～１２時間である。
ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料との接触に際して、被験試料１ｍＬあたりのＴＲＰＭ４発現細胞の個数は、ＴＲＰＭ４発現細胞の種類、被験試料の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、ＴＲＰＭ４発現細胞の種類、被験試料の種類などに応じて決定することが好ましい。被験試料１ｍＬあたりのＴＲＰＭ４発現細胞の個数は、ＴＲＰＭ４を介して引き起こされる生理学的事象の測定精度を向上させる観点から、通常、好ましくは１×１０3個以上、より好ましくは１×１０4個以上であり、ＴＲＰＭ４細胞におけるＴＲＰＭ４を介して引き起こされる生理学的事象を的確に生じさせる観点から、好ましくは１×１０9個以下、より好ましくは１×１０8個以下である。
ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料との接触に際して、被験試料１ｍＬあたりのサイトカイン産生促進物質の量は、サイトカイン産生促進物質の種類、ＴＲＰＭ４発現細胞の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、サイトカイン産生促進物質の種類、ＴＲＰＭ４発現細胞の種類などに応じて決定することが好ましい。被験試料１ｍＬあたりのサイトカイン産生促進物質の量は、ＴＲＰＭ４活性への被験試料の影響を的確に評価する観点から、通常、好ましくは５～５００ｎｇである。
ステップ（Ａ１）において、（ａ２）または（ａ３）の順序を採用する場合、被験試料１ｍＬあたりのＴＲＰＭ４発現細胞の個数および被験試料１ｍＬあたりのサイトカイン産生促進物質の量は、（ａ１）の順序を採用するときの被験試料１ｍＬあたりのＴＲＰＭ４発現細胞の個数および被験試料１ｍＬあたりのサイトカイン産生促進物質の量と同様である。
ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料とサイトカイン産生促進物質との接触温度は、ＴＲＰＭ４発現細胞の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、ＴＲＰＭ４発現細胞の種類などに応じて決定することが好ましい。ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料とサイトカイン産生促進物質との接触温度は、ＴＲＰＭ４発現細胞におけるＴＲＰＭ４活性の発現に適した温度条件を確保する観点から、通常、好ましくは３５～４０℃である。
ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料とサイトカイン産生促進物質との接触時間は、ＴＲＰＭ４発現細胞の種類、被験試料の種類、サイトカイン産生促進物質の種類、発現量の測定対象物質の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、ＴＲＰＭ４発現細胞の種類、被験試料の種類、サイトカイン産生促進物質の種類、発現量の測定対象物質の種類などに応じて決定することが好ましい。ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料とサイトカイン産生促進物質との接触時間は、ＴＲＰＭ４活性への被験試料の影響を的確に評価する観点から、通常、サイトカインの発現量を評価する場合、通常、好ましくは６～７２時間であり、サイトカイン遺伝子の発現量を評価する場合、通常、好ましくは１～１２時間である。
サイトカインの発現量の測定方法としては、ウェスタンブロッティング法、酵素標識免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。サイトカイン遺伝子の発現量の測定方法としては、例えば、ノーザンブロッティング法、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
ウェスタンブロッティング法およびＥＬＩＳＡに用いられる抗体としては、例えば、抗サイトカイン抗体またはその抗体断片などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。抗サイトカイン抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。サイトカインの発現量の定量性を向上させる観点から、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体は、例えば、サイトカインまたはその一部に対して反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを培養し、培養上清を得、得られた培養上清について、必要に応じて硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどによる精製を行なうことにより得られる。ハイブリドーマは、例えば、サイトカインまたはその一部を動物の静脈内、皮下または腹腔内に投与することにより当該動物を免疫し、抗体産生細胞を得、この抗体産生細胞とミエローマ細胞とを細胞融合させ、得られた融合細胞をＨＡＴ培地で培養することなどにより得られる。また、ポリクローナル抗体は、サイトカインまたはその一部を動物の静脈内、皮下または腹腔内に投与することにより当該動物を免疫し、抗血清を得、得られた抗血清について、必要に応じて硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどによる精製を行なうことなどにより得られる。抗体断片は、例えば、抗サイトカイン抗体を消化酵素で分解し、必要に応じて得られた分解産物を精製することなどにより得られる。また、抗サイトカイン抗体およびその抗体断片として、商業的に入手可能な抗サイトカイン抗体およびその抗体断片を用いることができる。
ノーザンブロッティング法に用いられるプローブとしては、例えば、サイトカイン遺伝子をコードする核酸の全部または一部からなる核酸、サイトカイン遺伝子をコードする核酸のアンチセンス鎖の全部または一部からなる核酸などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。サイトカイン遺伝子をコードする核酸の一部からなる核酸または当該核酸のアンチセンス鎖の一部からなる核酸である場合、プローブの長さは、サイトカイン遺伝子の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、サイトカイン遺伝子の種類などに応じて決定することが好ましい。プローブの長さは、サイトカイン遺伝子の発現量の測定精度を向上させる観点から、通常、好ましくは２０～５００ヌクレオチド長である。
定量的ＲＴ－ＰＣＲ法に用いられるプライマー対としては、例えば、サイトカイン遺伝子をコードする核酸の塩基配列の一部からなるプライマーと当該核酸のアンチセンス鎖の塩基配列の一部からなるプライマーとからなるプライマーなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。プライマー対を構成する各プライマーの長さ、ＧＣ含量およびＴｍ値ならびにサイトカイン遺伝子をコードする核酸上におけるプライマー間の距離は、サイトカイン遺伝子の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、サイトカイン遺伝子の種類などに応じて決定することが好ましい。プライマーの長さは、サイトカイン遺伝子の発現量の測定精度を向上させる観点から、通常、好ましくは１２～３０ヌクレオチド長である。プライマーのＧＣ含量は、サイトカイン遺伝子の発現量の測定精度を向上させる観点から、通常、好ましくは４０～６０％である。プライマーのＴｍ値は、サイトカイン遺伝子の発現量の測定精度を向上させる観点から、好ましくは５５～８０℃である。サイトカイン遺伝子をコードする核酸上におけるプライマー間の距離は、通常、サイトカイン遺伝子の発現量を迅速に測定する観点から、好ましくは１００～８００ヌクレオチド長である。また、プライマー対を構成する各プライマーは、サイトカイン遺伝子の発現量の測定精度を向上させる観点から、チミン残基またはシトシン残基が連続する配列（ポリピリミジン配列）およびアデニン残基またはグアニン残基が連続する配列（ポリプリン配列）の双方を含まない配列を有することが好ましい。プライマー対を構成する各プライマーは、サイトカイン遺伝子の発現量の測定精度を向上させる観点から、サイトカイン遺伝子をコードする核酸またはそのアンチセンス鎖の塩基配列の一部からなり、他の遺伝子などの配列には含まれない配列からなることが好ましい。プライマーに用いられる配列は、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ ＢＬＡＳＴなどのプライマー設計プログラムを用いることによって求めることができる。プライマー対は、商業的に入手可能なプライマー対であってもよい。
ステップ（Ａ２）では、サイトカイン発現能を有するＴＲＰＭ４発現細胞とサイトカイン産生促進物質とを接触させ、ＴＲＰＭ４発現細胞におけるサイトカインおよび／またはその遺伝子の発現量を測定する。
ステップ（Ａ２）に用いられるＴＲＰＭ４発現細胞とサイトカイン産生促進物質との接触方法、ＴＲＰＭ４欠損細胞とサイトカイン産生促進物質との接触温度、ＴＲＰＭ４欠損細胞とサイトカイン産生促進物質との接触時間ならびにサイトカイン遺伝子およびサイトカインの各発現量の測定方法は、ステップ（Ａ１）に用いられるＴＲＰＭ４発現細胞とサイトカイン産生促進物質との接触方法、ＴＲＰＭ４発現細胞とサイトカイン産生促進物質との接触温度、ＴＲＰＭ４発現細胞とサイトカイン産生促進物質との接触時間ならびにサイトカインおよびその遺伝子の各発現量の測定方法と同様である。ＴＲＰＭ４発現細胞に接触させるサイトカイン産生促進物質の量は、ステップ（Ａ１）におけるＴＲＰＭ４発現細胞と被験物質とサイトカイン産生促進物質との接触の際に用いられるサイトカイン産生促進物質の量と同じである。
ステップ（Ａ３）では、ＴＲＰＭ４発現細胞におけるＴＲＰＭ４の機能が欠損したＴＲＰＭ４欠損細胞と被験試料とサイトカイン産生促進物質とを接触させ、当該ＴＲＰＭ４欠損細胞におけるサイトカインおよび／またはその遺伝子の発現量を測定する。
ＴＲＰＭ４欠損細胞は、ＴＲＰＭ４の機能が欠損していることを除き、ステップ（Ａ１）およびステップ（Ａ２）で用いられたＴＲＰＭ４発現細胞と同様である。ＴＲＰＭ４欠損細胞は、ＴＲＰＭ４発現細胞におけるＴＲＰＭ４遺伝子を遺伝子ノックアウト法によって破壊すること、ＴＲＰＭ４発現細胞におけるＴＲＰＭ４の機能を欠損させることなどによって製造することができる。遺伝子ノックアウト法としては、例えば、相同組換法によってＴＲＰＭ４遺伝子を破壊する方法、ゲノム編集技術によってＴＲＰＭ４遺伝子を破壊する方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。また、ＴＲＰＭ４の機能を欠損させる方法としては、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを用いるＲＮＡサイレンシング法によってＴＲＰＭ４遺伝子の発現を阻害する方法、ＴＲＰＭ４発現細胞中でドミナント・ネガティブ変異体を発現させることによって正常なＴＲＰＭ４の機能を阻害する方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
ステップ（Ａ３）では、ステップ（Ａ１）において、サイトカイン発現能を有するＴＲＰＭ４発現細胞を用いる代わりにＴＲＰＭ４欠損細胞を用いることを除き、ステップ（Ａ１）と同様の条件で同様の操作を行なうことにより、サイトカインおよび／またはその遺伝子の発現量を測定する。
ステップ（Ａ４）では、ＴＲＰＭ４発現細胞におけるＴＲＰＭ４の機能が欠損したＴＲＰＭ４欠損細胞とサイトカイン産生促進物質とを接触させ、当該ＴＲＰＭ４欠損細胞におけるサイトカインおよび／またはその遺伝子の発現量を測定する。
ステップ（Ａ４）では、ステップ（Ａ２）において、サイトカイン発現能を有するＴＲＰＭ４発現細胞を用いる代わりにＴＲＰＭ４欠損細胞を用いることを除き、ステップ（Ａ２）と同様の条件で同様の操作を行なうことにより、サイトカインおよび／またはその遺伝子の発現量を測定する。
なお、本発明の被験試料の評価方法においては、評価の精度を向上させる観点から、対照試料を用い、被験試料を用いたときの発現量を較正することが好ましい。対照試料としては、被験試料を含まない液体であればよく、例えば、被験試料の希釈に用いられる溶媒、被験試料の溶解に用いられる溶媒などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。対照試料を用いる場合、ステップ（Ａ１）～（Ａ４）において、被験試料を用いる代わりに対照試料を用いることを除き、ステップ（Ａ１）～（Ａ４）と同様の操作を行ない、サイトカインおよび／またはその遺伝子の発現量を測定する。
ステップ（Ａ４）では、ステップ（Ａ１）～（Ａ４）で測定された発現量に基づき、被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価する。
ステップ（Ａ１）で測定された発現量が、ステップ（Ａ２）で測定された発現量と比べて少なく、ステップ（Ａ３）で測定された発現量がステップ（Ａ４）で測定された発現量と同等である場合、被験試料がＴＲＰＭ４を活性化し、皮膚細胞におけるサイトカイン産生を抑制する作用を有する物質であると評価することができる。
ＴＲＰＭ４を介して引き起こされる生理学的事象としてＴＲＰＭ４自体の活性の発現を用いる場合、本発明の被験試料の評価方法の具体例としては、例えば、以下の評価法２などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
＜評価法２＞
前記生理学的事象を測定し、当該生理学的事象に基づき、前記被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価する際の操作が、
（Ｂ１）前記ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料とを接触させ、被験試料の接触前後のＴＲＰＭ４発現細胞におけるＴＲＰＭ４活性の変化を測定するステップ、および
（Ｂ２）ステップ（Ｂ１）で測定されたＴＲＰＭ４活性の変化に基づき、前記被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価するステップ
を含む方法。
前記生理学的事象を測定し、当該生理学的事象に基づき、前記被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価する際の操作が、
（Ｂ１）前記ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料とを接触させ、被験試料の接触前後のＴＲＰＭ４発現細胞におけるＴＲＰＭ４活性の変化を測定するステップ、および
（Ｂ２）ステップ（Ｂ１）で測定されたＴＲＰＭ４活性の変化に基づき、前記被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価するステップ
を含む方法。
評価法２に用いられるＴＲＰＭ４発現細胞は、好ましくは外因性ＴＲＰＭ４発現細胞であり、ＴＲＰＭ４活性の変化の観察が容易に行なう観点から、より好ましくは外因性ＴＲＰＭ４を過剰発現している細胞である。
ＴＲＰＭ４活性の変化としては、例えば、被験試料の接触前後のＴＲＰＭ４発現細胞におけるＴＲＰＭ４による細胞内へのナトリウムイオンの取り込み量の変化、被験試料の接触前後のＴＲＰＭ４発現細胞におけるＴＲＰＭ４の活性化に起因する電流の増加などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
ＴＲＰＭ４活性の変化として、被験試料の接触前後のＴＲＰＭ４発現細胞におけるＴＲＰＭ４による細胞内へのナトリウムイオンの取り込み量の変化を用いる場合、ＴＲＰＭ４による細胞内へのナトリウムイオンの取り込み量の測定方法としては、例えば、ＴＲＰＭ４発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を細胞内へのナトリウムイオンの取り込み量の指標として用い、細胞内へのナトリウムイオンの取り込み量を測定する方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
ＴＲＰＭ４による細胞内へのナトリウムイオンの取り込み量の測定に細胞内カルシウムイオン濃度を指標として用いる場合、細胞内カルシウムイオン濃度の測定は、例えば、カルシウムイオンと特異的に結合するカルシウム指示薬をＴＲＰＭ４発現細胞に導入し、当該ＴＲＰＭ４発現細胞内のカルシウムイオンにカルシウム指示薬を結合させ、ＴＲＰＭ４発現細胞内のカルシウムイオンと結合したカルシウム指示薬の量を測定することなどによって行なうことができる。
ＴＲＰＭ４が活性化したＴＲＰＭ４発現細胞内では、ＴＲＰＭ４が活性化していないＴＲＰＭ４発現細胞と比べて、ＴＲＰＭ４を介するＴＲＰＭ４発現細胞外からＴＲＰＭ４発現細胞内へのナトリウムイオンの流入量が増加し、ＴＲＰＭ４発現細胞の細胞内ナトリウムイオン濃度が増加する。ＴＲＰＭ４発現細胞の細胞内ナトリウムイオン濃度の増加に伴い、当該ＴＲＰＭ４発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度が減少する。また、後述の実施例に示されるようにＴＲＰＭ４の活性化と皮膚細胞におけるサイトカイン産生の抑制とは、相関している。したがって、被験試料と接触させたＴＲＰＭ４発現細胞の細胞内カルシウム濃度が被験試料と接触させていないＴＲＰＭ４発現細胞の細胞内カルシウム濃度と比べて低い場合、被験試料がＴＲＰＭ４を活性化し、皮膚細胞におけるサイトカイン産生を抑制する作用を有する物質であると評価することができる。これに対し、被験試料と接触させたＴＲＰＭ４発現細胞の細胞内カルシウム濃度が被験試料と接触させていないＴＲＰＭ４発現細胞の細胞内カルシウム濃度と比べて高い場合または両者が同等である場合、被験試料が皮膚細胞におけるサイトカイン産生を抑制する作用を有しない物質であると評価することができる。
ＴＲＰＭ４による細胞内へのナトリウムイオンの取り込み量の測定に細胞内カルシウムイオン濃度を指標として用いる場合、ＴＲＰＭ４活性化作用は、例えば、
（Ｉ）カルシウム指示薬を用いてＴＲＰＭ４発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度Ａを測定するステップ、
（ＩＩ）ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料とを接触させ、カルシウム指示薬を用いて当該ＴＲＰＭ４発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度Ｂを測定するステップ、および
（ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）で得られた細胞内カルシウムイオン濃度Ａとステップ（ＩＩ）で得られた細胞内カルシウムイオン濃度Ｂとを比較し、被験試料が有するＴＲＰＭ４活性化作用を評価するステップ
を含む方法などによって評価することができる。
（Ｉ）カルシウム指示薬を用いてＴＲＰＭ４発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度Ａを測定するステップ、
（ＩＩ）ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料とを接触させ、カルシウム指示薬を用いて当該ＴＲＰＭ４発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度Ｂを測定するステップ、および
（ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）で得られた細胞内カルシウムイオン濃度Ａとステップ（ＩＩ）で得られた細胞内カルシウムイオン濃度Ｂとを比較し、被験試料が有するＴＲＰＭ４活性化作用を評価するステップ
を含む方法などによって評価することができる。
ステップ（Ｉ）では、カルシウム指示薬を用いてＴＲＰＭ４発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度Ａを測定する。ＴＲＰＭ４発現細胞として、外因性ＴＲＰＭ４を発現するＨＥＫ２９３細胞などを用いることが好ましい。
カルシウム指示薬は、カルシウムイオンと結合したカルシウム指示薬の量を簡便な操作で測定することができることから、カルシウムイオンとの結合前後の変化を光学的特性の変化などによって検出することができる試薬であることが好ましい。光学的特性の変化としては、例えば、蛍光強度の変化、吸光度の変化などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものでない。カルシウム指示薬としては、例えば、カルシウムイオンとの結合前後に蛍光強度が変化する蛍光カルシウム指示薬などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。カルシウム指示薬の具体例としては、１－［６－アミノ－２－（５－カルボキシ－２－オキサゾリル）－５－ベンゾフラニルオキシ］－２－（２－アミノ－５－メチルフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸ペンタアセトキシメチルエステル（Ｆｕｒａ ２－ＡＭ）、１－［２－アミノ－５－（２，７－ジクロロ－６－ヒドロキシ－３－オキソ－９－キサンテニル）フェノキシ］－２－（２－アミノ－５－メチルフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸テトラアセトキシメチルエステル（Ｆｌｕｏ ３－ＡＭ）、１－［２－アミノ－５－（２，７－ジフルオロ－６－アセトキシメトキシ－３－オキソ－９－キサンテニル）フェノキシ］－２－（２－アミノ－５－メチルフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸テトラアセトキシメチルエステル（Ｆｌｕｏ ４－ＡＭ）などの蛍光カルシウム指示薬などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。カルシウム指示薬のなかでは、測定が容易であり、しかもＴＲＰＭ４発現細胞内に存在する夾雑物質の動態との区別化が容易である観点から、カルシウムイオンとの結合前後に蛍光強度が変化する蛍光カルシウム指示薬が好ましい。
蛍光カルシウム指示薬は、１種類の励起波長を有していてもよく、２種類以上の励起波長を有していてもよい。カルシウム指示薬が蛍光カルシウム指示薬である場合、当該蛍光カルシウム指示薬は、蛍光強度の測定が容易であり、検出強度が高いことから、２種類の励起波長を有する蛍光カルシウム指示薬が好ましい。細胞内カルシウム濃度の変化の測定に際して、１種類の励起波長を有する蛍光カルシウム指示薬を用いる場合、当該励起波長における蛍光強度に基づき、細胞内カルシウム濃度の変化を測定することができる。細胞内カルシウム濃度の変化の測定に際し、２種類以上の励起波長を有する蛍光カルシウム指示薬を用いる場合、被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用の評価の精度を向上させる観点から、当該２種類以上の励起波長から選ばれた２種類の励起波長（第１励起波長および第２励起波長）を選択し、第１励起波長および第２励起波長のそれぞれにおける蛍光強度から算出された蛍光強度比に基づき、細胞内カルシウム濃度の変化を測定することができる。細胞内カルシウム濃度の測定に際し、例えば、２種類の励起波長を有する蛍光カルシウム指示薬であるＦＵＲＡ ２－ＡＭを用いる場合、第１励起波長における蛍光強度（以下、「第１蛍光強度」ともいう）として励起波長３４０ｎｍにおける蛍光強度および第２励起波長における蛍光強度（以下、「第２蛍光強度」ともいう）として励起波長３８０ｎｍにおける蛍光強度を用いることができる。蛍光強度比は、例えば、式（Ｉ）：
［蛍光強度比］＝［第１蛍光強度］／［第２蛍光強度］ （Ｉ）
に基づいて求めることができる。
［蛍光強度比］＝［第１蛍光強度］／［第２蛍光強度］ （Ｉ）
に基づいて求めることができる。
蛍光カルシウム指示薬を用いる細胞内カルシウムイオン濃度Ａの測定方法としては、例えば、以下の測定法１などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
＜測定法１＞
ＴＲＰＭ４発現細胞に蛍光カルシウム指示薬を導入して指示薬導入細胞を得るステップ、
指示薬導入細胞とカルシウムイオンとを接触させ、当該指示薬導入細胞内の蛍光カルシウム指示薬にカルシウムイオンを結合させるステップ、および
指示薬導入細胞内におけるカルシウムイオンと結合した蛍光カルシウム指示薬の蛍光強度を測定するステップ
を含む方法。
ＴＲＰＭ４発現細胞に蛍光カルシウム指示薬を導入して指示薬導入細胞を得るステップ、
指示薬導入細胞とカルシウムイオンとを接触させ、当該指示薬導入細胞内の蛍光カルシウム指示薬にカルシウムイオンを結合させるステップ、および
指示薬導入細胞内におけるカルシウムイオンと結合した蛍光カルシウム指示薬の蛍光強度を測定するステップ
を含む方法。
ＴＲＰＭ４発現細胞に蛍光カルシウム指示薬を導入する方法としては、例えば、ＴＲＰＭ４発現細胞が入った還流チャンバー内で蛍光カルシウム指示薬を含有する緩衝液を循環させる方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。緩衝液としては、例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
蛍光カルシウム指示薬が導入されたＴＲＰＭ４発現細胞とカルシウムイオンとを接触させる方法としては、例えば、蛍光カルシウム指示薬が導入されたＴＲＰＭ４発現細胞が入った還流チャンバー内でカルシウムイオンを含有する緩衝液を循環させる方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。緩衝液としては、例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
蛍光カルシウム指示薬が導入されたＴＲＰＭ４発現細胞とカルシウムイオンを含有する緩衝液との接触温度は、ＴＲＰＭ４発現細胞の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、ＴＲＰＭ４発現細胞の種類などに応じて決定することが好ましい。なお、温度によるＴＲＰＭ４活性への影響を排除するため、ＴＲＰＭ４発現細胞とカルシウムイオンを含有する緩衝液との接触は、一定温度環境下で行なうことが好ましい。
ステップ（Ｉ）に用いられるＴＲＰＭ４発現細胞の数は、カルシウムイオン濃度Ａの測定手段の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、カルシウムイオン濃度Ａの測定手段の種類などに応じて決定することが好ましい。例えば、倒立顕微鏡を用いて１００倍の倍率で細胞を観察してカルシウムイオン濃度Ａを測定する場合、１視野(データ解析範囲)あたりのＴＲＰＭ４発現細胞の数は、測定結果の信頼性を向上させる観点から、好ましくは１０個以上、より好ましくは１００個以上であり、細胞が密になり過ぎないように細胞同士の間隔を確保する観点から、好ましくは３００個以下、より好ましくは２００個以下である。
ステップ（ＩＩ）では、ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料とを接触させ、カルシウム指示薬を用いて当該ＴＲＰＭ４発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度Ｂを測定する。
蛍光カルシウム指示薬を用いる細胞内カルシウムイオン濃度Ｂの測定方法としては、例えば、以下の測定法２などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
＜測定法２＞
ＴＲＰＭ４発現細胞に蛍光カルシウム指示薬を導入して指示薬導入細胞を得るステップ、
指示薬導入細胞と被験試料とを接触させるステップ、
被験試料接触後の細胞とカルシウムイオンとを接触させ、当該細胞内の蛍光カルシウム指示薬にカルシウムイオンを結合させるステップ、および
細胞内におけるカルシウムイオンと結合した蛍光カルシウム指示薬の蛍光強度を測定するステップ
を含む方法。
ＴＲＰＭ４発現細胞に蛍光カルシウム指示薬を導入して指示薬導入細胞を得るステップ、
指示薬導入細胞と被験試料とを接触させるステップ、
被験試料接触後の細胞とカルシウムイオンとを接触させ、当該細胞内の蛍光カルシウム指示薬にカルシウムイオンを結合させるステップ、および
細胞内におけるカルシウムイオンと結合した蛍光カルシウム指示薬の蛍光強度を測定するステップ
を含む方法。
蛍光カルシウム指示薬が導入されたＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料とを接触させる方法としては、蛍光カルシウム指示薬が導入されたＴＲＰＭ４発現細胞が入った還流チャンバー内で蛍光カルシウム指示薬を含有する緩衝液を循環させる方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。被験試料接触後の細胞とカルシウムイオンとを接触させる方法としては、例えば、カルシウムイオンを含有し、被験試料を含まない緩衝液を循環させる方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。なお、本発明では、蛍光カルシウム指示薬が導入されたＴＲＰＭ４発現細胞が入った還流チャンバー内で被験試料を含有する緩衝液を循環させた後に、被験試料とカルシウムイオンとを含有する緩衝液を循環させてもよい。
ステップ（ＩＩ）に用いられる細胞内カルシウムイオン濃度Ｂの測定方法、接触温度およびＴＲＰＭ４発現細胞の数は、ステップ（Ｉ）に用いられる細胞内カルシウムイオン濃度Ｂの測定方法、接触温度およびＴＲＰＭ４発現細胞の数と同様である。
ステップ（ＩＩＩ）では、ステップ（Ｉ）で得られた細胞内カルシウムイオン濃度Ａとステップ（ＩＩ）で得られた細胞内カルシウムイオン濃度Ｂとを比較し、被験試料が有するＴＲＰＭ４活性化作用を評価する。ステップ（ＩＩＩ）において、カルシウムイオン濃度Ａと比べてカルシウムイオン濃度Ｂが減少している場合、当該被験試料は、ＴＲＰＭ４活性化作用を有すると評価することができ、さらに、カルシウムイオン濃度Ａとカルシウムイオン濃度Ｂとの間の差が大きいほど、当該被験試料は、高いＴＲＰＭ４活性化作用を有すると評価することができる。
ＴＲＰＭ４活性の変化として、被験試料の接触前後のＴＲＰＭ４発現細胞におけるＴＲＰＭ４の活性化に起因する電流の増加を用いる場合、ＴＲＰＭ４の活性化作用は、例えば、
（ｉ）一定電位下にＴＲＰＭ４発現細胞内の電流Ａを測定するステップ、
（ｉｉ）ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料とを接触させ、ステップ（ｉ）における電位と同じ電位下に当該ＴＲＰＭ４発現細胞内の電流Ｂを測定するステップ、および
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）で得られた電流Ａとステップ（ｉｉ）で得られた電流Ｂとを比較し、被験試料が有するＴＲＰＭ４活性化作用を評価するステップ
を含む方法などによって評価することができる。
（ｉ）一定電位下にＴＲＰＭ４発現細胞内の電流Ａを測定するステップ、
（ｉｉ）ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料とを接触させ、ステップ（ｉ）における電位と同じ電位下に当該ＴＲＰＭ４発現細胞内の電流Ｂを測定するステップ、および
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）で得られた電流Ａとステップ（ｉｉ）で得られた電流Ｂとを比較し、被験試料が有するＴＲＰＭ４活性化作用を評価するステップ
を含む方法などによって評価することができる。
ステップ（ｉ）では、一定電位下にＴＲＰＭ４発現細胞内のＴＲＰＭ４の活性化に起因する電流Ａを測定する。電流Ａの測定方法としては、例えば、パッチクランプ法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。パッチクランプ法によれば、ＴＲＰＭ４発現細胞の細胞膜に存在する１または複数個のＴＲＰＭ４の活性化に起因する電流を測定することができる。パッチクランプ法としては、例えば、ホールセル法、セルアタッチ法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
ステップ（ｉｉ）では、ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料とを接触させ、ステップ（ｉ）における電位と同じ電位下に当該ＴＲＰＭ４発現細胞内の電流Ｂを測定する。ステップ（ｉｉ）に用いられる電流Ｂの測定方法は、ステップ（ｉ）に用いられる電流Ａの測定方法と同様である。
ステップ（ｉｉｉ）では、ステップ（ｉ）で得られた電流Ａとステップ（ｉｉ）で得られた電流Ｂとを比較し、被験試料が有するＴＲＰＭ４活性化作用を評価する。ステップ（ｉｉｉ）において、電流Ｂと比べて電流Ａが小さい場合、当該被験試料は、ＴＲＰＭ４活性化作用を有すると評価することができる。また、電流Ａと電流Ｂとの間の差が大きいほど、当該被験試料は、高いＴＲＰＭ４活性化作用を有すると評価することができる。
以上説明したように、本発明の被験試料の評価方法によれば、被験試料によってＴＲＰＭ４発現細胞におけるＴＲＰＭ４を介して引き起こされる生理学的事象を測定し、当該生理学的事象に基づき、被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価するという操作が採られているので、被験試料が皮膚細胞におけるサイトカイン産生を抑制する作用を有するかどうかを容易に、しかも的確に評価することができる。したがって、本発明の被験試料の評価方法は、炎症予防用化粧料、炎症予防剤などの開発に好適に用いられることが期待されるものである。
２．サイトカイン産生抑制剤
本発明のサイトカイン産生抑制剤は、ＴＲＰＭ４を活性化して皮膚細胞におけるサイトカイン産生を抑制する用途に用いられるサイトカイン産生抑制剤であって、ＴＲＰＭ４を活性化させるための有効成分としてアルミニウム化合物を含有することを特徴とする。
本発明のサイトカイン産生抑制剤は、ＴＲＰＭ４を活性化して皮膚細胞におけるサイトカイン産生を抑制する用途に用いられるサイトカイン産生抑制剤であって、ＴＲＰＭ４を活性化させるための有効成分としてアルミニウム化合物を含有することを特徴とする。
本発明のサイトカイン産生抑制剤は、ＴＲＰＭ４を活性化させるための有効成分としてアルミニウム化合物を含有するので、皮膚細胞におけるサイトカイン産生を効果的に抑制することができる。したがって、本発明のサイトカイン産生抑制剤は、皮膚細胞におけるサイトカイン産生の抑制などに好適に用いることができる。
本発明の活性抑制剤におけるアルミニウム化合物の含有率は、アルミニウム化合物の種類、本発明のサイトカイン産生抑制剤の用途などによって異なるので一概には決定することができないので、アルミニウム化合物の種類、本発明のサイトカイン産生抑制剤の用途などに応じて適宜設定することが好ましい。本発明のサイトカイン産生抑制剤におけるアルミニウム化合物の含有率は、通常、ＴＲＰＭ４を活性化して皮膚細胞におけるサイトカイン産生を抑制する作用を十分に発現させる観点から、好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００５質量％以上、さらに好ましくは０．００８質量％以上、特に好ましくは０．０１質量％以上であり、皮膚に対する負荷を抑制する観点から、好ましくは１００質量％以下である。
本発明のサイトカイン産生抑制剤は、本発明の目的が妨げられない範囲内で、例えば、水、ｐＨ調整剤、安定化剤などの他の成分を含有していてもよい。なお、本発明のサイトカイン産生抑制剤が他の成分を含有する場合、本発明の目的が妨げられない範囲で、本発明のサイトカイン産生抑制剤中において、アルミニウム化合物と他の成分とが複合体を形成していてもよい。
以上説明したように、本発明のサイトカイン産生抑制剤は、皮膚細胞におけるサイトカイン産生を効果的に抑制することができるので、皮膚における炎症の発症の未然抑制に好適に用いることができる。したがって、本発明のサイトカイン産生抑制剤は、皮膚における炎症予防用化粧料、皮膚における炎症予防剤などの用途に用いられることが期待されるものである。
本発明のサイトカイン産生抑制剤を皮膚における炎症予防用化粧料または皮膚における炎症予防剤に用いる場合、当該炎症予防用化粧料または炎症予防剤における本発明のサイトカイン産生抑制剤の含有率は、炎症予防用化粧料または炎症予防剤の用途、本発明のサイトカイン産生抑制剤に含まれるアルミニウム化合物の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、炎症予防用化粧料または炎症予防剤の用途、本発明のサイトカイン産生抑制剤に含まれるアルミニウム化合物の種類などに応じて決定することが好ましい。炎症予防用化粧料または炎症予防剤における本発明のサイトカイン産生抑制剤の含有率は、通常、ＴＲＰＭ４を活性化して皮膚における炎症を抑制する作用を十分に発現させる観点から、炎症予防用化粧料または炎症予防剤におけるアルミニウム化合物の含有率が、好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．０００５質量％以上、さらに好ましくは０．０００８質量％以上、特に好ましくは０．０１質量％以上となり、皮膚に対する負荷を抑制する観点から、好ましくは２０質量％以下、より好ましくは１０質量％以下となるように調整されていることが望ましい。炎症予防用化粧料または炎症予防剤には、ＴＲＰＭ４を活性化して皮膚における炎症を抑制する作用が妨げられない範囲で、例えば、溶媒、界面活性剤、保湿剤、増粘剤、防腐剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤などの他の成分が配合されていてもよい。炎症予防用化粧料または炎症予防剤の用量および適用回数は、炎症の種類、適用対象の種類、適用対象の年齢、適用対象の体重などによって異なるので一概には決定することができないことから、炎症の種類、適用対象の種類、適用対象の年齢、適用対象の体重などに応じて決定することが好ましい。
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。なお、以下において、「％（ｍ／ｍ）」は質量／質量パーセント（質量％）、「％（ｍ／ｖ）」は質量／体積パーセント、「％（ｖ／ｖ）」は体積／体積パーセント（体積％）を示す。
製造例１
５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素含有空気の雰囲気中、３７℃に維持された直径３５ｍｍのシャーレ上の１０％（ｖ／ｖ）％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ中において、５×１０6細胞のＨＥＫ２９３細胞を培養した。培養後のＨＥＫ２９３細胞とヒトＴＲＰＭ４発現ベクター〔オリジーン（ＯｒｉＧｅｎｅ）社製、商品名：ＴｒｕｅＣｌｏｎｅ ＴＲＰＭ４（ＮＭ＿０１７６３６） Ｈｕｍａｎ ｃＤＮＡ Ｃｌｏｎｅ〕と遺伝子導入用試薬〔サーモフィッシャー・サイエンティフィック（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）社製、商品名：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ〕とを用い、当該遺伝子導入用試薬に添付のプロトコールに準じてＨＥＫ２９３細胞にヒトＴＲＰＭ４をコードする核酸および赤色蛍光タンパク質をコードする核酸を一過的に導入し、トランスフェクタントを得た。以下において、赤色の蛍光を発するトランスフェクタントをＴＲＰＭ４過剰発現細胞として用いた。
５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素含有空気の雰囲気中、３７℃に維持された直径３５ｍｍのシャーレ上の１０％（ｖ／ｖ）％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ中において、５×１０6細胞のＨＥＫ２９３細胞を培養した。培養後のＨＥＫ２９３細胞とヒトＴＲＰＭ４発現ベクター〔オリジーン（ＯｒｉＧｅｎｅ）社製、商品名：ＴｒｕｅＣｌｏｎｅ ＴＲＰＭ４（ＮＭ＿０１７６３６） Ｈｕｍａｎ ｃＤＮＡ Ｃｌｏｎｅ〕と遺伝子導入用試薬〔サーモフィッシャー・サイエンティフィック（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）社製、商品名：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ〕とを用い、当該遺伝子導入用試薬に添付のプロトコールに準じてＨＥＫ２９３細胞にヒトＴＲＰＭ４をコードする核酸および赤色蛍光タンパク質をコードする核酸を一過的に導入し、トランスフェクタントを得た。以下において、赤色の蛍光を発するトランスフェクタントをＴＲＰＭ４過剰発現細胞として用いた。
参考例１
製造例１で得られたＴＲＰＭ４過剰発現細胞（実験番号１）をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。洗浄後の細胞１×１０６個に対して溶解緩衝液〔組成：２５ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン（以下、「トリス」という）、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、０．１ｍＭグリコールエーテルジアミン四酢酸、５ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールおよび１％（ｖ／ｖ）ポリエチレングリコール－ｔｅｒｔ－オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）〕１００μＬを添加した。得られた混合物を撹拌した後、氷上で１０分間インキュベーションして細胞溶解物を得た。細胞溶解物を２００００×ｇで１０分間の遠心分離（４℃）に供し、上清を得た。得られた上清９０μＬに試料緩衝液〔組成：１８７ｍＭトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）、６％（ｍ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム、１５％（ｍ／ｖ）スクロース、０．０１５％（ｍ／ｖ）ブロモフェノールブルー、１５％（ｖ／ｖ） ２－メルカプトエタノール〕４５μＬを添加して電気泳動用試料を得た（実験番号１）。
製造例１で得られたＴＲＰＭ４過剰発現細胞（実験番号１）をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。洗浄後の細胞１×１０６個に対して溶解緩衝液〔組成：２５ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン（以下、「トリス」という）、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、０．１ｍＭグリコールエーテルジアミン四酢酸、５ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールおよび１％（ｖ／ｖ）ポリエチレングリコール－ｔｅｒｔ－オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）〕１００μＬを添加した。得られた混合物を撹拌した後、氷上で１０分間インキュベーションして細胞溶解物を得た。細胞溶解物を２００００×ｇで１０分間の遠心分離（４℃）に供し、上清を得た。得られた上清９０μＬに試料緩衝液〔組成：１８７ｍＭトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）、６％（ｍ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム、１５％（ｍ／ｖ）スクロース、０．０１５％（ｍ／ｖ）ブロモフェノールブルー、１５％（ｖ／ｖ） ２－メルカプトエタノール〕４５μＬを添加して電気泳動用試料を得た（実験番号１）。
実験番号１において、製造例１で得られたＴＲＰＭ４過剰発現細胞（実験番号１）を用いる代わりにヒト表皮角化細胞樹立株（ＨａＣａＴ細胞)（実験番号２）または正常ヒト表皮角化細胞（実験番号３）を用いたことを除き、実験番号１と同様の操作を行ない、実験番号２および実験番号３の各電気泳動用試料を得た。
実験番号１～３の各電気泳動用試料５μＬを泳動ゲル〔インビトロジェン社製、商品名：ＮｕＰＡＧＥ ４－１２％ Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ〕のウェルに注入し、２００Ｖで４５分間電気泳動した。つぎに、転写キット〔インビトロジェン社製、商品名：ｉＢｌｏｔ ｇｅｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｔａｃｋｓ ｍｉｎｉ〕および転写装置〔インビトロジェン社製、商品名：ｉＢｌｏｔ〕を用い、泳動後のゲル上のタンパク質をメンブレンに転写した。
転写後のメンブレンとマウス抗ＴＲＰＭ４抗体〔オリジーン（ＯｒｉＧｅｎｅ）社製、商品名：Ａｎｔｉ－ＴＲＰＭ４，Ｍｏｕｓｅ－Ｍｏｎｏ（１０Ｈ５） ＴｒｕｅＭＡＢ、品番：ＴＡ５００３８１〕と二次抗体〔ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ抗体〔シー・エス・ティー（ＣＳＴ）ジャパン（株）製、商品名：Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ，ＨＲＰ－ｌｉｎｋｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、品番：＃７０７６〕とを用い、ウェスタンブロット解析を行なった。
参考例１において、ウェスタンブロット解析の結果を図１に示す。図中、レーンＭはマーカー、レーン１は実験番号１の電気泳動用試料のウェスタンブロット解析の結果、レーン２は実験番号２の電気泳動用試料のウェスタンブロット解析の結果、レーン３は実験番号３の電気泳動用試料のウェスタンブロット解析の結果を示す。また、図中、矢印ＡはＴＲＰＭ４に対応するバンド、矢印Ｂはβ－アクチンに対応するバンドを示す。
図１に示された結果から、レーン１～３において、ＴＲＰＭ４に対応する位置にバンドが検出されたことから、製造例１で得られたＴＲＰＭ４過剰発現細胞、ＨａＣａＴ細胞および正常ヒト表皮角化細胞は、いずれもＴＲＰＭ４タンパク質を発現していることがわかる。
実施例１および２
５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素含有空気の雰囲気中、３７℃に維持された９６穴プレートの培地Ａ〔１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清－１００Ｕ／ｍＬペニシリン－１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン－１％（ｖ／ｖ）Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン含有培地用サプリメント（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製、商品名：ＧｌｕｔａＭＡＸ）含有ＤＭＥＭ〕０．１ｍＬ中において、ＨａＣａＴ細胞を２４時間培養し、ＨａＣａＴ細胞６．４×１０3個を含有する細胞培養物を得た。
５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素含有空気の雰囲気中、３７℃に維持された９６穴プレートの培地Ａ〔１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清－１００Ｕ／ｍＬペニシリン－１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン－１％（ｖ／ｖ）Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン含有培地用サプリメント（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製、商品名：ＧｌｕｔａＭＡＸ）含有ＤＭＥＭ〕０．１ｍＬ中において、ＨａＣａＴ細胞を２４時間培養し、ＨａＣａＴ細胞６．４×１０3個を含有する細胞培養物を得た。
細胞培養物に、ＴＲＰＭ４アゴニストであるＢＴＰ２をその濃度が１ｎＭ（実施例１）または１０ｎＭ（実施例２）となるように添加することにより、ＢＴＰ２とＨａＣａＴ細胞とを接触させた。得られた混合物を３７℃で１０分間インキュベーションした。インキュベーション後の混合物に、ＴＮＦαをその濃度が２０ｎｇ／ｍＬとなるように添加した後、得られた混合物を３７℃で１時間インキュベーションすることにより、ＴＮＦαとＨａＣａＴ細胞とを接触させた。その後、混合物に含まれるＨａＣａＴ細胞を回収した。
比較例１
５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素含有空気の雰囲気中、３７℃に維持された９６穴プレートの培地Ａ０．１ｍＬ中において、ＨａＣａＴ細胞を２４時間培養し、ＨａＣａＴ細胞６．４×１０3個を含有する細胞培養物を得た。細胞培養物を培地中で、３７℃で１時間１０分間インキュベーションし、その後、細胞を回収した。
５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素含有空気の雰囲気中、３７℃に維持された９６穴プレートの培地Ａ０．１ｍＬ中において、ＨａＣａＴ細胞を２４時間培養し、ＨａＣａＴ細胞６．４×１０3個を含有する細胞培養物を得た。細胞培養物を培地中で、３７℃で１時間１０分間インキュベーションし、その後、細胞を回収した。
比較例２
５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素含有空気の雰囲気中、３７℃に維持された９６穴プレートの培地Ａ０．１ｍＬ中において、ＨａＣａＴ細胞を２４時間培養し、ＨａＣａＴ細胞６．４×１０3個を含有する細胞培養物を得た。細胞培養物に、ＴＮＦαをその濃度が２０ｎｇ／ｍＬとなるように添加した後、得られた混合物を３７℃で１時間インキュベーションすることにより、ＴＮＦαとＨａＣａＴ細胞とを接触させた。その後、混合物から細胞を回収した。
５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素含有空気の雰囲気中、３７℃に維持された９６穴プレートの培地Ａ０．１ｍＬ中において、ＨａＣａＴ細胞を２４時間培養し、ＨａＣａＴ細胞６．４×１０3個を含有する細胞培養物を得た。細胞培養物に、ＴＮＦαをその濃度が２０ｎｇ／ｍＬとなるように添加した後、得られた混合物を３７℃で１時間インキュベーションすることにより、ＴＮＦαとＨａＣａＴ細胞とを接触させた。その後、混合物から細胞を回収した。
試験例１
実施例１～２および比較例１～２で得られた各細胞と細胞溶解試薬〔ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製、商品名：Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＲｅａｄｙＣｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｋｉｔ〕とを用い、ＲＮＡ含有試料を得た。得られたＲＮＡ含有試料とＲＴ－ＰＣＲ用キット〔タカラバイオ（株）製、商品名：Ｏｎｅ ｓｔｅｐ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ－ＰＣＲ ｋｉｔ〕とを用い、ｑＲＴ－ＰＣＲを行なうことにより、実施例１～２および比較例１～２で得られた各細胞におけるＩＬ－１α遺伝子、ＩＬ－８遺伝子およびＴＮＦ遺伝子の各発現量を測定した。なお、ＩＬ－１α、ＩＬ－８およびＴＮＦは、ＴＮＦαによって誘導される炎症性サイトカインである。
実施例１～２および比較例１～２で得られた各細胞と細胞溶解試薬〔ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製、商品名：Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＲｅａｄｙＣｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｋｉｔ〕とを用い、ＲＮＡ含有試料を得た。得られたＲＮＡ含有試料とＲＴ－ＰＣＲ用キット〔タカラバイオ（株）製、商品名：Ｏｎｅ ｓｔｅｐ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ－ＰＣＲ ｋｉｔ〕とを用い、ｑＲＴ－ＰＣＲを行なうことにより、実施例１～２および比較例１～２で得られた各細胞におけるＩＬ－１α遺伝子、ＩＬ－８遺伝子およびＴＮＦ遺伝子の各発現量を測定した。なお、ＩＬ－１α、ＩＬ－８およびＴＮＦは、ＴＮＦαによって誘導される炎症性サイトカインである。
試験例１において、実施例１～２および比較例１～２で得られた各細胞におけるＩＬ－１α遺伝子の発現量を調べた結果を図２、実施例１～２および比較例１～２で得られた各細胞におけるＩＬ－８遺伝子の発現量を調べた結果を図３、実施例１～２および比較例１～２で得られた各細胞におけるＴＮＦ遺伝子の発現量を調べた結果を図４に示す。図２中、レーン１は比較例１で得られた細胞におけるＩＬ－１α遺伝子の発現量、レーン２は比較例２で得られた細胞におけるＩＬ－１α遺伝子の発現量、レーン３は実施例１で得られた細胞におけるＩＬ－１α遺伝子の発現量、レーン４は実施例２で得られた細胞におけるＩＬ－１α遺伝子の発現量を示す。図３中、レーン１は比較例１で得られた細胞におけるＩＬ－８遺伝子の発現量、レーン２は比較例２で得られた細胞におけるＩＬ－８遺伝子の発現量、レーン３は実施例１で得られた細胞におけるＩＬ－８遺伝子の発現量、レーン４は実施例２で得られた細胞におけるＩＬ－８遺伝子の発現量を示す。図４中、レーン１は比較例１で得られた細胞におけるＴＮＦ遺伝子の発現量、レーン２は比較例２で得られた細胞におけるＴＮＦ遺伝子の発現量、レーン３は実施例１で得られた細胞におけるＴＮＦ遺伝子の発現量、レーン４は実施例２で得られた細胞におけるＴＮＦ遺伝子の発現量を示す。
図２～４に示された結果から、ＩＬ－１α遺伝子、ＩＬ－８遺伝子およびＴＮＦ遺伝子の各発現量は、ＢＴＰ２の濃度の増加に伴って減少することがわかる。これらの結果から、ＴＲＰＭ４の活性化とＩＬ－１α遺伝子、ＩＬ－８遺伝子、ＴＮＦ遺伝子などの炎症性サイトカイン遺伝子の発現の抑制とが相関していることが示唆される。また、ＴＲＰＭ４を活性化する作用を有する物質を予め皮膚細胞と接触させることにより、ＴＮＦαによって誘導される炎症性サイトカインの遺伝子レベルでの発現を抑制することができることから、ＴＲＰＭ４を活性化する作用を有する物質によれば、炎症を予防することができることが示唆される。
製造例２
ＨａＣａＴ細胞におけるＴＲＰＭ４遺伝子を遺伝子ノックアウト技術によって破壊することにより、ＴＲＰＭ４遺伝子がノックアウトされたノックアウトＨａＣａＴ細胞を得た。
ＨａＣａＴ細胞におけるＴＲＰＭ４遺伝子を遺伝子ノックアウト技術によって破壊することにより、ＴＲＰＭ４遺伝子がノックアウトされたノックアウトＨａＣａＴ細胞を得た。
比較例３
実施例１において、ＨａＣａＴ細胞を用いる代わりに製造例２で得られたノックアウトＨａＣａＴ細胞を用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、細胞を得た。
実施例１において、ＨａＣａＴ細胞を用いる代わりに製造例２で得られたノックアウトＨａＣａＴ細胞を用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、細胞を得た。
比較例４
実施例２において、ＨａＣａＴ細胞を用いる代わりに製造例２で得られたノックアウトＨａＣａＴ細胞を用いたことを除き、実施例２と同様の操作を行ない、細胞を得た。
実施例２において、ＨａＣａＴ細胞を用いる代わりに製造例２で得られたノックアウトＨａＣａＴ細胞を用いたことを除き、実施例２と同様の操作を行ない、細胞を得た。
比較例５
比較例１において、ＨａＣａＴ細胞を用いる代わりに製造例２で得られたノックアウトＨａＣａＴ細胞を用いたことを除き、比較例１と同様の操作を行ない、細胞を得た。
比較例１において、ＨａＣａＴ細胞を用いる代わりに製造例２で得られたノックアウトＨａＣａＴ細胞を用いたことを除き、比較例１と同様の操作を行ない、細胞を得た。
比較例６
比較例２において、ＨａＣａＴ細胞を用いる代わりに製造例２で得られたノックアウトＨａＣａＴ細胞を用いたことを除き、比較例２と同様の操作を行ない、細胞を得た。
比較例２において、ＨａＣａＴ細胞を用いる代わりに製造例２で得られたノックアウトＨａＣａＴ細胞を用いたことを除き、比較例２と同様の操作を行ない、細胞を得た。
試験例２
試験例１において、実施例１～２および比較例１～２で得られた各細胞を用いる代わりに比較例３～６で得られた各細胞を用いたことを除き、試験例１と同様の操作を行ない、比較例３～６で得られた各細胞におけるＩＬ－１α遺伝子、ＩＬ－８遺伝子およびＴＮＦ遺伝子の各発現量を測定した。
試験例１において、実施例１～２および比較例１～２で得られた各細胞を用いる代わりに比較例３～６で得られた各細胞を用いたことを除き、試験例１と同様の操作を行ない、比較例３～６で得られた各細胞におけるＩＬ－１α遺伝子、ＩＬ－８遺伝子およびＴＮＦ遺伝子の各発現量を測定した。
試験例２において、比較例３～６で得られた各細胞におけるＩＬ－８遺伝子の発現量を調べた結果を図５に示す。図５中、レーン１は比較例５で得られた細胞におけるＩＬ－８遺伝子の発現量、レーン２は比較例６で得られた細胞におけるＩＬ－８遺伝子の発現量、レーン３は比較例３で得られた細胞におけるＩＬ－８遺伝子の発現量、レーン４は比較例４で得られた細胞におけるＩＬ－８遺伝子の発現量を示す。
図５に示された結果から、ノックアウトＨａＣａＴ細胞をＢＴＰ２と接触させた後、ＴＮＦαと接触させたときのＩＬ－８遺伝子の発現量は、ノックアウトＨａＣａＴ細胞をＢＴＰ２と接触させずにＴＮＦαと接触させたときのＩＬ－８遺伝子の発現量と同程度であることがわかる。また、ＩＬ－１α遺伝子、ＴＮＦ遺伝子などのＩＬ－８遺伝子以外の炎症性サイトカイン遺伝子についても、ＩＬ－８遺伝子と同様の傾向が見られた。これらの結果から、ＢＴＰ２と接触させたときのＴＲＰＭ４発現細胞における炎症性サイトカイン遺伝子の発現量の減少は、ＴＲＰＭ４の活性化に起因することがわかる。
以上説明したように、ＴＲＰＭ４を活性化する作用を有する物質を予め皮膚細胞と接触させることにより、皮膚細胞における炎症性サイトカイン遺伝子の発現が抑制されることから、ＴＲＰＭ４を活性化する作用を有する物質によれば、炎症性サイトカインの発現を抑制することができ、炎症を予防することができることがわかる。
製造例３
タプシガーギンをその濃度が１μＭとなるようにカルシウム不含溶液（以下、「溶液Ｂ」という）〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭグリコールエーテルジアミン四酢酸、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）〕に添加し、タプシガーギン含有バスソリューションを得た。
タプシガーギンをその濃度が１μＭとなるようにカルシウム不含溶液（以下、「溶液Ｂ」という）〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭグリコールエーテルジアミン四酢酸、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）〕に添加し、タプシガーギン含有バスソリューションを得た。
製造例４
イオノマイシンをその濃度が２５μＭとなるようにカルシウム含有溶液（以下、「溶液Ａ」という）〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）〕に添加し、イオノマイシン含有溶液Ａを得た。
イオノマイシンをその濃度が２５μＭとなるようにカルシウム含有溶液（以下、「溶液Ａ」という）〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）〕に添加し、イオノマイシン含有溶液Ａを得た。
製造例５
ＴＲＰＭ４アゴニストであるＵ－７３１２２をその濃度が１０μＭとなるように溶液Ｂに添加し、Ｕ－７３１２２含有バスソリューションを得た。
ＴＲＰＭ４アゴニストであるＵ－７３１２２をその濃度が１０μＭとなるように溶液Ｂに添加し、Ｕ－７３１２２含有バスソリューションを得た。
製造例６
ＴＲＰＭ４アゴニストであるＵ－７３１２２をその濃度が１０μＭとなるように溶液Ａに添加し、Ｕ－７３１２２含有溶液Ａを得た。
ＴＲＰＭ４アゴニストであるＵ－７３１２２をその濃度が１０μＭとなるように溶液Ａに添加し、Ｕ－７３１２２含有溶液Ａを得た。
参考例２
（１）Ｆｕｒａ ２－ＡＭ導入細胞の調製
ＴＲＰＭ４発現細胞として製造例１で得られた外因性ＴＲＰＭ４を発現するＴＲＰＭ４過剰発現細胞を細胞内カルシウムイオン測定用試薬Ｆｕｒａ ２－ＡＭ含有ＤＭＥＭ中において、室温（２５℃）で６０分間インキュベーションすることにより、Ｆｕｒａ ２－ＡＭ導入細胞を得た。
（１）Ｆｕｒａ ２－ＡＭ導入細胞の調製
ＴＲＰＭ４発現細胞として製造例１で得られた外因性ＴＲＰＭ４を発現するＴＲＰＭ４過剰発現細胞を細胞内カルシウムイオン測定用試薬Ｆｕｒａ ２－ＡＭ含有ＤＭＥＭ中において、室温（２５℃）で６０分間インキュベーションすることにより、Ｆｕｒａ ２－ＡＭ導入細胞を得た。
（２）ＴＲＰＭ４アゴニスト非存在下における細胞内カルシウムイオン濃度の測定
参考例２（１）で得られたＦＵＲＡ ２－ＡＭ導入細胞を還流チャンバー付倒立顕微鏡の還流チャンバーに入れた。以下において、ＣＣＤカメラを用い、ＦＵＲＡ ２－ＡＭ導入細胞内のＦＵＲＡ ２－ＡＭに基づく励起波長３４０ｎｍにおける蛍光とＦＵＲＡ ２－ＡＭ導入細胞内のＦＵＲＡ ２－ＡＭに基づく励起波長３８０ｎｍにおける蛍光とを連続録画し、画像解析用ソフトウエア〔（株）ソリューションシステムズ製、商品名：ＩＰＬａｂ〕を用いてＦＵＲＡ ２－ＡＭ導入細胞内のＦＵＲＡ ２－ＡＭに基づく励起波長３４０ｎｍにおける蛍光の強度（以下、「蛍光強度340nm」という）およびＦＵＲＡ ２－ＡＭ導入細胞内のＦＵＲＡ ２－ＡＭに基づく励起波長３８０ｎｍにおける蛍光強度（以下、「蛍光強度380nm」という）を求めた。
参考例２（１）で得られたＦＵＲＡ ２－ＡＭ導入細胞を還流チャンバー付倒立顕微鏡の還流チャンバーに入れた。以下において、ＣＣＤカメラを用い、ＦＵＲＡ ２－ＡＭ導入細胞内のＦＵＲＡ ２－ＡＭに基づく励起波長３４０ｎｍにおける蛍光とＦＵＲＡ ２－ＡＭ導入細胞内のＦＵＲＡ ２－ＡＭに基づく励起波長３８０ｎｍにおける蛍光とを連続録画し、画像解析用ソフトウエア〔（株）ソリューションシステムズ製、商品名：ＩＰＬａｂ〕を用いてＦＵＲＡ ２－ＡＭ導入細胞内のＦＵＲＡ ２－ＡＭに基づく励起波長３４０ｎｍにおける蛍光の強度（以下、「蛍光強度340nm」という）およびＦＵＲＡ ２－ＡＭ導入細胞内のＦＵＲＡ ２－ＡＭに基づく励起波長３８０ｎｍにおける蛍光強度（以下、「蛍光強度380nm」という）を求めた。
ＦＵＲＡ ２－ＡＭ導入細胞が入った還流チャンバー内において、溶液Ｂを還流させた。溶液Ｂの還流開始時から５０秒間経過後、ＦＵＲＡ ２－ＡＭ導入細胞が入った還流チャンバー内において、製造例３で得られたタプシガーギン含有バスソリューションを還流させることにより、小胞体からカルシウムイオンを放出させた。タプシガーギン含有バスソリューション還流開始時から２４０秒間経過後、ＦＵＲＡ ２－ＡＭ導入細胞が入った還流チャンバー内において、溶液Ａを還流させた。溶液Ａ還流開始時から１５０秒間経過後、ＦＵＲＡ ２－ＡＭ導入細胞が入った還流チャンバー内において、製造例４で得られたイオノマイシン含有溶液Ａを１８０秒間還流させた。ＴＲＰＭ４が活性化した場合、ＴＲＰＭ４を介してナトリウムイオンが細胞内に取り込まれ、取り込まれたナトリウムイオンの量の増加に伴って細胞内に流入するカルシウムイオンの量が減少する。したがって、細胞内カルシウムイオン濃度の経時的変化を測定することにより、間接的にＴＲＰＭ４活性を測定することができる。
（３）ＴＲＰＭ４アゴニスト存在下における細胞内カルシウムイオン濃度の測定
参考例２（１）で得られたＦＵＲＡ ２－ＡＭ導入細胞を還流チャンバー付倒立顕微鏡の還流チャンバーに入れた。以下において、ＦＵＲＡ ２－ＡＭ導入細胞内のＦＵＲＡ ２－ＡＭに基づく蛍光強度340nmおよびＦＵＲＡ ２－ＡＭ導入細胞内のＦＵＲＡ ２－ＡＭに基づく蛍光強度380nmを経時的に測定した。測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmを用い、式（Ｉａ）：
蛍光強度比＝蛍光強度340nm／蛍光強度380nm （Ｉａ）
に基づいて蛍光強度比の経時的変化を求めた。
参考例２（１）で得られたＦＵＲＡ ２－ＡＭ導入細胞を還流チャンバー付倒立顕微鏡の還流チャンバーに入れた。以下において、ＦＵＲＡ ２－ＡＭ導入細胞内のＦＵＲＡ ２－ＡＭに基づく蛍光強度340nmおよびＦＵＲＡ ２－ＡＭ導入細胞内のＦＵＲＡ ２－ＡＭに基づく蛍光強度380nmを経時的に測定した。測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmを用い、式（Ｉａ）：
蛍光強度比＝蛍光強度340nm／蛍光強度380nm （Ｉａ）
に基づいて蛍光強度比の経時的変化を求めた。
ＦＵＲＡ ２－ＡＭ導入細胞が入った還流チャンバー内において、溶液Ｂを還流させた。溶液Ｂの還流開始時から５０秒間経過後、ＦＵＲＡ ２－ＡＭ導入細胞が入った還流チャンバー内において、製造例３で得られたタプシガーギン含有バスソリューションを還流させることにより、小胞体からカルシウムイオンを放出させた。タプシガーギン含有バスソリューション還流開始時から１２０秒間経過後、ＦＵＲＡ ２－ＡＭ導入細胞が入った還流チャンバー内において、製造例５で得られたＵ－７３１２２含有バスソリューションを還流させた。Ｕ－７３１２２含有バスソリューション還流開始時から１２０秒間経過後、ＦＵＲＡ ２－ＡＭ導入細胞が入った還流チャンバー内において、製造例６で得られたＵ－７３１２２含有溶液Ａを還流させた。Ｕ－７３１２２含有溶液Ａ還流開始時から１５０秒間経過後、ＦＵＲＡ ２－ＡＭ導入細胞が入った還流チャンバー内において、製造例４で得られたイオノマイシン含有溶液Ａを１８０秒間還流させた。
（４）相対蛍光強度の算出
参考例２（２）における溶液Ａ還流開始時から４０秒間経過後の蛍光強度比Ａと参考例２（２）におけるイオノマイシン含有溶液Ａ還流開始時から１７０秒間経過後の蛍光強度比Ｂとを用い、式（ＩＩ）：
［相対蛍光強度］＝蛍光強度比Ａ／蛍光強度比Ｂ （ＩＩ）
にしたがって、ＴＲＰＭ４アゴニスト非存在下（対照）での相対蛍光強度を算出した。
参考例２（２）における溶液Ａ還流開始時から４０秒間経過後の蛍光強度比Ａと参考例２（２）におけるイオノマイシン含有溶液Ａ還流開始時から１７０秒間経過後の蛍光強度比Ｂとを用い、式（ＩＩ）：
［相対蛍光強度］＝蛍光強度比Ａ／蛍光強度比Ｂ （ＩＩ）
にしたがって、ＴＲＰＭ４アゴニスト非存在下（対照）での相対蛍光強度を算出した。
参考例２（３）におけるＵ－７３１２２含有溶液Ａ還流開始時から４０秒間経過後の蛍光強度比と参考例２（３）におけるイオノマイシン含有溶液Ａ還流開始時から１７０秒間経過後の蛍光強度比とを用い、式（ＩＩ）にしたがって、ＴＲＰＭ４アゴニスト存在下での相対蛍光強度を算出した。
参考例２において、ＴＲＰＭ４アゴニストの有無と相対蛍光強度との関係を調べた結果を図６に示す。図中、レーン１はＴＲＰＭ４アゴニスト存在下での相対蛍光強度、レーン２はＴＲＰＭ４アゴニスト非存在下での相対蛍光強度を示す。
図６に示された結果から、ＴＲＰＭ４アゴニスト存在下での相対蛍光強度は、ＴＲＰＭ４アゴニスト非存在下での相対蛍光強度と比べて低いことから、ＴＲＰＭ４の活性化に伴い、ＨＥＫ２９３細胞内に流入するナトリウムイオン量が増加したことに伴い、細胞内カルシウムイオン濃度が減少したことがわかる。これらの結果から、製造例１で得られたＴＲＰＭ４過剰発現細胞のように、外因性ＴＲＰＭ４を過剰発現している細胞を用い、細胞内カルシウムイオン濃度に対する被験試料の作用を調べることにより、被験試料がＴＲＰＭ４を活性化して皮膚細胞におけるサイトカイン産生を抑制する作用を有するかどうかを評価することができることがわかる。
製造例７
被験試料として塩化アルミニウムをその濃度が１ｍＭとなるように溶液Ｂに添加し、被験試料含有バスソリューションを得た。
被験試料として塩化アルミニウムをその濃度が１ｍＭとなるように溶液Ｂに添加し、被験試料含有バスソリューションを得た。
製造例８
被験試料として塩化アルミニウムをその濃度が１ｍＭとなるように溶液Ａに添加し、被験試料含有溶液Ａを得た。
被験試料として塩化アルミニウムをその濃度が１ｍＭとなるように溶液Ａに添加し、被験試料含有溶液Ａを得た。
製造例９
被験試料として硫酸アルミニウムカリウムをその濃度が１ｍＭとなるように溶液Ｂに添加し、被験試料含有バスソリューションを得た。
被験試料として硫酸アルミニウムカリウムをその濃度が１ｍＭとなるように溶液Ｂに添加し、被験試料含有バスソリューションを得た。
製造例１０
被験試料として硫酸アルミニウムカリウムをその濃度が１ｍＭとなるように溶液Ａに添加し、被験試料含有溶液Ａを得た。
被験試料として硫酸アルミニウムカリウムをその濃度が１ｍＭとなるように溶液Ａに添加し、被験試料含有溶液Ａを得た。
実施例３
参考例２において、Ｕ－７３１２２含有バスソリューションを用いる代わりに製造例７で得られた被験試料含有バスソリューションを用いたことおよびＵ－７３１２２含有溶液Ａを用いる代わりに製造例８で得られた被験試料含有溶液Ａを用いたことを除き、参考例２と同様の操作を行ない、相対蛍光強度を算出した。
参考例２において、Ｕ－７３１２２含有バスソリューションを用いる代わりに製造例７で得られた被験試料含有バスソリューションを用いたことおよびＵ－７３１２２含有溶液Ａを用いる代わりに製造例８で得られた被験試料含有溶液Ａを用いたことを除き、参考例２と同様の操作を行ない、相対蛍光強度を算出した。
また、前記において、製造例７で得られた被験試料含有バスソリューションを用いる代わりに製造例９で得られた被験試料含有バスソリューションを用いたことおよび製造例８で得られた被験試料含有溶液Ａを用いる代わりに製造例１０で得られた被験試料含有溶液Ａを用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、相対蛍光強度を算出した。
実施例３において、被験試料の種類と相対蛍光強度との関係を調べた結果を図７に示す。図中、レーン１は被験試料として塩化アルミニウムを用いたときの相対蛍光強度、レーン２は被験試料として硫酸アルミニウムカリウムを用いたときの相対蛍光強度、レーン３は被験試料非存在下での相対蛍光強度を示す。
図７に示された結果から、被験試料として塩化アルミニウムまたは硫酸アルミニウムカリウムを用いたときの相対蛍光強度は、被験試料非存在下での相対蛍光強度よりも低いことがわかる。これらの結果から、塩化アルミニウムおよび硫酸アルミニウムカリウムは、ＴＲＰＭ４を活性化してサイトカイン産生を抑制する作用を有することがわかる。
実施例４
表皮角化細胞をＤＭＥＭ中において３７℃で１日間培養した。得られた培養細胞にトリプシン処理を施した。トリプシン処理後の培養細胞にＤＭＥＭを添加して培養細胞の濃度が１×１０５個／ｍＬとなるように調整することにより、培養液を得た。得られた培養液１ｍＬを１２穴プレートの各穴に播種し、前記培養細胞を３７℃で２４時間培養した。培養後、培養上清５００μＬを、硫酸アルミニウムカリウム含有ＤＭＥＭ（硫酸アルミニウムカリウム濃度：２ｍＭ）５００μＬで置換した後、３７℃で１０分間静置した。静置後、ＴＮＦα含有ＤＭＥＭ（ＴＮＦα濃度：２２０ｎｇ／ｍＬ）１００μＬを添加し、培養液Ａ（硫酸アルミニウムカリウム濃度：１ｍＭおよびＴＮＦα濃度：２０ｎｇ／ｍＬ）を得た。
表皮角化細胞をＤＭＥＭ中において３７℃で１日間培養した。得られた培養細胞にトリプシン処理を施した。トリプシン処理後の培養細胞にＤＭＥＭを添加して培養細胞の濃度が１×１０５個／ｍＬとなるように調整することにより、培養液を得た。得られた培養液１ｍＬを１２穴プレートの各穴に播種し、前記培養細胞を３７℃で２４時間培養した。培養後、培養上清５００μＬを、硫酸アルミニウムカリウム含有ＤＭＥＭ（硫酸アルミニウムカリウム濃度：２ｍＭ）５００μＬで置換した後、３７℃で１０分間静置した。静置後、ＴＮＦα含有ＤＭＥＭ（ＴＮＦα濃度：２２０ｎｇ／ｍＬ）１００μＬを添加し、培養液Ａ（硫酸アルミニウムカリウム濃度：１ｍＭおよびＴＮＦα濃度：２０ｎｇ／ｍＬ）を得た。
得られた培養液Ａを３７℃で４８時間培養した後、培養上清を遠心チューブに入れ、１４０００×ｇで５分間遠心分離し、培養上清Ａを回収した。一方、１２穴プレートの各穴に残った細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄した。当該細胞にタンパク質抽出用緩衝液〔サンタクルズ社製、商品名：ＲＩＰＡバッファー〕２００μＬを添加し、セルスクレイパーを用いて各穴の壁面から細胞を剥がして細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を１４０００×ｇで５分間遠心分離して上清を回収することにより、細胞抽出液Ａを得た。
比較例７
表皮角化細胞をＤＭＥＭ培地中において３７℃で１日間培養した。得られた培養細胞にトリプシン処理を施した。トリプシン処理後の培養細胞にＤＭＥＭを添加して培養細胞の濃度が１×１０５個／ｍＬとなるように調整することにより、培養液を得た。得られた培養液１ｍＬを１２穴プレートの各穴に播種し、前記培養細胞を３７℃で２４時間培養した。培養後、培養上清５００μＬをＤＭＥＭ５００μＬで置換した後、３７℃で１０分間静置した。静置後、ＴＮＦα含有ＤＭＥＭ（ＴＮＦα濃度：２２０ｎｇ／ｍＬ）１００μＬを添加し、培養液Ｂ（ＴＮＦα濃度：２０ｎｇ／ｍＬ）を得た。
表皮角化細胞をＤＭＥＭ培地中において３７℃で１日間培養した。得られた培養細胞にトリプシン処理を施した。トリプシン処理後の培養細胞にＤＭＥＭを添加して培養細胞の濃度が１×１０５個／ｍＬとなるように調整することにより、培養液を得た。得られた培養液１ｍＬを１２穴プレートの各穴に播種し、前記培養細胞を３７℃で２４時間培養した。培養後、培養上清５００μＬをＤＭＥＭ５００μＬで置換した後、３７℃で１０分間静置した。静置後、ＴＮＦα含有ＤＭＥＭ（ＴＮＦα濃度：２２０ｎｇ／ｍＬ）１００μＬを添加し、培養液Ｂ（ＴＮＦα濃度：２０ｎｇ／ｍＬ）を得た。
得られた培養液Ｂを３７℃で４８時間培養した後、培養上清を遠心チューブに入れ、１４０００×ｇで５分間遠心分離し、培養上清Ｂを回収した。一方、１２穴プレートの各穴に残った細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄した。当該細胞にタンパク質抽出用緩衝液〔サンタクルズ社製、商品名：ＲＩＰＡバッファー〕２００μＬを添加し、セルスクレイパーを用いて各穴の壁面から細胞を剥がして細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を１４０００×ｇで５分間遠心分離して上清を回収することにより、細胞抽出液Ｂを得た。
試験例３
実施例４で得られた細胞抽出液Ａまたは比較例７で得られた細胞抽出液ＢとＩＬ－１α定量試薬〔Ｒ＆Ｄ社製、商品名：Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１ ａｌｐｈａ／ＩＬ－１Ｆ１ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ ＤＹ２００〕とを用い、実施例４および比較例７で得られた各培養細胞（表皮角化細胞）におけるＩＬ－１α発現量を測定した。
実施例４で得られた細胞抽出液Ａまたは比較例７で得られた細胞抽出液ＢとＩＬ－１α定量試薬〔Ｒ＆Ｄ社製、商品名：Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１ ａｌｐｈａ／ＩＬ－１Ｆ１ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ ＤＹ２００〕とを用い、実施例４および比較例７で得られた各培養細胞（表皮角化細胞）におけるＩＬ－１α発現量を測定した。
試験例３において、実施例４および比較例７で得られた各表皮角化細胞におけるＩＬ－１ａ発現量を調べた結果を図８に示す。図中、レーン１は実施例４で得られた表皮角化細胞におけるＩＬ－１α発現量、レーン２は比較例７で得られた表皮角化細胞におけるＩＬ－１α発現量を示す。
図８に示された結果から、実施例４で得られた表皮角化細胞におけるＩＬ－１α発現量は、比較例７で得られた表皮角化細胞におけるＩＬ－１α発現量と対比して少ないことがわかる。この結果から、硫酸アルミニウムカリウムは、ＴＮＦαによって誘導されるＩＬ－１αの発現を抑制することがわかる。
また、実施例４で得られた培養上清Ａまたは比較例７で得られた培養上清ＢとＩＬ－６定量試薬〔Ｒ＆Ｄ社製、商品名：Ｈｕｍａｎ ＩＬ－６ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ ＤＹ２０６〕とを用い、実施例４および比較例７で得られた各培養細胞（表皮角化細胞）におけるＩＬ－６発現量を測定した。
試験例３において、実施例４および比較例７で得られた各表皮角化細胞におけるＩＬ－６発現量を調べた結果を図９に示す。図中、レーン１は実施例４で得られた表皮角化細胞におけるＩＬ－６発現量、レーン２は比較例７で得られた表皮角化細胞におけるＩＬ－６発現量を示す。
図９に示された結果から、実施例４で得られた表皮角化細胞におけるＩＬ－６発現量は、比較例７で得られた表皮角化細胞におけるＩＬ－６発現量よりも少ないことがわかる。この結果から、硫酸アルミニウムカリウムは、ＴＮＦαによって誘導されるＩＬ－６の発現を抑制することがわかる。
これらの結果から、被験試料によってＴＲＰＭ４発現細胞のＴＲＰＭ４を介して引き起こされる生理学的事象を用いることにより、ＴＲＰＭ４を活性化し、炎症性サイトカインの発現を抑制する物質を評価することができることがわかる。また、ＴＲＰＭ４を活性化する物質によれば、ＩＬ－１α、ＩＬ－６などの炎症性サイトカインの発現を抑制することができ、炎症を予防することができることがわかる。
以上説明したように、ＢＴＰ２などのＴＲＰＭ４アゴニスト；塩化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウムなどのアルミニウム化合物などのＴＲＰＭ４を活性化する作用を有する物質を予め皮膚細胞と接触させることにより、皮膚細胞における炎症性サイトカインおよびその遺伝子の発現が抑制されることから、ＴＲＰＭ４を活性化する作用を有する物質によれば、炎症性サイトカインの発現を抑制することができ、炎症を予防することができることがわかる。したがって、本発明は、炎症予防用化粧料、炎症予防剤などの開発に好適に用いられることが期待される。
また、ＴＲＰＭ４発現細胞を用い、被験試料によってＴＲＰＭ４発現細胞のＴＲＰＭ４を介して引き起こされる生理学的事象を測定し、被験試料の評価に当該生理学的事象を用いることにより、被験試料が有する皮膚細胞におけるサイトカイン産生抑制作用を評価することができることがわかる。
Claims (4)
- 被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価する被験試料の評価方法であって、ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料とを接触させ、被験試料によってＴＲＰＭ４を介して引き起こされる生理学的事象を測定し、当該生理学的事象に基づき、前記被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価する際に、前記ＴＲＰＭ４発現細胞としてサイトカイン発現能を有する角化細胞を用い、前記生理学的事象としてサイトカイン産生を用い、
（Ａ１）サイトカイン発現能を有する角化細胞と被験試料とサイトカイン産生促進物質とを接触させ、前記サイトカイン発現能を有する角化細胞におけるサイトカインおよび／またはその遺伝子の発現量を測定するステップ、
（Ａ２）サイトカイン発現能を有する角化細胞とサイトカイン産生促進物質とを接触させ、前記サイトカイン発現能を有する角化細胞におけるサイトカインおよび／またはその遺伝子の発現量を測定するステップ、
（Ａ３）前記サイトカイン発現能を有する角化細胞におけるＴＲＰＭ４の機能が欠損したＴＲＰＭ４欠損細胞と被験試料とサイトカイン産生促進物質とを接触させ、前記ＴＲＰＭ４欠損細胞におけるサイトカインおよび／またはその遺伝子の発現量を測定するステップ、
（Ａ４）前記サイトカイン発現能を有する角化細胞におけるＴＲＰＭ４の機能が欠損したＴＲＰＭ４欠損細胞とサイトカイン産生促進物質とを接触させ、前記ＴＲＰＭ４欠損細胞におけるサイトカインおよび／またはその遺伝子の発現量を測定するステップ、および
（Ａ５）ステップ（Ａ１）～（Ａ４）で測定された発現量に基づき、前記被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価するステップ
を行なうことを特徴とする被験試料の評価方法。 - 被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価する被験試料の評価方法であって、ＴＲＰＭ４発現細胞と被験試料とを接触させ、ＴＲＰＭ４活性を測定し、当該ＴＲＰＭ４活性に基づき、前記被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価する際に、前記ＴＲＰＭ４発現細胞としてサイトカイン発現能を有する角化細胞を用い、
（Ｂ１）前記サイトカイン発現能を有する角化細胞と被験試料とを接触させ、被験試料の接触前後のサイトカイン発現能を有する角化細胞におけるＴＲＰＭ４活性の変化を測定するステップ、および
（Ｂ２）ステップ（Ｂ１）で測定されたＴＲＰＭ４活性の変化に基づき、前記被験試料が有するサイトカイン産生抑制作用を評価するステップ
を行なうことを特徴とする被験試料の評価方法。 - 前記サイトカインがインターロイキン－１α、インターロイキン－１β、インターロイキン－２、インターロイキン－６、インターロイキン－８または腫瘍壊死因子である請求項１または２に記載の被験試料の評価方法。
- 前記サイトカイン産生がＴＲＰＭ４の活性化によるサイトカイン産生である請求項１～３のいずれかに記載の被験試料の評価方法。
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2022
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