JP7019665B2 - ＦｒａＣアクチノポリンに基づくバイオポリマーセンシングおよび配列決定のための生物学的ナノポア - Google Patents

Description

本発明は概して、ナノポアの分野、および典型的にはナノポアを通した移行の間に電気的測定を行うことによる、種々の適用、例えば、バイオポリマーおよび高分子の分析におけるその使用に関する。

ナノポアは、例えば、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの正体を決定するため、または配列決定のためにポリマー中の個々の構成単位の正体を推定するためにバイオポリマーを分析する、魅力的な方法となる。これは、この方法がラベルなしであり、少数のまたはさらには単一の分子に依存する測定を提供し、高度にスケーラブルな電気シグナルを生成するからである。

ナノポアを利用する測定システムでは、システムの一部の特性は、ナノポア中のヌクレオチドに依存し、その特性の電気的測定が行われる。例えば、測定システムは、ナノポアを絶縁膜中に配置し、ポリヌクレオチドのヌクレオチドの存在下でナノポアを通る電圧駆動性イオン流を測定することによって創出される。

ナノポアは、化学反応および酵素反応の単一分子モニタリング、タンパク質の検出ならびに核酸の配列決定のための強力なアプローチとして出現した［１］、［２］。Ｐｈｉ２９［３］ならびにＣｌｙＡ［４］は、二本鎖ＤＮＡの移行を可能にすることが示されている。最近、アエロリジンが、アデニンからなるが長さが異なるホモポリマーを識別するために使用された［５］。今日まで、αＨＬおよびＭｓｐＡのみが、核酸を識別することが示されている。両方のナノポアは、それらの膜貫通領域中にβシートを有する。ＤＮＡがＭｓｐＡを通るとき、遮断された電流のレベルは、４つ以上のヌクレオチドによって影響されるが［６］、αＨＬは、約２０核酸塩基を収容するそのバレル型構造中に３つのセンシングゾーンを有する［７］。

本発明は、配列決定の精度を改善し、および／または異なるエラープロファイルを提供する、異なる構造および認識部位を有する新規ナノポアを提供する。本明細書で、本発明者らは、スフィンゴミエリンと複合体を形成した、アクチノポリンタンパク質ファミリー由来のメンバーであるαヘリックスポア形成毒素フラガセアトキシン（Ｆｒａｇａｃｅａｔｏｘｉｎ）Ｃ（ＦｒａＣ）の精製および事前オリゴマー化、ならびに１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）から構成される平面状脂質二重層への再構成を記載する。本発明者らは、ｓｓＤＮＡの捕捉および移行を可能にし、ニュートラアビジン（ＮＡ）で固定化したアデニン、チミンおよびシトシンのホモポリマーを識別するＦｒａＣ変異体（例えば、ＲｅＦｒａＣ）をさらに操作した。特に、ｄｓＤＮＡは、ＦｒａＣを通して、最も可能性が高いのは、ナノポアの弾性的に変形したαヘリックス状のくびれを介して、移行し得る。

注目すべきことに、ＦｒａＣナノポアは、タンパク質配列決定および折り畳まれたタンパク質の分析のための理想的な形状を有することが見出された。電気浸透流が、ナノポアの内側へのタンパク質およびポリペプチドの進入を誘導する支配的な力であることが、本明細書で以下に示される。ナノポアのくびれを正確に操作することまたは溶液ｐＨを変化させることのいずれかによってナノポアの内側表面を調整することによって、正に荷電したポリペプチドおよび負に荷電したポリペプチドの両方の移行を観察できた。固定された印加電位において正の残基および負の残基の両方を輸送するのに十分に強い電気浸透流を誘導することが可能であることが示されているので、これは注目すべきことである。異なるサイズ、例えば、１．２～２５ｋＤａの範囲の一連の（折り畳まれていない）タンパク質は、個々の遮断に基づいて識別できることが、注目すべきことに見出された。２０アミノ酸のモデルポリペプチドを使用して、単一アミノ酸残基における差異でさえもナノポア記録によって観察できることが実証され、これは、ＦｒａＣナノポアが、移行するポリペプチド中の特定の配列特色の同定を可能にすることを示している。

さらに、本発明者らは、スフィンゴミエリンを含まない平面状脂質二重層中で事前オリゴマー化されたＦｒａＣナノポアを再構成する方法を発明した。ＲｅＦｒａＣナノポアは、電気泳動によるＤＮＡ捕捉を可能にするために操作され、ｓｓＤＮＡホモポリマー間の識別を示した。ＤＮＡを配列決定するために使用される他のナノポア（例えば、αＨＬおよびＭｓｐＡ）とは対照的に、ＦｒａＣは、核酸塩基識別を微調整するのに有利なαヘリックスＶ字型の膜貫通領域を有する。これは、膜貫通αヘリックス内の異なる位置におけるアミノ酸置換が、くびれのサイズおよび化学組成の両方をモジュレートし得るからである。

ＲｅＦｒａＣは、低い印加電位でＤＮＡ二重鎖のアンジッピングを誘導すること、または高い印加電位でそれらの移行を可能にすることもまた、本明細書で示されている。ＤＮＡヘアピンまたはより高次のＤＮＡ構造のアンジッピングは、αＨＬナノポアを使用して調査されてきた［２０］、［２１］。しかし、ＲｅＦｒａＣのシス前庭（５．５ｎｍ）は、αＨＬのシス前庭（２．６ｎｍ）［１３］またはＭｓｐＡのシス前庭（４．８ｎｍ）［２２］よりも広く、これは、ＦｒａＣが、より大きい高次のｄｓＤＮＡ構造、例えばＧ－四重鎖、または折り畳まれたＲＮＡ構造、例えばｔＲＮＡを研究するために有利に使用され得ることを示している。

したがって、第１の態様では、本発明は、アクチノポリンタンパク質ファミリー由来のメンバーであるαヘリックスポア形成毒素を含む漏斗状のタンパク質性ナノポアを含むシステムを提供する。より具体的には、αヘリックスポア形成毒素は、フラガセアトキシンＣ（ＦｒａＣ）、変異体ＦｒａＣ、ＦｒａＣパラログまたはＦｒａＣホモログである。ＦｒａＣは、好ましくはそのＣ末端で、ＨｉｓタグまたはＳｔｒｅｐタグなどのタンパク質親和性タグに融合され得る。

非常に良好な結果が、変異体ＦｒａＣを用いて得られ得る。例えば、変異体ＦｒａＣは、ポアの狭い部分における負に荷電したアミノ酸残基から、中性もしくは正に荷電したアミノ酸残基への少なくとも１つの置換、および／またはポアの狭い部分における中性アミノ酸残基から、正に荷電したアミノ酸残基への少なくとも１つの置換を含む。例えば、変異体は、膜貫通ヘリックス中に少なくとも１つの変異を含む。好ましくは、少なくとも１つの負に荷電したアミノ酸残基が、正に荷電したアミノ酸残基に変化される。好ましい実施形態では、変異体ＦｒａＣは、１０位における変異、好ましくは変異Ａｓｐ１０ＡｒｇまたはＡｓｐ１０Ｌｙｓ（結晶構造ＰＤＢ ＩＤ ４ＴＳＹと同様の残基番号付け）を含む。変異体ＦｒａＣは、ＦｒａＣの溶血活性を回復させる１つまたは複数の代償性変異をさらに含み得、好ましくは、前記代償性変異は、２位、９位、３４位、５２位、１１２位、１５０位、１５３位および／もしくは１５９位、ならびに／または好ましくは１５９位に存在する。例えば、前記代償性変異は、Ａ２Ｓ、Ｉ９Ｔ、Ａ３４Ｖ、Ｆ５２Ｙ、Ｗ１１２Ｌ、Ｔ１５０Ｉ、Ｇ１５３Ｄ、Ｋ１５９Ｅ、Ｉ１７１Ｔおよびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。具体的な態様では、変異体ＦｒａＣは、１５９位における変異、好ましくはＬｙｓ１５９Ｇｌｕを（さらに）含む。例えば、ＦｒａＣ二重変異体Ｄ１０Ｒ／Ｋ１５９Ｅが使用される。

ナノポアは第１の液体媒体と第２の液体媒体との間に位置し得、少なくとも一方の液体媒体は分析物を含み、システムは分析物の特性を検出するように作動する。

一実施形態では、システムは、トンネルを通して分析物を移行させるように作動する。別の実施形態では、このシステムは、分析物の特性を検出するように作動し、分析物がナノポアと相互作用するように、ナノポアを電場に供することを含む。印加電位（電場を作り出す）は、電流を有するために必要である。電流は、アウトプットシグナルである。例えば、このシステムは、分析物の特性を検出するように作動し、分析物がナノポアを通して電気泳動および／もしくは電気浸透によって移行するように、ならびに／またはナノポア中にトラップされるように、ナノポアを電場に供することを含む。特性は、分析物の電気的、化学的または物理的特性であり得る。

好ましくは、ナノポアは、（平面状）脂質二重層中に含まれる。具体的な態様では、脂質二重層は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、好ましくは１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンを含むまたはそれからなる。

第２の態様では、本発明は、本発明に従うシステムを提供するための方法であって、
アクチノポリンタンパク質ファミリー由来の前記αヘリックスポア形成毒素の組換えモノマーを用意するステップ；
前記モノマーをリポソームと接触させて、前記モノマーをオリゴマーへとアセンブルするステップ；
リポソームからオリゴマーを回収するステップ；および
オリゴマーを、スフィンゴミエリンを含有し得る脂質二重層と接触させて、ナノポアの形成を可能にするステップ
を含む方法を提供する。

第３の態様では、本発明は、本明細書に開示されるシステムに電場を印加するステップを含む方法であって、αヘリックスポア形成毒素を含む漏斗状のナノポアが、第１の伝導性液体媒体と第２の伝導性液体媒体との間に位置する、方法を提供する。伝導性液体媒体の少なくとも一方は、分析物を含み得る。この方法は、分析物がナノポアと相互作用する際のイオン電流を測定して電流パターンを得るステップを含む方法において分析物を検出するステップをさらに含み得、電流パターンにおける遮断の発生は、分析物の存在を示す。この方法は、例えば、電流パターンを、同じ条件下で既知の分析物を使用して得られた既知の電流パターンと比較することによって、分析物を同定するステップをさらに含み得る。分析物は、ヌクレオチド、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ポリマー、薬物、イオン、汚染物質、ナノスコピックな物体または生物兵器剤であり得る。

一実施形態では、分析物は、ポリマー、例えば、タンパク質、ペプチドまたは核酸である。好ましくは、分析物は、核酸、例えば、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組合せである。別の好ましい態様では、分析物は、例えば、約１～約４０ｋＤａ、好ましくは約１～約３０ｋＤａの範囲のサイズを有する、タンパク質、ポリペプチドまたはオリゴペプチドである。一実施形態では、分析物は、オリゴペプチド（約１０以下のアミノ酸）、ポリペプチド（＞１０のアミノ酸）または折り畳まれたタンパク質（＞５０のアミノ酸）である。

本発明の方法では、ＦｒａＣナノポアは、好ましくは、変異体ＦｒａＣナノポアである。変異体ＦｒａＣナノポアのトンネルを通るコンダクタンスは、典型的には、その対応する野生型ＦｒａＣナノポアを通るコンダクタンスよりも高い。

なおさらなる態様は、ポアの狭い部分における負に荷電したアミノ酸残基から、正に荷電したアミノ酸残基への少なくとも１つの置換、および／またはポアの狭い部分における中性アミノ酸残基から、正に荷電したアミノ酸残基への少なくとも１つの置換を含む第１の変異体ＦｒａＣモノマーを少なくとも含む、変異体フラガセアトキシンＣ（ＦｒａＣ）ナノポアに関する。例えば、変異体は、膜貫通ヘリックス中に少なくとも１つの変異を含む。好ましくは、少なくとも１つの負に荷電したアミノ酸残基が、正に荷電したアミノ酸残基に変化される。変異体は、３位もしくは１０位、または３位および１０位の両方における置換を含み得る。好ましい実施形態では、変異体ＦｒａＣは、１０位における変異、好ましくは変異Ａｓｐ１０ＡｒｇまたはＡｓｐ１０Ｌｙｓ（結晶構造ＰＤＢ ＩＤ ４ＴＳＹと同様の残基番号付け）を含む。変異体ＦｒａＣは、ＦｒａＣの溶血活性を回復させる１つまたは複数の代償性変異をさらに含み得、好ましくは、前記代償性変異は、２位、９位、３４位、５２位、１１２位、１５０位、１５３位および／もしくは１５９位、ならびに／または好ましくは１５９位に存在する。例えば、前記代償性変異は、Ａ２Ｓ、Ｉ９Ｔ、Ａ３４Ｖ、Ｆ５２Ｙ、Ｗ１１２Ｌ、Ｔ１５０Ｉ、Ｇ１５３Ｄ、Ｋ１５９Ｅ、Ｉ１７１Ｔおよびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。具体的な態様では、変異体ＦｒａＣは、１５９位における変異、好ましくはＬｙｓ１５９Ｇｌｕを（さらに）含む。非常に良好な結果が、ＦｒａＣ二重変異体Ｄ１０Ｒ／Ｋ１５９Ｅを用いて得られ得る。具体的に好ましい変異体には、以下の本明細書の表３のものが含まれる。

変異体ＦｒａＣナノポアは、野生型ＦｒａＣモノマー、第２の変異体ＦｒａＣモノマー、野生型ＦｒａＣパラログまたはホモログモノマーおよび変異体ＦｒａＣパラログまたはホモログモノマーからなる群から選択される第２のモノマーを少なくともさらに含み得、第２の変異体ＦｒａＣモノマーは、第１の変異体ＦｒａＣモノマーと同じでも異なってもよい。例えば、第２のモノマーは、野生型ＦｒａＣパラログまたはホモログモノマーである。一実施形態では、変異体ＦｒａＣナノポアの第１の変異体ＦｒａＣモノマーは、変異Ｄ１０Ｒを含み、好ましくは、変異体は、表３に示されるものから選択される。

変異体ＦｒａＣナノポアは、好ましくは、その対応する野生型ＦｒａＣナノポアのトンネルを通るコンダクタンスよりも高い、トンネルを通るコンダクタンスを有する。

変異体ＦｒａＣナノポアは、分子モーターをさらに含み得、分子モーターは、分子モーターの非存在下で分析物がナノポア中にまたはナノポアを通して移行する平均移行速度よりも低い平均移行速度で、分析物をナノポア中にまたはナノポアを通して移動させることが可能である。

例えば、分子モーターは、酵素、例えば、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼまたはクレノウ断片である。

タンパク質分析のために、荷電したくびれによって誘導される、シス区画からトランス区画への電気浸透流（ＥＯＦ）を有することが好ましい。くびれと同じ電荷のアミノ酸の移行は、分析物溶液のｐＨの操作によって得られ得る。低いｐＨ値（＜約４．５）で負の電荷を維持する１つまたは複数の非天然アミノ酸を使用することが有利であり、例えば、硫酸（ＳＯ₄ ^2-）またはリン酸（ＰＯ₄ ^2-）部分は、適切なアミノ酸側鎖基である。したがって、負の印加電位（ｐＨ４．５以下）下でシス区画からトランス区画への強い電気浸透流を有するように操作されたナノポアもまた提供される。

本発明は、バイオポリマーセンシングおよび／またはバイオポリマー配列決定のための、本明細書に開示されるシステムまたは本発明に従う変異体ＦｒａＣナノポアの使用もまた提供する。例えば、前記バイオポリマーは、タンパク質、ペプチドまたは核酸である。好ましくは、核酸、例えば、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質もしくはポリペプチド、あるいはそれらの組合せのセンシングおよび／あるいは配列決定のための、本明細書に開示されるシステムまたは本発明に従う変異体ＦｒａＣナノポアの使用が提供される。

例えば、ＦｒａＣナノポアは、タンパク質、ポリペプチドおよびオリゴペプチドバイオマーカーを認識するために有利に使用される。ナノポアの内側に入ると、異なるサイズのタンパク質およびポリペプチドは、イオン電流によって識別され得る。個々のアミノ酸は、移行の間にオンザフライで同定できなかったが、本発明者らは、トリプトファン残基１個だけが異なる２つの小さい（折り畳まれていない）オリゴペプチドであるエンドセリン１およびエンドセリン２（２．５ｋＤａ）が、イオン電流記録によって区別できることを示した。したがって、ポリペプチドの移行が、例えば酵素の使用によって制御できる場合、ＦｒａＣナノポアは、移行するポリペプチド中の特定の配列特色の同定を可能にする。

一実施形態では、（変異体）ＦｒａＣナノポアは、単一分子プロテオミクス分析においてセンサーとして使用される。ナノポアプロテオミクスの最も単純な実行では、タンパク質は、それらがナノポアを通して直線的に移行するとき、アミノ酸毎に認識される。生物中のタンパク質およびオリゴペプチドの配列は、ゲノム分析から公知であるので、タンパク質は、ナノポアを通過する折り畳まれていない移行の間の具体的なタンパク質遮断を、公知のタンパク質遮断のデータベースと単純に比較することによって認識され得る。あるいは、折り畳まれたタンパク質は、ナノポアを移行してまたは移行せずに、ナノポア前庭の内側にそれらが留まるときに認識され得る。

野生型ＦｒａＣ（ＷｔＦｒａＣ）およびＤ１０Ｒ－Ｋ１５９Ｅ ＦｒａＣ（ＲｅＦｒａＣ）ナノポア。（Ａ）クーロン力表面彩色（赤＝負の電荷、青＝正の電荷）を示すオクタマーＷｔＦｒａＣの断面図。ＷｔＦｒａＣのくびれゾーン中に位置するアスパラギン酸残基１０が示される。（Ｂ）ＷｔＦｒａＣ（上）およびＲｅＦｒａＣ（下）の上面図。（Ｃ）１Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５中＋５０ｍＶでのＷｔＦｒａＣ（青）およびＲｅＦｒａＣ（赤）の単一チャネルコンダクタンスヒストグラム。（Ｄ）同一の取得設定（２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターおよび１０ｋＨｚサンプリングレート）を用いて得た、３Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５緩衝液中＋１００ｍＶでのＷｔＦｒａＣ（上）およびＲｅＦｒａＣ（下）の生トレース。 ＲｅＦｒａＣを用いたＤＮＡ識別。（Ａ）ＲｅＦｒａＣを使用する、ＮＡと複合体を形成したホモポリマーＤＮＡ鎖の代表的遮断。模式図は、電流遮断の説明を示す。（Ｂ）ＲｅＦｒａＣナノポアを用いてＡ₂₀、Ｃ₂₀、Ｔ₂₀ホモポリマー鎖について得られた残留電流の代表的分布。（Ｃ）同じＲｅＦｒａＣポアへの、ホモポリマーＣ₂₀およびＡ₂₀ヌクレオチドによって誘導された連続的トレースの電流遮断。示されるトレースは、１００Ｈｚカットオフを用いてデジタルでフィルタリングした。（Ｄ）Ｃ₂₀およびＡ₂₀ホモポリマー鎖の混合物によって課された残留電流の分布。（Ｅ）ホモポリマーＣ₂₀およびＴ₂₀ヌクレオチドの混合物を分解するための実験の連続的トレース。（Ｆ）Ｃ₂₀およびＴ₂₀ホモポリマー鎖の混合物によって課された残留電流の分布。トレースを、２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターおよび１０ｋＨｚサンプリングレートを使用して、３Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で記録した。トレースＣおよびＥを、さらなる１００Ｈｚガウスデジタルフィルタリングに供した。 ＲｅＦｒａＣによるｄｓＤＮＡのアンジッピング／移行。（Ａ）＋５０ｍＶでの、ＮＡ：Ａ（ｄｓＤＮＡ）Ｃ複合体を捕捉するＲｅＦｒａＣの代表的トレース。開放ポア電流は、「１」として示され、比較のために、複合体の捕捉後が示される。２つのレベルをこのブロックにおいて観察できる：まず、ホモポリマーシトシンに対応する可能性が高い、より低いレベル（「２」）であって、これは、中間レベル（アンジッピング、角括弧）を介して、ホモポリマーアデニンに対応する可能性が最も高い、より高いレベル（「３」）へと変換する。電位の逆転の際（「４」）に、このブロックは即座に放出され、これは、二本鎖領域ＮＡ：Ａ（ｄｓＤＮＡ）Ｃ複合体が剥がされたことを示す。（Ｂ）＋１００ｍＶでは、事例の半分よりも多くにおいて（挿入図）、単一のブロック（「２」）が、ｄｓＤＮＡ部分が押し通された後に観察され（変形、角括弧）、－３０ｍＶの印加の際に、このブロックは、即座には放出され得ない（「３」）。より高い負の電位では、このブロックは放出され得、これは、ロタキサンが形成されたことを示している（さらなる例は図８中）。トレースを、２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターおよび１０ｋＨｚサンプリングレートを使用して、３Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で記録した。 ＷｔＦｒａＣおよびＲｅＦｒａＣナノポアについて決定した単位チャネルコンダクタンス分布および電圧電流依存性。Ａ：平面状脂質二重層中で再構成したＷｔＦｒａＣ（上）およびＲｅＦｒａＣ（下）の事前オリゴマー化されたポアについて測定した単位チャネルコンダクタンス分布。コンダクタンスは、－５０ｍＶの印加電位において測定した。各個々のチャネルの配向を、コンダクタンスにおける非対称に従って検証した。Ｂ：ＷｔＦｒａＣおよびＲｅＦｒａＣナノポアについて測定した電圧電流依存性。実験を３回反復し、エラーバーは、実験値間の標準偏差を示す。記録を、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５および１Ｍ ＮａＣｌ中で実施した。 ＷｔＦｒａＣ、Ｄ１０Ｒ ＦｒａＣおよびＲｅＦｒａＣの溶血活性。溶血率を、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５ １５０ｍＭ ＮａＣｌ中１％のウマ赤血球懸濁物において観察された濁度（６５０ｎｍ波長における光学密度として測定される）における５０％の減少までの経過時間の逆数として計算した。タンパク質を２００ｎＭ濃度で添加し、溶血率はＷｔＦｒａＣの百分率として示される。実験を３回反復し、エラーバーは、実験値間の標準偏差を示す。 ＲｅＦｒａＣナノポアを用いて記録したＡ（ｄｓＤＮＡ）Ｃ ＤＮＡ基質の移行および固定化。Ａ（ｄｓＤＮＡ）Ｃ基質（トレースの上に示される）を、オリゴＩ（５’ビオチン化ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＴＧＣＴＡＣＧＡＣＴＣＴＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ）およびオリゴＩＩ（ＣＡＣＡＣＡＧＡＧＡＧＴＣＧＴＡＧＣＡＣ）のアニーリングによって作製した。Ａ：１μＭのＡ（ｄｓＤＮＡ）Ｃ単独（左）および０．２５μＭのニュートラアビジンと複合体を形成したＡ（ｄｓＤＮＡ）Ｃ（右）によってＲｅＦｒａＣナノポア上で誘発された遮断。基質は、＋５０ｍＶの印加電位下でシスに添加した。Ｂ：１μＭのＡ（ｄｓＤＮＡ）Ｃ単独（左）および０．２５μＭのニュートラアビジンと複合体を形成したＡ（ｄｓＤＮＡ）Ｃ（右）によってＲｅＦｒａＣナノポア上で誘発された遮断。基質は、＋７０ｍＶでシスに添加した。遊離Ａ（ｄｓＤＮＡ）Ｃ遮断について検出された２つのレベルの残留電流は、薄紫の破線で示される。遮断されたポアおよび開放ポアに対応する電流レベルは、それぞれ、薄紫および灰色の破線として示される。電圧ステッピングプロトコールは、トレースの下に赤線で示される。記録を、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５および３Ｍ ＮａＣｌ中で実施し、サンプリング周波数は１０ｋＨｚであり、データを、取得の際に２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターによって平滑化した。 ＲｅＦｒａＣナノポア上で誘発されたＡ（ｄｓＤＮＡ）Ｃ－ニュートラアビジン遮断内の残留電流の段階的増強を示す代表的トレース。１μＭのＡ（ｄｓＤＮＡ）Ｃおよび０．２５μＭのニュートラアビジンは、＋５０ｍＶでシスに存在した。遮断内で、残留電流は、８．８±０．７％（初期レベル）から１２．５±０．７％（最終レベル）へと切り替わった。電圧ステッピングプロトコールは、下に赤線で示される。記録を、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５および３Ｍ ＮａＣｌ中で実施し、サンプリング頻度は１０ｋＨｚであり、データを、取得の際に２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターによって平滑化した。 ＋１００ｍＶの印加電位でＲｅＦｒａＣナノポア中に駆動されたＡ（ｄｓＤＮＡ）Ｃ－ニュートラアビジンによるロタキサン形成を示すトレースのさらなる例。１μＭのＡ（ｄｓＤＮＡ）Ｃおよび０．２５μＭのニュートラアビジンを、シスに添加した。電圧ステッピングプロトコールは、下に赤線で示される。ロタキサンを、印加電位を－４０ｍＶに切り替えることによって解体した。記録を、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５および３Ｍ ＮａＣｌ中で実施し、サンプリング頻度は１０ｋＨｚであり、データを、取得の際に２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターによって平滑化した。 ＲｅＦｒａＣナノポア内に固定化されたオリゴヌクレオチドＩ－ニュートラアビジンによる擬ロタキサンおよびロタキサン形成を示す代表的トレース。Ａ：シスに存在する１μＭのオリゴＩおよび０．２５μＭのニュートラアビジンによって誘発された擬ロタキサン形成。Ｂ：１μＭのオリゴヌクレオチドＩＩがトランスに添加された、シスに存在する１μＭのオリゴヌクレオチドＩおよび０．２５μＭのニュートラアビジンによるロタキサン形成。ロタキサンを、印加電位を－４０ｍＶに切り替えることによって解体した（トレースの上の赤い矢印は、ロタキサンの解体を示す）。ｄｓＤＮＡのアンジッピングを説明する一過的状態は、角括弧中に示される。電圧ステッピングプロトコールは、下に赤線で示される。記録を、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５および３Ｍ ＮａＣｌ中で実施し、サンプリング頻度は１０ｋＨｚであり、データを、取得の際に２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターによって平滑化した。 ２つの異なるｐＨ条件で２つのＦｒａＣバリアントを用いたオリゴペプチド（エンドセリン１）およびタンパク質（キモトリプシン）の捕捉。ａ）野生型ＦｒａＣ（ＷｔＦｒａＣ、ＰＤＢ：４ＴＳＹ）およびＤ１０Ｒ－Ｋ１５９Ｅ－ＦｒａＣ（ＲｅＦｒａＣ）の断面。ｂ～ｃ）ＷｔＦｒａＣ（左）およびＲｅＦｒａＣ（右）に対する、１μＭのエンドセリン１（ｂ）および２００ｎＭのキモトリプシン（ｃ）によって誘導された代表的トレース。キモトリプシン（ＰＤＢ：５ＣＨＡ）およびヒトエンドセリン１（ＰＤＢ：１ＥＤＮ）は、表面提示として示される。エンドセリン１およびキモトリプシンは、負の印加電位下ではＷｔＦｒａＣに進入するが、正の印加電位下ではＲｅＦｒａＣに進入する。ＷｔＦｒａＣへのキモトリプシン遮断は、ｐＨ７．５および４．５で－５０ｍＶ下でも観察されたが、十分な数の遮断を得るために、印加電位を－１００ｍＶまで増加させた。ｐＨ７．５では、正の印加バイアス下でのキモトリプシンによるＲｅＦｒａＣへの遮断は、負の印加バイアス下でのＷｔＦｒａＣへの遮断よりも、高い電位を必要とした。ｐＨ７．５の緩衝液は、１Ｍ ＫＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓを含み、ｐＨ４．５の緩衝液は、１Ｍ ＫＣｌ、０．１Ｍクエン酸、１８０ｍＭ Ｔｒｉｓ．塩基を含んだ。エンドセリン１およびキモトリプシンを、シス区画に添加した。全てのトレースを、５０ｋＨｚサンプリングレートおよび１０ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを使用して記録した。彩色は、それぞれ負の電位および正の電位（範囲－４～＋４ｋｂＴ／ｅｃ）に対応する赤および青により、ＡＰＢＳ（１３）（１Ｍ ＫＣｌ中ｐＨ７．５）によって計算された分子表面の静電電位を示す。ＰｙＭＯＬを使用して構造をレンダリングした。 ＷｔＦｒａＣおよびＲｅＦｒａＣの静電分布およびイオン選択性。ａ）モノマー平均したシミュレートされた静電電位は、それぞれ、ＷｔＦｒａＣおよびＲｅＦｒａｃの負に荷電したくびれおよび正に荷電したくびれを明らかにする。ＲｅＦｒａｃについて、ｐＨを７．５から４．５に低下させることは、静電電位に対して小さい影響を有しただけであったが、ＷｔＦｒａＣについて、くびれの中心部におけるピーク値は、約４１％低下した。全てのシミュレーションは、１Ｍ ＫＣｌでＡＰＢＳ（１３）を使用して実施し、各滴定可能な残基の部分的電荷を、ＰＤＢ２ＰＱＲソフトウェアの改変バージョンを用いてそれらの平均プロトン化状態に従って調整した（１４）。残基のｐＫａ値を、ＰＲＯＰＫＡを使用して推定した（３３、３４）。ｂ）逆転電位の決定は、ＷｔＦｒａＣおよびＲｅＦｒａＣが、それらのくびれにおける静電電位から予測されるように、それぞれカチオン選択的およびアニオン選択的であることを示している。ｐＨを７．５から４．５に低下させることは、シミュレートされた静電電位の低減された大きさに従って、ＷｔＦｒａＣのイオン選択性（Ｐ＿（Ｋ＾＋）／Ｐ＿（［Ｃｌ］＾－））を約４３％低減させた。対照的に、ｐＨ４．５におけるＲｅＦｒａＣのイオン選択性における約３７％の増加は、シミュレーションによって予測されなかった。全ての逆転電位を、非対称な塩条件（トランスでは４６７ｍＭ ＫＣｌ、シスでは１９６０ｍＭ ＫＣｌ）下で測定し、イオン選択性を、Ｇｏｌｄｍａｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ－Ｋａｔｚ方程式を使用して決定した。詳細な実験手順は、サポート情報中で与えられる。全ての電流－電圧曲線の背後の外被は、そのそれぞれの標準偏差を示す。 ｐＨ４．５でＷｔＦｒａＣを用いたバイオマーカーの特徴付け。ａ）上から下に：キモトリプシン（２５ｋＤ、ＰＤＢ：５ＣＨＡ）の分子表面および模式図提示（Ｐｙｍｏｌ）を伴った表面提示、－１５０ｍＶの印加電位下で得られた代表的トレース、－１５０ｍＶでのＩｒｅｓ％に対する滞留時間分布を示すヒートプロット、Ｉｒｅｓ％の電圧依存性、滞留時間の電圧依存性、および捕捉頻度。ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）はそれぞれ、β２－ミクログロブリン（１１．６ｋＤ、ＰＤＢ：１ＬＤＳ）、ヒトＥＧＦ（６．２ｋＤ、ＰＤＢ：１ＪＬ９）、エンドセリン１（２．５ｋＤ、ＰＤＢ：１ＥＤＮ）およびアンジオテンシンＩ（１．３ｋＤ）についての同じ情報を示す。アンジオテンシンＩは、Ｐｙｍｏｌを用いて引き出したランダム構造として示される。バイオマーカーの濃度は以下のとおりであった：それぞれ、キモトリプシンについて２００ｎＭ、β２－ミクログロブリン（ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｉｎ）について２００ｎＭ、ヒトＥＧＦについて２μＭ、エンドセリン１について１μＭ、アンジオテンシンＩについて２μＭ。バイオマーカーの等電点は、文献から、またはオンライン計算ツールＰｅｐｃａｌｃを用いて得られる。エラーバーは、少なくとも３回の反復および各反復について少なくとも３００の事象から得られた標準偏差を示す。データを、Ｂ－スプライン関数（Ｏｒｉｇｉｎ ８．１）を使用してフィットさせた。全ての記録を、５０ｋＨｚサンプリングレートおよび１０ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを用いて収集した。 ｐＨ４．５においてＷｔＦｒａＣを用いたエンドセリン１および２の識別。ａ）静電彩色（ＰｙＭＯＬ）を使用したエンドセリン１およびエンドセリン２の分子表面提示。ｂ）上：エンドセリン１および２のアミノ酸配列。青線は、各オリゴペプチド中のジスルフィド架橋を示す。下：ｐＨ４．５緩衝液（１Ｍ ＫＣｌ、０．１Ｍクエン酸、１８０ｍＭ Ｔｒｉｓ．塩基）中－５０ｍＶでのエンドセリン１およびエンドセリン２遮断についてのＩｒｅｓ％および滞留時間。ｃ）－５０ｍＶの印加電位下での同じＦｒａＣナノポアへの代表的エンドセリン１およびエンドセリン２遮断。ｄ）２μＭのエンドセリン１によって誘発された残留電流のヒストグラム（左）、およびＩｒｅｓ％に対する電流振幅の標準偏差を示す対応するヒートプロット（右）。ｅ）第２の集団を明らかにする同じポアへの８μＭのエンドセリン２の添加後ではあるが、（ｄ）と同じ。グラフは、カスタムＲスクリプトを用いて創出した。全ての記録を、５０ｋＨｚサンプリングレートおよび１０ｋＨｚ Ｂｅｓｓｅｌローパスフィルターを用いて実施した。

実験セクション
セクションＡ
材料および方法
特記しない限り、全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＤＮＡは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から購入した。酵素はＦｅｒｍｅｎｔａｓから、脂質はＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓから取得した。本研究における全ての誤差は、標準偏差として与えられる。

ＦｒａＣクローニング
クローニングを可能にするために、Ｎｃｏ Ｉ制限部位（ＣＣＡＴＧＧ）を、Ａ．ｆｒａｇａｃｅａ由来の成熟ＷｔＦｒａＣに対応するＤＮＡ配列の開始部（５’末端）において導入した。リーディングフレームを維持するために、さらに２つの塩基をＮｃｏ Ｉ部位の後ろに挿入し、開始メチオニンの後のさらなるアラニン残基を生じさせた。精製目的のために、ＦｒａＣのＣ末端で、Ｈｉｓ９親和性タグを、可撓性グリシン－セリン－アラニンリンカーを介して結合させ、オープンリーディングフレームを、２つの連続する停止コドンとその後のＨｉｎｄ ＩＩＩ制限部位（３’末端）によって終結させた。最適化されたコドン組成を有する合成遺伝子（ＩＤＴ）５０ｎｇが、以下のＰＣＲ反応のための鋳型として機能した：遺伝子を、３００μＬ体積中６μＭのプライマーＦｒｆおよびＦｒｒ（表２）を使用して、Ｐｈｉｒｅ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）によって増幅した。ＰＣＲプロトコールは以下のとおりであった：９８℃で３０秒間の事前インキュベーションステップの後には、３０サイクルの９８℃で５秒間の変性および７２℃で１分間の伸長が続いた。Ｈｉ９タグ化ＷｔＦｒａＣ遺伝子を含む得られたＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、Ｎｃｏ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ（ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて消化した。ゲル精製された挿入物（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）を、Ｎｃｏ Ｉ（５’）およびＨｉｎｄ ＩＩＩ（３’）部位を介した粘着末端ライゲーション（Ｔ４リガーゼ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用してｐＴ７－ＳＣ１発現プラスミド中にＴ７プロモーターの制御下でクローニングした。ライゲーション混合物のうち０．６μＬを、５０μＬのＥ．ｃｌｏｎｉ（登録商標）１０Ｇ細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）中に、エレクトロポレーションによって形質転換した。形質転換された細菌を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）ＬＢ寒天プレート上で３７℃で一晩増殖させた。クローンの正体を、配列決定によって確認した。

１０Ｒ ＦｒａＣの構築
ＷｔＦｒａＣ遺伝子を含むｐＴ７－ＳＣ１プラスミドのうち１００ｎｇが、ＰＣＲ反応のための鋳型として機能した：この遺伝子を、３００μＬ体積中６μＭのプライマー１０Ｒｆ（Ｄ１０Ｒをコードする）およびＴ７ターミネーター（表２）を使用してＰｈｉｒｅ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）によって増幅した。ＰＣＲ反応サイクリングプロトコールは以下のとおりであった：９８℃で３０秒間の事前インキュベーションステップの後には、３０サイクルの９８℃で５秒間の変性および７２℃で１分間の伸長が続いた。ＰＣＲ産物をゲル精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）、ＭＥＧＡＷＨＯＰ手順^[1]によってｐＴ７発現プラスミド（ｐＴ７－ＳＣ１）中にクローニングした：約５００ｎｇの精製されたＰＣＲ産物を、ＷｔＦｒａＣ遺伝子を含むｐＴ７－ＳＣ１プラスミド約３００ｎｇと混合し、増幅を、５０μＬの最終体積中でＰｈｉｒｅ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を用いて実施した（９８℃で３０秒間の事前インキュベーション、次いで、３０サイクルの９８℃で５秒間の変性、７２℃で１．５分間の伸長）。環状鋳型を、Ｄｐｎ Ｉ（１ＦＤＵ）との３７℃で２時間のインキュベーションによって排除した。得られた混合物のうち０．６μＬを、Ｅ．ｃｌｏｎｉ（登録商標）１０Ｇ細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）中に、エレクトロポレーションによって形質転換した。形質転換された細菌を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天プレート上で３７℃で一晩増殖させた。クローンの正体を、配列決定によって確認した。

エラープローンＰＣＲによる１０Ｒ ＦｒａＣライブラリーの構築
Ｔ７プロモーターおよびＴ７ターミネータープライマー（表２）を使用してプラスミドＤＮＡからＤ１０Ｒ ＦｒａＣ遺伝子を増幅することによって、ライブラリーを構築した。

表２． 本研究で使用したオリゴヌクレオチド。「５Ｂｉｏｓｇ」は、Ｃ６リンカー（ＩＤＴ）を介してＤＮＡの５’末端にコンジュゲートされたビオチン基を示す。

第１ラウンドの変異誘発において、本発明者らは、１０Ｒ ＦｒａＣをコードする合成遺伝子を含むプラスミドを、鋳型として使用した。第２の変異誘発ラウンドにおいて、本発明者らは、第１ラウンドのスクリーニングにおいて同定された最も高い活性を有するクローン由来のＤＮＡプラスミドのプールを使用した。ＤＮＡ増幅を、エラープローンＰＣＲによって実施した：４００μＬのＰＣＲミックス（２００μｌのＲＥＤＴａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ、６μＭのＴ７プロモーターおよびＴ７ターミネータープライマー、約４００ｎｇのプラスミド鋳型）を、０～０．２ｍＭのＭｎＣｌ₂を含む８つの反応体積に分割し、２７回サイクリングした（９５℃で３分間の事前インキュベーション、次いでサイクリング：９５℃で１５秒間の変性、５５℃で１５秒間のアニーリング、７２℃で３分間の伸長）。これらの条件は、典型的には、最終ライブラリー中に１遺伝子当たり１～４個の変異を生じた。ＰＣＲ産物を一緒にプールし、ゲル精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）、ＭＥＧＡＷＨＯＰ手順によってｐＴ７発現プラスミド（ｐＴ７－ＳＣ１）中にクローニングした：約５００ｎｇの精製されたＰＣＲ産物を、１０Ｒ ＦｒａＣ遺伝子を含むｐＴ７－ＳＣ１プラスミド約３００ｎｇと混合し、増幅を、５０μＬの最終体積中でＰｈｉｒｅ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を用いて実施した（９８℃で３０秒間の事前インキュベーション、その後３０サイクル：９８℃で５秒間の変性、７２℃で１．５分間の伸長）。環状鋳型を、Ｄｐｎ Ｉ（１ＦＤＵ）との３７℃で２時間のインキュベーションによって排除した。得られた混合物のうち０．６μＬを、Ｅ．ｃｌｏｎｉ（登録商標）１０Ｇ細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）中に、エレクトロポレーションによって形質転換した。形質転換された細菌を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）ＬＢ寒天プレート上で３７℃で一晩増殖させると、典型的には＞１０⁵コロニーが得られ、これを、プラスミドＤＮＡライブラリー調製のために収集した。

ＦｒａＣ過剰発現後の粗製溶解物における溶血活性についてのスクリーニング
６００のクローン（上記を参照）由来の一晩スターター培養物を、新しい９６深ウェルプレート中で４５０μＬの新鮮な培地中に接種し、培養物を、約０．８のＯＤ６００まで３７℃で増殖させた。次いで、ＩＰＴＧ（０．５ｍＭ）を添加して過剰発現を誘導し、温度を一晩インキュベーションのために２５℃に低減させた。次の日に、４℃で３０００×ｇで１５分間の遠心分離によって細菌を収集した。上清を廃棄し、ペレットを－８０℃で２時間凍結して、細胞破壊を促進した。次いで、細胞ペレットを、０．４ｍＬの溶解緩衝液（１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０μｇ／ｍｌリゾチーム、０．２単位／ｍＬ ＤＮＡｓｅ Ｉ）中で再懸濁し、３７℃で１３００ＲＰＭで３０分間振盪することによって溶解させた。次いで、粗製溶解物のうち０．５～５μＬを、１００μＬの約１％ウマ赤血球懸濁物に添加した。後者を、ウマ血液（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ Ｂｅｎｅｌｕｘ）を４℃で６０００×ｇで５分間遠心分離し、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中でペレットを再懸濁することによって調製した。上清が赤色を呈した場合、この溶液を再度遠心分離し、ペレットを同じ緩衝液中で再懸濁した。溶血活性を、経時的な６５０ｎｍでのＯＤにおける減少によってモニタリングした（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＧＯ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。

ＦｒａＣ中のＤ１０Ｒアミノ酸置換の有害効果を代償する変異についてのスクリーニング
Ｄ１０Ｒアミノ酸置換は、ＦｒａＣの溶血活性における約５分の１の減少を生じた（図５）。Ｄ１０Ｒ ＦｒａＣは、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）で作製された平面状二重層中でオリゴマー化および再構成されることがなおも可能であったが、本発明者らは、Ｄ１０Ｒ ＦｒａＣの溶血活性をＷｔＦｒａＣレベルに戻して回復させる代償性変異について探索した。ＦｒａＣの溶血活性を維持することは、２つの理由のために重要である：まず、これは、標的化された脂質二重層上でオリゴマーポアへとアセンブルする能力を反映し、したがって、オリゴマーナノポアのより効率的な調製につながり得る。他方で、溶血活性は、任意のアミノ酸配列変化を有するバリアントの機能性をスクリーニングするための簡便な方法を提供し、したがって、ＦｒａＣナノポアに対する将来的な操作の試みを促進するであろう。代償性変異を同定するために、本発明者らは、Ｄ１０Ｒ ＦｒａＣ遺伝子に基づいてランダム変異誘発ライブラリーを構築し、それをＢｌ２１ ＤＥ３ Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換し、参照としてＷｔＦｒａＣを使用して、過剰発現後の粗製溶解物におけるウマ赤血球に対する溶血活性について、個々のバリアントをスクリーニングした。第１ラウンドにおいて、本発明者らは、６００のバリアントをスクリーニングし、溶血活性スクリーニングと組み合わせた第２ラウンドのランダム変異誘発のための鋳型として１２のクローンを選択した。次いで、最も高いレベルの溶血活性を有する７つのクローンを、さらなる特徴付けのために選択した。対応する遺伝子中に生じた配列変化を表３にまとめる。

表３．ＦｒａＣ中のＤ１０Ｒ変異の有害効果を代償する配列変化

精製されたバリアントを、スフィンゴミエリン：ＤＰｈＰＣ（１：１）リポソームにおいてオリゴマー化し、０．６％ＬＤＡＯ中に可溶化した。Ｎｉ－ＮＴＡクロマトグラフィーによって界面活性剤を０．０２％ＤＤＭに交換した後、オリゴマータンパク質を、ＤＰｈＰＣから構成される平面状脂質二重層中でのポア形成活性について試験した。最初に、本発明者らは、最も有望なポア形成体として、３、４およびＲｅＦｒａＣと称するバリアント（表３）を同定した。しかし、バリアント３によって作製されたナノポアは不均一であり（５０％未満がオクタマーポアを生じた）、バリアント４のポア形成活性は、４℃で貯蔵した場合には数日内に減衰していた。オリゴマーＲｅＦｒａＣは、４℃で貯蔵した場合には数か月間にわたってポア形成活性を維持し、ｓｓＤＮＡを捕捉することができるままで、ＷｔＦｒａＣとほぼ同様に均一なナノポアを形成した。したがって、本発明者らは、本研究におけるさらなるＤＮＡ分析のためにＲｅＦｒａＣを選んだ。さらに、本発明者らは、ＲｅＦｒａＣ中のアスパラギン酸１０をアスパラギンで置き換えてＤ１０Ｎ Ｋ１５９Ｅバリアントを得たが、ｓｓＤＮＡ進入は検出できなかった。

ＷｔＦｒａＣ（タンパク質配列）
ＭＡＳＡＤＶＡＧＡＶＩＤＧＡＧＬＧＦＤＶＬＫＴＶＬＥＡＬＧＮＶＫＲＫＩＡＶＧＩＤＮＥＳＧＫＴＷＴＡＭＮＴＹＦＲＳＧＴＳＤＩＶＬＰＨＫＶＡＨＧＫＡＬＬＹＮＧＱＫＮＲＧＰＶＡＴＧＶＶＧＶＩＡＹＳＭＳＤＧＮＴＬＡＶＬＦＳＶＰＹＤＹＮＷＹＳＮＷＷＮＶＲＶＹＫＧＱＫＲＡＤＱＲＭＹＥＥＬＹＹＨＲＳＰＦＲＧＤＮＧＷＨＳＲＧＬＧＹＧＬＫＳＲＧＦＭＮＳＳＧＨＡＩＬＥＩＨＶＴＫＡＧＳＡＨＨＨＨＨＨ＊＊
ＷｔＦｒａＣ（ＤＮＡ配列）
ＡＴＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧＧＧＴＧＣＧＧＴＡＡＴＣＧＡＣＧＧＴＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＧＣＴＴＴＧＡＣＧＴＡＣＴＧＡＡＡＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＧＴＴＡＡＡＣＧＣＡＡＡＡＴＴＧＣＧＧＴＡＧＧＧＡＴＴＧＡＴＡＡＣＧＡＡＴＣＧＧＧＣＡＡＧＡＣＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＴＧＡＡＴＡＣＣＴＡＴＴＴＣＣＧＴＴＣＴＧＧＴＡＣＧＡＧＴＧＡＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＣＣＡＣＡＴＡＡＧＧＴＧＧＣＧＣＡＴＧＧＴＡＡＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＴＡＴＡＡＣＧＧＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴＣＧＣＧＧＴＣＣＴＧＴＣＧＣＧＡＣＣＧＧＣＧＴＡＧＴＧＧＧＴＧＴＧＡＴＴＧＣＣＴＡＴＡＧＴＡＴＧＴＣＴＧＡＴＧＧＧＡＡＣＡＣＡＣＴＧＧＣＧＧＴＡＣＴＧＴＴＣＴＣＣＧＴＧＣＣＧＴＡＣＧＡＴＴＡＴＡＡＴＴＧＧＴＡＴＡＧＣＡＡＴＴＧＧＴＧＧＡＡＣＧＴＧＣＧＴＧＴＣＴＡＣＡＡＡＧＧＣＣＡＧＡＡＧＣＧＴＧＣＣＧＡＴＣＡＧＣＧＣＡＴＧＴＡＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＡＣＴＡＴＣＡＴＣＧＣＴＣＧＣＣＧＴＴＴＣＧＣＧＧＣＧＡＣＡＡＣＧＧＴＴＧＧＣＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＣＴＴＡＧＧＴＴＡＴＧＧＡＣＴＣＡＡＡＡＧＴＣＧＣＧＧＣＴＴＴＡＴＧＡＡＴＡＧＴＴＣＧＧＧＣＣＡＣＧＣＡＡＴＣＣＴＧＧＡＧＡＴＴＣＡＣＧＴＴＡＣＣＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＴＧＣＧＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＧＡＴＡＡＧＣＴＴ

ＦｒａＣの過剰発現および精製
Ｅ．ｃｌｏｎｉ（登録商標）ＥＸＰＲＥＳＳ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、ＦｒａＣ遺伝子を含むｐＴ７－ＳＣ１プラスミドで形質転換した。形質転換体を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを補充したＬＢ寒天プレート上で３７℃で一晩増殖させた後に選択した。得られたコロニーを、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（Ｓｉｇｍａ）中に接種した。培養物を、２００ｒｐｍで振盪しながら、約０．８のＯＤ₆₀₀に達するまで、３７℃で増殖させた。次いで、ＦｒａＣの発現を、０．５ｍＭ ＩＰＴＧの添加によって誘導し、増殖を２５℃で継続した。次の日に、細菌を、６０００×ｇで２５分間の遠心分離によって収集し、ペレットを－８０℃で貯蔵した。モノマーＦｒａＣを含むペレット（５０～１００ｍｌの細菌培養物に由来する）を解凍し、４０ｍｌの１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．０５単位／ｍＬのＤＮａｓｅ Ｉ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）中で再懸濁した。次いで、細胞破壊を開始するために、細菌懸濁物に０．２ｍｇ／ｍｌリゾチームおよび２Ｍ尿素（デブリの形成を防止するため）を補充し、それを、周囲温度で４０分間にわたる精力的な振盪に供した。残存細菌を、プローブ超音波処理によって破壊した。粗製溶解物を、６０００×ｇで２０分間の遠心分離によって清澄化し、上清を、洗浄緩衝液（１０ｍＭイミダゾール １５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５）で事前平衡化した２００μＬ（ビーズ体積）のＮｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）と混合した。周囲温度での１時間の穏やかな混合後、樹脂をカラム（Ｍｉｃｒｏ Ｂｉｏ Ｓｐｉｎ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上にロードし、約５ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄した。ＦｒａＣを、３００ｍＭイミダゾールを含む洗浄緩衝液およそ約０．５ｍＬで溶出した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによって決定した。ＦｒａＣモノマーを、さらなる使用まで４℃で貯蔵した。

溶血活性アッセイ
脱線維素ウマ血液（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ Ｂｅｎｅｌｕｘ）を、上清が透明になるまで１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５で洗浄した。次いで、赤血球を、同じ緩衝液で約１％の濃度（０．６～０．８のＯＤ ６５０ｎｍ）になるように再懸濁した。次いで、懸濁物を、２００ｎＭのＦｒａＣと混合した。溶血活性を、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ（商標）ＧＯ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＯＤ６５０における減少をモニタリングすることによって測定した。溶血率を、濁度における５０％の減少までの経過時間にわたって一体として決定した。

スフィンゴミエリン：ＤＰｈＰＣリポソームの調製
２０ｍｇのスフィンゴミエリン（脳、ブタ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓ）およびＤＰｈＰＣ（１：１）混合物を、０．５％エタノール（スフィンゴミエリンの溶解を補助するため）を補充したペンタン４ｍｌ中に溶解し、丸底フラスコ中に配置した。溶媒を、壁上に脂質フィルムを沈着させるために、フラスコを緩徐に回転させながら蒸発させた。脂質フィルムの沈着後に、フラスコを３０分間にわたって開けたままにして、溶媒を完全に蒸発させた。次いで、脂質フィルムを、超音波処理槽（周囲温度で５～１０分間）を使用して、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５（総脂質の最終濃度は１０ｍｇ／ｍｌ）中に再懸濁した。得られたリポソームを－２０℃で貯蔵した。

ＦｒａＣのオリゴマー化
モノマーＦｒａＣを、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５緩衝液中でリポソーム（脂質／タンパク質質量比は１０：１）と混合した。混合物を、短時間超音波処理し（超音波処理槽）、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、プロテオリポソームを０．６％ＬＤＡＯで可溶化し、５分間インキュベートし、混合物を、ＤＤＭ含有洗浄緩衝液（０．０２％ＤＤＭ １５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５）で２０倍希釈し、ＤＤＭ含有洗浄緩衝液で事前平衡化した約１００μｌ（ビーズ体積）のＮｉ－ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）と混合した。１時間穏やかに混合した後、樹脂をカラム（Ｍｉｃｒｏ Ｂｉｏ Ｓｐｉｎ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上にロードし、約２ｍｌのＤＤＭ洗浄緩衝液で洗浄した。ＦｒａＣを、５０μｌの溶出緩衝液（２００ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ＤＤＭ、ｐＨ８－あるいは、本発明者らは１Ｍイミダゾール ０．０２％ＤＤＭを使用することもあり得たが、ＥＤＴＡがより効率的であることが証明された）によってカラムから溶出させた。精製されたＦｒａＣオリゴマーを４℃で貯蔵した。

あるいは、ＦｒａＣオリゴマーは、ＦｒａＣモノマーを、スフィンゴミエリン単独によって形成されたリポソームと混合する（３７℃で１時間、次いで、４℃で一晩）ことによって形成され得る。次の日に、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１％ＤＤＭ（最終）をプロテオリポソームに添加し、室温で１５分間インキュベートする。次いで、溶液を、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ＤＤＭ １５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ７．５ １５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１ｍｌ体積になるまで希釈する。次いで、溶液を、１００ｋＤａカットオフ限外濾過デバイスを用いて約１００ｕｌまで濃縮する。

平面状脂質二重層における電気的記録
印加電位とは、トランス電極の電位を指す。ＦｒａＣナノポアを、接地電極に接続したシス区画から、脂質二重層中に挿入した。２つの区画を、直径約１００μｍのオリフィスを含む２５μｍ厚のポリテトラフルオロエチレンフィルム（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ）によって分離した。開口部を、ペンタン中１０％のヘキサデカン約５μｌで事前処理し、二重層を、両方の電気生理学チャンバーへのペンタン中の１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）（１０ｍｇ／ｍＬ）約１０μＬの添加によって形成した。典型的には、シス区画（０．５ｍＬ）への０．０１～１０ｎｇのオリゴマーＦｒａＣの添加が、単一のチャネルを得るために十分であった。ＷｔＦｒａＣナノポアは、負の印加電位よりも正の印加電位において、より高い開放ポア電流を示し、ポアの配向を決定するための有用なツールを提供した。電気的記録を、１Ｍ（ＦｒａＣナノポアの初期特徴付け）および３ＭのＮａＣｌ（振幅を増幅するためのポリヌクレオチド分析のため）、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５中で実施した。

データの記録および分析
平面状二重層記録からの電気的シグナルを、Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂパッチクランプ増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して増幅し、Ｄｉｇｉｄａｔａ １４４０ Ａ／Ｄ変換器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてデジタル化した。データを、Ｃｌａｍｐｅｘ １０．４ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用することによって記録し、引き続く分析を、Ｃｌａｍｐｆｉｔソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて実施した。電気的記録を、２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターおよび１０ｋＨｚサンプリングレートを適用することによって取得した。レベル０からレベル１への電流遷移を、Ｃｌａｍｐｆｉｔ中の「単一チャネルサーチ」機能を用いて分析した。残留電流値（Ｉ_res）を、遮断されたポア電流値（Ｉ_B）および開放ポア電流値（Ｉ_O）から、Ｉ_res＝１００^*Ｉ_B／Ｉ_Oとして計算した。Ｉ_BおよびＩ_Oを、事象の振幅ヒストグラムへのガウシアンフィッティングから決定した。段階的電流増強を示す事象の場合、残留電流レベルを、ホールポイント電流ヒストグラムへのガウシアンフィッティングから計算した。事象寿命を決定するために、事象滞留時間（ｔ_off）を、累積分布として一緒にビニングし、単一指数関数にフィットさせた。段階的電流増強（図３Ａ）およびロタキサン形成性遮断を示す事象の頻度を、手動で計算した。グラフは、Ｏｒｉｇｉｎ（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）またはＣｌａｍｐｆｉｔソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて作成した。

ＦｒａＣナノポアのグラフィック提示
分子グラフィックスを、Ｃｈｉｍｅｒａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｇｌ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｃｈｉｍｅｒａ）を用いて実施した。

平面状脂質二重層中での野生型ＦｒａＣポアの再構成
Ｃ末端でＨｉ９タグに遺伝学的に融合させた組換え野生型ＦｒａＣ（ＷｔＦｒａＣ、図１Ａ；１Ｂ、上）タンパク質モノマーを、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ株において発現させた。以前の研究は、アクチノポリンのポアアセンブリが、脂質二重層中のＳＭの存在によって誘発されることを確立している［９］、［１０］、［１１］、［８］。一致して、Ｎｉ－ＮＴＡクロマトグラフィーによって精製されたＷｔＦｒａＣの水溶性モノマーは、ＤＰｈＰＣ平面状脂質二重層中ではポアを形成しなかった。したがって、本発明者らは、モノマーをＤＰｈＰＣ：ＳＭ（１：１）リポソームを用いて事前オリゴマー化した。０．６％Ｎ，Ｎ－ジメチルドデシルアミンＮ－オキシド（ＬＤＡＯ）中でのリポソームの可溶化後、オリゴマーの解離を防止するために［１２］、ＬＤＡＯを、第２ラウンドのＮｉ－ＮＴＡクロマトグラフィー（ＳＩ）によって０．０２％β－ドデシルマルトシド（ＤＤＭ）に交換した。ＤＰｈＰＣ平面状脂質二重層のシス側への、０．０２％ＤＤＭ中のオリゴマーＷｔＦｒａＣの精製されたマイクログラムに満たない量の添加は、容易にポアを生じた。１Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５緩衝液におけるＷｔＦｒａＣポアについての単位チャネルコンダクタンスの分布は、最近決定された結晶構造において観察されたオクタマーにおそらくは対応する、単一のコンダクタンス型（図１Ｃ；４Ａ、上）を主に明らかにした［８］。他の生物学的ナノポアと同様に、ＷｔＦｒａＣチャネルは、ポアの配向の決定を可能にする、非対称な電流－電圧（Ｉ－Ｖ）関係（図４Ｂ）を示した。３Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５緩衝液中で得られた例示的トレースは、図１Ｄ、上に示される。

核酸分析のためのＷｔＦｒａＣの操作
オクタマーＷｔＦｒａＣの結晶構造は、このナノポアが、ｓｓＤＮＡの貫通を可能にするのに十分に大きい（くびれ直径１．２ｎｍ）ことを示唆している［８］。しかし、本発明者らの最初の実験では、本発明者らは、ｓｓＤＮＡ遮断を観察できず、これは、ＷｔＦｒａＣポアの負に荷電したくびれ領域がＤＮＡ移行を防止したことに起因する可能性が最も高い［１３］、［１４］。ＦｒａＣを通したｓｓＤＮＡの貫通を誘導するために、本発明者らは、アスパラギン酸１０をアルギニンで置換して、正に荷電したくびれを有するナノポアを産生した（図１Ｂ、下）。Ｄ１０Ｒ ＦｒａＣは低いポア形成活性を示したので（図５）、本発明者らは、Ｄ１０Ｒ ＦｒａＣ遺伝子の背景に対してランダム変異誘発を実施し、得られたバリアントの溶血活性をスクリーニングした（ＳＩ）。結果として、本発明者らは、広い前庭の外側縁に位置するリジン１５９からグルタミン酸への代償性変異（Ｋ１５９Ｅ）を同定した（図１Ａ）。ＦｒａＣの二重変異体Ｄ１０Ｒ，Ｋ１５９Ｅ（ＲｅＦｒａＣ）は、ＷｔＦｒａＣと比較して変更されたＩ－Ｖ関係を有するにもかかわらず（図４Ｂおよび図１Ｄ、下）、ほぼ野生型レベルの溶血活性を示し（図５）、均一なポアを生じた（図１Ｃ）。１Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ７．５中で±５０ｍＶでのＲｅＦｒａＣポアのより低いコンダクタンスは、アルギニンがアスパラギン酸よりも嵩高い側鎖を有するので、より狭いくびれに帰せられ得る（図１Ｂ）。

ＲｅＦｒａＣを用いたポリヌクレオチド識別
本発明者らは、ＤＮＡをニュートラアビジン（ＮＡ）で固定化するために、αＨＬ［７］、［１５］、［１６］、［１７］およびＭｓｐＡ［１４］、［１８］を用いる確立されたアプローチに従った。本発明者らは、５’末端ビオチン化Ａ２０／Ｃ２０／Ｔ２０ ｓｓＤＮＡホモポリマーをテトラマーＮＡと複合体を形成して、ＤＮＡ鎖を移行および識別するＲｅＦｒａＣの能力を評価した。本発明者らは、事前混合したＤＮＡ（１μＭ）およびＮＡ（０．２５μＭ）を、平面状脂質二重層設定のシス区画に添加し、３Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．５緩衝液および＋７０ｍＶの印加電位（トランス電極を指す）においてＤＮＡ識別実験を実施した。本発明者らは、擬ロタキサンによって誘発される永続的電流遮断を観察したが、このとき、ｓｓＤＮＡは、印加電位が逆転されるまで、ポアを通して安定に貫通される（図２Ａ、図９Ａ）。遮断されたポア電流および開放ポア電流の振幅の百分率に１００を乗算した残留電流Ｉｒｅｓ（（ＩＢ／ＩＯ）×１００）は以下のとおりであった：ＮＡ：Ａ２０について１３．１±０．４％（Ｎ＝５、ｎ＝３６４、ここで、Ｎは、独立した単一のポア実験の数であり、ｎは分析した遮断である）、ＮＡ：Ｃ２０について１０．８±０．３％（Ｎ＝４、ｎ＝９２０）、ＮＡ：Ｔ２０について１４．０±０．３％（Ｎ＝５、ｎ＝７８０）（図２Ｂ）。ポア毎の変動の影響を排除するために、本発明者らは、ホモポリマーの混合物もまた分解した（図２Ｃ～図Ｆ）。比較的低い残留電流は、貫通したｓｓＤＮＡ周囲でのポアの緊密な閉鎖を示唆する。

ＲｅＦｒａＣナノポアによるＤＮＡアンジッピングおよび二本鎖ＤＮＡ移行
ＲｅＦｒａＣのくびれ（１．２ｎｍ）は、Ｂ形態の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ、約２ｎｍ）よりも小さい。したがって、ＤＮＡ分析のためのストッパーとしてのｄｓＤＮＡを評価するために、本発明者らは、２つのオリゴヌクレオチドを設計した：配列ビオチン－５’－Ａ２０－ＧＴＧＣＴＡＣＧＡＣＴＣＴＣＴＧＴＧＴＧ－Ｃ２０－３’を有する、５’末端にビオチン基が結合したオリゴＩ、およびオリゴＩの下線部と逆相補的な配列を有する短いオリゴＩＩ。アニーリングにより、Ａ（ｄｓＤＮＡ）Ｃ基質：Ａ２０およびＣ２０ ｓｓＤＮＡセグメントが隣接するｄｓＤＮＡの２０塩基対長の中心セグメントが得られた。＋５０ｍＶにおけるシス区画への１μＭのＡ（ｄｓＤＮＡ）Ｃの添加は、ＲｅＦｒａＣポアへの一過的遮断を引き起こした（遮断寿命 ２±５秒、Ｉｒｅｓ＝１０．０±０．２％、Ｎ＝３、ｎ＝２９０、図６Ａ、左）。印加電位を＋７０ｍＶに増加させると、遮断寿命は２．９±０．４ｍｓまで短縮した（残留電流は以下の２つの電流レベルを示したことに留意のこと：１２．８±０．６％および３．５±０．５％ Ｎ＝３ ｎ＝２７００ 図６Ｂ、左）。電位による遮断寿命の減少は、ＲｅＦｒａＣを通したＡ（ｄｓＤＮＡ）Ｃの移行を示唆する。ＤＮＡ移行を証明するために、本発明者らは、ＮＡをシスチャンバーに添加した。ＮＡ：Ａ（ｄｓＤＮＡ）Ｃ遮断は、＋５０ｍＶ（図６Ａ、右）および＋７０ｍＶ（図６Ｂ、右）の両方において永続的になり、したがって、これは、ＮＡの非存在下での一過的遮断が、シス区画へのＡ（ｄｓＤＮＡ）Ｃの後退によって誘発できなかったことを示唆している。奇妙なことに、＋５０ｍＶでは、３１±４％のＮＡ：Ａ（ｄｓＤＮＡ）Ｃ遮断（Ｎ＝３、ｎ＝４６８）は、一過的レベル（図３Ａ、状態「２」、Ｉｒｅｓ＝８．８±０．７％）から安定なレベル（図３Ａ、状態「３」、Ｉｒｅｓ＝１２．５±０．７％、Ｎ＝４、ｎ＝４６；さらなる例は図７中）への、残留電流の段階的増強を示した。状態「２」の電流レベルは、ＮＡ：Ｃ２０の電流レベルよりもわずかに低かった（＋５０ｍＶでＩｒｅｓ＝１０．５±０．７；Ｎ＝３、ｎ＝２０６）。状態「３」の電流レベルは、ＮＡ：Ａ２０の電流レベルと一致した。上記電流増強についてのもっともらしい説明は、＋５０ｍＶでは、ＮＡ：Ａ（ｄｓＤＮＡ）ＣのＣ２０セグメントがナノポアのくびれ中で滞留しており（図３Ａ、状態「２」）、二重鎖セグメントがさらなる移行を防止することである。しかし、二重鎖のアンジッピング後、Ａ２０は、ＲｅＦｒａＣのくびれを占拠し、ＮＡが移行を停止させる（図３Ａ、状態「３」）。一致して、＋５０ｍＶでは、ＮＡ：Ａ（ｄｓＤＮＡ）Ｃ遮断は、電位を－３０ｍＶに逆転させたときに即座に解放され、これは、＋５０ｍＶでは、Ａ（ｄｓＤＮＡ）Ｃの移行がアンジッピングによって媒介されることを示している（図３Ａ、角括弧）。

対照的に、＋７０ｍＶでは、かなりの割合の遮断は、－３０ｍＶでは即座には放出されず（図３Ｂ、挿入図）、これは、インターロックされた状態の形成を示している（図３Ｂ、状態「２」および「３」）。さらに、これらのインターロックされた状態は、電位を増加させることでより頻繁に生成された（例えば、＋７０ｍＶにおける全ての遮断の７±４％から、＋１００ｍＶにおける５４±１４％まで、Ｎ＝３、ｎ＝７３９；図３Ｂ、挿入図）。ＮＡと複合体を形成したオリゴＩ単独の遮断が、－３０ｍＶにおいて即座に解放されたこと（図９Ａ）を考慮して、本発明者らは、かかるインターロックされた状態がロタキサンに起因し、ここで、ＮＡおよびＡ（ｄｓＤＮＡ）Ｃの二重鎖ＤＮＡセグメントは、それぞれ、シスストッパーおよびトランスストッパーとして機能すると考えた（図３Ｂ、右）。期待されるように、かかるロタキサンは、オリゴＩＩをトランスに添加することによって、ＮＡ：オリゴＩシス遮断からも形成できた（図９Ｂ）。電位を－４０ｍＶに切り替えることで、トランスでのｄｓＤＮＡストッパーのアンジッピングをおそらくは介して、ロタキサンは迅速に解体された（図８および図９Ｂ）。シスで存在するＮＡ：Ａ（ｄｓＤＮＡ）Ｃからのロタキサンの形成は、Ａ（ｄｓＤＮＡ）Ｃ基質の二重鎖セグメントの移行を可能にするために、ＲｅＦｒａＣポアの変形を必要とする（図３Ｂ、角括弧）。

この構造的可撓性は、αヘリックスポアの一般的な特色であり得る。以前に、本発明者らは、Ｉ型ＣｌｙＡ－ＣＳナノポア（くびれ直径約３．３ｎｍ）へのヒトトロンビン（直径約４．２ｎｍ）の遮断の後に、開放ポア電流における一過的な増加が生じることを観察した［１９］。この現象は、ＣｌｙＡの変形したくびれを通したタンパク質の移行として解釈された。

セクションＡの参考文献
［１］Ｊ．Ｊ．カシアノヴィッツ、Ｅ．ブランディン、Ｄ．ブラントン、Ｄ．Ｗ．ディーマー、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １９９６、９３、１３７７０－１３７７３．
［２］Ｍ．アケソン、Ｄ．ブラントン、Ｊ．Ｊ．カシアノヴィッツ、Ｅ．ブランディン、Ｄ．Ｗ．ディーマー、Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ １９９９、７７、３２２７－３２３３．
［３］Ｄ．ウェンデル、Ｐ．ジン、Ｊ．ゲン、Ｖ．スブラマニアム、Ｔ．Ｊ．リー、Ｃ．モンテマーニョ、Ｐ．グオ、Ｎａｔｕｒｅ ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００９、４、７６５－７７２．
［４］Ｌ．フランチェスキーニ、Ｍ．ソスキン、Ａ．ビーセマンス、Ｇ．マリア、Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１３、４、２４１５．
［５］Ｃ．ツァオ、Ｙ．Ｌ．イン、Ｚ．Ｌ．フ、Ｄ．Ｆ．リャオ、Ｈ．ティエン、Ｙ．Ｔ．ロン、Ｎａｔｕｒｅ ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１６．
［６］Ａ．Ｈ．ラズロ、Ｉ．Ｍ．デリントン、Ｂ．Ｃ．ロス、Ｈ．ブリンカーホフ、Ａ．エイディー、Ｉ．Ｃ．ノヴァ、Ｊ．Ｍ．クレイグ、Ｋ．Ｗ．ラングフォード、Ｊ．Ｍ．サムソン、Ｒ．ダサ、Ｋ．ドーリング、Ｊ．シェンデュア、Ｊ．Ｈ．ガンドラック、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１４、３２、８２９－８３３．
［７］Ｄ．ストッダート、Ａ．Ｊ．ヘロン、Ｅ．ミハイロワ、Ｇ．マリア、Ｈ．ベイリー、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２００９、１０６、７７０２－７７０７．
［８］Ｋ．タナカ、Ｊ．Ｍ．カアベイロ、Ｋ．モランテ、Ｊ．Ｍ．ゴンサレス－マナス、Ｋ．ツモト、Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１５、６、６３３７．
［９］Ａ．バーリック、Ｉ．グティエレス－アギーレ、Ｊ．Ｍ．カアベイロ、Ａ．クルス、Ｍ．Ｂ．ルイス－アルゲリョ、Ｊ．ペレス－ヒル、Ｊ．Ｍ．ゴンサレス－マナス、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００４、２７９、３４２０９－３４２１６．
［１０］Ｂ．バクラッチ、Ｉ．グティエレス－アギーレ、Ｚ．ポドレセク、Ａ．Ｆ．ソネン、Ｒ．Ｊ．ギルバート、Ｐ．マツェク、Ｊ．Ｈ．レイキー、Ｇ．アンダールー、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００８、２８３、１８６６５－１８６７７．
［１１］Ｐ．ショーン、Ａ．Ｊ．ガルシア－サエス、Ｐ．マラボー、Ｋ．バーシア、Ｇ．アンダールー、Ｐ．シュヴィレ、Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ２００８、９５、６９１－６９８．
［１２］Ｋ．タナカ、Ｊ．Ｍ．カアベイロ、Ｋ．ツモト、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１５、５４、６８６３－６８６６．
［１３］Ｇ．マリア、Ｍ．Ｒ．レストレポ、Ｅ．ミハイロワ、Ｈ．ベイリー、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２００８、１０５、１９７２０－１９７２５．
［１４］Ｔ．Ｚ．バトラー、Ｍ．パヴレノク、Ｉ．Ｍ．デリントン、Ｍ．ニーダーヴァイス、Ｊ．Ｈ．ガンドラック、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２００８、１０５、２０６４７－２０６５２．
［１５］Ｒ．Ｆ．パーネル、Ｊ．Ｊ．シュミット、ＡＣＳ Ｎａｎｏ ２００９、３、２５３３－２５３８．
［１６］Ｄ．ストッダート、Ａ．Ｊ．ヘロン、Ｊ．クリンゲルヘーファー、Ｅ．ミハイロワ、Ｇ．マリア、Ｈ．ベイリー、Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ ２０１０、１０、３６３３－３６３７．
［１７］Ｄ．ストッダート、Ｇ．マリア、Ｅ．ミハイロワ、Ａ．Ｊ．ヘロン、Ｈ．ベイリー、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ２０１０、４９、５５６－５５９．
［１８］Ｅ．Ａ．マンラオ、Ｉ．Ｍ．デリントン、Ｍ．パヴレノク、Ｍ．ニーダーヴァイス、Ｊ．Ｈ．ガンドラック、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１１、６、ｅ２５７２３．
［１９］Ｍ．ソスキン、Ａ．ビーセマンス、Ｍ．デ・マイヤー、Ｇ．マリア、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２０１３、１３５、１３４５６－１３４６３．
［２０］Ｊ．マテ、Ｈ．ヴィスラム、Ｖ．ヴィアスノフ、Ｙ．ラビン、Ａ．メラー、Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ２００４、８７、３２０５－３２１２．
［２１］Ｎ．アン、Ａ．Ｍ．フレミング、Ｅ．Ｇ．ミドルトン、Ｃ．Ｊ．バロウズ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２０１４、１１１、１４３２５－１４３３１．
［２２］Ｍ．ファーラー、Ｍ．ニーダーヴァイス、Ｇ．Ｅ．シュルツ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００４、３０３、１１８９－１１９２．

セクションＢ
上記本明細書のセクションＡは、アクチノポリンタンパク質ファミリー由来のαヘリックスポア形成毒素であるフラガセアトキシンＣ（ＦｒａＣ）が、ポリヌクレオチド分析のために有利に使用されることを示している。

セクションＢは、ＦｒａＣナノポアが、オリゴペプチド（約１０以下のアミノ酸）、ポリペプチド（＞１０のアミノ酸）および折り畳まれたタンパク質（＞５０のアミノ酸）の形態の、タンパク質、例えば、バイオマーカーを認識するのにも適切であることを実証している。

材料
キモトリプシン（ウシ膵臓由来、≧８５％、Ｃ４１２９）、β２－ミクログロブリン（ヒト尿由来、≧９８％、Ｍ４８９０）、エンドセリン１（≧９７％、Ｅ７７６４）、エンドセリン２（≧９７％、Ｅ９０１２）、アンジオテンシンＩ（≧９０％、Ａ９６５０）、ペンタン（≧９９％、２３６７０５）およびヘキサデカン（９９％、Ｈ６７０３）、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩酸塩（ロット番号ＳＬＢＧ８５４１Ｖ）およびＴｒｉｚｍａ（登録商標）塩基（ロット番号ＳＬＢＫ４４５５Ｖ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルドデシルアミンＮ－オキシド（ＬＡＤＯ、≧９９％、４０２３４）ならびにｎ－ドデシルβ－Ｄ－マルトシド（ＤＤＭ、≧９８％、Ｄ４６４１）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから得た。ヒトＥＧＦ（≧９８％、ＣＹＴ－２１７）はＰＲＯＳＰＥＣから得た。１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ、８５０３５６Ｐ）およびスフィンゴミエリン（脳、ブタ、８６００６２）は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓから購入した。塩化カリウム（≧９９％、ロット番号ＢＣＢＬ９９８９Ｖ）は、Ｆｌｕｋａから購入した。クエン酸（≧９９％、ロット番号Ａ０３６５０２８）は、ＡＣＲＯＳから得た。全てのポリペプチドバイオマーカーおよび化学物質を、さらなる精製なしに直接使用した。

注意：以下で使用した１５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５緩衝液は、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）プロトコールからの処方を用いて調製した：１．９０２ｇのＴｒｉｚｍａ（登録商標）ＨＣｌおよび０．３５４ｇのＴｒｉｚｍａ（登録商標）塩基を、１リットルのＨ₂Ｏ中に溶解して、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５にした。

方法
ＦｒａＣモノマーの発現および精製
Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを有するＦｒａＣをコードする遺伝子を、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限消化部位を使用して、ｐＴ７－ＳＣ１発現プラスミド¹中にクローニングした。発現のために、プラスミドを、Ｅ．ｃｌｏｎｉ（登録商標）ＥＸＰＲＥＳＳ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞中に、エレクトロポレーションによって導入した。形質転換体を、３７℃での一晩インキュベーション後に１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートから収集し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む２００ｍｌの新鮮な液体２－ＹＴ培地中に接種した。細胞培養物を、２００ｒｐｍで振盪しながら、０．８の６００ｎｍにおける光学密度になるまで、３７℃で増殖させ、次いで、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを細胞培養物に添加した。温度を２５℃に低下させて、１２時間にわたってＦｒａＣタンパク質の発現を誘導した。細胞を、４℃で４，０００ＲＰＭで３０分間の遠心分離によって回収し、細胞ペレットを－８０℃で維持した。５０～１００ｍｌの細胞培養物ペレットを室温で解凍し、３０ｍｌの溶解緩衝液（１５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、４Ｍ尿素、０．２ｍｇ／ｍｌリゾチームおよび０．０５単位／ｍｌ ＤＮａｓｅ）で再懸濁し、ボルテックス（ｖｅｒｔｅｘ）振盪機で１時間、精力的に混合した。細胞を完全に破壊するために、懸濁物を２分間超音波処理した（デューティサイクル１０％、Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ４５０のアウトプットコントロール３）。次いで、粗製溶解物を、４℃で６，５００ＲＰＭで２０分間遠心分離した。上清（ＦｒａＣモノマーを含む）を、３ｍｌの洗浄緩衝液（１０ｍＭイミダゾール、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）で事前洗浄した１００μｌのＮｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ、４℃で貯蔵、懸濁した後、１００μｌをピペッティングして取った）を含む５０ｍｌファルコンチューブに移し、穏やかに混合しながら室温で１時間インキュベートした。樹脂を、４℃で４，０００ＲＰＭで５分間スピンダウンした。上清の大部分を廃棄し、約５ｍｌの緩衝液内のＮｉ－ＮＴＡ樹脂を含むペレットを、ＲＴでＭｉｃｒｏ Ｂｉｏ Ｓｐｉｎカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に移した。Ｎｉ－ＮＴＡビーズを１０ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄し、タンパク質を、５００μｌの３００ｍＭイミダゾールで溶出した。タンパク質濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて決定した。モノマーを４℃で貯蔵した。

スフィンゴミエリン－ＤＰｈＰＣリポソームの調製
２０ｍｇのスフィンゴミエリン（脳、ブタ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓ）を、２０ｍｇの１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓ）と混合し、０．５％ｖ／ｖエタノールを含むペンタン（Ｓｉｇｍａ）４ｍｌ中に溶解した。この脂質混合物を、丸底フラスコに移し、ヘアドライヤーの近くで緩徐に回転させ、壁の至る所に脂質を十分に分散させて、溶媒を蒸発させた。フラスコをもう３０分間室温で開けたままにして、溶媒を完全に蒸発させた。次いで、４ｍｌの緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）を、乾燥脂質に添加し、フラスコを、超音波処理槽に加えて５分間置いた。リポソーム溶液を－２０℃で維持した。

ＦｒａＣのオリゴマー化
凍結リポソームを、解凍後に超音波処理し、質量比１：１でモノマーＦｒａＣと混合した。ＦｒａＣおよびリポソーム混合物を、水槽中で約３０秒間超音波処理し、次いで、３７℃で３０分間維持した。プロテオリポソームを０．６％ＬＡＤＯ（Ｎ，Ｎ－ジメチルドデシルアミンＮ－オキシド、水中５％ｗ／ｖのストック溶液）で可溶化し、次いで、５０ｍｌファルコンチューブに移し、緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．０２％ＤＤＭ）で２０倍希釈した。１００μｌの事前洗浄したＮｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を、希釈されたタンパク質／リポソーム混合物に添加した。１時間穏やかに振盪しながらのインキュベーション後、ビーズをカラム（Ｍｉｃｒｏ Ｂｉｏ Ｓｐｉｎ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にロードし、１０ｍｌの緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）で洗浄した。ＦｒａＣオリゴマーを、３００μｌの溶出緩衝液（２００ｍＭ ＥＤＴＡ、７５ｍＭ ＮａＣｌ、７．５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、０．０２％ＤＤＭ）で溶出した。オリゴマーは、４℃で数週間安定であり得る。

平面状脂質二重層における電気的記録
電気的記録を、以前に記載されたように²実施した。簡潔に述べると、２つのチャンバーを、およそ１００μｍの直径を有する開口部を含む２５μｍポリテトラフルオロエチレンフィルム（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ）によって分離した。２つの銀／塩化銀電極を、０．５ｍｌの緩衝液を満たした電気生理学チャンバーの各区画中に浸した。接地電極をシス区画に接続し、作用電極をトランス側に接続した。脂質二重層を形成するために、約５μｌのヘキサデカン溶液（ペンタン中１０％ｖ／ｖのヘキサデカン）を、ポリテトラフルオロエチレンフィルムに添加した。約２分間後、ペンタン中の１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）１０ｍｇ／ｍｌ溶液１０μｌを、両方の区画中の緩衝液に直接添加した。次いで、脂質二重層は、Ｔｅｆｌｏｎフィルム中の開口部の上および下の緩衝液を低下させることによって、自発的に形成した。ＦｒａＣオリゴマーをシス側に添加した。印加電位下では、ＦｒａＣのイオン電流は非対称であり、これは、脂質二重層中のＦｒａＣナノポアの配向を評価する助けになる。ＦｒａＣナノポアは、より高いコンダクタンスを負の印加電位で測定したときには、図１０に示されるような配向を示した。次いで、分析物をシスチャンバーに添加した。２種の緩衝溶液を、ｐＨに依存して、本研究における電気生理学記録のために使用した。ｐＨ７．５では、１Ｍ ＫＣｌおよび１５ｍＭ Ｔｒｉｓを使用して記録を実施した。ｐＨを７．５から４．５に変動させた場合、使用した緩衝液は、１Ｍ ＫＣｌ、０．１Ｍクエン酸および１８０ｍＭ Ｔｒｉｓ．塩基を含んだ。ＦｒａＣおよびＲｅＦｒａＣオリゴマーは、ｐＨ４．５～７．５で脂質二重層中に挿入できた。

データの記録および分析
平面状二重層記録を、パッチクランプ増幅器（Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ、Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して収集し、データを、Ｄｉｇｉｄａｔａ １４４０ Ａ／Ｄ変換器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてデジタル化した。データを、Ｃｌａｍｐｅｘ １０．４ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用することによって取得し、引き続く分析を、Ｃｌａｍｐｆｉｔソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて実施した。事象持続時間（滞留時間）、２つの事象間の時間（事象間時間）、遮断された電流レベルおよび開放ポアレベルを、「単一チャネルサーチ」機能によって検出した。遮断の電流レベルをＩ_Bと呼び、開放ポア電流をＩ_oと呼んだ。（Ｉ_B／Ｉ_O）^*１００として定義されるＩｒｅｓ％を使用して、異なるバイオマーカーによって引き起こされる遮断の程度を記述した。平均事象間時間を、事象間時間をビニングし、単一指数関数フィットを累積分布に適用することによって計算した。

イオン選択性測定
イオン透過性比（Ｋ⁺／Ｃｌ^-）を、変数インプットとして逆転電位（Ｖ_r）を使用するＧｏｌｄｍａｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ－Ｋａｔｚ方程式（本明細書以下で、方程式（１））を使用して計算した。Ｖ_rを、以下の非対称な塩濃度条件を使用したＩ－Ｖ曲線からの外挿から測定した：個々のＦｒａＣナノポアを、両方のチャンバーにおいて同じ緩衝液（対称的条件、８４０ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、５００μｌ）を使用して再構成して、ナノポアの配向を評価した。３．３６Ｍ ＫＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５を含む溶液４００μｌを、シスチャンバーに緩徐に添加し、ＫＣｌを含まない緩衝溶液（１５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）４００μｌをトランス溶液に添加した（トランス：シス、４６７ｍＭ ＫＣｌ：１９６０ｍＭ ＫＣｌ）。溶液を混合し、Ｉ－Ｖ曲線を、１ｍＶきざみで－３０ｍＶから３０ｍＶまで収集した。ｐＨ４．５における実験を、０．１Ｍクエン酸緩衝溶液を使用するが同じ方法を使用して実施した。最初に、８４０ｍＭ ＫＣｌ、０．１Ｍクエン酸、１８０ｍＭ Ｔｒｉｓ．塩基の緩衝液５００μｌを両方のチャンバー中に添加し、単一のＦｒａＣチャネルを得た。次いで、３．３６Ｍ ＫＣｌ、０．１Ｍクエン酸、１８０ｍＭ Ｔｒｉｓ．塩基を含むｐＨ４．５溶液４００μｌを、シスチャンバーに緩徐に添加し、ＫＣｌを含まない緩衝溶液（０．１Ｍクエン酸、１８０ｍＭ Ｔｒｉｓ．塩基、ｐＨ４．５）４００μｌをトランス溶液に添加した（こうして、４６７ｍＭ ＫＣｌ：１９６０ｍＭ ＫＣｌのトランス：シス比が得られる）。溶液を混合し、Ｉ－Ｖ曲線を、１ｍＶきざみで－３０ｍＶから３０ｍＶまで収集した。イオン選択性の方向性もまた、トランスチャンバー中の高いＫＣｌ濃度およびシスチャンバー中の低いＫＣｌ濃度を使用することによって試験した。Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を、２．５Ｍ ＮａＣｌを含む２．５％アガロース架橋で囲んだ。

ＦｒａＣナノポアを用いたポリペプチドおよびタンパク質の捕捉
オリゴペプチドバイオマーカーについてのセンサーとしてのＦｒａＣナノポアを評価するために、本発明者らは、最初に、２１アミノ酸の２．５ｋＤオリゴペプチドであるエンドセリン１および２４５アミノ酸の２５ｋＤ球状タンパク質であるα－ＩＩ－キモトリプシン（以下、キモトリプシン）を選択した（図１０）。分析物を、１Ｍ ＫＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５溶液を使用して野生型ＦｒａＣ（ＷｔＦｒａＣ）ナノポア（図１０Ａ）のシス側に添加し、外部電位を、トランス区画中に位置する「作用」電極に印加した。ＷｔＦｒａＣは、約＋５０ｍＶよりも上ではゲーティングを示すが、－３００ｍＶほどの高さの電位では安定であるので、本発明者らは、それらの限界間の電位を印加した。シス区画への１μＭのエンドセリン１の添加は、±５０ｍＶ（図１０Ｂ）で、および－３００ｍＶまで、遮断を誘発しなかった。ＣｌｙＡのくびれは、アスパラギン酸残基で覆われているので（図１０Ａ）、本発明者らは、より酸性の条件におけるこれらの残基のプロトン化が、ＷｔＦｒａＣくびれを通したエンドセリン１（－２の正味の電荷を保有する）の移行に対するエネルギー障壁を弱めるはずであると考えた。同時に、あまり負でないエンドセリン１はまた、負の印加電位下でトランス電極に向かってより容易に移動するであろう。エンドセリン１遮断は、ｐＨ６．４で発生し始め、それらの捕捉頻度は、ｐＨの減少と共に直線的に増加した（ｐＨ６．４での０．６±０．２事象／ｓ^-1／μＭ^-1からｐＨ４．４での１０．８±２．３事象／ｓ^-1／μＭ^-1まで）。ｐＨ４．５（１Ｍ ＫＣｌ、０．１Ｍクエン酸、１８０ｍＭ Ｔｒｉｓ．塩基）では、ＷｔＦｒａＣへのエンドセリン１遮断は、－５０ｍＶで観察されたが（Ｉｒｅｓ％：９．１±０．１％、滞留時間：５．６±２．０ｍｓ、事象間時間：５．８±０．７ｍｓ）、＋５０ｍＶでは観察されなかった（図１０Ｂ）。

酸性条件下でのより正のくびれの影響に促されて、本発明者らは次に、Ｄ１０Ｒ，Ｋ１５９Ｅ ＦｒａＣ（ＲｅＦｒａＣ）ナノポア、ＤＮＡ分析の目的のために本明細書の上記セクションＡで操作した、くびれにおいてアルギニン残基を有するポアを用いたエンドセリン１の捕捉を調査した。ＷｔＦｒａＣとは逆に、ＲｅＦｒａＣは、正の印加電位下では安定であるが、約－５０ｍＶの電位ではゲーティングを示す。したがって、本発明者らは、－５０ｍＶ～＋２００ｍＶの間の電圧だけをＲｅＦｒａＣに印加した。シス区画への１μＭエンドセリン１の添加は、＋５０ｍＶではｐＨ７．５で遮断を惹起したが（滞留時間：３．３±２．２ｍｓ、事象間時間：１４１３±２２３ｍｓ）、－５０ｍＶでは惹起しなかった（図１０Ｂ）。ｐＨ４．５（１Ｍ ＫＣｌ、０．１Ｍクエン酸、１８０ｍＭ Ｔｒｉｓ．塩基）への減少は、トランス電極に向かう低減された電気泳動移動度にもかかわらず、＋５０ｍＶでの捕捉頻度における増加をもたらした（図１０Ｂ、滞留時間：８．５±１．８ｍｓ、事象間時間：４０２±７９ｍｓ）。

次に、タンパク質キモトリプシン（ｐＩ８．７５、Ｓｉｇｍａ）を、比較的大きいタンパク質分析物の一例として試験した。タンパク質遮断が、ｐＨ７．５緩衝液（１Ｍ ＫＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ）中－５０ｍＶで観察されたが、本発明者らが電位を－１００ｍＶに増加させた場合にはこれらは均一になり（４５．２±１９．１事象／ｓ^-1／μＭ^-1、滞留時間：１２．０±５．７ｍｓ）、正の印加電位では捕捉は観察されなかった（図１０Ｃ）。エンドセリン１を用いて観察されたものとは対照的に、キモトリプシンの捕捉頻度は、ｐＨ７．５と５．５との間で一定のままであり（ｐＨ７．５において４５．２±１９．１事象／ｓ^-1／μＭ^-1、ｐＨ６．４において５０．５±２２．６事象／ｓ^-1／μＭ^-1、ｐＨ５．５において４５．２±２０．６事象／ｓ^-1／μＭ^-1）、ｐＨを４．４に低下させた場合には減少した（ｐＨ４．４において２０．８±５．３事象／ｓ^-1／μＭ^-1）。ＲｅＦｒａＣをｐＨ７．５で使用して、本発明者らは、高い正の印加電位ではわずかな遮断のみを観察したが（＋２００ｍＶにおける滞留時間：０．２±０．１ｍｓ、事象間時間：１７４．３±２２．９ｍｓ）、－５０ｍＶでは観察しなかった（図１０Ｃ）。ｐＨを４．５に減少させることは、捕捉頻度における増加をもたらした（滞留時間：１．３±０．７ｍｓ、１１２．５±９．５事象／ｓ^-1／μＭ^-1、図９Ｂ）。注目すべきことに、ＲｅＦｒａＣは、図１０Ｃ右下に示されるように、酸性条件下で負の印加電位で浅いゲーティング事象をしばしば示した。合わせると、両方のナノポアは、分子量が１０倍異なる（２．５ｋＤ対２５ｋＤａ）分析物を捕捉できる。

ＦｒａＣナノポアのイオン選択性および静電電位
静電環境に対するｐＨの影響およびＦｒａＣナノポアの内側へのポリペプチドの進入に対する電気浸透流の影響に関するよりよい洞察を得るために、本発明者らは、Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｐｏｉｓｓｉｏｎ－Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ Ｓｏｌｖｅｒ（ＡＰＢＳ）（１３）およびＰＤＢ２ＰＱＲソフトウェアの改変バージョン（１４）を使用して、１Ｍ ＫＣｌ中ｐＨ７．５および４．５におけるＷｔＦｒａＣおよびＲｅＦｒａＣの相同モデルの内側の静電電位を推定した。シミュレーションにより、ナノポアの中心部におけるＷｔＦｒａＣおよびＲｅＦｒａＣのくびれ領域が、それぞれ、高度に負の電位および正の電位を示したことが示された（図１１Ａ）。興味深いことに、ＷｔＦｒａＣについて、ｐＨを７．５から４．５に低下させることは、それぞれ、くびれの中心部における－１．２～－０．７ｋ_BＴ／ｅ_c（２９８Ｋで１ｋ_BＴ／ｅ_c＝２５．６ｍＶ）の還元電位を引き起こしたが、かかる効果は、ＲｅＦｒａＣについては観察されなかった。

ＷｔＦｒａＣおよびＲｅＦｒａＣポアによる分析物の捕捉への電気浸透流の寄与を、ナノポアのいずれかの側での非対称なＫＣｌ濃度（１９６０ｍＭおよび４６７ｍＭ）を使用して、両方のポアのイオン選択性を測定することによって推定した。次いで、逆転電位（Ｖ_r）、即ち、電流がゼロである電位（図１１Ｂ）を、Ｇｏｌｄｍａｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ－Ｋａｔｚ方程式と一緒に使用して、両方のナノポアのイオン選択性（Ｐ_K+／Ｐ_Cl-）を計算した：

式中、［ａ_x］区画は、シス／トランス区画中のイオンＸの活性であり、Ｒは気体定数であり、Ｔは温度であり、Ｆはファラデー定数である。本発明者らは、ＦｒａＣナノポアのイオン選択性が、くびれにおける電荷によって支配され、ＷｔＦｒａｃが強くカチオン選択的であり（Ｐ_K+／Ｐ_Cl-＝３．５５±０．３０、ｐＨ７．５）、ＲｅＦｒａＣがアニオン選択的である（Ｐ_K+／Ｐ_Cl-＝０．５７±０．０４、ｐＨ７．５）ことを見出した。ｐＨを４．５に低下させることは、ＷｔＦｒａＣのカチオン選択性を減少させ（Ｐ_K+／Ｐ_Cl-＝２．０２±０．１５、ｐＨ７．５）、ＲｅＦｒａＣのアニオン選択性を増加させた（Ｐ_K+／Ｐ_Cl-＝０．３６±０．０８、ｐＨ４．５、図１１Ｂ）。

ＷｔＦｒａＣナノポアを用いたバイオマーカー検出
それぞれ、膵嚢胞症（１５）および閉塞性細気管支炎（１６）についてのタンパク質バイオマーカーであるキモトリプシン（２５ｋＤ、２４５アミノ酸）およびエンドセリン１（１２．５ｋＤ、２１アミノ酸）の捕捉を評価した後、ＷｔＦｒａＣナノポアを使用して、末梢動脈疾患についての１１．６ｋＤａ（９９アミノ酸）のバイオマーカーであるβ２－ミクログロブリン（１７）、慢性腎臓疾患についての６．２ｋＤａ（５３アミノ酸）のバイオマーカーであるヒトＥＧＦ（１８）、および高血圧クリーゼについての１．３ｋＤ（１０アミノ酸）のバイオマーカーであるアンジオテンシンＩ（１９）を含む、より広範なタンパク質バイオマーカーを検出した。

全てのバイオマーカーを、負の印加電位下で、およびキモトリプシンを除いてｐＨ４．５で評価した。全てのバイオマーカーの捕捉頻度は、印加電位と共に増加した。試験した全ての他のパラメーターは、非均一な電圧依存性を示した。ＷｔＦｒａＣの内側でのバイオマーカーの滞留時間は増加し（キモトリプシン）、減少し（β２－ミクログロブリンおよびアンジオテンシン１）、または印加電位により二相性の挙動を示した（ＥＧＦおよびエンドセリン１）。図１２を参照のこと。キモトリプシンの残留電流百分率（Ｉｒｅｓ％）の電圧依存性は、電位と共に減少し、エンドセリン１のＩｒｅｓ％は、電位と共に増加したが、β２－ミクログロブリン、ＥＧＦおよびアンジオテンシン１のＩｒｅｓ％は一定のままであった。電流遮断の複雑な電圧依存性にもかかわらず、本発明者らの結果は、ＷｔＦｒａＣナノポアが、それらの電流遮断単独のＩｒｅｓ％のおかげで、異なるサイズのオリゴペプチドおよびタンパク質バイオマーカーを識別することが可能であることを示した（図１２）。

ほぼアイソフォームのオリゴペプチドの識別
本発明者らの実験系に挑戦するために、本発明者らは、高度に類似した分析物を同定しようとした。本発明者らは、２１アミノ酸のうち１つだけが異なるほぼ異性体のオリゴペプチドであるエンドセリン１（ＥＴ－１）およびエンドセリン２（ＥＴ－２）を選択した（図１３Ａおよび図１３Ｂ）。－５０ｍＶでは、本発明者らは、ＥＴ－１（Ｉｒｅｓ％８．９±０．１％、滞留時間 ５．６±２．０ｍｓ、Ｎ＝３、ｎ＝６００）およびＥＴ－２（６．１±１．４％、滞留時間 １９．０±５．３ｍｓ、Ｎ＝３、ｎ＝３８４）について、独自のＩｒｅｓ％および滞留時間を有する識別可能な遮断を観察した（図１２Ｂ）。これは、個々の遮断レベルによるそれらの同定をすでに可能にした（図１３Ｃ）。

驚くべきことに、本発明者らが、同じポアに、最初に２μＭのＥＴ－１を添加し（図１３Ｄ）、その後８μＭのＥＴ－２を連続して添加した場合（図１３Ｅ）、本発明者らは、それらの対応するＩｒｅｓ％にわたって事象の振幅の標準偏差をプロットすることによって、２つの別個の集団の両方の混合物を分離することもできた。この観察は、高度に類似する（オリゴ）ペプチドまたは他の分析物が、ＦｒａＣナノポアを用いて識別できることを示している。

Claims (21)

1. バイオポリマーセンシングおよび／またはバイオポリマー配列決定のための、αヘリックスポア形成毒素フラガセアトキシンＣ（ＦｒａＣ）を含む漏斗状のタンパク質性ナノポアを含むシステムの使用であって、前記バイオポリマーは、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、折り畳まれていないペプチド、折り畳まれていないオリゴペプチド、又は折り畳まれていないタンパク質である、システムの使用。
2. αヘリックスポア形成毒素フラガセアトキシンＣ（ＦｒａＣ）を含む漏斗状のタンパク質性ナノポアを含むシステムに電場を印加する工程を含む方法であって、前記αヘリックスポア形成毒素フラガセアトキシンＣ（ＦｒａＣ）を含む漏斗状のタンパク質性ナノポアが第１の伝導性液体媒体と第２の伝導性液体媒体との間に位置し、前記伝導性液体媒体の少なくとも一方が分析物を含み、前記分析物は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、折り畳まれていないペプチド、折り畳まれていないオリゴペプチド及び折り畳まれていないタンパク質から成る群より選択される、方法。
3. 前記分析物が前記ナノポアと相互作用する際のイオン電流を測定して電流パターンを得る工程を含む方法において前記分析物を検出する工程をさらに含み、前記電流パターンにおける遮断の発生が、前記分析物の存在を示す、請求項２に記載の方法。
4. 前記分析物を同定する工程をさらに含む、請求項２又は３に記載の方法。
5. 前記分析物を同定するステップが、電流パターンを、同じ条件下で既知の分析物を使用して得られた既知の電流パターンと比較することを含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記バイオポリマーは、１～４０ｋＤａのサイズを有するタンパク質である、請求項１に記載のシステムの使用。
7. 前記バイオポリマーは、オリゴペプチド（１０以下のアミノ酸）、ポリペプチド（１０より多いアミノ酸）、又は折り畳まれたタンパク質（５０より多いアミノ酸）である、請求項１に記載のシステムの使用。
8. 前記システムは、前記バイオポリマーが前記ナノポアと相互作用するように前記ナノポアを電場に供することによって、前記バイオポリマーの特性を検出するように作動する、請求項１に記載のシステムの使用。
9. 前記システムは、前記バイオポリマーが前記ナノポアを通して電気泳動および／または電気浸透によって移行するように前記ナノポアを電場に供することによって、前記バイオポリマーの特性を検出するように作動する、請求項１、６～８のいずれか１項に記載のシステムの使用。
10. 前記特性が、前記バイオポリマーの電気的、化学的または物理的特性である、請求項９に記載のシステムの使用。
11. 前記ナノポアが、平面状脂質二重層中に含まれる、請求項１、６～９のいずれか１項に記載のシステムの使用。
12. 前記脂質二重層が、ホスファチジルコリン（ＰＣ）を含む又はホスファチジルコリン（ＰＣ）からなる、請求項１１に記載のシステムの使用。
13. 前記システムは、タンパク質親和性タグに融合されたＦｒａＣを含む、請求項１、６～１２のいずれか１項に記載のシステムの使用。
14. 前記分析物は、１～４０ｋＤａのサイズを有するタンパク質である、請求項２から５のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記分析物は、オリゴペプチド（１０以下のアミノ酸）、ポリペプチド（１０より多いアミノ酸）、又は折り畳まれたタンパク質（５０より多いアミノ酸）である、請求項２～５、１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記システムは、前記分析物が前記ナノポアと相互作用するように前記ナノポアを電場に供することによって、前記分析物の特性を検出するように作動する、請求項２～５、１４～１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記システムは、前記分析物が前記ナノポアを通して電気泳動および／または電気浸透によって移行するように前記ナノポアを電場に供することによって、前記分析物の特性を検出するように作動する、請求項２～５、１４～１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記特性が、前記分析物の電気的、化学的または物理的特性である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記ナノポアが、平面状脂質二重層中に含まれる、請求項２～５、１４～１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記脂質二重層が、ホスファチジルコリン（ＰＣ）を含む又はホスファチジルコリン（ＰＣ）からなる、請求項１９に記載の方法。
21. 前記システムは、タンパク質親和性タグに融合されたＦｒａＣを含む、請求項２～５、１４～２０のいずれか１項に記載の方法。
    
    

Images