JP7013419B2 - 炎症性サイトカインの産生誘導活性は低いが抗炎症性サイトカインの産生誘導活性が高いビフィズス菌 - Google Patents
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Description
本発明は、炎症性サイトカインの産生誘導活性は低いが抗炎症性サイトカインの産生誘導活性が高い乳児腸内由来のビフィズス菌の菌株及びその菌体を有する飲料、食品に関するものである。特に、ビフィドバクテリウム・ブレーベに関するものである。
ビフィズス菌は、ヨーグルトなどの発酵乳製品、各種漬物類など、多くの加工飲食品において、味や風味の付与、栄養の強化、食品の保存性改善など様々な目的で用いられてきた。また、近年ビフィズス菌の備える抗アレルギー作用、免疫賦活作用などといった有効な生理活性について注目が集まっており、精力的に研究が進められている。
免疫系はサイトカインと呼ばれる免疫調節物質によって制御されている。ここでサイトカインの一例としては、インターロイキン（IL）が知られている。例えば、IL-10は、樹状細胞や制御性T細胞などの免疫細胞が産生する抗炎症性サイトカインである。IL-10は免疫応答を抑制する機能を有し、自己免疫疾患、炎症性疾患やアレルギー疾患などを引き起こす過剰な免疫応答を抑制する役割を担っている。
一方、IL-12は、樹状細胞や2型ヘルパーT(Th2)細胞などの免疫細胞が産生する炎症性サイトカインである。IL-12は炎症を促進する機能を有する。
抗炎症性サイトカインであるIL-10を高めることは、慢性炎症性疾患で見られる結合組織破壊の制御に対して有効であると考えられており、IL-10産生を効率良く誘導する微生物として、ラクトコッカス属の菌株が得られたことが特許文献１に記載されている。また、炎症を抑制する観点で、炎症性サイトカインであるIL-12産生を抑制することも重要であると考えられる。したがって、IL-10産生を促進しなお且つIL-12産生を誘導しない素材、すなわちIL-10産生量/IL-12産生量の比率を高める素材を探索することができれば、抗炎症作用の高い素材やそれを用いた商品を提供でき、自己免疫疾患、炎症性疾患やアレルギー疾患の緩和が期待できる。
本発明は、炎症性サイトカインの産生誘導活性は低いが抗炎症性サイトカインの産生誘導活性が高い乳児腸内由来のビフィズス菌及び当該ビフィズス菌を含有する飲食品を提供することを目的とする。
本発明者らは、乳児糞便を分離源として、多数のビフィズス菌についてスクリーニングを行った。その結果、炎症性サイトカインの産生誘導活性は低いが抗炎症性サイトカインの産生誘導活性が高いビフィズス菌があることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本願第一の発明は、炎症性サイトカインの産生誘導活性は低いが抗炎症性サイトカインの産生誘導活性が高いビフィドバクテリウム属に属するビフィズス菌である。
本願第二の発明は、上記ビフィズス菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベ N708株（NITE BP-02958）である、本願第一の発明に記載のビフィズス菌である。
本願第三の発明は、本願第一の発明または本願第二の発明に記載のビフィズス菌を含有する飲食品である。
本発明のビフィズス菌は、炎症性サイトカインの産生誘導活性は低いが抗炎症性サイトカインの産生誘導活が高い。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．ビフィドバクテリウム・ブレーベ N708株（NITE BP-02958）
本発明のビフィズス菌はビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）である。本発明におけるN708の記号は、日清食品ホールディングス株式会社で独自に菌株に付与した番号である。本発明の菌株は、乳児糞便より本発明者によって初めて分離されたものである。
１．ビフィドバクテリウム・ブレーベ N708株（NITE BP-02958）
本発明のビフィズス菌はビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）である。本発明におけるN708の記号は、日清食品ホールディングス株式会社で独自に菌株に付与した番号である。本発明の菌株は、乳児糞便より本発明者によって初めて分離されたものである。
本発明のビフィドバクテリウム・ブレーベ N708株は、下記の条件で寄託されている。
（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
（２）連絡先：〒２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室
（３）受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０２９５８
（４）識別のための表示：Ｎ７０8
（５）寄託日：２０１９年５月２９日
（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
（２）連絡先：〒２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室
（３）受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０２９５８
（４）識別のための表示：Ｎ７０8
（５）寄託日：２０１９年５月２９日
本発明のビフィドバクテリウム・ブレーベ N708株の菌学的性質は、以下の表１及び表２に示す通りである。本菌学的性質は、Bergey’s manual of systematic bacteriology Vol.2(1986)に記載の方法による。表１は本菌株に関する形状などを、表２はアピ20A(ビオメリュー製)による生理・生化学的性状試験の結果を示す。表２において、「＋」が陽性、「－」は陰性を示す。
２．IL-10およびIL-12産生誘導能評価試験
本発明のビフィドバクテリウム・ブレーベ N708株は、後述する実験例に示すように、抗炎症性のIL-10産生誘導能が高く、なお且つ炎症性のIL-12産生誘導能が低い菌株である。IL-10およびIL-12産生誘導能の評価については、以下の試験方法によって実施した。
本発明のビフィドバクテリウム・ブレーベ N708株は、後述する実験例に示すように、抗炎症性のIL-10産生誘導能が高く、なお且つ炎症性のIL-12産生誘導能が低い菌株である。IL-10およびIL-12産生誘導能の評価については、以下の試験方法によって実施した。
＜菌体の調製＞
IL-10およびIL-12産生誘導能評価試験に用いた被験体（死菌紛末）は、ビフィズス菌を表３に示すGAM培地（ニッスイ）で37℃・24時間、前培養と本培養をした。次いで、増殖した本培養液中の菌体を遠心分離して集菌し、分離した菌体を滅菌水で3回洗浄し、加熱殺菌後、凍結した。その後、凍結乾燥機を用いて凍結乾燥をすることで、乾燥死菌体粉末を得た。
IL-10およびIL-12産生誘導能評価試験に用いた被験体（死菌紛末）は、ビフィズス菌を表３に示すGAM培地（ニッスイ）で37℃・24時間、前培養と本培養をした。次いで、増殖した本培養液中の菌体を遠心分離して集菌し、分離した菌体を滅菌水で3回洗浄し、加熱殺菌後、凍結した。その後、凍結乾燥機を用いて凍結乾燥をすることで、乾燥死菌体粉末を得た。
＜IL-10およびIL-12産生誘導能評価試験＞
本発明の菌株のIL-10およびIL-12産生誘導能を評価するために、ヒト末梢血CD14+単球をロンザジャパン株式会社より購入し、参考文献（Monika et al., Regulation of the IL-10/IL-12 axis in human dendritic cells with probiotic bacteria. (2011) FEMS Immunol Med Microbiol. 63:93-107.）に従い樹状細胞に分化誘導した。すなわち、ヒト末梢血CD14+単球を20 ng/mL GM-CS (Granulocyte Macrophage colony-stimulating Factor), 20 ng/mL IL-4 10%FBSおよび10%FBS含有RPMI-1640培地にて、37℃、5%CO2条件下で6日間培養することにより樹状細胞に分化誘導した。細胞回収後に細胞数を調整し、96穴培養プレートに1 × 105細胞/wellずつ分注した。そこに上記で得た乾燥死菌体粉末を100 ng/mLとなる様に添加後37℃、5%CO2条件下で6時間培養した。さらに、IL-12p70誘導剤 (0.1 μL/mL Lioppollysaccuaride、20 ng/mL IFN-γおよび50 ng/mL TNF-α)を添加して18時間培養した。なお、IL-12p70誘導剤が添加された樹状細胞は、ストレス環境下におかれると炎症性サイトカインであるIL-12p70の産生が高まる。本発明では、ストレス環境下に樹状細胞をおいても、IL-10の産生を促進し、なお且つIL-12の産生を促進しない菌株を探索する目的で、樹状細胞にIL-12ｐ70誘導剤を添加した。培養後培養上清を回収し、培養上清中のIL-10はIL-10 Human Uncoated ELISA Kit (Invitrogen)により、IL-12はHuman IL-12p70 Uncoated ELISA (Invitrogen)によりそれぞれ測定した。
本発明の菌株のIL-10およびIL-12産生誘導能を評価するために、ヒト末梢血CD14+単球をロンザジャパン株式会社より購入し、参考文献（Monika et al., Regulation of the IL-10/IL-12 axis in human dendritic cells with probiotic bacteria. (2011) FEMS Immunol Med Microbiol. 63:93-107.）に従い樹状細胞に分化誘導した。すなわち、ヒト末梢血CD14+単球を20 ng/mL GM-CS (Granulocyte Macrophage colony-stimulating Factor), 20 ng/mL IL-4 10%FBSおよび10%FBS含有RPMI-1640培地にて、37℃、5%CO2条件下で6日間培養することにより樹状細胞に分化誘導した。細胞回収後に細胞数を調整し、96穴培養プレートに1 × 105細胞/wellずつ分注した。そこに上記で得た乾燥死菌体粉末を100 ng/mLとなる様に添加後37℃、5%CO2条件下で6時間培養した。さらに、IL-12p70誘導剤 (0.1 μL/mL Lioppollysaccuaride、20 ng/mL IFN-γおよび50 ng/mL TNF-α)を添加して18時間培養した。なお、IL-12p70誘導剤が添加された樹状細胞は、ストレス環境下におかれると炎症性サイトカインであるIL-12p70の産生が高まる。本発明では、ストレス環境下に樹状細胞をおいても、IL-10の産生を促進し、なお且つIL-12の産生を促進しない菌株を探索する目的で、樹状細胞にIL-12ｐ70誘導剤を添加した。培養後培養上清を回収し、培養上清中のIL-10はIL-10 Human Uncoated ELISA Kit (Invitrogen)により、IL-12はHuman IL-12p70 Uncoated ELISA (Invitrogen)によりそれぞれ測定した。
３．飲食品
本発明のビフィズス菌は飲食品に含有せしめて使用することができる。本発明のビフィズス菌は特に飲料に好適に用いることができるが、例えば、発酵乳及び乳酸菌飲料が考えられる。現行の乳及び乳製品の成分規格等に関する省令では、成分規格として発酵乳（無脂乳固形分8.0％以上のもの）や乳製品乳酸菌飲料（無脂乳固形分3.0％以上のもの）であれば1.0×107 cfu/mL以上、乳酸菌飲料（無脂乳固形分3.0％未満のもの）であれば1.0×106 cfu/mL以上必要とされるが、乳などのはっ酵液中で増殖させたり、最終製品の形態で増殖させたりすることによって上記の菌数を実現することができる。また、ビフィズス菌入りの発酵乳及び乳酸菌飲料以外にも、バター等の乳製品、マヨネーズ等の卵加工品、バターケーキ等の菓子パン類等にも利用することができる。また、即席麺やクッキー等の加工食品にも好適に利用することができる。上記の他、本発明の食品は、前記ビフィズス菌と共に、必要に応じて適当な担体及び添加剤を添加して製剤化された形態（例えば、粉末、顆粒、カプセル、錠剤等）であってもよい。
本発明のビフィズス菌は飲食品に含有せしめて使用することができる。本発明のビフィズス菌は特に飲料に好適に用いることができるが、例えば、発酵乳及び乳酸菌飲料が考えられる。現行の乳及び乳製品の成分規格等に関する省令では、成分規格として発酵乳（無脂乳固形分8.0％以上のもの）や乳製品乳酸菌飲料（無脂乳固形分3.0％以上のもの）であれば1.0×107 cfu/mL以上、乳酸菌飲料（無脂乳固形分3.0％未満のもの）であれば1.0×106 cfu/mL以上必要とされるが、乳などのはっ酵液中で増殖させたり、最終製品の形態で増殖させたりすることによって上記の菌数を実現することができる。また、ビフィズス菌入りの発酵乳及び乳酸菌飲料以外にも、バター等の乳製品、マヨネーズ等の卵加工品、バターケーキ等の菓子パン類等にも利用することができる。また、即席麺やクッキー等の加工食品にも好適に利用することができる。上記の他、本発明の食品は、前記ビフィズス菌と共に、必要に応じて適当な担体及び添加剤を添加して製剤化された形態（例えば、粉末、顆粒、カプセル、錠剤等）であってもよい。
本発明のビフィズス菌は、一般の飲料や食品以外にも特定保健用食品、栄養補助食品等に含有させることも有用である。
また、本発明のビフィズス菌は、食品以外にも化粧水等の化粧品分野、整腸剤等の医薬品分野、歯磨き粉等の日用品分野、サイレージ、動物用餌、植物液体肥料等の動物飼料・植物肥料分野においても応用可能である。
以下、本発明の実施例を示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜試験例１＞IL-10およびIL-12産生誘導活性能評価
本発明のBifidobacterium breve N708株と、自社保有の3株のBifidobacterium breve比較菌株（Bbr1, Bbr2, Bbr3）及び標準株のBifidobacterium breve JCM1192についてIL-10およびIL-12産生誘導能を評価した。
本発明のBifidobacterium breve N708株と、自社保有の3株のBifidobacterium breve比較菌株（Bbr1, Bbr2, Bbr3）及び標準株のBifidobacterium breve JCM1192についてIL-10およびIL-12産生誘導能を評価した。
IL-10およびIL-12産生誘導能評価は次の手順により行った。本発明の菌株、標準株、及び比較菌株（Bbr1, Bbr2, Bbr3）のそれぞれについて、表３に示すGAM培地（GAM Broth”Nissui”）で37℃ ・24時間培養し、増殖した菌体を遠心分離して集菌し、分離した菌体を滅菌水にて3回洗浄し、加熱殺菌後、凍結した。その後、凍結乾燥機を用いて凍結乾燥し、乾燥菌体粉末を得た。
ヒト末梢血CD14+単球を20 ng/mL GM-CS (Granulocyte Macrophage colony-stimulating Factor), 20 ng/mL IL-4 10%FBSおよび10%FBS含有RPMI-1640培地にて、37℃、5%CO2条件下で6日間培養することにより樹状細胞に分化誘導した。細胞回収後細胞数を調整し、96穴培養プレートに1 × 105細胞/wellずつ分注した。そこに上記で得た乾燥死菌体粉末を100 ng/mLとなる様に添加後37℃、5%CO2条件下で6時間した。さらに、IL-12p70誘導剤 (0.1 μL/mL Lioppollysaccuaride、20 ng/mL IFN-γおよび50 ng/mL TNF-α)を添加して18時間培養した。培養後、培養上清を回収し、培養上清中のIL-10はIL-10 Human Uncoated ELISA Kit (Invitrogen)により、IL-12はHuman IL-12p70 Uncoated ELISA (Invitrogen)によりそれぞれ測定した。その結果を図１～図３に示す。
図１からも明らかなように、本発明のビフィドバクテリウム・ブレーベ N708株のIL-10産生量は145 pg/mLであり、標準株、及び比較菌株（Bbr1, Bbr2, Bbr3）と比べて高いIL-10産生誘導能力を有していることが確認された。図2より、ビフィドバクテリウム・ブレーベ N708株は他の菌株と比べてもIL-12産生を誘導しないことも確認された。さらに、図3に示すように、ビフィドバクテリウム・ブレーベ N708株のIL-10産生量/IL-12産生量の比率が他の菌株と比べて顕著に高いことが確認できた。
＜試験例２＞スキムミルク培地増殖性試験
本発明のビフィドバクテリウム・ブレーベ N708株と標準株であるBifidobacterium breve JCM1192について、スキムミルク培地増殖性試験を実施した。
本発明のビフィドバクテリウム・ブレーベ N708株と標準株であるBifidobacterium breve JCM1192について、スキムミルク培地増殖性試験を実施した。
10％SM（スキムミルク）+ 0.5%酵母エキス培地に植菌し、これを37℃ ・24時間培養し、生菌数によってスキムミルク培地での増殖性を評価した。結果を表４に示す。
本発明のビフィドバクテリウム・ブレーベ N708株の菌数は9.21 x 108 cfu/mlであり、はっ酵乳、乳酸菌飲料を生産する上で問題のないレベルであった。
Claims (2)
- ビフィズス菌であって、
炎症性サイトカインＩＬ－１２の産生誘導活性は低いが抗炎症性サイトカインＩＬ－１０の産生誘導活性が高い、ビフィドバクテリウム属に属するビフィドバクテリウム・ブレーベ Ｎ７０８株（ＮＩＴＥ ＢＰ－０２９５８）。 - 請求項１に記載のビフィズス菌を含有する飲食品。
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