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JP7012124B2 - リポソーム組成物および医薬組成物 - Google Patents

リポソーム組成物および医薬組成物 Download PDF

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Description

本発明は、高い血中滞留性を示すリポソーム組成物および医薬組成物に関する。
リポソーム組成物によって、薬物を、がんなどの疾患部位に集積させ、長期間に渡って曝露させることが多く検討されている。医薬組成物としてのリポソーム組成物においては、脂質膜からなるリポソーム中に薬物が内包されている。
特許文献１および非特許文献１には、スフィンゴミエリンとコレステロールを含むリポソームに、トポテカンを内包させたリポソームが記載されている。
特許文献２には、ジヒドロスフィンゴミエリンとコレステロールを含むリポソームに、トポテカンを内包させたリポソームが記載されている。
特許文献３には、カンプトテシンの安定性を高めるように適合されたリポソームカンプトテシン製剤であって、（ａ）リポソームに封入されたカンプトテシン、（ｂ）リポソームの外部にあり、ｐＨ４．５未満または４．５である第一の溶液、および（ｃ）リポソーム内部にある第２の溶液を含む製剤が記載されている。また、リポソームがジヒドロスフィンゴミエリンおよびコレステロールを含むことが記載されている。
特許文献４には、両親媒性薬剤をリポソームに有効に充填するシステムであって、アンモニウム化合物またはアンモニウム塩の存在下でリポソーム懸濁液を調整し、上記懸濁液を緩衝剤または塩で希釈して、内部水性相と外部水性相との間に、内側から外側に向かうアンモニウム勾配と、リポソームの内側のｐＨが外側のｐＨより酸性側であるようなｐＨ勾配とを与えることを包含する、システムが記載されている。
特許文献５には、精製水素添加大豆リン脂質またはスフィンゴミエリン、コレステロールおよび親水性ポリマー誘導体脂質を含むリポソームに、硫酸アンモニウムの存在下でトポテカンを内包させたリポソームが記載されている。
米国特許第７，０６０，８２８Ｂ２号公報 米国特許第７，８１１，６０２Ｂ２号公報 特表２００８－５１９０４５号公報 特開平２－１９６７１３号公報 米国特許第６，３５５，２６８Ｂ２号公報
AACR-EORTC International Conference, San Francisco, California, October 22-26, 2007, #C113 A Pharmacokinetics Study of a Novel Sphingomyelin/Cholesterol Liposomal Topotecan and Non-Liposomal Topotecan in Rats, William C.Zamboni et al.
上記した特許文献１、２および３並びに非特許文献１には、トポテカンを、スフィンゴミエリンまたはジヒドロスフィンゴミエリンを含むリポソームに内包することにより、血中でのトポテカンの流出を抑制し、ＡＵＣ（Area Under the blood concentration-time Curve：血中濃度－時間曲線下面積）を向上させることにより薬効の向上を図ることが記載されている。しかし、リポソームを構成する脂質組成、およびトポテカンを沈殿させる塩の組成の最適化がなされていないため、ＡＵＣの向上は十分なものではなく、更なる改善が求められている。
また、トポテカンが、リポソームの内水相から外水相に漏れ、中性条件に曝されると、トポテカンは類縁体へ変化する。具体的には、極めて溶解度の低いN-N bis付加物(トポテカンアミン二量体)などが結晶として析出し沈殿することがある。最終的には、米国のFood and Drug Administration (FDA)、日本のPharmaceutical and Medical Device Agency (ＰＭＤＡ)、およびEuropean Medicines Agency (EMEA)が規定する安全基準および品質基準を逸脱する多くの不溶性微粒子が生成して好ましくない。このような不溶性微粒子の生成を抑制するために、特許文献３においては、外水相のｐＨを酸性条件にしている。しかし、外水相が酸性条件では、リポソームを構成する脂質の分解が促進し、リポソームの安定化のためには不利であった。特許文献３のリポソームにおいては、外水相を酸性にすることが必要であることから、酸性で加水分解するメトキシポリエチレングリコールで修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミンを血中滞留性の向上のために添加することは困難である。
本発明は、高いＡＵＣを示すリポソーム組成物および医薬組成物を提供することを解決すべき課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を使用し、内水相が硫酸アンモニウムを含み、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上とすることによって、上記の課題を解決したリポソーム組成物を提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、下記を提供する。
［１］
リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であって、上記リポソーム組成物は薬物を内包し、内水相が硫酸アンモニウムを含み、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上である、リポソーム組成物。
［２］
薬物がトポテカンまたはその塩、ドキソルビシンまたはその塩、イリノテカンまたはその塩、スニチニブまたはその塩である、［１］に記載のリポソーム組成物。
［３］
全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．６以上１．８以下である、［１］または［２］に記載のリポソーム組成物。
［４］
親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミンが、ポリエチレングリコールまたはメトキシポリエチレングリコールで修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミンである、［１］から［３］の何れかに記載のリポソーム組成物。
［５］
リポソーム膜の構成成分における親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミンの比率が２～１０モル％である、［１］から［４］の何れかに記載のリポソーム組成物。
［６］
リポソーム膜の構成成分におけるコレステロール類の比率が３５～４３モル％である、［１］から５の何れかに記載のリポソーム組成物。
［７］
粒子径が１５０ｎｍ以下である、［１］から［６］の何れかに記載のリポソーム組成物。
［８］
外水相のｐＨが５．５～８．５である、［１］から［７］の何れかに記載のリポソーム組成物。
［９］
ジヒドロスフィンゴミエリンが炭素数１６と炭素数１８の長鎖アルキル基を含むジヒドロスフィンゴミエリンで、内包薬剤がトポテカンまたはその塩である［１］から［８］の何れかに記載のリポソーム組成物。
［１０］
リポソームの内水相に含まれる硫酸イオンのリポソーム組成物全体の硫酸イオンに対する比率が、少なくとも８０％であり、リポソームの内水相に含まれる薬物のリポソーム組成物全体の薬物に対する比率が、少なくとも８０％である、［１］から［９］何れかに記載のリポソーム組成物。
［１１］
アンモニウム濃度が１ｍｍｏＬ／Ｌ以下の血漿におけるリポソームからの薬物のリリース速度が、３７℃において２０％／２４時間以下であり、アンモニウム濃度が４～６ｍｍｏＬ／Ｌの血漿におけるリポソームからの薬物のリリース速度が、３７℃において６０％／２４時間以上である、［９］に記載のリポソーム組成物。
［１２］
５℃で１か月の保管後におけるリポソーム組成物の脂質１μｍｏｌ当たりに含まれる１０μｍ超の粒子が１５０個以下、前記リポソーム組成物の脂質１μｍｏｌ当たりに含まれる２５μｍを超える粒子の個数が１５個以下である、［１］から［１１］の何れかに記載のリポソーム組成物。
［１３］
［１］から［１２］の何れかに記載のリポソーム組成物を含む、医薬組成物。
［１４］
抗がん剤である、［１３］に記載の医薬組成物。
［１５］
リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であって、前記リポソーム組成物は薬物を内包し、内水相がアンモニウム塩を含み、ジヒドロスフィンゴミエリンが炭素数１６と炭素数１８の長鎖アルキル基を有するジヒドロスフィンゴミエリンである、リポソーム組成物。
［Ａ］ リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であって、上記リポソーム組成物は薬物を内包し、内水相が硫酸アンモニウムを含み、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上である、リポソーム組成物を、対象に投与することを含む、疾患の治療方法。
［Ｂ］ 疾患（好ましくは、がん）の治療において使用するための、リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であって、上記リポソーム組成物は薬物を内包し、内水相が硫酸アンモニウムを含み、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上である、リポソーム組成物。
［Ｃ］ 医薬組成物の製造のための、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であって、上記リポソーム組成物は薬物を内包し、内水相が硫酸アンモニウムを含み、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上である、リポソーム組成物の使用。
本発明のリポソーム組成物および医薬組成物は、高いＡＵＣを示すことができる。
図１は、Ａ５４９皮下移植マウスモデルを用いた薬効試験における体重の測定結果を示す。 図２は、Ａ５４９皮下移植マウスモデルを用いた薬効試験における体重の測定結果を示す。 図３は、Ａ５４９皮下移植マウスモデルを用いた薬効試験における腫瘍体積の測定結果を示す。 図４は、Ａ５４９皮下移植マウスモデルを用いた薬効試験における腫瘍体積の測定結果を示す。 図５は、各コレステロール量に対するＡＵＣの値を示す。 図６は、リリース率へ与えるアンモニウムイオン依存性を測定した結果を示す。
本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。
本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する上記複数の物質の合計量を意味する。
「血中滞留性」とは、リポソーム組成物を投与した対象において、リポソームに封入された状態の薬物が血液中に存在する性質を意味する。
「リポソームの平均粒子径」とは、特に指定しない限り動的光散乱法を用いて測定されるキュムラント平均粒子径を意味する。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、濃厚系粒子アナライザーＦＰＡＲ－１０００（大塚電子社製）、ナノトラックＵＰＡ（日機装社製）およびナノサイザー（マルバーン社製）等が挙げられる。各メーカーの測定装置固有の変換式により、リポソームの体積平均粒子径や数平均粒子径を算出することも可能である。
１００ｎｍ付近の粒子を測定するには、静的光散乱法などでは、正確に粒子の分布を捉えることができず、動的光散乱法による測定が好ましい。
「不溶性微粒子」とは、静脈注射製剤など全身投与用の医薬品組成物における、ＰＭＤＡ、ＦＤＡ、ＥＭＥＡ等の規制当局が安全性および品質基準として設定する項目であり、例えば日本における日本薬局方＜６．０７＞注射剤の不溶性微粒子試験法において、第一法（光遮蔽粒子計数法）にて評価する場合、表示量が１００ｍＬ未満の製品の薬物バイアル１個に含まれる粒径が１０μｍ以上の不溶性微粒子は６０００個以下、粒径が２５μｍ以上の不溶性微粒子は６００個以下であることを求めている。また、第二法（顕微鏡粒子計数法）にて評価する場合、粒径が１０μｍ以上の不溶性微粒子は６０００個以下、粒径が２５μｍ以上の不溶性微粒子は６００個以下であることを求めている。
不溶性微粒子は、その粒子の成分によらず、粒子のサイズだけによって定義されるもので、例えば、リポソーム組成物において、リポソームそのものの凝集物であっても良いし、リポソーム内部から漏出した薬物成分の凝集および析出物であっても良いし、リポソーム外水相の成分の凝集および析出物であっても良い。特に本発明におけるトポテカンを内包したリポソームは、内包されたトポテカンがリポソーム外に漏出し、溶解度の低い分解物への分解を経て生成される析出物であることが、特許文献３などの記載により知られている。
不溶性微粒子を測定する方法として、光学的に検出する光遮蔽粒子計数法（パーティクルカウンター、例えば、ベックマン・コールター社のＨＩＡＣ ９７０３＋、パーティクルサイジングシステム社のアキュサイザーＡ２０００ＵＳＰが使用される）の他、顕微鏡での拡大像を目視で観察しカウントする顕微鏡粒子計数法が挙げられる。
リポソーム医薬組成物、特に注射製剤の場合は、日本薬局方＜６．０７＞注射剤の不溶性微粒子試験法に定める通り、使用時において医薬組成物に含まれる粒径が１０μｍを超える粒子が６０００個以下、粒径が２５μｍを超える粒子が６００個以下であることが好ましいとされる。
リポソーム医薬組成物の注射製剤においては、不溶性微粒子が生じる原因は、大部分が保管中に生じるリポソーム粒子成分の凝集・合一・分解に起因すると考えられるが、これに限定されるものではない。リポソームを構成する主な素材である脂質の量に応じて、不溶性微粒子が発生する傾向がある。例えば、脂質濃度２０ｍｍｏｌ／Ｌのリポソーム組成物２ｍＬを含む医薬組成物を考えた場合、脂質１μｍｏｌ当たり粒径が１０μｍを超える粒子が１５０個以下、粒径が２５μｍを超の粒子が１５個以下であると、日本薬局方＜６．０７＞注射剤の不溶性微粒子試験法に定める基準である、医薬組成物に含まれる粒径が１０μｍを超える粒子が６０００個以下、粒径が２５μｍを超える粒子が６００個以下を満たすことができる。
本発明のリポソーム組成物においても、５℃で１か月の保管後において脂質１μｍｏｌ当たり粒径が１０μｍを超える粒子が１５０個以下、粒径が２５μｍを超える粒子が１５個以下であることが好ましい。５℃で１か月の保管後において脂質１μｍｏｌ当たり粒径が１０μｍを超える粒子が７５個以下、粒径が２５μｍを超える粒子が７．５個以下であることがより好ましい。５℃で１か月の保管後において脂質１μｍｏｌ当たり粒径が１０μｍを超える粒子が２５個以下、粒径が２５μｍを超える粒子が２．５個以下であることがさらに好ましい。
また、粒径が１０μｍを超える粗大粒子は、保管時の経時劣化により増大する場合が多く、３カ月貯蔵後の状態でも上記個数を満たすことが好ましく、１年貯蔵後の状態でも上記個数を満たすことがより好ましい。
「対象」とは、疾病等の予防若しくは治療を必要とするヒト、マウス、サル、家畜等の哺乳動物であり、好ましくは、疾病等の予防若しくは治療を必要とするヒトである。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の第一の形態であるリポソーム組成物は、リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であり、薬物を内包し、内水相が硫酸アンモニウムを含み、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上である。
また、本発明の第二の形態であるリポソーム組成物は、リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含むリポソーム組成物であり、薬物を内包し、内水相がアンモニウム塩を含み、ジヒドロスフィンゴミエリンが炭素数１６と炭素数１８の長鎖アルキル基を有するジヒドロスフィンゴミエリンである。
本発明においては、リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を使用することによって、血中でのリポソームの滞留性を向上させている。さらに、内水相が硫酸アンモニウムを含むことにより、血中でのリポソームからの薬物の漏出を抑制し、ＡＵＣを向上させている。さらに、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上とすることにより、血中でのリポソームからの薬物の漏出をさらに抑制し、より高いＡＵＣを達成している。
上記の結果、冷蔵保管中においても、内水相から外水相への薬物の漏出を抑制することができ、中性条件においても不溶性微粒子の生成を抑制することができる。即ち、本発明のリポソーム組成物においては、外水相のｐＨを中性（ｐＨ７．４）付近に設定することができ、酸性条件下で加水分解する「親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン」を、血中滞留性向上のために使用することが可能になった。
（リポソーム）
リポソームとは、脂質を用いた脂質二重膜で形成される閉鎖小胞体であり、その閉鎖小胞の空間内に水相（内水相）を有する。内水相には、水等が含まれる。リポソームは通常、閉鎖小胞外の水溶液（外水相）に分散した状態で存在する。リポソームはシングルラメラ（単層ラメラまたはユニラメラとも呼ばれ、二重層膜が一重の構造である。）であっても、多層ラメラ（マルチラメラとも呼ばれ、タマネギ状の形状の多数の二重層膜の構造である。個々の層は水様の層で仕切られている。）であってもよいが、本発明では、医薬用途での安全性および安定性の観点から、シングルラメラのリポソームであることが好ましい。
リポソームは、薬物を内包することのできるリポソームであれば、その形態は特に限定されない。「内包」とは、リポソームに対して薬物が内水相および膜自体に含まれる形態をとることを意味する。例えば、膜で形成された閉鎖空間内に薬物を封入する形態、膜自体に内包する形態等が挙げられ、これらの組合せでもよい。
リポソームの平均粒子径は、一般的には１０ｎｍ～１０００ｎｍであり、２０ｎｍ～５００ｎｍが好ましく、３０～３００ｎｍがより好ましく、３０ｎｍ～２００ｎｍがさらに好ましく、１５０ｎｍ以下、例えば、３０ｎｍ～１５０ｎｍが更に一層好ましく、７０～１５０ｎｍが特に好ましい。
リポソームは球状またはそれに近い形態をとることが好ましい。
リポソームの脂質二重層を構成する成分は、脂質から選ばれる。脂質として、水溶性有機溶媒およびエステル系有機溶媒の混合溶媒に溶解するものを使用することができる。
本発明におけるリポソームは、リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含む。
リポソームとは、先述の通り脂質を用いた脂質二重膜で形成される閉鎖小胞体であり、一般的に脂質二重膜を形成する基材となる脂質としては二本のアシル鎖を有するリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、カルジオリピン等の天然もしくは合成のリン脂質、またはこれらに水素添加したもの（例えば、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ））等が挙げられる。
本発明においては、脂質二重膜を形成する基材となる脂質として、二本のアシル鎖を有するリン脂質、ジヒドロスフィンゴミエリンを用いる。ジヒドロスフィンゴミエリンを使用することにより、血中でのリポソームの滞留性を向上させることができる。
ジヒドロスフィンゴミエリンをリポソーム膜の基材として用いることで、そのリポソーム膜の隔壁性を向上させ、内包した薬物の漏出を防ぐことができる。これは、ジヒドロスフィンゴミエリンが有するアミド結合が、強い水素結合能を持ち、互いに強く相互作用することで強固で隔壁性の高い膜を形成できるためと推測する。また、本発明において同時に用いるコレステロールの水酸基とも強く相互作用し、さらに隔壁性の高い膜を作ることができる。これは、エステル結合を有するＨＳＰＣやレシチンなどの汎用されている脂質では達成し得ない機能になる。
また、アミド結合を有するが、アシル鎖に不飽和結合を有するスフィンゴミエリンに対して、全て飽和されたジヒドロスフィンゴミエリンはその融点が高く、形成される膜の運動性が低くなることから、スフィンゴミエリンに対しても、ジヒドロスフィンゴミエリンは、隔壁性の高い膜を作ることができると推測する。
ジヒドロスフィンゴミエリンは、一般的に分子内に２つの長鎖アルキル基を有しており、炭素数１６の長鎖アルキル基を２つ有するもの、炭素数１６と炭素数１８の長鎖アルキル基を有するもの、炭素数１６と炭素数２０～２４の長鎖アルキル基を有するものが挙げられる。
ジヒドロスフィンゴミエリンとしては、薬物のリポソームからの漏出防止の観点で、炭素数１６と炭素数１８の長鎖アルキル基を有する下記化合物を用いることが好ましい。これは、炭素数が多いほど、融点が高くなり隔壁性の高いリポソーム膜を作ることができるためである。
Figure 0007012124000001
ジヒドロスフィンゴミエリンとしては、例えば、天然物由来のスフィンゴミエリンを一般的な手法で還元することにより得られるジヒドロスフィンゴミエリンを用いてもよく、合成することにより得られるジヒドロスフィンゴミエリンを用いても良い。鶏卵など天然物由来のジヒドロスフィンゴミエリンは、一般的に炭素数１６の長鎖アルキル基を２つ有するものが大半を占めるため、炭素数１６と炭素数１８の長鎖アルキル基を有するジヒドロスフィンゴミエリンが純度高く得られる点で、化学合成により得られるものを使用した方が好ましい。
リポソーム膜の構成成分（リポソームを構成する全脂質）におけるジヒドロスフィンゴミエリンの比率は好ましくは３０～８０モル％であり、より好ましくは４０～７０モル％であり、さらに好ましくは５０～６０モル％である。
親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミンにおける親水性高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール類、ポリグリセリン類、ポリプロピレングリコール類、ポリビニルアルコール、スチレン－無水マレイン酸交互共重合体、ポリビニルピロリドン、合成ポリアミノ酸等が挙げられる。上記の親水性高分子は、それぞれ単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。
これらの中でも、組成物の血中滞留性の観点から、ポリエチレングリコール類、ポリグリセリン類およびポリプロピレングリコール類が好ましく、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリグリセリン（ＰＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）およびそれらの誘導体がより好ましい。
汎用性および血中滞留性の観点から、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびその誘導体がさらに好ましい。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の誘導体としては、メトキシポリエチレングリコールなどが挙げられるが、特に限定されない。
ポリエチレングリコール類の分子量は、特に限定されないが、５００～１０，０００ダルトンであり、好ましくは１，０００～７，０００ダルトンであり、より好ましくは２，０００～５，０００ダルトンである。
ジアシルホスファチジルエタノールアミンにおけるアシルの炭素数は１６以上が好ましく、例えば炭素数１６以上３０以下が好ましく、炭素数１６以上２４以下がより好ましく、炭素数２０がさらに好ましい。
ポリエチレングリコール類で修飾されたジアシルホスファチジルエタノールアミンとしては、例えば、１、２－ジステアロイル－３－ホスファチジルエタノールアミン－ＰＥＧ２０００（日本油脂社製）、１，２－ジステアロイル－３－ホスファチジルエタノールアミン－ＰＥＧ５０００（日本油脂社製）およびジステアロイルグリセロール－ＰＥＧ２０００（日本油脂社製）等の１，２－ジステアロイル－３－ホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコールが挙げられる。
リポソーム膜の構成成分（リポソームを構成する全脂質）において、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミンの比率は、好ましくは１～１５モル％であり、より好ましくは２～１０モル％である。
コレステロール類として、シクロペンタヒドロフェナントレンを基本骨格とし、その一部あるいはすべての炭素が水素化されているコレステロールおよびその誘導体を挙げることができる。例えば、コレステロールが好ましい。リポソームの平均粒子径を１００ｎｍ以下に微細化していくと、脂質膜の曲率が高くなることがある。リポソームにおいて配列した膜のひずみも大きくなる。脂質による膜のひずみを埋める（膜安定化効果）ために、コレステロール等を添加することが有効である。
リポソームにおいて、コレステロールの添加は、リポソームの膜のすきまを埋めること等により、リポソームの膜の流動性を下げることが期待される。
リポソーム膜の構成成分（リポソームを構成する脂質）におけるコレステロールの比率は、好ましくは２０モル％～５０モル％であり、より好ましくは３０モル％～４５モル％であり、さらに好ましくは３５～４３モル％である。
リポソームには、上記の成分の他に、血中滞留性の改善のために親水性高分子等、膜構造の安定剤として脂肪酸またはジアセチルホスフェート等、抗酸化剤としてα－トコフェロール等を加えてもよい。本発明では、医薬用途において静脈注射用途での使用が認められていない分散助剤等の添加剤、例えば、界面活性剤等を用いないことが好ましい。
（薬物）
本発明のリポソーム組成物は、薬物を内包する。
薬物の種類は特に限定されないが、以下に例示する抗がん剤を使用することができる。具体的には、ドキソルビシン、ダウノルビシンおよびエピルビシンなどのアントラサイクリン系抗がん剤；
シスプラチンおよびオキサリプラチンなどのシスプラチン系抗がん剤；
パクリタキセルおよびドセタキセルなどのタキサン系抗がん剤；
ビンクリスチンおよびビンブラスチンなどのビンカアルカロイド系抗がん剤；
ブレオマイシンなどのブレオマイシン系抗がん剤；
シロリムスなどのシロリムス系抗がん剤；
トポテカン（ノギテカンとも言う）、イリノテカン、カレニテシン（登録商標）（ＢＮＰ１３５０とも言う）、エキサテカン 、ルートテカン、ギマテカン（ＳＴ１４８１とも言う）およびベロテカン（ＣＫＤ６０２とも言う）などのカンプトテシン系抗がん剤；
ビンクリスチンなどのビンカアルカロイド系抗がん剤；
メトトレキセート、フルオロウラシル、ゲムシタビン、シタラビンおよびペメトレキセドなどの代謝拮抗剤；ならびに
イマチニブ（グリベック（登録商標））、エベロリムス（アフィニトール（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））、スニチニブ（スーテント（登録商標））、ソラフェニブ（ネクサバール（登録商標））、ダサチニブ（スプリセル（登録商標））、タミバロテン（アムノレイク（登録商標））、トレチノイン（ベサノイド（登録商標））、ボルテゾミブ（ベルケイド（登録商標））およびラパチニブ（タイケルブ（登録商標））などの分子標的薬が挙げられる。
上記の中でもトポテカン（ノギテカンとも言う）、ドキソルビシン、イリノテカンまたはスニチニブが好ましく、トポテカンがより好ましい。
薬物は、塩の形態として使用してもよい。
薬物の塩としては、通常知られているアミノ基などの塩基性基、ヒドロキシル基およびカルボキシル基などの酸性基における塩を挙げることができる。
塩基性基における塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、ホウ酸、硝酸および硫酸などの鉱酸との塩；ギ酸、酢酸、乳酸、クエン酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、アスパラギン酸、トリクロロ酢酸およびトリフルオロ酢酸などの有機カルボン酸との塩；ならびにメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、メシチレンスルホン酸およびナフタレンスルホン酸などのスルホン酸との塩が挙げられる。
酸性基における塩としては、例えば、ナトリウムおよびカリウムなどのアルカリ金属との塩；カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩；アンモニウム塩；ならびにトリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ、Ｎ－ジメチルアニリン、Ｎ－メチルピペリジン、Ｎ－メチルモルホリン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ－ベンジル－β－フェネチルアミン、１－エフェナミンおよびＮ、Ｎ'－ジベンジルエチレンジアミンなどの含窒素有機塩基との塩などが挙げられる。
リポソーム組成物における薬物の含有量は特に限定されないが、リポソーム組成物に対して０．０２５～２０ｍｇ／ｍｌであることが好ましく、０．２５～１０ｍｇ／ｍｌであることがより好ましい。
リポソーム膜を形成する脂質に対するリポソーム内包された薬物量は、リポソームからの放出速度、リポソーム内部の浸透圧や沈殿した薬物によるリポソーム形状の観点から、モル比で０．１～１．５が好ましく、０．２～０．３がより好ましい。
脂質に対する薬物量のモル比が低すぎる場合、単位薬物量に対するリポソーム膜の面積が大きくなることで薬物のリポソームからの放出速度が大きくなり、血中滞留性を向上する機能が損なわれる。一方で、脂質に対する薬物量のモル比が高すぎる場合は、リポソーム内部の浸透圧が薬物の溶解量が増加することで上昇しリポソームが破壊される、または薬物がリポソーム内部で沈殿する場合は沈殿した固形物が大きく成長してリポソーム形状が変形することになる。
（内水相における硫酸アンモニウム）
本発明におけるリポソームの内水相は、硫酸アンモニウムを含む。また、本発明の第一の形態であるリポソーム組成物においては、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比は０．３６以上であり、好ましくは０．４以上である。全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比は、より好ましくは０．４以上１．８以下であり、さらに好ましくは０．６以上１．８以下である。全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比を上記の通りに設定することにより、血中でのリポソームからの薬物の漏出を抑制することができる。全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が低すぎると、薬物の硫酸塩による固形物の形成が不完全となり、リポソーム内でリポソーム膜の透過性が高くなる溶解状態の薬物の濃度が高まり、薬物がリポソームから漏出し易くなり、血中滞留性向上の効果を損なう。また、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が高すぎると、リポソーム内部の浸透圧が高くなり、リポソーム構造の破壊を招くため、薬物がリポソームから漏出し易くなり、血中滞留性向上の効果を損なう。
また、本発明においてリポソームの内水相に含まれる硫酸イオンのリポソーム組成物全体の硫酸イオンに対する比率（硫酸イオンの内水相率）が、少なくとも８０％であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、同時に、リポソームの内水相に含まれる薬物のリポソーム組成物全体の薬物に対する比率（薬物の内水相率）が、少なくとも８０％であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましい。
リポソーム中の薬物濃度は、例えば、液体クロマトグラフィー／紫外可視吸光度検出法により測定することができる。また、リポソームの内水相の硫酸イオン濃度は、例えば、イオンクロマトグラフィにより測定することができる。
（外水相のｐＨ）
本発明のリポソーム組成物は、薬物を内包するリポソームと、上記リポソームを分散する水性溶媒（外水相）とを含むことができる。外水相のｐＨは、中性であることが好ましく、具体的にｐＨ５．５～８．５程度であることが好ましい。
薬物の漏出を極度に抑制し過ぎると、患部、特に腫瘍部での薬物の漏出をも抑制し、期待するほどの薬効が得られない場合がある。
本発明のリポソーム組成物は、血中での薬剤漏出を抑制し、十分な量の薬物を腫瘍部に送達させ、さらに腫瘍部では速やかに薬物を放出する驚くべき機構を兼ね備えている。
腫瘍部においては、血中などその他臓器に比べてアンモニウム濃度が高いという性質があり（引用論文：Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and medicien, 11(2015) 1841-1850）、本発明のリポソーム組成物は、腫瘍のようにグルタミン分解が亢進しアンモウム濃度が高い（５ｍｍｏｌ／Ｌ）環境で、薬物のリリースが非常に増大する。
本発明のリポソーム組成物は、アンモニウム濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌ以下の血漿におけるリポソームからの薬物のリリース速度が、３７℃において２０％／２４時間以下であり、アンモニウム濃度が４～６ｍｍｏｌ／Ｌの血漿におけるリポソームからの薬物のリリース速度が６０％以上であり、より好ましくは、アンモニウム濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌ以下の血漿におけるリポソームからの薬物のリリース速度が、３７℃において１５％／２４時間以下であり、アンモニウム濃度が４～６ｍｍｏｌ／Ｌの血漿におけるリポソームからの薬物のリリース速度が７０％以上である。
（リポソーム組成物の製造方法）
本発明のリポソーム組成物の製造方法は、特に限定されないが、一例として、
（ａ）油相の調製；
（ｂ）水相の調製；
（ｃ）乳化によるリポソーム粒子形成；
（ｄ）エクストルーダーによる整粒；
（ｅ）透析によるリポソーム外水相液の置換；
（ｆ）リモートローディングによる薬物のリポソーム粒子への内包；および
（ｇ）透析による外水相薬物の除去：
の工程により製造することができる。（ｄ）エクストルーダーによる整粒は、行ってもよいし、行わなくてもよい。
＜（ａ）油相の調製＞
（ａ）油相の調製においては、リポソームを構成する各成分（親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類）と有機溶媒とを混合し、混合物を加温して上記成分を溶解することにより油相を製造することができる。
油相において使用する有機溶媒は特に限定されないが、例えば、水と任意に混じりあう水溶性有機溶媒を用いることができる。
水溶性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、イソブタノールおよびｔ－ブタノール等のアルコール類、グリセリン、エチレングリコールおよびプロピレングリコール等のグリコール類、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール類等が挙げられる。これらのなかでも、アルコール類が好ましい。アルコール類としては、エタノール、メタノール、２－プロパノールおよびｔ－ブタノールから選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、エタノール、２－プロパノールおよびｔ－ブタノールから選ばれる少なくとも１種であることがより好ましく、エタノールであることがさらに好ましい。
リポソームを構成する各成分の濃度は、特に限定されず、適宜調整することが可能である。
＜（ｂ）水相の調製＞
水相としては、水（蒸留水、注射用水等）、生理食塩水、各種緩衝液または糖類（スクロースなど）の水溶液およびこれらの混合物（水性溶媒）を使用することができる。本発明において、後述するリモートローディングによって薬物をリポソーム粒子へ内包させる場合には、水相として硫酸アンモニウム水溶液を使用することが好ましい。
緩衝液としては、有機系、無機系に限定されることはないが、体液に近い水素イオン濃度付近に緩衝作用を有する緩衝液が好適に用いられ、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液およびグッドバッファー等が挙げられる。リポソームの内水相は、リポソームを製造する際に、リポソームを分散する水溶液であってもよいし、新たに添加される、水、生理食塩水、各種緩衝液または糖類の水溶液およびこれらの混合物であってもよい。外水相または内水相として用いる水は、不純物（埃、化学物質等）を含まないことが好ましい。
生理食塩水とは、人体と等張になるように調整された無機塩溶液を意味し、さらに緩衝機能を持っていてもよい。生理食塩水としては、塩化ナトリウムを０．９ｗ／ｖ％（質量／体積パーセント）含有する食塩水、ＰＢＳおよびトリス緩衝生理食塩水等が挙げられる。
本発明において、水相とは、外水相および内水相の両方を包含する。
本発明における外水相とは、リポソームを分散する水溶液を意味する。例えば注射剤の場合においては、バイアル瓶またはプレフィルドシリンジ包装されて保管されたリポソームの分散液のリポソームの外側を占める溶液が外水相となる。また、添付された分散用液またはその他溶解液により投与時に用時分散した液についても同様に、リポソームの分散液のリポソームの外側を占める溶液が外水相となる。
本発明における内水相とは、リポソームの脂質二重膜を隔てた閉鎖小胞内の水相を意味する。
＜（ｃ）乳化によるリポソーム粒子形成＞
乳化工程では、油相と水相とを混合して脂質を含む水溶液を攪拌して乳化することができる。脂質が有機溶媒に溶解している油相および水相を混合し撹拌し、乳化することで、油相および水相がＯ／Ｗ型（水中油型）に乳化した乳化液が調製される。混合後、油相由来の有機溶媒の一部または全部を蒸発によって除去することにより、リポソームが形成される。または、油相中の有機溶媒の一部または全部が撹拌・乳化の過程で蒸発して、リポソームが形成される。
撹拌する方法としては、粒子微細化のために、超音波または機械的せん断力が用いられる。また、粒子径の均一化のためには、一定の孔径のフィルターを通すエクストルーダー処理またはマイクロフルイダイザー処理を行うことができる。エクストルーダー等を用いれば、副次的に形成された多胞リポソームをばらして単胞リポソームにすることができる。
乳化工程は、乳化する工程であれば限定されることはないが、好ましくは高せん断をかけ、有機溶媒を含む乳化工程で微粒子化する工程である。高せん断は、乳化機の撹拌羽根の周速で定義され、５ｍ／ｓ～３２ｍ／ｓが好ましく、特に２０ｍ／ｓ～３０ｍ／ｓが好ましい。必要に応じて、乳化工程で用いた有機溶媒を蒸発させる（脱溶媒する）ことでリポソームを形成することができる。
リポソームを製造する際の乳化工程の液温は、適宜調整することが可能であるが、油相と水相との混合時の液温を使用する脂質の相転移温度以上とすることが好ましく、例えば、相転移温度が３５～４０℃の脂質を使用する場合、３５℃～７０℃とすることが好ましい。
乳化工程においては、リポソームを含む水溶液から有機溶媒と水を蒸発させてもよい。ここで言う蒸発とは、油相由来の有機溶媒と水相由来の水の一部または全部を蒸発工程として強制的に除去してもよいし、油相由来の有機溶媒と水相由来の水の一部または全部が撹拌・乳化の過程で自然に蒸発するものでもよい。
蒸発の方法は、特に限定されないが、例えば、有機溶媒と水を加熱することにより蒸発させる工程、乳化後に静置または緩やかな撹拌を継続する工程、および真空脱気を行う工程の少なくとも一つを行えばよい。
＜（ｄ）エクストルーダーによる整粒＞
得られたリポソームは、透析法、ろ過法またはエクストルージョン処理等を用いて粒径を均一にすることができる。
エクストルージョン処理とは、細孔を有するフィルターにリポソームを通過させることで、物理的なせん断力を施し、微粒化する工程を意味する。リポソームを通過させる際、リポソーム分散液およびフィルターを、リポソームを構成する膜の相転移温度以上の温度に保温することで、速やかに微粒化することができる。
なお、エクストルーダーによる整粒は行ってもよいし、行わなくてもよい。
＜（ｅ）透析によるリポソーム外水相液の置換＞
本発明において、リモートローディングによって薬物をリポソーム粒子へ内包させる場合には、透析によりリポソーム外水相液を置換してもよい。透析液として、０．０５～５質量％のＮａＣｌ水溶液を使用することができるが、特に限定されない。上記した透析液を用いて、リポソーム液を透析することにより、外水相に存在する硫酸アンモニウムを除去し、透析液で外水相を置換したリポソームを得ることができる。
＜（ｆ）リモートローディング法による薬物のリポソーム粒子への内包＞
本発明においては、リモートローディング法によって薬物をリポソーム粒子へ内包させることが好ましい。
本発明においてリモートローディング法とは、薬物が内包されていない空リポソームを製造し、リポソーム外液に薬物を加えることによりリポソームに薬物を導入する方法を意味する。リモートローディングの方法については、特に限定されないが、アンモニウム塩を用いた方法が好ましく、硫酸アンモニウムを用いた方法がより好ましい。
リモートローディング法では、外液に加えられた薬物が、能動的にリポソームへと移行し、リポソームへと取り込まれる。このドライビングフォースとしては、溶解度勾配、イオン勾配、ｐＨ勾配等が用いられている。例えば、リポソーム膜を隔てて形成されるイオン勾配を用いて薬物をリポソーム内部に導入する方法がある。例えば、Ｎａ+／Ｋ+濃度勾配を利用してリモートローディング法により予め形成されているリポソーム中に薬物を添加する技術がある。
イオン勾配の中でもプロトン濃度勾配が一般的に用いられ、例えば、リポソーム膜の内側（内水相）ｐＨが、外側（外水相）ｐＨよりも低いｐＨ勾配をもつ態様が挙げられる。ｐＨ勾配は、具体的に、アンモニウムイオン勾配の濃度勾配等により形成することができる。
＜（ｇ）透析による外水相薬物の除去＞
薬物を内包したリポソーム液は、リポソームに含まれなかった薬物を除去するために、透析を行ってもよい。例えば、所定濃度のスクロース／ヒスチジンバッファーを透析液として用いて、薬物を内包したリポソーム液に対して、透析を行うことにより、外水相に存在する薬物を除去し、透析液で外水相を置換したリポソーム組成物を得ることができる。
＜無菌ろ過＞
上記で得られたリポソーム組成物は、無菌ろ過を行うことが好ましい。ろ過の方法としては、中空糸膜、逆浸透膜またはメンブレンフィルター等を用いて、リポソームを含む水溶液から不要な物を除去することができる。本発明では、滅菌できる孔径をもつフィルター（好ましくは０．２μｍのろ過滅菌フィルター）によってろ過することが好ましい。
リポソームの変形による平均粒子径への影響を防ぐために、無菌ろ過工程および後述する無菌充填工程は、リポソームを構成する脂質の相転移温度以下で行うことが好ましい。例えば、脂質の相転移温度が５０℃付近である場合、０～４０℃程度が好ましく、より具体的には５～３０℃程度で製造されることが好ましい。
＜無菌充填＞
無菌ろ過の後に得られたリポソーム組成物は、医療用途として無菌充填することが好ましい。無菌充填の方法は公知のものが適用できる。容器に無菌的に充填することで医療用として好適なリポソーム組成物が調製できる。
（医薬組成物）
本発明のリポソーム組成物は、投与経路に関連して、医薬的に許容される等張化剤、安定化剤、酸化防止剤、およびｐＨ調整剤の少なくとも一種を含んでもよい。即ち、本発明のリポソーム組成物は、医薬組成物として提供することができる。
等張化剤としては、特に限定されないが、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウムのような無機塩類、グリセロール、マンニトール、ソルビトールのようなポリオール類、グルコース、フルクトース、ラクトース、またはスクロースのような糖類が挙げられる。
安定化剤としては、特に限定されないが、例えば、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、またはスロースのような糖類が挙げられる。
酸化防止剤としては、特に限定されないが、例えば、アスコルビン酸、尿酸、トコフェロール同族体（例えば、ビタミンＥ、トコフェロールα、β、γ、δの４つの異性体）システイン、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）等が挙げられる。安定化剤および酸化防止剤は、それぞれ単独でまたは２種以上組み合わせて使用することができる。
ｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウム、クエン酸、酢酸、トリエタノールアミン、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム等が挙げられる。
本発明のリポソーム組成物は、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、塩化ナトリウム、糖類、生体内分解性ポリマー、無血清培地、医薬添加物として許容される添加物を含有してもよい。
本発明のリポソーム組成物を充填する容器は、特に限定されないが、酸素透過性が低い材質であることが好ましい。例えば、プラスチック容器、ガラス容器、アルミニウム箔、アルミ蒸着フィルム、酸化アルミ蒸着フィルム、酸化珪素蒸着フィルム、ポリビニルアルコール、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリ塩化ビニリデン、等をガスバリア層として有するラミネートフィルムによるバック等が挙げられ、必要に応じて、着色ガラス、アルミニウム箔やアルミ蒸着フィルム等を使用したバック等を採用することで遮光することもできる。
リポソーム組成物を充填する容器において、容器内の空間部に存在する酸素による酸化を防ぐために、容器空間部および薬液中のガスを窒素等の不活性ガスで置換することが好ましい。例えば、注射液を窒素バブリングし、容器への充填を窒素雰囲気下で行うことが挙げられる。
本発明の医薬組成物の投与経路としては、非経口的投与が好ましい。例えば、点滴等の静脈内注射（静注）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、眼内注射および髄腔内注射を挙げることができる。投与方法としては、シリンジまたは点滴による投与が挙げられる。
本発明の医薬組成物の投与量および投与回数は、薬物の種類、患者の状態などに応じて適宜設定すればよく、有効成分である薬物質量として、１日あたり、一般的には０．０１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの範囲で設定することができる。有効成分である薬物質量として、１回あたり、２ｍｇ～１０ｍｇの範囲で設定することができる。ただし、これらの投与量に限定されるものではない。
本発明の医薬組成物は、好ましくは抗がん剤として使用することができる。
本発明の医薬組成物の適用対象であるがんの種類は、特に限定されないが、例えば、肺がん（特に、小細胞肺がん）、卵巣がん、小児固形腫瘍、子宮頸がん、乳がん、前立腺がん、子宮体がん、胃（胃腺）がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、頚部扁平上皮がん、食道がん、膀胱がん、メラノーマ、大腸がん、腎細胞がん、非ホジキンリンパ腫、尿路上皮がん、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、成人Ｔ細胞白血病、骨髄転移がん、肉腫、軟部組織腫、瘍慢性骨髄単球性白血病、ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ等が挙げられる。
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかし、本発明は実施例に限定されるものではない。
ＳＭは、スフィンゴミエリン（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）（ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＭ－１０、日油製）を示す。
鶏卵由来ＤＨＳＭは、鶏卵由来のＳＭを水素添加することで得たジヒドロスフィンゴミエリン（Ｄｉｈｙｄｒｏｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）（ＣＯＡＴＳＯＭＥ ＮＭ－１０（日油製）に対し水素添加した合成品）を示す。この鶏卵由来ＤＨＳＭは、炭素数１６のアルキル鎖の２つ有したものが、全体の７０～８０％であり、残りはアルキル鎖長の異なるＤＨＳＭを含む混合物である。
全合成ＤＨＳＭは、炭素数１６と炭素数１８の長鎖アルキル基を有する下記化合物が９８％以上含むように化学合成により作製されたジヒドロスフィンゴミエリン（Ｄｉｈｙｄｒｏｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）を示す。
Figure 0007012124000002
ＰＥＧリン脂質（表中ではＰＥＧと表記）としては、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＤＳＰＥ－０２０ＣＮ、日油製（以下、ＤＳＰＥ－ＰＥＧとする）を使用した。
コレステロール（表中ではＣｈｏｌと表記）としては、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ＨＰ(日本精化社製)を使用した。
＜比較例１～１０＞
（ａ）油相の調製
比較例１については、ＳＭ、ＰＥＧリン脂質、コレステロールをそれぞれ１１．５２ｇ、４．３２ｇ、４．３２ｇ秤量した。比較例２～１０については、表１に記載の比率になるように、ＳＭまたは鶏卵由来ＤＨＳＭ、ＰＥＧリン脂質、コレステロールの量を変更した。この脂質を３８１ｍＬのエタノールと混合し、６５℃で溶解し油相とした。
（ｂ１）水相１の調製
硫酸アンモニウム２５．２ｇを水１１１８．５gに溶解し、水相１を調製した。
（ｂ２）水相２の調製
硫酸アンモニウム５．０４ｇを水２２３．７gに溶解し、水相２を調製した。
（ｃ）乳化によるリポソーム粒子形成
（ｂ１）で調製した水相１を６５℃に加温し、（ａ）で調製した油相全量を添加した後、精密乳化分散機にて、周速２６ｍ／ｓにて６０分間混合した。つづいて、室温の水相２を添加した後、６５℃で加温しながら周速０．１ｍ／ｓで攪拌を続けることで有機溶媒と水を蒸発させ、液が６００ｍＬまで濃縮された時点で加温と攪拌を止め、蒸発を停止した。
（ｅ）透析によるリポソーム外水相液の置換
透析液として３．１５質量％のＮａＣｌ水溶液を用いた。この透析液を用いて、（ｃ）で得た液に対して、室温にてクロスフローフィルトレーションを用い、外水相に存在する硫酸アンモニウムを除去し、透析液で外水相を置換したリポソームを得た。
（ｆ）リモートローディングによるトポテカンのリポソーム粒子への内包
トポテカン塩酸塩（Ｂｉｏｃｏｍｐｏｕｎｄｓ社製）に注射用水を加え、５ ｍｇ／ｍ
Ｌとした。さらに、液をよく攪拌しながら８ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液を添加し、ｐＨを約３に調整してトポテカンを溶解させた。このトポテカン溶液にリポソームを１／１の容積比で加えた後、６０℃で６０分間加温した。
（ｇ）透析による外水相トポテカンの除去
透析液として９．４質量％スクロース、１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジンからなるスクロース／ヒスチジンバッファーを調製した。この透析液を用いて、（ｆ）で得た液に対して、室温にてクロスフローフィルトレーションを用い、外水相に存在するトポテカンを除去し、透析液で外水相を置換したトポテカン含有リポソームを得た。
＜比較例１１および１２＞
（ａ）油相の調製
比較例１１については、鶏卵由来ＤＨＳＭ、およびコレステロールをそれぞれ、０．５１７ｇおよび０．２３３ｇ秤量した。比較例１２については、表１に記載の比率になるように、ＳＭ、およびコレステロールの量を変更した。リポソームをＤｉＩ（１，１’－ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ－３，３，３’，３’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ Ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ）で標識するため、全脂質に対して０．２ｍｏｌ％となる分量のＤｉＩを秤量し、エタノールに溶解させた。このＤｉＩエタノール溶液にエタノールを加え、全量で１.５ｍＬとし、秤量した脂質とこの有機溶媒を混合し、６５℃に加温して脂質を溶解し油相とした。
（ｂ）水相の調製
硫酸アンモニウム０．９ｇおよびスクロース２．１６ｇを水１３．５ｇに溶解し、水相を調製した。
（ｃ）油相と水相混合によるリポソーム粒子形成
（ｂ）で調製した水相を６５℃に加温し、マグネチックスターラーで攪拌する（３０００ｒｐｍ）。（ａ）で調製した油相全量をホットプレートで６５℃に加温し、油相全量をシリンジで吸って５分間ホットプレートで加温する。加温してある水相に、油相を３０秒かけて滴下する。
（ｄ）エクストルーダーによる整粒
７０℃の加温下でエクストルーダー（Ｍｉｎｉ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）を用い、（ｃ）で得た液をフィルターに順次通過させることで整粒した。
（ｅ）透析によるリポソーム外水相液の置換
透析液として０．０９質量％のＮａＣｌ水溶液を用いた。この透析液を用いて、（ｃ）または（ｄ）で得た液に対して、室温にて透析を行い、外水相に存在する硫酸アンモニウムを除去し、透析液で外水相を置換したリポソームを得た。
（ｆ）リモートローディングによるトポテカンのリポソーム粒子への内包
トポテカン塩酸塩（Ｂｉｏｃｏｍｐｏｕｎｄｓ社製）に注射用水を加え、５ｍｇ／ｍＬとした。さらに、液をよく攪拌しながら８ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液を添加し、ｐＨを約３に調整してトポテカンを溶解させた。このトポテカン溶液にリポソームを１／１の容積比で加えた後、６０℃で１２０分間加温した。
（ｇ）透析による外水相トポテカンの除去
透析液として９．４質量％スクロースおよび１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジンからなるスクロース／ヒスチジンバッファーを調製した。この透析液を用いて、（ｆ）で得た液に対して、室温にて透析を行い、外水相に存在するトポテカンを除去し、透析液で外水相を置換したトポテカン含有リポソームを得た。
＜実施例１～８＞
（ａ）油相の調製
実施例１については、鶏卵由来ＤＨＳＭ、ＰＥＧリン脂質（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＤＳＰＥ－０２０ＣＮ、日油製、以下、ＤＳＰＥ－ＰＥＧとする）、およびコレステロールをそれぞれ１１．５２ｇ、４．３２ｇ、および４．３２ｇ秤量した。実施例２～８については、表２に記載の比率になるように、ＤＨＳＭ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、およびコレステロールの量を変更した。この脂質を３８１ｍＬのエタノールと混合し、６５℃で溶解し油相とした。
（ｂ１）水相１の調製
硫酸アンモニウム２５．２ｇを水１１１８．５gに溶解し、水相１を調製した。
（ｂ２）水相２の調製
硫酸アンモニウム５．０４ｇを水２２３．７gに溶解し、水相２を調製した。
（ｃ）乳化によるリポソーム粒子形成
（ｂ１）で調製した水相１を６５℃に加温し、（ａ）で調製した油相全量を添加した後、精密乳化分散機にて、周速２６ｍ／ｓにて６０分間混合した。つづいて、室温の水相２を添加した後、６５℃で加温しながら周速０．１ｍ／ｓで攪拌を続けることで有機溶媒と水を蒸発させ、液が６００ｍＬまで濃縮された時点で加温と攪拌を止め、蒸発を停止した。
（ｅ）透析によるリポソーム外水相液の置換
透析液として３．１５質量％のＮａＣｌ水溶液を用いた。この透析液を用いて、（ｃ）で得た液に対して、室温にてクロスフローフィルトレーションを用い、外水相に存在する硫酸アンモニウムを除去し、透析液で外水相を置換したリポソームを得た。
（ｆ）リモートローディングによるトポテカンのリポソーム粒子への内包
トポテカン塩酸塩（Ｂｉｏｃｏｍｐｏｕｎｄｓ社製）に注射用水を加え、５ｍｇ／ｍＬとした。さらに、液をよく攪拌しながら８ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液を添加し、ｐＨを約３に調整してトポテカンを溶解させた。このトポテカン溶液にリポソームを１／１の容積比で加えた後、６０℃で６０分間加温した。
（ｇ）透析による外水相トポテカンの除去
透析液として９．４質量％スクロース、１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジンからなるスクロース／ヒスチジンバッファーを調製した。この透析液を用いて、（ｆ）で得た液に対して、室温にてクロスフローフィルトレーションを用い、外水相に存在するトポテカンを除去し、透析液で外水相を置換したトポテカン含有リポソームを得た。
＜実施例９および１０＞
（ａ）油相の調製
実施例９については、鶏卵由来ＤＨＳＭ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、コレステロールをそれぞれ０．４１２ｇ、０．１５３ｇ、および０．１５３ｇ秤量した。実施例１０については、表２に記載の比率になるように、鶏卵由来ＤＨＳＭ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、およびコレステロールの量を変更した。リポソームをＤｉＩで標識するため、全脂質に対して０．２ｍｏｌ％となる分量のＤｉＩを秤量し、エタノールに溶解させた。このＤｉＩエタノール溶液にエタノールを加え、全量で１１．２５ｍＬとし、さらに酢酸エチル３．７５ｍＬを加えた。秤量した脂質とこの有機溶媒を混合し、６０℃に加温して脂質を溶解し油相とした。
（ｂ）水相の調製
硫酸アンモニウム０．９ｇを水４０ｇに溶解し、水相を調製した。
（ｃ）乳化によるリポソーム粒子形成
（ｂ）で調製した水相を７０℃に加温し、（ａ）で調製した油相全量を添加した後（容積比：水相／油相＝８／３）、乳化機（エクセルオートホモジナイザーＥＤ－３、日本精機製作所製）にて、３０００ｒｐｍ（ｒｏｔａｔｉｏｎ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ：１／６０ｓ-1）にて３０分間混合した。つづいて、６５℃で加温しながら３００ｒｐｍで攪拌を続けることで有機溶媒と水を蒸発させ、液が１５ｇまで濃縮された時点で加温と攪拌を止め、蒸発を停止した。
（ｄ）エクストルーダーによる整粒
７０℃の加温下でエクストルーダー（Ｍｉｎｉ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）を用い、（ｃ）で得た液をフィルターに順次通過させることで整粒した。
（ｅ）透析によるリポソーム外水相液の置換
透析液として０．０９質量％のＮａＣｌ水溶液を用いた。この透析液を用いて、（ｃ）または（ｄ）で得た液に対して、室温にて透析を行い、外水相に存在する硫酸アンモニウムを除去し、透析液で外水相を置換したリポソームを得た。
（ｆ）リモートローディングによるトポテカンのリポソーム粒子への内包
トポテカン塩酸塩（Ｂｉｏｃｏｍｐｏｕｎｄｓ社製）に注射用水を加え、５ ｍｇ／ｍ
Ｌとした。さらに、液をよく攪拌しながら８ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液を添加し、ｐＨを約３に調整してトポテカンを溶解させた。このトポテカン溶液にリポソームを１／１の容積比で加えた後、６０℃で１２０分間加温した。
（ｇ）透析による外水相トポテカンの除去
透析液として９．４質量％スクロース、１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジンからなるスクロース／ヒスチジンバッファーを調製した。この透析液を用いて、（ｆ）で得た液に対して、室温にて透析を行い、外水相に存在するトポテカンを除去し、透析液で外水相を置換したトポテカン含有リポソームを得た。
［物性測定および評価］
＜平均粒子径＞
本発明において、平均粒子径とは、動的光散乱法により測定されるキュムラント平均粒子径を意味する。表に記載の各実施例および比較例の平均粒子径は、オートサンプラー付き濃厚系粒径アナライザーＦＰＡＲ－１０００ＡＳ（大塚電子社製）により動的光散乱法で測定したキュムラント平均粒子径である。測定結果を表１および表２に示す。
＜トポテカン濃度測定＞
ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）装置 Ｎｅｘｅｒａ－ｉ ＬＣ－２０４０Ｃ（島津社製）にて、サンプルを測定し、トポテカン濃度を定量した結果を表１および表２に示す。具体的な測定方法は、次のとおりである。
表１及び２のリポソームにおいては、リポソームの内水相に含まれる薬物のリポソーム組成物全体の薬物に対する比率は、比較例１０を除くと少なくとも９５％であった。比較例１０は５９％であった。
リポソーム製剤中のトポテカン量の測定
調製したリポソーム液をメタノールに溶かしフィルターろ過した試料溶液、およびトポテカン塩酸塩を希釈調製した検量線標準溶液を用いて、液体クロマトグラフィー／紫外可視吸光度検出法により測定した。
内水相トポテカン濃度は、全水相トポテカン濃度から外水相トポテカン濃度を引いて算出した。
各水相のトポテカン濃度は以下のように測定した。
（全水相トポテカン濃度）
リポソーム分散液を５０μＬ測り取り、メタノール９５０μＬを加え、ボルテックスで1分間攪拌した。その液を１００μＬを測り取り、ミリQ水を９００μＬを加え、ボルテックスを1分間攪拌し、ＨＰＬＣ分析用サンプルとした。
（外水相トポテカン濃度）
リポソーム分散液を５０μＬ測り取り、９．４ｗｔ％スクロース/１０ｍＭヒスチジン水溶液４５０μＬを加え希釈する。その希釈液１００μＬにＰＢＳ ２００μＬ添加し、転倒混和した。この分散液を超遠心分離（２００，０００ ｇ, ２０℃, ６０分間）し、上清をＨＰＬＣ分析サンプルとした。超遠心分離機は、日立製ｈｉｍａｃ ＣＰ８０ＷＸを使用した。
ａ）検量線標準液の調製
トポテカン塩酸塩約２０ｍｇを量り、２０ｍＬの１０質量％メタノール水溶液に溶かした。この液にミリＱ水を加えて、トポテカン塩酸濃度０．１、１．０、５．０、１０．０、２０．０、５０．０、または１００．０ｐｐｍの溶液を調製し、検量線標準液とした。ｂ）試料溶液の調製
（１）試料（リポソーム製剤溶液）約５０μＬをマイクロマン（ＭＩＣＲＯＭＡＮ（登録商標））で量りとり、これにマイクロマンで量りとった約９５０μＬのメタノールを加えた。このとき、約１分間振とうし、溶液が透明になることを目視で確認した。
（２）上記（１）の溶液１００μＬをマイクロマンで量りとり、マイクロピペットで量りとった約９００μＬのミリＱ水を加えた。この液を約１分間振とうした後、約１分間超音波処理をし、さらに約１０秒間振とうした。
（３）上記（２）の溶液をＤＩＳＭＩＣ（登録商標）フィルター（穴径０．４５μｍ）でろ過した溶液を試料溶液とした。
ｃ）測定
液体クロマトグラフィー／紫外可視吸光度検出法により以下の条件で測定した。
測定波長：３８２ｎｍ、カラム：資生堂ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ Ｃ１８ ＡＣＲ ３μｍ_３．０ｍｍ＊７５ｍｍ
カラム温度：４０℃付近の一定温度
移動相Ａ、Ｂはいずれも水／メタノール／トリフルオロ酢酸混液で、移動相の送液は移動相ＡおよびＢの混合比を変えて濃度勾配を制御した。
流量：毎分１．０ｍＬ、注入量：１０μＬ、オートサンプラー温度：２５℃付近の一定温度で測定を行った。
＜硫酸イオン濃度測定＞
イオンクロマト装置 ８８３ Ｂａｓｉｃ ＩＣ ｐｌｕｓ（Ｍｅｔｒｏｈｍ社製）にて、サンプルを測定し、硫酸イオン濃度を定量した。トポテカンに対する硫酸イオンのモル比を測定した結果を表１および表２に示す。表１及び２のリポソームにおいては、リポソームの内水相に含まれる硫酸イオンのリポソーム組成物全体の硫酸イオンに対する比率が、少なくとも９０％であった。
内水相硫酸イオン濃度は、全水相硫酸イオン濃度から外水相硫酸イオン濃度を引き算して、算出した。各水相の硫酸イオン濃度は以下のように測定した。
（全水相硫酸イオン濃度）
リポソーム分散液を５０μＬ測り取り、メタノール９５０μＬを加え、超音波処理を１５秒実施し、混和した。その液を９０μＬを測り取り、注射用水（光製薬製）を８１０μＬを加え、超音波処理を30秒実施し、混和した。この溶液に酢酸エチル９００μＬ添加し、よく振って酢酸エチル相へ脂質類を抽出した。水相の液を適量は測り取り、イオンクロマト分析に使用した。
（外水相硫酸イオン濃度）
リポソーム分散液を１００μＬ測り取り、５％ブドウ糖液（大塚製薬製）９００μＬを加え希釈した。その液４５０μＬを限外ろ過にて処理し、ろ液をイオンクロマト分析サンプルとした。
遠心条件は、７４００ｇ, ５℃, ３０分。遠心分離機は、日立製himac CF15RXIIを使用した。
＜ＡＵＣの測定＞
調製したトポテカン含有リポソームを投与したマウス（投与量は薬物量として１ｍｇ／ｋｇ）については、投与後０．２５、２、６、２４時間で採血した。血液は８００×ｇ、１０分間遠心し、血漿を回収した。採取した血漿について、液体クロマトグラフィー／質量分析／質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いて、トポテカン濃度の定量を行った。得られたトポテカン濃度推移より薬物動態解析ソフトＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）（Ｃｅｒｔａｒａ）を用いて単回投与後の無限時間までの血中濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した。ＡＵＣの単位は、時間×ｎｇ／ｍＬ（表中では、hr*ng/mLと表記）である。なお、非特許文献１に記載のリポソームのＡＵＣは、６８１５２時間×ｎｇ／ｍＬと計算される。
Figure 0007012124000003
Figure 0007012124000004
表１および表２の結果から分かるように、リポソーム膜の構成成分として、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロールを含むリポソーム組成物において、内水相が硫酸アンモニウムを含み、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６以上である実施例１～１０において、ＡＵＣの測定値が２０００００以上となり、高い血中滞留性を達成できることが示された。一方、ジヒドロスフィンゴミエリンを使用しない比較例１から８、全水相薬物に対する内水相硫酸イオンのモル比が０．３６未満である比較例９および１０、親水性高分子で修飾したジアシルホスファチジルエタノールアミンを使用しない比較例１１および１２においては、ＡＵＣの測定値が２０００００未満であり、実施例１から１０よりも劣ることが示された。
＜Ａ５４９皮下移植マウスモデルを用いた薬効試験＞
Ｂａｌｂ／ｃ／ｎｕ／ｎｕマウス（雌、６週齢）にヒト肺癌細胞株であるＡ５４９細胞１×１０7個を右腹側部皮下に移植した。移植後１５日目から実施例１０で調製したトポテカン含有リポソーム（薬物量として４ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇ、週１回投与を２回）、比較例１２で調製したトポテカン含有リポソーム（薬物量として４ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇ、週１回投与を２回）を投与した。また、陰性対照としては生理食塩液を投与した。また、比較対照としては、トポテカン水溶液（薬物量として２ｍｇ／ｋｇ）を投与した。投与開始から週２回、体重および腫瘍体積を測定した。体重の測定結果を図１および図２に示し、腫瘍体積の測定結果を図３および図４に示す。
図３および図４の結果から、比較例１２で調製したトポテカン溶液と比較して、実施例１０で調製したトポテカン含有リポソームは、高い薬効を示し、効果は用量に依存していることが分かった。
＜実施例１１～１６、比較例１３～１６＞
実施例１１～１６について、油相の調整におけるコレステロールの添加量と鶏卵由来ＤＨＳＭの添加量を、表３に記載の比率になるように、ＤＨＳＭ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、およびコレステロールの量を変更した以外については、実施例１同様に作製した。例えば、実施例１１について、油相の調整におけるコレステロールの添加量と鶏卵由来ＤＨＳＭの添加量を、コレステロールを３．６ｇ、鶏卵由来ＤＨＳＭを１２．９ｇに変更した以外は、実施例１同様に作製した。比較例１３～１６について、表３に記載の比率になるよう、ＳＭ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、およびコレステロールの量を変更した。
同様に粒子径、全水相トポテカン濃度、内水相硫酸イオン濃度、ＡＵＣを測定した結果を表３に示す。また、各コレステロール量に対する、ＡＵＣの値を図５に示す。
表３のリポソームにおいては、リポソームの内水相に含まれる薬物のリポソーム組成物全体の薬物に対する比率は、比較例１３を除き少なくとも９８％であった。比較例１３は、６８％であった。
表３のリポソームにおいては、リポソームの内水相に含まれる硫酸イオンのリポソーム組成物全体の硫酸イオンに対する比率が、比較例１３を除き少なくとも９０％であった。比較例１３は、７１％であった。
Figure 0007012124000005
実施例１１～１６、比較例１、２、４、７、１３～１６の結果より、鶏卵由来ＤＨＳＭを用いたリポソームが、ＳＭリポソームより幅広いコレステロールの添加比率において、本発明は良好なＡＵＣを達成することが分かる。また本発明の鶏卵由来ＤＨＳＭリポソームにおいて、特にコレステロール比率が、３５～４３モル％の範囲でＡＵＣがより良好であることが分かる。
＜実施例１７～２４、比較例１７～２４＞
＜リポソーム分散物の作製＞
実施例１７～２４、比較例１７～２４について、油相の調整における各脂質の添加量を表４のように設定し、また、リモートローディングによりリポソーム粒子へ内包する薬物を表４のように設定し、トポテカン以外の薬剤は、下記の＜リモートローディングによる各抗がん剤のリポソーム粒子への内包＞に記載した方法で薬剤を内包したことを除き、実施例１と同様に作製した。また、実施例１７～２４、比較例１７～２４について、それぞれの脂質構成比を表５に示す。
Figure 0007012124000006
Figure 0007012124000007
＜リモートローディングによる各抗がん剤のリポソーム粒子への内包＞
ドキソルビシンの内包（実施例１９、２０、比較例１９、２０）：ドキソルビシン塩酸塩（東京化成社製）に注射用水を加え、4 ｍｇ／ｍＬとした。さらに、液をよく攪拌しながら８ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液を添加し、ｐＨを約３に調整してドキソルビシン塩酸塩を溶解させた。このドキソルビシン溶液にリポソームを１／１の容積比で加えた後、ｐＨ ７．０に調整した分散液を６２℃で６０分間加温した。
スニチニブの内包（実施例２１、２２、比較例２１、２２）：リンゴ酸スニチニブ（トロントリサーチケミカルズ社製）に注射用水を加え、５ ｍｇ／ｍＬとした。さらに、液をよく攪拌しながら８ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液を添加し、ｐＨを約３に調整してリンゴ酸スニチニブを溶解させた。このスニチニブ溶液にリポソームを１／１の容積比で加えた後、６２℃で６０分間加温した。
イリノテカンの内包（実施例２３、２４、比較例２３、２４）：イリノテカン塩酸塩（東京化成社製）に注射用水を加え、４ ｍｇ／ｍＬとした。さらに、液をよく攪拌しながら８ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ溶液を添加し、ｐＨを約３に調整してイリノテカン塩酸塩を溶解させた。このイリノテカン溶液にリポソームを１／１の容積比で加えた後、６２℃で６０分間加温した。
実施例１７～２２、比較例１７～２２について、本実施例中において上記した方法と同様にＡＵＣを測定した結果を表６に示す。
Figure 0007012124000008
実施例１７～２２、比較例１７～２２の結果より、トポテカン及びスニチニブのどちらの薬剤を用いた場合においても、ＤＨＳＭを用いたリポソーム方が、ＳＭリポソームおよびＨＳＰＣリポソームより血中滞留性が向上する結果となった。また、ＤＨＳＭとして炭素数１６と１８のアルキル鎖を持つＤＨＳＭが９８％以上の純度を持つ全合成ＤＨＳＭを用いたリポソームが、鶏卵由来ＤＨＳＭに比べて血中滞留性が向上できることが分かった。
実施例１７～２４、比較例１７～１８、２１～２４について、粒子径、トポテカン濃度、硫酸イオン濃度、リリース率を測定した結果を表７に示す。粒子径、トポテカン濃度、硫酸イオン濃度は、本実施例中において上記した方法と同様に測定した。
表７のリポソームにおいては、リポソームの内水相に含まれる薬物のリポソーム組成物全体の薬物に対する比率は、少なくとも９５％であった。
表７のリポソームにおいては、リポソームの内水相に含まれる硫酸イオンのリポソーム組成物全体の硫酸イオンに対する比率が、少なくとも９５％であった。
各濃度の塩化アンモニウム含有PBS緩衝液中にリポソーム製剤を２０倍希釈し、４時間インキュベートした時点のリリース率を測定した。リリース率は、外水相へ漏れたAPI濃度を初期の全水相API濃度で割り算した値の百分率として定義される。
各濃度の塩化アンモニウム含有ＰＢＳ緩衝液としては、
実施例１７、１８、比較例１７、１８（トポテカン内包リポソームの評価）では、塩化アンモニウム４．８ ｍｍｏｌ／Ｌ、
実施例１９、２０、比較例１９、２０（ドキソルビシン内包リポソームの評価）では、塩化アンモニウム２００ ｍｍｏｌ／Ｌ、
実施例２１、２２、比較例２１、２２（スニチニブ内包リポソームの評価）では、塩化アンモニウム１００ ｍｍｏｌ／Ｌ、
実施例２３、２４、比較例２３、２４（イリノテカン内包リポソームの評価）では、塩化アンモニウム４．８ ｍｍｏｌ／Ｌ、を溶解したＰＢＳ緩衝液を用いた。
Figure 0007012124000009
実施例１７～２４、比較例１７～１８、２１～２４の結果より、いずれの薬剤を用いた場合においても、ＤＨＳＭを用いたリポソームの方が、ＳＭリポソームおよびＨＳＰＣリポソームよりリリース率が低減し、血中滞留性の向上が期待できる結果となった。また、ＤＨＳＭとして炭素数１６と１８のアルキル鎖を持つＤＨＳＭが９８％以上の純度を持つ全合成ＤＨＳＭを用いた場合、トポテカン内包リポソーム、ドキソルビシン内包リポソーム、イリノテカン内包リポソームで大きくリリース率が低減できており、血中での漏出を抑制するうえで、より好ましいことが分かった。
＜不溶性微粒子測定＞
液中パーティクルカウンター（ＨＡＣＨ ＵＬＴＲＡ）にて、実施例２、３、４について、それぞれ５℃保管後１か月のサンプルを測定し、１バイアル製剤（２ｍＬ）当たりに含まれる１０μｍ超の粒子および２５μｍ超の粒子の個数を測定した（以下、特に説明がない限り、１０μｍ超の粒子とは、粒径が１０μｍを超える粒子を意味する。２５μｍ超の粒子とは、粒径が２５μｍを超える粒子を意味する。）。実施例２、３、４は脂質濃度２３ｍｍｏｌ／Ｌであり、脂質１μｍｏｌ当たりの粒子の個数としてまとめると、１０μｍ超の粒子について、実施例２は０．７個、実施例３は１．１個、実施例４は０．３個であった。また、２５μｍ超の粒子について、実施例２は０．０９個、実施例３は０．５個、実施例４は０個であった。トポテカンを内包したリポソームは、漏出し中性環境に晒されると難溶性の二量体へと分解し、不溶性微粒子になることが知られている。この結果は、本発明により漏出が極めてよく抑制できたため、不溶性微粒子の発生も低減できた驚くべき結果である。
比較例８について、５℃保管後１か月のサンプルにおいても１バイアル製剤（２ｍＬ）中の不溶性微粒子を測定した。脂質１μｍｏｌ当たりの粒子の個数に換算すると、１０μｍ超の粒子が２５１個であり１５０個を大きく超えており、また２５μｍ超の粒子の個数が１７個であり、１５個を大きく超えていた。
＜リリース率へ与えるアンモニウムイオン依存性＞
リリース率は、全水相薬剤濃度に対する漏出した薬剤濃度（外水相濃度）の百分率で算出した。実施例１７で作製したトポテカンを内包するＤＨＳＭリポソーム、ドキソルビシンを内包するＨＳＰＣリポソーム（ドキシル（登録商標）２０ＭＧ、ヤンセンファーマ）を、塩化アンモニウムを添加しない血漿（LAMPIRE製、マウス血漿、品名：Control and Donor Mouse Plasma in Na Hep、カタログ番号7315511）と５ｍｍｏｌ／Ｌの塩化アンモニウムを溶解した血漿中でのリリース率を測定した。その結果を図６に示す。腫瘍環境においては、グルタミン分解が亢進しており、その結果アンモニウムが多く発生しており、おおよそ５ｍｍｏｌ／Ｌの発生が報告されている（引用論文：Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and medicien, 11(2015) 1841-1850）。
ドキシル（登録商標）２０ＭＧはＨＳＰＣからなるドキソルビシンを内包したリポソームである。ドキシル（登録商標）は、血中を模した環境では漏出が極めて少ないが、腫瘍環境を模した高アンモニウム環境でもほとんど放出されないことが分かった。これに対して、本発明の実施例１７記載のトポテカンを含有するリポソームは、血中を模した環境では漏出が極めて少なく高い血中滞留性が得られる一方で、腫瘍環境を模した高アンモニウム環境で、86％と言う非常に高く、血中では漏出せず多くの薬物を腫瘍にリポソームによって送達され、リポソームによって運ばれた薬物が腫瘍で多く放出されることが期待できる結果となった。この結果を図６に示した。
また、実際にヒト卵巣がん細胞株ES-2をBALB/cヌードマウスの皮下に移植して得た腫瘍を採取し、孔径５ μｍの遠心ろ過フィルターに載せ、４００ ｇで１０分間遠心することにより、腫瘍間質液を得た。腫瘍間質液３０μＬに、実施例１７で作製した本発明のトポテカンリポソーム（薬物量として３０ｎｇ）、ドキソルビシンを内包するＨＳＰＣリポソーム（ドキシル（登録商標）２０ＭＧ、ヤンセンファーマ）（薬物量として３０ｎｇ）をそれぞれ添加し、３７℃２４時間インキュベートした際のリリース率は、実施例１７で８５％、ドキソルビシンを内包するＨＳＰＣリポソームで６％となり、実際の腫瘍環境から採取された腫瘍間質液で、リリース性の差異が期待通り観察された。

Claims (22)

  1. 内水相を有するリポソームと、リポソームを分散する外水相である水溶液を有するリポソーム組成物であって、
    リポソームを構成する全脂質として、ジステアロイルグリセロール－ＰＥＧ２０００、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含み、
    リポソーム組成物が薬物を含み、内水相が硫酸アンモニウムを含み、内水相及び外水相に含まれる薬物のモルの総和に対する内水相に含まれる硫酸イオンのモル比が０．３６以上である、リポソーム組成物。
  2. 薬物がトポテカンまたはその塩、ドキソルビシンまたはその塩、イリノテカンまたはその塩、スニチニブまたはその塩である、請求項１に記載のリポソーム組成物。
  3. 内水相及び外水相に含まれる薬物のモルの総和に対する内水相に含まれる硫酸イオンのモル比が０．６以上１．８以下である、請求項１または２に記載のリポソーム組成物。
  4. リポソームを構成する全脂質におけるジステアロイルグリセロール－ＰＥＧ２０００の比率が２～１０モル％である、請求項１から３の何れか一項に記載のリポソーム組成物。
  5. リポソームを構成する全脂質におけるコレステロール類の比率が３５～４３モル％である、請求項１から４の何れか一項に記載のリポソーム組成物。
  6. リポソームの粒子径が３０ｎｍ以上１５０ｎｍ以下である、請求項１から５の何れか一項に記載のリポソーム組成物。
  7. 外水相のｐＨが５．５～８．５である、請求項１から６の何れか一項に記載のリポソーム組成物。
  8. ジヒドロスフィンゴミエリンが炭素数１６と炭素数１８の長鎖アルキル基を含むジヒドロスフィンゴミエリンで、薬物がトポテカンまたはその塩である請求項１から７の何れか一項に記載のリポソーム組成物。
  9. リポソーム組成物全体に含まれる硫酸イオンに対する内水相に含まれる硫酸イオンの比率が、少なくとも８０％であり、リポソーム組成物全体に含まれる薬物に対する内水相に含まれる薬物の比率が、少なくとも８０％である、請求項１から８の何れか一項に記載のリポソーム組成物。
  10. ５℃で１か月の保管後におけるリポソーム組成物の脂質１μｍｏｌ当たりに含まれる１０μｍを超える不溶性微粒子が１５０個以下であり、リポソーム組成物の脂質１μｍｏｌ当たりに含まれる２５μｍを超える不溶性微粒子が１５個以下である、請求項１から９の何れか一項に記載のリポソーム組成物。
  11. リポソームを構成する全脂質におけるジヒドロスフィンゴミエリンの比率が４０～７０モル％である、請求項１から１０の何れか一項に記載のリポソーム組成物。
  12. 請求項１から１１の何れか一項に記載のリポソーム組成物を含む、医薬組成物。
  13. 請求項１２に記載の医薬組成物を含む、抗がん剤。
  14. 内水相を有するリポソームと、リポソームを分散する外水相である水溶液を有するリポソーム組成物であって、
    リポソームを構成する全脂質として、ジステアロイルグリセロール－ＰＥＧ２０００、ジヒドロスフィンゴミエリン、およびコレステロール類を含み、
    リポソーム組成物が薬物を含み、内水相がアンモニウム塩を含み、ジヒドロスフィンゴミエリンが炭素数１６と炭素数１８の長鎖アルキル基を有するジヒドロスフィンゴミエリンである、リポソーム組成物。
  15. 内水相及び外水相に含まれる薬物のモルの総和に対する内水相に含まれる硫酸イオンのモル比が０．６以上１．８以下である、請求項１４に記載のリポソーム組成物。
  16. リポソームを構成する全脂質におけるジステアロイルグリセロール－ＰＥＧ２０００の比率が２～１０モル％である、請求項１４または１５に記載のリポソーム組成物。
  17. リポソームを構成する全脂質におけるコレステロール類の比率が３５～４３モル％である、請求項１４から１６の何れか一項に記載のリポソーム組成物。
  18. リポソームの粒子径が３０ｎｍ以上１５０ｎｍ以下である、請求項１４から１７の何れか一項に記載のリポソーム組成物。
  19. 外水相のｐＨが５．５～８．５である、請求項１４から１８の何れか一項に記載のリポソーム組成物。
  20. ジヒドロスフィンゴミエリンが、化学合成により得られるものである。請求項１４から１９の何れか一項に記載のリポソーム組成物。
  21. リポソームを構成する全脂質におけるジヒドロスフィンゴミエリンの比率が４０～７０モル％である、請求項１４から２０の何れか一項に記載のリポソーム組成物。
  22. 請求項１４から２１の何れか一項に記載のリポソーム組成物を含む、医薬組成物。
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