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JP7096667B2 - Ｇｐｃ３標的治療剤が有効である患者に投与されるｇｐｃ３標的治療剤 - Google Patents

Ｇｐｃ３標的治療剤が有効である患者に投与されるｇｐｃ３標的治療剤 Download PDF

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Description

本発明は、患者における癌に対するGPC3標的治療剤の有効性を決定する方法、または、GPC3標的治療剤が有効であると決定された患者（のみ）に投与するためのGPC3標的治療剤または製剤を提供する。
肝細胞癌に起因する死亡は通年で60万に相当し、世界の癌による死亡のうちでは5番目に位置するといわれている（非特許文献１）。肝細胞癌の大半はその疾患であるとの診断後1年以内に死亡する。不幸にも、肝細胞癌は治癒可能な療法があまり奏功しない後期ステージで診断される例が頻繁である。こうした患者に対しての化学療法、化学塞栓術、焼灼や陽子ビーム療法を含む医療処置の効果は依然として不十分である。多くの患者が疾患の再発を示し、これは血管浸潤および多部位肝内転移を伴って進行ステージに急速に進行して、その5年生存率は7％に過ぎない（非特許文献２）。局部癌の切除術が可能な肝細胞癌の患者の予後は比較的よいが、その5年生存率は15％から39％に留まる（非特許文献３）。当該技術分野においては、このような悪性疾患である肝細胞癌に対する新規療法が求められている。
肝細胞癌は日本における原発性肝癌の90％以上の原因を占めるといわれている。こうした肝細胞癌に対する内科的治療方法としては、例えば、化学療法剤を用いて、腫瘍への栄養供給経路となる肝動脈に油性造影剤（リピオドール）と抗癌剤、塞栓物質（ゼルフォーム）を混和したものを注入し、栄養動脈を閉塞することにより、選択的に肝細胞癌を壊死に導く治療法であるTAE（肝動脈塞栓療法）のほか、経皮的エタノール注入法、経皮的マイクロ波凝固療法、ラジオ波焼灼療法等の侵襲を伴う手法が用いられている。また、化学療法剤として、5-FU（フルオロウラシル）、UFT（ウラシルとテガフール）、MMC（マイトマイシンC）、DHAD（ミトキサントロン）、ADR（アドリアマイシン）、EPI（エピルビシン）、CDDP（シスプラチン）等が単独で、あるいはIFN（インターフェロン）との併用療法として、全身化学療法の臨床試験が行われた（非特許文献４）。
こうした中、Raf/MEK/ERKシグナル伝達をRafキナーゼの段階で阻害することによって癌細胞の増殖をブロックし、かつ、VEGFR-2、VEGFR-3およびPDGFR-βチロシンキナーゼを標的とすることによって抗血管形成効果を発揮し、上記の化学療法剤に比べて有利な効果を示した経口活性型のソラフェニブ（Nexavar、BAY43-9006）が承認されている。ソラフェニブの有効性については、進行性肝細胞癌を対象とした2つの第III相多施設共同プラセボ対照比較試験（SHARP試験及びアジア・太平洋地域において実施された試験）において検討が行われている。これらいずれの試験においても生存期間の延長が認められ、共にHRは0.68であった。SHARP試験では生存期間は7.9カ月から10.7カ月に延長された。一方、アジアの試験では、生存期間は4.2カ月から6.5カ月に延長された。しかし、客観的奏効率は低く、画像上の腫瘍進行までの期間は延長されたものの（欧米の試験では2.8カ月から5.5カ月、アジアの試験では1.4カ月から2.8カ月）、症状悪化までの期間の延長は認められなかった。アジア人コホートでは生存延長期間が短かったが、これはアジア地域では欧米と比較して疾患経過のやや遅い時期に治療が開始されたためであると考えられる（非特許文献５、６）。
一般的に、肝癌の進行に伴い肝機能障害を伴う、食欲不振、体重減少、全身倦怠感、右悸肋部腫瘤触知、右悸肋部痛、腹部膨満感、発熱、黄疸等の肝癌特有の症状が観察される。しかしながらソラフェニブ等の化学療法剤は、下痢または便秘、貧血、（致死的な重篤度の）感染や敗血症を引き起こすほどの免疫系の抑制、出血、心毒性、肝毒性、腎毒性、食欲不振、体重減少等の化学療法剤に固有の副作用も併発するという、克服すべき課題を有している。
一般に、肝癌は初期には特別な初期症状は観察されないが、肝癌の進行に伴い肝機能障害を伴う、食欲不振、体重減少、全身倦怠感、右悸肋部腫瘤触知、右悸肋部痛、腹部膨満感、発熱、黄疸等の肝癌特有の症状が観察される。こうした症状は上記の化学療法剤の使用によって増幅されることが臨床上観察される。たとえば、肝癌細胞が検出される患者の食欲不振、および、それに伴うまたはそれとは独立して生じる体重減少等の症状は、当該患者に対する化学療法剤の投与によって、非投与に比較してより増幅されることがある。こうした症状が表れる場合には当該化学療法剤の使用を断念せざるを得なくなる場合もあり、上記の症状の増幅は化学療法剤による治療を妨げる要因となる。したがって、治療効果の向上や治療を受ける患者のQOLの改善等の観点からより優れた治療法の確立が求められていた。
グリピカン３（GPC3）は肝癌で頻繁に高発現していることから、GPC3は、GPC3の肝癌における機能の同定、肝癌の治療の標的または肝癌の診断の標的として有用であろうと考えられている。
前記の情況の下で、GPC3を肝癌の治療の標的とする治療剤の開発が進められている。GPC3を発現する細胞に対して抗体依存性細胞傷害（Antibody-dependent cellular cytotoxicity、以下「ADCC」と述べられる。）活性および/または補体依存性細胞傷害（Complement-dependent cytotoxicity、以下「CDC」と述べられる）活性を奏する抗GPC3抗体を有効成分として含む肝癌治療剤が開発された（特許文献１）。また、ADCC活性およびCDC活性を有するヒト化抗GPC3抗体を有効成分として含むGPC3標的治療剤が開発された（特許文献２）。さらに、ADCC活性が増強されたヒト化抗GPC3抗体（特許文献３、４）に加え、ADCC活性およびCDC活性を有し、血漿中動態が改善されたGPC3抗体（特許文献５）を含むGPC3標的治療剤が開発された。また、これらの抗GPC3抗体とソラフェニブ等の化学療法剤との併用療法によってソラフェニブ等の化学療法剤による単独療法がもたらす副作用等が減弱されるとともに、両薬剤による相乗的効果を示すことも見出されており（特許文献６）、治療効果の向上や治療を受ける患者のQOLの改善等の観点から、GPC3標的治療剤を中核とするより優れた肝癌の治療法が確立されつつある。
一方で、GPC3を肝癌の診断の標的とする診断方法の開発もまた進められている。GPC3は細胞表面への発現途中または発現後、その特定の部位においてコンバルターゼ、フォスフォリパーゼD、Notumまたは未同定のメカニズムによってプロセッシングを受けることが知られている（非特許文献７、８）。こうした現象を利用することによって、患者の血漿中に存在する、プロセッシングを受けて血漿中に分泌された可溶型GPC3のエピトープに結合する抗体を含む肝癌の診断薬または診断方法が開発されている（特許文献７）。また、患者から単離された組織標品等に存在する、プロセッシングを受けた後に細胞表面になお存在する係留型GPC3のエピトープに結合する抗体を含む肝癌の診断薬または診断方法が開発されている（特許文献８）。しかしながら、以上の診断薬または診断方法は、被験患者における肝癌の存在を検出する方法であって、GPC3標的治療剤が有効性を期待できる患者を同定する方法、または、GPC3標的治療剤を投与された患者に対するGPC3標的治療剤の投与の継続を決定する方法については知られていなかった。
腫瘍組織標品での抗GPC3抗体を用いた免疫組織化学染色による免疫染色結果とGPC3標的治療剤の治療効果との関連性について、GPC3配列由来のペプチドワクチンまたはヒト化抗GPC3抗体の第一相臨床試験において検討されているが、予測精度が低いためと思われるが、未だ明らかな結論には至っていない（非特許文献９、１０、１１）。
本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書に参照として取り込まれる。なお、これらの文献のいずれかが、本明細書に対する先行技術であると認めるものではない。
WO2003/000883 WO2006/006693 WO2006/046751 WO2007/047291 WO2009/041062 WO2009/122667 WO2004/038420 WO2009/116659
Llovet JM, Burroughs A, Bruix J; Lancet (2003), 362, 1907-17 Bosch FX, Ribes J, Cleries R; Gastroenterology (2004), 127, S5-16 Takenaka K, Kawahara N, Yamamoto K, Kajiyama K, Maeda T, Itasaka H, Shirabe K, Nishizaki T, Yanaga K, Sugimachi K; Arch Surg (1996), 131, 71-6 Yeo W, Mok TS, Zee B, Leung TW, Lai PB, Lau WY, Koh J, Mo FK, Yu SC, Chan AT, Hui P, Ma B, Lam KC, Ho WM, Wong HT, Tang A, Johnson PJ; J Natl Cancer Inst (2005), 97, 1532-8 Llovet J, Ricci S, Mazzaferro V, Hilgard P, Gane E, et al. Sorafenib in advanced hepatocellular carcinoma. New Eng. J. Med. (2008) 359, 378-90 Cheng AL, Chen Z, Tsao CJ, Qin S, Kim JS, et al. Efficacy and safety of sorefanib in patients in the Asia-Pacific region with advanced hepatocellular carcinoma: a phase III randomized, double-blind, placebo- controlled trial. Lancet Oncol. (2009) 10, 25-34 De Cat B, Muyldermans S-Y, Coomans C, Degeest G, Vanderschueren B, et al. Processing by proprotein convertases is required for glypican-3 modulation of cell survival, Wnt signaling, and gastrulation movements. J. Cell. Biol. (2003) 163, 625-635 Traister A, Shi W and Filmus J. Mammalian Notum induces the release of glypicans and other GPI-anchored proteins from the cell surface. Biochem. J. (2008) 410, 503-511 Sawada Y, Yoshikawa T, Nobuoka D, Shirakawa H, Kuronuma T et al. Phase I trial of a glypican-3-derived peptide vaccine for advanced hepatocellular carcinoma: Immunologic evidence and potential for improving overall survival. Clin. Cancer Res. (2012) 18, 3686-3696 Zhu A.X, Gold P.J, El-Koueiry A.B, Abrams T.A, Morikawa H et al. First-in-man pahse I study of GC33, a novel recombinant humanized antibody against glypican-3, in patients with advanced hepatocellular carcinoma. Clin. Cancer Res. (2013) 19, 920-928 Ikeda M, Ohkawa S, Okusaka T, Mitsunaga S, Kobayashi S, et al. Japanese phase I study of GC33, a humanized antibody against glypican-3 for advanced hepatocellular carcinoma. Cancer Sci. (2014) 105, 455-462
本発明はこのような情況に鑑みて為されたものであり、その目的は、肝癌患者に対するGPC3標的治療剤の有効性を決定する方法を提供することにある。また、併せて、GPC3標的治療剤が有効であると決定された患者（のみ）に投与するためのGPC3標的治療剤または製剤を提供することにある。
本発明者らは前記のような情況下で鋭意研究を進めたところ、GPC3標的治療剤を投与される前の患者から単離された生物学的試料中のGPC3の発現量を測定し、1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量のみが患者のGPC3標的治療剤に対する有効性と高い相関を示すことを見いだし、1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値である場合に当該GPC3標的治療剤が有効であると決定する方法を創作した。また、そのようにしてGPC3標的治療剤が有効であると決定された患者（のみ）に投与するためのGPC3標的治療剤または製剤を創作した。
より具体的には、以下の発明が提供される。
〔１〕患者における肝癌に対するGPC3標的治療剤の有効性を決定する方法であって、当該患者から単離された生物学的試料における１腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量を測定することを含む、方法。
〔２〕前記生物学的試料における1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値である場合に、GPC3標的治療剤が有効であると決定することをさらに含む、〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記生物学的試料が肝癌組織試料である、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量がIQD Cell Scoreで表される、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕前記GPC3標的治療剤が、前記患者の血中トラフ値で200μg/ml以上となるように投与される、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕前記GPC3標的治療剤が、抗GPC3抗体を有効成分として含む治療剤である、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕前記抗GPC3抗体が、抗体依存性細胞傷害（ADCC）活性および／または補体依存性細胞傷害（CDC）活性を有する抗体である、〔６〕に記載の方法。
〔８〕前記抗GPC3抗体が、以下の（１）から（５）のいずれか：
（１） 配列番号：４、配列番号：５、および配列番号：６でそれぞれ表される重鎖CDR1、重鎖CDR2および重鎖CDR3、ならびに配列番号：７、配列番号：８、および配列番号：９でそれぞれ表される軽鎖CDR1、軽鎖CDR2および軽鎖CDR3；
（２） 配列番号：１２、配列番号：１３、および配列番号：１４でそれぞれ表される重鎖CDR1、重鎖CDR2および重鎖CDR3、ならびに配列番号：１５、配列番号：１６、および配列番号：１７でそれぞれ表される軽鎖CDR1、軽鎖CDR2および軽鎖CDR3；
（３） 配列番号：２０、配列番号：２１、および配列番号：２２でそれぞれ表される重鎖CDR1、重鎖CDR2および重鎖CDR3、ならびに配列番号：２３、配列番号：２４、および配列番号：２５でそれぞれ表される軽鎖CDR1、軽鎖CDR2および軽鎖CDR3；
（４） 配列番号：２８、配列番号：２９、および配列番号：３０でそれぞれ表される重鎖CDR1、重鎖CDR2および重鎖CDR3、ならびに配列番号：３１、配列番号：３２、および配列番号：３３でそれぞれ表される軽鎖CDR1、軽鎖CDR2および軽鎖CDR3；もしくは
（５） 配列番号：３６、配列番号：３７、および配列番号：３８でそれぞれ表される重鎖CDR1、重鎖CDR2および重鎖CDR3、ならびに配列番号：３９、配列番号：４０、および配列番号：４１でそれぞれ表される軽鎖CDR1、軽鎖CDR2および軽鎖CDR3；
を含む抗GPC3キメラ抗体またはヒト化抗GPC3抗体である、〔６〕または〔７〕に記載の方法。
〔９〕前記抗GPC3抗体が、以下の（１）から（６）のいずれか：
（１） 配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、および配列番号：５０で表される重鎖可変領域の群から選択される重鎖可変領域、ならびに配列番号：５１で表される軽鎖可変領域；
（２） 配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、および配列番号：５０で表される重鎖可変領域の群から選択される重鎖可変領域、ならびに配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、および配列番号：６６で表される軽鎖可変領域の群から選択される軽鎖可変領域；
（３） 配列番号：６７で表される重鎖可変領域、および配列番号：６８で表される軽鎖可変領域；
（４） 配列番号：６９で表される重鎖可変領域、および配列番号：７０で表される軽鎖可変領域；
（５） 配列番号：７１で表される重鎖可変領域、および配列番号：７２で表される軽鎖可変領域；もしくは
（６） 配列番号：７１で表される重鎖可変領域、および配列番号：７３で表される軽鎖可変領域；
を含む抗体である、〔６〕から〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕前記抗GPC3抗体が、細胞傷害物質が連結された抗体である、〔６〕に記載の方法。
〔１１〕前記GPC3標的治療剤が、１または２以上の抗がん剤と同時または別々に投与される、〔１〕から〔１０〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕前記抗がん剤がソラフェニブである、〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕GPC3標的治療剤を有効成分として含む薬剤であって、患者から単離された生物学的試料における1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値である患者に投与するための薬剤。
〔１４〕前記患者が、当該患者から単離された生物学的試料における1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値であると決定された患者である、〔１３〕に記載の薬剤。
〔１５〕前記患者が、当該患者から単離された生物学的試料における1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値であることによりGPC3標的治療剤が有効であると決定された患者である、〔１３〕に記載の薬剤。
〔１６〕前記1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量がIQD Cell Scoreで表される、〔１３〕から〔１５〕のいずれかに記載の薬剤。
〔１７〕前記患者が肝癌患者である、〔１３〕から〔１６〕のいずれかに記載の薬剤。
〔１８〕前記肝癌が、GPC3標的治療剤が有効である肝癌である、〔１７〕に記載の薬剤。
〔１９〕前記GPC3標的治療剤が有効である肝癌が、前記患者から単離された生物学的試料におけるIQD Cell Scoreで表されるGPC3の発現量が所定の値であることによって特徴付けられる、〔１８〕に記載の薬剤。
〔２０〕前記生物学的試料が肝癌組織試料である、〔１３〕から〔１９〕のいずれかに記載の薬剤。
〔２１〕前記GPC3標的治療剤が、前記患者の血中トラフ値で200μg/ml以上となるように投与される、〔１３〕から〔２０〕のいずれかに記載の薬剤。
〔２２〕前記GPC3標的治療剤が、抗GPC3抗体を有効成分として含む治療剤である、〔１３〕から〔２１〕のいずれかに記載の薬剤。
〔２３〕前記抗GPC3抗体が、抗体依存性細胞傷害（ADCC）活性および／または補体依存性細胞傷害（CDC）活性を有する抗体である、〔２２〕に記載の薬剤。
〔２４〕前記抗GPC3抗体が、以下の（１）から（５）のいずれか：
（１） 配列番号：４、配列番号：５、および配列番号：６でそれぞれ表される重鎖CDR1、重鎖CDR2および重鎖CDR3、ならびに配列番号：７、配列番号：８、および配列番号：９でそれぞれ表される軽鎖CDR1、軽鎖CDR2および軽鎖CDR3；
（２） 配列番号：１２、配列番号：１３、および配列番号：１４でそれぞれ表される重鎖CDR1、重鎖CDR2および重鎖CDR3、ならびに配列番号：１５、配列番号：１６、および配列番号：１７でそれぞれ表される軽鎖CDR1、軽鎖CDR2および軽鎖CDR3；
（３） 配列番号：２０、配列番号：２１、および配列番号：２２でそれぞれ表される重鎖CDR1、重鎖CDR2および重鎖CDR3、ならびに配列番号：２３、配列番号：２４、および配列番号：２５でそれぞれ表される軽鎖CDR1、軽鎖CDR2および軽鎖CDR3；
（４） 配列番号：２８、配列番号：２９、および配列番号：３０でそれぞれ表される重鎖CDR1、重鎖CDR2および重鎖CDR3、ならびに配列番号：３１、配列番号：３２、および配列番号：３３でそれぞれ表される軽鎖CDR1、軽鎖CDR2および軽鎖CDR3；もしくは
（５） 配列番号：３６、配列番号：３７、および配列番号：３８でそれぞれ表される重鎖CDR1、重鎖CDR2および重鎖CDR3、ならびに配列番号：３９、配列番号：４０、および配列番号：４１でそれぞれ表される軽鎖CDR1、軽鎖CDR2および軽鎖CDR3；
を含む抗GPC3キメラ抗体またはヒト化抗GPC3抗体である、〔２２〕または〔２３〕に記載の薬剤。
〔２５〕前記抗GPC3抗体が、以下の（１）から（６）のいずれか：
（１） 配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、および配列番号：５０で表される重鎖可変領域の群から選択される重鎖可変領域、ならびに配列番号：５１で表される軽鎖可変領域；
（２） 配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、および配列番号：５０で表される重鎖可変領域の群から選択される重鎖可変領域、ならびに配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、および配列番号：６６で表される軽鎖可変領域の群から選択される軽鎖可変領域；
（３） 配列番号：６７で表される重鎖可変領域、および配列番号：６８で表される軽鎖可変領域；
（４） 配列番号：６９で表される重鎖可変領域、および配列番号：７０で表される軽鎖可変領域；
（５） 配列番号：７１で表される重鎖可変領域、および配列番号：７２で表される軽鎖可変領域；もしくは
（６） 配列番号：７１で表される重鎖可変領域、および配列番号：７３で表される軽鎖可変領域；
を含む抗体である、〔２２〕から〔２４〕のいずれかに記載の薬剤。
〔２６〕前記抗GPC3抗体が、細胞傷害物質が連結された抗体である、〔２２〕に記載の薬剤。
〔２７〕１または２以上の抗がん剤を有効成分としてさらに含む、〔１３〕から〔２６〕のいずれかに記載の薬剤。
〔２８〕１または２以上の抗がん剤と同時にまたは別々に投与される、〔１３〕から〔２６〕のいずれかに記載の薬剤。
〔２９〕前記抗がん剤がソラフェニブである、〔２７〕または〔２８〕に記載の薬剤。
〔３０〕肝癌に罹患した患者群からGPC3標的治療剤が有効な患者 を選別する方法であって、当該患者から単離された生物学的試料における1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値である場合に、GPC3標的治療剤が有効な患者であると決定する工程を含む、方法。
〔３１〕前記GPC3標的治療剤が、抗GPC3抗体を有効成分として含む治療剤である、〔３０〕に記載の方法。
〔３２〕患者における肝癌に対するGPC3標的治療剤の有効性を決定するためのキットであって、当該患者から単離された生物学的試料における1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量を測定するための試薬を含むキット。
〔３３〕前記生物学的試料における1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値である場合に、GPC3標的治療剤が有効であると決定することを記載した指示書をさらに含む、〔３２〕に記載のキット。
〔３４〕GPC3標的治療剤をさらに含む、〔３２〕または〔３３〕に記載のキット。
〔３５〕前記GPC3標的治療剤が、抗GPC3抗体を有効成分として含む治療剤である、〔３２〕から〔３４〕のいずれかに記載のキット。
〔３６〕GPC3標的治療剤、および患者から単離された生物学的試料における1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値である患者に当該GPC3標的治療剤を投与することが記載された指示書を含む製剤。
〔３７〕前記GPC3標的治療剤が、抗GPC3抗体を有効成分として含む治療剤である、〔３６〕に記載の製剤。
〔３８〕次の要素を含む、肝癌の治療用キット：
（１）GPC3標的治療剤；および
（２）患者から単離された生物学的試料における1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値である患者に当該GPC3標的治療剤が有効であると決定することを記載した指示書。
〔３９〕前記GPC3標的治療剤が、抗GPC3抗体を有効成分として含む治療剤である、〔３８〕に記載のキット。
本発明によれば、簡便かつ的確に、患者に対してGPC3標的治療剤が有効かどうかを決定することができる。これにより、GPC3標的治療剤の効果の向上と、治療を受ける患者のQOL改善が可能となり、より優れた癌の治療が実現される。
図１は、GPC3を強発現するヒト細胞株HepG2を用いたマウス移植モデルにおける治療剤投与と腫瘍径との関係を示す。 図２は、抗腫瘍効果評価終了時の各投与群の血漿中の可溶型GPC3断片sGPC3-Nの存在量を示す。 図３は、抗腫瘍効果評価終了時の各投与群の血漿中の可溶型GPC3断片sGPC3-Cの存在量を示す。 図４は、GC33およびソラフェニブの投与開始前に摘出し、GPC3組織免疫染色した進行および/または再発性肝細胞癌（HCC）組織における細胞膜または細胞内の染色強度（Hスコア）のヒストグラムを示す。 図５は、GC33およびソラフェニブの投与開始前に摘出し、免疫蛍光染色したHCC腫瘍組織における単位面積あたりの蛍光強度（IQD Intensity Score）および1腫瘍細胞あたりの蛍光強度（IQD Cell Score）を示す。 図６は、GPC3のIQD Cell Scoreのカットオフ値を変化させた場合の低値群および高値群それぞれにおけるPFSに関するカプランマイヤー曲線を示す。 図７は、GPC3スコアが中央値以上の群において、各個体の腫瘍細胞サイズが群における腫瘍細胞サイズの中央値よりも大きい群と小さい群とに分類し、それぞれの群におけるカプランマイヤー曲線を示す。図７Ａは、GPC3-IHC膜Hスコアが中央値よりも大きかった群、図７Ｂは、GPC3-IHC細胞質Hスコアが中央値よりも大きかった群、図７Ｃは、GPC3-IQD Intensity Scoreが中央値よりも大きかった群における分析を示す。
定義
本明細書において別段の定義がない限り、本発明に関連して用いられる化学的用語および技術的用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有するものとする。
不定冠詞
「一つの（a）」および「一つの（an）」という不定冠詞は、本発明において、一つのまたは二つ以上の（すなわち少なくとも一つの）その不定冠詞の文法上の対象をいう。例えば「一つの（a）要素」は、一つの要素または二つ以上の要素を意味する。
抗体
本発明における「抗体」は、抗体の全体分子に限られず、抗体の断片又はその修飾物であってもよく、二価抗体も一価抗体も含まれる。例えば、抗体の断片としては、Fab、F(ab')2、Fv、１個のFabと完全なFcを有するFab/c、またはH鎖若しくはL鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチェインFv(scFv)が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc., Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc., Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663, Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669, Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137 参照）。
scFvは、抗体のH鎖V領域とL鎖V領域とを連結することにより得られる。このscFvにおいて、H鎖V領域とL鎖V領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988）85, 5879-5883）。scFvにおけるH鎖V領域およびL鎖V領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。V領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２～１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
scFvをコードするDNAは、前記抗体のH鎖またはH鎖V領域をコードするDNA、およびL鎖またはL鎖V領域をコードするDNAのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするDNA部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてPCR法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするDNA、およびその両端が各々H鎖、L鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
また、一旦scFvをコードするDNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってscFvを得ることができる。
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
さらに、本発明で使用される抗体は、二重特異性抗体（bispecific antibody）であってもよい。二重特異性抗体は２種類の抗体のHL対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。
アミノ酸
本明細書において、たとえば、Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/Vと表されるように、アミノ酸は1文字コードまたは3文字コード、またはその両方で表記されている。
アミノ酸の改変
抗原結合分子のアミノ酸配列中のアミノ酸の改変のためには、部位特異的変異誘発法（Kunkelら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492））やOverlap extension PCR等の公知の方法が適宜採用され得る。また、天然のアミノ酸以外のアミノ酸に置換するアミノ酸の改変方法として、複数の公知の方法もまた採用され得る（Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249、Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357）。例えば、終止コドンの１つであるUAGコドン（アンバーコドン）の相補的アンバーサプレッサーtRNAに非天然アミノ酸が結合されたtRNAが含まれる無細胞翻訳系システム（Clover Direct（Protein Express））等も好適に用いられる。
本明細書において、アミノ酸の改変部位を表す際に用いられる「および/または」の用語の意義は、「および」と「または」が適宜組み合わされたあらゆる組合せを含む。具体的には、例えば「43位、52位、および/または105位のアミノ酸が置換されている」とは以下のアミノ酸の改変のバリエーションが含まれる；(a) 43位、(b) 52位、(c) 105位、(d) 43位および52位、(e) 43位および105位、(f) 52位および105位、(g) 43位および52位および105位。
EUナンバリングおよびKabatナンバリング
本発明で使用されている方法によると、抗体のCDRとFRに割り当てられるアミノ酸位置はKabatにしたがって規定される（Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987年および1991年）。本明細書において、抗原結合分子が抗体または抗原結合断片である場合、可変領域のアミノ酸はKabatナンバリングにしたがって表される。定常領域のアミノ酸は、前出のKabat（Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987年および1991年）で報告されている「EUナンバリング」または「EUインデックス」で表される。
GPC3の発現量の測定
本発明は、患者に対するGPC3標的治療剤の有効性を決定する方法であって、当該患者から単離された生物学的試料中の1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量を測定する工程を含む方法に関する。
生物学的試料
本発明において「生物学的試料」とは、対象から単離される組織または流体の試料をいう。そのような試料の非限定な一態様として、例えば血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚、気道、腸管、および尿生殖路の外部切片、涙、唾液、痰、乳、全血またはあらゆる血液画分、血液誘導体、血球、腫瘍、神経組織、器官またはあらゆるタイプの組織、洗浄により得られるあらゆる試料（例えば気管支系のもの）、ならびにインビトロでの細胞培養物の構成成分の試料が含まれる。
「単離された」とは、その天然の状態から「人為的」に変化されたこと、すなわち、天然で生じた場合、その本来の環境から変化および/または取り出されたことをいう。例えば、生物中に存在する細胞、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然の状態で一緒に存在する材料から分離された同じ細胞、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていることを本発明では意味する。さらに、形質転換、遺伝学的操作またはいずれの他の組換え方法によって生物に導入されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、生物（生存していても非生存でもよい）内にまだ存在している場合でも、単離されている。
本発明において、組織における1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量を検出するために用いられる生物学的試料として、被験体標品が好適に挙げられる。好ましい被験体標品は、被験体から得られた組織であり、さらに好ましくは、被験体の肝癌または肝細胞癌組織である。肝癌または肝細胞癌組織を採取する方法としては公知の方法である生検（バイオプシー）が好適に用いられる。肝生検とは細く長い針が皮膚の表面から直接肝臓に刺され、肝臓の組織が採取される方法をいう。通常、針が穿刺される部位は右胸下部の肋間である。術前に超音波検査装置を用いて穿刺部の安全性が確認された上で、穿刺部が消毒される。さらに皮膚から肝臓の表面までが麻酔の対象となり、穿刺部の皮膚が小切開された後に穿刺針が穿刺される。
組織標品が顕微鏡下で透過光線によって観察されるために、組織標品が顕微鏡に使用される光線を十分に透過する程度に薄切される。薄切の前段階として組織標品が固定される。すなわち、組織・細胞の蛋白質に脱水や変性を起こさせて凝固させることによって、組織を構成する細胞が速やかに死滅し、その構造が安定化および不溶化される。まず、固定の対象とされる組織標品が、パラフィン包埋切片を作るのに適した大きさおよび形の断片として手術用メス等の刃物で切り取られる。次いで、固定を実施するために用いられる試薬である固定液中で当該断片が浸漬される。固定液としては、ホルマリン、さらに好ましくは中性緩衝ホルマリンが好適に使用される。中性緩衝ホルマリンの濃度は組織標品の特性または物性に応じて適宜選択される。濃度は1～50％、好ましくは5～25％、さらに好ましくは10～15％の間で適宜変更されて使用され得る。組織標品が浸漬された固定液が真空ポンプを用いて適宜脱気される。固定は組織標品を常圧および室温の条件下で固定液中に数時間放置することによって実施される。固定に要する時間は、1時間から7日間、好ましくは2時間から3日間、また好ましくは3時間から24時間、さらに好ましくは4時間から16時間の範囲で適宜選択され得る。固定の後にリン酸緩衝液等にさらに数時間（2時間から48時間、好ましくは3時間から24時間、さらに好ましくは4時間から16時間の範囲で適宜選択され得る時間）、適宜浸漬される。
次に、固定が適用された組織標品から、凍結切片法またはパラフィン切片法を用いて切片が好適に作製され得る。凍結切片法の好適な例としては、O.C.T.compound（Miles. Inc）中に組織を投入して凍結させたものを、クリオスタット（凍結切片作製装置）を用いて薄切する方法が挙げられる。パラフィン切片法においては、固定が適用された組織標品が包埋剤に浸漬され固められることにより、均一かつ適切な硬度が付与される。包埋剤としては、パラフィンが好適に使用され得る。固定が適用された組織標品はエタノールを用いて脱水される。具体的には、組織標品が70％エタノール、80％エタノール、100％エタノールに順次浸漬されることによって、当該組織標品が脱水される。浸漬に要する時間および回数は、1時間から数日および1回から3回の範囲で適宜選択され得る。また、室温または4℃においても浸漬され得るが、4℃において浸漬される場合には、浸漬時間は終夜等その時間が長いほうが好ましい。次いでその液相がキシレンに置換された後に、組織標品がパラフィンによって包埋される。その液相のキシレンへの置換に要する時間は1時間から数時間の範囲で適宜選択され得る。その際に、室温で置換され得るし、4℃においても置換され得るが、4℃において置換される場合には、置換の時間は、終夜等その時間が長いほうが好ましい。パラフィン包埋に要する時間および回数は、1時間から数時間および1回から4回の範囲で適宜選択され得る。その際に、室温で包埋され得るし、4℃においても包埋され得るが、4℃において包埋される場合には、包埋の時間は、終夜等その時間が長いほうが好ましい。また、パラフィン包埋反応が自動化処理されるパラフィン包埋装置（EG1160、Leica等）を用いることによって、組織標品が好適にパラフィン包埋され得る。
上述のようにしてパラフィン包埋された組織標品を台木に接着することによって「ブロック」が作製され、このブロックがミクロトームよって1から20μｍの厚さから選択される所望の厚さに薄切される。薄切された組織切片は透過性の支持体であるスライドグラス上に静置されることにより固着される。この場合において、組織切片の剥離を防止するためにスライドガラスに0.01％ポリ－L－リジン（Sigma）を塗布し乾燥させたスライドグラスも好適に使用され得る。固着された組織切片は数分から1時間の間から選択される適切な時間風乾される。
抗原賦活化
好ましい態様においては、ホルマリン固定により抗体との反応性が減弱した抗原の反応性を賦活化する。本発明においては、プロテアーゼ抗原賦活化法（PIER法）を適用することも可能であるし、熱誘導抗原賦活化法（HIER法）を適用することも可能である。また、非限定な一態様では、下記で示されるように調製される「同視され得る二つの組織標品」のうち一の標品に対して、PIER法を適用し、他方の標品に対して、HIER法を適用し、抗体と反応させたときの両者間の染色程度の相違を数値化することも可能である。
非限定な一態様においては、「生物学的試料」の項で示されるように調製され、透過性の支持体上に取り付けられた二つの組織標品が一組用意される。この当該組織標品は組織上同視され得る二つの組織標品であることが望ましい。「同視され得る」とは、相比較する二つの組織標品がその組織標品が由来する被験体標品中でほぼ同一の細胞または組織から構成されていることを意味する。例えば、隣接する切片として調製された二つの組織標品は同視され得る二つの組織標品である。本発明においても特段別に記載しない限り、「同視され得る二つの組織標品」とは隣接する切片として調製された二つの組織標品をいうが、これに加えて、隣接する切片として調製されていなくとも二つの組織標品を構成する細胞または組織の構成が当該二つの組織標品間で同視できるものであれば「同視され得る二つの組織標品」に該当する。細胞または組織の構成が当該二つの組織標品間で同視できる場合としては、例えば、（１）組織切片中の平面座標上で同一の位置に同一の細胞から由来する細胞の切片が存在する場合、（２）当該細胞の切片が当該平面座標上の同一の位置に存在する割合が少なくとも50％以上、好ましくは60％以上、また好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上である場合、等が好適に例示される。
熱誘導抗原賦活化法は、マイクロ波による加熱方法やオートクレーブによる加熱方法、または、煮沸処理による加熱方法等が適宜用いられる。液温が約98℃に保たれるように780Wの出力で煮沸処理する場合、処理等賦活化に要する時間は5分－60分の間から適宜選択され、例えば10分間である。抗原の賦活化処理は、10 mMクエン酸ナトリウム緩衝液の他、市販のTarget Retrieval Solution（DakoCytomation）等の中で行うことができる。下記の実施例においてはTarget Retrieval Solutionを使用する。賦活化処理の結果として抗GPC3抗体が認識する抗原中のエピトープが抗体との結合性を獲得して、後述する抗原と抗体の複合体の検出が可能となるものであれば、いずれの緩衝液、水溶液も好適に用いられる。
プロテアーゼ抗原賦活化法において使用されるプロテアーゼは、その種類や由来について特に限定されるものでなく、一般的に入手可能なプロテアーゼを適宜選択して使用され得る。用いられるプロテアーゼの例として、0.01N塩酸中0.05％濃度のペプシン、または、pH7.6のTris緩衝液中0.01％濃度のCaCl2をさらに含有する0.1％濃度のトリプシン、10 mMのEDTAおよび0.5％のSDSを含むpH7.8の10 mM Tris塩酸緩衝液中1～50μg/ml濃度のプロテアーゼK等が好適に挙げられる。さらにプロテアーゼKを用いる場合、その反応液のpHは6.5から9.5の間で適宜選択され、SH試薬やトリプシン阻害剤やキモトリプシン阻害剤も適宜利用され得る。ヒストファインHER2キット（MONO）（ニチレイバイオサイエンス）に添付されるプロテアーゼもこうした好適なプロテアーゼの具体例として挙げられる。プロテアーゼ抗原賦活化は通常37℃にて行われるが、反応温度は25℃から50℃の範囲内において適宜変更され得る。プロテアーゼ抗原賦活化が37℃にて行われる場合には、反応時間は例えば1分から5時間の間で適宜選択され、例えば、15分、30分、45分、1時間、2時間、3時間、4時間等である。賦活化処理が終了した後、当該処理が施された組織標品は洗浄用緩衝液によって洗浄される。洗浄用緩衝液はPBS（Phosphate buffer saline）が好適に用いられる他、Tris塩酸緩衝液も好適に使用され得る。通常、洗浄条件としては室温にて5分間の洗浄を3回実施する方法が採用されるが、洗浄の時間および温度は適宜変更され得る。
組織標品と抗GPC３抗体との反応
熱誘導抗原賦活化法による抗原賦活化処理が施された組織標品および/またはプロテアーゼ抗原賦活化法による抗原賦活化処理が施された組織標品に対して、後述される抗GPC3抗体を一次抗体として反応させる。当該反応は抗GPC3抗体が抗原中のエピトープを認識して抗原抗体複合体を形成するのに適切な条件下で実施される。通常、当該反応は4℃にて終夜、または37℃にて1時間実施されるが、反応条件は、抗体が抗原中のエピトープを認識して抗原抗体複合体を形成するのに適切な範囲で適宜変更され得る。例えば、反応温度は4℃から50℃の範囲内で変更され得るし、反応時間は1分から7日の間で変更され得る。低温での反応が実施される場合には長い時間反応させることが好ましい。一次抗体反応が終了した後、組織標品は洗浄用緩衝液によって洗浄される。洗浄用緩衝液はPBS（Phosphate buffer saline）が好適に用いられる他、Tris塩酸緩衝液も好適に使用され得る。通常、洗浄条件としては室温にて５分間の洗浄を３回実施する方法が採用されるが、洗浄の時間および温度は適宜変更され得る。
次いで、一次抗体反応が施された組織標品に対して、一次抗体を認識する二次抗体を反応させる。通常、二次抗体を可視化するための標識物質によって予め標識された二次抗体が用いられる。標識物質としては、FITC（フルオレセインイソチオシアネート）やCy2（ GE Healthcare社）、Alexa488（ Life Technologies社）、Qdot 655（Life Technologies社）等の蛍光色素、ペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ等の酵素、または金コロイド等が好適に挙げられる。
二次抗体との反応は、抗GPC3抗体と、当該抗GPC3抗体を認識する二次抗体とが抗原抗体複合体を形成するのに適切な条件下で実施される。通常、当該反応は室温または37℃にて30分乃至1時間実施されるが、抗GPC3抗体と二次抗体とが抗原抗体複合体を形成するのに適切な範囲で適宜変更され得る。例えば、反応温度は4℃から50℃の範囲内で変更され得るし、反応時間は1分から7日の間で変更され得る。低温での反応が実施される場合には長い時間反応させることが好ましい。二次抗体反応が終了した後、組織標品は洗浄用緩衝液によって洗浄される。洗浄用緩衝液はPBS（Phosphate buffer saline）が好適に用いられる他、Tris塩酸緩衝液も好適に使用され得る。通常、洗浄条件としては室温にて5分間の洗浄を3回実施する方法が採用されるが、洗浄の時間および温度は適宜変更され得る。
次に、二次抗体反応が施された組織標品に対して、標識物質を可視化する物質を反応させる。二次抗体の標識物質としてペルオキシダーゼを用いた場合には、0.02％過酸化水素水とpH 7.2の0.1 Mトリス塩酸緩衝液で0.1％濃度に調整されたDAB（ジアミノベンジジン）溶液とをインキュベート直前に等量混合することによって得られる反応液で組織標品がインキュベートされる。DABの他には、DAB-NiやAEC+（以上、DAKO）等の発色基質が適宜選択され得る。インキュベートの過程において、時折顕微鏡下で発色の程度を観察し、適切な発色が確認された段階で組織標品をＰＢＳに浸漬することによって可視化反応が止められる。
二次抗体の標識物質として、アルカリフォスファターゼを用いた場合には、BCIP（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸）/NBT（ニトロブルーテトラゾリウム）（Zymed）基質溶液（10 mM濃度のMgCl2および28 mM濃度のNaClを含有するpH9.8の50 mM炭酸ナトリウム緩衝液に、0.4 mM濃度でNBTおよび0.38 mM濃度でBCIPが溶解されたもの）で組織標品がインキュベートされる。また、BCIPおよびNBTの他には、Permanent Red、Fast Red、またはFuchsin+（以上、DAKO）等も適宜使用されうる。インキュベートに先立って、1 mM濃度の内在性アルカリフォスファターゼの阻害剤である塩化レバミソール（ナカライテスク）、0.1 M塩化ナトリウムおよび50 mM塩化マグネシウムを含む0.1 Mトリス－塩酸緩衝液（pH 9.5）と、室温にて1分から数時間プレインキュベートしてもよい。インキュベートの過程において、時折顕微鏡下で観察し、反応最終産物である紫色のホルマザンの沈着が観察された段階で、組織標品を水洗または2％ポリビニルアルコールを含むTBSによる反応停止の後、TBST（0.1％のTween20を含むTBS）にて洗浄される。金コロイドが二次抗体の標識として使用される場合には、銀増感によって金粒子に金属銀が付着されることによって金コロイドが可視化される。銀増感の方法は当業者に公知である。
FITC（フルオレセインイソチオシアネート）や Cy2（GE Healthcare社）、Alexa488（Life Technologies社）、Qdot 655（Life Technologies社）等の蛍光色素を二次抗体の標識物質として用いた場合には、可視化物質の反応工程は不要であり、当該蛍光物質の励起波長の光を照射して、放出される光が蛍光顕微鏡を用いることによって適宜検出され得る。また、当該蛍光物質の励起波長の光を照射して放出される光は、バーチャルスライドスキャナ等を用いて適宜検出することもできる。蛍光物質の検出に用いるバーチャルスライドスキャナとしては、Nano Zoomer（浜松ホトニクス）等が好適に挙げられる。
GPC3発現量の数値化
本発明は、上記の方法によって検出された組織標品中のGPC3から、当該組織標品中の腫瘍組織における、単位面積あたりのGPC3発現量または1腫瘍細胞あたりのGPC3発現量を算出することにより、GPC3発現量を数値化する方法を提供する。組織標本中の腫瘍組織は、当業者に公知の方法で適宜特定することができる。組織標品中の腫瘍組織における単位面積あたりのGPC3発現量は、組織標本中の腫瘍組織から検出された染色強度または蛍光強度等の総量を当該検出に用いた領域中の腫瘍組織の面積で割ることにより算出することができる。組織標品中の1腫瘍細胞あたりのGPC3発現量は、組織標本中の腫瘍組織から検出された染色強度または蛍光強度等の総量を当該検出に用いた腫瘍組織内に存在する細胞の数（すなわち腫瘍細胞の数）で割ることにより算出することができる。上記検出に用いた腫瘍組織内の細胞の数は、当該腫瘍組織内に存在する細胞核の数により算定することができる。すなわち、組織標品中の1腫瘍細胞あたりのGPC3発現量は、腫瘍細胞内および腫瘍細胞膜上のGPC3の存在量を腫瘍細胞数（または腫瘍細胞核数）で除して求められた数値である。
組織免疫染色スコア
WO2009116659に記載された方法にしたがって、表１に示す基準に従って算出された、陽性細胞率（Positive cell rate: PR）、細胞質または細胞膜におけるGPC3発現量は、検出された染色強度（Staining intensity of cytoplasm: SI-cp, Staining intensity of cell membrane: SI-cm）および細胞膜染色パターン（Staining pattern of cell membrane: Sp-cm）の各々のスコアを式１および式２の計算式にもとづいて加算して得られるスコアが、本発明の非限定なGPC3の組織免疫染色スコア（便宜的に、「複合評価スコア１」と呼ぶ）として例示される。
Figure 0007096667000001
式１
IHC total = PR + SI-Cp + SI-Cm + Sp-Cm
式２
IHC cm = PR + SI-Cm + Sp-Cm
Figure 0007096667000002
他に、細胞膜、もしくは細胞質内の領域の面積で割ることにより算出することができる。組織標品中の1腫瘍細胞あたりのGPC3発現量は、検出された染色強度を0～3に分類し、それぞれの染色または蛍光強度を示す細胞の割合を元に算出するHスコア（文献：KS. McCarty Jr. et al., Use of a monoclonal anti-Estrogen receptor antibody in the immunohistochemical evaluation of human tumors. Cancer Res. 等の総量を当該検出に用いた領域内に存在する細胞の数で割ることにより算出することができる。上記検出に用いた領域内の細胞の数は、当該領域内に存在する細胞核の数により算定することができる (1986) 46, 4244s-4248s）が知られている。
一方で、膜、ならびに細胞質の染色強度、染色の割合を元に0～3+に分類する下記スコアリングアルゴリズムおよび同アルゴリズムにもとづく評価スコア（複合評価スコア２）が例示される。
Figure 0007096667000003
本発明において、「GPC3の組織免疫染色スコア」としては、例えばこれらの複合評価スコア１、Hスコア、複合評価スコア２等の単独でまたはこれらを組み合わせて用いることが可能である。非限定の一態様としては、「GPC3の組織免疫染色スコア」は複合評価スコア１が使用され得るし、別の非限定の一態様としては、「GPC3の組織免疫染色スコア」は複合評価スコア２が使用され得る。非限定の一態様としては、「GPC3の組織免疫染色スコア」は、GPC3組織免疫染色における細胞膜Hスコアまたは細胞質Hスコアである。
組織標品中の腫瘍細胞の密度と腫瘍細胞のサイズ
腫瘍細胞の密度は、組織標品中の、腫瘍組織における単位面積当たりの細胞数（すなわち腫瘍細胞数）をカウントすることにより決定することができる。また、腫瘍細胞のサイズは、組織標品中の、腫瘍組織の面積を、当該腫瘍組織内に存する細胞数（すなわち腫瘍細胞数）で除することにより決定することができる。GPC3を発現する腫瘍細胞の密度は、組織標品中の腫瘍組織における単位面積当たりのGPC3発現細胞数（すなわちGPC3を発現する腫瘍細胞数）をカウントすることにより決定することができる。また、GPC3を発現する腫瘍細胞のサイズは、組織標品中の、腫瘍細胞の面積の総和をGPC3発現細胞数（すなわちGPC3を発現する腫瘍細胞数）で除することにより決定することができる。この態様において、対象は、GPC3標的治療剤未治療例の患者とすることができる。
免疫蛍光デジタルスライド（Immnoflorescent quantification digital slide、IQD）
本明細書では、「免疫蛍光デジタルスライド」とは、蛍光標識された二次抗体が反応した免疫組織学像であって、コンピュータに取り込まれた画像を意味する。デジタル化してコンピュータに保存することにより破損や退色などの心配がないスライド（デジタルスライド）として、蛍光像を保存することができることが知られている。デジタルスライドでは、染色像の保存性の高さおよび染色度合いの定量性の高さから、非蛍光の染色組織像を保存することできる。本明細書では、デジタルスライドを「バーチャルスライド」と呼ぶことがある。本発明の好ましい態様においては、二次抗体反応が施された組織標品が免疫蛍光デジタルスライド（Immnoflorescent quantification digital slide、IQD）により評価され、当該組織標品中の腫瘍組織における単位面積あたりのGPC3発現量または1腫瘍細胞あたりのGPC3発現量が算出される。免疫蛍光デジタルスライドによる評価においては、二次抗体反応が施された組織標品を上記バーチャルスライドスキャナでスキャンし、組織標品からバーチャルスライドを作製する。作製されたバーチャルスライド（IQDイメージ）からGPC3の発現量を測定するために適した領域を選択し、当該領域における腫瘍組織の蛍光強度を測定する。蛍光強度の測定に用いるソフトウェアとしては、ViwePlus software（浜松ホトニクス）等が好適に用いられる。
本発明の非限定な一態様では、IQDを用いて測定されるGPC3の発現量は、例えば、IQD Intensity ScoreまたはIQD Cell Score等によって表示され得る。IQD Intensity Scoreは、組織標品中の腫瘍組織における単位面積あたりのGPC3発現量を表すスコアであり、上記選択された領域中の腫瘍組織の蛍光強度の総量を当該腫瘍組織の面積で割ることにより算出される。IQD Cell Scoreは、組織標品中の1腫瘍細胞あたりのGPC3発現量を表すスコアであり、上記選択された領域における腫瘍組織の蛍光強度の総量を当該腫瘍組織内の細胞数（すなわち腫瘍細胞数）で割ることにより算出される。上記腫瘍組織内の細胞数は、当該腫瘍組織内に存在する細胞核の数により算定することができる。上記IQD Intensity ScoreまたはIQD Cell Scoreは、非癌部の蛍光強度で補正した数値を用いてもよいし、補正しない数値を用いてもよい。
IQD Cell Scoreの算出において、組織標品中の選択された領域における腫瘍組織内に存在する細胞核の数の算定は、あらかじめ染色し可視化した細胞核の数を測定する。細胞核の染色方法は、特に限定されず、例えばHematoxilin染色などを挙げることができる。IQD Cell Scoreによる評価に供される組織標品は、例えば、細胞核を染色した後に抗GPC3抗体と反応させ、上記バーチャルスライドスキャナを用いて細胞核の数とGPC3の発現量を同時に測定してもよい。また、例えば、先に抗GPC3抗体と反応させて上記バーチャルスライドスキャナを用いてGPC3の発現量を測定し、その後細胞核を染色し、再度上記バーチャルスライドスキャナを用いて細胞核の数を測定してもよい。このように、免疫蛍光デジタルスライドにより、データの長期的な保存が可能となる他、GPC3の発現量、腫瘍組織における単位面積あたりのGPC3の発現量および1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量をより簡便に定量性高く測定することができる。
Fcγ受容体多型の確認
本発明の非限定な一態様では、上記の方法によって検出された生物学的試料における1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量の測定に加えて、対象となる患者がFcγ受容体の遺伝子多型を有するかどうかを確認する工程を含む方法も提供される。本発明において、対象となる患者がFcγ受容体の遺伝子多型を有するかどうか確認する方法は、特に限定されない。例えば、対象となる患者から生物学的試料を採取し、採取した試料からゲノム遺伝子を単離してFcγ受容体に該当する遺伝子の塩基配列を決定することによって確認することができる。具体的には例えば、Journal of Clinical Oncology, vol.21, No.21 (2003) pp3940-3947に記載の方法に従って測定することができる。ここで採取される生物学的試料は、患者由来のゲノム遺伝子を取得することのできる試料であれば特に限定されず、例えば、末梢血、皮膚切片などが挙げられる。
遊離GPC3濃度の測定
本発明の非限定な一態様では、上記の方法によって検出された生物学的試料における1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量の測定に加えて、GPC3標的治療剤を投与される前の患者および／またはGPC3標的治療剤を投与された患者から単離された生物学的試料中の遊離GPC3濃度を測定する工程を含む方法も提供される。「GPC3標的治療剤を投与される前の患者」とは、癌であると診断された患者であって、GPC3標的治療剤を投与された経歴のない患者をいい、さらに、当該患者は、上述の組織における1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量からGPC3標的治療剤が有効であると決定されていてもよい。また、「GPC3標的治療剤を投与された患者」とは、GPC3標的治療剤を投与された経歴を有する患者をいう。
「遊離GPC3」とは、GPC3を発現する細胞にアンカーされていないGPC3をいい、生体内または試験管内の特定の条件下でGPC3を発現する細胞にアンカーされたGPC3から容易に解離し得る分泌型GPC3断片を含む。「遊離GPC3」の非限定な一態様として、配列番号：１で規定されるポリペプチドからなるGPC3の３５８位よりアミノ末端側のポリペプチド、配列番号：１で規定されるポリペプチドからなるGPC3の３７４位よりアミノ末端側のポリペプチド、カルボキシ末端に存在するGPIアンカーが分解され遊離したGPC3ポリペプチドおよびそれらの断片等が例示され得る（WO2004/038420）。遊離GPC3の構造を特定するために当業者は公知の手法を適宜選択することが可能である。非限定の態様として上記特許文献７に記載された方法等によって患者またはモデル動物の血漿中に存在する遊離GPC3を直接検出してその構造を解析する方法のほか、たとえば試験管内で培養された細胞に発現するGPC3にコンバルターゼ、フォスフォリパーゼDまたはNotum等の遊離GPC3を解離する酵素が作用することによって生じた遊離GPC3を検出してその構造を解析する方法等も適宜使用され得る（J.Cell.Biol. (2003) 163 (3), 625-635等）。
非限定な一態様として、WO2014/097648に記載された方法にしたがって、GPC3標的治療剤を投与される前の患者および／またはGPC3標的治療剤を投与された患者から単離された生物学的試料中の遊離GPC3濃度を測定することができる。
GPC3標的治療剤
本発明において「GPC3標的治療剤」という用語は、GPC3により媒介されるシグナル経路を含めた、GPC3の生物学的活性の遮断、抑制、阻害、または低減をもたらす、またはGPC3を発現する細胞に対する細胞傷害をもたらすあらゆる分子をいう。「標的治療」という用語は、生物学的作用のある特定のメカニズムも示唆するものではなく、GPC3の薬理学的、生理学的、および生化学的相互作用のうち可能性のある作用をすべて含む概念である。GPC3標的治療剤の例として、（１）GPC3に結合するリガンドに対するGPC3の結合の拮抗阻害剤または非拮抗阻害剤、よってGPC3とそのリガンドとの結合に干渉する作用物質、（２）GPC3とそのリガンドとの結合には干渉しないが、その代わり、GPC3によるそのリガンドに対する結合によって生じる活性を阻害または減少させる作用物質、（３）GPC3の発現を減少させる作用物質、（４）GPC3を発現する細胞に対して細胞傷害活性を誘起することが可能な作用物質、が含まれる。リガンドの非限定な一態様として、wnt（Cancer Res. (2005) 65, 6245-6254）、IGF-II（Carcinogenesis (2008) 29 (7), 1319-1326）またはFibroblast Growth Factor 2（Int. J. Cancer (2003) 103 (4), 455-465）等が例示され得る。このような作用物質の非限定な一態様として、抗体（その抗原結合ドメインまたは断片を含む）、核酸分子（アンチセンスまたはRNAi分子等）、ペプチド、非ペプチド低分子有機物、免疫細胞等が含まれ得る。
本発明のGPC3標的治療剤として使用される非ペプチド性の低分子有機物の非限定な一態様として、メチル化抑制遺伝子に作用する非ペプチド性の低分子キノリン誘導体（WO2008/046085）等が例示される。また、細胞傷害性T細胞の細胞傷害活性を誘起するHLA-A2拘束性GPC3ペプチド144-152（配列番号：２）またはHLA-A24拘束性GPC3ペプチド298-306（配列番号：３）（Clin. Cancer Res. (2006) 12 (9), 2689-2697）等もまた例示され得る。
本発明のGPC3標的治療剤として使用される免疫細胞の非限定な一態様として、GPC3キメラ抗原受容体（CAR）遺伝子導入T細胞（WO2014/180306）等もまた例示され得る。
GPC3標的治療剤と他の抗がん剤との併用
本発明のGPC3標的治療剤は、1または2以上の抗がん剤を、同一の製剤または別々の製剤で、同時または別々に投与して併用してもよい。本発明のGPC3標的治療剤と併用するのに適当な抗がん剤は化学療法剤であり、好ましくはマルチキナーゼ阻害剤であり、さらに好ましくは、ソラフェニブまたはスニチニブである。抗GPC3標的治療剤と併用される抗がん剤は当該抗GPC3標的治療剤とは結合されていない。抗GPC3標的治療剤と抗がん剤は、両者がともに含有される配合剤の形で提供されてもよいし、両者が別々に提供され、同時に、別々に、または順次に使用されてもよい。さらに、GPC3標的治療剤と抗がん剤から構成されるキットとして提供されてもよい。
抗GPC3抗体
本発明のGPC3標的治療剤として使用される抗GPC3抗体の非限定な一態様として、（BioMosaic社よりカタログ番号B0134Rのもとに販売されている）1G12抗体（WO2003/100429）に細胞傷害性物質が連結された抗体薬物複合体（Antibody drug conjugate（ADC））（WO2007/137170）、または抗GPC3一本鎖抗体（single chain variable fragment; scFv）（CN103833852）等が例示され得る。
また、上記と異なる非限定な一態様として、WO2006/006693またはWO2009/041062に記載されたヒト化抗GPC3抗体が例示される。すなわち、配列番号：４、配列番号：５、および配列番号：６でそれぞれ表される重鎖CDR1、重鎖CDR2および重鎖CDR3、ならびに配列番号：７、配列番号：８、および配列番号：９でそれぞれ表される軽鎖CDR1、軽鎖CDR2および軽鎖CDR3を含むヒト化抗GPC3抗体が、本発明のGPC3標的治療剤として使用され得る。当該ヒト化抗GPC3抗体の作製に際して、配列番号：１０で表される重鎖フレームワーク配列または配列番号：１１で表される軽鎖フレームワーク配列と配列の同一性が高いヒトフレームワーク配列が適宜選択の上でヒト化の際のテンプレートとして使用される。
さらに異なる非限定な一態様として、配列番号：１２、配列番号：１３、および配列番号：１４でそれぞれ表される重鎖CDR1、重鎖CDR2および重鎖CDR3、ならびに配列番号：１５、配列番号：１６、および配列番号：１７でそれぞれ表される軽鎖CDR1、軽鎖CDR2および軽鎖CDR3を含む抗GPC3キメラ抗体またはヒト化抗GPC3抗体が、本発明のGPC3標的治療剤として使用され得る。当該ヒト化抗GPC3抗体の作製に際して、配列番号：１８で表される重鎖フレームワーク配列または配列番号：１９で表される軽鎖フレームワーク配列と配列の同一性が高いヒトフレームワーク配列が適宜選択の上でヒト化の際のテンプレートとして使用される。
別の異なる非限定な一態様として、配列番号：２０、配列番号：２１、および配列番号：２２でそれぞれ表される重鎖CDR1、重鎖CDR2および重鎖CDR3、ならびに配列番号：２３、配列番号：２４、および配列番号：２５でそれぞれ表される軽鎖CDR1、軽鎖CDR2および軽鎖CDR3を含む抗GPC3キメラ抗体またはヒト化抗GPC3抗体が、本発明のGPC3標的治療剤として使用され得る。当該ヒト化抗GPC3抗体の作製に際して、配列番号：２６で表される重鎖フレームワーク配列または配列番号：２７で表される軽鎖フレームワーク配列と配列の同一性が高いヒトフレームワーク配列が適宜選択の上でヒト化の際のテンプレートとして使用される。
さらに別の異なる非限定な一態様として、配列番号：２８、配列番号：２９、および配列番号：３０でそれぞれ表される重鎖CDR1、重鎖CDR2および重鎖CDR3、ならびに配列番号：３１、配列番号：３２、および配列番号：３３でそれぞれ表される軽鎖CDR1、軽鎖CDR2および軽鎖CDR3を含む抗GPC3キメラ抗体またはヒト化抗GPC3抗体が、本発明のGPC3標的治療剤として使用され得る。当該ヒト化抗GPC3抗体の作製に際して、配列番号：３４で表される重鎖フレームワーク配列または配列番号：３５で表される軽鎖フレームワーク配列と配列の同一性が高いヒトフレームワーク配列が適宜選択の上でヒト化の際のテンプレートとして使用される。
また、別の異なる非限定な一態様として、配列番号：３６、配列番号：３７、および配列番号：３８でそれぞれ表される重鎖CDR1、重鎖CDR2および重鎖CDR3、ならびに配列番号：３９、配列番号：４０、および配列番号：４１でそれぞれ表される軽鎖CDR1、軽鎖CDR2および軽鎖CDR3を含む抗GPC3キメラ抗体またはヒト化抗GPC3抗体が、本発明のGPC3標的治療剤として使用され得る。当該ヒト化抗GPC3抗体の作製に際して、配列番号：４２で表される重鎖フレームワーク配列または配列番号：４３で表される軽鎖フレームワーク配列と配列の同一性が高いヒトフレームワーク配列が適宜選択の上でヒト化の際のテンプレートとして使用される。
また、さらに別の異なる非限定な一態様として、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、および配列番号：５０で表される重鎖可変領域の群から選択される重鎖可変領域、ならびに配列番号：５１で表される軽鎖可変領域を含むヒト化抗GPC3抗体が、本発明のGPC3標的治療剤として使用され得る。その他の非限定な一態様として、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、および配列番号：５０で表される重鎖可変領域の群から選択される重鎖可変領域、ならびに配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、および配列番号：６６で表される軽鎖可変領域の群から選択される軽鎖可変領域を含むヒト化抗GPC3抗体が、本発明のGPC3標的治療剤として使用され得る。
また、別の異なる非限定な一態様として、配列番号：６７で表される重鎖可変領域および配列番号：６８で表される軽鎖可変領域を含むヒト化抗GPC3抗体、配列番号：６９で表される重鎖可変領域および配列番号：７０で表される軽鎖可変領域を含むヒト化抗GPC3抗体、配列番号：７１で表される重鎖可変領域および配列番号：７２で表される軽鎖可変領域を含むヒト化抗GPC3抗体、または配列番号：７１で表される重鎖可変領域および配列番号：７３で表される軽鎖可変領域を含むヒト化抗GPC3抗体もまた、本発明のGPC3標的治療剤として使用され得る。
細胞傷害活性
本発明の抗GPC3抗体として、細胞傷害活性を有する抗GPC3抗体が例示される。本発明において細胞傷害活性の非限定な例として、例えば抗体依存性細胞介在性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC）活性、補体依存性細胞傷害（complement-dependent cytotoxicity：CDC）活性およびT細胞による細胞傷害活性等が挙げられる。本発明において、CDC活性とは補体系による細胞傷害活性を意味する。一方ADCC活性とは、標的細胞の細胞膜に発現された膜型分子に結合する抗原結合ドメインを含む抗原結合分子のFc領域に、免疫細胞等が当該免疫細胞に発現したFcγレセプターを介して結合し、当該免疫細胞が標的細胞に傷害を与える活性を意味する。目的の抗原結合分子がADCC活性を有するか否か、又はCDC活性を有するか否かは公知の方法により測定され得る（例えば、Current protocols in Immunology, Chapter7. Immunologic studies in humans、Coliganら編(1993)等）。
具体的には、まず、エフェクター細胞、補体溶液、標的細胞が調製される。
（１）エフェクター細胞の調製
CBA/Nマウスなどから摘出された脾臓から、RPMI1640培地（Invitrogen）中で脾臓細胞が分離される。10％ウシ胎児血清（FBS、HyClone）を含む同培地で洗浄された当該脾臓細胞の濃度を5×106/mLに調製することによって、エフェクター細胞が調製され得る。
（２）補体溶液の調製
10％ FBS含有培地（Invitrogen）によってBaby Rabbit Complement（CEDARLANE）を10倍に希釈することによって、補体溶液が調製され得る。
（３）標的細胞の調製
抗原を発現する細胞を0.2 mCiの51Cr-クロム酸ナトリウム（GEヘルスケアバイオサイエンス）とともに、10％ FBS含有DMEM培地中で37℃にて１時間培養することにより該標的細胞が放射性標識され得る。放射性標識後、10％ FBS含有RPMI1640培地にて３回洗浄された細胞の濃度を2×105/mLに調製することによって、当該標的細胞が調製され得る。
ADCC活性、又はCDC活性は下記に述べる方法により測定され得る。ADCC活性の測定の場合は、96ウェルＵ底プレート（Becton Dickinson）に加えられた各50μlずつの標的細胞と抗原結合分子が氷上にて15分間反応させられる。その後、エフェクター細胞100μlが加えられた当該プレートが、炭酸ガスインキュベーター内で4時間静置される。抗体（抗原結合分子）の終濃度は例えば0または10μg/ml等の濃度が設定され得る。静置後、各ウェルから回収された100μlの上清の放射活性が、ガンマカウンター（COBRAII AUTO-GAMMA、MODEL D5005、Packard Instrument Company）を用いて測定される。測定値を用いて細胞傷害活性（％）が(A-C) / (B-C) x 100の計算式に基づいて計算され得る。Aは各試料における放射活性（cpm）、Bは1％ NP-40（nacalai tesque)を加えた試料における放射活性（cpm）、Cは標的細胞のみを含む試料の放射活性（cpm）を表す。
一方、CDC活性の測定の場合は、96ウェル平底プレート（Becton Dickinson）に加えられた各50μlずつの標的細胞と抗原結合分子が氷上にて15分間反応させられる。その後、補体溶液100μlが加えられた当該プレートが、炭酸ガスインキュベーター内で４時間静置される。抗体抗原結合分子の終濃度は例えば0または3μg/mL等の濃度が設定され得る。静置後、各ウェルから回収された100μlの上清の放射活性が、ガンマカウンターを用いて測定される。細胞傷害活性はADCC活性の測定と同様に計算され得る。
細胞傷害性物質
また、本発明の抗GPC3抗体の非限定な一態様として、細胞傷害性物質が連結された抗GPC3抗体も例示される。そのような抗GPC3-抗体薬物複合体（Antibody drug conjugate（ADC））はWO2007/137170等に具体的に開示されているがこれに限定されない。すなわち、細胞傷害性物質としては、以下に例示される化学療法剤であってもよく、またAlleyら（Curr. Opin. Chem. Biol. (2010) 14, 529-537）やWO2009/140242に開示されている化合物であってもよく、これらの化合物が適切なリンカー等で抗原結合分子に結合される。
本発明の抗GPC3抗体に結合される化学療法剤が以下に例示され得る；アザリビン（azaribine）、アナストロゾール（anastrozole）、アザシチジン（azacytidine）、ブレオマイシン（bleomycin）、ボルテゾミブ（bortezomib）、ブリオスタチン-1（bryostatin-1）、ブスルファン（busulfan）、カンプトテシン（camptothecin）、10-ヒドロキシカンプトテシン（10-hydroxycamptothecin）、カルムスチン（carmustine）、セレブレックス（celebrex）、クロラムブシル（chlorambucil）、シスプラチン（cisplatin）、イリノテカン（irinotecan）、カルボプラチン（carboplatin）、クラドリビン（cladribine）、シクロホスファミド（cyclophosphamide）、シタラビン（cytarabine）、ダカルバジン（dacarbazine）、ドセタキセル（docetaxel）、ダクチノマイシン（dactinomycin）、ダウノマイシングルクロニド（daunomycin glucuronide）、ダウノルビシン（daunorubicin）、デキサメタゾン（dexamethasone）、ジエチルスチルベストロール（diethylstilbestrol）、ドキソルビシン（doxorubicin）、ドキソルビシンブルクロニド（doxorubicin glucuronide）、エピルビシン（epirubicin）、エチニルエストラジオール（ethinyl estradiol）、エストラムスチン（estramustine）、エトポシド（etoposide）、エトポシドグルクロニド（etoposide glucuronide）、フロキシウリジン（floxuridine）、フルダラビン（fludarabine）、フルタミド（flutamide）、フルオロウラシル（fluorouracil）、フルオキシメステロン（fluoxymesterone）、ゲムシタビン（gemcitabine）、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート（hydroxyprogesterone caproate）、ヒドロキシウレア（hydroxyurea）、イダルビシン（idarubicin）、イフォスファミド（ifosfamide）、ロイコボリン（leucovorin）、ロムスチン（lomustine）、マイタンシノイド（maytansinoid）、メクロレタミン（mechlorethamine）、メドロキシプロゲステロンアセテート（medroxyprogesterone acetate）、メゲストロールアセテート（megestrol acetate）、メルファラン（melphalan）、メルカプトプリン（mercaptopurine）、メトトレキセート（methotrexate）、ミトキサントロン（mitoxantrone）、ミトラマイシン（mithramycin）、ミトマイシン（mitomycin）、ミトタン（mitotane）、フェニルブチレート（phenylbutyrate）、プレドニゾン（prednisone）、プロカルバジン（procarbazine）、パクリタキセル（paclitaxel）、ペントスタチン（pentostatin）、セムスチン（semustine）、ストレプトゾシン（streptozocin）、タモキシフェン（tamoxifen）、タキサン類（taxanes）、タキソール（taxol）、テストステロンプロピオネート（testosterone propionate）、サリドマイド（thalidomide）、チオグアニン（thioguanine）、チオテパ（thiotepa）、テニポシド（teniposide）、トポテカン（topotecan）、ウラシルマスタード（uracil mustard）、ビンブラスチン（vinblastine）、ビノレルビン（vinorelbine）、ビンクリスチン（vincristine）。
本発明において、好ましい化学療法剤は、低分子の化学療法剤である。低分子の化学療法剤は、本発明の抗GPC3-抗体薬物複合体が結合した後も、抗GPC3抗体の機能に干渉する可能性が低い。本発明において、低分子の化学療法剤は、通常100～2000、好ましくは200～1000の分子量を有する。ここに例示した化学療法剤は、いずれも低分子の化学療法剤である。これらの本発明における化学療法剤は、生体内で活性な化学療法剤に変換されるプロドラッグを含む。プロドラッグの活性化は酵素的な変換であり得るし、非酵素的な変換でもあり得る。
また、本発明の抗GPC3-抗体薬物複合体に連結される細胞傷害性物質としては、シュードモナスエキソソキシンＡ（Pseudomonas exotoxin A）、サポリン－ｓ６（Saporin-s6）、ジフテリア毒素（Diphtheria toxin）、クニダリア毒素（Cnidarian toxin）等の毒性ペプチド（トキシン）や放射性ヨウ素（Radioiodine）、光増感剤（Photosensitizer）も例示され得る。毒性ペプチドの例としては、例えば、次のものが好適に挙げられる。ジフテリアトキシンＡ鎖（Diphtheria toxin A Chain）（Langoneら（Methods in Enzymology (1983) 93, 307-308））；
シュードモナスエキソトキシン（Pseudomonas Exotoxin）（Nature Medicine (1996) 2, 350-353）；
リシンＡ鎖（Ricin A Chain）（Fultonら（J. Biol. Chem. (1986) 261, 5314-5319）、Sivamら（Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173）、Cumberら、（J. Immunol. Methods (1990) 135,15-24、Wawrzynczakら（Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562）、およびGheeiteら（J. Immunol.Methods (1991) 142,223-230））；
無糖鎖リシンＡ鎖（Deglycosylated Ricin A Chain）（Thorpeら（Cancer Res. (1987) 47, 5924-5931））；
アブリンＡ鎖（Abrin A Chain）（Wawrzynczakら（Br. J. Cancer (1992) 66, 361-366）、Wawrzynczakら（Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562）、Sivamら（Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173）、およびThorpeら（Cancer Res. (1987) 47, 5924-5931））；
ゲロニン（Gelonin）（Sivamら（Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173）、Cumberら（J. Immunol. Methods (1990) 135, 15-24）、Wawrzynczakら（Cancer Res., (1990) 50, 7519-7562）、およびBolognesiら（Clin. exp. Immunol. (1992) 89, 341-346））；
ポークウイード抗ウィルス蛋白（PAP-s; Pokeweed anti-viral protein fromseeds）（Bolognesiら（Clin. exp. Immunol. (1992) 89, 341-346））；
ブリオジン（Bryodin）（Bolognesiら（Clin. exp. Immunol. (1992) 89, 341-346））；
サポリン（Saporin）（Bolognesiら（Clin. exp. Immunol. (1992) 89, 341-346））；
モモルジン（Momordin）（Cumberら（J. Immunol. Methods (1990) 135, 15-24）；Wawrzynczakら（Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562）、およびBolognesiら（Clin. exp. Immunol. (1992) 89, 341-346））；
モモルコキン（Momorcochin）（Bolognesiら（Clin. exp. Immunol. (1992) 89, 341-346））；
ジアンシン３２（Dianthin 32）（Bolognesiら（Clin. exp. Immunol. (1992) 89, 341-346））；
ジアンシン３０（Dianthin 30）（Stirpe F., Barbieri L.（FEBS letter (1986) 195, 1-8））；
モデッシン（Modeccin）（Stirpe F., Barbieri L.（FEBS letter (1986) 195, 1-8））；
ビスカミン（Viscumin）（Stirpe F., Barbieri L.（FEBS letter (1986) 195, 1-8））；
ボルケシン（Volkensin）（Stirpe F., Barbieri L.（FEBS letter (1986) 195, 1-8））；
ドデカンドリン（Dodecandrin）（Stirpe F., Barbieri L.（FEBS letter (1986) 195, 1-8））；
トリチン（Tritin）（Stirpe F., Barbieri L.（FEBS letter (1986) 195, 1-8））；
ルフィン（Luffin）（Stirpe F., Barbieri L.（FEBS letter (1986) 195, 1-8））；および
トリコキリン（Trichokirin）（Casellasら（Eur. J. Biochem. (1988) 176, 581-588）、およびBolognesiら（Clin. exp. Immunol., (1992) 89, 341-346)）。
一方、本発明の抗GPC3-抗体薬物複合体による細胞傷害活性の測定の場合は、96ウェル平底プレート（Becton Dickinson）に、標的細胞と、当該抗GPC3-抗体薬物複合体の50 μlずつが加えられ、氷上にて15分間の反応が実施される。当該プレートは炭酸ガスインキュベーター内で１から４時間インキュベートされる。抗GPC3-抗体薬物複合体の終濃度は0から3μg/mlの範囲内で適宜使用され得る。培養後、100 μlの上清が回収され、ガンマカウンターで当該上清が有する放射活性が測定される。細胞傷害活性はADCC活性の測定と同様にして計算され得る。
Fc領域
本発明の抗GPC3抗体に含まれる定常領域に含まれるFc領域は、ヒトIgGから取得され得るが、IgGの特定のサブクラスに限定されるものでもない。Fc領域とは、EUナンバリングで表されるおよそ216位のアミノ酸における、パパイン切断部位のヒンジ領域のN末端から、当該ヒンジ、CH2およびCH3ドメインを含める抗体の重鎖定常領域をいう。当該Fc領域の好適な例として、後述されるようにFcγレセプターに対する結合活性を有するFc領域が挙げられる。そのようなFc領域の非限定な一態様として、ヒトIgG1（配列番号：７４）、IgG2（配列番号：７５）、IgG3（配列番号：７６）、またはIgG4（配列番号：７７）で表される定常領域に含まれるFc領域が例示される。
Fcγレセプター（FcγR）
Fcγレセプター（FcγRとも記載される）とは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4モノクローナル抗体のFc領域に結合し得るレセプターをいい、実質的にFcγレセプター遺伝子にコードされるタンパク質のファミリーのいかなるメンバーをも意味する。ヒトでは、このファミリーには、アイソフォームFcγRIa、FcγRIbおよびFcγRIcを含むFcγRI（CD64）；アイソフォームFcγRIIa（アロタイプH131およびR131を含む。 即ち、FcγRIIa (H)およびFcγRIIa (R)）、FcγRIIb（FcγRIIb-1およびFcγRIIb-2を含む）およびFcγRIIcを含むFcγRII（CD32）；およびアイソフォームFcγRIIIa（アロタイプV158およびF158を含む。即ち、FcγRIIIa (V)およびFcγRIIIa (F)）およびFcγRIIIb（アロタイプFcγRIIIb-NA1およびFcγRIIIb-NA2を含む）を含むFcγRIII（CD16）、ならびにいかなる未発見のヒトFcγR類またはFcγRアイソフォームまたはアロタイプも含まれるが、これらに限定されるものではない。FcγRは、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルを含むが、これらに限定されるものではない、いかなる生物由来でもよい。マウスFcγR類には、FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、FcγRIII（CD16）およびFcγRIII-2（FcγRIV、CD16-2）、並びにいかなる未発見のマウスFcγR類またはFcγRアイソフォームまたはアロタイプも含まれるが、これらに限定されない。こうしたFcγレセプターの好適な例としてはヒトFcγRI（CD64）、FcγRIIa（CD32）、FcγRIIb（CD32）、FcγRIIIa（CD16）及び/又はFcγRIIIb（CD16）が挙げられる。ヒトFcγRIのポリペプチド配列は配列番号：７８（NP＿000557.1）に、ヒトFcγRIIa（アロタイプH131）のポリペプチド配列は配列番号：７９（AAH20823.1）に（アロタイプR131は配列番号：７９の166番目のアミノ酸がArgに置換されている配列である）、FcγRIIbのポリペプチド配列は配列番号：８０（AAI46679.1）に、FcγRIIIaのポリペプチド配列は配列番号：８１（AAH33678.1）に、およびFcγRIIIbのポリペプチド配列は、配列番号：８２（AAI28563.1）に記載されている（カッコ内はRefSeq等のデータベース登録番号を示す）。Fcγレセプターが、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4モノクローナル抗体のFc領域に結合活性を有するか否かは、FACSやELISAフォーマットのほか、ALPHAスクリーン（Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay）や表面プラズモン共鳴（SPR）現象を利用したBIACORE法等の公知の方法によって確認され得る（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2006) 103 (11), 4005-4010）。
FcγRIa、FcγRIbおよびFcγRIcを含むFcγRI（CD64）ならびにアイソフォームFcγRIIIa（アロタイプV158およびF158を含む）およびFcγRIIIb（アロタイプFcγRIIIb-NA1およびFcγRIIIb-NA2を含む）を含むFcγRIII（CD16）は、IgGのFc領域と結合するα鎖と細胞内に活性化シグナルを伝達するITAMを有する共通γ鎖が会合する。一方、アイソフォームFcγRIIa（アロタイプH131およびR131を含む）およびFcγRIIcを含むFcγRII（CD32）の自身の細胞質ドメインにはITAMが含まれている。これらのレセプターは、マクロファージやマスト細胞、抗原提示細胞等の多くの免疫細胞に発現している。これらのレセプターがIgGのFc領域に結合することによって伝達される活性化シグナルによって、マクロファージの貪食能や炎症性サイトカインの産生、マスト細胞の脱顆粒、抗原提示細胞の機能亢進が促進される。上記のように活性化シグナルを伝達する能力を有するFcγレセプターは、本明細書において活性型Fcγレセプターと呼ばれる。
一方、FcγRIIb（FcγRIIb-1およびFcγRIIb-2を含む）の自身の細胞質内ドメインには抑制型シグナルを伝達するITIMが含まれている。B細胞ではFcγRIIbとB細胞レセプター（BCR）との架橋によってBCRからの活性化シグナルが抑制される結果BCRの抗体産生が抑制される。マクロファージでは、FcγRIIIとFcγRIIbとの架橋によって貪食能や炎症性サイトカインの産生能が抑制される。上記のように抑制化シグナルを伝達する能力を有するFcγレセプターは、本明細書において抑制型Fcγレセプターと呼ばれる。
FcγRに対するFc領域の結合活性
前述されるように、本発明の抗GPC3抗体に含まれるFc領域として、Fcγレセプターに対する結合活性を有するFc領域が挙げられる。そのようなFc領域の非限定な一態様として、ヒトIgG1（配列番号：７４）、IgG2（配列番号：７５）、IgG3（配列番号：７６）、またはIgG4（配列番号：７７）で表される定常領域に含まれるFc領域が例示される。Fcγレセプターが、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4モノクローナル抗体のFc領域に結合活性を有するか否かは、FACSやELISAフォーマットのほか、ALPHAスクリーン（Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay）や表面プラズモン共鳴（SPR）現象を利用したBIACORE法等の公知の方法によって確認され得る（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2006) 103 (11), 4005-4010）。
ALPHAスクリーンは、ドナーとアクセプターの2つのビーズを使用するALPHAテクノロジーによって下記の原理に基づいて実施される。ドナービーズに結合した分子が、アクセプタービーズに結合した分子と生物学的に相互作用し、2つのビーズが近接した状態の時にのみ、発光シグナルを検出される。レーザーによって励起されたドナービーズ内のフォトセンシタイザーは、周辺の酸素を励起状態の一重項酸素に変換する。一重項酸素はドナービーズ周辺に拡散し、近接しているアクセプタービーズに到達するとビーズ内の化学発光反応を引き起こし、最終的に光が放出される。ドナービーズに結合した分子とアクセプタービーズに結合した分子が相互作用しないときは、ドナービーズの産生する一重項酸素がアクセプタービーズに到達しないため、化学発光反応は起きない。
例えば、ドナービーズにビオチン標識されたFc領域を含む抗GPC3抗体が結合され、アクセプタービーズにはグルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）でタグ化されたFcγレセプターが結合される。競合するFc領域改変体を含む抗GPC3抗体の非存在下では、天然型Fc領域を有する抗GPC3抗体とFcγレセプターは相互作用し520-620 nmのシグナルを生ずる。タグ化されていないFc領域改変体を含む抗GPC3抗体は、天然型Fc領域を有する抗GPC3抗体とFcγレセプター間の相互作用と競合する。競合の結果表れる蛍光の減少を定量することによって相対的な結合親和性が決定され得る。抗体をSulfo-NHS-ビオチン等を用いてビオチン化することは公知である。FcγレセプターをGSTでタグ化する方法としては、FcγレセプターをコードするポリヌクレオチドとGSTをコードするポリヌクレオチドをインフレームで融合した融合遺伝子が作動可能に連結されたベクターに保持した細胞等において発現し、グルタチオンカラムを用いて精製する方法等が適宜採用され得る。得られたシグナルは例えばGRAPHPAD PRISM（GraphPad社、San Diego）等のソフトウェアを用いて非線形回帰解析を利用する一部位競合（one-site competition）モデルに適合させることにより好適に解析される。
相互作用を観察する物質の一方（リガンド）をセンサーチップの金薄膜上に固定し、センサーチップの裏側から金薄膜とガラスの境界面で全反射するように光を当てると、反射光の一部に反射強度が低下した部分（SPRシグナル）が形成される。相互作用を観察する物質の他方（アナライト）をセンサーチップの表面に流しリガンドとアナライトが結合すると、固定化されているリガンド分子の質量が増加し、センサーチップ表面の溶媒の屈折率が変化する。この屈折率の変化により、SPRシグナルの位置がシフトする（逆に結合が解離するとシグナルの位置は戻る）。Biacoreシステムは上記のシフトする量、すなわちセンサーチップ表面での質量変化を縦軸にとり、質量の時間変化を測定データとして表示する（センサーグラム）。センサーグラムのカーブからカイネティクス：結合速度定数（ka）と解離速度定数(kd）が、当該定数の比からアフィニティー（KD）が求められる。BIACORE法では阻害測定法も好適に用いられる。阻害測定法の例はLazorら（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2006) 103 (11), 4005-4010）において記載されている。
Fcγレセプター（FcγR）結合改変Fc領域
本発明の抗GPC3抗体が含むFc領域として、ヒトIgG1（配列番号：７４）、IgG2（配列番号：７５）、IgG3（配列番号：７６）、またはIgG4（配列番号：７７）で表される定常領域に含まれるFc領域のほかに、天然型ヒトIgGのFc領域のFcγレセプターに対する結合活性よりもFcγレセプターに対する結合活性が高いFcγR結合改変Fc領域も適宜使用され得る。本明細書において、「天然型ヒトIgGのFc領域」とは、配列番号：７４、７５、７６または７７で例示されるヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4の定常領域に含まれるFc領域のEUナンバリング297位に結合した糖鎖がフコース含有糖鎖であるFc領域を意味する。そのようなFcγR結合改変Fc領域は、天然型ヒトIgGのFc領域のアミノ酸を改変することによって作製され得る。FcγR結合改変Fc領域のFcγRに対する結合活性が、天然型ヒトIgGのFc領域のFcγRに対する結合活性より高いか否かは、前記のFACSやELISAフォーマットのほか、ALPHAスクリーン（Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay）や表面プラズモン共鳴（SPR）現象を利用したBIACORE法等の公知の方法を用いて適宜実施され得る。
本発明において、Fc領域の「アミノ酸の改変」または「アミノ酸改変」とは、出発Fc領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列に改変することを含む。出発Fc領域の修飾改変体がpH中性域においてヒトFcγレセプターに結合することができる限り、いずれのFc領域も出発Fc領域として使用され得る。また、既に改変が加えられたFc領域を出発Fc領域としてさらなる改変が加えられたFc領域も本発明のFc領域として好適に使用され得る。出発Fc領域とは、ポリペプチドそのもの、出発Fc領域を含む組成物、または出発Fc領域をコードするアミノ酸配列を意味し得る。出発Fc領域には、抗体の項で概説された組換えによって産生された公知のFc領域が含まれ得る。出発Fc領域の起源は、限定されないが非ヒト動物の任意の生物またはヒトから取得され得る。好ましくは、任意の生物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ネコ、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、および非ヒト霊長類から選択される生物が好適に挙げられる。別の態様において、出発Fc領域はまた、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル、チンパンジー、またはヒトから取得され得る。好ましくは、出発Fc領域は、ヒトIgG1から取得され得るが、IgGの特定のクラスに限定されるものでもない。このことは、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域を出発Fc領域として適宜用いることができることを意味する。同様に、本明細書において、前記の任意の生物からのIgGの任意のクラスまたはサブクラスのFc領域を、好ましくは出発Fc領域として用いることができることを意味する。天然に存在するIgGのバリアントまたは操作された型の例は、公知の文献（Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 685-91、Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4), 460-470、Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4), 195-202、国際公開WO2009/086320、WO2008/092117、WO2007/041635、およびWO2006/105338）に記載されるがそれらに限定されない。
改変の例としては一以上の変異、例えば、出発Fc領域のアミノ酸とは異なるアミノ酸残基に置換された変異、あるいは出発Fc領域のアミノ酸に対して一以上のアミノ酸残基の挿入または出発Fc領域のアミノ酸から一以上のアミノ酸の欠失等が含まれる。好ましくは、改変後のFc領域のアミノ酸配列には、天然に生じないFc領域の少なくとも部分を含むアミノ酸配列を含む。そのような変種は必然的に出発Fc領域と100％未満の配列同一性または類似性を有する。好ましい実施形態において、変種は出発Fc領域のアミノ酸配列と約75％～100％未満のアミノ酸配列同一性または類似性、より好ましくは約80％～100％未満、より好ましくは約85％～100％未満の、より好ましくは約90％～100％未満、最も好ましくは約95％～100％未満の同一性または類似性のアミノ酸配列を有する。本発明の非限定の一態様において、出発Fc領域および本発明のFcγR結合改変Fc領域の間には少なくとも１つのアミノ酸の差がある。出発Fc領域と本発明のFcγR結合改変Fc領域のアミノ酸の違いは、特に前述のEUナンバリングで特定されるアミノ酸残基の位置の特定されたアミノ酸の違いによっても好適に特定可能である。
Fc領域のアミノ酸の改変のためには、部位特異的変異誘発法（Kunkelら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492））やOverlap extension PCR等の公知の方法が適宜採用され得る。また、天然のアミノ酸以外のアミノ酸に置換するアミノ酸の改変方法として、複数の公知の方法も採用され得る（Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357）。例えば、終止コドンの１つであるUAGコドン（アンバーコドン）の相補的アンバーサプレッサーtRNAに非天然アミノ酸が結合されたtRNAが含まれる無細胞翻訳系システム（Clover Direct（Protein Express））等も好適に用いられる。
本発明の抗原結合分子に含まれる、天然型ヒトIgGのFc領域のFcγレセプターに対する結合活性よりもFcγレセプターに対する結合活性が高いFcγR結合改変Fc領域はいかなる方法によっても取得され得るが、具体的には、出発Fc領域として用いられるヒトIgG型免疫グロブリンのアミノ酸の改変によって当該FcγR結合改変Fc領域が取得され得る。改変のための好ましいIgG型免疫グロブリンのFc領域としては、例えば、配列番号：７４、７５、７６または７７で例示されるヒトIgG（IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4、およびそれらの改変体）の定常領域に含まれるFc領域が挙げられる。
他のアミノ酸への改変は、天然型ヒトIgGのFc領域のFcγレセプターに対する結合活性よりもFcγレセプターに対する結合活性が高いかぎり、いかなる位置のアミノ酸も改変され得る。抗原結合分子が、ヒトFc領域としてヒトIgG1のFc領域を含んでいる場合、EUナンバリング297位に結合した糖鎖がフコース含有糖鎖である天然型ヒトIgGのFc領域のFcγレセプターに対する結合活性よりもFcγレセプターに対する結合活性が高い効果をもたらす改変が含まれていることが好ましい。こうしたアミノ酸の改変としては、例えば国際公開WO2007/024249、WO2007/021841、WO2006/031370、WO2000/042072、WO2004/029207、WO2004/099249、WO2006/105338、WO2007/041635、WO2008/092117、WO2005/070963、WO2006/020114、WO2006/116260およびWO2006/023403などにおいて報告されている。
そのような改変が可能なアミノ酸として、例えば、EUナンバリングで表される221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位および440位の群から選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸が挙げられる。これらのアミノ酸の改変によって、天然型ヒトIgGのFc領域のFcγレセプターに対する結合活性よりもFcγレセプターに対する結合活性が高いFc領域（FcγR結合改変Fc領域）を取得することができる。
本発明に使用するために、特に好ましい改変としては、例えば、Fc領域のEUナンバリングで表される；
221位のアミノ酸がLysまたはTyrのいずれか、
222位のアミノ酸がPhe、Trp、GluまたはTyrのいずれか、
223位のアミノ酸がPhe、Trp、GluまたはLysのいずれか、
224位のアミノ酸がPhe、Trp、GluまたはTyrのいずれか、
225位のアミノ酸がGlu、LysまたはTrpのいずれか、
227位のアミノ酸がGlu、Gly、LysまたはTyrのいずれか、
228位のアミノ酸がGlu、Gly、LysまたはTyrのいずれか、
230位のアミノ酸がAla、Glu、GlyまたはTyrのいずれか、
231位のアミノ酸がGlu、Gly、Lys、ProまたはTyrのいずれか、
232位のアミノ酸がGlu、Gly、LysまたはTyrのいずれか、
233位のアミノ酸がAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
234位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
235位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
236位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
237位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
238位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
239位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
240位のアミノ酸がAla、Ile、MetまたはThrのいずれか、
241位のアミノ酸がAsp、Glu、Leu、Arg、TrpまたはTyrのいずれか、
243位のアミノ酸がLeu、Glu、Leu、Gln、Arg、TrpまたはTyrのいずれか、
244位のアミノ酸がHis、
245位のアミノ酸がAla、
246位のアミノ酸がAsp、Glu、HisまたはTyrのいずれか、
247位のアミノ酸がAla、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、ValまたはTyrのいずれか、
249位のアミノ酸がGlu、His、GlnまたはTyrのいずれか、
250位のアミノ酸がGluまたはGlnのいずれか、
251位のアミノ酸がPhe、
254位のアミノ酸がPhe、MetまたはTyrのいずれか、
255位のアミノ酸がGlu、LeuまたはTyrのいずれか、
256位のアミノ酸がAla、MetまたはProのいずれか、
258位のアミノ酸がAsp、Glu、His、SerまたはTyrのいずれか、
260位のアミノ酸がAsp、Glu、HisまたはTyrのいずれか、
262位のアミノ酸がAla、Glu、Phe、IleまたはThrのいずれか、
263位のアミノ酸がAla、Ile、MetまたはThrのいずれか、
264位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、TrpまたはTyrのいずれか、
265位のアミノ酸がAla、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
266位のアミノ酸がAla、Ile、MetまたはThrのいずれか、
267位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
268位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、ValまたはTrpのいずれか、
269位のアミノ酸がPhe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
270位のアミノ酸がGlu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、TrpまたはTyrのいずれか、
271位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
272位のアミノ酸がAsp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
273位のアミノ酸がPheまたはIleのいずれか、
274位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
275位のアミノ酸がLeuまたはTrpのいずれか、
276位のアミノ酸が、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
278位のアミノ酸がAsp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、ValまたはTrpのいずれか、
279位のアミノ酸がAla、
280位のアミノ酸がAla、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、TrpまたはTyrのいずれか、
281位のアミノ酸がAsp、Lys、ProまたはTyrのいずれか、
282位のアミノ酸がGlu、Gly、Lys、ProまたはTyrのいずれか、
283位のアミノ酸がAla、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、ArgまたはTyrのいずれか、
284位のアミノ酸がAsp、Glu、Leu、Asn、ThrまたはTyrのいずれか、
285位のアミノ酸がAsp、Glu、Lys、Gln、TrpまたはTyrのいずれか、
286位のアミノ酸がGlu、Gly、ProまたはTyrのいずれか、
288位のアミノ酸がAsn、Asp、GluまたはTyrのいずれか、
290位のアミノ酸がAsp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、TrpまたはTyrのいずれか、
291位のアミノ酸がAsp、Glu、Gly、His、Ile、GlnまたはThrのいずれか、
292位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Pro、ThrまたはTyrのいずれか、
293位のアミノ酸がPhe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
294位のアミノ酸がPhe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
295位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
296位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、ThrまたはValのいずれか、
297位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
298位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
299位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
300位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、ValまたはTrpのいずれか、
301位のアミノ酸がAsp、Glu、HisまたはTyrのいずれか、
302位のアミノ酸がIle、
303位のアミノ酸がAsp、GlyまたはTyrのいずれか、
304位のアミノ酸がAsp、His、Leu、AsnまたはThrのいずれか、
305位のアミノ酸がGlu、Ile、ThrまたはTyrのいずれか、
311位のアミノ酸がAla、Asp、Asn、Thr、ValまたはTyrのいずれか、
313位のアミノ酸がPhe、
315位のアミノ酸がLeu、
317位のアミノ酸がGluまたはGln、
318位のアミノ酸がHis、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、ValまたはTyrのいずれか、
320位のアミノ酸がAsp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
322位のアミノ酸がAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
323位のアミノ酸がIle、
324位のアミノ酸がAsp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
325位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
326位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
327位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
328位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
329位のアミノ酸がAsp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
330位のアミノ酸がCys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
331位のアミノ酸がAsp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
332位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
333位のアミノ酸がAla、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、ValまたはTyrのいずれか、
334位のアミノ酸がAla、Glu、Phe、Ile、Leu、ProまたはThrのいずれか、
335位のアミノ酸がAsp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、TrpまたはTyrのいずれか、
336位のアミノ酸がGlu、LysまたはTyrのいずれか、
337位のアミノ酸がGlu、HisまたはAsnのいずれか、
339位のアミノ酸がAsp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、SerまたはThrのいずれか、
376位のアミノ酸がAlaまたはValのいずれか、
377位のアミノ酸がGlyまたはLysのいずれか、
378位のアミノ酸がAsp、
379位のアミノ酸がAsn、
380位のアミノ酸がAla、AsnまたはSerのいずれか、
382位のアミノ酸がAlaまたはIleのいずれか、
385位のアミノ酸がGlu、
392位のアミノ酸がThr、
396位のアミノ酸がLeu、
421位のアミノ酸がLys、
427位のアミノ酸がAsn、
428位のアミノ酸がPheまたはLeuのいずれか、
429位のアミノ酸がMet、
434位のアミノ酸がTrp、
436位のアミノ酸がIle、もしくは
440位のアミノ酸がGly、His、Ile、LeuまたはTyrのいずれか、
の群から選択される少なくともひとつ一つ以上のアミノ酸の改変が挙げられる。また、改変されるアミノ酸の数は特に限定されず、一箇所のみのアミノ酸が改変され得るし、二箇所以上のアミノ酸が改変され得る。二箇所以上のアミノ酸の改変の組合せとしては、例えば表３（表３－１～表３－３）に記載されるような組合せが挙げられる。また、天然型ヒトIgGのFc領域のFcγレセプターに対する結合活性よりもFcγレセプターに対する結合活性が高いFcγR結合改変Fc領域（FcγR結合改変Fc領域）を含む抗GPC3抗体の具体的な例が、WO2007/047291に記載されている。
Figure 0007096667000004

Figure 0007096667000005
Figure 0007096667000006
本発明の抗GPC3抗体に含まれるFcγレセプター結合ドメインとFcγレセプターとの結合活性を測定するpHの条件はpH酸性域乃至pH中性域の条件が適宜使用され得る。本発明の抗原結合分子に含まれるFcγレセプター結合ドメインとFcγレセプターとの結合活性を測定する条件としてのpH酸性域乃至pH中性域とは、通常pH5.8～pH8.0を意味する。好ましくはpH6.0 ～pH7.4の任意のpH値によって示される範囲であり、好ましくはpH6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、および7.4から選択され、特に好ましくは癌組織のpHに近いpH6.15～7.4である（Vaupelら（Cancer Res. (1989) 49, 6449-6665））。測定条件に使用される温度として、Fc領域とヒトFcγレセプターとの結合アフィニティーは、10℃～50℃の任意の温度で評価され得る。好ましくは、Fc領域とヒトFcγレセプターとの結合アフィニティーを決定するために、15℃～40℃の温度が使用される。より好ましくは、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、および35℃のいずれか1つのような20℃から35℃までの任意の温度も同様に、Fc領域とFcγレセプターとの結合アフィニティーを決定するために使用される。25℃という温度は本発明の態様の非限定な一例である。
本明細書において、FcγR結合改変Fc領域のFcγレセプターに対する結合活性が天然型Fc領域のFcγレセプターに対する結合活性よりも高いとは、FcγR結合改変Fc領域のFcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa及び/又はFcγRIIIbのいずれかのヒトFcγレセプターに対する結合活性が、これらのヒトFcγレセプターに対する天然型Fc領域の結合活性よりも高いことをいう。例えば、上記の解析方法にもとづいて、対照とするヒトIgGの天然型Fc領域を含む抗GPC3抗体の結合活性に比較してFcγR結合改変Fc領域を含む抗GPC3抗体の結合活性が、105％以上、好ましくは110％以上、115％以上、120％以上、125％以上、特に好ましくは130％以上、135％以上、140％以上、145％以上、150％以上、155％以上、160％以上、165％以上、170％以上、175％以上、180％以上、185％以上、190％以上、195％以上、2倍以上、2.5倍以上、3倍以上、3.5倍以上、4倍以上、4.5倍以上、5倍以上、7.5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、100倍以上の結合活性を示すことをいう。天然型Fc領域としては、出発Fc領域も使用され得るし、同じサブクラスの抗体の天然型Fc領域も使用され得る。
本発明では、対照とするヒトIgGの天然型Fc領域として、EUナンバリングで表される297位のアミノ酸に結合した糖鎖がフコース含有糖鎖である天然型ヒトIgGのFc領域が好適に用いられる。EUナンバリングで表される297位のアミノ酸に結合した糖鎖がフコース含有糖鎖であるか否かは、公知の手法を用いて確認され得る。例えば、下記のような方法によって、天然型ヒトIgGのFc領域に結合した糖鎖がフコース含有糖鎖であるか否かを判定することが可能である。被験天然型ヒトIgGにN-Glycosidase F（Roche diagnostics）を反応させることによって、被験天然型ヒトIgGから糖鎖が遊離される（Weitzhandlerら（J. Pharma. Sciences (1994) 83, 12, 1670-1675）。次に、エタノールを反応させてタンパク質が除かれた反応液（Schenkら（J. Clin. Investigation (2001) 108 (11) 1687-1695）の濃縮乾固物が、2-アミノベンズアミドによって蛍光標識される（Biggeら（Anal. Biochem. (1995) 230 (2) 229-238)。セルロースカートリッジを用いた固相抽出により脱試薬された、蛍光標識された2-AB化糖鎖が、順相クロマトグラフィーによって解析される。検出されるクロマトグラムのピークを観察することによって、ヒトIgGの天然型Fc領域に結合した糖鎖がフコース含有糖鎖であるか否かを判定することが可能である。
対照とする同じサブクラスの抗体の天然型Fc領域を含む抗GPC3抗体としては、IgGモノクローナル抗体のFc領域を有する抗GPC3抗体が適宜使用され得る。当該Fc領域の構造として、配列番号：７４（データベース登録番号AAC82527.1のN末にA付加）、７５（データベース登録番号AAB59393.1のN末にA付加）、７６（データベース登録番号CAA27268.1）、および７７（データベース登録番号AAB59394.1のN末にA付加）に記載される定常領域に含まれるFc領域が例示される。また、ある特定のアイソタイプの抗GPC3抗体を被検物質として使用する場合には、当該特定のアイソタイプの抗GPC3抗体を対照として用いることによって、被験Fc領域を含む抗GPC3抗体によるFcγレセプターに対する結合活性の効果が検証される。上記のようにして、Fcγレセプターに対する結合活性が高いことが検証されたFc領域を含む抗GPC3抗体が適宜選択される。
活性型Fcγレセプターに対する結合活性が抑制型Fcγレセプターに対する結合活性よりも高いFc領域
前記したように、活性型Fcγレセプターとしては、FcγRIa、FcγRIbおよびFcγRIcを含むFcγRI（CD64）、 FcγRIIaならびにアイソフォームFcγRIIIa（アロタイプV158およびF158を含む）およびFcγRIIIb（アロタイプFcγRIIIb-NA1およびFcγRIIIb-NA2を含む）を含むFcγRIII（CD16）が好適に挙げられる。また、FcγRIIb（FcγRIIb-1およびFcγRIIb-2を含む）が抑制型Fcγレセプターの好適な例として挙げられる。
本発明の非限定な一態様として、活性型Fcγレセプターに対する結合活性が抑制型Fcγレセプターに対する結合活性よりも高いFc領域を含む抗GPC3抗体が挙げられる。この場合、活性型Fcγレセプターに対する結合活性が抑制型Fcγレセプターに対する結合活性よりも高いとは、Fc領域のFcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa及び/又はFcγRIIIbのいずれかのヒトFcγレセプターに対する結合活性が、FcγRIIbに対する結合活性よりも高いことをいう。例えば、上記の解析方法にもとづいて、Fc領域を含む抗原結合分子のFcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa及び/又はFcγRIIIbのいずれかのヒトFcγレセプターに対する結合活性が、FcγRIIbに対する結合活性の、105％以上、好ましくは110％以上、120％以上、130％以上、140％以上、特に好ましくは150％以上、160％以上、170％以上、180％以上、190％以上、200％以上、250％以上、300％以上、350％以上、400％以上、450％以上、500％以上、750％以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍以上の結合活性を示すことをいう。こうしたFc領域を含むIgG抗体は、前述のADCC活性が増強されていることが知られていることから、当該Fc領域を含む抗GPC3抗体は、本発明のGPC3標的治療剤として有用である。
本発明の非限定な一態様では、活性型Fcγレセプターに対する結合活性が抑制型Fcγレセプターに対する結合活性よりも高い（活性型Fcγレセプターに対する選択的な結合活性を有する）Fc領域の例として、前述されたEUナンバリングで表される221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位および440位の群から選択される少なくともひとつ一つ以上のアミノ酸が天然型Fc領域と異なるアミノ酸に改変されているFc領域が好適に挙げられる。
本発明の非限定な一態様では、活性型Fcγレセプターに対する結合活性が抑制型Fcγレセプターに対する結合活性よりも高い（活性型Fcγレセプターに対する選択的な結合活性を有する）Fc領域の例として、表３－１から３－３に記載される複数のアミノ酸が天然型Fc領域と異なるアミノ酸に改変されているFc領域が好適に挙げられる。
糖鎖が修飾されたFc領域
本発明が提供する抗GPC3抗体に含まれるFc領域として、Fc領域に結合した糖鎖の組成がフコース欠損糖鎖を結合したFc領域の割合が高くなるように、またはバイセクティングN-アセチルグルコサミンが付加したFc領域の割合が高くなるように修飾されたFc領域も含まれ得る。抗体Fc領域に結合するN -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN -アセチルグルコサミンからフコース残基を除去すると、FcγRIIIaに対する親和性が増強されることが知られている（Satoら（Expert Opin. Biol. Ther. (2006) 6 (11), 1161-1173））。こうしたFc領域を含むIgG1抗体は、上記ADCC活性が増強されていることが知られていることから、当該Fc領域を含む抗原結合分子は、本発明の医薬組成物に含まれる抗原結合分子としても有用である。抗体Fc領域に結合するN -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN -アセチルグルコサミンからフコース残基が除去された抗体としては、例えば、次のような抗体；－グリコシル化が修飾された抗体（国際公開WO1999/054342等）、－糖鎖に付加するフコースが欠損した抗体（国際公開WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等）、が挙げられる。また、Fc領域に結合した糖鎖の組成がフコース欠損糖鎖を結合したFc領域の割合が高くなるように、またはバイセクティングN-アセチルグルコサミンが付加したFc領域の割合が高くなるように修飾されたFc領域を含む抗GPC3抗体の具体的な例が、WO2006/046751およびWO2009/ 041062に記載されている。
より具体的には、抗体Fc領域に結合するN-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンからフコース残基が除去された抗体の異なる非限定の一態様として、糖鎖に付加するフコースが欠損した抗体（国際公開WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等）を作製するために、糖鎖修飾を受けるポリペプチドの糖鎖構造を形成する活性が改変された結果、糖鎖にフコースを付加する能力が低い宿主細胞が作製される。当該宿主細胞において所望の抗体遺伝子を発現することによって、当該宿主細胞の培養液からその糖鎖中のフコースが欠損した当該抗体が回収され得る。ポリペプチドの糖鎖構造を形成する活性として、フコシルトランスフェラーゼ（EC 2.4.1.152）、フコーストランスポーター（SLC35C1）、GMD（GDP-マンノース4,6-デヒドラターゼ）（EC 4.2.1.47）、Fx（GDP-ケト-6-デオキシマンノース3，5-エピメラーゼ，4-レダクターゼ）（EC 1.1.1.271）、およびGFPP（GDP-β-L-フコースピロフォスフォリラーゼ）（EC 2.7.7.30）からなる群から選択される酵素またはトランスポーターの活性が非限定の好適な例として挙げられ得る。これらの酵素またはトランスポーターは、その活性を発揮することができれば必ずしもその構造は特定されない。本明細書においては、これらの活性を発揮することが可能なタンパク質を機能性タンパク質という。これらの活性を改変する方法の非限定の一態様として、これらの活性の欠失が挙げられる。これらの活性が欠失した宿主細胞を作製するために、これらの機能性タンパク質の遺伝子を機能不能に破壊する方法等公知の方法が適宜採用され得る（国際公開WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等）。そのような活性が欠失した宿主細胞は、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髄腫細胞、P3X63マウス骨髄腫細胞、PER細胞、PER.C6細胞、HEK293細胞、またはハイブリドーマ細胞等に内在性であるこれらの機能性タンパク質の遺伝子を機能不能に破壊する方法等によって作製され得る。
バイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を有する抗体（国際公開WO2002/079255等）が公知である。非限定な一態様では、バイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を有する抗体を作製するために、GnTIII（β-1,4-マンノシル-グリコプロテイン，4-β-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）（EC 2.4.1.144）活性またはGalT（β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ）（EC 2.4.1.38）活性を有する機能性タンパク質をコードする遺伝子を発現する宿主細胞が作製される。別の非限定の好適な一態様では、前記の機能性タンパク質に加えて、ヒトManII（マンノシダーゼII）（3.2.1.114）活性を有する機能性タンパク質をコードする遺伝子、GnTI（β-1,2-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI）（EC 2.4.1.94）活性を有する機能性タンパク質をコードする遺伝子、GnTII（β-1,2-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼII）（EC 2.4.1.143）活性を有する機能性タンパク質をコードする遺伝子、ManI（マンノシダーゼ）（EC 3.2.1.113）活性を有する機能性タンパク質をコードする遺伝子、およびα-1,6-フコシルトランスフェラーゼ（EC 2.4.1.68）と共発現する宿主細胞が作製される（国際公開WO2004/065540）。
前記のような糖鎖にフコースを付加する能力が低い宿主細胞、およびバイセクティングGlcNAc構造を含む糖鎖を形成する活性を有する宿主細胞に抗体遺伝子を含む発現ベクターを形質導入することによって、抗体Fc領域に結合するN -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN -アセチルグルコサミンからフコース残基が除去された抗体、およびバイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を有する抗体がそれぞれ作製され得る。これらの抗体の製造方法は本発明のFc領域に結合した糖鎖の組成がフコース欠損糖鎖を結合したFc領域の割合が高くなるように、またはバイセクティングN-アセチルグルコサミンが付加したFc領域の割合が高くなるように修飾された改変Fc領域を含む抗原結合分子の製造方法にも適用することが可能である。こうした製造方法によって作製された本発明の抗原結合分子に含まれるFc領域に結合した糖鎖の組成は、前記の「Fcγレセプター（FcγR）結合改変Fc領域」で記載された方法によって確認され得る。
等電点が改変された抗GPC3抗体
本発明で使用される抗GPC3抗体の非限定な一態様として、その等電点（pI）が変化するように、抗GPC3抗体のアミノ酸残基が改変されている抗GPC3抗体も例示される。本発明が提供する抗GPC3抗体における「アミノ酸残基の電荷の改変」の好適な例としては以下のものが挙げられる。pI値を増加させる改変としては、例えば、配列番号：５０で表される抗GPC3抗体の重鎖可変領域中のKabatナンバリングで表される43位のQのKへの置換、52位のDのNへの置換、105位のQのRへの置換から選択される少なくとも一つの置換を行うことができ、例えば配列番号：６７で表されるアミノ酸配列に改変される。また、例えば、配列番号：５１または配列番号：６６で表される抗GPC3抗体の軽鎖可変領域中のKabatナンバリングで表される17位のEのQへの置換、27位のQのRへの置換、105位のQのRへの置換から選択される少なくとも一つの置換を行うことができ、例えば配列番号：６８で表されるアミノ酸配列に改変される。一方、pI値を減少させる改変としては、配列番号：５０で表される抗GPC3抗体の重鎖可変領域中のKabatナンバリングで表される19位のKのTへの置換、43位のQのEへの置換、61位のGのEへの置換、62位のKのSへの置換、64位のKのQへの置換、65位のGのDへの置換から選択される少なくとも一つの置換を行うことができ、例えば配列番号：６９、配列番号：７１で表されるアミノ酸配列に改変される。また、例えば、配列番号：５１または配列番号：６６で表される抗GPC3抗体の軽鎖可変領域中のKabatナンバリングで表される24位のRのQへの置換、27位のQのEへの置換、74位のKのTへの置換、77位のRのSへの置換、107位のKのEへの置換から選択される少なくとも一つの置換を行うことができ、例えば配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７３で表されるアミノ酸配列に改変される。さらに、pI値を減少させる改変としては、配列番号：７４で表される重鎖定常領域中においてEUナンバリングで表される268位、274位、355位、356位、358位、419位から選択されるアミノ酸の少なくとも一つの置換が挙げられる。これらの置換は、例えば、配列番号３１で表される重鎖定常領域の、EUナンバリングで表される268位のHのQへの置換、274位のKのQへの置換、355位のRのQへの置換、356位のDのEへの置換、358位のLのMへの置換、419位のQのEへの置換、から選択される少なくとも一つの置換が好適な例として挙げられ得る。これらの置換の結果、ヒト抗体のIgG1の定常領域とIgG4の定常領域とのキメラ体が構築される。すなわち、当該置換によって、改変された抗体の免疫原性に影響を及ぼすことなく、所望のpIを有する抗体の作製が可能となる。
ヘテロジェニティー低減のための改変
配列番号：７４、７５、７６または７７で表されるIgGの定常領域におけるEUナンバリングで表される446位のGlyおよび447位のLysが欠損したIgG定常領域も本発明の抗GPC3抗体に含まれる定常領域として使用され得る。これらのアミノ酸を両方欠損させることにより、抗体の重鎖定常領域の末端に由来するヘテロジェニティーを低減することが可能である。
抗体の修飾
ポリペプチドの翻訳後修飾とは、ポリペプチドの生合成において翻訳されたポリペプチドに対する化学修飾をいう。抗体の一次構造はポリペプチドから形成されるため、本発明の抗GPC3抗体には、抗GPC3抗体の一次構造であるポリペプチドの翻訳後修飾を受けた修飾物も含まれる。ポリペプチドの翻訳後修飾には大きく、官能基付加、ポリペプチドまたはペプチドの付加（ISG化、SUMO化、ユビキチン化）、アミノ酸の化学的性質の変換（シリル化または脱アミン、脱アミド）、および構造変換（ジスルフィド化、プロテアーゼ分解）に分類することができる。本発明における翻訳後修飾の非限定な一態様として、ポリペプチドの形成単位であるアミノ酸残基に対するペプチド付加または官能基付加が挙げられる。かかる修飾として具体的には、リン酸化（セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸等）、グルコシル化（セリン、スレオニン、アスパラギン酸等）、アシル化（リシン）、アセチル化（リシン）、ヒドロキシル化（リシン、プロリン）、プレニル化（システイン）、パルミトイル化（システイン）、アルキル化（リシン、アルギニン）、ポリグルタミル化（グルタミン酸）、カルボキシル化（グルタミン酸）、ポリグリシル化（グルタミン酸）、シトルリン化（アルギニン）、スクシンイミド形成（アスパラギン酸）等を挙げることができる。例えば、N末端のグルタミンのピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾を受けた抗GPC3抗体も当然のことながら本発明の抗GPC3抗体に含まれる。また、例えば、二個の硫黄原子の間に形成される共有結合を意味する「ジスルフィド結合」によって重鎖と軽鎖、または重鎖同士が連結された抗GPC3抗体の翻訳後修飾物も、本発明の抗GPC3抗体に含まれる。アミノ酸のシステインに含まれるチオール基は、第二のチオール基とジスルフィド結合または架橋を形成することができる。一般的にIgG分子では、CH1およびCL領域がジスルフィド結合によって連結され、重鎖を形成する二つのポリペプチドは、EUナンバリングで表される226位および229位のシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結される。こうしたジスルフィド結合によって連結された抗GPC3抗体の翻訳後修飾物も、本発明の抗GPC3抗体に含まれる。
癌に対するGPC3標的治療剤の有効性
「癌に対するGPC3標的治療剤の有効性」または「癌に対するGPC3標的治療剤が有効である」という用語は、癌であると診断された患者において、GPC3標的治療剤が、所望のまたは有益な効果を生じさせることをいう。所望のまたは有益な効果には、（１）癌細胞のさらなる成長または拡散の阻害、（２）癌細胞の死滅、（３）癌の再発の阻害、（４）癌に関連する症候（痛みなど）の緩和、低減、軽減、阻害、もしくは前記症候の頻度の低減、または（５）患者の生存率の改善が含まれ得る。癌の再発の阻害には、放射線、化学療法、外科手術、または他の技術によりこれまでに治療されている、癌の原発部位および周辺組織での癌の成長の阻害、ならびに新たな遠位部位での癌の成長の不存在が含まれる。所望のまたは有益な効果は、患者により知覚されるものまたは他覚的なもののいずれかであり得る。例えば、患者がヒトである場合、ヒトは、改善または療法に対する応答の、患者により知覚される兆候として、気力もしくは活力の改善または痛みの減少を認識し得る。あるいは、臨床医は、身体的検査、実験的パラメーター、腫瘍マーカー、またはX線撮影による所見に基づいて、腫瘍サイズまたは腫瘍組織量の減少に気付き得る。治療に対する応答について臨床医が観察し得るいくつかの実験的兆候には、白血球数、赤血球数、血小板数、赤血球沈降速度、および様々な酵素レベルなどの、試験結果の正常化が含まれる。さらに、臨床医は、検出可能な腫瘍マーカーの減少を観察し得る。あるいは、他覚的な改善を評価するために、超音波診断、核磁気共鳴試験、および陽電子放出試験などの他の試験を用いることができる。
本発明のGPC3標的治療剤の対象となる癌は、標的となるGPC3が高発現している癌であればどのような癌も該当する。そのような癌の一例として、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、子宮体癌、頭頸部癌、肝臓癌、肺癌、悪性カルチノイド（Malignant carcinoid）、悪性神経膠腫（Malignant glioma）、悪性リンパ腫（Malignant lymphoma）、悪性黒色種（Malignant melanoma）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿路上皮癌等から選択される癌が例示される。
GPC3標的治療剤の有効性を決定する方法
本発明の非限定な一態様では、GPC3標的治療剤を投与される前の患者から単離された生物学的試料中の1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量を測定し、当該発現量が所定の値である場合に当該GPC3標的治療剤が有効であると決定する方法が提供される。「GPC3標的治療剤を投与される前の患者」とは、癌であると診断された患者であって、上述のGPC3標的治療剤を投与された経歴のない患者をいい、さらに、当該患者は、上述の腫瘍組織におけるGPC3の総発現量または単位面積あたりの発現量からGPC3標的治療剤が有効であると決定されていてもよいし、上述の腫瘍組織におけるGPC3の総発現量または単位面積あたりの発現量からGPC3標的治療剤が有効でないと決定されていてもよい。本発明のある態様では、例えば、GPC3標的治療剤が有効でないと決定された患者から、1腫瘍細胞あたりのGPC3発現量を併せて考慮することにより、現実にはGPC3標的治療剤が有効である患者を抽出することが可能である。GPC3標的治療剤の投与経路は、投与されるGPC3標的治療剤の性状等に併せて好適な投与経路が適宜選択され得る。例えば、投与経路の例として非経口投与が例示される。非経口投与のさらなる例として、例えば、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与が例示される。例えば、注射投与のさらなる例として、静脈内注射投与、筋肉内注射投与、腹腔内注射投与、皮下注射投与などによる全身または局部的な投与が例示される。
本発明の非限定な一態様では、前記患者から単離された生物学的試料中で発現している1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量を測定することを含み、ここで、当該発現量が所定の値である場合に、当該患者における癌に対するGPC3標的治療剤が有効であることが予測、予想または決定される。
本発明の非限定な一態様では、1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値であるとは1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現レベルが高いことをいい、GPC3の発現レベルが高いとは1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が設定された特定の値より高いことをいう。所定の値は、患者群における中央値（50パーセンタイル値）、55パーセンタイル値、60パーセンタイル値、65パーセンタイル値、70パーセンタイル値、75パーセンタイル値または80パーセンタイル値のいずれか、または該値より高い値とすることができる。所定の値は、例えば、複数の癌患者にGPC3標的治療剤を投与し、癌に対するGPC3標的治療剤の効果が確認できない患者群の生物学的試料中の1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量の平均値より高い範囲にある値であれば、当該GPC3標的治療剤の効果が期待できる所定の値とすることが可能である。また、例えば、複数の癌患者にGPC3標的治療剤を投与し、有意なPFS（無増悪生存期間）の延長又は有意なOS（全生存期間）の延長傾向が認められる患者群の1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量の平均値に基づき所定の値を決定することができる。また、例えば、複数の癌患者の1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量を測定し、その中央値（50パーセンタイル値）、55パーセンタイル値、60パーセンタイル値、65パーセンタイル値、70パーセンタイル値、75パーセンタイル値または80パーセンタイル値のいずれか、または該値より高い値であれば、GPC3標的治療剤による有意なPFSの延長又は有意なOSの延長傾向が認められる患者を高い確率で選択するための所定の値とすることができる。ここで複数の癌患者とは、GPC3標的治療剤の有効性を決定するための基準となる、1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量に対する所定の値を有意な値として算出できる数であればよく、100人以上が好ましく、150人以上がより好ましい。所定の値として、具体的には例えば、上述のIQD Cell Scoreが、10000, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 16100, 16200, 16300, 16400, 16500, 16600, 16700, 16800, 16900, 17000, 17100, 17200, 17300, 17400, 17500, 17600, 17700, 17800, 17900, 18000, 18100, 18200, 18300, 18400, 18500, 18600, 18700, 18800, 18900, 19000, 19100, 19200, 19300, 19400, 19500, 19600, 19700, 19800, 19900, 20000, 20100, 20200, 20300, 20400, 20500, 20600, 20700, 20800, 20900, 21000, 21100, 21200, 21300, 21400, 21500, 21600, 21700, 21800, 21900, 22000, 22100, 22200, 22300, 22400, 22500, 22600, 22700, 22800, 22900, 23000等の特定の値より高い値から決定され得る。当該特定の値は、例えば、11000から22000までの数値範囲から適宜選択され得る。好ましい数値範囲として、13000から22000、が例示される。より好ましい数値範囲として、15000から22000、さらに好ましい数値範囲として、16000から22000、17000から22000、18000から22000、19000から22000、20000から22000または21000から22000が例示されるがこれらに限定されない。当該数値範囲より選択される特定の値より高い値を所定の値とすることができる。
本発明の非限定的な一態様では、GPC3の組織免疫染色スコアのいずれかが低く（例えば、IHC totalスコア７未満または複合評価スコア２が２＋以下、１＋以下若しくは０）、通常であればGPC3標的治療剤の有効性がないか、低いと判定される患者を対象として、1腫瘍細胞あたりのGPC3発現量が所定の値である患者をGPC3標的治療剤が有効であると評価することができる。ここで、所定の値とは、上記の組織免疫染色スコアのいずれかが低い患者群の平均よりも高い、例えば、1倍以上、1.05倍以上、1.1倍以上、1.15倍以上、1.2倍以上、1.25倍以上、1.3倍以上、1.35倍以上、1.4倍以上、1.45倍以上、1.5倍以上、1.55倍以上、1.6倍以上、1.65倍以上、1.7倍以上、1.75倍以上、1.8倍以上、1.85倍以上、1.9倍以上、1.95倍以上、2倍以上、2.1倍以上、2.2倍以上、2.3倍以上、2.4倍以上、2.5倍以上、2.6倍以上、2.7倍以上、2.8倍以上、2.9倍以上、3倍以上、3.1倍以上、3.2倍以上、3.3倍以上、3.4倍以上、3.5倍以上、3.6倍以上、3.7倍以上、3.8倍以上、3.9倍以上、4倍以上、4.1倍以上、4.2倍以上、4.3倍以上、4.5倍以上、4.6倍以上、4.7倍以上、4.8倍以上、4.9倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、11倍以上、12倍以上、13倍以上、14倍以上、15倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、100倍以上、200倍以上、300倍以上、400倍以上、500倍以上、600倍以上、700倍以上、800倍以上、900倍以上、または1000倍以上の値である。この態様において、対象は、GPC3標的治療剤未治療例の患者とすることができる。
本発明の非限定的な一態様としては、GPC3-IHC膜Hスコア、GPC3-IHC細胞質Hスコア、GPC3-IQD Intensity ScoreまたはIQD Cell Scoreが所定の値(I)である群において、該群の患者の組織標品中の腫瘍細胞のサイズを測定することを含み、ここで腫瘍細胞のサイズが所定の値(II)である場合に、当該患者における癌に対するGPC3標的治療剤が有効であることが予測、予想または決定される。所定の値(I)および(II)はそれぞれ、独立して、患者群における中央値（50パーセンタイル値）、55パーセンタイル値、60パーセンタイル値、65パーセンタイル値、70パーセンタイル値、75パーセンタイル値または80パーセンタイル値のいずれか、または該値より高い値とすることができる。所定の値(II)は、例えば、複数の癌患者にGPC3標的治療剤を投与し、癌に対するGPC3標的治療剤の効果が確認できない患者群の生物学的試料中の腫瘍細胞サイズに基づき、決定することができる。所定の値(II)はまた、例えば、複数の癌患者にGPC3標的治療剤を投与し、有意なPFS（無増悪生存期間）の延長又は有意なOS（全生存期間）の延長傾向が認められる患者群の腫瘍細胞サイズに基づき、決定することができる。所定の値(II)はまた、例えば、GPC3-IHC膜Hスコア、GPC3-IHC細胞質Hスコア、GPC3-IQD Intensity ScoreまたはIQD Cell Scoreが所定の値(I)である複数の癌患者の組織標品中の腫瘍細胞サイズに基づき、決定することができる。そして上記のいずれにおいても、患者群における腫瘍細胞サイズの中央値（50パーセンタイル値）、55パーセンタイル値、60パーセンタイル値、65パーセンタイル値、70パーセンタイル値、75パーセンタイル値または80パーセンタイル値のいずれか、または該値より高い値であれば、当該患者における癌に対するGPC3標的治療剤が有効であることを予想、予測または決定するための所定の値(II)とすることができ、好ましくは、GPC3標的治療剤による有意なPFSの延長又は有意なOSの延長傾向が認められる患者を高い確率で選択するための所定の値(II)とすることができる。
1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量の所定の値は、多くの因子、例えば、用いられるアッセイ方法、1腫瘍細胞あたりのGPC3を測定する試料のタイプ、試料の保存条件（温度および期間等）、患者の民族的アイデンティティー等に依存して、わずかに変化し得る。上記の有効であることを予測、予想または決定する方法において、1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量は、患者から単離された生物学的試料、特に肝癌組織試料において測定される。
上記の、当該1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値である場合に、当該GPC3標的治療剤が有効であると決定する際に、当該患者がFcγ受容体のタイプIIA及び/又はタイプIIIAの遺伝子において、FcγRIIIAの158位の少なくとも１つのアミノ酸残基がValである多型及び/又はFcγRIIAの131位の少なくとも１つのアミノ酸残基がHisである多型を有するかどうかをも考慮することも可能である。すなわち、対象患者における1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値であって、対象患者が、FcγRIIIAの158位のアミノ酸残基の少なくとも１つがValである多型及び/又はFcγRIIAの131位の少なくとも１つのアミノ酸残基がHisである多型を有する場合に、当該GPC3標的治療剤が有効であると決定することも含まれる。
ここで、FcγRIIIAの158位の少なくとも１つのアミノ酸残基がValである多型を有するとは、上述のFcγ受容体多型の確認に記載の方法に従って、FcγRIIIAの場合には158位のアミノ酸残基をコードする塩基配列を確認し、Valのホモ型(V/V)又はヘテロ型(V/F)の塩基配列の場合に、これに該当する。また、FcγRIIAの131位の少なくとも１つのアミノ酸残基がHisである多型を有するとは、同様に、FcγRIIAのの131位アミノ酸残基をコードする塩基配列を確認し、Hisのホモ型(H/H)又はヘテロ型(H/R)の塩基配列の場合に、これに該当する。
遊離GPC3濃度を考慮してGPC3標的治療剤の有効性を決定する方法
上記の、当該1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値である場合に、当該GPC3標的治療剤が有効であると決定する際に、さらに、遊離GPC3濃度を併せて考慮することも可能である。すなわち、GPC3標的治療剤を投与される前の患者から単離された生物学的試料中の遊離GPC3濃度を測定し、当該遊離GPC3濃度が所定の値である場合に当該GPC3標的治療剤が有効であると決定することも含まれる。
また、上記の、当該1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値であって、当該GPC3標的治療剤が有効であると決定され、投与が開始された後に、当該GPC3標的治療剤の投与の継続を決定する際に、遊離GPC3濃度を併せて考慮することも可能である。すなわち、GPC3標的治療剤を投与される前の患者および／またはGPC3標的治療剤を投与された患者から単離された生物学的試料中の遊離GPC3濃度をモニタリングし、当該遊離GPC3濃度が所定の値である場合に当該GPC3標的治療剤の投与の継続を決定することも含まれる。
非限定な一態様では、上記の遊離GPC3濃度の所定の値は、0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.3 ng/mL、0.4 ng/mL、0.5 ng/mL、0.6 ng/mL、0.7 ng/mL、0.8 ng/mL、0.9 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、3.0 ng/mL、4.0 ng/mL、5.0 ng/mL、6.0 ng/mL、7.0 ng/mL、8.0 ng/mL、9.0 ng/mL、10.0 ng/mL、15.0 ng/mL、20.0 ng/mL、25.0 ng/mL、30.0 ng/mL、35.0 ng/mL、40.0 ng/mL、45.0 ng/mL、50.0 ng/mL、55.0 ng/mL、60.0 ng/mL、65.0 ng/mL、70.0 ng/mL、75.0 ng/mL、80.0 ng/mL、85.0 ng/mL、90.0 ng/mL、100.0 ng/mL等の特定の値から決定され得るし、上記の特定の値の群から任意に選択される特定の値を上限および下限とする数値範囲として決定され得る。例えば、0.1から100 ng/mL、0.5から80 ng/mL、1.0から60 ng/mL、2.0から55 ng/mL、3.0から50 ng/mL、4.0から45 ng/mL、5.0から40 ng/mL、6.0から35 ng/mL、7.0から30 ng/mL、8.0から25 ng/mL、9.0から20 ng/mL、10から20ng/mLが例示されるがこれらに限定されない。遊離GPC3濃度の所定の値は、多くの因子、例えば、用いられるアッセイ方法、遊離GPC3を測定する生物学的試料のタイプ、生物学的試料の保存条件（温度および期間等）、患者の民族的アイデンティティー等に依存して、わずかに変化し得る。上記の有効であることを予測、予想もしくは決定する方法、または当該GPC3標的治療剤の投与の継続を決定する方法において、遊離GPC3の濃度として、患者から単離された血液、血漿または血清の生物学的試料における濃度が測定される。
前記の遊離GPC3濃度は、GPC3標的治療剤の投与を開始した後に単離された生物学的試料において測定され得るが、それらは所定の時間間隔で採取された複数の生物学的試料でも測定され得る。所定の時間間隔で採取された複数の生物学的試料のうちいずれかひとつにおける遊離GPC3濃度が上述の所定の濃度である場合に、当該患者における癌に対するGPC3標的治療剤が有効であることが予測、予想もしくは決定され、または当該GPC3標的治療剤の投与の継続が決定される。所定の時間間隔は適宜設定されるが、当該間隔の非限定な一態様としてGPC3標的治療剤の初回投与後1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日（すなわち1週）、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日（すなわち2週）、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日（すなわち3週）、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日（すなわち4週）、29日、30日、1月、5週、6週、7週、8週、9週、10週、2月、3月、4月、5月、もしくは6月、もしくは１回、２回、３回、４回、またはそれ以上の治療サイクル後などの、GPC3標的治療剤の投与の開始と終結との間のあらゆる時点で採取され得る。投与間隔すなわち治療サイクルは適宜設定され得るが、例えば、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日（すなわち1週）、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日（すなわち2週）、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日（すなわち3週）、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日（すなわち4週）、29日、30日、1月、5週、6週、7週、8週、9週、10週、2月、3月、4月、5月、6月等が非限定な一例として挙げられる。
非限定な一態様において、上記患者から単離された生物学的試料中の遊離GPC3濃度のモニタリングは、GPC3標的治療剤の投与を開始した30日後または1月後に当該GPC3標的治療剤を投与された患者から単離された血液、血漿または血清中の遊離GPC3濃度をモニタリングすることを含み、当該遊離GPC3濃度が0.1 ng/mLから100 ng/mLまでの範囲である場合が、上記の遊離GPC3濃度が所定の値である場合の非限定な一態様として例示される。別の非限定な一態様において、上記患者から単離された生物学的試料中の遊離GPC3濃度のモニタリングは、GPC3標的治療剤の投与を開始した2月後、3月後、4月後、5月後または6月後に当該GPC3標的治療剤を投与された患者から単離された血液、血漿または血清中の遊離GPC3濃度をモニタリングすることを含み、当該遊離GPC3濃度が0.1 ng/mLから100 ng/mLまでの範囲である場合が、上記の遊離GPC3濃度が所定の値である場合の非限定な一態様として例示される。
別の非限定な一態様では、GPC3標的治療剤を投与された患者から単離された生物学的試料中の遊離GPC3濃度は、GPC3標的治療剤の投与を開始する前に患者から単離された血液、血漿または血清の生物学的試料において測定される遊離GPC3の濃度（「ベースライン濃度」）と比較され得る。本態様における、遊離GPC3濃度の「所定の値」とは、GPC3標的治療剤を投与された患者から単離された生物学的試料中の遊離GPC3濃度が、当該ベースライン濃度以上である場合を意味する。すなわち同一患者においてGPC3標的治療剤を投与された前後で遊離GPC3濃度が同じか増加しているときに、当該患者における癌に対するGPC3標的治療剤が有効であることが予測、予想または決定され、または当該GPC3標的治療剤の投与の継続が決定される。GPC3標的治療剤を投与された前後で遊離GPC3濃度が同じか増加している割合は、当業者が適宜選択することが可能であり特定の値に限定されない。そのような割合として、1倍から106倍までの数値範囲から適宜選択され得る。例えば、1倍以上、1.05倍以上、1.1倍以上、1.2倍以上、1.3倍以上、1.4倍以上、1.5倍以上、1.6倍以上、1.7倍以上、1.8倍以上、1.9倍以上、2倍以上、2.1倍以上、2.2倍以上、2.3倍以上、2.4倍以上、2.5倍以上、2.6倍以上、2.7倍以上、2.8倍以上、2.9倍以上、3倍以上、3.1倍以上、3.2倍以上、3.3倍以上、3.4倍以上、3.5倍以上、3.6倍以上、3.7倍以上、3.8倍以上、3.9倍以上、4倍以上、4.1倍以上、4.2倍以上、4.3倍以上、4.4倍以上、4.5倍以上、4.6倍以上、4.7倍以上、4.8倍以上、4.9倍以上、5倍以上、5.1倍以上、5.2倍以上、5.3倍以上、5.4倍以上、5.5倍以上、5.6倍以上、5.7倍以上、5.8倍以上、5.9倍以上、6倍以上、6.1倍以上、6.2倍以上、6.3倍以上、6.4倍以上、6.5倍以上、6.6倍以上、6.7倍以上、6.8倍以上、6.9倍以上、7倍以上、7.1倍以上、7.2倍以上、7.3倍以上、7.4倍以上、7.5倍以上、7.6倍以上、7.7倍以上、7.8倍以上、7.9倍以上、8倍以上、8.1倍以上、8.2倍以上、8.3倍以上、8.4倍以上、8.5倍以上、8.6倍以上、8.7倍以上、8.8倍以上、8.9倍以上、9倍以上、9.1倍以上、9.2倍以上、9.3倍以上、9.4倍以上、9.5倍以上、9.6倍以上、9.7倍以上、9.8倍以上、9.9倍以上、10倍以上、11倍以上、12倍以上、13倍以上、14倍以上、15倍以上、16倍以上、17倍以上、18倍以上、19倍以上、20倍以上、21倍以上、22倍以上、23倍以上、24倍以上、25倍以上、26倍以上、27倍以上、28倍以上、29倍以上、30倍以上、31倍以上、32倍以上、33倍以上、34倍以上、35倍以上、36倍以上、37倍以上、38倍以上、39倍以上、40倍以上、41倍以上、42倍以上、43倍以上、44倍以上、45倍以上、46倍以上、47倍以上、48倍以上、49倍以上、50倍以上、55倍以上、60倍以上、65倍以上、70倍以上、75倍以上、80倍以上、85倍以上、90倍以上、95倍以上、100倍以上、105倍以上、110倍以上、120倍以上、130倍以上、140倍以上、150倍以上、160倍以上、170倍以上、180倍以上、190倍以上、200倍以上、220倍以上、240倍以上、260倍以上、280倍以上、300倍以上、320倍以上、340倍以上、360倍以上、380倍以上、400倍以上、420倍以上、440倍以上、460倍以上、480倍以上、500倍以上、550倍以上、600倍以上、650倍以上、700倍以上、750倍以上、800倍以上、850倍以上、900倍以上、950倍以上、1000倍以上、2000倍以上、3000倍以上、4000倍以上、5000倍以上、6000倍以上、7000倍以上、8000倍以上、9000倍以上、104倍以上、2 x 104倍以上、4 x 104倍以上、6 x 104倍以上、8 x 104倍以上、105 倍以上、2 x 105倍以上、4 x 105倍以上、6 x 105倍以上、8 x 105倍以上、または106倍以上である場合が、上記の遊離GPC3濃度が所定の値である場合の非限定な一態様として例示される。
非限定な一態様において、上記患者から単離された生物学的試料中の遊離GPC3濃度のモニタリングは、GPC3標的治療剤の投与を開始した30日後または1月後に当該GPC3標的治療剤を投与された患者から単離された血液、血漿または血清中の遊離GPC3濃度をモニタリングすることを含み、当該遊離GPC3濃度がベースライン濃度以上である場合が、上記の遊離GPC3濃度が所定の値である場合の非限定な一態様として例示される。別の非限定な一態様において、上記患者から単離された生物学的試料中の遊離GPC3濃度のモニタリングは、GPC3標的治療剤の投与をを開始した2月後、3月後、4月後、5月後または6月後に当該GPC3標的治療剤を投与された患者から単離された血液、血漿または血清中の遊離GPC3濃度をモニタリングすることを含み、当該遊離GPC3濃度がベースライン濃度の1倍以上から106倍以上である場合が、上記の遊離GPC3濃度が所定の値である場合の非限定な一態様として例示される。
患者の選別方法
本発明における患者の選別方法は、上述の方法により、患者から単離された生物学的試料中の1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値である場合にGPC3標的治療剤が有効な患者であると決定する工程を含む。本発明の非限定な一態様において、上記の患者の選別方法は、さらに、患者から単離された生物学的試料中の遊離GPC3濃度が所定の値である場合にGPC3標的治療剤が有効な患者であると決定する工程を含むこともできる。また、別の異なる非限定な一態様において、上記の患者の選別方法は、さらに、GPC3標的治療剤を投与される前の患者および／またはGPC3標的治療剤を投与された患者から単離された生物学的試料中の遊離GPC3濃度をモニタリングし、当該遊離GPC3濃度が所定の値である場合に当該GPC3標的治療剤の投与の継続を決定する工程を含むこともできる。
治療剤
本発明において治療剤とは、通常、疾患の治療もしくは予防、または検査・診断のための薬剤をいう。また、本発明において、「GPC3標的治療剤を投与される前の癌患者から単離された生物学的試料中の1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値である患者（のみ）に投与するためのGPC3標的治療剤」との用語は、「GPC3標的治療剤を受ける前の癌患者から単離された生物学的試料中の1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値である患者（のみ）にGPC3標的治療剤を投与することを含む癌の治療方法」と言い換えることも可能であるし、「癌を治療するための医薬の製造における、GPC3標的治療剤を投与される前の癌患者から単離された生物学的試料中の1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値である患者（のみ）に投与するためのGPC3標的治療剤の使用」と言い換えることも可能である。この文脈において、用語「患者のみ」とは、生物学的試料中の1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値である患者には投与するが、所定の値でない患者には投与しないことを意味する。本発明の好ましいある特定の態様では、例えば、GPC3標的治療剤を投与される前の癌患者から単離された生物学的試料中の1腫瘍細胞あたりのGPC3発現量が所定の値である患者にはGPC3標的治療剤を投与するが、所定の値ではない患者に対しては投与しないことができる（例えば、生物学的試料中の1腫瘍細胞あたりのGPC3発現量が一定値以上であれば投与するが、一定値未満の場合には投与しない）。
本発明の治療剤は、当業者に公知の方法を用いて製剤化され得る。例えば、水またはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用され得る。例えば、薬理学上許容される担体または媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化され得る。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な容量が得られるように設定される。
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施にしたがって処方され得る。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム）を含む等張液が挙げられる。適切な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート80（TM）、HCO-50等）が併用され得る。
油性液としてはゴマ油、大豆油が挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル及び/またはベンジルアルコールも併用され得る。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液及び酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸プロカイン）、安定剤（例えば、ベンジルアルコール及びフェノール）、酸化防止剤と配合され得る。調製された注射液は通常、適切なアンプルに充填される。
本発明の治療剤は、好ましくは非経口投与により投与される。例えば、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型の治療剤が投与される。例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与され得る。
投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択され得る。前記治療剤を含有する医薬用製剤の投与量は、例えば、一回につき体重1 kgあたり0.0001 mgから1000 mgの範囲に設定され得る。または、例えば、患者あたり0.001～100000 mgの投与量が設定され得るが、本発明はこれらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量及び投与方法は、患者の体重、年齢、症状などにより変動するが、当業者であればそれらの条件を考慮し適当な投与量及び投与方法を設定することが可能である。例えば、本発明の好ましい投与量と投与方法の一例として、患者の血中トラフ値が一定量以上となるように投与することができる。好ましい血中トラフ値としては、例えば、150μg/mL以上、160μg/mL以上、170μg/mL以上、180μg/mL以上、190μg/mL以上、200μg/mL以上、210μg/mL以上、220μg/mL以上、230μg/mL以上、240μg/mL以上、250μg/mL以上、260μg/mL以上、270μg/mL以上、280μg/mL以上、290μg/mL以上、300μg/mL以上、400μg/mL以上を挙げることができる。より好ましくは、200μg/mL以上を挙げることができる。
指示書
本発明の製剤には、GPC3標的治療剤を投与される前の癌患者から単離された生物学的試料中の1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値である患者（のみ）に投与する旨の指示書が含まれる。また、本発明における肝癌の治療用キットには、GPC3標的治療剤、およびGPC3標的治療剤を投与される前の癌患者から単離された生物学的試料中の1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値である患者（のみ）に投与する旨の指示書が含まれる。この文脈において、用語「患者のみ」とは、生物学的試料中の1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値である患者には投与するが、所定の値でない患者には投与しないことを意味する。本発明の好ましいある特定の態様では、指示書は、例えば、GPC3標的治療剤を投与される前の癌患者から単離された生物学的試料中の1腫瘍細胞あたりのGPC3発現量が所定の値である患者には投与するが、所定の値ではない患者に対しては投与しないという趣旨の記載がなされた指示書とすることができる（例えば、1腫瘍細胞あたりのGPC3発現量が一定値以上であれば投与するが、一定値未満の場合には投与しないという趣旨の記載としてもよい）。
本発明の非限定な一態様では、GPC3標的治療剤を受ける前の患者から単離された生物学的試料中の1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量を測定することを含み、当該1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値である場合に当該GPC3標的治療剤が有効であると決定することが記載される指示書を含む製剤または肝癌の治療用キットが提供される。
本発明の非限定な一態様では、前記患者から単離された生物学的試料中の1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量を測定することを含み、ここで、当該発現量が所定の値である場合に、当該患者における癌に対するGPC3標的治療剤が有効であることが予測、予想または決定されることが記載される指示書を含む製剤または肝癌の治療用キットが提供される。ここで当該指示書に記載される所定の値は、上述のGPC3標的治療剤の有効性を決定する方法に記載の所定の値が例示される。
1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量の所定の値は、多くの因子、例えば、用いられるアッセイ方法、1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量を測定する試料のタイプ、試料の保存条件（温度および期間等）、患者の民族的アイデンティティー等に依存して、わずかに変化し得る。上記の有効であることを予測、予想または決定する方法において、1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量の所定の値として、患者から単離された生物学的試料、特に肝癌組織における値が測定される。
上記の、当該1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値である場合に、当該GPC3標的治療剤が有効であることが記載される指示書には、当該患者がFcγ受容体のタイプIIA及び/又はタイプIIIAの遺伝子において、FcγRIIIAの158位の少なくとも１つのアミノ酸残基がValである多型及び/又はFcγRIIAの131位の少なくとも１つのアミノ酸残基がHisである多型を有するかどうかをも考慮することも記載され得る。すなわち、対象患者における1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値であって、対象患者が、FcγRIIIAの158位のアミノ酸残基の少なくとも１つがValである多型及び/又はFcγRIIAの131位の少なくとも１つのアミノ酸残基がHisである多型を有する場合に、当該GPC3標的治療剤が有効であると決定することも記載され得る。
ここで、FcγRIIIAの158位の少なくとも１つのアミノ酸残基がValである多型を有するとは、上述のFcγ受容体多型の確認に記載の方法に従って、FcγRIIIAの場合には158位のアミノ酸残基をコードする塩基配列を確認し、Valのホモ型(V/V)又はヘテロ型(V/F)の塩基配列の場合に、これに該当する。また、FcγRIIAの131位の少なくとも１つのアミノ酸残基がHisである多型を有するとは、同様に、FcγRIIAのの131位アミノ酸残基をコードする塩基配列をを確認し、Hisのホモ型(H/H)又はヘテロ型(H/R)の塩基配列の場合に、これに該当する。
上記の、当該1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値である場合に、当該GPC3標的治療剤が有効であると決定することが記載される指示書には、さらに、当該患者から単離された生物学的試料における遊離GPC3の濃度を併せて考慮することも記載され得る。すなわち、対象患者から単離された生物学的試料中の遊離GPC3濃度を測定し、当該遊離GPC3濃度が所定の値である場合に当該GPC3標的治療剤が有効であると決定することも記載され得る。
また、上記の、当該1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値である場合に、当該GPC3標的治療剤が有効であると決定することが記載される指示書には、さらに、当該GPC3標的治療剤の投与の継続を決定する際に、遊離GPC3濃度を併せて考慮することも記載され得る。すなわち、GPC3標的治療剤を投与される前の患者および／またはGPC3標的治療剤を投与された患者から単離された生物学的試料中の遊離GPC3濃度をモニタリングし、当該遊離GPC3濃度が所定の値である場合に当該GPC3標的治療剤の投与の継続を決定することも記載され得る。ここで当該指示書に記載される所定の値は、上述の、遊離GPC3濃度を考慮してGPC3標的治療剤の有効性を決定する方法に記載の所定の値が例示される。
診断キット
本発明の診断キットには、GPC3標的治療剤を投与される前の癌患者から単離された生物学的試料中の1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量を測定するための試薬が含まれる。
本発明の非限定な一態様では、GPC3標的治療剤を投与される前の癌患者から単離された生物学的試料中の1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量を測定するための試薬、および当該試薬を用いて測定された1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値である場合に当該GPC3標的治療剤が有効であると決定することが記載される指示書を含む診断キットが提供される。また、本発明の非限定な一態様では、診断キットは、さらに、当該試薬を用いて測定された1腫瘍細胞あたりのGPC3の発現量が所定の値であることによりGPC3標的治療剤が有効であると決定された患者（のみ）に投与するためのGPC3標的治療剤を含んでもよい。
実施例１
GC33は、ヒトGPC3に高い親和性をもって結合する遺伝子組換えヒト化IgG1モノクローナル抗体である（WO2006/006693）。また、GC33とキナーゼ阻害剤であるソラフェニブとの併用効果がヒト肝癌細胞株を用いた非臨床試験において見出されている（Ishiguro T et al., Anti-Glypican 3 antibody as a potential antitumor agent for human liver cancer. Cancer Res. (2008) 68, 9832-9838. またはWO2009/122667）。
Ishiguroらに従い、GPC3を強発現するヒト細胞株HepG2を用いたマウス移植モデルにおいてGC33、ag-GC33（重鎖Fc領域のN型糖鎖結合部位である297位のアスパラギン残基をアラニン残基に置換し、糖鎖を結合しなくすることでADCC活性をなくしたGC33の改変体：Ishiguro T et al., Anti-Glypican 3 antibody as a potential antitumor agent for human liver cancer. Cancer Res. (2008) 68, 9832-9838）もしくはソラフェニブ単剤、またはGC33およびag-GC33とソラフェニブとの併用における抗腫瘍効果に加え、マウス血漿中の可溶型GPC3の変化を検討した。
GC33またはag-GC33は、HepG2移植後18日目より5 mg/kgで週1回、計3回尾静脈より投与され、ソラフェニブは、同じくHepG2移植後18日目より5 mg/kgで週5回、3週間経口投与された。各投与群での腫瘍体積の推移を図1に示す。
GC33投与群においては抗腫瘍効果が発揮され、対照群に比べ腫瘍の増大が抑制された。一方で、ADCC活性をなくしたag-GC33では腫瘍増大抑制効果は見られなかった。ソラフェニブ投与群では、腫瘍増大抑制効果がGC33より弱かった。GC33及びソラフェニブ併用群においては、腫瘍増大抑制効果が最も高かった。
抗腫瘍効果評価終了時に各マウスより血漿を採取し、抗GPC3抗体の組合せを変えた2種類のELISAにて可溶型GPC3断片を測定した。ELISAにおける可溶型GPC3断片を検出するために、WO2004/022739に記載の通り、ヒトGPC3のN末サブユニットに結合するマウスモノクローナル抗体を作製した。得られた抗体を以下便宜的にGT30及びGT607と呼ぶこととする。また、WO2004/022739に記載の通り、ヒトGPC3のC末サブユニットに結合するマウスモノクローナル抗体を作製した。得られた抗体を以下便宜的にGT96及びM3C11と呼ぶこととする。抗GPC3抗体の組合せとしては、GT30とGT607の組合せ、またはGT96とM3C11の組合せ用い、可溶型GPC3断片を測定し、前者の組合せで測定された可溶性GPC3断片を「sGPC3-N」、後者の組合せで測定された可溶性GPC3断片を「sGPC3-C」と定義した。sGPC3-Nとしては、GPC3を発現する細胞にアンカーされていないGPC3であって、かつ、配列番号：１で規定されるポリペプチドからなるGPC3の３５８位よりアミノ末端側のポリペプチドを含むポリペプチドおよび配列番号：１で規定されるポリペプチドからなるGPC3の３７４位よりアミノ末端側のポリペプチドとして知られるポリペプチドを含むポリペプチドが検出される。sGPC3-Cとしては、GPC3を発現する細胞にアンカーされていないGPC3であって、かつ、配列番号：１で規定されるポリペプチドからなるGPC3の３５９位よりカルボキシ末端側のポリペプチドを含むポリペプチドおよび配列番号：１で規定されるポリペプチドからなるGPC3の３７５位よりカルボキシ末端側のポリペプチドとして知られるポリペプチドを含むポリペプチドが検出され得る。
ELISAにおけるsGPC3-Nの検出およびsGPC3-Cの検出は、具体的には、以下のように行った。まず、96ウェルマイクロプレート（Meso Scale Discovery社製、Multi-array 96-well plate）に1 μg/mLとなるようにCarbonate-Bicarbonateバッファー（SIGMA社製）にて希釈したGT30抗体、または128 μg/mLとなるように同様に調製したM3C11抗体を50 μLずつ加え、室温で1時間撹拌した。次いで、マイクロプレートを洗浄液（SIGMA社製、PBS Buffered Saline with Tween 20, pH 7.4）で5回洗浄後、ブロッキング溶液（Roche社製Bovine Serum Albumin Fraction Vを2.5または5.0%ふくむPBS Buffered Saline with Tween 20, pH 7.4）を100 μLずつ加え、室温で1時間撹拌した。さらに、マイクロプレートを洗浄液で3回洗浄後、検量線用標準品を希釈液（Bovine Serum Albumin Fraction Vを0.05または1.0%ふくむPBS Buffered Saline with Tween 20, pH 7.4）にて段階希釈した後、さらに希釈液で5倍希釈したコントロールマウス血漿を等用量で混合した検量線用標準品溶液または希釈液で10倍希釈したマウス血漿を50 μLずつ加え、室温で1時間撹拌した。洗浄液で5回洗浄後、検出抗体溶液としてビオチン標識したGT607抗体（1 μg/mL）、またはビオチン標識したGT96抗体（8 μg/mL）を50μLずつ加え、室温で1時間撹拌した。洗浄液で5回洗浄後、希釈液にて500倍希釈したSULFO-TAG Streptavidin（Meso Scale Discovery社製）を25μLずつ加え、室温で1時間撹拌した。洗浄液で5回洗浄後、基質溶液（MSD社製、MSD Read Buffer T (4x) with Surfactant）を100μLずつ加え、電気化学発光免疫測定器（ECL：Meso Scale Discovery社製、SECTOR imager 2400）にてシグナルを測定した。測定結果をもとに、検量線よりマウス血漿中のsGPC3-NまたはsGPC3-C濃度が算出された。なお、検量線用標準品としては、ヘパラン硫酸糖鎖が結合しないように495位ならびに509位のセリン残基がアラニン残基に置換されたリコンビナントGPC3（Hippoら（Cancer Res.(2004) 64, 2418-2423））が用いられた。
各マウスにおけるsGPC3-Nの測定結果のプロット図を図2に、sGPC3-Cの測定結果のプロット図を図3に示す。
GC33投与群においては、対照群に比べsGPC3-Nが少ないことが見出された。一方で、ADCC活性をなくしたag-GC33では、sGPC3-Nは対照群と同程度であった。ソラフェニブ投与群では、sGPC3-N値はGC33と同程度であった。
sGPC3-Cに関しては、sGPC3-Nと異なり、GC33投与群で対照群、ag-GC33ならびにソラフェニブ群に比べ高値であり、GC33のADCC活性による抗腫瘍効果がsGPC-3の上昇をもたらすことが示唆された。
実施例２
GC33およびソラフェニブ併用時の、進行および/または再発性肝細胞癌（HCC）患者におけるDose Limiting Toxicity（DLT）を確認するため、多施設において第I相臨床試験が実施された（GC-002US試験）。進行および/または再発性HCC患者における安全性および/または忍容性の確認、GC33の薬物動態プロファイル、抗腫瘍効果、およびバイオマーカー探索を目的とする本試験では、HCC患者にGC33が週1回（2.5 mg/kg体重、5 mg/kg体重、10 mg/kg体重もしくは1,600 mg）、または2週に1回（1,600 mg）、点滴を用いた静脈注射によって投与された。ソラフェニブは最初のGC33投与の次の日から投薬が開始され、400 mgを1日2回、毎日服薬され、添付文書に従い減薬または休薬された。
投与が検討されたHCC患者は、ソラフェニブ治療歴のない組織学的または細胞学的に確認された、外科手術および/または治癒的治療に適していない進行性または転移性のHCCを有していた。適格患者は少なくとも18歳であり、3ヶ月以上の生存が見込まれ、米国東海岸癌臨床試験グループ・パフォーマンスステータスが0または1で、かつChild-Pugh（チャイルドピュー指数） AまたはBクラス（なお、試験途中よりChild-Pugh Aクラスのみに変更）であった。また、固形腫瘍の治療効果基準（RECIST）に従い少なくとも1つの評価可能な病変を有していた。他の基準としては、GPC3免疫組織染色（GPC3-IHC）に用いられるHCC腫瘍組織（針生検標本）が提供可能であることのほか、適切な造血機能（絶対好中球数≧1500/μl、血小板≧75,000 /μl（なお、試験途中より100,000/μLに変更））、適切な肝機能（総ビリルビン≦正常の3 倍（なお、試験途中より≦正常の1.5倍）、アスパルギン酸アミノトランスフェラーゼおよびアラニンアミノトランスフェラーゼ≦正常の5倍、PT-INR≦2.0）、および適切な腎機能（血清クレアチニン≦正常の2倍）が定められた。経口服薬困難な患者、妊婦、授乳婦または妊娠検査陽性（妊娠検査は登録日から12カ月以内に月経のあった女性を対象とする）の患者、適切な避妊法を用いる意思のない患者、HIV抗体陽性の患者、HBVまたはHCVを除く治療を要する活動性の感染症を有する患者、無病期間が5年未満の他の活動性悪性腫瘍を有する患者、移植の既往歴を有する患者、管理不能な併存疾患を有する患者、症状を伴う脳転移が認められる患者、同意または治験実施の理解に支障をきたす中枢神経系障害または他の精神障害を有する患者、管理不能な高血圧症を有する患者、癌に関連のない血栓塞栓症、GPC3標的治療剤投与前の4週間以内に重度の肺出血や生命を脅かす他の出血の既往がある患者、重度な治癒していない創傷または潰瘍、骨折、針生検による影響が残る患者を有する患者、GPC3標的治療剤投与前の2週間以内に抗凝固薬や血栓溶解剤、全身用抗ウイルス薬、輸血を受けた患者、他の抗体医薬品またはCHO細胞によって製造された医薬品に対する既知の過敏性を示した患者、CYP3A4を誘導する薬剤の治療を受けている患者は、登録の除外対象となった。また、GPC3標的治療剤投与前の4週間以内に主要な外科手術、放射線療法、その他の化学療法を含めた治療を受けた患者は、GPC標的治療剤の登録の除外対象となる所定期間のwash-out以降にGPC3標的治療がなされた。プロトコルは、医薬品の臨床試験の実施の基準のガイドラインに従って実施され、それぞれの参加する治験倫理審査委員会により認可された。全ての患者は、登録の前に、書面のインフォームドコンセントに署名した。患者へのGC33投与は、週1回投与の場合は4回投与を1サイクル、2週に1回投与の場合は2回投与を1サイクルとし、疾患の進行または許容不可能な毒性が発現しない限り、GC33およびソラフェニブの投与が継続された。腫瘍の評価はベースラインで実施し、疾患が進行するまで2サイクルごとに反復して評価された。疾患の状態は治験責任医師によって評価された。
主目的として安全性・忍容性の評価が、副次目的として、PK解析、効果評価、バイオマーカー探索、第II相臨床試験に向けた至適用量の検討がなされた。効果評価としては、肝細胞癌マーカーとして知られるαフェトプロテイン（AFP）のベースラインからの変化、ならびに無増悪生存期間（PFS：Progression free survival）、増悪までの期間（TTP：Time-to-progression）が求められた。
実施例３
HCC腫瘍組織におけるGPC3タンパク質の発現はGPC3組織免疫染色（GPC3-IHC）によって評価された。HCC患者に対するGC33およびソラフェニブの投与開始前に、各病院によって針生検により当該HCC患者からHCC腫瘍組織が摘出され、フォルマリン固定およびパラフィン法埋された腫瘍ブロックが作製された。当該腫瘍ブロックより調製されたHCC腫瘍組織の未染色スライドのGPC3-IHCは、BenchMark自動染色装置（Ventana Medical Systgem社製）を用い、anti-glypican 3 Mouse GC33 Monoclonal Primary Antibody（Ventana Medical System Inc.）添付の指示書に従って中央測定がなされた。Ventana Medical Systemにて実施されたGPC3-IHCのスコアは、染色後の腫瘍細胞の細胞膜、または細胞質内の染色強度を0～3に分類し、それぞれの染色強度を示す細胞の割合を基に算出するHスコア（文献：KS. McCarty Jr. et al., Use of a monoclonal anti-Estrogen receptor antibody inthe immunohistochemical evaluation of human tumors. Cancer Res. Suppl. (1986) 46, 4244s-4248s）を用い下記計算式により算出され、図４に示す分布が得られた。
Hスコア ＝ 1×（染色強度が弱陽性の細胞の割合（％）） ＋ 2×（染色強度が中陽性の細胞の割合（％）） ＋ 3×（染色強度が強陽性の細胞の割合（％））
また、上記にて評価された腫瘍検体の一部を用いて蛍光定量デジタルスライド技術（IQD）によるGPC3発現評価（GPC3-IQD）が追加して実施された。GPC3-IQDは、マウスGC33抗体を用い、Hashiguchiらの方法（Hashiguchi A. et al., Using immunofluorescent digital slide technology to quantify protein expression in archival paraffin-embedded tissue sections. Pathol. Int. (2010) 60, 720-725）に従い実施された。
IQD法によるスコアとして、非癌部の蛍光強度を差し引いた腫瘍部位の蛍光強度の合算値としてのintensityスコア（GPC3のIQD Intensity Score）、または腫瘍細胞あたりの蛍光強度を示すCellスコア（GPC3のIQD Cell Score）がそれぞれ各サンプルの平均値として算出され、図５に示す分布が得られた。
それぞれのGC33投与量ならびにGPC3-IHCまたはGPC3-IQDにて評価された症例数を表４に示す。
Figure 0007096667000007
実施例４
GC33が投与された患者の血清中の遊離GPC3の濃度が測定された。実施例1と同様にGT30とGT607の組合せを用いてsGPC3-Nを測定し、GT96とM3C11の組合せを用いてsGPC3-Cの濃度を測定した。GT30とGT607の組合せに関しては、Haruyamaらの方法（Haruyama Y et al., High preoperative levels of serum glypican-3 containing N-terminal subunit are associated with poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma after partial hepatectomy. (2015) in press）に従い遊離GPC3の濃度が測定され、GT96とM3C11の組合せに関しても、M3C11と抗体結合磁性粒子を結合させ、GT96とアルカリフォスファターゼを結合させたものを用いたほかは、Haruyamaらの方法に従い遊離GPC3の濃度が測定された。
GC33およびソラフェニブ投与前の患者血清中の測定値をベースライン値とし、投与後に採血された血清の測定値との変化が算出され、最良変化率、すなわちsGPC3-Nについては最小変化率、sGPC3-Cについては最大変化率が求められた。
実施例５
GC33およびソラフェニブ投与による抗腫瘍効果として、前述の通りsGPC3-N最小変化率、sGPC3-C最大変化率、AFP最小変化率、TTPならびにPFSをそれぞれ用い、腫瘍組織におけるGPC3の発現との関連性が調べられた。GPC3の発現評価としてGPC3-IHCによる膜Hスコアおよび細胞質Hスコア、GPC3のIQD Cell ScoreおよびIQD Intensity Scoreをそれぞれ用い、これらのスコアとsGPC3-N最小変化率、sGPC3-C最大変化率およびAFP最小変化率との関連性を、回帰分析のパラメーター推定量についてのt検定またはSpearmanの相関係数を用いてそれぞれ検討した。その結果、表５に示すように、GPC3のIQD Cell Scoreにおいて、sGPC3-C最大変化率との有意な関係性が示された。また、各GPC3スコアの変化、すなわちGPC3-IHCによる膜Hスコア、細胞質Hスコア、GPC3のIQD Intensity Scoreについてはそれぞれのスコアが10変化する毎、GPC3のIQD Cell Scoreについてはスコアが100,000変化する毎でのTTPまたはPFSについてハザード比を検討した。その結果、表５に示すように、従来の手法（例えば、GPC3-IHCや単位面積あたりの蛍光強度IQD Intensity Score）ではPFSとの高い相関は見られなかったが、意外にも、GPC3の1腫瘍細胞あたりの存在量（IQD Cell Score）においてのみPFSと予想外の高い相関が見られた。
Figure 0007096667000008
続いて、GPC3のIQD Cell Scoreのカットオフ値を変化させた場合の低値群および高値群それぞれにおけるPFSをカプランマイヤー法により検討した結果、図６に示すようにGPC3のIQD Cell Scoreのカットオフ値が高くなるに従い、高値群のPFSが低値群のPFSよりも長くなることが示され、ログランク検定によるp値が最も低かったカットオフ値（66,183）のハザード比は0.24、p = 0.038（Cell Score4例）であった。また、非癌部の蛍光強度で補正しない数値、または各サンプルの最大値でも同様の結果が示され、非癌部の蛍光強度で補正しないGPC3のIQD Cell Scoreにおいてp値が最も低かったカットオフ値（60,790.3）のハザード比は0.21、p = 0.019（Cell Score高値群：5例）、最大値においてはp値が最も低かったカットオフ値（89,052.5）のハザード比は0.28、p = 0.032（Cell Score高値群：6例）であった。以上より、HCC細胞の1腫瘍細胞あたりのGPC3発現量が多い患者においてGC33単独治療および／またはGC33とソラフェニブとの併用治療が有効であることが示された。
実施例６
続いて、今回の評価においてPFSとの高い相関がみられなかった各種GPC3評価法、すなわちGPC3-IHC膜Hスコア、又は細胞質Hスコア、若しくはGPC3-IQD Intensity Scoreを用いた評価法において、各スコアの値がそれぞれの中央値より高い値を示す症例のみに絞った上で、腫瘍組織の単位面積（μm2）あたりの腫瘍細胞サイズの平均値をもとに中央値を算出し、中央値よりも腫瘍細胞サイズが小さい群と、大きい群の2群に分類した。それぞれのスコアにおいて、腫瘍細胞サイズで2群間のGPC3値の平均値はほぼ変わりはなく、いずれにおいても有意差が見られなかった（表６）。
Figure 0007096667000009
一方で、腫瘍細胞サイズが大きい群と小さい群でPFSをカプランマイヤー法において比較した場合、ハザード比が0.343から0.441といずれにおいても腫瘍細胞サイズが大きい群においてPFSが長い傾向が見られ（表７、図7）、GPC3値が中央値以上の発現が高い群において、GC33単独療法および／またはGC33とソラフェニブとの併用療法が有効であることの予測に細胞サイズを評価することが有効であることが示された。
Figure 0007096667000010
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
本発明は、G PC3標的治療剤の有効性向上と、治療を受ける患者のQOL改善に資するものであり、肝癌をはじめとする癌の治療に有用である。

Claims (18)

  1. 肝臓癌患者におけるＧＰＣ３発現肝臓癌に対するＧＰＣ３標的治療剤の有効性を決定するための方法であって、当該患者から単離された肝癌組織試料における１腫瘍細胞あたりのＧＰＣ３の発現量を測定することと、前記１腫瘍細胞あたりのＧＰＣ３の発現量がＩＱＤ Ｃｅｌｌ Ｓｃｏｒｅが１３０００から２２０００の範囲の閾値より高いか否かを決定することとを含み、ＩＱＤ Ｃｅｌｌ Ｓｃｏｒｅが当該閾値より高い場合に当該ＧＰＣ３標的治療剤が有効であることが示される、方法｛但し、ヒトに対する診断を除く｝。
  2. 前記ＧＰＣ３標的治療剤が、前記患者の血中トラフ値で２００μｇ／ｍｌ以上となるように投与されるものである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＧＰＣ３標的治療剤が、抗ＧＰＣ３抗体を有効成分として含む治療剤である、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 前記抗ＧＰＣ３抗体が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する抗体である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記抗ＧＰＣ３抗体が、以下の（１）から（５）のいずれか：
    （１） 配列番号：４、配列番号：５、および配列番号：６でそれぞれ表される重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ３、ならびに配列番号：７、配列番号：８、および配列番号：９でそれぞれ表される軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３；
    （２） 配列番号：１２、配列番号：１３、および配列番号：１４でそれぞれ表される重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ３、ならびに配列番号：１５、配列番号：１６、および配列番号：１７でそれぞれ表される軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３；
    （３） 配列番号：２０、配列番号：２１、および配列番号：２２でそれぞれ表される重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ３、ならびに配列番号：２３、配列番号：２４、および配列番号：２５でそれぞれ表される軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３；
    （４） 配列番号：２８、配列番号：２９、および配列番号：３０でそれぞれ表される重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ３、ならびに配列番号：３１、配列番号：３２、および配列番号：３３でそれぞれ表される軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３；もしくは
    （５） 配列番号：３６、配列番号：３７、および配列番号：３８でそれぞれ表される重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ３、ならびに配列番号：３９、配列番号：４０、および配列番号：４１でそれぞれ表される軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３；
    を含む抗ＧＰＣ３キメラ抗体またはヒト化抗ＧＰＣ３抗体である、請求項３または請求項４に記載の方法。
  6. 前記抗ＧＰＣ３抗体が、以下の（１）から（６）のいずれか：
    （１） 配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、および配列番号：５０で表される重鎖可変領域の群から選択される重鎖可変領域、ならびに配列番号：５１で表される軽鎖可変領域；
    （２） 配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、および配列番号：５０で表される重鎖可変領域の群から選択される重鎖可変領域、ならびに配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、および配列番号：６６で表される軽鎖可変領域の群から選択される軽鎖可変領域；
    （３） 配列番号：６７で表される重鎖可変領域、および配列番号：６８で表される軽鎖可変領域；
    （４） 配列番号：６９で表される重鎖可変領域、および配列番号：７０で表される軽鎖可変領域；
    （５） 配列番号：７１で表される重鎖可変領域、および配列番号：７２で表される軽鎖可変領域；もしくは
    （６） 配列番号：７１で表される重鎖可変領域、および配列番号：７３で表される軽鎖可変領域；
    を含む抗体である、請求項３から請求項５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記ＧＰＣ３標的治療剤が、１または２以上の抗がん剤と同時または別々に投与されるものである、請求項１から請求項６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記抗がん剤がソラフェニブである、請求項７に記載の方法。
  9. 抗ＧＰＣ３抗体を有効成分として含む薬剤であって、肝臓癌患者から単離された肝癌組織試料における１腫瘍細胞あたりのＧＰＣ３の発現量がＩＱＤ Ｃｅｌｌ Ｓｃｏｒｅ が１３０００から２２０００の範囲の閾値より高い肝臓癌患者に投与するための薬剤。
  10. 前記患者が、当該患者から単離された腫瘍組織試料における１腫瘍細胞あたりのＧＰＣ３の発現量がＩＱＤ Ｃｅｌｌ Ｓｃｏｒｅ が１３０００から２２０００の範囲の閾値より高いことによりＧＰＣ３標的治療剤が有効であると決定された患者である、請求項９に記載の薬剤。
  11. 前記肝癌が、抗ＧＰＣ３抗体が有効である肝癌である、請求項９または請求項１０に記載の薬剤。
  12. 前記抗ＧＰＣ３抗体が、前記患者の血中トラフ値で２００μｇ／ｍｌ以上となるように投与される、請求項９から請求項１１のいずれかに記載の薬剤。
  13. 前記抗ＧＰＣ３抗体が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する抗体である、請求項９から請求項１２のいずれかに記載の薬剤。
  14. 前記抗ＧＰＣ３抗体が、以下の（１）から（５）のいずれか：
    （１） 配列番号：４、配列番号：５、および配列番号：６でそれぞれ表される重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ３、ならびに配列番号：７、配列番号：８、および配列番号：９でそれぞれ表される軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３；
    （２） 配列番号：１２、配列番号：１３、および配列番号：１４でそれぞれ表される重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ３、ならびに配列番号：１５、配列番号：１６、および配列番号：１７でそれぞれ表される軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３；
    （３） 配列番号：２０、配列番号：２１、および配列番号：２２でそれぞれ表される重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ３、ならびに配列番号：２３、配列番号：２４、および配列番号：２５でそれぞれ表される軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３；
    （４） 配列番号：２８、配列番号：２９、および配列番号：３０でそれぞれ表される重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ３、ならびに配列番号：３１、配列番号：３２、および配列番号：３３でそれぞれ表される軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３；もしくは
    （５） 配列番号：３６、配列番号：３７、および配列番号：３８でそれぞれ表される重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ３、ならびに配列番号：３９、配列番号：４０、および配列番号：４１でそれぞれ表される軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３；
    を含む抗ＧＰＣ３キメラ抗体またはヒト化抗ＧＰＣ３抗体である、請求項９から請求項１３のいずれかに記載の薬剤。
  15. 前記抗ＧＰＣ３抗体が、以下の（１）から（６）のいずれか：
    （１） 配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、および配列番号：５０で表される重鎖可変領域の群から選択される重鎖可変領域、ならびに配列番号：５１で表される軽鎖可変領域；
    （２） 配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、および配列番号：５０で表される重鎖可変領域の群から選択される重鎖可変領域、ならびに配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：５５、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：６０、配列番号：６１、配列番号：６２、配列番号：６３、配列番号：６４、配列番号：６５、および配列番号：６６で表される軽鎖可変領域の群から選択される軽鎖可変領域；
    （３） 配列番号：６７で表される重鎖可変領域、および配列番号：６８で表される軽鎖可変領域；
    （４） 配列番号：６９で表される重鎖可変領域、および配列番号：７０で表される軽鎖可変領域；
    （５） 配列番号：７１で表される重鎖可変領域、および配列番号：７２で表される軽鎖可変領域；もしくは
    （６） 配列番号：７１で表される重鎖可変領域、および配列番号：７３で表される軽鎖可変領域；
    を含む抗体である、請求項９から請求項１４のいずれかに記載の薬剤。
  16. １または２以上の抗がん剤を有効成分としてさらに含む、請求項９から請求項１５のいずれかに記載の薬剤。
  17. １または２以上の抗がん剤と同時にまたは別々に投与される、請求項９から請求項１５のいずれかに記載の薬剤。
  18. 前記抗がん剤がソラフェニブである、請求項１６または請求項１７に記載の薬剤。
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