JP7069011B2 - 間葉幹細胞由来のエクソソームおよびその使用 - Google Patents

Description

本発明は、間葉幹細胞由来のエクソソーム、同様に免疫介在性炎症性疾患の治療のためのその使用に関する。

エクソソームはほとんどの細胞種が分泌する小さな膜質小胞である。これらの小胞は細胞と細胞の伝達に関与し、それらの中身は、ＲＮＡ、脂質およびタンパク質からなる。これらのタンパク質（即ち、ＣＤ９、ＣＤ６３またはＣＤ８１）のうちのいくつかは至るところで発現されるが、細胞源によっては、細胞型特異的タンパク質がそれらの機能の原因であると見出されることがある。異なる細胞および有機体からのエクソソームの、タンパク質、脂質およびＲＮＡ発現は、ＥｘｏＣａｒｔａデータベースで広範囲に記載されている。

エクソソームは、in vitro培養細胞から超遠心分離によって容易に単離することができるが、文献では種々の単離試験計画が記載されてきた。これらのすべての試験計画は、研究の具体的な種類に基づいて互いに異なっていて、発見、診断または準備の研究のための手順として分けられる。エクソソームの臨床級での生産については、大規模生産を行うための安全な技術が絶対的な前提条件である。

前臨床のセッティングでは、特にマウスのモデルでは、エクソソームは、感染、アレルギー、同様に自己免疫疾患などの様々な疾患の治療のために適用されてきた。これらの小胞の免疫調節能に関して、最初のin vivo研究は、Ｐｅｃｈｅらが行い、骨髄の樹状細胞由来エクソソームが使用された（Peche H. et al., Transplantation 2003, 76: 1503-10; Peche H. et al., Am. J. Transplant. 2006, 6:1541-50)。前臨床研究と比較して、エクソソームを使用して行われた臨床試験はほんのわずかであった。最初の臨床試験のうちのいくつかは、樹状細胞由来エクソソームおよび腹水由来エクソソームを使用して癌患者に行われ、安全性、忍容性および効能が実証された。

現在では、ＭＳＣ由来エクソソーム（Ｅｘｏ－ＭＳＣ）の治療的有効性は、心疾患の治療のためのマウスモデルで成功裡に適用された。この意味では、異なる幹細胞サブセットで説明される血管新生効果がこの治療効果の原因かもしれない。

ＭＳＣ由来エクソソームと他の出所に由来するエクソソームとの間では、形態学的特徴、単離および保管条件の点から差異はない。同定に関しては、ｅｘｏ－ＭＳＣは、ＣＤ９とＣＤ８１などのエクソソームの共通表面マーカーだけでなく、ＭＳＣの膜上に発現するＣＤ２９、ＣＤ４４およびＣＤ７３を含むいくつかの接着分子も発現する。

証拠は蓄積され、ＭＳＣ移植の効果は、部分的にパラクリン効果によって媒介されていると考えられるということが確立された。確かに、心筋梗塞の関係では、パラクリン機序の全体的な薬効が、５０～８０％を占めることが実験的に定量化された。ＭＳＣからの終結因子を用いる利点がいくつか記載されてきた。例えば、移植した細胞は、死滅するかもしれないし、または損傷した組織の部位内へ完全にたどり着かないかもしれない一方で、生物学的因子を制御した用量で局所投与することができる。

本発明の発案者らは、ヒト脂肪間葉幹細胞から単離されたエクソソーム集団が免疫疾患の治療に有用となるような免疫調節特性を有し、具体的にはそれらはＴ細胞の分化および活性で阻害効果を発揮し（図３および４）、in vitro増殖Ｔ細胞の増殖を低減させ（図２）かつＩＦＮ－γ放出を低減させる（図５）ことを見出した。

したがって、第一の態様では、本発明は、以下を特徴とする、間葉幹細胞（ＭＳＣ）由来エクソソームに関する：
－分子量が少なくとも約３ｋＤａであり、かつ／または
－直径が約１５０～約３００ｎｍであり、かつ／または
－トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）を含んでなり、かつ／または
－低いレべルのＴＧＦ－βおよび／または潜在ＴＧＦ－βを示す。

第二の態様では、本発明は、以下を特徴とする、ＭＳＣ由来の単離されたエクソソーム集団に関する：
－エクソソームの少なくとも２０％が、少なくとも約３ｋＤａの平均分子量を有し、かつ／または
－エクソソームの少なくとも２０％が、約１５０～約３００ｎｍの平均直径を有し、かつ／または
－当該集団からのエクソソームがＴＳＰ－１を含んでなり、かつ／または
－エクソソームが低いレべルのＴＧＦ－βおよび／または潜在ＴＧＦ－βを示す。

第三の態様では、本発明は、以下を含んでなる、ＭＳＣ由来の単離されたエクソソーム集団の調製方法に関する：
ａ）３ｋＤａカットオフ膜を用いて細胞を含まないＭＳＣ馴化培地を濾過して残留物（retentate）を回収すること、または
ｂ）細胞を含まないＭＳＣ馴化培地を、エクソソームを沈殿させるのに十分な速度で遠心分離してペレットを回収すること。

第四の態様では、本発明は、第三の態様の方法によって得られた、単離されたＭＳＣ由来のエクソソーム集団に関する。

第五の態様では、本発明は、ＴＧＦ－β阻害剤と組み合わせた、四つの態様のうち第二の態様による単離されたエクソソーム集団を含んでなる組成物に関する。

第六の態様では、本発明は、第一の態様のエクソソームまたは本発明の第二または第四の態様の単離されたエクソソーム集団を含んでなる、医薬組成物に関する。

第七の態様では、本発明は、免疫介在性炎症性疾患を、当該疾患に罹患した対象において治療する方法であって、当該対象に、治療上効果的な量の、第一の態様のエクソソーム、本発明の第二または第四の態様の単離されたエクソソーム集団、第五の態様による本発明による単離されたエクソソーム集団およびＴＧＦ－β阻害剤を含んでなる医薬組成物あるいは本発明の第六の態様による医薬組成物を投与することを含んでなる方法に関する。

Ａ）ｅｘｏ－ｈＡＳＣの頻度粒度分布グラフ。エクソソームサンプルにナノ粒子追跡分析を行い、粒度分布および粒子濃度（ｎＤ６）を定量化した。ナノ粒子追跡分析の代表的グラフが示されている。 Ｂ）ｅｘｏ－ｈＡＳＣ中に同定されたタンパク質。サンプルはＳＤＳポリアクリルアミドゲルによって分離した。タンパク質はクーマシィーブルーで視認され、バンドは切断して切断して分解した。結果として生じたペプチドは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。タンパク質同定はＳＥＱＵＥＳＴおよびＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースを用いて行なった。 in vitro刺激ＰＢＬｓの増殖能はｅｘｏ－ｈＡＳＣによって縮小される。ＰＢＬは、単独で培養か、異なる濃度（ＰＢＬ１００万個当たりにエクソソーム４、８および１６ｍｇ）で、異なるバッチのｅｘｏ－ｈＡＳＣ（ｎＤ８）と共培養した。６日目で、ＰＢＬを回収し、Ｔリンパ球サブセットを、抗－ＣＤ３、抗－ＣＤ４および抗－ＣＤ８で染色した。ＣＦＳＥ標識細胞の蛍光プロファイルから、８個の分裂を同定できた。各細胞分裂周期（＃として示す）中の集団全体のパーセンテージを示す、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の詳細な図（Ａ）およびヒストグラムの図（Ｂ）が提供されている。異なる細胞分裂周期でのリンパ球サブセットの統計的比較も提供されている（Ｃ）。水平の棒は、グループ間の統計的有意差（ｐ±０．０５で有意）を表わす。 ｅｘｏ－ｈＡＳＣの存在下で共培養したin vitro刺激Ｔ細胞上の ＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７の発現パーセンテージ。６日目で、in vitro刺激ＰＢＬを、ＣＤ８^＋およびＣＤ４^＋Ｔ細胞サブセットのＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７について分析した。異なるドナーからの細胞１６ｍｇ／１０^６個での異なる２つのｅｘｏ－ｈＡＳＣをこれらの実験で使用した（Ｅｘｏｓ＃１およびＥｘｏｓ＃２）。グラフでは、対照と称された標準化された定量的発現（ｅｘｏ－ｈＡＳＣ不在下でのin vitro刺激Ｔ細胞）を示す。棒に示された値は、独立に行なった３つの実験の平均±ＳＤを表わす。水平棒は、刺激ＰＢＬのグループ間の統計的有意差（ｐ±０．１で有意）を表わす。 ｅｘｏ－ｈＡＳＣ存在下で共培養されたin vitro刺激Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７共発現。６日目に、in vitro刺激ＰＢＬを、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７の共発現のために分析した。ＣＤ４５ＲＡアイソフォームおよびＣＣＲ７は、Ｔ細胞の４つのサブセットを識別した：最終分化ＲＡ^＋Ｔ細胞（ＴＥＭＲＡ、ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＣＲ７^－）、未感作Ｔ細胞（ＮＡＩＶＥ、ＣＣＲ７^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋）ならびに２つのメモリーサブセット：エフェクターメモリー（ＥＭ、ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＣＲ７^－）およびセントラルメモリー（ＣＭ、ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＣＲ７^＋）。これらの実験では異なるドナーからの異なる２つのエクソソーム（Ｅｘｏｓ＃１およびＥｘｏｓ＃２）を使用した。示された値は、３つの独立に行なった実験の平均±ＳＤを表わす。 ｅｘｏ－ｈＡＳＣはin vitro刺激Ｔ細胞中のＩＦＮ－γ生成を阻害する。これらの実験では異なるドナーからの異なる２つのエクソソーム（Ｅｘｏｓ＃１およびＥｘｏｓ＃２）を使用した。グラフは、３つの独立に行なった実験の平均±ＳＤを表わす。各条件の図の点のプロットは下記各グラフで示され、四分円中の数字は、ゲーティングされたＣＤ４^＋（Ａ）およびＣＤ８^＋Ｔ細胞（Ｂ）中のＩＦＮ－γパーセンテージを示す（ｐ±０．０５で有意）。 異なる方法で単離したエクソソーム中の総タンパク質濃度の測定。総タンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄ法で決定した。吸収値はウシ血清アルブミンの標準曲線から推定した。アステリスクは、グループ間の統計的有意差を示す（ｐ≦０．０５）。 サンプル中の粒度決定。グラフおよび表では、測定のグラフ的な図および統計的な図が示されている。アステリスクは、グループ間の統計的有意差を示す（ｐ≦０．０５）。 異なるサンプルからの粒度の代表図。粒子のサイズはＮａｎｏＳｉｇｈｔで決定した。Ｘ軸の目盛は、１区分につき１００ｎｍを指す。Ｙ軸の目盛は、１ｍｌ当たりの粒子で表現した粒子濃度を表わす。 異なるサンプルからの粒度数の決定。エクソソームが富化した画分中の粒子の数をＮａｎｏＳｉｇｈｔで決定した。 ＴＧＦ－β１ＥＬＩＳＡによる異なるエクソソームの分析。異なるドナーのエクソソームの平均および標準偏差をＥｘｏｈＡＳＣ（ｎ＝３）、およびｅｘｏＭｅｎＳＣ（ｎ＝４）について示した。サンプルはＴＧＦ－β１ ＥＬＩＳＡによって酸処理した後に分析し、かつＬＡＰ ＥＬＩＳＡによる酸処理をすることなく分析した。

発明の具体的説明

エクソソーム
第一の態様では、本発明は、間葉幹細胞（ＭＳＣ）由来のエクソソームに関し、以降第一の態様のエクソソームは以下を特徴とする：
－分子量が少なくとも約３ｋＤａであり、かつ／または
－直径が約１５０～約３００ｎｍであり、かつ／または
－トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）を含んでなり、かつ／または
－低いレべルのＴＧＦ－βおよび／または潜在ＴＧＦ－βを示す。

「エクソソーム」という用語は、本明細書で使用する場合、細胞由来の膜質小胞を指す。エクソソームはほとんどの細胞種から放出され、多くの体液で見つけることができる。第一の態様のエクソソームは間葉幹細胞に由来する。

「間葉幹細胞」または「ＭＳＣ」という用語は、本明細書で使用する場合、とりわけ、結合組織、骨髄間質、脂肪細胞、真皮および筋肉ならびに月経組織を含む、大規模な発現型の変種を有する後代細胞を生成する自己再生能力および分化能力を有する、中胚葉由来の多能性の体性幹細胞を指す。ＭＳＣは、一般にマーカーＣＤ１９、ＣＤ４５、ＣＤ１４およびＨＬＡ－ＤＲに陰性であって、マーカーＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ９０およびＣＤ７３には陽性であることを特徴とする細胞マーカー発現プロファイルを有している。

本発明で使用するＭＳＣは、（ｉ）抗原提示細胞に特定のマーカーを発現しないこと、（ｉｉ）構造的に、ＩＤＯ（インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ）を発現しないこと、（ｉｉｉ）ＩＦＮ－ガンマで刺激した後にＩＤＯを発現すること、（ｉｖ）少なくとも２つの細胞系譜に分化する能力を示すことを特徴とすることが好ましい。あるいは、本発明で使用するＭＳＣは、一式のマーカーの存在または不在により特徴づけられることが好ましく、即ち、それら細胞は（ｉ）ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ５１、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ９０またはＣＤ１０５を発現すること、および（ｉｉ）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１０２、ＣＤ１０４、ＣＤ１０６またはＣＤ１３３を発現しないことを特徴とする。

ＭＳＣは任意の組織種から単離してもよい。一般に、ＭＳＣは、骨髄、脂肪組織、臍帯、末梢血または月経組織から単離するだろう。特別の実施態様では、ＭＳＣは脂肪組織由来幹細胞である。

「脂肪組織由来幹細胞」または「ＡＳＣ」という用語は、本明細書で使用する場合、脂肪組織由来のＭＳＣを指す。ＡＳＣは、当技術で既知の方法によって、例えば、下記の「ヒト脂肪間葉幹細胞単離および増殖」に記載の方法によって脂肪組織から単離することができる。「脂肪組織」とは、任意の脂肪組織を意味する。脂肪組織は、例えば皮下部分、大網部分／内臓部分、乳房部分、生殖腺部分、周辺臓器（periorgan）部分または他の脂肪組織部分に由来する褐色脂肪組織または白色脂肪組織であってもよい。好ましくは、脂肪組織は皮下白色脂肪組織である。脂肪組織は初代細胞培養物または不死化細胞株を含んでなり得る。脂肪組織は脂肪組織を有する任意の有機体からでもよい。いくつかの実施態様では、脂肪組織は哺乳類であり、さらなる実施態様では、脂肪組織はヒトである。脂肪組織の便利な源は脂肪吸引外科手術である。しかしながら、脂肪組織源も脂肪組織の単離方法も、本発明にとっては重大でないことが理解されよう。特別の実施態様では、対象の脂肪吸引物（lipoaspirate）からＡＳＣを単離する。

「月経組織」という用語は、本明細書で使用する場合、子宮の内壁に由来する粘膜であって、月経中に膣から放出されるものであり、通常、月経直前に存在するままの子宮組織部分、膣の粘液内層からの細胞および膣のフローラを構築する細菌からなるものである。月経組織からのＭＳＣの単離方法は、当技術で周知である（例えば、Rossignioli et al., Biomed Res Int. 2013; 2013: 901821; Xu et al., Stem Cells International, 2016, 2016: 3573846; Alcayaga-Miranda et al., Stem Cell Research & Therapy, 20156:32を参照のこと）。

ＭＳＣは任意の動物に由来し得、好ましくは非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットまたはマウス）および霊長類（例えば、サルまたはヒト）を含む。特別の実施態様では、ＭＳＣはヒトである。

第一の態様のエクソソームは、次の特徴の１つ以上を特徴とする:
－分子量が少なくとも約３ｋＤａであり、かつ／または
－直径が約１５０～約３００ｎｍであり、かつ／または
－トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）を含んでなり、かつ／または
－低いレべルのＴＧＦ－βおよび／または潜在ＴＧＦ－βを示す。

本明細書で使用する場合、「約」という用語は、指定値の若干の変動、好ましくは指定値の１０パーセント以内を意味する。しかしながら、「約」という用語は、例えば、使用する実験技術に応じて、変動のより高い許容性を意味することができる。当該所定値の変動は当業者であれば理解するものであり、本発明の範囲内である。さらに、より簡潔な説明を提供するために、本明細書で示す定量的表現のうちのいくつかは「約」という用語で修飾されていない。「約」という用語が明示的に使用されているか否かにかかわらず、本明細書に示された全ての量は、実際の所与の値を指すことを意味し、実験および／または測定の条件によるそのような所与の値への同等値および近似値を含む、当業者により合理的に推測されるであろうそのような所与の値の近似値を意味すると理解される。

（ａ）少なくとも約３ｋＤａの分子量
本明細書で使用する場合、「分子量」という用語は、分子中の全ての原子の原子量の合計を指す。したがって、第一の態様のエクソソームの分子量は、当該エクソソーム中に含まれてなる分子中の全ての原子の原子量の合計である。エクソソームの分子量は、特定のカットオフを有する膜を用いて決定することができる。当業者であれば理解するように、エクソソームを含有しているサンプルが３ｋＤａカットオフ膜を通過した場合、結果として生じる残留物中に存在するエクソソームの分子量は３ｋＤａ以上となり、一方で溶出液に存在するエクソソームの分子量は３ｋＤａ未満となるだろう。特別の実施態様では、第一の態様のエクソソームの分子量は少なくとも約３ｋＤａ、例えば少なくとも約５ｋＤａ、少なくとも約１０ｋＤａ、少なくとも約２０ｋＤａ、少なくとも約３０ｋＤａ、少なくとも約４０ｋＤａ、少なくとも約５０ｋＤａ、少なくとも約７５ｋＤａ、少なくとも約１００ｋＤａである。

（ｂ）約１５０～約３００ｎｍの直径
「直径」という用語は、本明細書で使用する場合、エクソソームの最大寸法を指し、エクソソームは必ずしも球状ではないと理解する。直径は、顕微鏡検査法技術（例えば、透過型電子顕微鏡）または光散乱法技術などのナノ粒子度を測定するための従来技術を使用して便利に測定してもよい。特定の実施態様では、第一の態様のエクソソームの直径は、国際公開第０３／０９３８０１号に記載されているように、光散乱およびブラウン（Browian）運動の両方の分析に基づく、ナノ粒子追跡分析（Nanoparticle Tracking Analysis：ＮＴＡ）を使用して測定することができる。

特別の実施態様では、第一の態様のエクソソームの直径は、約２２３～約３００ｎｍである。より特別な実施態様では、直径は約１７０～約２８３ｎｍである。より特別な実施態様では、直径は約１５０および約１９３．５ｎｍである。

（ｃ）トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）の存在
「トロンボスポンジン－１」または「ＴＳＰ－１」または「ＴＨＢＳ１」という用語は、本明細書で使用する場合、細胞から細胞へのおよび細胞からマトリックスへの相互作用を媒介する糖タンパク質を指す。ヒトでは、それは遺伝子ＴＨＢＳ１によってコードされる。ＡｐｏＣ－Ｉは任意の起源（例えば、ヒト、ウシ、マウス、ウマ、イヌ等）からのものでよい。特別な実施態様では、ＴＳＰ－１は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０７９９６号（２０１５年９月１６日公開）のヒトタンパク質である。

エクソソーム中のＴＳＰ－１の存在は、サンプル中の特定のタンパク質を検出することができる任意の方法によって決定することができる。非制限的な例証として、ＴＳＰ－１の存在は、ＴＳＰ－１（または抗原決定基を含有しているそのフラグメント）に特異的に結合することができる抗体を使用することを含んでなる技術によって、または代替的に、例えば質量分析に基づく技術など抗体の使用を含んでならない技術によって決定することができる。抗体は、モノクローナル、ポリクローナルでも、またはそれらのフラグメント、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体（diabodies）、三重特異性抗体（triabodies）、四重特異性抗体（tetrabodies）およびヒト化抗体であってもよい。同様に、抗体は標識付けされていてもよい。本明細書で使用することができるマーカーの例証となる非独占的な例としては、放射性同位体、酵素、蛍光色素分子、化学発光試薬、酵素補助因子または酵素基質、酵素阻害物質、粒子または染料が挙げられる。エクソソーム中のＴＳＰ－１の存在を決定するためには種々様々の既知の試験を使用することができ、例えば、非標識抗体（一次抗体）と標識抗体（二次抗体）の組合せ適用、ウェスタンブロット法または免疫ブロット法、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定吸着法）、ＲＩＡ（放射免疫測定）、競合ＥＩＡ（酵素免疫測定）、ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ（二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）、２次元ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、免疫細胞化学的技術、免疫組織化学的技術、免疫比濁法、免疫蛍光法、バイオチップまたは特定の抗体を含有しているタンパク質マイクロアレイ、あるいは試薬ストリップなどの形態でのコロイド析出に基づくアッセイおよび抗体結合量子ドットに基づくアッセイの使用に基づく技術である。

（ｄ）低いレべルのＴＧＦ－βおよび／または潜在ＴＧＦ－β
潜在ＴＧＦ－βレベルという用語は、本明細書で使用する場合、ＴＧＦ－βホモ二量体に加えてプロペプチド部位を含有しているＴＧＦ－β前駆体分子の複合体である小型潜在複合体（Small Latent Complex：ＳＬＣ）、ＴＧＦ－β遺伝子生成物のＮ末端領域に由来するタンパク質である潜在関連ペプチド（Latency Associated Peptide：ＬＡＰ）のいずれかのレベルを指す。別の実施態様では、潜在ＴＧＦ－βレベルという用語は、小型潜在複合体（ＳＬＣ）と潜在ＴＧＦ－β－結合タンパク質（Latent TGF-β-Binding Protein ：ＬＴＢＰ）、好ましくはＬＴＢＰ－１、ＬＴＢＰ－２、ＬＴＢＰ－３およびＬＴＢＰ－４を含んでなる複合体である大型潜在複合体（Large Latent Complex：ＬＬＣ）を指す。ＴＧＦ－βのＬＴＢＰへの結合は、ジスルフィド結合により、それによってその受容体に結合することが防止されて不活性が維持される。

一つの実施態様では、エクソソームが脂肪組織に由来するＭＳＣに由来する場合、それらのＴＧＦ－β含量は好ましくは、エクソソーム１μｇ当たりにＴＧＦ－βが０．００１～０．５μｇであり、より好ましくはエクソソーム１μｇ当たりにＴＧＦ－βが０．００５～０．０２５μｇであり、一層より好ましくはエクソソーム１μｇ当たりにＴＧＦ－βが０．０１～０．０２μｇである。

別の実施態様では、エクソソームは月経組織由来のMSCに由来し、ＴＧＦ－β含量は、エクソソーム１μｇ当たりにＴＧＦ－βが０．１～１μｇであり、より好ましくはエクソソーム１μｇ当たりにＴＧＦ－βが０．２～０．８μｇであり、一層より好ましくはエクソソーム１μｇ当たりにＴＧＦ－βが０．３～０．７μｇまたは０．４～０．６μｇである。

一つの実施態様では、エクソソームが脂肪組織に由来するＭＳＣに由来する場合、それらの潜在ＴＧＦ－β含量は好ましくは、エクソソーム１μｇ当たりに潜在ＴＧＦ－βが０．０００１～０．０１μｇであり、より好ましくはエクソソーム１μｇ当たりに潜在ＴＧＦ－βが０．０００５～０．００５μｇであり、一層より好ましくはエクソソーム１μｇ当たりに潜在ＴＧＦ－βが０．００１～０．００２μｇである。

別の実施態様では、エクソソームは月経組織由来のＭＳＣに由来し、潜在ＴＧＦ－β含量は、エクソソーム１μｇ当たりに潜在ＴＧＦ－βが０．００１～０．５μｇであり、より好ましくはエクソソーム１μｇ当たりに潜在ＴＧＦ－βが０．００５～０．０２５μｇであり、一層より好ましくはエクソソーム１μｇ当たりに潜在ＴＧＦ－βが０．０１～０．０２μｇである。

特別の実施態様では、第一の態様のエクソソームは分子量を少なくとも約３ ｋＤａとし、直径を約１５０～約３００ｎｍとする。

別の特別の実施態様では、第一の態様のエクソソームは、分子量を少なくとも約３ｋＤａとし、かつＴＳＰ－１を含んでなる。

別の特別の実施態様では、第一の態様のエクソソームは、直径を約１５０～約３００ｎｍとし、かつＴＳＰ－１を含んでなる。

別の特別の実施態様では、第一の態様のエクソソームは、分子量を少なくとも約３ｋＤａとし、直径を約１５０～約３００ｎｍとし、かつＴＳＰ－１を含んでなる。

単離されたエクソソーム集団
第二の態様では、本発明は、以下を特徴とする、ＭＳＣ由来の単離されたエクソソーム集団に関する：
－エクソソームの少なくとも２０％が、少なくとも約３ｋＤａの平均分子量を有し、かつ／または
－エクソソームの少なくとも２０％が、約１５０～約３００ｎｍの平均直径を有し、かつ／または
－当該集団からのエクソソームがＴＳＰ－１を含んでなり、かつ／または
－エクソソームが低いレべルのＴＧＦ－βおよび／または潜在ＴＧＦ－βを示す。

「エクソソーム」、「ＭＳＣ」、「分子量」、「直径」、「約」「ＴＳＰ－１」、「低いレベルのＴＧＦ－β」または「低いレベルの潜在ＴＧＦ－β」という用語は第一の態様のエクソソームに関して前に定義されている。

特別の実施態様では、ＭＳＣは脂肪組織由来幹細胞(ＡＳＣ）であり、好ましくはヒトＡＤＳＣである。別の実施態様では、ＭＳＣは月経組織、好ましくはヒト月経組織に由来する。

「エクソソーム集団」という用語は、本明細書で使用する場合、少なくとも２つのエクソソームによって形成されたセット、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも５００個または少なくとも１０００個以上のエクソソームによって形成されたセットを指す。

「単離されたエクソソーム集団」という用語は、本明細書で使用する場合、ヒトまたは動物の身体から単離したエクソソームの集団であって、in vivoまたはin vitroで当該エクソソーム集団と関係している１つ以上のエクソソーム集団を実質的に含まないエクソソームの集団を指す。特別の実施態様では、「単離されたエクソソーム集団」は、細胞または細胞残屑を実質的に含まない（例えば、当該エクソソーム集団が派生する細胞からを実質的に含まない）。

第二の態様の単離されたエクソソーム集団は、以下の特徴の１つ以上を特徴とする：
－エクソソームの少なくとも２０％が、少なくとも約３ｋＤａの平均分子量を有し、かつ／または
－エクソソームの少なくとも２０％が、約１５０～約３００ｎｍの平均直径を有し、かつ／または
－当該集団からのエクソソームがＴＳＰ－１を含んでなり、かつ／または
－低いレべルのＴＧＦ－βおよび／または潜在ＴＧＦ－βを含有する。

１．エクソソームの少なくとも２０％が、少なくとも約３ｋＤａの平均分子量を有する
「平均分子量」という用語は、本明細書で使用する場合、エクソソームの集団の５０％がこの分子量未満となるように定義した分子量の半分の値を指す。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９５％が、少なくとも３ｋＤａ、例えば少なくとも約３ｋＤａ、例えば少なくとも約１０ｋＤａ、少なくとも約２０ｋＤａ、少なくとも約３０ｋＤａ、少なくとも約４０ｋＤａ、少なくとも約５０ｋＤａ、少なくとも約７５ｋＤａ、少なくとも約１００ｋＤａの平均分子量を有する。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも２０％が、少なくとも約３ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも２０％が、少なくとも約１０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも２０％が、少なくとも約２０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも２０％が、少なくとも約３０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも２０％が、少なくとも約４０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも２０％が、少なくとも約５０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも２０％が、少なくとも約７５ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも２０％が、少なくとも約１００ｋＤａの平均分子量を有する。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも４０％が、少なくとも約３ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも４０％が、少なくとも約１０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも４０％が、少なくとも約２０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも４０％が、少なくとも約３０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも４０％が、少なくとも約４０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも４０％が、少なくとも約５０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも４０％が、少なくとも約７５ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも４０％が、少なくとも約１００ｋＤａの平均分子量を有する。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも６０％が、少なくとも約３ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも６０％が、少なくとも約１０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも６０％が、少なくとも約２０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも６０％が、少なくとも約３０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも６０％が、少なくとも約４０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも６０％が、少なくとも約５０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも６０％が、少なくとも約７５ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも６０％が、少なくとも約１００ｋＤａの平均分子量を有する。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも８０％が、少なくとも約３ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも８０％が、少なくとも約１０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも８０％が、少なくとも約２０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも８０％が、少なくとも約３０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも８０％が、少なくとも約４０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも８０％が、少なくとも約５０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも８０％が、少なくとも約７５ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも８０％が、少なくとも約１００ｋＤａの平均分子量を有する。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９０％が、少なくとも約３ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９０％が、少なくとも約１０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９０％が、少なくとも約２０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９０％が、少なくとも約３０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９０％が、少なくとも約４０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９０％が、少なくとも約５０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９０％が、少なくとも約７５ｋＤａの平均分子量を有するを有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９０％が、少なくとも約１００ｋＤａの平均分子量を有する。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９５％が、少なくとも約３ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９５％が、少なくとも約１０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９５％が、少なくとも約２０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９５％が、約３０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９５％が、少なくとも約４０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９５％が、約５０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９５％が、少なくとも約７５ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９５％が、少なくとも約１００ｋＤａの平均分子量を有する。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９９％が、少なくとも約３ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９９％が、少なくとも約１０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９９％が、少なくとも約２０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９９％が、少なくとも約３０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９９％が、少なくとも約４０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９９％が、少なくとも約５０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９９％が、少なくとも約７５ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９９％が。少なくとも約１００ｋＤａの平均分子量を有する。

２．エクソソームの少なくとも２０％が、約１５０～約３００ｎｍの平均直径を有する
「平均分子直径」という用語は、本明細書で使用する場合、エクソソームの集団の５０％がこの直径未満となるように定義した分子量の半分の値を指す。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９５％が、約１５０～約３００ｎｍ、より具体的には約２２３～約３００ｎｍ、一層より具体的には約１５０～約１９３．５ｎｍのの平均直径を有する。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも２０％が、約１５０～約３００ｎｍのの平均直径を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも２０％が、約２２３～約３００ｎｍのの平均直径を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも２０％が、約１５０～約１９３．５ｎｍのの平均直径を有する。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも４０％が、約１５０～約３００ｎｍのの平均直径を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも４０％が、約２２３～約３００ｎｍのの平均直径を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも４０％が、約１５０～約１９３．５ｎｍのの平均直径を有する。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも６０％が、約１５０～約３００ｎｍのの平均直径を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも６０％が、約２２３～約３００ｎｍのの平均直径を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも６０％が、約１５０～約１９３．５ｎｍのの平均直径を有する。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも８０％が、約１５０～約３００ｎｍのの平均直径を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも８０％が、約２２３～約３００ｎｍのの平均直径を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも８０％が、約１５０～約１９３．５ｎｍのの平均直径を有する。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９０％が、約１５０～約３００ｎｍのの平均直径を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９０％が、約２２３～約３００ｎｍのの平均直径を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９０％が、約１５０～約１９３．５ｎｍのの平均直径を有する。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９５％が、約１５０～約３００ｎｍのの平均直径を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９５％が、約２２３～約３００ｎｍのの平均直径を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９５％が、約１５０～約１９３．５ｎｍのの平均直径を有する。

特別の実施態様では、第二の態様のエクソソームの集団の少なくとも２０％が少なくとも約３ｋＤａの平均分子量を有し、エクソソームの集団の少なくとも２０％が、約１５０～約３００ｎｍのの平均直径を有する。

（３）トロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）の存在
「トロンボスポンジン－１」または「ＴＳＰ－１」または「ＴＨＢＳ１」という用語は、本明細書で使用する場合、細胞から細胞へのおよび細胞からマトリックスへの相互作用を媒介する糖タンパク質を指す。ＡｐｏＣ－Ｉは任意の起源でよく、例えば、ヒト、ウシ、マウス、ウマ、イヌ等でよい。特別な実施態様では、ＴＳＰ－１は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０７９９６号（２０１５年９月１６日公開）のヒトタンパク質である。

エクソソーム中のＴＳＰ－１の存在は、サンプル中の特定のタンパク質を検出することができる任意の方法によって決定することができる。非制限的な例証として、ＴＳＰ－１の存在は、ＴＳＰ－１（または抗原決定基を含有しているそのフラグメント）に特異的に結合することができる抗体を使用することを含んでなる技術によって、または代替的に、例えば質量分析に基づく技術など抗体の使用を含んでならない技術によって決定することができる。抗体は、モノクローナル、ポリクローナルでも、またはそれらのフラグメント、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体およびヒト化抗体であってもよい。同様に、抗体は標識付けされていてもよい。本明細書で使用することができるマーカーの例証となる非独占的な例としては、放射性同位体、酵素、蛍光色素分子、化学発光試薬、酵素補助因子または酵素基質、酵素阻害物質、粒子または染料が挙げられる。エクソソーム中のＴＳＰ－１の存在を決定するためには種々様々の既知の試験を使用することができ、例えば、非標識抗体（一次抗体）と標識抗体（二次抗体）の組合せ適用、ウェスタンブロット法または免疫ブロット法、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定吸着法）、ＲＩＡ（放射免疫測定）、競合ＥＩＡ（酵素免疫測定）、ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ（二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）、２次元ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、免疫細胞化学的技術、免疫組織化学的技術、免疫比濁法、免疫蛍光法、バイオチップまたは特定の抗体を含有しているタンパク質マイクロアレイ、あるいは試薬ストリップなどの形態でのコロイド析出に基づくアッセイおよび抗体結合量子ドットに基づくアッセイの使用に基づく技術である。

（４）低いレべルのＴＧＦ－βおよび／または潜在ＴＧＦ－β
潜在ＴＧＦ－βレベルという用語は、本明細書で使用する場合、ＴＧＦ－βホモ二量体に加えてプロペプチド部位を含有しているＴＧＦ－β前駆体分子の複合体である小型潜在複合体（ＳＬＣ）、ＴＧＦ－β遺伝子生成物のＮ末端領域に由来するタンパク質である潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）のいずれかのレベルを指す。別の実施態様では、潜在ＴＧＦ－βレベルという用語は、小型潜在複合体（ＳＬＣ）と潜在ＴＧＦ－β－結合タンパク質（ＬＴＢＰ）、好ましくはＬＴＢＰ－１、ＬＴＢＰ－２、ＬＴＢＰ－３およびＬＴＢＰ－４を含んでなる複合体である大型潜在複合体（ＬＬＣ）を指す。ＴＧＦ－βのＬＴＢＰへの結合は、ジスルフィド結合により、それによってその受容体に結合することが防止されて不活性が維持される。

一つの実施態様では、ＴＧＦ－βは、ＴＧＦβ－１、ＴＧＦβ－２またはＴＧＦβ－３あるいはそれらの任意の組合せであってもよい。

一つの実施態様では、エクソソームが脂肪組織に由来するＭＳＣに由来する場合、それらのＴＧＦ－β含量は好ましくは、エクソソーム１μｇ当たりにＴＧＦ－βが０．００１～０．５ｎｇであり、より好ましくはエクソソーム１μｇ当たりにＴＧＦ－βが０．００５～０．０２５ｎｇであり、一層より好ましくはエクソソーム１μｇ当たりにＴＧＦ－βが０．０７５～０．２ｎｇである。

別の実施態様では、エクソソームは月経組織由来のＭＳＣに由来し、ＴＧＦ－β含量は、エクソソーム１μｇ当たりにＴＧＦ－βが０．１～１ｎｇであり、より好ましくはエクソソーム１μｇ当たりにＴＧＦ－βが０．２～０．８ｎｇであり、一層より好ましくはエクソソーム１μｇ当たりにＴＧＦ－βが０．３～０．７ｎｇまたはエクソソーム１ｎｇ当たりにＴＧＦ－βが０．４～０．６μｇである。

一つの実施態様では、エクソソームが脂肪組織に由来するＭＳＣに由来する場合、それらの潜在ＴＧＦ－β含量は好ましくは、エクソソーム１μｇ当たりに潜在ＴＧＦ－βが０．０００１～０．０１ｎｇであり、より好ましくはエクソソーム１μｇ当たりに潜在ＴＧＦ－βが０．０００５～０．０１ｎｇであり、一層より好ましくはエクソソーム１μｇ当たりに潜在ＴＧＦ－βが０．００１～０．００５μｇである。

別の実施態様では、エクソソームは月経組織由来のＭＳＣに由来し、潜在ＴＧＦ－β含量は、エクソソーム１μｇ当たりに潜在ＴＧＦ－βが０．００１～０．５ｎｇであり、より好ましくはエクソソーム１μｇ当たりに潜在ＴＧＦ－βが０．００５～０．０２５ｎｇであり、一層より好ましくはエクソソーム１μｇ当たりに潜在ＴＧＦ－βが０．０１～０．０２ｎｇである。

一つの実施態様では、ＴＧＦ－βまたは潜在ＴＧＦ－βの含量は、場合によっては、エクソソームタンパク質１μｇ当たりに、ＴＧＦ－βまたは潜在ＴＧＦ－βのナノグラムで提供される。別の実施態様では、場合によっては、エクソソームの合計重量１μｇ当たり（即ち、タンパク質および脂質を含む）に、ＴＧＦ－βまたは潜在ＴＧＦ－βのナノグラムで提供される。

別の特別の実施態様では、第二の態様のエクソソームの集団の少なくとも２０％は、少なくとも約３ｋＤａの平均分子量を有し、エクソソームの集団はＴＳＰ－１を含んでなる。

別の特別の実施態様では第二の態様のエクソソームの集団の少なくとも２０％は約１５０～約３００ｎｍの平均直径を有し、ＴＳＰ－１を含んでなる。

別の特別の実施態様では、第二の態様のエクソソームの集団の少なくとも２０％は、少なくとも約３ｋＤａの平均分子量を有し、エクソソームの集団の少なくとも２０％は、約１５０～約３００ｎｍの平均直径を有し、エクソソームの集団は、ＴＳＰ－１を含んでなる。

ＭＳＣに由来する単離されたエクソソーム集団の調製方法およびそれから得られたエクソソーム集団
第三の態様では、本発明は、以下を含んでなる、ＭＳＣ由来の単離されたエクソソーム集団の調製方法に関する：
ａ）３ｋＤａカットオフ膜を用いて細胞を含まないＭＳＣ馴化培地を濾過して残留物を回収すること、または
ｂ）細胞を含まないＭＳＣ馴化培地を、エクソソームを沈殿させるのに十分な速度で遠心分離してペレットを回収すること。

「単離されたエクソソーム集団」および「ＭＳＣ」という用語は、本発明の第一の態様のエクソソームに関連して前に定義されている。

特別の実施態様では、ＭＳＣは脂肪組織由来幹細胞（ＡＳＣ）である。別の態様では、ＭＳＣは月経組織由来のＭＳＣである。

特別の実施態様では、ＭＳＣはヒトである。

第三の態様の方法は、３ｋＤａカットオフ膜を使用した、細胞を含まないＭＳＣ馴化培地を濾過する第一工程を含んでなる。

「細胞を含まないＭＳＣ馴化培地」という用語は、本明細書で使用する場合、培養物中のＭＳＣと接触させた、細胞を実質的に含まない培地を指す。「培地」または「培養培地」という用語は、本明細書で使用する場合、細胞を取り囲む環境の成分を含む、生細胞の培養に使用する任意の物質または調製物を指す。培地は、ＭＳＣを培養するために十分な任意の培地でよく、例えば、抗生物質（例えば、ペニシリン１００単位／ｍｌおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ）との、または抗生物質なしのダルベッコ改変イーグル培地）（ＤＭＥＭ）およびグルタミン２ｍＭでよく、２％～２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補給してもよい。特別の実施態様では、ＭＳＣ馴化培地は、ウシ胎児血清、ウシ血清（ＢＳ）、子ウシ血清（ＣＳ）、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、新生子ウシ血清（ＮＣＳ）、ヤギ血清（ＧＳ）、ウマ血清（ＨＳ）、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清、ラット血清（ＲＳ）を含む任意の血清種を含んでならない。別の特別の実施態様では、ＭＳＣ馴化培地はインシュリン－トランスフェリン－セレニウムを含んでなる。より特別な実施態様では、ＭＳＣ馴化培地はインシュリン－トランスフェリン－セレニウムを１％含有しているＤＭＥＭである。

特別の実施態様では、ＭＳＣ馴化培地は、ＭＳＣ培養物と少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日以上接触させたものである。より特別な実施態様では、ＭＳＣ馴化培地は３日または４日ＭＳＣと接触させたものである。

細胞を含まないＭＳＣ馴化培地は、細胞のない培養培地を回収することを可能にする、任意の当業者にとって周知の方法によって得ることができる。例えば、培地は、ＭＳＣの単層培養物から回収することができる。

特別の実施態様では、細胞を含まないＭＳＣ馴化培地は、ＭＳＣ培養物から培地を回収し、当該培地を遠心分離機にかけて、細胞および残骸を除去して上澄みを回収することによって得られる。より特別な実施態様では、細胞および残骸は、培地を２連続で１０００×ｇおよび５０００×ｇでそれぞれ遠心分離にかけることによって除去される。一層より特別な実施態様では、これらの遠心分離は４℃で行なわれる。さらにより特別な実施態様では、第一の遠心分離は約１０分続き、第二の遠心分離は約２０分続く。

第三の態様の方法の第一工程は、３ｋＤａカットオフ膜を用いて細胞を含まないＭＳＣ馴化培地を濾過して残留物を回収することを含んでなる。「濾過する」という用語は、本明細書で使用する場合、ＭＳＣ馴化培地を、膜に通過させることを意味する。「３ｋＤａカットオフ膜」という用語は、本明細書で使用する場合、３ｋＤａ未満の粒子を通過させるが、３ｋＤａ以上の粒子の通過を防止する直径の孔を有する材料の多孔性平面シートを指す。ＭＳＣ馴化培地は、３ｋＤａカットオフ膜で、任意の適当な技術、例えば、３ｋＤａカットオフ膜を備えた遠心チューブ上で培地を遠心分離機にかけることによって、濾過することができる。膜は任意の好適な材料、例えばセルロースでもよい。

「残留物」という用語は、本明細書で使用する場合、３ｋＤａカットオフ膜を通過することができない培地の部分を指す。

第三の態様の方法の第二工程は、細胞を含まないＭＳＣ馴化培地を、エクソソームを沈殿させるのに十分な速度で遠心分離してペレットを回収することを含んでなる。

「遠心分離機にかける」という用語は、本明細書で使用する場合、細胞を含まないＭＳＣ馴化培地を遠心力にかけて、当該培地の成分を、当該遠心力を与えてそれらの異なる挙動に基づき分離させることを指す。「エクソソームを沈殿させるのに十分な速度」は、エクソソームのサイズに応じて当業者が決定できる。特別の実施態様では、エクソソームを沈殿させるのに十分な速度は１００．０００ｇ～１．０００．０００ｇであり、したがって、遠心分離は超遠心分離である。より特別な実施態様では、遠心分離は１０００００×ｇで行なわれる。特別の実施態様では、遠心分離は３０分～１２時間続けられる。より特別な実施態様では、遠心分離は２時間～１０時間続けられる。一層より特別な実施態様では、遠心分離は約６時間続けられる。

第四の態様では、本発明は、第三の態様の方法によって得られたＭＳＣ由来の単離されたエクソソーム集団に関する。

特別の実施態様では、ＭＳＣは脂肪組織由来幹細胞（ＡＳＣ）である。

特別の実施態様では、ＭＳＣはヒトである。

本発明によるエクソソーム含有組成物およびその使用
第五の態様では、本発明は、本発明の第二または第四の態様によるエクソソーム集団およびＴＧＦ－β阻害剤を含んでなる組成物に関する。

「エクソソーム」、「単離されたエクソソーム集団」、「ＭＳＣ」、「分子量」、「平均分子量」、「直径」、「平均直径」、「約」および「ＴＳＰ－１」という用語は、本発明の第一の態様のエクソソームに関して前に定義されていて、本明細書で定義するエクソソーム含有組成物に等しく適用可能である。

「ＴＧＦ－β阻害剤」という用語は、本明細書で使用する場合、ＴＧＦ－βとその受容体との間の相互作用に起因するシグナル変換を防止することができる任意の化合物として理解される。本発明によって使用することができるＴＧＦ－β阻害剤は、ＴＧＦ－βのその受容体への競合的結合またはアロステリック結合を防止する化合物、ＴＧＦ－βに結合する化合物およびＴＧＦ－βの細胞間シグナリングを阻害する化合物を含む。ＴＧＦ－β阻害剤の阻害能を決定する適切なアッセイは、Ｍｖ－１－Ｌｕ細胞増殖アッセイでの阻害剤を使用することによるＴＧＦ－β生物活性のin vitro阻害、同様にＣＣｌ４に誘発された急性肝損傷モデルを使用する阻害剤によてうＴＧＦ－β生物活性のin vivo阻害（国際公開第２００５１９２４４号）を含む。ＴＧＦ－βアンタゴニストに関する詳細については、Wojtowicz-Praga (2003)も参照のこと。

一つの実施態様（ＴＧＦ）では、ＴＧＦ－β阻害剤は特定のＴＧＦ－β１阻害剤、特定のＴＧＦ－β２阻害剤または特定のＴＧＦ－β３阻害剤である。別の実施態様では、特定のＴＧＦ－β阻害剤は、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２およびＴＧＦ－β３を含むすべてのＴＧＦ－βアイソフォームを阻害することができる。

ＴＧＦ－β阻害剤は、ＴＧＦ－βとその受容体との間の相互作用に起因するシグナル変換を少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％（即ち、無し）防止することができる。

本発明で使用する好適なＴＧＦ－β阻害剤は限定することなく、表１中に定義されるものである：

「多形体」という用語は、本明細書で使用する場合、Ｘ線回折図形、ＩＲスペクトル、相転移点などによって説明される、特定の物理的性質を有する、物質の特定の結晶状態を指す。異なる多形体は、結晶充填（充填多型性）の差または同一の分子の異なる配座異性体間の充填の差（立体配座の多型性）に起因し得る。

好ましい実施態様では、ＴＧＦ－β阻害剤は、Ｘ線粉末回折図形（Ｃｕ放射、λ＝１．５４０５６Å）によって特徴づけられた結晶性ＬＹ２１５７２９９一水和物であって、９．０５でのピークならびに１１．０２、１１．９５および１４．８４（２θ＋／・０．１°）を含んでなる群から選択される１つ以上のピークを含んでなる。

好ましい実施態様では、ＴＧＦ－β阻害剤は、Ｘ線粉末回折図形（Ｃｕ放射、λ＝１．５４０５６Å）によってさらに特徴づけられた結晶のＬＹ２１５７２９９一水和物であって、９．０５でのピーク（２θ＋／・０．１°）を含んでなる。

別の好ましい実施態様では、ＴＧＦ－β阻害剤は、化学シフトが１０８．８、１１５．６、１２２．６および１７１．０（＋／－０．２）ｐｐｍである、固形状１３Ｃの核磁気共鳴によって特徴づけられた結晶性ＬＹ２１５７２９９一水和物である。

本明細書で使用する場合、「溶媒和物」という用語は、非共有結合の分子間力によって結合している、化学量論量または非化学量論量の、水、アセトン、エタノール、メタノール、ジクロロメタン、２－プロパノールなどの溶媒をさらに含む化合物を意味する。溶媒が水である場合、溶媒和物の代わりに「水和物」という用語を使用する。

本発明は、そのようなポリペプチドと特異的に結合し、かつＴＧＦ－βのシグナル伝達活性を中和する抗体および抗体フラグメントをさらに提供する。典型的な中和抗体にはポリクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体由来のヒト化抗体、およびヒトモノクローナル抗体が含まれる。具体的な抗体フラグメントとしてはＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖおよび最小の認識単位が挙げられる。

本発明の組成物の単離されたエクソソーム集団を形成する部分は、次の１つ以上の特徴によって特徴づけられる:
－エクソソームの少なくとも２０％が少なくとも約３ｋＤａの平均分子量を有し、かつ／または
－エクソソームの少なくとも２０％が約１５０～約３００ｎｍのの平均直径を有し、かつ／または
－当該集団からのエクソソームがＴＳＰ－１を含んでなり、かつ／または
－エクソソームが低いレべルのＴＧＦ－βおよび／または潜在ＴＧＦ－βを示す。

特別の実施態様では、ＭＳＣは脂肪組織由来幹細胞（ＡＳＣ）である。別の実施態様では、ＭＳＣは月経組織に由来する。別の特別の実施態様では、ＭＳＣはヒトである。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９５％が、少なくとも３ｋＤａ、例えば少なくとも約３ｋＤａ、例えば少なくとも約１０ｋＤａ、少なくとも約２０ｋＤａ、少なくとも約３０ｋＤａ、少なくとも約４０ｋＤａ、少なくとも約５０ｋＤａ、少なくとも約７５ｋＤａ、少なくとも約１００ｋＤａの平均分子量を有する。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも２０％が少なくとも約３ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも２０％が少なくとも約１０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも２０％が少なくとも約２０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも２０％が少なくとも約３０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも２０％が少なくとも約４０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも２０％が少なくとも約５０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも２０％が少なくとも約７５ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも２０％が少なくとも約１００ｋＤａの平均分子量を有する。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも４０％が少なくとも約３ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも４０％が少なくとも約１０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも４０％が少なくとも約２０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも４０％が少なくとも約３０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも４０％が少なくとも約４０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも４０％が少なくとも約５０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも４０％が少なくとも約７５ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも４０％が少なくとも約１００ｋＤａの平均分子量を有する。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも６０％が少なくとも約３ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも６０％が少なくとも約１０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも６０％が少なくとも約２０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも６０％が少なくとも約３０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも６０％が少なくとも約４０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも６０％が少なくとも約５０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも６０％が少なくとも約７５ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも６０％が少なくとも約１００ｋＤａの平均分子量を有する。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも８０％が少なくとも約３ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも８０％が少なくとも約１０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも８０％が少なくとも約２０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも８０％が少なくとも約３０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも８０％の平均分子量を有するが少なくとも約４０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも８０％が少なくとも約５０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも８０％が少なくとも約７５ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも８０％が少なくとも約１００ｋＤａの平均分子量を有する。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９０％が少なくとも約３ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９０％が少なくとも約１０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９０％が少なくとも約２０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９０％が少なくとも約３０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９０％が少なくとも約４０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９０％が少なくとも約５０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも６０％が少なくとも約７５ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９０％が少なくとも約１００ｋＤａの平均分子量を有する。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９５％が少なくとも約３ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９５％が少なくとも約１０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９５％が少なくとも約２０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９５％が少なくとも約３０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９５％が少なくとも約４０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９５％が少なくとも約５０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも６０％が少なくとも約７５ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９５％が少なくとも約１００ｋＤａの平均分子量を有する。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９９％が少なくとも約３ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９９％が少なくとも約１０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９９％が少なくとも約２０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９９％が少なくとも約３０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９９％が少なくとも約４０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９９％が少なくとも約５０ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９９％が少なくとも約７５ｋＤａの平均分子量を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９９％が少なくとも約１００ｋＤａの平均分子量を有する。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９５％が、約１５０～約３００ｎｍ、より具体的には約２２３～約３００ｎｍ、一層より具体的には約１５０～約１９３．５ｎｍの平均直径を有する。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも２０％が、約１５０～約３００ｎｍの平均直径を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも２０％が、約２２３～約３００ｎｍの平均直径を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも２０％が、約１５０～約１９３．５ｎｍの平均直径を有する。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも４０％が、約１５０～約３００ｎｍの平均直径を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも４０％が、約２２３～約３００ｎｍの平均直径を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも４０％が、約１５０～約１９３．５ｎｍの平均直径を有する。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも６０％が、約１５０～約３００ｎｍの平均直径を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも６０％が、約２２３～約３００ｎｍの平均直径を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも６０％が、約１５０～約１９３．５ｎｍの平均直径を有する。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも８０％が、約１５０～約３００ｎｍの平均直径を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも８０％が、約２２３～約３００ｎｍの平均直径を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも８０％が、約１５０～約１９３．５ｎｍの平均直径を有する。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９０％が、約１５０～約３００ｎｍの平均直径を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９０％が、約２２３～約３００ｎｍの平均直径を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９０％が、約１５０～約１９３．５ｎｍの平均直径を有する。

特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９５％が、約１５０～約３００ｎｍの平均直径を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９５％が、約２２３～約３００ｎｍの平均直径を有する。別の特別の実施態様では、エクソソームの少なくとも９５％が、約１５０～約１９３．５ｎｍの平均直径を有する。

特別の実施態様では、本発明による組成物のエクソソームの少なくとも２０％が少なくとも約３ｋＤａの平均分子量を有し、エクソソームの集団の少なくとも２０％が、約１５０～約３００ｎｍの平均直径を有する。

特別の実施態様では、本発明による組成物のエクソソームの少なくとも２０％が少なくとも約３ｋＤａの平均分子量を有し、エクソソームの集団はＴＳＰ－１を含んでなる。

別の特別の実施態様では、本発明による組成物のエクソソームの少なくとも２０％は平均直径を約１５０～約３００ｎｍとし、ＴＳＰ－１を含んでなる。

別の特別の実施態様では、本発明による組成物のエクソソームの少なくとも２０％は、少なくとも約３ｋＤａの平均分子量を有し、エクソソームの集団の少なくとも２０％は約１５０～約３００ｎｍの平均直径を有し、エクソソームの集団はＴＳＰ－１を含んでなる。

好ましい実施態様では、ＴＧＦ－β阻害剤は表１に示された阻害剤を含んでなる群から選択される。

別の実施態様では、本発明の組成物の単離されたエクソソーム集団を形成する部分は、以下の工程を含んでなる方法によって得られたものであることを特徴とする:
ａ）３ｋＤａカットオフ膜を用いて細胞を含まないＭＳＣ馴化培地を濾過して残留物を回収する工程、または
ｂ）細胞を含まないＭＳＣ馴化培地を、エクソソームを沈殿させるのに十分な速度で遠心分離してペレットを回収する工程。

特別の実施態様では、ＭＳＣは脂肪組織由来幹細胞（ＡＳＣ）である。特別の実施態様では、ＭＳＣは月経組織に由来するＭＳＣである。別の特別の実施態様では、ＭＳＣはヒトである。

特別の実施態様では、ＭＳＣ馴化培地は、ウシ胎児血清、ウシ血清（ＢＳ）、子ウシ血清（ＣＳ）、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、新生子ウシ血清（ＮＣＳ）、ヤギ血清（ＧＳ）、ウマ血清（ＨＳ）、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清、ラット血清（ＲＳ）を含む任意の血清種を含んでならない。別の特別の実施態様では、ＭＳＣ馴化培地はインシュリン－トランスフェリン－セレニウムを含んでなる。より特別な実施態様では、ＭＳＣ馴化培地はインシュリン－トランスフェリン－セレニウムを１％含有しているＤＭＥＭである。特別の実施態様では、ＭＳＣ馴化培地は、ＭＳＣ培養物と少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日以上接触させたものである。より特別な実施態様では、ＭＳＣ馴化培地は３日または４日ＭＳＣと接触させたものである。細胞を含まないＭＳＣ馴化培地は、細胞のない培養培地を回収することを可能にする、任意の当業者にとって周知の方法によって得ることができる。例えば、培地は、ＭＳＣの単層培養物から回収することができる。

特別の実施態様では、細胞を含まないＭＳＣ馴化培地は、ＭＳＣ培養物から培地を回収し、当該培地を遠心分離機にかけて、細胞および残骸を除去して上澄みを回収することによって得られる。より特別な実施態様では、細胞および残骸は、培地を２連続で１０００×ｇおよび５０００×ｇでそれぞれ遠心分離にかけることによって除去される。一層より特別な実施態様では、これらの遠心分離は４℃で行なわれる。さらにより特別な実施態様では、第一の遠心分離は約１０分続き、第二の遠心分離は約２０分続く。

特別の実施態様では、エクソソームを沈殿させるのに十分な速度は１００．０００ｇ～１．０００．０００ｇであり、したがって、遠心分離は超遠心分離である。より特別な実施態様では、遠心分離は１０００００×ｇで行なわれる。特別の実施態様では、遠心分離は３０分～１２時間続けられる。より特別な実施態様では、遠心分離は２時間～１０時間続けられる。一層より特別な実施態様では、遠心分離は約６時間続けられる。

本発明の医薬組成物
第六の態様では、本発明は、医薬組成物、以下では、本発明の第一の態様によるエクソソーム、本発明の第二または第四の態様による単離されたエクソソーム集団または本発明の第五目の態様による組成物を含んでなる本発明の医薬組成物に関する。

「医薬組成物」という用語は、本明細書で使用する場合、治療上有効量の本発明による薬品（即ち、第一の態様のエクソソームまたは第二もしくは第四の態様の単離されたエクソソーム集団）および少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含んでなる組成物を指す。

本明細書で互換的に使用される「薬学的に許容可能な賦形剤」または「薬学的に許容可能な担体」、「薬学的に許容可能な希釈剤」または「薬学的に許容可能なビヒクル」という用語は、任意の従来的な種類の、毒性のない固体、半固体または液体のフィラー、希釈剤、封入材料または製剤助剤を指す。薬学的に許容可能な担体は、使用された用量および濃度で受領者にとって本質的に毒性が無く、処方物の他の成分と相溶性を有する。好適な担体には、限定することなく、水、デキストロース、グリセロール、食塩水、エタノールおよびそれらの組合せが含まれる。担体は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、または処方物の効果を増強するアジュバントなどの追加の薬剤が含まれていてもよい。

当業者であれば、本発明の医薬組成物中の賦形剤の性質が投与経路に大いに依存するだろうことを認識するだろう。経口（または局所）使用のために製剤化した医薬組成物の場合には、本発明による医薬組成物は、通常１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤と混合した本発明の医薬組成物を含んでいる。これらの添加剤は、例えば、スクロース、ソルビトール、砂糖、マンニトール、微結晶セルロース、バレイショデンプンを含むデンプン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、硫酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなどの不活性のフィラーまたは希釈剤；崩壊剤（crumbling agent）および崩壊剤（disintegrant）、例えば、微結晶セルロースを含むセルロース誘導体、バレイショデンプンを含むデンプン、クロスカルメロースナトリウム、アルギネートまたはアルギン酸およびキトサン；結合剤、例えば、スクロース、グルコース、ソルビトール、アカシア、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、α澱粉、微結晶セルロース、アルミニウムマグネシウムシリケート、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、酢酸ポリビニルまたはポリエチレングリコールおよびキトサン；流動促進剤および接着防止剤を含む平滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、水素化植物油または滑石であってもよい。

特に好ましい実施態様では、本発明の医薬組成物は、直腸、鼻、口腔、膣、皮下、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、くも膜下腔内、病巣内もしくは頭蓋内の経路を介した投与、または埋め込み型リザーバーを介した投与のために製剤化される。

本発明による医薬組成物は、例えば溶液、懸濁液および乳液などの注入可能物（injectable）として調製することができる。

本発明の免疫介在性炎症性疾患の治療方法
第七の態様では、本発明は、免疫介在性炎症性疾患を、当該疾患に罹患した対象において治療する方法であって、当該対象に、治療上効果的な量の、第一の態様のエクソソーム、第二または第四の態様の単離されたエクソソーム集団、第五の態様による組成物あるいは第六の態様による医薬組成物を投与することを含んでなる方法に関する。また、本発明は、免疫介在性炎症性疾患の治療方法で使用するための、第一の態様のエクソソーム、第二または第四の態様の単離されたエクソソーム集団、第五の態様による組成物あるいは第六の態様による医薬組成物にも関する。また、本発明は、免疫介在性炎症性疾患を治療するための医薬の調製のための、第一の態様のエクソソーム、第二または第四の態様の単離されたエクソソーム集団、第五の態様による組成物あるいは第六の態様による医薬組成物にも関する。

「治療方法」という用語は、本明細書で使用する場合、免疫介在性炎症性疾患に罹患した対象の、当該疾患に関連する１つ以上の症状を防止、緩和または除外することを含む、健康を保護するための、第一の態様のエクソソーム、第二または第四の態様の単離されたエクソソーム集団、第五の態様による医薬組成物の投与を意味する。

「免疫介在性炎症性疾患」または「ＩＭＩＤ」という用語は、本明細書で使用する場合、決定的な病因を欠くが、炎症に結びつく共通の炎症性経路を特徴とし、かつ正常な免疫反応の脱制御に起因するかまたはそれによって引き起こされる、病態または疾患の任意の群を指す。炎症は、多くの内科的障害および自己免疫障害を介在し、かつそれらの一次要因ともなるので、本発明の文脈内では、免疫介在性炎症性疾患という用語は自己免疫障害および炎症性疾患を包含することを意図している。

「自己免疫障害」という用語は、本明細書で使用する場合、対象の細胞、組織および／または器官の損傷を特徴とする病態であって、当該対象の、それ自身の細胞、組織および／または器官への免疫反応によって引き起こされた病態を指す。本発明の方法または医薬組成物で治療することができる自己免疫疾患の実例としては、限定することなく、円形脱毛症、関節リウマチ（ＲＡ）、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群（chronic fatigue immune dysfunction syndrome：ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、クレスト症候群、寒冷凝集素症、円盤状狼瘡、本態性混合型クリオグロブリン血症（essential mixed cryoglobulinemia）、線維筋痛線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（idiopathic thrombocytopenia purpura：ＩＴＰ）、ＩｇＡ神経病、若年性関節炎、扁平苔癬、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、１型糖尿病または免疫介在糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、サルコイドーシス、強皮症、進行性全身硬化症、シェーグレン症候群、グッドパスチャー症候群、スティッフマン症候群、全身性エリトマトーデス、紅斑性狼瘡、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、疱疹状皮膚炎血管炎などの血管炎、尋常性白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症、抗糸球体基底膜疾患（anti-glomerular gasement membrane disease）、抗リン脂質抗体症候群、神経系の自己免疫疾患、家族性地中海熱、ランバート-イートン筋無力症候群、交感性眼炎、多内分泌症、乾癬等が挙げられる。

「炎症性疾患」という用語は、本明細書で使用する場合、炎症(例えば、慢性炎症)を特徴とする対象の病態を指す。炎症性障害の非限定的な実例としては、限定することなく、セリアック病、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、喘息、脳炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性骨溶解、クローン病、潰瘍性大腸炎、アレルギー性障害、敗血症性ショック、肺線維症（例えば、特発性肺線維症）、炎症性血管炎（例えば、結節性多発動脈炎、ウェーグナー肉芽腫症、高安動脈炎、側頭動脈炎およびリンパ腫様肉芽腫）、外傷後血管形成術（例えば、血管形成後の再狭窄）、未分化脊椎関節障害、未分化関節障害、関節炎、炎症性骨溶解、慢性肝炎、ウイルス感染または細菌感染に起因する慢性炎症、および敗血症などの急性炎症が挙げられる。

特別の実施態様では、免疫介在性炎症性疾患は、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）およびクローン病からなる群から選択される。

「関節リウマチ」または「ＲＡ」という用語は、本明細書で使用する場合、持続性の関節の滑膜炎を引き起こし、それらの進行性の破壊を引き起こし、異なる程度の変形および機能障害を発生させることを特徴とする、全身性の自己免疫炎症性病変を指す。プロセスは、体液因子および細胞因子、特にＣＤ４ Ｔ細胞の介在から始まり、それらは分子を介在して炎症を発生させ、末梢血液細胞を活性化させて、滑膜細胞の増殖および活性を引き起こし、関節軟骨、軟骨下骨、腱および靱帯に侵入して破壊する。

「炎症性腸疾患」または「ＩＢＤ」という用語は、潰瘍性大腸炎、コラーゲン蓄積大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置腸管大腸炎（diversion colitis）、ベーチェット病および不定の大腸炎を含む、結腸と小腸の炎症性病態の群を指す。

「クローン病」という用語は、本明細書で使用する場合、口から肛門までの胃腸管の任意の部分に影響し得る炎症性腸疾患の任意の種類を指し、種々様々の症状がもたらされる。それは主として腹痛、下痢(炎症が最悪である場合には出血を伴う)、嘔吐(連続的な場合もある)または体重低下を引き起こすだけでなく、貧血、皮疹、関節炎、目の炎症、疲労および集中力欠如などの、胃腸管外の合併症を引き起こすかもしれない。クローン病は、遺伝的に感受性な個体の環境因子、免疫因子および細菌因子との間の相互作用によって引き起こされる。これは、身体の免疫系が胃腸管を攻撃するという慢性の炎症性障害をもたらす。クローン病が免疫関連疾患である一方、自己免疫疾患ではないようである(免疫系が身体自体によって引き起こされていないという点で)。

「対象」という用語は前に定義されたものである。「当該疾患に罹患している対象」という用語は、その疾患の診察を受けた対象を意味する。

エクソソームの由来であるＭＳＣは、自己由来でも同種異系由来でも異種由来でもよい。本明細書で使用する場合、「自己由来」という用語は、ＭＳＣのドナーと当該ＭＳＣ由来のエクソソーム（または単離されたエクソソーム集団）の受領者が同一の対象であることを意味する。「同種異系由来」という用語は、ＭＳＣのドナーと当該ＭＳＣ由来のエクソソーム（または単離されたエクソソーム集団）の受領者が異なる対象であることを意味する。「異種由来」という用語は、ＭＳＣのドナーと当該ＭＳＣ由来のエクソソーム（または単離されたエクソソーム集団）の受領者が異なる種の対象であることを意味する。特別の実施態様では、エクソソームの由来であるＭＳＣは同種異系由来である。

特別の実施態様では、エクソソームまたは単離されたエクソソーム集団は全身にまたは局所的に投与する。「全身に」という用語は、本発明のエクソソーム、単離したエクソソーム集団または医薬組成物を、非局所的な方法で対象に投与してもよいことを意味する。本発明のエクソソーム、単離したエクソソーム集団または医薬組成物の全身投与は、対象の身体にわたる、いくつかの器官または組織に達してもよく、または対象の特定の器官または組織に達してもよい。「局所的に投与する」という用語は、本明細書で使用する場合、本発明のエクソソーム、単離したエクソソーム集団または医薬組成物が、特定の部位、またはその近辺で対象に投与してもよいことを意味する。より特別な実施態様では、エクソソームまたは単離されたエクソソーム集団は、直腸、鼻、口腔、膣、皮下、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、くも膜下腔内、病巣内もしくは頭蓋内の経路を介して、または埋め込み型リザーバーを介して投与される。

特別の実施態様では、エクソソームまたは単離されたエクソソーム集団は少なくとも１つの追加的治療薬と組み合わせて投与される。「治療薬」という用語は、本明細書で使用する場合、疾患の治療に有用な薬品を指す。特別の実施態様では、追加的治療薬は、前述の免疫介在性炎症性疾患の治療のための既知の薬であり、例えば、限定することなく、コルチコステロイドまたは非ステロイド性抗炎症化合物などである。

「共に投与される」という発現は、本発明のエクソソーム、単離したエクソソーム集団または医薬組成物が、任意の順序で、追加的治療薬（例えば、炎症に関連する疾患の治療で有用な治療薬）と共同でまたは別々に、同時に（simultaneously）、同じ時点で（at the same time）または連続的に投与してもよいことを意味する。例えば、本発明のエクソソーム、単離したエクソソーム集団または医薬組成物の投与を最初に行い、続けて、１つ以上の追加的治療薬を投与してもよく；あるいは本発明のエクソソーム、単離したエクソソーム集団または医薬組成物の投与を最後に行い、その前に１つ以上の追加的治療薬を投与してもよく；あるいは本発明のエクソソーム、単離したエクソソーム集団または医薬組成物の投与を、１つ以上の追加的治療薬の投与と同時に行ってもよい。

一つの実施態様では、本発明による方法を使用して治療を受ける患者は、ＴＧＦ－β阻害剤を含んでなる療法の治療を受けているか、または受けていた患者である。

以下の単なる例証であり、本発明を全く制限しない例を通じて本発明を説明する。

例１
材料と方法
ヒト脂肪間葉幹細胞の単離および増殖
ヒト脂肪間葉幹細胞（ｈＡＳＣ）を、健康な成人ドナーからのヒト脂肪組織から得られた脂肪吸引物から単離した。脂肪吸引物をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中で、Ｉ型コラゲナーゼで分解した。分解したサンプルを、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で洗浄し、塩化アンモニウム１６０ｍＭで処理し、培地（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）中で懸濁し、４０μｍナイロンメッシュで濾過した。細胞は組織培養フラスコ上に播種し、３７℃および５％ＣＯ_２で増殖させ、７日ごとに培地を交換した。培養物が９０％の密集度に達した際に、細胞を新しい培養フラスコに移した。さらに、ＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５に対して陰性であり、ＣＤ２９、ＣＤ５９、ＣＤ９０およびＣＤ１０５に対して陽性であった特定の表面積マーカーを用いてフローサイトメトリーによりｈＡＳＣを試験した（提示データなし）。研究では２人の健康なドナーからの細胞系を使用した。生物学的試料は適切な研究倫理委員会の後援下でインフォームド・コンセントを行った後に得た。

ｈＡＳＣからのエクソソームの単離および精製
１７５ｃｍ^２フラスコの中で培養したｈＡＳＣから、ｈＡＳＣからのエクソソーム（ｅｘｏ－ｈＡＳＣ）が富化した画分を得た。細胞が８０％の密集度に達した際に、培地（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）をエクソソーム単離培地（１％インシュリン－トランスフェリン－セレニウム含有ＤＭＥＭ）と取り替えた。３～４日ごとにｈＡＳＣ上澄みを回収した。４℃にて１００，０００×ｇ（１０分）と５０００×ｇ（２０分）での２回の連続した遠心分離を行い、上澄みからエクソソームを単離し、細胞および残骸を除去し、続けて６時間１００，０００×ｇで超遠心分離を行ってエクソソームを沈殿させた。ペレットをＰＢＳ２５０μＬ中で再懸濁し、－２０℃にて保管した。in vitro実験の前にエクソソームの量をブラッドフォードアッセイで定量化し、ナノ粒子追跡分析により特徴づけた。

ｅｘｏ－ｈＡＳＣの特徴化
精製されたエクソソームの濃度およびサイズは、粒径にブラウン運動の割合を関連づけるナノ粒子追跡分析（NanoSight Ltd、Amesbury、UK）によって測定した。ナノ粒子追跡分析ソフトウェアパッケージバージョン２．２を用いて結果を分析した。三通のサンプルは滅菌濾過ＰＢＳ中で１：１０に希釈して分析した。

ブラッドフォードアッセイ
ブラッドフォードアッセイでのタンパク質定量化によってエクソソーム濃度を間接的に測定した。タンパク質濃度の定量化を行うために、ＲＴで、エクソソームサンプル２０μＬをブラッドフォード試薬１８０μＬ（Bio Rad Laboratories、Hercules、CA）でインキュベートした。５９５ｎｍにて５分後に吸収度を読み取り、タンパク質濃度をウシ血清アルブミンの標準濃度曲線から推定した。

タンパク質の半定量的（Semicuantitative）同定
・タンパク質単離:
－Bonzon-Kulichenkoら、Mol. Cell Proteomics 2011, 10(1):M110.003335に記載の方法を使用するタンパク質消化。簡潔には次の通りである：タンパク質５０μｇを、バッファー（５％ＳＤＳ、１０％グリセロール、２５ｍＭＴｒｉｓ－Ｃｌ、１０ｍＭ ＤＴＴまたはｐＨ６．８の０．０１％ブロモフェノールブルー）７５μｌ中に再懸濁させる。
－サンプルをＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル（SDS-poliacrilamide gel）によって分離した。タンパク質はクーマシィーブルーで視認され、切断して分解させた（３７℃、ｐＨ８．８の５０ｍＭアンモニウム重炭酸塩中５：１タンパク質：トリプシン（ｗ／ｗ）の比にてトリプシン６０ｎｇ／μｌおよび１０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルおよび０．０１％（ｗ／ｖ）５－シクロヘキシル－１－ペンチル－β－Ｄ マルトシド)
・結果として生じたペプチドは、システムＥａｓｙ－ｎＬＣ １０００と四重極（quadruple）Ｏｒｂｉｔｒａｐハイブリッド質量分析計（QExactive、Thermo Scientific、San Jose、CA）を使用して、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析された。
・タンパク質の同定は、ＳＥＱＵＥＳＴ（Protein Discoverer 1.3.0.339、Thermo Scientific）およびSwissprot（Uniprot、2012-5公開）データベースを使用して行なった。
・Navarro Pら、J Proteome Res. 2009, 8(4):1792-6に記載のように、ＳＥＱＵＥＳＴ結果を確認した。

リンパ球単離および保管
健康なドナーからの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をHistopaque-1077（Sigma、St. Louis、MO、USA）で遠心分離して、ＰＢＳで２度洗浄することによって得た。ＰＢＬは冷凍して、液体窒素中に保管した。in vitro実験については、細胞のアリコートを３７℃で溶かし、１０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０に添加し、１５００ｒｐｍで遠心分離機に５分間かけてＤＭＳＯを除去した。ペレットを１０％ＦＢＳで補給したＲＰＭＩ１６４０中に再懸濁した。

エクソソームでのＴ細胞と共培養物のin vitro刺激
in vitro刺激ＰＢＬに対するｅｘｏ－ｈＡＳＣの免疫調節効果を決定するために、精製されたＰＢＬを２×１０^５個、９６ウェルプレート（ウェル１個あたりに２００μｌ）に播種した。ＰＢＬを刺激するために、Ｔ細胞活性／増殖キット（Miltenyi Biotec inc、San Diego、CA、USA）を使用し、抗ＣＤ２／抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８でコーティングしたマイクロビーズ５μＬを各ウェルに添加した。最後に、異なる濃度（ＰＢＬ ４μｇ／１０^６、８μｇ／１０^６および１６μｇ／１０^６）のエクソソームをウェルに添加した。ＰＢＬを６日間培養した。陰性の対照（非刺激ＰＢＬ）および陽性の対照（エクソソームなしでの刺激ＰＢＬ）を、すべての実験で使用した。

ＣＦＳＥ増殖アッセイ
Ｔ細胞の増殖挙動を、カルボキシフルオレセンスクシンイミジルエステル（carboxyfluorescein succinimidyl ester ：ＣＦＳＥ）希釈によって定量化した。ＣＦＳＥ染色は、播種前に行い、最終濃度１０μＭでのＣＦＳＥ細胞増殖キット（Invitrogen、Eugene、ＯＲ）を３７℃にて１０分間用いて、続けて培養培地での即時のクエンチングを行った。６日後に、ｅｘｏ－ｈＡＳＣの存在下または不在下でのin vitro刺激ＰＢＬについて、フローサイトメトリーによってＣＦＳＥ希釈の試験を行った。

in vitro刺激ＰＢＬの分化／活性マーカー発現分析
in vitro刺激ＰＢＬのフローサイトメトリーのために、上下にピペットで移すことにより、６日後に細胞をウェルから回収した。細胞を、ＣＤ３（ＳＫ７）、ＣＤ４（ＳＫ３）、ＣＤ８（ＳＫ１）、ＣＣＲ７（３Ｄ１２）、ＣＤ４５ＲＡ（Ｌ４８）（BD Biosciences、San Jose、CA、USA）に対して、蛍光標識されたヒトモノクローナル抗体で染色した。マーカー発現分析は次のように行なった：細胞２×１０^５個を、２％ＦＢＳ含有ＰＢＳの存在下で、適当な濃度のモノクローナル抗体で４℃にて３０分間培養した。細胞を洗浄し、ＰＢＳ中で再懸濁した。１０^５のイベントを習得した後に、FAC-Scaliburサイトメーター（BD Biosciences、San Jose、CA、USA）でフローサイトメトリーを行なった。第一に前方および側面の散乱特徴を用いて細胞を選択し、CellQuestソフトウェア（BD Biosciences、San Jose、CA、USA）を用いて蛍光性を分析した。アイソタイプが一致した陰性対照抗体をすべての実験で使用した。相対蛍光強度の平均は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、その陰性対照のＭＦＩで割ることによって計算した。

細胞間ガンマ－インターフェロンアッセイ
ＩＦＮ－γアッセイのために、ＰＢＬを、ＰＢＬ １６μｇ／１０^６個でｅｘｏ－ｈＡＳＣの存在下にて６日間、Ｔ細胞活性／増殖キット（Miltenyi Biotec inc、San Diego、CA、USA）でin vitro刺激した。その後、ＰＢＬをBD GolgiStopで６時間インキュベートした。ＰＢＬを、ＰｅｒＣＰ標識付された抗ＣＤ４（ＳＫ３）およびＡＰＣ標識抗ＣＤ８（ＳＫ１）で染色し、BD Cytofix/Cytoperm固定／透過化キットを使用して、固定し透過させた。最後に、細胞をＰＥ標識抗ＩＦＮ－γ抗体（全ての試薬はBD Biosciences、San Jose、CA、USAからのものである）で染色した。ゲートされたＣＤ３＋ＣＤ４＋およびＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞上のＩＦＮ－γ発現の頻度を測定することによってフローサイトメトリーによる分析を行った。

統計的分析
パラメーター分布での変数についてはスチューデントｔ－試験を用いてデータを統計的に分析した。増殖アッセイについては、ポストホックボンフェローニ（post hoc Bonferroni）試験でのＡＮＯＶＡを行なった。ｐ値が≦０．１０または≦０．０５であると、統計的に有意と考えられた。統計的決定はすべてＳＰＳＳ－２１ソフトウェア(SPSS、Chicago、IL、USA)を使用して行なった。

結果
ｅｘｏ－ｈＡＳＣの粒度分布および濃度
エクソソームが富化した画分を超遠心分離によってｈＡＳＣから回収した。エクソソームのタンパク質濃度をブラッドフォードアッセイで決定した。各エクソソームサンプルにつきナノ粒子追跡分析を独立に３回行ない、粒度分布および粒子濃度を定量化した。第一に、全タンパク質濃度からin vitroアッセイのためのエクソソームが定量化できた。第二に、ナノ粒子追跡分析から、放出小胞の特徴化ができた。単離された小胞のサイズは２２３～３００ｎｍの範囲であり、平均サイズおよび標準偏差は２４６．８±２５．０５ｎｍであった。ｅｘｏ－ｈＡＳＣの代表的な結果は、頻度粒度分布グラフ（図１Ａ）として表示される。エクソソーム（ｎ＝６）の濃度はナノ粒子追跡分析によって決定し、１ミリリットル当たりの粒子は８．４～９．７（×１０^９）個の範囲であり、平均濃度として１ミリリットル当たりの粒子は９．１±０．５（×１０^９）個であった。最後に、エクソソーム中のペプチド含量は四重極（quadruple）Ｏｒｂｉｔｒａｐハイブリッド質量分析計（Q-Exactive、Thermo Scientific、San Jose、CA）に接続したＥａｓｙ－ｎＬＣ １０００システムを用いてＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。タンパク質の同定はヒトSwissProtデータベースを使用して、SEQUEST（Protein Discoverer 1.3.0.339、Thermo Scientific）で実施した。ＴＳＰ１ペプチドは同定されたタンパク質合計１１０個の中で２番目に豊富であった（図１Ｂ）。

ｅｘｏ－ｈＡＳＣの存在下で共培養された細胞の存在下で共培養されたin vitro刺激Ｔ細胞の増殖能
ｅｘｏ－ｈＡＳＣの生物活性を評価するために、リンパ球サブセットの増殖速度に対するそれらの効果を決定した。そのために、合計２×１０^６個のＰＢＬを「材料および方法」で記載したように、抗ＣＤ２／抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で刺激し、異なる濃度（４μｇ／１０^６個、８μｇ／１０^６個および１６μｇ／１０^６個のＰＢＬ）のｅｘｏ－ｈＡＳＣと６日間共培養した。増殖能をＣＦＳＥ希釈によって決定した。非刺激ＰＢＬを陰性対照として使用し、エクソソームなしの刺激ＰＢＬは陽性対照を構成した。予想通りに、非刺激ＰＢＬの増殖速度は非常に低度（提示データなし）であり、かつ最大の増殖速度はエクソソームのない刺激ＰＢＬによって到達された。ＣＦＳＥ蛍光により合計８つの細胞分裂が検出された。図２Ａ中に示されたように、in vitro刺激リンパ球を、異なる濃度のｅｘｏ－ｈＡＳＣの存在下で培養した場合、増殖速度は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方で比例して減少した。大部分の細胞は、少ない細胞分裂を示した一方で、多くの細胞分裂に達した細胞の割合は低かった。各分裂周期の細胞の割合を示す詳細な図は、図２Ａで提供されている。各分裂周期の細胞の割合を示す代表的なヒストグラム（図２Ｂ）および詳細な図も提供されている（図２Ｃ）。

ここでは、エクソソームの増加する濃度がどのようにして８世代から７世代までのＣＤ４およびＣＤ８の両方の増殖を阻止しているのかを理解することができる。さらに、エクソソームは、初期の分裂周期４、５および６の細胞を保持し、ここでの細胞の割合はエクソソームの存在下で著しくより高く、一方で分裂周期７および８では、高い用量のエクソソームを使用した場合、細胞の割合は著しく減少した。最初の２つの分裂周期では、エクソソームの存在下または不在下の両方でＴ細胞を非常に低い割合で含み、これは、ポリクローナル刺激の効果がこれらの２つの分裂周期の後に開始されたことを示すが、エクソソームの存在は、依然としてこれらの最初の２つの分裂周期で細胞を著しく保持していた（ただし、これは１０％未満のＴ細胞の一群で起こっていた）。統計的分析はＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかで異なる分裂周期にて有意差を示した。最後に、非刺激Ｔ細胞中の低ＣＦＳＥＴ細胞の頻度として、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に対して刺激指数を計算した。抗ＣＤ２／抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で刺激したＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の刺激指数はそれぞれ６９２．３と６５５．６であった。しかしながら、ＰＢＬをエクソソームの存在下で刺激した場合、染色指数は、ＣＤ８＋Ｔ細胞（４μｇ、８μｇおよび１６μｇで、５１９．７５±６０．９７、４８８．０３±１０７．３２、４３７．４±７９．２５）と同様にＣＤ４＋Ｔ細胞（４μｇ、８μｇおよび１６μｇで、５８９．９３±３９．３１、５８５±８０．２７、５２９．１４±５８．８８）で著しく減少した。

ｅｘｏ－ｈＡＳＣの存在下で共培養されたin vitro刺激Ｔ細胞のＴ細胞サブセット分布
ＣＤ４５ＲＡアイソフォームおよびケモカイン受容体ＣＣＲ７は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の分化ステージを同定するために一般に使用される表面マーカーである。リンパ球サブセットに対するｅｘｏ－ｈＡＳＣの効果を研究するために、ＰＢＬ１６μｇ／１０^６個で、ｅｘｏ－ｈＡＳＣ（異なる２つのドナーから）の存在下で、合計２×１０^６個の刺激ＰＢＬを培養した。６日目に、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７に対する市販の抗体を使用してフローサイトメトリーを行なった。ＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７の量的発現は、対照（ｅｘｏ－ｈＡＳＣの不在下でのin vitro刺激Ｔ細胞）を参照して標準化した。結果では、陽性対照（刺激ＰＢＬ）で、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方にてＣＤ４５ＲＡ＋およびＣＣＲ７＋細胞が著しく減少したことが示された。しかしながら、in vitro刺激ＰＢＬでのＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７の損失は、ｅｘｏ－ｈＡＳＣの存在で部分的に補填された（図３）。

LanzavecchiaおよびSallustoが提案したモデルでは、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７発現の組合せ分析により、ＣＤ８＋Ｔ細胞内で４つの異なるステージが定義され、それは即ち次のものである: 未感作（ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＣＲ７^＋）、セントラルメモリー（ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＣＲ７^＋）ならびに少なくとも２つのエフェクターメモリー細胞のサブセット：エフェクターメモリー細胞（ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＣＲ７^－）および最終分化エフェクターメモリー細胞（ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＣＲ７^－）（Geginat J, Lanzavecchia A and Sallusto F. Blood (2003) 101:4260-6）。
この分布に対するｅｘｏ－ｈＡＳＣの効果を研究するために、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセットに対するフローサイトメトリーによってＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７の共発現を分析した。図４に示されるように、未感作細胞の割合はｅｘｏ－ｈＡＳＣの存在によって著しく変更されなかったが、ｅｘｏ－ｈＡＳＣの存在下で培養したin vitro刺激ＣＤ８＋Ｔ細胞では最終分化エフェクターメモリー細胞（ＣＤ４５ＲＡ^＋ ＣＣＲ７^－）が著しく減少したことが観察された。ＣＤ４＋Ｔ細胞の場合には、ｅｘｏ－ｈＡＳＣにより、エフェクターメモリー細胞（ＣＤ４５ＲＡ^－ ＣＣＲ７^－）の割合が減少し、セントラルメモリー細胞（ＣＤ４５ＲＡ^－ ＣＣＲ７^＋）の割合が著しく増加した。

これらの結果から、ｅｘｏ－ｈＡＳＣが抗ＣＤ３／ＣＤ２／ＣＤ２８刺激の介在を受けたin vitro分化を妨げることが証拠づけられた。実際に、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の場合には、ｅｘｏ－ｈＡＳＣは最終分化発現型およびエフェクターメモリー発現型それぞれへの分化に阻害作用を有している。

ヒト脂肪間葉幹細胞由来エクソソームの存在下で共培養されたin vitro刺激Ｔ細胞でのＩＦＮ－γ生産
ＩＦＮ－γは、一定の活性条件下での免疫細胞によって分泌された炎症反応促進性サイトカインである。ＩＦＮ－γ分泌とＴ細胞活性のレベルとの間には直接の相関がある。Ｔ細胞の分泌されたＩＦＮ－γに対するエクソソームの効果を決定するために、ｅｘｏ－ｈＡＳＣの存在下および不在下でＰＢＬを６日間培養し、ＩＦＮ－γの細胞間レベルを、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセットで決定した。我々の結果からは、両方のＴ細胞のサブセット中でＰＢＬをエクソソームで培養した場合、陽性対照と比較して、６日目に細胞間ＩＦＮ－γの割合が減少したことを示した。しかしながら、この減少は、ゲートされたＣＤ４＋Ｔ細胞でのみ統計的に有意であった（図５）。これらの結果から、ｅｘｏ－ｈＡＳＣがリンパ球の分化発現型だけでなくそれらのＩＦＮ－γ分泌も害することが実証された。

免疫介在性炎症性障害からの保護にはＩＦＮ－γが重大であることを考慮すると、局所的免疫抑制の理想的なビヒクルとしてｅｘｏ－ｈＡＳＣを使用することができると仮定することができる。さらに、個々の細胞の生存度、ホーミングまたは移植が害される細胞療法とは対照的に、制御することができ、かつ空間と時間によって定義することができる投薬計画での、良好に特徴化されたｅｘｏ－ｈＡＳＣの用法は利点と考えられ得る。さらに、ＭＳＣの臨床効果のために重要な問題である同種異系由来細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞への感受性を報告している著者も数人いる。ｅｘｏ－ｈＡＳＣの場合には、これらの微小胞は細胞介在溶解による影響を受けず、これはそれらの治療効果の利点である。

例２
エクソソームは細胞の開口分泌から派生した微小胞である。それらは異なる細胞種によって分泌され、細胞培養上澄みおよび体液の両方の中で単離することができる。間葉幹細胞由来エクソソームの治療の潜在性は巨大であり、組織再生および炎症の低減を促進する。エクソソームは細胞間の関係に関係し、細胞および標的細胞によって生産されたタンパク質および脂質の交換を可能にすることが示された。エクソソームは、それら発生した細胞からのＲＮＡ、ミクロＲＮＡおよびタンパク質を含有していて、このことは生理的プロセスでの重要なシグナリング機序となる。

最も一般的な方法は超遠心分離であるが、エクソソームの単離には様々な方法がある。前臨床試験から非常に大きな関心が寄せられて、現在では臨床セッティングでエクソソームの新しい単離試験計画の設計が必要とされている。この研究の目的は、収率、純度およびサイズの点から、ヒトＭＳＣからの単離の様々な方法を比較することであった。我々の結果からは、細胞培養上澄みからエクソソームを単離する中で濃縮フィルターが従来の試験計画の有望な代用となるかもしれないことが実証された。

材料と方法
ヒト間葉幹細胞を健康な成人ドナーからのヒト脂肪組織から得られた脂肪吸引物から単離した。組織培養フラスコ上に細胞を播種し、３７℃および５％ＣＯ_２で増殖させ、３～４日ごとに培地を交換した。

上澄みを回収するために、細胞が８０％の密集度に達した際に、培養培地をエクソソーム単離培地（血清のないＤＭＥＭ、１％インシュリン－トランスフェリン－セレニウム含有）と取り替えた。培養を６日行った後に、上澄みを回収して、４℃で１０００×ｇ（１０分）および５０００×ｇ（２０分）で遠心分離機にかけて細胞と残骸を除去した。また、上澄みを０．４５μＭおよび０．２２μＭフィルターで濾過した。最後に、エクソソームの濃縮のために、上澄みを、３ｋＤａのＭＷＣＯ（molecular weight cut off：分画分子量）の濃縮器で遠心分離にかけ、または６時間１００．０００×ｇで超遠心分離機にかけた。

エクソソーム濃度はブラッドフォードアッセイでのタンパク質定量化によって測定した。タンパク質濃度を定量化するために、室温にてブラッドフォード試薬１８０μｌでエクソソームサンプル２０μｌをインキュベートした。吸収度を５９５ｎｍで読み取り、タンパク質濃度をウシ血清アルブミンの標準濃度曲線から推定した。

精製されたエクソソームの濃度およびサイズは、粒径にブラウン運動の割合を関連づけるナノ粒子追跡分析（NanoSight）によって測定した。結果はナノ粒子追跡分析ソフトウェアパッケージを使用して分析された。三連のサンプルを１：１０で、滅菌濾過ＰＢＳ中に希釈して分析した。

結果
本発明者らは、超遠心分離で６５～７０倍で上澄みを濃縮することができ、一方で３ｋＤａを使用すると、上澄みを１００倍に濃縮することができた。

結果として生じた容積を使用してブラッドフォードアッセイによって総タンパク質濃度を決定した。３ｋＤａ濃縮器を使用すると、タンパク質濃度は超遠心分離による場合よりも５～８倍高かったことが観察された。３ｋＤａ濃縮器では、タンパク質濃度として４９０．４３μｇ／ｍｌ±１２１．０３がもたらされた一方で超遠心分離法では９０．４０μｇ／ｍｌ±５７．１６がもたらされた。

富化した上澄みの粒径を分析した。３ｋＤａ濃縮器で分離された粒子は超遠心分離によって分離された粒子より小さかったことが観察された。３ｋＤａ濃縮器で得られた粒子の平均径は１９１．０８ｎｍ±１３．４８であった一方で、超遠心分離法によって分離された粒子の平均径は２４６．８３ｎｍ±２５．０６であった。

最後に、粒子数は３ｋＤａ濃縮器を使用した場合の方が超遠心分離よりも高かった。３ｋＤａ濃縮器の使用での粒子数としては、１ｍｌ当たりの粒子が１１．８６×１０^９±３．４６個であった一方で、超遠心分離法での粒子数としては、１ｍｌ当たりの粒子が９．１１×１０^９±０．５３個であった。

結論
１．より小さな孔径の濃縮器フィルターを使用し、かつより遅い速度で遠心分離機を行うことで、より小さなサイズおよびより高純度であるエクソソームを大量に得ることが可能であった。
２．エクソソームを単離するための超遠心分離法では、濃度および純度がより低い結果となった。
３．濃縮フィルターを使用する好ましい態様は、診療所、病院および研究センターで一般に利用可能な従来の機器の用法に存在している。

例３
材料と方法
ヒト脂肪間葉幹細胞の単離および増殖
ヒト脂肪間葉幹細胞（ｈＡＳＣ）を健康な成人のドナーからのヒト脂肪組織から得られた脂肪吸引物から単離した。脂肪吸引物をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中のＩ型コラゲナーゼで分解した。分解したサンプルを、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で洗浄し、塩化アンモニウム１６０ｍＭで処理し、培地（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）で懸濁し、４０μｍナイロンメッシュで濾過した。細胞を組織培養フラスコ上に播種し、３７℃および５％ＣＯ_２で増殖させ、７日ごとに培地を交換した。培養物が９０％の密集度に達した際に細胞は新しい培養フラスコに移した。さらに、ＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５に陰性であって、ＣＤ２９、ＣＤ５９、ＣＤ９０およびＣＤ１０５に陽性である特定の表面積マーカーを使用してフローサイトメトリーによってｈＡＳＣを試験した（提示データなし）。研究では２人の健康なドナーからの細胞系を使用した。生物学的試料は適切な研究倫理委員会の後援下でインフォームド・コンセントを行った後に得た。

ｈＡＳＣからのエクソソームの単離および精製
ｈＡＳＣからのエクソソーム（ｅｘｏ－ｈＡＳＣ）に富化した画分を１７５ｃｍ^２フラスコ中で培養されたｈＡＳＣから得た。細胞が密集度８０％に達した際に、培養培地（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）をエクソソーム単離培地（１％インシュリン－トランスフェリン－セレニウム含有ＤＭＥＭ）と取り替えた。３～４日ごとにｈＡＳＣ上澄みを回収した。エクソソームを上澄みから単離し、４℃で１０分間１０００×ｇおよび２０分間５０００×ｇで遠心分離機にかけて死滅細胞および残骸を除去した。これらの上澄みを０．４５μｍおよび０．２０μｍの無菌酢酸セルロースフィルターを使用して、連続して濾過した。最後に、事前濾過した上澄みを、４℃で１時間、Amicon（商標）Ultra Centrifugal Filters、3000 MWCO（Merck Millipore）で濃縮した。濃縮されたエクソソームは、濃縮器の上部に残り、－２０℃で保管した。

ｅｘｏ－ｈＡＳＣの特徴化
精製されたエクソソームの濃度およびサイズは、粒径にブラウン運動の割合を関連づけるナノ粒子追跡分析（NanoSight Ltd, Amesbury, UK）によって測定した。結果はナノ粒子追跡分析ソフトウェアパッケージバージョン２．２を使用して分析された。三連のサンプルを１：１０で、滅菌濾過ＰＢＳ中に希釈して分析した。

ｍｅｎＳＣ（月経組織）からのエクソソームの単離および精製
ｍｅｎＳＣからのエクソソーム（ｅｘｏ－ｍｅｎＳＣ）に富化した画分を１７５ｃｍ^２フラスコ中で培養されたｈＡＳＣから得た。ｍｅｎＳＣを月経組織から得た。細胞が密集度８０％に達した際に、培養培地（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）をエクソソーム単離培地（１％インシュリン－トランスフェリン－セレニウム含有ＤＭＥＭ）と取り替えた。３～４日ごとにｍｅｎＳＣ上澄みを回収した。エクソソームを上澄みから単離し、４℃で１０分間１０００×ｇおよび２０分間５０００×ｇで遠心分離機にかけて死滅細胞および残骸を除去した。これらの上澄みを０．４５μｍおよび０．２０μｍの無菌酢酸セルロースフィルターを使用して、連続して濾過した。最後に、事前濾過した上澄みを、４℃で１時間、Amicon（商標）Ultra Centrifugal Filters、3000 MWCO（Merck Millipore）で濃縮した。濃縮されたエクソソームは、濃縮器の上部に残り、－２０℃で保管した。

ｅｘｏ－ｍｅｎＳＣの特徴化
精製されたエクソソームの濃度およびサイズは、粒径にブラウン運動の割合を関連づけるナノ粒子追跡分析（NanoSight Ltd, Amesbury, UK）によって測定した。結果はナノ粒子追跡分析ソフトウェアパッケージバージョン２．２を使用して分析された。三連のサンプルを１：１０で、滅菌濾過ＰＢＳ中に希釈して分析した。

ブラッドフォードアッセイ
ブラッドフォードアッセイでのタンパク質定量化によってエクソソーム濃度を間接的に測定した。タンパク質濃度の定量化を行うために、ＲＴで、エクソソームサンプル２０μＬをブラッドフォード試薬１８０μＬ（Bio Rad Laboratories、Hercules、CA）でインキュベートした。５９５ｎｍにて５分後に吸収度を読み取り、タンパク質濃度をウシ血清アルブミンの標準濃度曲線から推定した。

ＴＧＦベータ濃度
活性かつ潜在のＴＧＦβ形態をＥＬＩＳＡキットおよび次の製造会社による指示を使用して測定した： Legend MaxTM Free active TGF-β1 (Cat番号437707) およびLegend MaxTM Latent TGF-β (Cat番号432907)。

結果
異なるドナーのｅＡＳＣＳ（ＡＳＣドナー１０、ＡＳＣドナー１３、ＡＳＣドナー１４）から得たエクソソームおよび、異なるドナーのｍｅｎＳＣ（ｍｅｎＳＣ０１、ｍｅｎＳＣ０２、ｍｅｎＳＣ０３およびｍｅｎＳＣ０４）から得られたエクソソームをＴＧＦ－βの測定のために選択した。下表で示されるように、全てのサンプル中に活性ＴＧＦ－βおよび潜在ＴＧＦ－βの両方が検出された。ＥｘｏｈＡＳＣよりもＥｘｏＭｅｎＳＣでのＴＧＦ－βレベルの方がはるかに高かった。

ｅｘｏ－ｈＡＳＣ（ｅｘｏ－ｍｅｎＳＣと一意的に比較）で見出された低いレベルのＴＧＦ－βによれば、これらの結果は、ｅｘｏ－ｈＡＳＣの免疫調節活性がＴＧＦ－βとは異なる他のパラクリン放出分子によって介在されたであろうということを示し得る。対照的に、ｅｘｏ－ｍｅｎＳＣの免疫調節活性の効果（未公開の結果）はエクソソームに関連したＴＧＦ－βによって介在されたであろう。

エクソソームに結び付くＴＧＦ－βの関係する阻害効果を決定するためにin vitro活性化リンパ球と一緒にエクソソームを使用したＴＧＦ－β遮断実験を行うだろう。これらの実験では、抗ＴＧＦ－β遮断抗体（ＭＡ１－２４７３４、クローン９０１６．２）を１μｇ／ｍｌでエクソソームの存在下で共培養したin vitro刺激Ｔ細胞に添加するだろう。

免疫細胞にとって匹敵する調節役であるが、調節のためにＴＧＦ－βを重要なパラクリン因子として使用しないエクソソームを有しているという利点は、エクソソームの調節作用を必要とするが、ＴＧＦ－β阻害剤での治療中である患者にとって利点と見なすことができるかもしれない。

Claims (8)

1. 脂肪組織由来幹細胞（ＡＳＣ）に由来するエクソソーム集団を含んでなる、免疫介在性炎症性疾患の治療方法における使用のための組成物であって、
   前記治療対象の患者が、ＴＧＦ－β阻害剤を含む療法による治療中であるか、またはその治療を受けていた患者であり、
   前記エクソソーム集団が、
   ａ．該エクソソームの少なくとも２０％が、少なくとも３ｋＤａの平均分子量を有し、かつ
   ｂ．該エクソソームの少なくとも２０％が、１５０～３００ｎｍの平均直径を有し、かつ
   ｃ．該集団からのエクソソームがＴＳＰ－１を含んでなり、かつ
   ３ｋＤａカットオフ膜を用いて細胞を含まないＭＳＣ馴化培地を濾過して残留物を回収することを含む方法により得られる、
   前記組成物。
2. 前記集団におけるエクソソームが、低いレベルのＴＧＦ－βおよび／または潜在ＴＧＦ－βを含む、請求項１に記載の使用のための組成物。
3. 前記ＡＳＣがヒトに由来する、請求項１または２に記載の使用のための組成物。
4. 前記免疫介在性炎症性疾患が、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）およびクローン病からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
5. 前記ＡＳＣが同種異系である、請求項１または４に記載の使用のための組成物。
6. 前記組成物が全身にまたは局所的に投与される、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
7. 前記組成物が、直腸、鼻、口腔、膣、皮下、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、くも膜下腔内、病巣内もしくは頭蓋内の経路を介して、または埋め込み型リザーバーを介して投与される、請求項６に記載の使用のための組成物。
8. 前記組成物が、少なくとも１つの追加的治療薬と組み合わせて投与される、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

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