JP7066209B2 - 糖代謝異常の検出方法と予防及び治療 - Google Patents

Description

本発明は、グルタチオンペルオキシダーゼ２（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ２，ＧＰｘ２）を利用して糖代謝異常の検出方法と、２型糖尿病の予防及び治療の分野に関する。

食習慣の変化に伴って、全世界の糖尿病罹患率は年々上昇しており、糖尿病の合併症がヒトの主な死因の一つとなっている。近年では、Ｃ型肝炎ウィルスが糖尿病の危険因子の一つであって、患者の糖尿病リスクを加速及び増加させ得ることを示す数多くの証拠が提示されている。

糖尿病は全世界においてますます深刻な課題となっているが、現在のところ、糖尿病の発生を予防可能とする効果的な薬物は存在していない。また、治療に関しては血糖降下薬があるが、治療効果に限界があるものや、合併症として低血糖を誘発しやすいものなど、使用には依然として限界がある。

慢性Ｃ型肝炎の患者は血糖値の異常上昇を伴うことが多く、深刻な場合には糖尿病を発症する。しかし、この現象の原因は明らかとなっておらず、要因として、ＴＮＦ－α系の活性化、肝細胞の脂肪化又は線維化によるインスリン抵抗性等が推測される。これまでの研究で、インスリン抵抗性はＣ型肝炎の疾病進行、特に、肝臓の線維化度合との間に関連性があることが示されている。インターフェロンにリバビリンを併用してＣ型肝炎を治療する場合には、治療前に患者のインスリン抵抗性が明らかとなっていることが治療の成否を予測するための重要な指標の一つとなる。一方で、Ｃ型肝炎ウィルスを除去できれば、体内のインスリン抵抗性の状況、ランゲルハンス島のβ細胞機能、及び肝臓のインスリン受容体の発現をいずれも改善することが可能である。そのため、Ｃ型肝炎ウィルス自体が、インスリン抵抗性、ひいては２型糖尿病の形成にかなり重要な役割を果たしていると思われる。この役割や働きを追及することは、糖尿病の発症メカニズムを理解するために有用であり、更には、糖尿病を予防及び治療するための標的が見出されるはずである。

そこで、本発明は、Ｃ型肝炎による宿主の血糖代謝異常を誘発する遺伝子及びその関連因子をコントロールすることで、糖尿病を予防及び治療するための標的へと発展させるものである。

Ｃ型肝炎ウィルスへの感染、或いは高脂肪食の摂取のいずれの場合にも、ＧＰｘ２の発現は減少する。これにより、肝細胞のグルコース取り込み能力が低下するとともに、肝細胞の糖新生が増加する結果、血中のグルコース濃度が上昇して糖尿病を発症する。遺伝子ネットワーク解析ソフトを用いたところ、ＧＰｘ２は、脂肪酸の酸化、耐糖能、グルコースの取り込み、及び糖新生の遺伝子との間にいずれも密接な関係を有することが分かった。肝臓のインスリン抵抗性及び肝細胞の糖新生増加が２型糖尿病の重要な発症メカニズムであることから、本発明では、肝臓のＧＰｘ２の発現上昇を糖尿病の予防及び治療のための新たな標的として用いる。且つ、この場合には副作用として低血糖が発生しない。

そこで、本発明は、個体の糖代謝異常を検出する方法を提供する。当該方法では、当該個体の検体におけるＧＰｘ２遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）発現、ＧＰｘ２タンパク発現量、又はＧＰｘ２タンパク活性を検出し、正常個体のＧＰｘ２発現量と比較する。当該個体のＧＰｘ２発現量が当該正常個体のＧＰｘ２発現量よりも著しく低い場合には、当該個体が糖代謝異常状態を有することを意味する。特に、当該糖代謝異常は、血糖濃度が正常範囲よりも高いことを表す。そのため、本発明では、ＧＰｘ２を糖代謝異常の指標とすることが可能である。

また、本発明は、２型糖尿病を治療及び予防するための医薬組成物の調製におけるＧＰｘ２の用途を提供する。高脂肪食の摂取開始時にＧＰｘ２を投与すると、糖新生関連タンパクの発現量が減少する一方、ＧＬＵＴ（グルコーストランスポーター）の発現は上昇する。そのため、ＧＰｘ２は２型糖尿病の予防効果を有する。また、高脂肪食の摂取により２型糖尿病の発症が誘発されてからＧＰｘ２を投与した場合にも、糖新生関連タンパクの発現量は減少し、且つ、ＧＬＵＴの発現は上昇する。よって、ＧＰｘ２は２型糖尿病の治療効果を有する。

本文中で記載する「検体」とは、生物個体から収集したものをいい、組織、糞便、尿、均質化細胞、血液、血清、血漿、１又は複数の生体液又はこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。また、本発明で言及する個体とは動物であり、ヒト及び哺乳類を含むが、ヒトであることが好ましい。

本発明の方法は、特に、過体重者、運動を好まない者、家族歴（例えば、両親の一方又は兄弟に２型糖尿病患者がいる者）、人種的要因、老化が始まった者（特に４５歳以降）、糖尿病予備軍（糖尿病予備軍とは、体内の血糖値が正常値よりも高いが２型糖尿病に分類されるには至っておらず、コントロールしなければ２型糖尿病に進行し得る者をいう）、或いは、妊娠糖尿病に罹患したことのある者など、２型糖尿病のハイリスク群に適用される。

本発明の実施例より、Ｃ型肝炎ウイルスタンパクの発現を有する肝細胞（Ｃ型肝炎ウイルスのレプリコン）において、ＧＰｘ２の発現量が減少すると、細胞におけるグルコースの取り込みも減少し、且つ、糖新生が大幅に増加することが分かった。そこで、抗Ｃ型肝炎ウィルス薬（例えば、ダクラタスビル）を投与してＣ型肝炎ウイルスタンパクを抑制するか、或いは、ＧＰｘ２を過剰発現するプラスミドをトランスフェクションしたところ、いずれの場合にもＧＰｘ２の発現量が増加し、且つ、肝細胞におけるグルコースの取り込みが効果的に増加するとともに、糖新生を減少させることが可能であった。

Ｃ型肝炎ウィルスのレプリコンを持たず、ＧＰｘ２の発現が正常な肝細胞に関しては、ＧＰｘ２のｓｉＲＮＡをトランスフェクションすることでＧＰｘ２の発現を低下させ、ＧＰｘ２が影響を及ぼす代謝メカニズムについて観察した。その結果、ＧＰｘ２のｓｉＲＮＡを添加すると、ＧＰｘ２の発現が低下するとともに、インスリンのシグナル経路に影響が及ぶことで肝細胞におけるグルコースの取り込みが減少し、且つ、肝細胞における糖新生の進行が大幅に増加することが分かった。ここで、図１５を参照する。図１５Ａは、Ｈｕｈ７．５細胞をＧＰｘ２ ｓｉＲＮＡで処理してＧＰｘ２の発現を抑制した後に、ウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を実施したところ、ＧＰｘ２の発現量が減少した場合には細胞内のＧＬＵＴ１（グルコーストランスポーター１）とＧＬＵＴ２（グルコーストランスポーター２）の発現量も低下したことを示している。一方で、細胞内のＰＥＰＣＫとＧ６ＰＣ（Ｇ６Ｐａｓｅ）の発現量については明らかな増加が見られた（図１５Ｂ）。肝細胞における糖新生の増加は糖尿病発症の重要因子の一つである。以上から明らかなように、ＧＰｘ２は、肝細胞がグルコース代謝をコントロールする上での中枢を担っている。Ｃ型肝炎ウィルスは、肝細胞におけるＧＰｘ２の発現に影響を及ぼすことで宿主のグルコース代謝に異常を生じさせ、２型糖尿病を誘発する。よって、肝細胞におけるＧＰｘ２の低発現を矯正又は強化することで、肝細胞のグルコース代謝異常現象を効果的に回復させられる。

また、ＧＰｘ２を過剰発現させるプラスミドを構築し、高脂肪餌で飼育したマウスの体内に静脈注射により投与することで、血糖へのＧＰｘ２の影響を観察した。その結果、ＧＰｘ２の発現が正常なマウスと比較して、早期にＧＰｘ２高発現プラスミドを投与したマウスについては、糖新生増加の明らかな予防、グルコース代謝異常の効果的な改善、及び血糖コントロールが可能であり、糖尿病の罹患リスクが低下することが分かった。また、グルコース代謝異常を誘発済みの、高脂肪餌で飼育した糖尿病マウスにＧＰｘ２過剰発現プラスミドを投与して治療した場合にも、糖代謝異常の状況を効果的に改善可能であり、血糖コントロールの目的が達成された。図３Ｂに示すように、高脂肪餌を１６週間与えて糖尿病マウスとなるよう誘発した後に、尾静脈にＧＰｘ２過剰発現プラスミドを３２週間投与したところ、糖代謝異常を効果的に改善可能であった。以上の結果より、肝細胞のＧＰｘ２が血糖コントロールを左右する中枢となることが実証された。また、肝細胞におけるＧＰｘ２の発現を矯正又は強化することで、グルコース代謝異常を効果的に改善可能であり、血糖コントロールの目的が達成されることが分かった。したがって、ＧＰｘ２は糖尿病を予防できるだけでなく、糖尿病を発症した場合であっても治療効果を発揮可能である。本発明の組成物は、腸内又は胃腸外に適用される有機又は無機の担体或いは賦形剤を採用する。例えば、活性成分を複合可能であり、一般的に無毒且つ薬学的に許容可能な、タブレット、丸剤、カプセル剤、座薬、溶液、懸濁液、及び、使用に適したその他任意の形態に用いられる担体に適用される。使用可能な担体としては、グルコース、乳糖、アラビアガム、ゼラチン、マンニトール、デンプン糊、三ケイ酸塩、滑石、コーンスターチ、ケラチン、コロイド状二酸化ケイ素、バレイショデンプン、尿素、中鎖トリアシルグリセロール、デキストラン、及び、固体、半固体又は液体形状の薬剤の製造に適用されるその他の担体が含まれる。また、助剤、安定剤、増粘剤、着色剤及び香料を使用してもよい。

本発明の組成物は経口使用に適した形態とすればよい。例えば、錠剤、タブレット、糖衣錠、水性又は油性の懸濁液、分散剤又は顆粒剤、エマルション、硬質又は軟質のカプセル、或いはシロップ又はエリキシル剤とすればよい。経口使用に適用される組成物又は混合物は、製薬分野において既知の任意の方法に基づき製造すればよい。

本発明における医薬組成物は、注射用滅菌懸濁液としてもよい。この懸濁液は、既知の方法に基づいて、適切な分散剤、浸潤剤及び懸濁化剤を用いて調合すればよい。滅菌注射液は、無毒であり、消化管で受け入れ可能な希釈剤又は溶媒を用いて調合した滅菌注射液又は懸濁液としてもよい。

図１Ａは、ｑＰＣＲ分析したＧＰｘ２ Ｌｏｇ２タンパク発現量のうち、耐糖能異常群におけるＧＰｘ２の発現量を示す。 図１Ｂは、ｑＰＣＲ分析したＧＰｘ２ Ｌｏｇ２タンパク発現量のうち、検証群におけるＧＰｘ２の発現量を示す。 図２は、高脂肪餌を２４週間与えたマウスの肝臓におけるＧＰｘ２、ＰＥＰＣＫ、Ｇ６ＰＣ（Ｇ６Ｐａｓｅ）の発現量を２^－ΔＣＴ法で算出した値を示す（ＧＡＰＤＨとの比較倍数で示している）（対照群との比較において、^＊：ｐ＜０．０５、^＊＊：ｐ＜０．０１、^＊＊＊：ｐ＜０．００１。空担体ｖｅｈｉｃｌｅとの比較において、＃＃＃：ｐ＜０．００１）。 図３は、高脂肪餌を与えたマウスのＩＰＧＴＴの結果であって、そのうち、Ａは、高脂肪餌を２４週間与えつつ、ＧＰｘ２過剰発現プラスミドを投与した場合のＩＰＧＴＴの結果を示す（^＊＊：対照群との比較において、ｐ＜０．０１。＃＃：空担体ｖｅｈｉｃｌｅとの比較において、ｐ＜０．０１）図であり、Ｂは、高脂肪餌を与えたマウスのＩＰＧＴＴの結果であって、高脂肪餌を１６週間与えて２型糖尿病を誘発した後、ＧＰｘ２過剰発現プラスミドを投与した場合のＩＰＧＴＴの結果を示す（^＊＊：対照群との比較において、ｐ＜０．０１。＃＃：空担体ｖｅｈｉｃｌｅとの比較において、ｐ＜０．０１）図である。 図４は、Ｃ型肝炎患者の肝臓組織切片におけるＲＮＡ及びｃＤＮＡの完全性確認図であり、そのうち、ＡはＲＮＡ濃度の完全性確認図であり、ｃＤＮＡの完全性確認図である。 図５は、マイクロアレイチップ実験による全遺伝子の発現検出結果を示す図である。 図６は、ＨｅｐＧ２、Ｃｏｎ１、Ｈｕｈ７．５細胞株におけるＧＰｘ２の各発現量を示す。 図７は、ＧＰｘ２過剰発現ベクターを投与したＣｏｎ１細胞株におけるＧＬＵＴ１及びＧＬＵＴ２の発現量を示す（^＊：空担体ｖｅｈｉｃｌｅとの比較において、ｐ＜０．０５。^＊＊：空担体ｖｅｈｉｃｌｅとの比較において、ｐ＜０．０１。＃：対照群との比較において、ｐ＜０．０５）。 図８は、ＧＰｘ２過剰発現ベクターを投与したＣｏｎ１細胞株におけるＧ６Ｐａｓｅ及びＰＥＰＣＫの発現量を示す（^＊：空担体ｖｅｈｉｃｌｅとの比較において、ｐ＜０．０５。^＊＊：空担体ｖｅｈｉｃｌｅとの比較において、ｐ＜０．０１。＃＃：対照群との比較において、ｐ＜０．０１。＃＃＃：対照群との比較において、ｐ＜０．００１）。 図９は、濃度の異なるＨＣＶウィルス特異的阻害剤（ダクラタスビル）を投与した場合のＣｏｎ１細胞株におけるＧＰｘ２、ＧＬＵＴ１及びＧＬＵＴ２の発現量を示す（ＤＭＳＯ（ダクラタスビル濃度０ｐＭ）との比較において、^＊：ｐ＜０．０５、^＊＊：ｐ＜０．０１、^＊＊＊：ｐ＜０．００１。ダクラタスビルの濃度別作用との比較において、＃：ｐ＜０．０５、＃＃：ｐ＜０．０１）。 図１０は、濃度の異なるＨＣＶウィルス特異的阻害剤（ダクラタスビル）を投与した場合のＣｏｎ１細胞株におけるＧ６ＰＣ（Ｇ６Ｐａｓｅ）及びＰＥＰＣＫの発現量を示す（ＤＭＳＯ（ダクラタスビル濃度０ｐＭ）との比較において、^＊：ｐ＜０．０５、^＊＊：ｐ＜０．０１、^＊＊＊：ｐ＜０．００１。ダクラタスビルの濃度別作用との比較において、＃：ｐ＜０．０５、＃＃：ｐ＜０．０１）。 図１１は、高脂肪餌を２４週間与えたマウスの肝臓におけるＧＰｘ２の発現量を示す。 図１２は、高脂肪餌を４８週間与えたマウスの肝臓におけるＧＰｘ２の発現量を示す。 図１３は、高脂肪餌を４８週間与えたマウスの肝臓におけるＧＬＵＴの発現量を示す。 図１４は、高脂肪餌を４８週間与えたマウスの肝臓における糖新生関連タンパクの発現量を示す。 図１５は、ＧＰｘ２ ｓｉＲＮＡ処理を施してＧＰｘ２の発現を抑制した後のＧＬＵＴ２、Ｇ６ＰＣ（Ｇ６Ｐａｓｅ）及びＰＥＰＣＫの発現量を示す。

細胞実験
レプリコン細胞Ｈｕｈ７．５及びＨｕｈ７．５／Ｃｏｎ１（遺伝子型１ｂ）を高グルコースのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ）で培養した。これを５％二酸化炭素／３７℃のインキュベーター内で培養し、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ｈｅａｔ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，ｈｅａｔ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ＦＢＳ）、５％抗生物質－抗菌薬（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）溶液、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び５％非必須アミノ酸溶液を補充した。そして、細胞株に２４時間の飢餓処理を施した後、１０％ＦＢＳ及びアンノナシンを含有する新鮮培地を加えて細胞実験を行った。一方、Ｃｏｎ１細胞株については引き続き完全培地（０．５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含有）で培養した。

ウェスタンブロッティング
３０μｇの細胞溶解物サンプルを１０％ＳＤＳ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅゲル上に配置し、電気泳動してから、ＰＶＤＦ膜にブロットした。ブロッキングの後、当該膜を標的タンパクであるＧＰｘ２、ＧＬＵＴ１、ＰＣＫ１（ＰＥＰＣＫ）、ＧＬＵＴ２、及びＧ６ＰＣ（Ｇ６Ｐａｓｅ）抗体（一次抗体）を含有する溶液にそれぞれ浸漬し、２時間インキュベートしてから、０．１％ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳで５分間洗浄した。続いて、当該膜をＨＲＰ複合二次抗体で１時間インキュベートした。そして、増強化学発光試薬（ＥＣＬ）を膜に加えて照射し、タンパク質分布を観察した。

プラスミドの準備及び一過性トランスフェクション
細胞を各ウェル１．２×１０^５の数量で６ウェルプレート培地に配置し、一晩成長させた。次に、特定の所定時間だけＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（登録商標）を用い、ＧＰｘ２過剰発現プラスミド及びｓｉＧＰｘ２（ＧＰｘ２ ｓｉＲＮＡ）を当該細胞にトランスフェクションした。また、対照群として、担体にｐｃＤＮＡ（空担体，ｖｉｈｅｃｌｅ）又はｓｉＮＣ（ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ）のみをトランスフェクションした。

動物実験
２４週間：高脂肪餌による糖代謝異常誘発マウス：６週齢のＣ５７ＢＬ／６オスマウスを病原無し環境で２週間飼育した。その後、各群が少なくとも５匹のマウスを有するよう、全てのマウスをランダムに６群に分けた。群１には正常餌を与えた。群２には正常餌を与え、且つ、毎週１回マウスの尾部からプラスミド担体を静脈注射した（Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔに溶解したものを５０μｇ／ｐｌａｓｍｉｄ／マウス／週）。群３には正常餌を与え、且つ、毎週１回マウスの尾部からＧＰｘ２過剰発現プラスミドを静脈注射した（Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔに溶解したものを５０μｇ／ｐｌａｓｍｉｄ／マウス／週）。群４には、正常餌よりも３０％増しの高脂肪餌を与えた。群５には、正常餌よりも３０％増しの高脂肪餌を与え、且つ、毎週１回マウスの尾部からプラスミド担体を静脈注射した（Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔに溶解したものを５０μｇ／ｐｌａｓｍｉｄ／マウス／週）。群６には、正常餌よりも３０％増しの高脂肪餌を与え、且つ、毎週１回マウスの尾部からＧＰｘ２過剰発現プラスミドを静脈注射した（Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔに溶解したものを５０μｇ／ｐｌａｓｍｉｄ／マウス／週）。２４週間後に全てのマウスを殺処理し、組織を採取して３つの部分に分けた。第１部分については４％ホルムアルデヒドで固定してパラフィンで包埋し、組織切片として研究した。第２部分の組織については組織用ＲＮＡサンプル保存液（ＲＮＡｌａｔｅｒ）に保存し、後の遺伝子発現検出に備えて－８０℃環境下に置いた。第３部分の組織については液体窒素に保存した。

４８週間：６週齢のＣ５７ＢＬ／６オスマウスを病原無し環境で２週間飼育した。その後、各群が少なくとも５匹のマウスを有するよう、全てのマウスをランダムに４群に分けた。群１には正常餌を与えた。群２には、正常餌よりも３０％増しの高脂肪餌を与えた。群３には、正常餌よりも３０％増しの高脂肪餌を与え、且つ、実験を開始して給餌１６週間後より、毎週１回マウスの尾部からプラスミド担体を静脈注射した（Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔに溶解したものを５０μｇ／ｐｌａｓｍｉｄ／マウス／週）。群４には、正常餌よりも３０％増しの高脂肪餌を与え、且つ、実験を開始して給餌１６週間後より、毎週１回マウスの尾部からＧＰｘ２過剰発現プラスミドを静脈注射した（Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔに溶解したものを５０μｇ／ｐｌａｓｍｉｄ／マウス／週）。４８週間後に全てのマウスを殺処理し、組織を採取して３つの部分に分けた。第１部分については４％ホルムアルデヒドで固定してパラフィンで包埋し、組織切片として研究した。第２部分の組織については組織用ＲＮＡサンプル保存液（ＲＮＡｌａｔｅｒ）に保存し、後の遺伝子発現検出に備えて－８０℃環境下に置いた。第３部分の組織については液体窒素に保存した。

高脂肪餌で糖代謝異常を誘発したマウスは、肝臓におけるＧＰｘ２の発現量が明らかに低下していた。

一方、マウスを高脂肪餌で飼育しつつ、尾静脈からＧＰｘ２過剰発現プラスミドを投与したところ、ｑＰＣＲ検出の結果、ＧＰｘ２過剰発現プラスミドを有するマウスについては、図２に示すように、肝臓におけるＧＰｘ２の発現が明らかに増加し、且つ、糖新生関連遺伝子（ＰＥＰＣＫ及びＧ６ＰＣ（Ｇ６Ｐａｓｅ））の発現を効果的に低減可能であることが分かった。

グルコース負荷試験（Ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｅｓｔ，ＧＴＴ）
全てのマウスを１２時間絶食させてから、腹膜内にグルコースを注射した（グルコース２ｇ／体重ｋｇ）。次に、グルコース注射から０分、３０分、６０分及び１２０分の時点で尾部から採血し、血糖検出器を用いて血糖濃度を検出した。

その結果、図３Ａに示すように、マウスを高脂肪餌で飼育しつつ尾静脈からＧＰｘ２過剰発現プラスミドを投与し、２４週間後にグルコース負荷試験を実施したところ、ＧＰｘ２過剰発現プラスミドを投与したマウスは好ましい糖代謝状況を有していた。また、図３Ｂに示すように、高脂肪餌を１６週間与えて糖尿病マウスとなるよう誘発した後に、尾静脈にＧＰｘ２過剰発現プラスミドを投与し、３２週間後にＩＰＧＴＴ（Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｅｓｔ，腹腔内グルコース負荷試験）を実施した結果、ＧＰｘ２が糖代謝異常を効果的に改善可能なことが示された。ＧＰｘ２過剰発現プラスミドを投与したマウスが有する好ましい糖代謝状況は、正常餌を与えた非糖尿病マウスに相当していた。

免疫組織化学分析
パラフィンで包埋した肝臓組織を４μｍサイズの切片に切断し、１００℃でマイクロ波を３０分間かけて、非特異性反応をブロッキングした。次に、一次抗体により切片を４℃下で一晩培養した後、０．２％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳで１０分間の洗浄を２度行った。次に、ビオチン標識二次抗体で当該切片を１時間培養した後、０．２％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳで１０分間の洗浄を２度行った。最後に、当該切片を染色し、各種タンパクの発現を観察した。

患者の募集
４８名のＣ型肝炎患者を募集して、それぞれを経口ブドウ糖負荷試験及びグリコヘモグロビンに基づき分類したところ（表１参照）、１９名が正常血糖患者、１１名が耐糖能異常患者、１８名が２型糖尿病患者であった。

ウィルスの定型分析
患者ごとにウィルスの定型分析を行い、ウィルスの遺伝子型を特定するとともに、ウィルスの定量分析を行った。次に、５名の正常血糖患者、３名の耐糖能異常患者、３名の２型糖尿病患者をランダムに抽出した。且つ、インスリン又は経口血糖降下薬の服用経験のない者をサンプルとし、遺伝子チップ実験を行うことで候補遺伝子を選別した。その他のサンプルについては検証群とし、候補遺伝子の検証に用いた。２つのサンプル群の基本データについては表２に示す通りであった。

肝臓切片
各患者の肝臓切片を収集し、各々よりＲＮＡを抽出してＲＮＡ濃度を測定してから、それぞれをｃＤＮＡに変換して完全性を確認した。結果は図４に示す通りであった。

全遺伝子の発現検出
マイクロアレイチップ実験により全遺伝子の発現検出を行い、全チップの結果を正則化したところ、図５に示すようになった。

続いて、遺伝子発現の差について分析した。１．５倍の差を閾値とし、発現に差のある遺伝子を抽出した。耐糖能異常患者と正常血糖患者を比較したところ、８１の遺伝子発現に上昇が見られ、７７の遺伝子発現に低下が見られた。また、２型糖尿病患者と正常血糖患者を比較したところ、１６１の遺伝子発現に上昇が見られ、９９の遺伝子発現に低下が見られた。

遺伝子ネットワーク解析の実施：耐糖能異常患者と２型糖尿病患者の比較において、発現差のある遺伝子機能を脂質代謝（Ｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）、分子輸送（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）、小分子生化学（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ビタミン及びミネラル代謝（ｖｉｔａｍｉｎ ａｎｄ ｍｉｎｅｒａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）等の機能にまとめた。その結果、表３のようになった。

耐糖能異常群と２型糖尿病群の比較結果をまとめ、顕著な差のあった候補遺伝子ＧＰｘ２を取得した。ｑＰＣＲ方式でＧＰｘ２を分析したところ、図１Ａに示すように、耐糖能異常の程度に応じてＧＰｘ２の程度にも変化が見られた。また、ｑＰＣＲ方式で検証群のサンプルをテストしたところ、やはりＧＰｘ２は顕著な差を維持しており、且つ、図１Ｂに示すように、耐糖能が悪化するに伴ってＧＰｘ２遺伝子の発現量も低下していた。

遺伝子ネットワーク解析
遺伝子ネットワーク解析の結果、ＧＰｘ２は、脂肪酸の酸化、耐糖能、グルコースの取り込み、及び糖新生の遺伝子との間にいずれも密接な関係を有すると推測された。

糖代謝におけるＧＰｘ２の役割
細胞実験で、糖代謝におけるＧＰｘ２の役割を検証した。Ｃ型肝炎ウィルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ，ＨＣＶ）は、ＧＰｘ２の発現を抑制することでＨＣＶによる肝細胞の糖代謝異常（グルコース輸送の低下と糖新生の増加）を招来し得る。これに対し、ＧＰｘ２の発現を増加させれば、ＨＣＶに起因する糖代謝異常現象を明らかに改善可能である。

プラスミドトランスフェクション及びウェスタンブロッティング実験より、ＨＣＶ関連遺伝子を持たない細胞（ＨｅｐＧ２及びＨｕｈ７．５）と比較して、ＨＣＶ ｔｙｐｅ １ｂレプリコン関連遺伝子を有する細胞（Ｃｏｎ１細胞）では、図６に示すように、ＧＰｘ２の発現量が明らかに低下した。

従来文献で指摘されているように、ＨＣＶ関連遺伝子の発現を有する細胞（Ｃｏｎ１）では、ＨＣＶによってＧＬＵＴの発現量が減少する。そこで、本発明では、ＧＰｘ２を過剰発現させる担体を投与してＧＰｘ２の発現量を増加させたところ、図７に示すように、ＧＬＵＴの発現量が明らかに増加し、ＧＰｘ２が細胞のグルコース輸送能力を改善可能であることが分かった。

従来文献で指摘されているように、ＨＣＶ関連遺伝子の発現を有する細胞（Ｃｏｎ１）では、ＨＣＶによって糖新生関連遺伝子（Ｇ６ＰＣ（Ｇ６Ｐａｓｅ）及びＰＥＰＣＫ）の発現量が増加する。そこで、本発明では、ＧＰｘ２を過剰発現させる担体を投与してＧＰｘ２の発現量を増加させたところ、図８に示すように、Ｇ６ＰＣ（Ｇ６Ｐａｓｅ）とＰＥＰＣＫの発現が明らかに低下し、細胞内の糖新生作用が抑制されることが分かった。

Ｃｏｎ１細胞をＨＣＶウィルス特異的阻害剤（ダクラタスビル）で処理し、ウェスタンブロッティングで検出したところ、阻害剤の濃度が上昇するほどウィルス量が減少するとともに、図９に示すように、ＧＰｘ２及びＧＬＵＴの発現量が増加したことから、濃度依存性があることが分かった。また、図１０に示すように、ダクラタスビルは糖新生関連タンパクＧ６ＰＣ（Ｇ６Ｐａｓｅ）とＰＥＰＣＫを減少させており、且つ、濃度依存性があることが分かった。

免疫組織染色図から明らかとなった点として、図１１に示すように、高脂肪餌による糖尿病誘発マウスはＧＰｘ２の発現量が減少したが、ＧＰｘ２過剰発現プラスミドを投与することでＧＰｘ２の発現量は回復した。また、図１２に示すように、４８週間の高脂肪給餌実験では、ＧＰｘ２の発現を著しく増加可能であった。一方、図１３に示すように、高脂肪餌による糖尿病誘発マウスはＧＬＵＴの発現量が減少したが、ＧＰｘ２過剰発現プラスミドを投与することでＧＬＵＴの発現量は回復した。また、図１４に示すように、高脂肪餌による糖尿病誘発マウスはＧ６ＰＣ（Ｇ６Ｐａｓｅ）及びＰＥＰＣＫの発現量が増加したが、ＧＰｘ２過剰発現プラスミドを投与することで、Ｇ６ＰＣ（Ｇ６Ｐａｓｅ）及びＰＥＰＣＫの発現量は回復した。

Claims (6)

1. 所望個体における２型糖尿病の進行リスクを検出する方法であって、
   （ａ）前記所望個体の検体におけるＧＰｘ２のみの遺伝子発現量、ＧＰｘ２のみのタンパク発現量、又はＧＰｘ２のみのタンパク活性を検出し、
   （ｂ）前記所望個体の検体におけるＧＰｘ２のみの遺伝子発現量、ＧＰｘ２のみのタンパク発現量、又はＧＰｘ２のみのタンパク活性を正常個体からの検体のＧＰｘ２のみの発現量、ＧＰｘ２のみのタンパク発現量、又はＧＰｘ２のみのタンパク活性と比較して、前記所望個体からの検体のＧＰｘ２のみの遺伝子発現量、ＧＰｘ２のみのタンパク発現量、又はＧＰｘ２のみのタンパク活性が前記正常個体からの検体のＧＰｘ２のみの発現量、ＧＰｘ２のみのタンパク発現量、又はＧＰｘ２のみのタンパク活性よりも低く、Ｐ値＜０．０５の場合には、前記所望個体が２型糖尿病を進行させるリスクが高い糖代謝異常状態を有することを意味する方法であって、前記検体は、肝臓からなる群より選択する、方法。
   
2. 前記個体は動物であり、ヒト及び哺乳類を含む請求項１に記載の方法。
3. 前記個体はヒトである請求項１に記載の方法。
4. ＧＰｘ２遺伝子をコードする核酸またはＧＰｘ２タンパク質を利用して２型糖尿病を予防又は治療する医薬組成物を調製する使用であって、前記組成物は、有効投与量のＧＰｘ２遺伝子をコードする核酸またはＧＰｘ２タンパク質及び医薬的に許容可能な担体を含む使用。
5. 前記２型糖尿病は、Ｃ型肝炎ウィルスへの感染又は高脂肪食の摂取により招来される請求項４に記載の使用。
6. 前記有効投与量とは、少なくとも、投与対象の前記ＧＰｘ２遺伝子をコードする核酸またはＧＰｘ２タンパク質を正常発現量まで回復させられる投与量である請求項４に記載の使用。

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