JP7051677B2 - 次世代シークエンシングのための高分子量ｄｎａサンプル追跡タグ - Google Patents
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Description
関連出願への相互参照
本出願は、２０１５年９月２９日に出願された米国仮出願番号第６２／２３４，６３０号、および２０１６年５月１２日に出願された米国仮出願番号第６２／３３５，３６４号に基づき、それらの利益を主張している。
政府支援による研究に関する陳述
適用なし。
本出願は、２０１５年９月２９日に出願された米国仮出願番号第６２／２３４，６３０号、および２０１６年５月１２日に出願された米国仮出願番号第６２／３３５，３６４号に基づき、それらの利益を主張している。
政府支援による研究に関する陳述
適用なし。
配列表の援用
「ＲＭＳＩ－００６００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」という名称のテキストファイル（２０１６年９月２７日付けで作成、サイズは２０ＫＢ）の内容は、それらの全体において参考として援用される。
「ＲＭＳＩ－００６００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」という名称のテキストファイル（２０１６年９月２７日付けで作成、サイズは２０ＫＢ）の内容は、それらの全体において参考として援用される。
背景
ＤＮＡシークエンシング技術の継続している革命は、医療、農業、および法科学を変容させ、莫大な数のサンプルが制限された時間において処理されるという予測および要求の両方を作り出している。近年の技術総説は、以下の現在のプロジェクトを記載している（例えば、ロードマップ・エピゲノミクス・コンソーシアム（Ｒｏａｄｍａｐ Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）（これは、ハイスループットＤＮＡシークエンシング技術を使用して、ヒト細胞タイプのエピゲノムを記載する）、マウス脳の単一細胞トランスクリプトミクスを分析する研究、および「以前は想像を絶する」としてニューヨーク市地下鉄のメタゲノミクスを詳細に記録する活動（Ｐｅｒｋｅｌ， ＪＭ， Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ： ２０１５ Ｕｐｄａｔｅ ｐｏｓｔｅｄ ａｔ Ｂｉｏｃｏｍｐａｒｅ ｏｎ ２４ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１５）。
ＤＮＡシークエンシング技術の継続している革命は、医療、農業、および法科学を変容させ、莫大な数のサンプルが制限された時間において処理されるという予測および要求の両方を作り出している。近年の技術総説は、以下の現在のプロジェクトを記載している（例えば、ロードマップ・エピゲノミクス・コンソーシアム（Ｒｏａｄｍａｐ Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）（これは、ハイスループットＤＮＡシークエンシング技術を使用して、ヒト細胞タイプのエピゲノムを記載する）、マウス脳の単一細胞トランスクリプトミクスを分析する研究、および「以前は想像を絶する」としてニューヨーク市地下鉄のメタゲノミクスを詳細に記録する活動（Ｐｅｒｋｅｌ， ＪＭ， Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ： ２０１５ Ｕｐｄａｔｅ ｐｏｓｔｅｄ ａｔ Ｂｉｏｃｏｍｐａｒｅ ｏｎ ２４ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１５）。
Ｐｅｒｋｅｌ， ＪＭ， Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ： ２０１５ Ｕｐｄａｔｅ ｐｏｓｔｅｄ ａｔ Ｂｉｏｃｏｍｐａｒｅ ｏｎ ２４ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１
要旨
本開示は、とりわけ、核酸サンプルを追跡するための技術に関するある特定の見通しを提供する。一局面において、本開示は、多くの既存の核酸管理および／または分析システムと関連する問題の出所を同定する。例えば、本開示は、多くのハイスループット設備（例えば、臨床検査室およびコアラボが、サンプルを混同するかまたは二次汚染するリスクを冒すという見通しを包含する。多くの状況では、これらのタイプのエラーは、標準的な品質コントロールワークフローによって検出不能であり、特に、臨床上の背景（例えば、体細胞変異検出）、法医学検査におけるＤＮＡ分析のエラーなどでは、潜在的に重大な結論を伴う。本開示は、従って、このようなエラーの検出が重要であり、サンプル取り扱いおよび分析における必要性が満たされていないことを認識している。
本開示は、とりわけ、核酸サンプルを追跡するための技術に関するある特定の見通しを提供する。一局面において、本開示は、多くの既存の核酸管理および／または分析システムと関連する問題の出所を同定する。例えば、本開示は、多くのハイスループット設備（例えば、臨床検査室およびコアラボが、サンプルを混同するかまたは二次汚染するリスクを冒すという見通しを包含する。多くの状況では、これらのタイプのエラーは、標準的な品質コントロールワークフローによって検出不能であり、特に、臨床上の背景（例えば、体細胞変異検出）、法医学検査におけるＤＮＡ分析のエラーなどでは、潜在的に重大な結論を伴う。本開示は、従って、このようなエラーの検出が重要であり、サンプル取り扱いおよび分析における必要性が満たされていないことを認識している。
とりわけ、本発明は、例えば、サンプル同一性を確認するためにおよび／またはサンプル二次汚染を検出するために有用である高分子量合成核酸タグを提供する。
いくつかの実施形態において、提供されるタグは、ＤＮＡを含むか、またはＤＮＡからなる。いくつかの実施形態において、提供されるタグは、２本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）を含むか、または２本鎖ＤＮＡからなる。いくつかの実施形態において、提供されるタグ（例えば、ｄｓＤＮＡタグ）は、配列エレメントの反復を含むか、またはその反復からなるヌクレオチド配列であって、ここで上記配列エレメントは、本明細書で記載されるように、タグ配列およびユニバーサル配列を含むか、またはこれらからなるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態において、提供されるタグは、タグ質量 対 サンプル質量の特定の比でサンプルに「スパイクイン（ｓｐｉｋｅｄ ｉｎ）」または添加され得る。
いくつかの実施形態において、提供されるタグは、例えば、規定量（重量および／または容積）で、分析下にある（例えば、核酸シークエンシングまたは他の処理技術に供されている）核酸サンプルに添加（「スパイクイン」）され得る。
いくつかの実施形態において、プローブベースのｑＰＣＲのような技術を使用して、提供されるタグの間を検出および区別することは可能である。
いくつかの実施形態において、提供されるタグは、独立型のＤＮＡマーカーとして（例えば、物理的物体をタグ化するために）使用され得る。いくつかの実施形態において、上記タグ化された物理的物体は、核酸分子ではない。
いくつかのこのような実施形態において、提供されるタグは、特定の分析を受けている複数のサンプルに添加され得る。いくつかの実施形態において、提供されるタグは、特定の分析を受けている全てのサンプルに添加され得る。
本開示のいくつかの実施形態によれば、本明細書で記載されるとおりのタグは、タグ 対 サンプルＤＮＡの所定の質量比（例えば、０．１％）でサンプルに添加され得る。
いくつかの実施形態において、タグは、シークエンシング分析（例えば、ＤＮＡシークエンシング分析）を受けている（そして従って、そのための成分および／または試薬を含む）サンプルに添加され得る。いくつかの実施形態において、タグは、ハイスループットシークエンシング分析を受けているサンプルに添加され得る。いくつかの実施形態において、タグは、いわゆる「次世代シークエンシング」（「ＮＧＳ」）分析を受けているサンプルに添加され得る。
いくつかの実施形態において、タグは、それらが、単一の供給源（例えば、単一ゲノム、単一トランスクリプトームなど）に由来するサンプル核酸であるか、または関連供給源のセットに由来するサンプル核酸（例えば、シークエンシングされるべき標的ＤＮＡもしくはＲＮＡ）を含むという点で、互いに関連するサンプルのセットに添加され得る。いくつかの実施形態において、サンプルのセットは、「ライブラリー」である。
いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるとおりのタグは、それらの収集時点でサンプル（例えば、特定の生物核酸もしくは細胞核酸の例えば、粗製サンプル）に添加され得、サンプル二次汚染の可能性をさらに低減し得る。本開示によれば、いくつかの実施形態において、提供されるタグのある特定の特徴（例えば、それらの合成設計、ランダムおよび／もしくはユニバーサル配列エレメントの包含、それらの反復性の構造など）は、データ分析の間の改善された明白なタグ由来配列同定を促進する。特有のタグ間の大きな編集距離は、サンプル二次汚染の明確な同定を可能にし得、技術的パラメーター（例えば、アダプターバーコードクロストークにインデックスを付加する）をアッセイするために使用され得る。いくつかの実施形態において、反復性のタグ構造は、標的とされたシークエンシング適用（例えば、ハイブリッド捕捉およびアンプリコンシークエンシング）において提供されるタグの使用を可能にする。コンビナトリアルサンプルタグ化は、特有のタグ配列の比較的小さなセットを使用して、多くの特有のサンプルタグ組み合わせの生成を可能にする。とりわけ、提供されるサンプルタグ化方法論は、サンプルセキュリティー（特に、ハイスループット、例えば、ＮＧＳサンプルのために）およびサンプル収集から配列分析までのプロセス制御を確実にするための単純かつ強力な手段を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、合成核酸タグであって、上記タグの核酸配列は、構造Ａ－Ｂ－Ｃの複数の反復ユニットを有し得、以下の式：Ｘ－［Ａ－Ｂ－Ｃ］ｎ－Ｙによって表される全体構造を有するものを提供する。一実施形態において、ｎは、少なくとも２であり、Ａ、ＢおよびＣの各々は、２個もしくはこれより多くの残基の規定された長さを有する。
いくつかの実施形態において、式：Ｘ－［Ａ－Ｂ－Ｃ］ｎ－Ｙに従う式を有するタグは、ＡおよびＣの各々の配列を有し、それら配列は、これらにハイブリダイズされるプライマーが伸長され得るという点で少なくとも１個のプライマーランディングパッド配列エレメントを有し、そしてさらにここでＡおよびＣが、逆方向性のプライマーが両方に同時にハイブリダイズし得、その結果増幅生成物が上記ハイブリダイズしたプライマーの伸長によって生成されるという点で互いに適合性であるヌクレオチド配列を有する。
いくつかの実施形態において、少なくともＢは、分析のための直接関連するサンプルにおいて見出される任意の配列とハイブリダイズしない配列を有し、ここでＢは、上記タグの中の個々のＢ領域間に少なくとも２の編集距離を担保するために十分な長さを有する。
いくつかの実施形態において、式：Ｘ－［Ａ－Ｂ－Ｃ］ｎ－Ｙに従う式を有するタグは、必要に応じて存在するか、または存在しないＸを有し、存在する場合、－Ｃ－の１個もしくはこれより多くの例からなり得るか、もしくはその例を含み得るか、またはさもなければ、別のエレメントからなり得るか、または別のエレメントを含み得る。いくつかの実施形態において、Ｙは、必要に応じて存在するか、または存在せず、存在する場合、－Ａ－の１個もしくはこれより多くの例からなり得るか、もしくはその例を含み得るか、またはさもなければ、別のエレメントからなり得るかまたは別のエレメントを含み得る。
いくつかの実施形態において、本発明は、ＤＮＡおよび少なくとも１個の合成核酸タグを含むシークエンシングサンプルを提供し、ここでＡおよびＣは、各々少なくとも２個の核酸の長さであり、同じ長さまたは異なる長さであり；そしてここでＢは、少なくとも２個の核酸を含み、そして上記複数の反復ユニットは、少なくとも２である。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列分析のためのサンプルのセットを提供し、ここで各サンプルは、少なくとも１個の合成核酸タグを含み、上記タグのヌクレオチド配列は、式Ａ－Ｂ－Ｃに従う複数の反復ユニットを含み、ここでＡおよびＣは、各々少なくとも８個の核酸の長さであり、同じ長さまたは異なる長さであり；そしてここでＢは、少なくとも８個の核酸を含む。
いくつかの実施形態において、上記タグは、２本鎖である核酸分子を含む。
いくつかの実施形態において、Ａの長さおよびＣの長さの各々は、少なくとも２個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、Ｂの長さは、少なくとも２個のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、１分子あたりの反復ユニットの数は、少なくとも２である。
いくつかの実施形態において、本発明は、キットを提供する。いくつかの実施形態において、上記キットは、複数の核酸分子タグを含み、上記タグの各々は、式：［Ａ－Ｂ－Ｃ］ｎによって表される核酸配列を有し、ここでｎは、少なくとも２であり、Ａ、Ｂ、およびＣの各々は、２個もしくはこれより多くの残基の規定された長さを有する。
いくつかの実施形態において、上記キットは、異なるタグもしくはタグのセットを有する。いくつかの実施形態において、上記キット中の異なるタグは、各タグが、同一のＡ配列エレメントを有する；各タグが、同一のＣ配列エレメントを有する；および各タグが、上記キット中の他のタグのものとは異なるＢ配列エレメントを有するという点で、互いに構造的に関連する。
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書で記載されるとおりの１個もしくはこれより多くのタグを含むサンプル収集チューブを提供する。
いくつかの実施形態において、上記核酸分子タグは、２本鎖ＤＮＡである。
いくつかの実施形態において、ＡおよびＣの各々の長さは、少なくとも２個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、Ｂの長さは、少なくとも２個のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、タグ内の反復の数は、少なくとも２である。
いくつかの実施形態において、本発明は、サンプルをタグ化するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記サンプルと、本明細書で記載されるとおりの少なくとも１種のタグとを、上記タグおよび上記サンプルが同じ容器の中に含まれるようにする条件下で接触させる工程を包含する。
いくつかの実施形態において、上記サンプルは、粗製サンプルである。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、１もしくはこれより多くの部分（副サンプル）に分けられる。
いくつかの実施形態において、上記サンプルは、精製サンプルである。いくつかの実施形態において、上記精製サンプルは、単離されたＤＮＡである。
いくつかの実施形態において、上記サンプルと上記タグとを接触させる工程は、上記サンプルが収集される時に起こる。いくつかの実施形態において、上記接触させる工程は、サンプル精製の前に起こる。いくつかの実施形態において、上記接触させる工程は、ＤＮＡ抽出の前に起こる。いくつかの実施形態において、上記接触させる工程は、ＤＮＡ抽出後に起こる。いくつかの実施形態において、上記接触させる工程は、ＤＮＡ精製後に起こる。
いくつかの実施形態において、上記接触させる工程は、上記サンプルを含む収集容器の中で起こる。いくつかの実施形態において、上記接触させる工程は、ウェルプレート／容器の中で起こり、その容器は、サンプルを増幅および分析するために使用される。いくつかの実施形態において、上記接触させる工程は、上記サンプルが１より多くの部分に分けられる前に起こる。いくつかの実施形態において、上記接触させる工程は、上記サンプルが１より多くの部分に分けられた後に起こる。
いくつかの実施形態において、上記接触させる工程は、上記タグを上記サンプルに、上記サンプルの質量に対して少なくとも約０．０００１％～少なくとも約１０％質量のタグ添加する工程を包含する。
別の実施形態において、本開示は、合成核酸タグであって、上記タグの核酸配列は、構造Ａ－Ｂ－Ｃの複数の反復ユニットを含むものを提供する。上記合成核酸タグは、式：Ｘｉ－［Ａ－Ｂ－Ｃ］ｎ－Ｙｊによって表される全体構造を有する。上記合成核酸タグは、構造Ａ－Ｂ－Ｃのｎ回反復を含み、ここでｎは、少なくとも２である。一局面において、Ａ、Ｂ、およびＣの各々は、少なくとも２個の残基の規定された長さを有する核酸であり、上記合成核酸タグは、Ｘのｉ回反復を含み、そして上記合成核酸タグは、Ｙのｊ回反復を含む。別の局面において、Ｘは、Ｃ、別の核酸、および核酸改変のうちの少なくとも１つであり、Ｙは、Ａ、別の核酸、および核酸改変のうちの少なくとも１つである。さらに別の局面において、ｉおよびｊは、０～１００から独立して選択される整数である。
定義
本出願において、文脈から別段明らかでなければ、（ｉ）用語「１つの、ある（ａ）」は、「少なくとも１」を意味すると理解され得る；（ｉｉ）用語「または（ｏｒ）」は、「および／または」を意味すると理解され得る；（ｉｉｉ）用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、単独で示されていようが、１もしくはこれより多くのさらなる成分もしくは工程と一緒に提示されていようが、箇条書きにした成分または工程を包含すると理解され得る；そして（ｉｖ）用語「約」および「およそ」は、当業者によって理解されるとおりの標準的変動を許容すると理解され得る；そして（ｖ）範囲が提供される場合、端点は包含される。
本出願において、文脈から別段明らかでなければ、（ｉ）用語「１つの、ある（ａ）」は、「少なくとも１」を意味すると理解され得る；（ｉｉ）用語「または（ｏｒ）」は、「および／または」を意味すると理解され得る；（ｉｉｉ）用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、単独で示されていようが、１もしくはこれより多くのさらなる成分もしくは工程と一緒に提示されていようが、箇条書きにした成分または工程を包含すると理解され得る；そして（ｉｖ）用語「約」および「およそ」は、当業者によって理解されるとおりの標準的変動を許容すると理解され得る；そして（ｖ）範囲が提供される場合、端点は包含される。
およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）： 本明細書で使用される場合、用語「およそ」または「約」とは、目的の１もしくはこれより多くの値に適用されるように、述べられた参照値に類似である値に言及する。ある特定の実施形態において、用語「およそ」または「約」とは、別段述べられなければ、または状況から別段明らかでなければ（このような数が、考えられる値の１００％を超える場合は除く）、いずれの方向（大きいかまたは小さい）においても、その述べられた参照値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、もしくはこれより小さい範囲内に入る値の範囲に言及する。
と関連する（ａｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ）： ２つの事象または実体は、その用語が本明細書で使用される場合、一方の存在、レベルおよび／または形態が、他方の存在、レベルおよび／または形態と相関するのであれば、互いと「関連する」。例えば、特定の実体（例えば、ポリペプチド、遺伝的シグネチャー、代謝産物など）は、その存在、レベルおよび／または形態が、特定の疾患、障害、または状態の発生率および／または感受性と（例えば、直接関連する集団にわたって）相関するのであれば、上記疾患、障害、または状態と関連すると考えられる。いくつかの実施形態において、２もしくはこれより多くの実体は、それらが互いと物理的に近接してあるおよび／または近接したままであるように、直接的にまたは間接的にそれらが相互作用するのであれば、互いと物理的に「関連する」。いくつかの実施形態において、互いと物理的に関連する２もしくはこれより多くの実体は、互いと共有結合している；いくつかの実施形態において、互いと物理的に関連する２もしくはこれより多くの実体は、互いに共有結合していないが、例えば、水素結合、ファン・デル・ワールス相互作用、疎水的相互作用、磁性、およびこれらの組み合わせによって、非共有結合している。
バーコード（ｂａｒｃｏｄｅ）：本明細書で使用される場合、用語「バーコード」は、（例えば、核酸シークエンシング分析によって）分析されるべきサンプルに混合および／または添加された場合に、機械読み取り可能な識別子として働く特定の核酸分子または配列を表すことが意味される。いくつかの実施形態において、バーコードは、特定のサンプルの存在および／または非存在を同定、追跡および／または確認するために使用される。
生物学的サンプル（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ）： 本明細書で使用される場合、用語「生物学的サンプル」とは、代表的には、本明細書で記載されるように、目的の生物学的供給源（例えば、組織または生物または細胞培養物）から得られるかまたはこれらに由来するサンプルをいう。いくつかの実施形態において、目的の供給源は、生物（例えば、動物またはヒト）を含むかまたはその生物からなる。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、生物学的組織もしくは流体を含むか、または生物学的組織もしくは流体からなる。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、骨髄；血液；血球；腹水；組織または細針生検サンプル；細胞含有体液；浮遊性（ｆｒｅｅ ｆｌｏａｔｉｎｇ）核酸；喀痰；唾液；尿；脳脊髄液、腹膜内液（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｆｌｕｉｄ）；胸膜液；糞便；リンパ液；婦人科学的な流体；皮膚スワブ；膣スワブ；口腔スワブ；鼻腔スワブ；洗浄物（ｗａｓｈｉｎｇｓ）または洗浄液（ｌａｖａｇｅｓ）（例えば、導管洗浄液もしくは気管支肺胞洗浄液）；吸引物；擦過物；骨髄標本；組織生検標本；摘出標本（ｓｕｒｇｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎ）；他の体液、標本、および／または排出物；ならびに／あるいはこれらに由来する細胞などであり得るか、またはこれらを含み得る。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、個体から得られる細胞であるか、上記細胞を含むか、または上記細胞からなる。いくつかの実施形態において、得られる細胞は、サンプルが得られる個体に由来する細胞であるかまたはその細胞を含む。いくつかの実施形態において、サンプルは、任意の適切な手段によって目的の供給源から直接得られる「一次サンプル」である。例えば、いくつかの実施形態において、生物学的一次サンプルは、生検（例えば、細針吸引または組織生検）、外科手術、体液（例えば、血液、リンパ液、糞便など）の収集などからなる群より選択される方法によって得られる。いくつかの実施形態において、状況から明らかであるように、用語「サンプル」とは、一次サンプルを処理することによって（例えば、１もしくはこれより多くの成分の除去によって、および／または１もしくはこれより多くの薬剤の添加によって）得られる調製物をいう。例えば、半透膜を使用して濾過する。このような「加工処理されたサンプル」は、例えば、サンプルから抽出されたか、あるいはｍＲＮＡの増幅もしくは逆転写、ある特定の成分の単離および／または精製などのような技術に一次サンプルを供することによって得られる核酸またはタンパク質を含み得る。
キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）： 本明細書で使用される場合、用語「キャリア」とは、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルであって、これらとともにある組成物が投与されるものをいう。いくつかの例示的実施形態において、キャリアとしては、例えば、水および油（石油、動物、植物または合成期限の油（例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、ミネラルオイル、ゴマ油などのような））のような滅菌液体が挙げられ得る。いくつかの実施形態において、キャリアは、１もしくはこれより多くの固体成分であるかまたはその固体成分を含む。
細胞性溶解物（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｙｓａｔｅ）： 本明細書で使用される場合、用語「細胞性溶解物」または「細胞溶解物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）」とは、１もしくはこれより多くの崩壊させた細胞（すなわち、膜を崩壊させた細胞）の内容物を含む流体をいう。いくつかの実施形態において、細胞性溶解物は、親水性および疎水性両方の細胞性成分を含む。いくつかの実施形態において、細胞性溶解物は、植物細胞、微生物（例えば、細菌もしくは真菌）細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、ヒト細胞、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１もしくはこれより多くの細胞の溶解物である。いくつかの実施形態において、細胞性溶解物は、１もしくはこれより多くの異常な細胞（例えば、がん細胞）の溶解物である。いくつかの実施形態において、細胞性溶解物は、細胞の崩壊（これは、「一次」溶解物を生成する）後に、ほとんどもしくは全く精製が行われないという点で粗製溶解物である。いくつかの実施形態において、１もしくはこれより多くの単離もしくは精製工程が、上記一次溶解物に対して行われる。しかし、用語「溶解物」は、複数の細胞性成分を含む調製物に言及し、いかなる個々の成分の純粋な調製物にも言及しない。
特徴的得配列（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）： 「特徴的配列」は、ポリペプチドまたは核酸のファミリーの全てのメンバーにおいて見出される配列であり、従って、そのファミリーのメンバーを規定するために当業者によって使用され得る。
特徴的配列エレメント（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）： 本明細書で使用される場合、語句「特徴的配列エレメント」とは、ポリマー中で（例えば、ポリペプチドまたは核酸中で）見出される、そのポリマーの特徴的部分を表す配列エレメントをいう。いくつかの実施形態において、特徴的配列エレメントの存在は、そのポリマーの特定の活性または特性の存在またはレベルと相関する。いくつかの実施形態において、特徴的配列エレメントの存在（または非存在）は、特定のポリマーの特定のファミリーまたは群のメンバー（またはメンバーではない）としてそのような特定のポリマーを規定する。特徴的配列エレメントは、代表的には、少なくとも２つのモノマー（例えば、アミノ酸またはヌクレオチド）を含むか、またはこれらからなる。いくつかの実施形態において、特徴的配列エレメントは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、もしくはこれより多くのモノマー（例えば、連続して連結されたモノマー）を含む。いくつかの実施形態において、特徴的配列エレメントは、１もしくはこれより多くのスペーサー領域（その長さは、上記配列エレメントを共有するポリマーにわたって変動してもよいし、変動しなくてもよい）によって間隔を空けられた、連続モノマーの少なくとも第１のおよび第２の伸長部（ｓｔｒｅｔｃｈ）を含む。
適合性の（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）： 用語「適合性の」とは、適合性プライマーの状況において本明細書で使用される場合、例えば、プライマーダイマーの形成またはゲノムＤＮＡ配列もしくはサンプルＤＮＡ配列への結合を含む、有害な効果なしに同じ反応において使用され得る、ある反応内の例えば２つのプライマーの特徴をいう。適合性のプライマーは、例えば、％ＧＣ含有量、融解温度および結合特異性を含む類似の特徴を有し得る。その結果それらは、互いに対してより、意図した標的に結合する可能性がより高い。
含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）： １もしくはこれより多くの指定されたエレメントまたは工程を「含む」と本明細書で記載される組成物または方法は、開放系であって、その指定されたエレメントまたは工程が必須であるが、他のエレメントまたは工程が、その組成物または方法の範囲内に付加され得ることを意味する。１もしくはこれより多くの指定されたエレメントまたは工程を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（または「含む（ｗｈｉｃｈ ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）と記載される組成物または方法がまた、その相当する、同じ指定されたエレメントもしくは工程「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」（または「から本質的になる（ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」）より限定された組成物または方法を記載し、その組成物または方法がその指定された本質的なエレメントもしくは工程を含み、そしてまた、その組成物または方法の基本的かつ新規な特徴に本質的に影響を及ぼさないさらなるエレメントもしくは工程を含み得ることを意味することは、理解されるべきである。もしくはこれより多くの指定されたエレメントまたは工程を「含む」かまたはこれら「から本質的になる」と本明細書で記載される任意の組成物または方法はまた、その相当する、その指定されたエレメントまたは工程「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」（または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」、いかなる他の指定されていないエレメントまたは工程の排除へとより限定されかつ閉鎖系の組成物または方法を記載することはまた、理解される。本明細書で開示される任意の組成物または方法において、任意の指定された本質的なエレメントまたは工程の、公知のまたは開示された均等物は、そのエレメントまたは工程の代わりに使用され得る。
コンカテマー（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒ）：本明細書で使用される場合、用語「コンカテマー」とは、核酸配列を有する連続する核酸分子であって、核酸配列自体が、互いに連続して連結した複数の配列エレメントを含むかまたはこれらからなる核酸配列の反復を含むかまたはその反復からなるものをいう。いくつかの実施形態において、コンカテマーは、ゲノム全体のコピーを含む。いくつかの実施形態において、コンカテマーは、ゲノムの一部を含む。いくつかの実施形態において、コンカテマーは、１もしくはこれより多くの遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、コンカテマーは、合成して生成されたヌクレオチドの１もしくはこれより多くの群を含む。いくつかの実施形態において、その連結された一連の配列エレメントは、例えば、各反復の間の短いヌクレオチド配列によって分離される。例えば、配列エレメントＡ、Ｂ、およびＣの「コンカテマー」は、ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣまたはＡＣＢＡＣＢＡＣＢＡＣＢまたはＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡまたはＢＡＣＢＡＣＢＡＣＢＡＣまたはＣＡＢＣＡＢＣＡＢまたはＣＢＡＣＢＡＣＢＡまたはＡＡＢＣＡＡＢＣＡＡＢＣなどによって表される配列を有し得る。
縮重オリゴヌクレオチド（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）： 本明細書で使用される場合、語句「縮重オリゴヌクレオチド」とは、いくつかの実施形態において、合成の間の特定のオリゴヌクレオチド位置において全４個の塩基（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣ）の組み込みを可能にする方法で合成されるオリゴヌクレオチドの混合物をいう。例えば、ＡＣＧＣＧＡＣＧＮＮＮＮＮＮＴＧＧＧＡＣＧＡは、縮重配列／縮重オリゴヌクレオチド（ここで「Ｎ」は、縮重ヌクレオチドを表す）である。例示された配列を伴うオリゴヌクレオチド合成は、６個の連続的縮重ヌクレオチドの存在および４種の異なる塩基（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣ）の使用に起因して、４６ オリゴヌクレオチドを生じる。
設計された（ｄｅｓｉｇｎｅｄ）：本明細書で使用される場合、用語「設計された」とは、（ｉ）その構造がひとの手によって選択されているかもしくは選択された薬剤；（ｉｉ）ひとの手を要するプロセスによって生成される薬剤；および／または（ｉｉｉ）天然の物質および他の公知の薬剤とは別個のものである薬剤に言及する。
決定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ）： 当業者は、本明細書を読んで、「決定すること」が、当業者に利用可能な種々の技術のうちのいずれか（例えば、本明細書で明示的に言及される具体的技術が挙げられる）を利用し得るかまたはその技術を使用することによって達成され得ることを認識する。いくつかの実施形態において、決定することは、物理的サンプルの操作を要する。いくつかの実施形態において、決定することは、例えば、直接関連する分析を行うために適合されたコンピューターもしくは他の処理装置を利用する、データまたは情報の考慮および／または操作を要する。いくつかの実施形態において、決定することは、ある情報源から直接関連する情報および／または資料を受け取ることを要する。いくつかの実施形態において、決定することは、サンプルまたは実体の１もしくはこれより多くの特徴を、比較参照に対して比較することを要する。
診断情報（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）： 本明細書で使用される場合、「診断情報」または「診断において使用するための情報」は、患者が疾患、障害もしくは状態を有するか否かを決定することにおいて、および／あるいはある疾患、障害もしくは状態を、表現型的カテゴリーもしくはある疾患、障害もしくは状態の予後、またはおそらくある疾患、障害もしくは状態の処置（一般的な処置もしくは任意の特定の処置のいずれか）に対する応答に関して重大性を有する任意のカテゴリーへと分類することにおいて、有用である情報である。同様に、「診断」とは、診断情報の任意のタイプ（被験体が疾患、障害もしくは状態をおそらく有するかまたは発症するか否か、被験体に現れているとおりの疾患、障害もしくは状態の状態、ステージ決定または特徴、腫瘍の性質もしくは分類に関連する情報、適切な処置を選択することにおいて有用な予後および／もしくは情報に関連する情報が挙げられるが、これらに限定されない）を提供することをいう。処置の選択としては、特定の治療剤または他の処置モダリティー（例えば、外科手術、放射線療法など）の選択、治療を差し控えるかもしくは行うかについての選択、投与レジメン（例えば、特定の治療剤または治療剤の組み合わせの１もしくはこれより多くの用量の頻度またはレベル）に関する選択などが挙げられ得る。
ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）： 用語「ドメイン」とは、実体の区分もしくは一部に言及するために本明細書で使用される。いくつかの実施形態において、「ドメイン」は、その実体の特定の構造的および／または機能的特徴と関連し、その結果、そのドメインは、その親実体の残りから物理的に分離される場合に、そのドメインがその特定の構造的および／または機能的特徴を実質的にまたは完全に保持している。代わりにまたはさらに、ドメインは、その（親）実体から分離されかつ異なる（レシピエント）実体と関連付けられる場合に、その親実体においてそのドメインを特徴付けた１もしくはこれより多くの構造的および／または機能的特徴を実質的に保持するおよび／またはそのレシピエント実体に付与する、実体の一部であり得るかまたはその実体の一部を含み得る。いくつかの実施形態において、ドメインは、分子構造（例えば、低分子、炭水化物、脂質、核酸、またはポリペプチド）の区分または一部である。いくつかの実施形態において、ドメインは、ポリペプチドの区分である；いくつかのこのような実施形態において、ドメインは、特定の構造的エレメント（例えば、特定のアミノ酸配列もしくは配列モチーフ、αヘリックス特徴、βシート特徴、コイルドコイル特徴、ランダムコイル特徴など）によって、および／または特定の機能的特徴（例えば、結合活性、酵素活性、折りたたみ活性、シグナル伝達活性など）によって特徴付けられる。
編集距離（ｅｄｉｔ ｄｉｓｔａｎｃｅ）： 本明細書で使用される場合、語句「編集距離」とは、例えば、一連の核酸、核酸分子またはタグ（タグが本明細書で記載される場合）が、別の一連の核酸、核酸分子またはタグとは異なる核酸の数を表し、そして１つのタグが別のタグとして誤って同定されることが起こる必要がある置換、挿入、欠失もしくは他の変化の数をいう（例えば、２個の核酸分子、例えば、タグ１およびタグ２に関しては、８個の核酸の編集距離で、タグ１の配列の中に７個の変形事象がある必要があり、ここでこのような変形事象は、タグ１がタグ２として同定されるように、タグ１をタグ２により類似であるようにする）。いくつかの実施形態において、編集距離は、Ｌｅｖｅｎｓｈｔｅｉｎ， Ｖｌａｄｉｍｉｒ Ｉ． （Ｆｅｂｒｕａｒｙ １９６６）． 「Ｂｉｎａｒｙ ｃｏｄｅｓ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｃｏｒｒｅｃｔｉｎｇ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ， ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ， ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓａｌｓ」．Ｓｏｖｉｅｔ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｄｏｋｌａｄｙ １０（８）： ７０７－７１０にあるとおりの「レーベンシュタイン距離」と交換可能に使用され得る。
発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）： 本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」とは、以下の事象のうちの１もしくはこれより多くをいう：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡテンプレートの生成（例えば、転写によって）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、および／または３’末端形成によって）；（３）ポリペプチドもしくはタンパク質へのＲＮＡの翻訳；および／または（４）ポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾。
フラグメント： 本明細書で記載されるとおりの物質もしくは実体の「フラグメント」とは、全体の不連続部分を含む構造を有するが、全体において見出される１もしくはこれより多くの部分を欠いている。いくつかの実施形態において、フラグメントは、このような不連続部分からなる。いくつかの実施形態において、フラグメントは、全体において見出される特徴的な構造的エレメントもしくは部分からなるかまたはこれら構造的エレメントもしくは部分を含む。いくつかの実施形態において、ポリマーフラグメントは、全体のポリマーで見出されるとおりの少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２１０個、２２０個、２３０個、２４０個、２５０個、２７５個、３００個、３２５個、３５０個、３７５個、４００個、４２５個、４５０個、４７５個、５００個もしくはこれより多くのモノマー単位（例えば、残基）を含むかまたはこれらのモノマー単位からなる。いくつかの実施形態において、ポリマーフラグメントは、全体のポリマーで見出されるこのマー単位（例えば、残基）のうちの少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、２５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはこれより多くを含むかまたはこれらからなる。全体の物質または実体は、いくつかの実施形態において、全体の「親」といわれ得る。
遺伝子（ｇｅｎｅ）： 本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」とは、生成物（例えば、ＲＮＡ生成物および／またはポリペプチド生成物）をコードする染色体中のＤＮＡ配列をいう。いくつかの実施形態において、遺伝子は、コード配列（すなわち、特定の生成物をコードする配列）を含む；いくつかの実施形態において、遺伝子は、非コード配列を含む。いくつかの特定の実施形態において、遺伝子は、コード（例えば、エキソン）配列および非コード（例えば、イントロン）配列の両方を含み得る。いくつかの実施形態において、遺伝子は、例えば、遺伝子発現の１もしくはこれより多くの局面（例えば、細胞タイプ特異的発現、誘導可能な発現など）を制御し得るかまたはこれら局面に影響を及ぼし得る１もしくはこれより多くの調節エレメントを含み得る。
遺伝子生成物または発現生成物（ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ）： 本明細書で使用される場合、用語「遺伝子生成物」または「発現生成物」とは、一般に、遺伝子から転写されるＲＮＡ（プロセシング前および／またはプロセシング後）またはその遺伝子から転写されたＲＮＡによってコードされるポリペプチド（修飾前および／または修飾後）をいう。
ゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）： 本明細書で使用される場合、用語「ゲノム」とは、個々の生物または細胞によって行われ、その染色体の完全ＤＮＡ配列によって表される全遺伝情報をいう。
ゲノムプロフィール（ｇｅｎｏｍｅ ｐｒｏｆｉｌｅ）： 本明細書で使用される場合、用語「ゲノムプロフィール」とは、ゲノム内に含まれる全情報の代表的な部分セットをいう。代表的には、ゲノムプロフィールは、多型遺伝子座の特定のセットにある遺伝子型を含む。いくつかの実施形態において、ゲノムプロフィールは、例えば、特定の動物、系統、品種、または雑種の集団に特徴的な特定の特徴、形質、もしくはそのセットと相関し得る。
ゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）： 本明細書で使用される場合、語句「ゲノムＤＮＡ」とは、生物のゲノム内に含まれる全遺伝情報の少なくとも約１コピーを表すＤＮＡをいう。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡは、染色体から抽出される。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡは、例えば、ＰＣＲ増幅および／またはシークエンシング分析などのために使用され得る染色体外ゲノムＤＮＡである。
遺伝子タイプ（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）： 本明細書で使用される場合、用語「遺伝子タイプ」とは、所定の細胞もしくは生物での所定の遺伝子座または関連遺伝子座のセットにおける対立遺伝子の二倍体組み合わせをいう。ホモ接合性被験体は、同じ対立遺伝子の２コピーを有し、ヘテロ接合性被験体は、２つの異なる対立遺伝子を有する。２つの対立遺伝子「Ａ」および「ａ」を有する遺伝子座という最も単純な場合では、３つの遺伝子型が形成され得る：Ａ／Ａ、Ａ／ａ、およびａ／ａ。
遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）： 本明細書で使用される場合、用語「遺伝子型決定」とは、１もしくはこれより多くの十分に規定された遺伝子座において個体の遺伝子型を区別するための実験プロトコル、計算プロトコルまたは実測プロトコルに言及する。当業者は、遺伝子型決定を有用にかつ有効に行い得る種々の技術を知っている。いくつかの実施形態において、遺伝子型決定は、核酸または核酸配列の直接的検出を要する。いくつかの実施形態において、遺伝子型決定は、例えば、核酸もしくは核酸配列の存在と相関する代用マーカーまたは事象の検出または分析を介して、その核酸もしくは核酸配列の間接的検出を要する。
高分子量ＤＮＡ（ｈｉｇｈ－ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ＤＮＡ）： 本明細書で使用される場合、語句「高分子量ＤＮＡとは、とりわけ、処理全体を通じてゲノムＤＮＡと一緒に容易に移動する、および／または一緒に共精製してくるＤＮＡをいう。高分子量ＤＮＡは、代表的には、短い（５キロベースもしくはこれより小さい）ＰＣＲ生成物または消化された／切断されたＤＮＡを遺伝子型決定するかまたは分析するために使用される標準、例えば、アガロースゲル（例えば、１～２％ アガロース）を通じて移動しない。いくつかの実施形態において、高分子量ＤＮＡは、ＰＣＲ生成物が代表的には高分子量ではなくかつ構造的に異なり得るという点で、ＰＣＲ生成物とは異なる。いくつかの実施形態において、高分子量ＤＮＡは、少なくとも約４００ベース（ｂａｓｅ）、少なくとも約５００ベース、少なくとも約６００ベース、少なくとも約７００ベース、少なくとも約８００ベース、少なくとも約９００ベース、少なくとも約１キロベース、少なくとも約２キロベース、少なくとも約３キロベース、少なくとも約４キロベース、少なくとも約５キロベース、少なくとも約６キロベース、少なくとも約７キロベース、少なくとも約８キロベース、少なくとも約９キロベース、少なくとも約１０キロベース、少なくとも約１１キロベース、少なくとも約１２キロベース、少なくとも約１３キロベース、少なくとも約１４キロベース、少なくとも約１５キロベース、少なくとも約１６キロベース、少なくとも約１７キロベース、少なくとも約１８キロベース、少なくとも約１９キロベース、少なくとも約２０キロベース、少なくとも約３０キロベース、少なくとも約４０キロベース、少なくとも約５０キロベース、少なくとも約６０キロベース、少なくとも約７０キロベース、少なくとも約８０キロベース、少なくとも約９０キロベース、少なくとも約１００キロベースまたは１００キロベースよりも多くを含むかまたはそれからなる。
相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）： 本明細書で使用される場合、用語「相同性」とは、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間、および／またはポリペプチド分子間の全体の関連性をいう。いくつかの実施形態において、ポリマー分子は、これらの配列が、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である場合、互いに「相同」であると考えられる。いくつかの実施形態において、ポリマー分子は、これらの配列が、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％類似である（例えば、相当する位置に関連する化学特性を有する残基を含む）場合、互いに相同であると考えられる。当業者によって理解されるように、それらの相同性の程度を決定するために配列の比較を許容する（どの残基が異なる配列において互いに「相当する」かを考慮する場合に、一方の配列における指定された長さのギャップをもう一方に対して許容することによることを含む）種々のアルゴリズムが利用可能である。２つの核酸配列の間の％相同性の計算は、例えば、最適な比較目的でその２つの配列を整列させることによって行われ得る（例えば、ギャップは、最適なアラインメントのために第１のおよび第２の核酸配列のうちの一方または両方において導入され得、相当しない配列は、比較目的のために無視され得る）。ある特定の実施形態において、比較目的で整列される配列の長さは、参照配列の長さのうちの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または実質的に１００％である。次いで、相当するヌクレオチド位置でのヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置を、第２の配列中の相当する位置と同じヌクレオチドが占めている場合、その分子は、その位置で同一である；第１の配列中の位置を、第２の配列中の相当する位置と類似のヌクレオチドが占めている場合、その分子は、その位置で類似である。その２つの配列間の％相同性は、ギャップの数、および各ギャップの長さ（これは、その２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要がある）を考慮して、配列によって共有される同一および類似の位置の数の関数である。２つのヌクレオチド配列間の％相同性を決定するにあたって有用な、代表的なアルゴリズムおよびコンピュータープログラムとしては、例えば、ＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ， １９８９， ４： １１－１７）（これは、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、ギャップ長ペナルティー１２およびギャップペナルティー４を使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれた）が挙げられる。２つのヌクレオチド配列間の％相同性は、代わりに、例えば、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスを使用するＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを使用して、決定され得る。
同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）： 本明細書で使用される場合、用語「同一性」とは、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体の関連性をいう。いくつかの実施形態において、ポリマー分子は、これらの配列が、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である場合に、互いに対して「実質的に同一」であると考えられる。例えば、２つの核酸配列またはポリペプチド配列の％同一性の計算は、最適な比較目的でその２つの配列を整列させることによって行われ得る（例えば、ギャップは、最適なアラインメントのために第１のおよび第２の配列のうちの一方または両方において導入され得、同一でない配列は、比較目的のために無視され得る）。ある特定の実施形態において、比較目的で整列される配列の長さは、参照配列の長さのうちの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または実質的に１００％である。次いで、相当する位置でのヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置を、第２の配列中の相当する位置と同じ残基（例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸）が占めている場合、その分子は、その位置で同一である。その２つの配列間の％同一性は、ギャップの数、および各ギャップの長さ（これは、その２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要がある）を考慮して、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。配列の比較および２つの配列間の％同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。例えば、２つのヌクレオチド配列間の％同一性は、ＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ， １９８９， ４： １１－１７）（これは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれた）を使用して決定され得る。いくつかの例示的実施形態において、ＡＬＩＧＮプログラムで行われる核酸配列比較は、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、ギャップ長ペナルティー１２およびギャップペナルティー４を使用する。２つのヌクレオチド配列間の％同一性は、代わりに、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスを使用するＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを使用して、決定され得る。
単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）： 本明細書で使用される場合、用語「単離された」とは、（１）最初に生成されたときに関連付けられていた成分（天然にあろうと、および／または実験設定にあろうと）のうちの少なくともいくつかから分離、ならびに／あるいは（２）ひとの手によって設計、生成、調製、および／または製造、された物質および／または実体をいう。単離された物質および／または実体は、それらが最初に関連付けられていた他の成分のうちの約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９％より多くから分離され得る。いくつかの実施形態において、単離された薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％より高く純粋である。本明細書で使用される場合、物質は、他の成分を実質的に含まない場合に「純粋」である。いくつかの実施形態において、当業者によって理解されるように、物質は、ある特定の他の成分（例えば、１もしくはこれより多くのキャリアもしくは賦形剤（例えば、緩衝液、溶媒、水など）のような）と合わされた後に、なお「単離され」ているかまたはさらには「純粋」であると考えられ得る；このような実施形態において、その物質の％単離または純度は、このようなキャリアもしくは賦形剤を含めずに計算される。一例を挙げると、いくつかの実施形態において、生物学的ポリマー（例えば、天然に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド）は、ａ）その起源または由来の源のおかげで、天然においてその天然の状態でそのポリマーに付随する成分のうちのいくつかまたは全てと関連付けられていない；ｂ）天然においてそのポリマーを生成する種に由来する同じ種の他のポリペプチドまたは核酸を実質的に含まない；ｃ）天然においてそのポリマーを生成する種のものではない細胞または他の発現系に由来する成分によって発現されるかまたは別の方法でその成分と関連付けられている、場合に、「単離され」ていると考えられる。従って、例えば、いくつかの実施形態において、化学的に合成されるかまたは天然において核酸分子を生成する細胞系とは異なる細胞系において合成される核酸分子は、「単離された」核酸分子であると考えられる。代わりにまたはさらに、いくつかの実施形態において、１もしくはこれより多くの精製技術に供された核酸分子は、ａ）この核酸分子が天然に関連付けられている他の成分；および／またはｂ）最初に生成されたときにこの核酸分子が関連付けられている他の成分とは分離されている程度まで、「単離された」核酸分子であると考えられ得る。
リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）： 本明細書で使用される場合、用語「リンカー」とは、異なるエレメントを互いに連結するマルチエレメントポリペプチドのその部分をいうために使用される。例えば、当業者は、ポリペプチドの構造が２もしくはこれより多くの機能的または組織的ドメインを含むそのポリペプチドが、しばしば、それらエレメントを互いに連結するこのようなドメイン間のアミノ酸の伸長部を含むことを理解する。いくつかの実施形態において、リンカーエレメントを含むポリペプチドは、一般形態Ｓ１－Ｌ－Ｓ２（ここでＳ１およびＳ２は、同じであっても異なっていてもよく、そのリンカーによって互いと関連付けられた２つのドメインを表す）の全体構造を有する。いくつかの実施形態において、リンカーは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個もしくはこれより多くのアミノ酸の長さである。いくつかの実施形態において、リンカーは、剛性の三次元構造をとらない傾向にあるが、むしろポリペプチドに可撓性を提供するという点で特徴付けられる。種々の異なるリンカーエレメントは、当該分野で公知のポリペプチドを操作する場合に適切に使用され得る（例えば、融合ポリペプチド）（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ， Ｐ．ら （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８； Ｐｏｌｊａｋ， Ｒ． Ｊ．ら （１９９４） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２： １ １２１－１１２３を参照のこと）．
核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）： 本明細書で使用される場合、用語「核酸」とは、その最も広い意味において、オリゴヌクレオチド鎖へと組みこまれるかまたは組み込まれ得る任意の化合物および／または物質をいう。いくつかの実施形態において、核酸は、ホスホジエステル結合を介してオリゴヌクレオチド鎖へと組みこまれるかまたは組み込まれ得る化合物および／または物質である。状況から明らかであるように、いくつかの実施形態において、「核酸」とは、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）をいう；いくつかの実施形態において、「核酸」とは、個々の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖をいう。いくつかの実施形態において、「核酸」は、ＲＮＡであるかまたはＲＮＡを含む；いくつかの実施形態において、「核酸」は、ＤＮＡであるかまたはＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、核酸は、１もしくはこれより多くの天然の核酸残基であるか、これら核酸残基を含むか、またはこれら核酸残基からなる。いくつかの実施形態において、核酸は、１もしくはこれより多くの核酸アナログであるか、それら核酸アナログを含むか、またはそれら核酸アナログからなる。いくつかの実施形態において、核酸アナログは、ホスホジエステル骨格を利用しないという点で、核酸とは異なる。例えば、いくつかの実施形態において、核酸は、１もしくはこれより多くの「ペプチド核酸」であるか、これらペプチド核酸を含むか、またはこれらペプチド核酸からなる。これらペプチド核酸は当該分野で公知であり、その骨格の中にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有し、本発明の範囲内であると考えられる。代わりにまたはさらに、いくつかの実施形態において、核酸は、ホスホジエステル結合よりむしろ、１もしくはこれより多くのホスホロチオエートおよび／または５’－Ｎ－ホスホルアミダイト連結を有する。いくつかの実施形態において、核酸は、１もしくはこれより多くの天然のヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）であるか、これらヌクレオシドを含むか、またはこれらヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態において、核酸は、１もしくはこれより多くのヌクレオシドアナログ（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５ プロピニル－シチジン、Ｃ－５ プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、０（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、メチル化塩基、インターカレートされた塩基（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ ｂａｓｅ）、およびこれらの組み合わせ）であるか、これらヌクレオシドアナログを含むか、またはこれらヌクレオシドアナログからなる。いくつかの実施形態において、核酸は、天然の核酸の中にあるものと比較した場合、１もしくはこれより多くの改変糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、ＲＮＡまたはタンパク質のような機能的遺伝子生成物をコードするヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態において、核酸は、１もしくはこれより多くのイントロンを含む。いくつかの実施形態において、核酸は、天然供給源からの単離、相補的テンプレートに基づく重合による酵素的合成（インビボまたはインビトロ）、組換え細胞もしくは系における再現、および化学合成のうちの１もしくはこれより多くによって調製される。いくつかの実施形態において、核酸は、少なくとも、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００またはより多くの残基の長さである。いくつかの実施形態において、核酸は、１本鎖である；いくつかの実施形態において、核酸は、２本鎖である。いくつかの実施形態において、核酸は、ポリペプチドをコードするか、またはそのポリペプチドをコードする配列の相補体である少なくとも１つのエレメントを含むヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態において、核酸は、酵素活性を有する。
主に存在する（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｐｒｅｓｅｎｔ）： 用語「主に存在する」とは、本明細書で使用される場合、ある集団にわたる特定の位置での実体（例えば、アミノ酸残基）の存在をいう。例えば、アミノ酸は、ポリペプチドの集団にわたって、特定のアミノ酸が統計的に、直接関連する集団内でそのポリペプチドのうちの少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくはこれより多く、特定の位置に存在する場合に主に存在し得る。
プライマーランディングパッド（ｐｒｉｍｅｒ ｌａｎｄｉｎｇ ｐａｄ）： 本明細書で使用される場合、語句「プライマーランディングパッド」とは、核酸の伸長部（この伸長部に、核酸の相補的な伸長部（例えば、ＰＣＲ増幅反応をプライムするために使用されるオリゴヌクレオチド）が結合し得る）上のプライミング部位をいう。いくつかの実施形態において、このようなプライマーランディングパッドは、多重置換増幅反応をプライムするために適している。
純粋な（ｐｕｒｅ）： 本明細書で使用される場合、薬剤または実体は、他の成分を実質的に含まない場合に、「純粋」である。例えば、約９０％より多くの特定の薬剤もしくは実体を含む調製物は、代表的には、純粋な調製物であると考えられる。いくつかの実施形態において、薬剤または実体は、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％純粋である。
ランダム： 本明細書で使用される場合、用語「ランダム」とは、ＧＣ含有量、長さ、および任意の２つの配列の間の編集距離のような基準によってフィルタにかけられる、アルゴリズムでアセンブリされた配列（ａｌｇｏｒｉｔｈｍ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）または確率論的選択に基づく核酸の配置を生成するために使用されるアルゴリズムでアセンブリされた配列を生成するための方法に言及する。
参照（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）： 本明細書で使用される場合、用語「参照」とは、標準またはコントロール（これに対して比較が行われる）を記載する。例えば、いくつかの実施形態において、目的の薬剤、動物、個体、集団、サンプル、配列または値が、参照またはコントロールの薬剤、動物、個体、集団、サンプル、配列もしくは値と比較される。いくつかの実施形態において、参照またはコントロールは、目的の試験または決定と実質的に同時に試験および／または決定される。いくつかの実施形態において、参照またはコントロールは、歴史上の参照またはコントロールであり、これらは触知可能な媒体中に必要に応じて埋め込まれている。代表的には、当業者によって理解されるように、参照またはコントロールは、評価中のものに匹敵する条件または環境の下で決定または特徴付けられる。当業者は、どのような場合に、特定の考えられる参照またはコントロールへの依拠および／または比較を正当化するために十分な類似性が存在するかを理解する。
サンプル（ｓａｍｐｌｅ）： 本明細書で使用される場合、用語「サンプル」とは、定性的および定量的評価のための目的の組成物であるかまたはこの組成物を含む物質をいう。いくつかの実施形態において、サンプルは、生物学的サンプルである（すなわち、生きているもの（例えば、細胞または生物）に由来する）。いくつかの実施形態において、サンプルは、地質学的な、水生の、天文学的な、または農業的な供給源に由来する。いくつかの実施形態において、目的の供給源は、生物（例えば、動物またはヒト）を含むか、またはこの生物からなる。いくつかの実施形態において、法科学分析のためのサンプルは、生物学的組織、生物学的流体、有機物質または非有機物質（例えば、衣類、汚物、プラスチック、水のような）であるかまたはそれらを含む。いくつかの実施形態において、農業的サンプルは、有機物質（例えば、葉、花弁、樹皮、木、種子、植物、果実など）を含むかまたはこの有機物質からなる。
一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）： 本明細書で使用される場合、用語「一ヌクレオチド多型」または「ＳＮＰ」とは、代替の塩基が一方の対立遺伝子をもう一方の対立遺伝子から区別することが公知である、ゲノム中の特定の塩基位置をいう。いくつかの実施形態において、１もしくは数個のＳＮＰｓおよび／またはＣＮＰｓは、分析目的で、ＳＮＰｓおよび／またはＣＮＰｓのうちの一方もしくはセットが、特定の改変体、形質、動物、系統、品種、雑種、またはこれらのセットに特徴的であると考えられ得るように、複雑な遺伝的改変体を互いから区別するために十分である。いくつかの実施形態において、ＳＮＰｓおよび／またはＣＮＰｓのうちの一方もしくはセットは、特定の改変体、形質、動物、系統、品種、雑種、またはこれらのセットを規定すると考えられ得る。
特異的（ｓｐｅｃｉｆｉｃ）： 用語「特異的」とは、活性を有する薬剤を参照して本明細書で使用される場合、その薬剤が潜在的な標的実体または状態の間を区別することを意味することが当業者によって理解される。例えば、いくつかの実施形態で、薬剤は、その標的が、１もしくはこれより多くの競合する代わりの標的の存在下でその標的と優先的に結合する場合に、その標的に「特異的に」結合するといわれる。多くの実施形態において、特異的相互作用は、標的実体の特定の構造的特徴（例えば、エピトープ、割れ目（ｃｌｅｆｔ）、結合部位）の存在に依存する。特異性は、絶対的である必要はないことは理解されるべきである。いくつかの実施形態において、特異性は、１もしくはこれより多くの他の潜在的標的実体（例えば、競合相手）に関する結合剤の特異性に対して評価され得る。いくつかの実施形態において、特異性は、参照特異的結合薬剤のものと比較して評価される。いくつかの実施形態において、特異性は、参照非特異的結合薬剤のものと比較して評価される。いくつかの実施形態において、上記薬剤または実体は、その標的実体への結合の条件下で、競合する代わりの標的には検出可能に結合しない。いくつかの実施形態において、結合薬剤は、その競合する代わりの標的と比較した場合に、その標的実体へのより高い結合速度（ｏｎ－ｒａｔｅ）、より低い解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）、増大した親和性、低下した解離、および／または増大した安定性で結合する。
実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）： 本明細書で使用される場合、用語「実質的に」とは、目的の特徴または特性の全体のまたはほぼ全体の範囲（ｅｘｔｅｎｔ）または程度（ｄｅｇｒｅｅ）を示す定性的条件に言及する。生物学分野の当業者は、生物学的および化学的現象が、あるとしても希に、完了するおよび／または完了に向かって進むか、あるいは絶対的な結果を達成するかまたは回避することを理解する。従って、用語「実質的に」とは、多くの生物学的および化学的現象に内在する完全性の潜在的な欠如を捕らえるために本明細書で使用される。
実質的同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）： 本明細書で使用される場合、語句「実質的同一性」とは、アミノ酸配列または核酸配列の間の比較に言及する。当業者によって認識されるように、２つの配列は一般に、これらが相当する位置において同一の残基を含む場合、「実質的に同一」であると考えられる。この分野で周知であるように、アミノ酸配列または核酸配列は、種々のアルゴリズム（市販のコンピュータープログラム（例えば、ヌクレオチド配列に関してはＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列に関してはＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ）の中で利用可能なものが挙げられる）のうちのいずれかを使用して比較され得る。例示的なこのようなプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５（３）： ４０３－４１０， １９９０； Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ； Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９－３４０２， １９９７； Ｂａｘｅｖａｎｉｓら， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｗｉｌｅｙ， １９９８；およびＭｉｓｅｎｅｒら， （編）， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １３２）， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， １９９９に記載される。同一の配列を同定することに加えて、上述のプログラムは、代表的には、同一性の程度の表示を提供する。いくつかの実施形態において、２つの配列は、これらの相当する残基のうちの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはこれより多くが、残基の直接関連する伸長部にわたって同一である場合に、実質的に同一であると考えられる。いくつかの実施形態において、その直接関連する伸長部は、完全な配列である。いくつかの実施形態において、その直接関連する伸長部は、少なくとも、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００またはより多くの残基である。
実質的配列相同性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）： 語句「実質的相同性」は、アミノ酸配列または核酸配列の間の比較に言及するために本明細書で使用される。当業者によって認識されるように、２つの配列は一般に、これらが相当する位置において相同な残基を含む場合に、「実質的に相同」であると考えられる。相同な残基は、同一な残基であってもよい。代わりに、相同な残基は、適切に類似の構造および／または機能的特徴を有する同一でない残基であってもよいこの分野で周知であるように、アミノ酸配列または核酸配列は、種々のアルゴリズム（市販のコンピュータープログラム（例えば、ヌクレオチド配列に関してはＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列に関してはＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ）の中で利用可能なものが挙げられる）のうちのいずれかを使用して比較され得る。例示的なこのようなプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５（３）： ４０３－４１０， １９９０； Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ； Ａｌｔｓｃｈｕｌら，「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ： ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９－３４０２， １９９７； Ｂａｘｅｖａｎｉｓら， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｗｉｌｅｙ， １９９８；およびＭｉｓｅｎｅｒら， （編）， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １３２）， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， １９９９に記載される。相同な配列を同定することに加えて、上述のプログラムは、代表的には、相同性の程度の表示を提供する。いくつかの実施形態において、２つの配列は、これらの相当する残基のうちの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはこれより多くが、残基の直接関連する伸長部にわたって相同である場合に、実質的に相同であると考えられる。いくつかの実施形態において、その直接関連する伸長部は、完全な配列である。いくつかの実施形態において、その直接関連する伸長部は、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７５、少なくとも５００またはより多くの残基である。
合成の（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）： 本明細書で使用される場合、文言「合成の」とは、ひとの手で、従って、天然では存在しない形態で生成されることを意味する。なぜならその形態は、天然に存在しない構造を有するか、またはその形態が天然では関連付けられていない１もしくはこれより多くの他の成分と関連付けられているか、またはその形態が天然では関連付けられている１もしくはこれより多くの他の成分と関連付けられていないかのいずれかであるからである。
可変の（ｖａｒｉａｂｌｅ）： 本明細書で使用される場合、用語「可変の」とは、例えば、ある領域が不変であるとは考えられないような特定のエレメントの間の差異をいう。例えば、ＡＢ式に従って配置された配列において、配列のセットが不変領域「Ａ」、および領域「Ｂ」においてそのセットの各メンバーにおいて異なる配列を有する場合、「Ｂ」の配列は、可変である。本明細書で使用される場合、可変のはまた、縮重オリゴヌクレオチド混合物の限界希釈を生じることによって、本発明のタグを設計するという概念に適用される。
改変体（ｖａｒｉａｎｔ）： 本明細書で使用される場合、用語「改変体」とは、参照実体と顕著な構造的同一性を示すが、その参照実体と比較した場合に、１もしくはこれより多くの化学的部分の存在またはレベルにおいてその参照実体とは構造的に異なる実体をいう。多くの実施形態において、改変体はまた、その参照実体とは機能的に異なる。一般に、特定の実体が参照実体の「改変体」であると適切に考えられているか否かは、その参照実体との構造的同一性の程度に基づいている。当業者によって認識されるように、任意の生物学的または化学的参照実体は、ある特定の特徴的構造エレメントを有する。改変体は、定義によって、１もしくはこれより多くのこのような特徴的構造エレメントを共有する別個の化学的実体である。いくつか例を挙げると、低分子は、特徴的なコア構造エレメント（例えば、マクロサイクルコア）および／または１もしくはこれより多くの特徴的なペンダント部分を有し得、その結果、その低分子の改変体は、そのコア構造エレメントをおよびその特徴的ペンダント部分を共有するが、他のペンダント部分においておよび／またはコア内に存在する結合のタイプ（単 対 二重、Ｅ 対 Ｚなど）において異なるものである。ポリペプチドは、直線状または三次元空間において互いに対して指定された位置を有するおよび／または特定の生物学的機能に寄与する複数のアミノ酸から構成される特徴的配列エレメントを有し得る。核酸は、直線状または三次元空間において互いに対して指定された位置を有する複数のヌクレオチド残基から構成される特徴的配列エレメントを有し得る。例えば、改変体ポリペプチドは、アミノ酸配列における１もしくはこれより多くの差異および／またはポリペプチド骨格に共有結合した化学的部分（例えば、炭水化物、脂質など）における１もしくはこれより多くの差異の結果として、参照ポリペプチドとは異なり得る。いくつかの実施形態において、改変体ポリペプチドは、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％である参照ポリペプチドとの全体の配列同一性を示す。代わりにまたはさらに、いくつかの実施形態において、改変体ポリペプチドは、参照ポリペプチドと少なくとも１個の特徴的配列エレメントを共有しない。いくつかの実施形態において、その参照ポリペプチドは、１もしくはこれより多くの生物学的活性を有する。いくつかの実施形態において、改変体ポリペプチドは、その参照ポリペプチドの生物学的活性のうちの１もしくはこれより多くを共有する。いくつかの実施形態において、改変体ポリペプチドは、その参照ポリペプチドの生物学的活性のうちの１もしくはこれより多くを欠いている。いくつかの実施形態において、改変体ポリペプチドは、その参照ポリペプチドと比較した場合に、１もしくはこれより多くの生物学的活性の低下したレベルを示す。多くの実施形態において、目的のポリペプチドは、この目的のポリペプチドが、特定の位置における小数の配列変化を除いて、親ポリペプチドのものに同一であるアミノ酸配列を有する場合に、親または参照ポリペプチドの「改変体」であると考えられる。代表的には、その改変体における残基のうちの２０％未満、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％が、その親と比較した場合に置換される。いくつかの実施形態において、改変体は、親と比較した場合に、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、もしくは１個の置換された残基を有する。しばしば、改変体は、非常に少数（例えば、５個未満、４個、３個、２個、もしくは１個）の置換された機能的残基（すなわち、特定の生物学的活性に関与する残基）を有する。さらに、改変体は、その親と比較した場合に、代表的には、５個以下、４個、３個、２個、もしくは１個の付加または欠失を有し、しばしば、付加または欠失を有しない。さらに、任意の付加または欠失は、代表的には、約２５個未満、約２０個、約１９個、約１８個、約１７個、約１６個、約１５個、約１４個、約１３個、約１０個、約９個、約８個、約７個、約６個であり、一般には、約５個未満、約４個、約３個、もしくは約２個の残基である。いくつかの実施形態において、改変体はまた、１もしくはこれより多くの機能的欠陥を有し得る、および／またはさもなければ「変異体」と考えられ得る。いくつかの実施形態において、その親または参照ポリペプチドは、天然に見出されるものである。当業者によって理解されるように、目的の特定のポリペプチドの複数の改変体は、天然において、特に、その目的のポリペプチドが感染性因子のポリペプチドである場合に、一般に見出され得る。
ある特定の実施形態の詳細な説明
本出願は、とりわけ、タグを提供する。一局面において、タグは、サンプルを同定する、サンプルを追跡する、サンプルを分析するなど、およびこれらの組み合わせのために有用である。
本出願は、とりわけ、タグを提供する。一局面において、タグは、サンプルを同定する、サンプルを追跡する、サンプルを分析するなど、およびこれらの組み合わせのために有用である。
図１を参照すると、本開示に従う方法１００の実施形態は、同定、追跡、分析などのためにサンプルと合わせられ得る高分子量ＤＮＡタグの使用を含む。方法１００の工程１０２は、サンプルを収集する工程を包含する。一局面において、その１もしくはこれより多くのサンプルは、分析されるべき核酸を含み得る。よって、そのサンプルは、核酸を含む任意の適切な供給源から収集され得る。サンプルが収集され得る一例の供給源としては、１もしくはこれより多くのヒト、植物または動物被験体が挙げられ得るが、他の供給源は、本明細書で記載されるように適切であり得る。方法１００の工程１０４において、そのサンプルは、本開示のタグと合わせられる。一般に、各サンプルは、そのサンプルを下流の分析の間に互いから区別するために、特有のタグ配列と合わせられ得る。方法１００に関しては、タグは、このタグの核酸配列が、方法１００において使用されるタグとは、少なくとも１ヌクレオチド程度互いに異なる場合に、特有と考えられる。
図１を続けて参照すると、工程１０６は、ＤＮＡおよび必要に応じて他の核酸を、タグを含むサンプルから抽出する工程を包含する。ＤＮＡ抽出は、ｉ）サンプルに由来する核酸、およびｉｉ）タグＤＮＡの組み合わせを生じる。工程１０８において、その抽出されたＤＮＡは、任意の適切な技術（例えば、剪断、酵素によるフラグメント化、超音波処理など）を使用してフラグメント化される。工程１１０において、種々の選択肢的工程が、シークエンシングまたは他の下流の分析のためのＤＮＡサンプルをさらに調製するために行われ得る。例えば、そのフラグメント化したＤＮＡの末端は、修復され得、Ａテール付加は、Ｔ－Ａベースのアダプターライゲーションなどのために行われ得、そしてアダプターは、連結され得るかまたは別の方法でそのフラグメント化したＤＮＡに付加される。ＤＮＡフラグメントサイズ選択およびその調製したＤＮＡライブラリーの品質管理試験のようなさらなる操作は、工程１１２において行われ得る。
方法１００の次の工程１１４において、そのタグＤＮＡを含む調製したサンプルは、シークエンシングまたは他の下流の分析のために一緒にプールされ得る（すなわち、複合される）。その後、工程１１４において獲得されたデータは、工程１１６において脱複合化（ｄｅ－ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ）されかつ分析され得る。
本開示の方法のある特定の実施形態において、本開示の高分子量ＤＮＡタグは、収集直後に、１もしくはこれより多くのサンプルと合わせられ得る（例えば、図１を参照のこと）。さらに、本開示の高分子量ＤＮＡタグは、サンプル自体を分析するために使用されるタグの処理または検出のためのさらなるまたは別個の工程以外のそれら工程の必要性なく、そのサンプル配列（例えば、サンプル内のゲノムＤＮＡ配列）とともに処理され得る。従って、ポリペプチドタグまたは視覚的に検出可能な標識もしくは抗体に特異的に結合する標識を一般に含むタグ（これは、ＤＮＡシークエンシング以外の手段によって検出されることを意味する）とは異なり、本開示の高分子量ＤＮＡタグは、他の技術では一般に必要とされるタグ自体を処理または検出する工程を排除すると同時に、複数のサンプル（複数とは、別個のサンプル間で１、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、または任意の整数を含むかまたはその整数からなる）を含むハイスループット反応内で各サンプルを明白に同定するという同じ結果を提供する。各別個のサンプルは、各サンプルに関する識別コードを提供する１種もしくはこれより多くのタグを含み得る。そのサンプル内の任意の所定のサンプルに関して指定されたコードに属しない任意のタグの同定は、汚染を示す。各コードが各サンプルに特有であるので、その汚染源は、汚染タグが一旦同定された後に直ぐに知られる。ハイスループット適用のために、特有の配列を有すると同時に、サンプル（ＤＮＡポリマー）と同じ物質から構成されるタグを使用すると、サンプル配列の同定、追跡、分析などのために有意に増大した効率が可能になる。
サンプル
いくつかの実施形態において、本発明に従って分析されるべきサンプル（例えば、このサンプルに１種もしくはこれより多くのタグが付加され得る）は、核酸を含む。いくつかの実施形態において、サンプルは、核酸配列分析に反応しやすいという点で特徴付けられる。例えば、いくつかの実施形態において、サンプルは、核酸シークエンシング酵素または試薬の１もしくはこれより多くの特定のインヒビターを実質的に含まない可能性がある。いくつかの実施形態において、サンプルは、このような分析が成功裡に行われ得る分析されるべき核酸に関して、十分に純粋であり得る。
いくつかの実施形態において、本発明に従って分析されるべきサンプル（例えば、このサンプルに１種もしくはこれより多くのタグが付加され得る）は、核酸を含む。いくつかの実施形態において、サンプルは、核酸配列分析に反応しやすいという点で特徴付けられる。例えば、いくつかの実施形態において、サンプルは、核酸シークエンシング酵素または試薬の１もしくはこれより多くの特定のインヒビターを実質的に含まない可能性がある。いくつかの実施形態において、サンプルは、このような分析が成功裡に行われ得る分析されるべき核酸に関して、十分に純粋であり得る。
いくつかの実施形態において、サンプルは、生物学的、臨床的、法医学的、地質学的、天文学的、水生の、または農学的サンプルを含むかまたはこれらサンプルからなる。ある特定の実施形態において、サンプルは、粗製サンプル（例えば、血液、岩石、木、池の水）であり、これらは処理されていないか、またはサンプルは、処理および／もしくは精製される（血液、樹皮、葉、種子のような供給源から例えば、ＤＮＡ抽出され、必要に応じて精製される）（図１）。
いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、生物学的組織または流体を含むかまたはこれらからなる。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、骨髄；血液；血球；腹水；組織もしくは細針生検サンプル；細胞含有体液；浮遊性核酸；喀痰；唾液；尿；脳脊髄液、腹膜内液；胸膜液；糞便；リンパ液；婦人科学的な流体；皮膚スワブ；膣スワブ；口腔スワブ；鼻腔スワブ；洗浄物（ｗａｓｈｉｎｇ）または洗浄液(ｌａｖａｇｅ）（例えば、導管洗浄液または気管支肺胞洗浄液）；吸引物；擦過物；骨髄標本；組織生検標本；摘出標本；他の体液、分泌物、および／または排出物；ならびに／あるいはこれらに由来する細胞などを含み得るか、またはこれらからなり得る。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、個体から得られる細胞を含むかまたはこの細胞からなる。いくつかの実施形態において、得られる細胞は、そのサンプルが得られる個体に由来する細胞であるかまたはこの細胞を含む。
いくつかの実施形態において、サンプルは、任意の適切な手段によって目的の供給源から直接得られる「一次サンプル」である。例えば、いくつかの実施形態において、生物学的一次サンプルは、生検（例えば、細針吸引または組織生検）、外科手術、体液（例えば、血液、リンパ液、糞便など）の収集などからなる群より選択される方法によって得られる。いくつかの実施形態において、状況から明らかであるように、用語「サンプル」とは、処理されないかまたは最小限に処理される調製物をいう。このような「粗製サンプル」は、生物から収集した後にさらに処理に供されない、例えば尿を含み得る。いくつかの実施形態において、粗製サンプルは収集され、分析の前におよび／またはタグの付加の前にさらに処理されない。
いくつかの実施形態において、状況から明らかであるように、用語「サンプル」とは、一次サンプルを処理することによって（例えば、その一次サンプルの１もしくはこれより多くの成分を除去するおよび／またはその一次サンプルに１もしくはこれより多くの薬剤を添加することによって）得られる調製物をいう。例えば、半透膜を使用する濾過。このような「処理されたサンプル」は、サンプルから抽出されるかまたは一次サンプルを、ｍＲＮＡの増幅もしくは逆転写、ある特定の成分の単離および／もしくは精製などのような技術に供することによって得られる、例えば、核酸またはタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態において、粗製サンプルに適用される処理は、分析用のサンプルが提供されるように、粗製サンプルに存在した核酸を精製するという効果を有する。
本明細書で記載される場合、本発明者らは、種々の適用において彼らの成功を示すタグおよびこのようなタグの使用方法を成功裡に開発した。タグは、サンプル追跡、サンプル同定およびサンプル分析（例えば、シークエンシング）のような適用において有用である。本発明のタグは、既存のタグならびにサンプル追跡、同定および／または分析の方法を超える、ある特定の特徴および利点を提供する。
いくつかの実施形態において、このようなタグは、サンプルに添加され得るか、または「スパイクイン」され得、その結果、少なくとも１つのサンプルおよび少なくとも１種もしくはこれより多くのタグが、近接して（例えば、収集チューブの中に、ウェルプレートの中に、または物体の表面にあるように）存在する。サンプルおよび少なくとも１種のタグを近接するようにして合わせることは、サンプル同一性の容易な決定を可能にし、これは、種々のシークエンシングプロトコルによって、およびいかなる帰属の必要性をもなしに、アッセイされ得る。
いくつかの実施形態において、サンプルは、核酸シークエンシング反応（例えば、ＤＮＡシークエンシング反応）において利用される。
いくつかの実施形態において、タグは、例えば、サンプル同定および／または分析において使用される（図１）。
タグ
本開示は、例えば、分析を受けている核酸サンプルの追跡、同定および／またはさもなければ処理の改善において使用するためのタグを提供する。提供されるタグは、例えば、核酸サンプルを同定および／または二次汚染を検出するために使用される場合、公知のタグまたはタグ化システムと比較して種々の利点を付与する。
本開示は、例えば、分析を受けている核酸サンプルの追跡、同定および／またはさもなければ処理の改善において使用するためのタグを提供する。提供されるタグは、例えば、核酸サンプルを同定および／または二次汚染を検出するために使用される場合、公知のタグまたはタグ化システムと比較して種々の利点を付与する。
公知のタグ化システムは、例えば、Ｑｕａｉｌらによる国際特許出願公開ＷＯ ２０１４１２８４５３（本明細書中以降「Ｑｕａｉｌ」）において記載されるものを含む。これは、例えば、核酸サンプルを同定するために、およびサンプルの二次汚染を検出するために、「核酸マーカー分子」を開示する。Ｑｕａｉｌのマーカー分子は、外側でネスト化された（ｏｕｔ－ｎｅｓｔｅｄ）（その配列に各末端で隣接する）バーコードとともに、ｐｈｉＸ（ウイルス）をテンプレートとして使用して生成された、種々の長さのＰＣＲフラグメントである。隣接するバーコードを有するその記載されるｐｈｉＸ配列は、それ自体タグであり（「Ｑｕａｉｌタグ」）、処理および配列分析を通じて、サンプルを例えば、追跡および／または同定するために、サンプルに添加される。Ｑｕａｉｌは、その核酸マーカー分子を添加して、サンプルを処理前からシークエンシングおよび分析まで追跡することを開示する（本明細書中以降、「Ｑｕａｉｌ技術」）。
本開示は、公知のタグ化システム（例えば、Ｑｕａｉｌ技術）のある特定の制限を同定および／または認識する。例えば、このＱｕａｉｌ技術は、比較的短くかつ低分子量である種々のサイズの核酸マーカー分子を利用する。本開示は、このようなストラテジーがある特定の適用（例えば、長い配列読み取り適用が挙げられる）には適していない、従って、数百、数千および／または数十万ものサンプルもしくはこれより多くを要する適用には容易に拡大可能ではない可能性があるという見通しを提供する。さらに、本開示は、Ｑｕａｉｌによって記載されるとおりの核酸マーカー分子が粗製サンプルに添加される場合、それらは、おそらく、その後の処理工程の間に（例えば、剪断工程の間に）壊れやすいことを認識する。
本発明は、とりわけ、高分子量ＤＮＡから構成されるタグ、そのタグの使用法、ならびにそのタグを含むキット、収集バイアル、および他の容器を提供する。さらに、その提供されるタグは、とりわけ、例えば、長い読み取り適用、少なくとも数百、数千および／または数十万のサンプルもしくはこれより多くを要する適用への拡張性、例えば、収集の時点、分離もしくは精製前からシークエンシングおよび分析までのサンプルのタグ化、追跡、および／または同定のような種々の適用に適している。
いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるタグは、合成の、高分子量核酸（例えば、２本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」））を含み、その結果、タグがサンプルに付加される場合、処理全体を通じてサンプルとともに残る。高分子量ＤＮＡタグは、サンプル中のゲノムＤＮＡまたは高分子量ＤＮＡに類似して、代表的な処理手順、例えば、分離、精製および分析に耐え得る。
いくつかの実施形態において、タグの高分子量の性質は、そのタグを長い読み取り技術（例えば、ＰＡＣＢＩＯ、ＯＸＦＯＲＤ ＮＡＮＯＰＯＲＥ、ＧＥＮＩＡ、ＲＯＣＨＥ）のためのサンプルタグ化における使用に理想的にする。短いＰＣＲタグおよび／または短いオリゴヌクレオチドは、このような適用における使用に一般には適切でも望ましくもない。
提供されるタグは、とりわけ、例えば、法医学、医療および／または農学分野において例えば、追跡に有用である。
タグ設計
有用なこのようなタグは、配列Ａ（不変）、配列Ｂ（各タグに特有）および配列Ｃ（不変）の反復ユニットを含むかまたはその反復ユニットからなり、１タグあたりＡ－Ｂ－Ｃの少なくとも２個の反復ユニットを有するヌクレオチド配列を有するように設計および／または構築され得ることが企図される。いくつかの実施形態において、タグは、Ｘ－［Ａ－Ｂ－Ｃ］ｎ－Ｙを含む式に従って配置され、ここでｎは、少なくとも２であり、そしてＡ、Ｂ、およびＣの各々は、２個もしくはこれより多くの残基の規定された長さを有する。いくつかの実施形態において、Ｘは、必要に応じて存在するかまたは非存在であり、存在する場合、－Ｃ－の１もしくはこれより多くの例からなり得るかまたはこれら例を含み得るか、あるいはさもなければ、別のエレメントからなり得るかまたは別のエレメントを含み得る。いくつかの実施形態において、Ｙは、必要に応じて存在するかまたは非存在であり、存在する場合、－Ａ－の１もしくはこれより多くの例からなり得るかまたはこれら例を含み得るか、あるいはさもなければ、別のエレメントからなり得るかまたは別のエレメントを含み得る。いくつかの実施形態において、そのエレメントは、核酸、５’プライマー改変もしくは３’プライマー改変（例えば、ホスホロチオエート化、内部改変、メチル化シトシンなど）を含むかまたはこれらからなる。
有用なこのようなタグは、配列Ａ（不変）、配列Ｂ（各タグに特有）および配列Ｃ（不変）の反復ユニットを含むかまたはその反復ユニットからなり、１タグあたりＡ－Ｂ－Ｃの少なくとも２個の反復ユニットを有するヌクレオチド配列を有するように設計および／または構築され得ることが企図される。いくつかの実施形態において、タグは、Ｘ－［Ａ－Ｂ－Ｃ］ｎ－Ｙを含む式に従って配置され、ここでｎは、少なくとも２であり、そしてＡ、Ｂ、およびＣの各々は、２個もしくはこれより多くの残基の規定された長さを有する。いくつかの実施形態において、Ｘは、必要に応じて存在するかまたは非存在であり、存在する場合、－Ｃ－の１もしくはこれより多くの例からなり得るかまたはこれら例を含み得るか、あるいはさもなければ、別のエレメントからなり得るかまたは別のエレメントを含み得る。いくつかの実施形態において、Ｙは、必要に応じて存在するかまたは非存在であり、存在する場合、－Ａ－の１もしくはこれより多くの例からなり得るかまたはこれら例を含み得るか、あるいはさもなければ、別のエレメントからなり得るかまたは別のエレメントを含み得る。いくつかの実施形態において、そのエレメントは、核酸、５’プライマー改変もしくは３’プライマー改変（例えば、ホスホロチオエート化、内部改変、メチル化シトシンなど）を含むかまたはこれらからなる。
一局面において、タグの一般化したＸ－［Ａ－Ｂ－Ｃ］ｎ－Ｙ構造は、タグに由来する読み取りの簡単なかつ一貫した同定を提供することが認識される。別の局面において、タグの構造は、タグ由来読み取りの機密性の除去または機密性を下げる編集（ｓａｎｉｔｉｚａｔｉｏｎ）を可能にし得、これは、デノボゲノムシークエンシングおよびサンプル参照またはキーが存在しない他の同様の適用に有用であり得る。
いくつかの実施形態において、タグは、ゲノムＤＮＡに類似して振る舞う場合に、高分子量であると考えられる。いくつかの実施形態において、タグは、処理手順（例えば、剪断）を通じて残る場合に、高分子量であると考えられる。
いくつかの実施形態において、タグは、下限および上限による境界があり、ここでその上限がその下限より大きい範囲内の分子量を有する場合に、高分子量であると考えられる；いくつかのそのような実施形態において、その下限は、約２６００００ダルトン、約３２５０００ダルトン、約３９００００ダルトン、約４５５０００ダルトン、約５２００００ダルトン、約５８５０００ダルトン、約６５００００ダルトン、約１３０００００ダルトン、約１９５００００ダルトン、約２６０００００ダルトン、約３２５００００ダルトン、約３９０００００ダルトン、約４５５００００ダルトン、約５２０００００ダルトン、約５８５００００ダルトン、約６５０００００ダルトン、約７１５００００ダルトン、約７８０００００、約８４５００００ダルトン、約９１０００００ダルトン、約９７５００００ダルトン、約１０４０００００ダルトン、約１１０５００００ダルトン、約１１７０００００ダルトン、約１２３５００００ダルトン、約１３００００００ダルトン、約１９５０００００ダルトン、約２６００００００ダルトン、約３２５０００００、約３９００００００ダルトン、約４５５０００００ダルトン、約５２００００００ダルトン、約５８５０００００ダルトン、約６５００００００ダルトンまたは６５００００００ダルトン超である。いくつかの実施形態において、その上限は、約３２５０００ダルトン、約３９０，０００ダルトン、約４５００００ダルトン、約５２００００ダルトン、約５８５０００ダルトン、約６５００００ダルトン、約１３０００００ダルトン、約１９５００００ダルトン、約２６０００００ダルトン、約３２５００００ダルトン、約３９０００００ダルトン、約４５５００００ダルトン、約５２０００００ダルトン、約５８５００００ダルトン、約６，５００，０００ダルトン、約７１５００００ダルトン、約７８０００００、約８４５００００ダルトン、約９１０００００ダルトン、約９７５００００ダルトン、約１０４０００００ダルトン、約１１０５００００ダルトン、約１１７０００００ダルトン、約１２３５００００ダルトン、約１３００００００ダルトン、約１９５０００００ダルトン、約２６００００００ダルトン、約３２５０００００、約３９００００００ダルトン、約４５５０００００ダルトン、約５２００００００ダルトン、約５８５０００００ダルトン、約６５００００００ダルトンまたは６５００００００ダルトン超である。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約２６００００ダルトンから約６５００００００ダルトンより大きい範囲内の分子量を有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約３２５０００ダルトン～約６５００００００ダルトンの範囲内の分子量を有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約３９０，０００ダルトン～約５８５０００００ダルトンの範囲内の分子量を有する。
いくつかの実施形態において、タグは、下限および上限による境界があり、ここでその上限がその下限より大きい範囲内の長さを有する場合に、高分子量であると考えられる；いくつかのそのような実施形態において、その下限は、約４００ベース、約５００ベース、約６００ベース、約７００ベース、約８００ベース、約９００ベース、約１キロベース、約２キロベース、約３キロベース、約４キロベース、約５キロベース、約６キロベース、約７キロベース、約８キロベース、約９キロベース、約１０キロベース、約１１キロベース、約１２キロベース、約１３キロベース、約１４キロベース、約１５キロベース、約１６キロベース、約１７キロベース、約１８キロベース、約１９キロベース、約２０キロベース、約３０キロベース、約４０キロベース、約５０キロベース、約６０キロベース、約７０キロベース、約８０キロベース、約９０キロベース、約１００キロベース、および１００キロベース超である。いくつかの実施形態において、その上限は、約５００ベース、約６００ベース、約７００ベース、約８００ベース、約９００ベース、約１キロベース、約２キロベース、約２キロベース、約２キロベース、約３キロベース、約４キロベース、約５キロベース、約６キロベース、約７キロベース、約８キロベース、約９キロベース、約１０キロベース、約１１キロベース、約１２キロベース、約１３キロベース、約１４キロベース、約１５キロベース、約１６キロベース、約１７キロベース、約１８キロベース、約１９キロベース、約２０キロベース、約３０キロベース、約４０キロベース、約５０キロベース、約６０キロベース、約７０キロベース、約８０キロベース、約９０キロベース、約１００キロベースおよび１００キロベース超である。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約４００ベース～約１００キロベース超の間の範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約５００ベース～約１００キロベースの間の範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約６００ベース～約９０キロベースの間の範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約７００ベース～約８０キロベースの間の範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約８００ベース～約７０キロベースの間の範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約９００ベース～約６０キロベースの間の範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約１キロベース～約５０キロベースの間の範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約２キロベース～約４０キロベースの間の範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約３キロベース～約３０キロベースの間の範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約４キロベース～約２０キロベースの間の範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約５キロベース～約１９キロベースの間の範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約６キロベース～約１８キロベースの間の範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約７キロベース～約１７キロベースの間の範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約７キロベース～約１６キロベースの間の範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約８キロベース～約１５キロベースの間の範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約９キロベース～約１４キロベースの間の範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約１０キロベース～約１３キロベースの間の範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約１１キロベース～約１２キロベースの間の範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約５００ベース～約５キロベースの間の範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約６００ベース～約６キロベースの間の範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約７００ベース～約７キロベースの間の範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約８００ベース～約８キロベースの間の範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約９００ベース～約９キロベースの間の範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約１キロベース～約５０キロベースの間の範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約２キロベース～約４０キロベースの間の範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約２キロベース～約３０キロベースの間の範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約２キロベース～約２０キロベースの間の範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態において、高分子量タグは、約１キロベース～約５キロベースの間の範囲内の長さを有する。
いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約１２ヌクレオチド～少なくとも約３００，０００ヌクレオチド超を含み得るかまたはそれからなり得ることが企図される。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００、１９０００、２００００、２１０００、２２０００、２３０００、２４０００、２５０００、２６０００、２７０００、２８０００、２９０００、３００００、３１０００、３２０００、３３０００、３４０００、３５０００、３６０００、３７０００、３８０００、３９０００、４００００、４１０００、４２０００、４３０００、４４０００、４５０００、４６０００、４７０００、４８０００、４９０００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、１１００００、１２００００、１３００００、１４００００、１５００００、１６００００、１７００００、１８００００、１９００００、２０００００、２１００００、２２００００、２３００００、２４００００、２５００００、２６００００、２７００００、２８００００、２９００００、または３０００００ベースを含み得るかまたはそれからなり得る。
いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約１２ヌクレオチド～少なくとも約１００ヌクレオチドを含み得るかまたはそれからなり得る。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約１３ヌクレオチド～少なくとも約９９ヌクレオチドを含み得るかまたはそれからなり得る。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約１４ヌクレオチド～少なくとも約９８ヌクレオチドを含み得るかまたはそれからなり得る。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約１５ヌクレオチド～少なくとも約９７ヌクレオチドを含み得るかまたはそれからなり得る。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約１６ヌクレオチド～少なくとも約９６ヌクレオチドを含み得るかまたはそれからなり得る。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約１７ヌクレオチド～少なくとも約９５ヌクレオチドを含み得るかまたはそれからなり得る。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約１８ヌクレオチド～少なくとも約９４ヌクレオチドを含み得るかまたはそれからなり得る。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約１９ヌクレオチド～少なくとも約９３ヌクレオチドを含み得るかまたはそれからなり得る。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約２０ヌクレオチド～少なくとも約９２ヌクレオチドを含み得るかまたはそれからなり得る。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約２０ヌクレオチド～少なくとも約９０ヌクレオチドを含み得るかまたはそれからなり得る。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約２０ヌクレオチド～少なくとも約８０ヌクレオチドを含み得るかまたはそれからなり得る。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約２０ヌクレオチド～少なくとも約７０ヌクレオチドを含み得るかまたはそれからなり得る。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約２０ヌクレオチド～少なくとも約６０ヌクレオチドを含み得るかまたはそれからなり得る。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約２０ヌクレオチド～少なくとも約５０ヌクレオチドを含み得るかまたはそれからなり得る。
いかなる特定の理論にも拘束されないが、いくつかの実施形態において、１タグあたり複数のユニットを有することは、ある特定の特別な利点を提供し得ると考えられる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００または３００超のユニットを有する。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約２～約３００のユニットを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約３～約２９０のユニットを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約２４～約２８０のユニットを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約５～約２７０のユニットを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約６～約２６０のユニットを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約７～約２５０のユニットを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約８～約２４０のユニットを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約９～約２３０のユニットを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約１０～約２２０ユニットを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約１１～約２１０のユニットを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約１２～約２００のユニットを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約１３～約１９０のユニットを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約１４～約１８０のユニットを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約１５～約１７０のユニットを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約１６～約１８０のユニットを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約１７～約１９０のユニットを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約１８～約１８０のユニットを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約１９～約１７０のユニットを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約２０～約１６０のユニットを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約２１～約１５０のユニットを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約２２～約１４０のユニットを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約２３～約１３０ユニットを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約２４～約１２０ユニットを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約２５～約１１０ユニットを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約２６～約１００のユニットを含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約２７～約９０のユニットを含むかまたはそれからなる。
いくつかの実施形態において、特定のタグの中に含まれるユニットの数は、個々のユニットの長さによって影響を受け得るおよび／または決定され得る。一般に、より短い個々のユニットから構成されるタグは、ユニットがより長いタグが有するより、このようなユニットのより大きな数を有し得る。
いくつかの実施形態において、ユニットの長さは、少なくとも約６個の核酸～少なくとも約１０００個超の核酸である。いくつかの実施形態において、ユニットの長さは、少なくとも、約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００および１０００超の核酸である。
いくつかの実施形態において、ユニットの長さは、少なくとも約２０～少なくとも約１００である。いくつかの実施形態において、ユニットの長さは、少なくとも約２０～少なくとも約８０である。いくつかの実施形態において、ユニットの長さは、少なくとも約３０～少なくとも約８０である。いくつかの実施形態において、ユニットの長さは、少なくとも約２０～少なくとも約６０である。いくつかの実施形態において、ユニットの長さは、少なくとも約１０～少なくとも約１００である。いくつかの実施形態において、ユニットの長さは、約１０～少なくとも約８０である。いくつかの実施形態において、ユニットの長さは、少なくとも約４０～少なくとも約８０である。いくつかの実施形態において、ユニットの長さは、少なくとも約３０～少なくとも約９０である。いくつかの実施形態において、ユニットの長さは、少なくとも約４０～少なくとも約７０である。いくつかの実施形態において、タグは、一般構造Ｘ－［Ａ－Ｂ－Ｃ］ｎ－Ｙを有し、ここでＸおよびＹは選択肢的であり、Ａ、Ｂ、およびＣの各々は、本明細書で記載されるように規定および／または選択される配列エレメントである。いかなる特定の理論によっても拘束されることは望まないが、このような構造を有する（すなわち、複数の反復するＡ－Ｂ－Ｃユニットによって特徴付けられる構造を有する）高分子量核酸タグが特定の有利な特徴（例えば、高い安定性が挙げられる）を示し得ることは、本明細書で提唱される。とりわけ、本開示は、このような構造のタグが、ある特定の特徴を、天然のサンプルで（例えば、ゲノムＤＮＡで）見出される高分子量ＤＮＡと共有し得るという見通しを提供する。
本明細書で示される場合、コンカテマー構造（例えば、その構造は、本明細書で記載されるように、式Ｘ－［Ａ－Ｂ－Ｃ］ｎ－Ｙに従う、連続して配置されるユニットの反復を含むかまたはこの反復からなる）を有するタグは、種々のサンプル調製手順（他の利用可能なマーカーになる薬剤（例えば、Ｑｕａｉｌ核酸マーカー分子および／または他のより短いオリゴヌクレオチド薬剤（特に、直線状のオリゴヌクレオチド）、および／または本明細書で記載されるタグの構造［例えば、Ｘ－［Ａ－Ｂ－Ｃ］ｎ－Ｙ］を有しない、例えばＰＣＲによって生成され得るとおりの約２～約６００残基の範囲内の長さのオリゴヌクレオチド）を破壊または分解するかまたは破壊または分解し得るものが挙げられる）を通して残存し／続き得る。
いくつかの実施形態において、提供されるタグ中のエレメントＡおよびＣは、プライマーとハイブリダイズし、そしてそれらの伸長を可能にして、核酸（例えば、ＤＮＡ）ポリマーを生成するために設計および／または選択された配列を有する。いくつかの実施形態において、エレメントＡおよびＣは、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）において有用なプライマー対のメンバーとハイブリダイズするように特異的に設計される。いくつかの実施形態において、エレメントＡおよびＣは、プライミングが多重鎖形成において支持されるように、多重ＰＣＲ反応の状況で互いと適合性であるように設計される。いくつかの実施形態において、ＡおよびＣの配列は、１もしくはこれより多くの（およびいくつかの実施形態において、多重の）異なるプラットフォーム（例えば、ハイブリダイゼーション捕捉など）の状況で互いと適合性である。例えば、いくつかの実施形態において、エレメントＡおよびＣは、匹敵する融解温度を有する、ＡおよびＣの各々にハイブリダイズするプライマーによって特徴付けられる配列を有する。
一般に、エレメントＢは、分析されるべきサンプルに存在する確率が低いかまたはゼロであるように設計および／または選択される配列を有する。いくつかの実施形態において、エレメントＢは、任意のおよび全ての公知の配列（例えば、配列情報の利用可能なデータベースへの参照によって決定される場合）から別個であるように設計および／または選択された配列を有する。例えば、いくつかの実施形態において、エレメントＢは、任意のおよび全ての公知の配列（例えば、配列情報の利用可能なデータベースを参照することによって決定される場合）に対して１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、またはその間の任意のパーセンテージの値に等しいかまたはこれらの値未満の相同性または同一性を有するように設計および／または選択された配列を有する。いくつかの実施形態において、エレメントＢは、任意のおよび全ての公知の植物配列（例えば、配列情報の利用可能なデータベースへの参照によって決定される場合）から別個であるように設計および／または選択された配列を有する。例えば、いくつかの実施形態において、エレメントＢは、任意のおよび全ての公知の植物配列（例えば、配列情報の利用可能なデータベースを参照することによって決定される場合）に対して１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、またはその間の任意のパーセンテージの値に等しいかまたはこれらの値未満の相同性または同一性を有するように設計および／または選択された配列を有する。いくつかの実施形態において、エレメントＢは、任意のおよび全ての公知の脊椎動物配列（例えば、配列情報の利用可能なデータベースへの参照によって決定される場合）から別個であるように設計および／または選択された配列を有する。例えば、いくつかの実施形態において、エレメントＢは、任意のおよび全ての公知の脊椎動物配列（例えば、配列情報の利用可能なデータベースを参照することによって決定される場合）に対して１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、またはその間の任意のパーセンテージの値に等しいかまたはこれらの値未満の相同性または同一性を有するように設計および／または選択された配列を有する。いくつかの実施形態において、エレメントＢは、任意のおよび全ての公知の無脊椎動物配列（例えば、配列情報の利用可能なデータベースへの参照によって決定される場合）から別個であるように設計および／または選択された配列を有する。例えば、いくつかの実施形態において、エレメントＢは、任意のおよび全ての公知の無脊椎動物配列（例えば、配列情報の利用可能なデータベースを参照することによって決定される場合）に対して１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、またはその間の任意のパーセンテージの値に等しいかまたはこれらの値未満の相同性または同一性を有するように設計および／または選択された配列を有する。いくつかの実施形態において、エレメントＢは、任意のおよび全ての公知の哺乳動物配列（例えば、配列情報の利用可能なデータベースへの参照によって決定される場合）から別個であるように設計および／または選択された配列を有する。例えば、いくつかの実施形態において、エレメントＢは、任意のおよび全ての公知の哺乳動物配列（例えば、配列情報の利用可能なデータベースを参照することによって決定される場合）に対して１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、またはその間の任意のパーセンテージの値に等しいかまたはこれらの値未満の相同性または同一性を有するように設計および／または選択された配列を有する。いくつかの実施形態において、エレメントＢは、任意のおよび全ての公知のヒト配列（例えば、配列情報の利用可能なデータベースへの参照によって決定される場合）から別個であるように設計および／または選択された配列を有する。例えば、いくつかの実施形態において、エレメントＢは、任意のおよび全ての公知のヒト配列（例えば、配列情報の利用可能なデータベースを参照することによって決定される場合）に対して１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、またはその間の任意のパーセンテージの値に等しいかまたはこれらの値未満の相同性または同一性を有するように設計および／または選択された配列を有する。いくつかの実施形態において、エレメントＢは、任意のおよび全ての公知のウイルス、細菌、微生物および／または酵母の配列（例えば、配列情報の利用可能なデータベースへの参照によって決定される場合）から別個であるように設計および／または選択された配列を有する。例えば、いくつかの実施形態において、エレメントＢは、任意のおよび全ての公知のウイルス、細菌、微生物および／または酵母の配列（例えば、配列情報の利用可能なデータベースを参照することによって決定される場合）に対して１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、またはその間の任意のパーセンテージの値に等しいかまたはこれらの値未満の相同性または同一性を有するように設計および／または選択された配列を有する。配列情報の公的に利用可能なデータベースとしては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ）が挙げられるが、これらに限定されない。代わりにまたはさらに、いくつかの実施形態において、エレメントＢは、およそ３５～６５％、およそ４０～６０％、およそ４５～５５％、またはおよそ５０％のＧ／Ｃ含有量によって特徴付けられる配列を有するように設計および／または選択された配列を有する。
いくつかの実施形態において、Ａ、Ｂ、および／またはＣのうちのいずれかまたは全ては、ひとの手という行為を通じて化学合成されるという点で、合成エレメントであるかまたは合成エレメントを含む。いくつかの実施形態において、このような化学合成は、ポリメラーゼ酵素を利用しない。いくつかの実施形態において、このような化学合成は、ポリメラーゼ酵素を利用するが、細胞の状況にはない、そして／またはポリメラーゼ酵素を天然に生成する細胞の状況にはない。いくつかの実施形態において、このような化学合成は、天然に存在する酵素の改変体であるおよび／またはポリメラーゼが天然で機能するもの以外の状況で（例えば、インビトロで、エキソビボで、天然のテンプレート核酸の非存在下で、標識の存在下でなど）利用される、ポリメラーゼ酵素を利用する。
本開示によって提供される１つの見通しは、多くの実施形態において、本明細書で記載されるとおりのエレメントＡ、Ｂ、および／またはＣに含まれる配列の正確な同一性が、記載されるタグの全体構造によって提供される利益を達成するために決定的でなくてもよいことである。すなわち、いくつかの実施形態において、本開示は、種々の特定の配列のうちのいずれかが、本明細書で記載されるとおりの望ましい反復ユニット構造の高分子量タグをアセンブリするために、本明細書で提供されるガイドラインに従って、Ａ、Ｂ、およびＣエレメントとして利用され得ることを企図する。
従って、本開示は、構造：Ｘ－［Ａ－Ｂ－Ｃ］ｎ－Ｙ
の高分子量核酸タグの有用性および予測外の利点を教示し、示す。ここでＸおよびＹは、選択肢的であり、Ａ、Ｂ、およびＣは、本明細書で記載されるとおりである。多くの実施形態において、タグ内の各「Ａ」は、そのタグ内の互いの「Ａ」と同一である；タグ内の各「Ｂ」は、タグ内の互いの「Ｂ」と同一である；そしてタグ内の各「Ｃ」は、タグ内の互いの「Ｃ」と同一である。その結果、そのタグは、真に同一の反復ユニットの構造を有する。しかし、本明細書で記載される場合、本開示の一局面は、エレメント内の正確な配列同一性の厳格な定義が本明細書で記載されるとおりの有効なかつ有用なタグ化のために必要とされなくてもよいという見通しである。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるとおりのタグは、各々のおよびあらゆる反復ユニットが、あらゆる他の単位と完全に同一でない場合ですら、なお有効であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、タグ内の１もしくはこれより多くの「Ｂ」エレメントは、変動し得る。いくつかの実施形態において、１もしくはこれより多くのＡまたはＣエレメントは、変動し得るが、一般に、単一のタグ内の全てのＡおよびＣエレメントは、これらが匹敵するかまたは同一の長さの増幅生成物を生成するために、同じプライマーセットとハイブリダイズして伸長を可能にし得る（それらの間のＢエレメントが、このような匹敵することまたは同一性を担保するために適切な長さのものであることをも要求する）という点で適合性であることは好ましい。従って、例えば、本明細書で記載されるとおりの有用なタグが、構造：
Ｘ－Ａｉ－Ｂｉ－Ｃｉ－Ａｉｉ－Ｂｉｉ－Ｃｉｉ－Ａｉｉｉ－Ｂｉｉｉ－Ｃｉｉｉ－ ．．． －Ａｎ－Ｂｎ－Ｃｎ－Ｙ、および／または
Ｘ－［Ａｉ－Ｂｉ－Ｃｉ］ｎｉ－［Ａｉｉ－Ｂｉｉ－Ｃｉｉ］ｎｉｉ－［Ａｉｉｉ－Ｂｉｉｉ－Ｃｉｉｉ］ｎｉｉｉ－ ．．． ［Ａｎ－Ｂｎ－Ｃｎ］ｎｎ
を有し得ることは考えられる。
の高分子量核酸タグの有用性および予測外の利点を教示し、示す。ここでＸおよびＹは、選択肢的であり、Ａ、Ｂ、およびＣは、本明細書で記載されるとおりである。多くの実施形態において、タグ内の各「Ａ」は、そのタグ内の互いの「Ａ」と同一である；タグ内の各「Ｂ」は、タグ内の互いの「Ｂ」と同一である；そしてタグ内の各「Ｃ」は、タグ内の互いの「Ｃ」と同一である。その結果、そのタグは、真に同一の反復ユニットの構造を有する。しかし、本明細書で記載される場合、本開示の一局面は、エレメント内の正確な配列同一性の厳格な定義が本明細書で記載されるとおりの有効なかつ有用なタグ化のために必要とされなくてもよいという見通しである。いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるとおりのタグは、各々のおよびあらゆる反復ユニットが、あらゆる他の単位と完全に同一でない場合ですら、なお有効であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、タグ内の１もしくはこれより多くの「Ｂ」エレメントは、変動し得る。いくつかの実施形態において、１もしくはこれより多くのＡまたはＣエレメントは、変動し得るが、一般に、単一のタグ内の全てのＡおよびＣエレメントは、これらが匹敵するかまたは同一の長さの増幅生成物を生成するために、同じプライマーセットとハイブリダイズして伸長を可能にし得る（それらの間のＢエレメントが、このような匹敵することまたは同一性を担保するために適切な長さのものであることをも要求する）という点で適合性であることは好ましい。従って、例えば、本明細書で記載されるとおりの有用なタグが、構造：
Ｘ－Ａｉ－Ｂｉ－Ｃｉ－Ａｉｉ－Ｂｉｉ－Ｃｉｉ－Ａｉｉｉ－Ｂｉｉｉ－Ｃｉｉｉ－ ．．． －Ａｎ－Ｂｎ－Ｃｎ－Ｙ、および／または
Ｘ－［Ａｉ－Ｂｉ－Ｃｉ］ｎｉ－［Ａｉｉ－Ｂｉｉ－Ｃｉｉ］ｎｉｉ－［Ａｉｉｉ－Ｂｉｉｉ－Ｃｉｉｉ］ｎｉｉｉ－ ．．． ［Ａｎ－Ｂｎ－Ｃｎ］ｎｎ
を有し得ることは考えられる。
ここで本明細書に記載されるパラメーターに従って、各Ａは、あらゆる他のＡと必ずしも同一ではなく、各Ｂは、互いのＢと必ずしも同一ではなく、そして／または各Ｃは、互いのＣと必ずしも同一ではなく（そして／または各ｎは、互いのｎと等しくてもよいし等しくなくてもよい）。しかし、多くのまたは大部分の実施形態において、各Ａは、あらゆる他のＡと同一であり、各Ｂは、互いのＢと同一であり、そして／または各Ｃは、互いのＣと同一である。
いくつかの実施形態において、Ａ、Ｂ、および／またはＣのうちのいずれかまたは全ては、特定の参照配列に対して選択またはモデル化されないという点で、「ランダム」または「合成」と考えられる配列を有する。多くの実施形態において、エレメントＡ、Ｂ、および／またはＣとして含まれる正確な配列は、コンピューターに入力するかまたは本明細書で記載されるとおりの設計ガイドラインを別の方法で実施することによって設計され得る（例えば、ＡおよびＣは、適合性のプライマーハイブリダイゼーション部位を含み、Ｂは、Ａ、Ｂ、およびＣと一緒に、本明細書で記載されるとおりのタグの「ユニット」であるように適切な長さおよび機能的特徴のユニットを形成するために、直接関連する範囲内のＧＣ含有量を有する）。いくつかの実施形態において、「ランダム」または「合成」配列は、特定のサンプルまたは目的のサンプルセット中で見出される（または見出されると予測される）他の核酸と、バックグラウンドを超えてハイブリダイズしない（またはハイブリダイズしないと推測される）という点で特徴付けられる；いくつかの実施形態において、このようなランダムまたは合成配列は、これが添加され得るサンプルを「特有に」マークする（例えば、標識する）ことができると考えられる。このようなマークする工程は、他の処理および／または分析を受けることがあれば、および受けるときに、そのサンプルの容易な同定およびまたは特徴付けを可能にし得る。
いくつかの実施形態において、タグは、１もしくはこれより多くのリンカーエレメントを（例えば、１もしくはこれより多くのユニット内に、全てのユニット内に、および／または末端のユニットと存在し得る任意のＸもしくはＹエレメントとの間に）含む構造を有し得る。一般に、リンカーエレメント、特に、ユニット内リンカーエレメントは、少数の（代表的には、約３０個未満、約２９個、約２８個、約２７個、約２６個、約２５個、約２４個、約２３個、約２２個、約２１個、約２０個、約１９個、約１８個、約１７個、約１６個、約１５個、約１４個、約１３個、約１２個、約１１個、約１０個、約９個、約８個、約７個、約６個、約５個、約４個、約３個、約２個、約１個、約０個）の核酸残基であるか、またはこれら核酸残基を含む。リンカーは、本明細書で記載されるように、リンカーが含まれるか、またはリンカーが付加される、個々のエレメントの、ユニットの、および／またはタグの機能に干渉するべきではない。
いくつかの実施形態において、タグは、本明細書で記載されるとおりのいかなるリンカーエレメントをも含まない（例えば、Ｘ－［Ａ－Ｂ－Ｃ］ｎ－Ｙからなる構造を有する）。
いくつかの実施形態において、タグは、切断部位（例えば、制限部位）を含む配列を有し得る。いくつかの実施形態において、タグは、複数の切断部位を含む配列を有し得る。いくつかの実施形態において、このような切断部位は、全体的に単一のエレメント（例えば、Ｘ、Ｙ、Ａ、Ｂ、またはＣエレメント）内に存在し得る；いくつかの実施形態において、それは、２個の異なる配列エレメントの並置によって形成され得る。
いくつかの実施形態において、比較的長いタグは、調製およびシークエンシングプロトコルの最も広い範囲との適合性を担保するために好ましい。いくつかの実施形態において、タグがバーコードモチーフ、好ましくは、明確に同定可能であるために十分長いが、少なくとも１個の完全タグ（ｆｕｌｌ ｔａｇ）、例えば、約１００ｂｐよみとりあたりを担保するために十分短いバーコードモチーフを含むことは、望ましい；本明細書で例示されるある特定の実施形態において、２０塩基対のバーコードモチーフを利用した。いくつかの実施形態において、バーコードモチーフは、少なくとも約６～少なくとも約１００００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、バーコードモチーフは、少なくとも、約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、バーコードモチーフは、少なくとも約６～少なくとも約１００個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、バーコードモチーフは、少なくとも約８～少なくとも約８０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、バーコードモチーフは、少なくとも約８～少なくとも約６０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、バーコードモチーフは、少なくとも約１０～少なくとも約５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、バーコードモチーフは、少なくとも約１０～少なくとも約４０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、バーコードモチーフは、少なくとも約１０～少なくとも約３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、バーコードモチーフは、少なくとも約１０～少なくとも約２０ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、タグは、例えば、正確なスパイキングを可能にするために、標準化された濃度で調製される。スパイクイン 対 テンプレートの質量比が、直接関連する分析（例えば、シークエンシング分析、特に、次世代シークエンシング分析）におけるスパイクイン由来の読み取りのパーセンテージに十分に相関することは、代表的には好ましい。
いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約０．０００１％～少なくとも約１０％のサンプルに対するタグの濃度で、サンプルへとスパイクされる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約０．００１％～少なくとも約２％のサンプルに対するタグの濃度でサンプルへとスパイクされる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約０．０１％～少なくとも約２％のサンプルに対するタグの濃度でサンプルへとスパイクされる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約０．１％～少なくとも約２％のサンプルに対するタグの濃度でサンプルへとスパイクされる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約１％～少なくとも約２％のサンプルに対するタグの濃度でサンプルへとスパイクされる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約０．００１％～少なくとも約１％のサンプルに対するタグの濃度でサンプルへとスパイクされる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約０．０１％～少なくとも約１％のサンプルに対するタグの濃度でサンプルへとスパイクされる。いくつかの実施形態において、タグは、少なくとも約０．１％～少なくとも約１％のサンプルに対するタグの濃度でサンプルへとスパイクされる。ある特定の好ましい実施形態において、サンプルに対するタグの比は、１００～１００，０００のサンプル読み取りあたり、少なくとも約１種のタグ読み取りを生じる。
反復構造を有する高分子量タグの使用は、標的化されたポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」；（例えば、ＡＭＰＬＩＳＥＱ））またはハイブリダイゼーションベースの捕捉技術のいずれかを使用してタグにおけるスパイクを捕捉するために、保存された配列（例えば、本明細書で例示されるとおりの配列エレメントＡおよびＣ）の使用を可能にすることは、認識される。
タグのセット
いくつかの実施形態において、本開示は、例えば、複数の別個のサンプルを個々にマークする／標識するために、一緒に（例えば、多重化シークエンシング分析において）利用され得る場合、本明細書で記載されるとおりのタグのセットを提供する。いくつかの実施形態において、セット内の異なるタグは、関連する構造を有する。一例を挙げると、いくつかの実施形態において、セットの中の全てのタグは、共通するＡおよび／またはＣエレメントを有し得るが、それらのＢエレメントにおいて互いとは異なり得る。いくつかのこのような実施形態において、セット内の全てのタグが、匹敵するかまたは同一の長さおよび／またはＧＣ含有量などであるが、異なる正確な配列のＢエレメントを有し得る。
いくつかの実施形態において、本開示は、例えば、複数の別個のサンプルを個々にマークする／標識するために、一緒に（例えば、多重化シークエンシング分析において）利用され得る場合、本明細書で記載されるとおりのタグのセットを提供する。いくつかの実施形態において、セット内の異なるタグは、関連する構造を有する。一例を挙げると、いくつかの実施形態において、セットの中の全てのタグは、共通するＡおよび／またはＣエレメントを有し得るが、それらのＢエレメントにおいて互いとは異なり得る。いくつかのこのような実施形態において、セット内の全てのタグが、匹敵するかまたは同一の長さおよび／またはＧＣ含有量などであるが、異なる正確な配列のＢエレメントを有し得る。
例えば、いくつかの実施形態において、提供されるタグのセット（例えば、複数のタグ集団を含む集まり）は、以下の式のセット：
セット１： タグ１、タグ２、 …、タグＮ
タグ１： Ｘ１－［Ａ１－Ｂ１－Ｃ１］ｎ１－Ｙ１
タグ２： Ｘ２－［Ａ２－Ｂ２－Ｃ２］ｎ２－Ｙ２
タグＮ： Ｘ３－［ＡＮ－ＢＮ－ＣＮ］ｎＮ－ＹＮ；
によって表され得る。いくつかの実施形態において、ｎ１、ｎ２、およびｎＮは、全て同じである（すなわち、セットの中の全てのタグは、同じ長さを有する）；いくつかの実施形態において、ｎ１、ｎ２、およびｎＮは、匹敵する（すなわち、セットの中の全てのタグは、匹敵する長さを有する）。いくつかの実施形態において、セットの中の異なるタグは、異なる長さを有し得る。
セット１： タグ１、タグ２、 …、タグＮ
タグ１： Ｘ１－［Ａ１－Ｂ１－Ｃ１］ｎ１－Ｙ１
タグ２： Ｘ２－［Ａ２－Ｂ２－Ｃ２］ｎ２－Ｙ２
タグＮ： Ｘ３－［ＡＮ－ＢＮ－ＣＮ］ｎＮ－ＹＮ；
によって表され得る。いくつかの実施形態において、ｎ１、ｎ２、およびｎＮは、全て同じである（すなわち、セットの中の全てのタグは、同じ長さを有する）；いくつかの実施形態において、ｎ１、ｎ２、およびｎＮは、匹敵する（すなわち、セットの中の全てのタグは、匹敵する長さを有する）。いくつかの実施形態において、セットの中の異なるタグは、異なる長さを有し得る。
いくつかの実施形態において、上記のように、Ａ１、Ａ２、およびＡＮは、全て同じである（すなわち、セットの中の全てのタグは、共通する「Ａ」エレメントを有する）、および／またはＣ１、Ｃ２、およびＣＮは、全て同じである（すなわち、セットの中の全てのタグは、共通する「Ｃ」エレメントを有する）。いくつかの実施形態において、各Ｂは、タグのセット間で互いのＢとは異なる。いくつかの実施形態において、各Ｂは、タグ内の互いのＢとは異なっていてもよいし、異なっていなくてもよい。
本明細書で記載されるとおりのセットの中のタグの一般化された構造に従ういくつかの実施形態において、セット内の異なるタグが互いから区別可能であるが、例えば、匹敵する処理条件に曝される場合にサンプルを特有に同定するために、タグとして有効に機能するために十分共通する特性または特徴を共有する限りにおいて、このようなタグは、少なくとも本明細書で記載されるとおりの適用に（例えば、多重シークエンシングのような多重化評価の状況において、が挙げられる）適していることが企図される。
いくつかの実施形態において、セット内のタグは、それらの編集距離と互いに関連している。本開示は、タグが約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０および３０超以下の編集距離を設定し、本明細書で記載されるように特に有用であり得るという見通しを提供する。いくつかの実施形態において、タグセットは、下限および上限による境界があり、上限が下限より高い範囲内の編集距離によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、その下限は２であり、その上限は３０であり、そしていくつかの実施形態において下限による境界がある範囲内のある特定の実施形態において、例えば、ＡおよびＣがタグ間で不変であり、Ｂが異なるようにされているタグのセットは、有利な特徴としての編集距離の使用が企図される。
本発明は、特に、本明細書で記載されるとおりの制限された編集距離を有するプライマーセットが、核酸サンプルをマークするためにときおり使用される他の技術と比較して、ある特定の利点を示すことを認める。例えば、本明細書で記載されるＱｕａｉｌ技術、および他の技術（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇプラットフォーム）は、代表的には、短い（例えば、約４～約１１の範囲内の）核酸を、サンプルにインデックスを付加する（「インデックス付加バーコード」）ためのバーコードまたはマーカー（または「アダプター」）として利用する。本開示は、処理およびシークエンシングの間の事象が、アダプターの配列に変化をもたらし得、その結果、例えば、バーコード１が、例えば、４という編集距離に起因してバーコード２と誤って同定される（すなわち、３つの変化がバーコード１へともたらされ、バーコード２として同定されている配列のコールを生じる）確率を、このような短いアダプターの使用が増大させるという見通しを提供する。
いくつかの実施形態において、大きな編集距離は、１つのタグを別のタグと誤って同定する確率を低減するように企図される。いくつかの実施形態において、少なくとも約４～少なくとも約１５の編集距離が企図される。いくつかの実施形態において、編集距離は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０である。いくつかの実施形態において、編集距離は、約４～約１５の間である。
本発明は、特に、大きな編集距離が他の利用可能な方法を超える利点があることを認識する。いくつかの実施形態において、その大きな編集距離は、潜在的に無限数のタグおよび組み合わせが生成され得るという可能性を許容する。その大きな編集距離に加えて、タグの反復性の性質は、次世代シークエンシングプラットフォームでの単一シークエンシング読み取りでの複数の可変（Ｂ）領域の問い合わせを可能にする。このことは、シークエンシングエラーおよび製造エラーに対してさらなる保護を提供し得る。
タグをマークする方法
本発明に従うタグは、いくつかの方法論を使用して生成され得る。いくつかの実施形態において、タグは、２本鎖ＤＮＡ環のライゲーション、続いて、多重置換増幅（ＭＤＡ）を介して生成される。いくつかの実施形態において、タグは、図２～５に示される例示的方法に従って生成される。
本発明に従うタグは、いくつかの方法論を使用して生成され得る。いくつかの実施形態において、タグは、２本鎖ＤＮＡ環のライゲーション、続いて、多重置換増幅（ＭＤＡ）を介して生成される。いくつかの実施形態において、タグは、図２～５に示される例示的方法に従って生成される。
図２を見ると、タグモノマー２００は、上側の鎖２０２および相補的な下側の鎖２０２’を含む２本鎖ＤＮＡである。一局面において、そのモノマー２００は、本明細書で記載されるとおりの式［Ａ－Ｂ－Ｃ］の少なくとも１個の特有のヌクレオチドタグモノマーを含み得る。モノマー２００の上側の鎖２０２は、５’突出部２０４を含み、下側の鎖２０２’は、５’突出部２０６を含む。本例では、突出部２０４は、突出部２０６に相補的である。よって、一方のモノマー２００の突出部２０４は、別のモノマー２００の突出部２０６にアニールされ得、そのアニールされたモノマー２００は、一緒に連結され得る。４個のモノマー２００の組み合わせの一例は、図２に直線状テトラマー２０８として示される。その直線状テトラマー２０８は、２本鎖環状テンプレート２１０を提供するために環化および連結され得る。顕著なことには、その環状テンプレート２１０は、モノマー２００の複数の反復ユニットを含む。環状テンプレート２１０は、式Ｘｉ－［Ａ－Ｂ－Ｃ］ｎ－Ｙｊを有する高分子量ＤＮＡタグ２１２を提供するために、本明細書で記載される技術のうちの１もしくはこれより多くのような方法を使用して複製され得る。一局面において、ｎは、モノマーまたは特定のモノマー配列の反復ユニットの数（代表的には少なくとも２）を表し、ＸおよびＹは、タグ２１２の末端に対して作製されたさらなる核酸または核酸改変を表す。
いくつかの実施形態において、タグは、小さな１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）環（例えば、テンプレート３３２、図３）を形成し、続いて、多重置換増幅（ＭＤＡ）を行うために連結される、ランダムまたは特異的タグモノマーオリゴヌクレオチドを使用して生成される。いくつかの実施形態において、タグは、図３Ａ、図３Ｂ、および図４に示される例示的方法に従って生成される。いくつかの実施形態において、タグは、複数の工程を含むかまたはこれら工程からなる方法に従って生成される。このような工程は、連続してまたは同時に起こり得、工程は、単一の工程へと合わせられ得、例えば、いくつかの実施形態において、第１の工程および第２の工程は、工程１、続いて工程２のような順序で行われ得るのに対して、いくつかの実施形態において、第１の工程および第２の工程は、単一の工程内で行われ得る。いくつかの実施形態において、第１の工程は、特異的タグの配置または縮重タグの限界希釈物のプレートへの配置を含むか、またはこれら配置からなる。
図３Ａを参照すると、タグを生成するための一例である方法３００は、特有のＢ領域またはバーコード配列を有する１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）タグモノマーを調製する工程３０２を包含する。工程３０４において、そのタグモノマーは、例えば、マルチウェルプレート（例えば、標準的な９６ウェルプレート）へとアレイ状にされる。その後、ｓｓＤＮＡタグモノマーの各々は、工程３０６において環化され得、工程３０８において増幅され得る。工程３１０において、その環化されたタグモノマーの増幅は、例えば、蛍光ベースの定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）または別の適切な技術を使用してモニターされ得る。一局面において、品質管理手段として増幅をモニターして、タグモノマーのうちのどれが成功裡に増幅された可能性があるかを決定することは有用であり得る。工程３１２において、工程３０８において増幅から生成された生成物は、成功裡の増幅をさらに確認しかつタグの各々がタグまたはタグモノマーの別のもので汚染されなかったことを担保するために、シークエンシングされ得る。種々の品質管理手段に合格したそれら生成物は、工程３１４においてさらなる使用のために選択され得る。
図３Ｂを参照すると、方法３００の一実施形態は、式［Ａ－Ｂ－Ｃ］を有するｓｓＤＮＡモノマー３１６で始まる。そのモノマー３１６は、ｉ）モノマー３１６に特有であるヌクレオチドバーコード配列を有するＢ領域３１８、ｉｉ）異なるモノマー３１６の間で保存されているヌクレオチド配列を有するＡ領域３２０、およびｉｉｉ）異なるモノマー３１６の間で保存されているヌクレオチド配列を有するＣ領域３２２を含む。いくつかの実施形態において、Ａ領域３２０のヌクレオチド配列は、Ｃ領域３２２のヌクレオチド配列とは異なり得る。
複数の異なるモノマー３２４（これは、モノマー３１６を含み得る）は、適切な物品（例えば、マルチウェルプレート３２６）へとアレイ状にされ、その結果、そのマルチウェルプレートの各ウェルが、異なるモノマー３２４の１個のモノマーを受容する。一局面において、確率論的アプローチがとられ得、それによって、モノマー３２４は、マルチウェルプレート３２６の各ウェルが、モノマー３２４のうちの０個または１個のいずれかを受容して、いずれか１個のウェルがモノマー３２４のうちの１個より多くを受容することを妨げるように希釈される。別の局面において、指向性のアプローチがとられ得、それによって、マルチウェルプレート３２６の各ウェルに、異なるモノマー３２４のうちの１個が直接提供され得る。例えば、その異なるモノマー３２４は、マルチウェルプレート３２６の各ウェルの中で、各ウェルがモノマー３２４のうちの異なる１個を含むように直接合され得る。
モノマー３２４をマルチウェルプレート３２６へとアレイ状にした後に、ブリッジオリゴ３２８は、次いで、マルチウェルプレート３２６のウェルの各々へと添加され得る。そのブリッジオリゴ３２８は、モノマー３２４の各々にアニールして、環状構築物３３０を形成し得る。本例において、例となる環状構築物３３０は、モノマー３１６を含み、ここでモノマー３１６の末端は、ブリッジオリゴ３２８の配列と比較して、モノマー３１６の末端の間にニックは存在するがヌクレオチドギャップは存在しないように、ブリッジオリゴ３２８に各々ハイブリダイズされる。この構成において、モノマー３１６の末端は、一緒に連結されて、環状テンプレート３３２を提供し得る。そのテンプレート３３２は、次いで、テンプレート３３２の配列に相補的な複数の連続する反復配列を有する長いｓｓＤＮＡ ３３４を提供するために、例えば、ＭＤＡを使用して増幅され得る。第２鎖合成およびｓｓＤＮＡ ３３４のその後の増幅は、本開示に従う高分子量２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を提供するために、逆方向プライマー３３６および正方向プライマー３３８を通じて達成され得る。一局面において、その得られたタグは、式Ｘｉ－［Ａ－Ｂ－Ｃ］ｎ－Ｙｊを有し、ここでｎは、モノマーまたは特定のモノマー配列の反復ユニットの数（代表的には、少なくとも２）を表し、ＸおよびＹは、タグの末端に対して作製されるさらなる核酸または核酸改変を表す。
ここで図４を見ると、図３Ｂに示されるマルチウェルプレート３２６におけるウェルの各々は、ｄｓＤＮＡタグを生じ得る。所定のウェルが１個の特有のバーコード配列を含むタグを生じたか否かを決定するために、１もしくはこれより多くの品質管理手段がとられ得る。例えば、図３Ａおよび図３Ｂに記載され示される方法は、第１の増幅生成物４０２、第２の増幅生成物４０４、第３の増幅生成物４０６、第４の増幅生成物４０８、および第５の増幅生成物４１０を含む複数の増幅生成物４００を生じ得る。第１の生成物４０２、第２の生成物４０４、および第３の生成物４０６の各々は、タグの単一のタイプを含む組成物であり、ここでそのタグの各々が同じ特有のモノマー配列を含む（すなわち、そのモノマーが特有のバーコード配列を含む）ことが決定された。例えば、第１の生成物４０２は、特有のモノマー４１２を含む反復ユニットを含むのみであり、第２の生成物４０４は、特有のモノマー４１４を含む反復ユニットを含むのみであり、そして第３の生成物４０６は、特有のモノマー４１６を含む反復ユニットを含むのみである。
場合によっては、図３Ａおよび図３Ｂに記載され示される方法は、２個もしくはこれより多くの異なるモノマーまたはタグで汚染されている生成物を生じ得る。一例では、生成物４０８は、モノマー４１４およびモノマー４１６の両方を含む異種のタグ配列を含むことが決定された。別の例では、生成物４１０は、少なくとも２種の異なる均質なタグの混合物を含むことが決定された。すなわち、生成物４１０は、生成物４０２および生成物４０４の混合物である。顕著なことには、２種もしくはこれより多くのタグ、２種もしくはこれより多くのモノマー配列、またはこれらの組み合わせを含む不均質の生成物の他の繰り返しは、可能であり得る。さらに、シークエンシングベースの品質管理手段は、さらに（または代わりに）モノマーの各々の信頼性（例えば、欠失、置換、または他の同様のものの合成エラーの存在）を決定するために使用され得る。
いくつかの実施形態において、縮重は、合成の間に特定のオリゴヌクレオチド位置において全４塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）の組み込みを可能にする方法で合成されるオリゴヌクレオチドの混合物を含む：
例えば、ＡＣＧＣＧＡＣＧＮＮＮＮＮＮＴＧＧＧＡＣＧＡは、縮重として特徴付けられるべき基準を満たす。例示された配列でのオリゴヌクレオチド合成は、６個の連続する縮重ヌクレオチドの存在および４種の異なる塩基（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣ）の使用に起因して、４６のオリゴヌクレオチドを生じる。
例えば、ＡＣＧＣＧＡＣＧＮＮＮＮＮＮＴＧＧＧＡＣＧＡは、縮重として特徴付けられるべき基準を満たす。例示された配列でのオリゴヌクレオチド合成は、６個の連続する縮重ヌクレオチドの存在および４種の異なる塩基（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣ）の使用に起因して、４６のオリゴヌクレオチドを生じる。
いくつかの実施形態において、第２の工程は、ブリッジオリゴヌクレオチドをアニールして、タグオリゴヌクレオチドを環化し、次いで、ニックを連結する工程を包含するかまたはこの工程からなる。いくつかの実施形態において、第３の工程は、ＭＤＡを鎖置換ポリメラーゼ（例えば、ｐｈｉ２９（φ２９）ＤＮＡポリメラーゼまたはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ）で行う工程を含むかまたはこの工程からなる。このようなポリメラーゼの使用は、このようなポリメラーゼの校正特徴および高信頼性の性能に起因して有利であることが企図される。いくつかの実施形態において、第４の工程は、少なくとも１種のＭＤＡ生成物の次世代シークエンシングによってタグ同一性および純度を確認する工程を含むかまたはこの工程からなる。
いくつかの実施形態において、タグは、ロングレンジＰＣＲを使用して生成される。いくつかの実施形態において、タグは、図５Ａおよび図５Ｂに示される例示的方法に従って生成される。いくつかの実施形態において、提供されるタグは、校正活性を有する高信頼性のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、φ２９）を使用して生成される。
図５Ａを見ると、タグを生成するための一例である方法５００は、特有の１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）モノマーを調製する工程５０２を包含する。工程５０４において、そのモノマーは、例えば、マルチウェルプレート（例えば、標準的な９６ウェルプレート）へとアレイ状にされる。その後、そのｓｓＤＮＡモノマーの各々は、工程５０６において増幅され得る。次いで、その増幅されたタグモノマーは、末端から末端への様式で一緒に連結されて、工程５０８において個々のタグモノマーから構成されるマルチマーを提供し得る。工程５０８は、そのタグマルチマーを（例えば、ライゲーションを介して）環化して、環状テンプレートのセットを提供する工程をさらに包含し得る。一局面において、そのライゲーションおよび環化は、１つの協奏反応工程において起こり得るのに対して、別の局面において、そのライゲーションおよび環化は、連続的反応工程において起こり得る。工程５１０において、その環化生成物は増幅され得、その環化したマルチマーの増幅は、例えば、蛍光ベースのｑＰＣＲまたは別の適切な技術を使用してモニターされ得る。一局面において、品質管理手段として増幅をモニターして、そのモノマーのうちのどれが成功裡に増幅された可能性があるかを決定することは、有用であり得る。工程５１２において、工程５１０における増幅から生じた生成物は、成功裡の増幅をさらに確認しかつそのタグの各々がタグもしくはモノマーの別のもので汚染されなかったことを担保するために、シークエンシングされ得る。種々の品質管理手段に合格したそれら生成物は、工程５１４におけるさらなる使用のために選択され得る。
図５Ｂを参照すると、方法５００の一実施形態は、式［Ａ－Ｂ－Ｃ］を有するｓｓＤＮＡモノマー５１６で始まる。そのモノマー５１６は、ｉ）モノマー５１６に特有のヌクレオチドバーコード配列を有するＢ領域５１８、ｉｉ）異なるモノマー５１６の間で保存されているヌクレオチド配列を有するＡ領域５２０、およびｉｉｉ）異なるモノマー５１６の間で保存されているヌクレオチド配列を有するＣ領域５２２を含む。いくつかの実施形態において、Ａ領域５２０のヌクレオチド配列は、Ｃ領域５２２のヌクレオチド配列とは異なり得る。
複数の異なるモノマー５２４（これらは、モノマー５１６を含み得る）は、適切な物品（例えば、マルチウェルプレート５２６）へと、そのマルチウェルプレートの各ウェルが、異なるモノマー５２４のうちの１個を受容するようにアレイ状にされる。一局面において、確率論的アプローチがとられ得、それによって、そのモノマー５２４は、マルチウェルプレート５２６の各ウェルが、そのモノマー５２４のうちの０個または１個のいずれかを受容して、任意の１個のウェルがモノマー５２４のうちの１個より多くを受容することを妨げるように、希釈される。別の局面において、指向性のアプローチがとられ得、それによって、マルチウェルプレート５２６の各ウェルには、異なるモノマー５２４のうちの１個が直接提供され得る。例えば、その異なるモノマー５２４は、マルチウェルプレート５２６の各ウェルにおいて、各ウェルがモノマー５２４のうちの異なる１個を含むように直接合成され得る。
モノマー５２４をマルチウェルプレート５２６へとアレイ状にした後、プライマー５２８のセットは、次いで、マルチウェルプレート５２６のウェルの各々に添加され得る。プライマー５２８は、モノマー５２４の各々にアニールして、モノマー５２４の複数のコピーを形成し得る。本例において、モノマー５１６は、プライマー５２８によって増幅されると示される。そこで２本鎖モノマー５１６’のコピーは、次いで、一緒に連結されて、そのモノマー５１６’のモノマーの複数のコピーから構成される中間の直線状構築物５３０を形成し得る。その直線状構築物５３０は、環化および連結されて、モノマー５１６’の多くの反復ユニットを含む環状２本鎖テンプレート５３２を提供し得る。テンプレート５３２は、次いで、テンプレート５３２の複数の連続反復配列を有する長いｓｓＤＮＡタグ５３４を提供するために、例えば、ＭＤＡを使用して増幅され得る。その結果、タグ５３４は、式Ｘｉ－［Ａ－Ｂ－Ｃ］ｎ－Ｙｊを有する。一局面において、ｎは、モノマーまたは特定のモノマー配列の反復ユニットの数（代表的には、少なくとも２）を表し、そしてＸおよびＹは、タグ５３４の末端に作製されるさらなる核酸または核酸改変を表す。
いくつかの実施形態において、スパイクインタグは、サンプルインデックス付加バーコードクロストークを決定および較正するために使用される。例えば、サンプルインデックス付加バーコード（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプラットフォームでは、インデックスとしても公知であり、これは、例えば、２４個の別個のインデックスを有し得る）は、代表的には、シークエンシング分析処理の一部として含まれる。そのインデックスは、サンプル特異的インデックスに基づいて、得られる配列のその後の分割とともに、混合物としての複数のライブラリーを同時にシークエンシングするために使用される。このようなバーコードはしばしば、インデックス付加バーコード間の編集距離が小さいように、短い長さの核酸から構成される。このことは、所定のバーコードが、処理の間の累積シークエンシング変化に起因して、別のバーコードと誤って同定され得る統計的確率を増大させる。本発明に従うスパイクインタグは、配列分析に関するこの問題を克服および／または較正するために有用である。
いくつかの実施形態において、本発明に従うタグは、限界希釈で調製され、ここで限界希釈の使用は、縮重オリゴヌクレオチドを含み、このような希釈は、ほぼ完全に特有のバーコード（例えば、これまでにシークエンシングしたことがあるあらゆるサンプルに関して１つの特有のタグシグネチャー）の生成を可能にする。
いくつかの実施形態において、縮重オリゴヌクレオチドの使用は、単一のオリゴヌクレオチド合成で多くの特有のオリゴヌクレオチドの生成を可能にする。他の公知の方法と比較して、本発明は、縮重オリゴヌクレオチドおよび限界希釈の使用によって、コストおよび労働節約手段のような利点を提供することは、認識される。配列ＮＮＮＮのオリゴヌクレオチドに関して一例を与えるために、４４（すなわち、２５６）のオリゴヌクレオチドが、混合物中に生成される。次いで、限界希釈アプローチを使用して、わずかおよそ１個のオリゴヌクレオチド／ウェルへと希釈すると（例えば、ウェルプレート形式を使用すれば）、４４ オリゴヌクレオチドが、４４の合成を行う必要なしに得られ得る。
当業者は、本開示を読めば、提供されるタグが、種々のアッセイのうちのいずれかにおいて、このようなアッセイのための種々のプラットフォームのうちのいずれかとともに利用され得ることを認識する。特に、提供されるタグは、任意のハイスループット（例えば、ＮＧＳ）シークエンシングプラットフォームにおいて有用である。さらになお、提供されるタグは、長い読み取りのシークエンシング適用（例えば、ＰＡＣＢＩＯ、ＯＸＦＯＲＤ ＮＡＮＯＰＯＲＥ、ＧＥＮＩＡ）において有用である。
コンビナトリアルサンプルタグ化
いくつかの実施形態において、コンビナトリアルサンプルタグ化は、本発明に従って使用される。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、３８４程度の少なさのタグとともに、およびサンプルあたり３種もしくは４種のタグを使用すると、サンプルあたり３種および４種のタグの各々が可能にした特有の組み合わせは、Ｃ（３８４，３）＝９，３６３，５８４およびＣ（３８４，４）＝８９１，８８１，３７６の特有の組み合わせであることは、可能である。いくつかの実施形態において、このような組み合わせは、その施設を通じて移動するあらゆるサンプルを特有にタグ化するためのシークエンシングコアを可能にする。さらに、３８４種のタグの別のセットと組み合わせると、地球上のあらゆる個体を特有にタグ化することが可能である。
いくつかの実施形態において、コンビナトリアルサンプルタグ化は、本発明に従って使用される。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、３８４程度の少なさのタグとともに、およびサンプルあたり３種もしくは４種のタグを使用すると、サンプルあたり３種および４種のタグの各々が可能にした特有の組み合わせは、Ｃ（３８４，３）＝９，３６３，５８４およびＣ（３８４，４）＝８９１，８８１，３７６の特有の組み合わせであることは、可能である。いくつかの実施形態において、このような組み合わせは、その施設を通じて移動するあらゆるサンプルを特有にタグ化するためのシークエンシングコアを可能にする。さらに、３８４種のタグの別のセットと組み合わせると、地球上のあらゆる個体を特有にタグ化することが可能である。
キット
本発明はまた、本発明に従う少なくとも１種のタグを含む１もしくはこれより多くの容器を有するパッケージユニットを含むキット形式を企図する。いくつかの実施形態において、キットは、タグ再構成または希釈に使用される種々の試薬の容器を含む。いくつかの実施形態において、キットは、例えば、ＰＣＲ、処理および／またはシークエンシング分析のために使用される種々の試薬の容器を含む。いくつかの実施形態において、キットはまた、緩衝液、説明書、およびコントロールのうちの少なくとも１もしくはこれより多くを含み得る。
本発明はまた、本発明に従う少なくとも１種のタグを含む１もしくはこれより多くの容器を有するパッケージユニットを含むキット形式を企図する。いくつかの実施形態において、キットは、タグ再構成または希釈に使用される種々の試薬の容器を含む。いくつかの実施形態において、キットは、例えば、ＰＣＲ、処理および／またはシークエンシング分析のために使用される種々の試薬の容器を含む。いくつかの実施形態において、キットはまた、緩衝液、説明書、およびコントロールのうちの少なくとも１もしくはこれより多くを含み得る。
タグの使用法
本発明に従うタグのための種々の使用は、企図される。いくつかの実施形態において、サンプルは、サンプルと少なくとも１種もしくはこれより多くのタグとを接触させることによってタグ化される。いくつかの実施形態において、ゼロまたは少なくとも１種もしくはこれより多くのタグが、サンプル収集の前、間、または直後に、サンプルを含む容器へとスパイクインされる。いくつかの実施形態において、ゼロまたは少なくとも１種もしくはこれより多くのタグが、処理の前、間、または後に、サンプルへとスパイクインされる。いくつかの実施形態において、０、１種もしくはこれより多くのタグが、分離前または分離後にサンプルへとスパイクインされる。いくつかの実施形態において、０、１種もしくはこれより多くのタグが、精製前または精製後にサンプルへとスパイクインされる。いくつかの実施形態において、０、１種もしくはこれより多くのタグが、下流の処理および／または分析が起こっている容器へとスパイクインされる。いくつかの実施形態が、シークエンシングエラーを決定および較正するための手段として、合成のスパイクインタグの使用を可能にし得ることは、認識される。このような決定および較正は、例えば、公知配列および可変配列の高い信頼性の生成に基づき、ここでミスマッチが配列の後ろに、観察された配列アラインメントと予測された配列アラインメントとの間に観察される場合、このようなミスマッチが、サンプルを分析するために使用されるシークエンシングプロセスの化学および／または塩基コーリングに起因し得ると高い信頼度で決定され得ることを合理的に確信し得る。
本発明に従うタグのための種々の使用は、企図される。いくつかの実施形態において、サンプルは、サンプルと少なくとも１種もしくはこれより多くのタグとを接触させることによってタグ化される。いくつかの実施形態において、ゼロまたは少なくとも１種もしくはこれより多くのタグが、サンプル収集の前、間、または直後に、サンプルを含む容器へとスパイクインされる。いくつかの実施形態において、ゼロまたは少なくとも１種もしくはこれより多くのタグが、処理の前、間、または後に、サンプルへとスパイクインされる。いくつかの実施形態において、０、１種もしくはこれより多くのタグが、分離前または分離後にサンプルへとスパイクインされる。いくつかの実施形態において、０、１種もしくはこれより多くのタグが、精製前または精製後にサンプルへとスパイクインされる。いくつかの実施形態において、０、１種もしくはこれより多くのタグが、下流の処理および／または分析が起こっている容器へとスパイクインされる。いくつかの実施形態が、シークエンシングエラーを決定および較正するための手段として、合成のスパイクインタグの使用を可能にし得ることは、認識される。このような決定および較正は、例えば、公知配列および可変配列の高い信頼性の生成に基づき、ここでミスマッチが配列の後ろに、観察された配列アラインメントと予測された配列アラインメントとの間に観察される場合、このようなミスマッチが、サンプルを分析するために使用されるシークエンシングプロセスの化学および／または塩基コーリングに起因し得ると高い信頼度で決定され得ることを合理的に確信し得る。
本発明は、例えば、タグの反復ユニット配置の利益が、所定のサンプルへとスパイクされたタグのパーセンテージが小さくても、各タグの多くコピーが分析、例えば、シークエンシングされるということを含むことを認識する。
いくつかの実施形態において、エラー較正は、例えば、シークエンシングプロセスが冒すエラーの特定のシステム上のタイプ、例えば、Ｇ＞Ｃ変異が、ＳＮＰコーリングアルゴリズムを、偽陽性結果のこのタイプに対して重み付けする統計モデルの開発における使用を可能にする場合に、使用され得る。
いくつかの実施形態において、タグ配列は、特定のＤＮＡモチーフ／配列タイプ（例えば、反復、ヘアピンなど）をシークエンシングする際にシークエンシングプロセスがどの程度良好か、または分析プラットフォームにおける参照配列（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングにおけるｐｈｉＸゲノム）の使用を評価するために使用され得る。本発明の合成配列が、既知の生物のゲノムに由来するコントロールを使用するプラットフォームに対する比較において使用することに関する利点を提供することは、認識される。
以下の実施例は、例証であることが意味されるのであって、限定するとは如何様にも意図されない。
実施例１：高分子量（ＨＭＷ）タグの生成
高分子量２本鎖ＤＮＡタグを、以下で記載される成分および方法論を使用して生成した。
高分子量２本鎖ＤＮＡタグを、以下で記載される成分および方法論を使用して生成した。
単一の規定された６０マーのＤＮＡオリゴを、プライミング不変区分（領域Ａ）および（領域Ｃ）ならびにタグ領域（領域Ｂ；タグ１またはタグ２のいずれかとしてマークした）で設計した。異なるスパイクインタグを生成するために使用されるオリゴを、同一の不変領域ＡおよびＣを有するが、異なるタグまたはＢ領域を有するように設計した（すなわち、タグ１およびタグ２）。
タグ１ Ｂ領域を含む第１のオリゴ（ＲＣＡ＿タグ＿１）は、以下の配列を有した：
ＲＣＡ＿タグ＿１：
この第１のオリゴ（配列番号１）は、以下の配列を有するＡ領域、Ｂ領域、およびＣ領域を含んだ：
ＲＣＡ＿タグ＿１：
この第１のオリゴ（配列番号１）は、以下の配列を有するＡ領域、Ｂ領域、およびＣ領域を含んだ：
タグ２ Ｂ領域を含む第２のオリゴ（ＲＣＡ＿タグ＿２）は、以下の配列を有した：
RCA_タグ_2:
この第２のオリゴ（配列番号５）は、上記第１のオリゴ（配列番号１）のＡ領域（配列番号２）およびＣ領域（配列番号４）を含んだ。しかし、この第２のオリゴは（配列番号５）は、タグ２配列を有する異なるＢ領域を含んだ：
Ｂ領域（タグ２）：
RCA_タグ_2:
この第２のオリゴ（配列番号５）は、上記第１のオリゴ（配列番号１）のＡ領域（配列番号２）およびＣ領域（配列番号４）を含んだ。しかし、この第２のオリゴは（配列番号５）は、タグ２配列を有する異なるＢ領域を含んだ：
Ｂ領域（タグ２）：
上記第１のオリゴ（配列番号１）および上記第２のオリゴ（配列番号５）を、以下の配列を有するブリッジオリゴ（ＲＣＡ＿タグ＿ブリッジ）を使用して環化した：
ブリッジオリゴ（ＲＣＡ＿タグ＿ブリッジ）：
ブリッジオリゴ（ＲＣＡ＿タグ＿ブリッジ）：
ニックを連結して、６０塩基のｓｓＤＮＡ環を作った。
正方向および逆方向プライマー（それぞれ、ＲＣＡ＿ＰＣＲ＿ＦおよびＲＣＡ＿ＰＣＲ＿Ｒ）、ならびにφ２９ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、そのオリゴをＭＤＡによって増幅した。その正方向および逆方向プライマーは、以下の配列を有した：
正方向プライマー(RCA_PCR_F):
逆方向プライマー(RCA_PCR_R):
正方向プライマー(RCA_PCR_F):
逆方向プライマー(RCA_PCR_R):
２本鎖であることを、制限酵素ＨａｅＩＩＩ（認識配列＝ＧＧＣＣ）で切断することによって試験した。
上記第１のオリゴ（配列番号１）および上記第２のオリゴ（配列番号５）を個々に合わせ、ブリッジオリゴ（配列番号７）とアニールして、環状構造を形成し（例えば、３３０、図３Ｂ）、そしてＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用してニックを連結した。次に、過剰なプライマーＲＣＡ＿ＰＣＲ＿Ｆ（配列番号８）およびＲＣＡ＿ＰＣＲ＿Ｒ（配列番号９）を添加した。上記ブリッジオリゴ（配列番号７）は、φ２９または別の鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ｓｓＤＮＡ合成をプライムする。
本実施例の方法は、不変領域およびタグ領域を含む反復ユニットを有する長い１本鎖を生じた。例えば、２個の反復ユニット（すなわち、［Ａ－Ｂ－Ｃ］２）を含む増幅生成物は、以下の配列を有する：
ＲＣＡ＿ＰＣＲ＿Ｆプライマー（配列番号８）を、その得られたｓｓＤＮＡ増幅生成物（例えば、配列番号１０）へとアニールしたところ、そのポリメラーゼが逆方向の鎖を合成することが可能になった。この後に、上記ＲＣＡ＿ＰＣＲ＿Ｒプライマー（配列番号９）は、新たに合成された鎖上でのＤＮＡ合成をプライムした。環状テンプレート（配列番号１；配列番号５）、ブリッジオリゴ（配列番号７）、ＲＣＡ＿ＰＣＲ＿Ｆ（配列番号８）およびＲＣＡ＿ＰＣＲ＿Ｒ（配列番号９）を一緒に、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼと合わせると、指数関数的な、等温性の、反復構造を有する長い２本鎖高分子量ＤＮＡ（例えば、配列番号１０）の生成を生じた。
特に、ＲＣＡ＿タグ＿１（配列番号１）およびＲＣＡ＿タグ＿ブリッジ（配列番号７）オリゴを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ ８．０中に、１００ｐｍｏｌ／μｌ（μＭ）になるように再懸濁して、オリゴストック溶液を提供した。
オリゴストック溶液を、アニーリング緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ １ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＮａＣｌ）で１／１００希釈した。
アニーリングを、１０μｌ（４００ｎｇ、１０ｐｍｏｌ）のＲＣＡ＿タグ＿１（配列番号１）およびＲＣＡ＿タグ＿ブリッジ（配列番号７）オリゴで、２０μｌ反応容積中で標準的なアニーリング条件（９０℃で３０秒、続いて、４℃へと０．２℃／秒ずつ低下）を使用して、行った。濃度は、０．５ｐｍｏｌ／μｌまたは３０ｎｇ／μｌであると計算された。
次の工程では、そのアニールされたオリゴのうちの２μｌ（６０ｎｇ）を、ＫＡＰＡ迅速ライゲーションキットを使用して、１０μｌ ２×リガーゼ緩衝液、２μｌ テンプレート（１ｐｍｏｌ）、１μｌ Ｔ４リガーゼ（２５Ｕ）、７μｌ 水を含む２０μｌ 反応ミックス中、室温（ＲＴ）において１５分間で連結した。クリーンアップは行わなかった。テンプレート濃度は、０．０５ｐｍｏｌ／μｌ、または３×１０１０コピー／μｌであると計算された。
次に、ライゲーション生成物のうちの１μｌを、３００μｌ １０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌへと希釈したところ、１×１０８コピー／μｌ（１００～２００ｐｇ／μｌ）を生じた。
ＭＤＡを、以下の工程において詳述されるとおりの環状テンプレートの希釈シリーズを使用して行った。
φ２９ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，カタログ番号Ｍ０２６９Ｓ）を有する２０μｌ 増幅反応混合物を、以下のとおりに調製した：０．５μｌ φ２９（５Ｕ）、２μｌ １０×φ２９緩衝液、０．２μｌ １００×ＢＳＡ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ（各々、０．４μｌ～２００μＭ）、１μｌ ２０×ＫＡＰＡ ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ染料、水を２０μｌになるまで。増幅のために、その反応混合物を、合計２００読み取りのためのグリーンチャネルを使用して、２分ごとに蛍光測定値を集めながら、３０℃で４００分間維持した。
プライマーＲＣＡ＿ＰＣＲ＿Ｆ（配列番号８）、ＲＣＡ＿ＰＣＲ＿Ｒ（配列番号８）、またはその両方を、その反応物に最終濃度０．５μＭになるように添加した。テンプレート反応（ＮＴＣ）およびプライマーコントロール反応は含めなかった。
増幅を、Ｑｉａｇｅｎ Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ機器でＳＹＢＲグリーンを使用してモニターした。その反応を、完了するまで１２時間進行させた（図７）。
ＤＮＡを、１×Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズを使用して精製し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ中で溶離し、分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ １０００）を使用して定量し、１０ｎｇ／μｌへと正規化した。
得られたＤＮＡのアリコートを、ＨａｅＩＩＩ制限酵素で消化して、得られたＤＮＡが完全に２本鎖であることを確認した。その消化生成物を、ゲル電気泳動によって分析した（図６）。
ＭＤＡ反応を完了するまで３０℃で進ませると、＞３μｇの精製した生成物を生じる（数千回ものシークエンシング反応に等価）。
生成物は、アガロースゲル上で高分子量ＤＮＡとして移動するようである（ウェル中の大部分の残渣）。
ＨａｅＩＩＩ制限酵素（反復ごとに１個の部位）で消化したＨＭＷ物質は、低分子量物質に分解する。従って、その物質の大部分は、２本鎖ＤＮＡであるようである。
ＮＴＣは、一晩のインキュベーション後に検出可能な生成物を生じない。
正方向（ＲＣＡ＿ＰＣＲ＿Ｆ）および逆方向（ＲＣＡ＿ＰＣＲ＿Ｒ）プライマー、ならびに正方向プライマー単独での増幅は、指数関数的である。
連結されていない環状物なしでの反応は、生成物を作製しない。
反応は、３時間後にプラトーに達する。
実施例２：例えば、２つのライブラリーがタグ１でタグ化されたＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームのためのシークエンシングライブラリーの生成
実施例１の既知質量のタグ１を、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の既知質量のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）へとスパイクし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ適合ライブラリーを、ＫＡＰＡ Ｈｙｐｅｒ Ｐｌｕｓライブラリー調製キットで作製した。
実施例１の既知質量のタグ１を、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の既知質量のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）へとスパイクし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ適合ライブラリーを、ＫＡＰＡ Ｈｙｐｅｒ Ｐｌｕｓライブラリー調製キットで作製した。
そのスパイクインしたライブラリーをシークエンシングし、それを、タグ１が推定量で検出可能であるか否かを決定した。
タグ１ ＨＭＷ物質を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ中で、１ｎｇ／μｌおよび２０ｐｇ／μｌへと希釈した。精製タグ１ ＭＤＡ生成物を、５０ｎｇまたは１ｎｇのＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｇＤＮＡ（すなわち、それぞれ、１ｎｇおよび２０ｐｇのＭＤＡ生成物；ライブラリー１および２）へと２質量％で添加した。
スパイクインタグなしのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｇＤＮＡ由来のライブラリー（５０ｎｇおよび１ｎｇ）を、同時に構築した（ライブラリー３および４）。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ適合ライブラリーを、ＫＡＰＡ Ｈｙｐｅｒ Ｐｌｕｓライブラリー調製キットを使用して作った（製造業者の説明書に従って、ＤＮＡの３０分間の剪断、続いて、Ａテール付加およびアダプターライゲーション）。
ライブラリー調製の後、５０ｎｇ ライブラリーをＰＣＲ増幅なしで使用した一方で、１ｎｇ ライブラリーを１２サイクルにわたって増幅して、５０ｎｇ ライブラリーと同量の最終生成物連結ライブラリーを得た。
ｑＰＣＲを、スパイクイン特異的プライマーＲＣＡ＿ＰＣＲ＿Ｆ（配列番号８）およびＲＣＡ＿ＰＣＲ＿Ｒ（配列番号８）とともにライブラリーに対して行って、スパイクインタグ物質がそのライブラリーの一部になったか否かおよびその増幅したライブラリーがタグ 対 ライブラリーの同じ比を保持したか否かを決定した（図８）。
ライブラリーをプールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑプラットフォームでシークエンシングした。
トリミングされたＩｌｌｕｍｉｎａ配列を、タグ１配列に整列させて、タグ１に由来する読み取りのパーセンテージを決定した（図９）。図９を参照すると、反復する［Ａ－Ｂ－Ｃ］モノマー配列のＡ領域は９００で、Ｂ領域は９０２で、ならびにＣ領域は、９０４ａおよび９０４ｂで示される。顕著なことには、そのＣ領域は、そのタグ配列の反復する性質に起因して、図示された読み取りの両方の末端に示される。
４つのライブラリーのシークエンシングの後に、タグ１配列の読み取りを、ｂｌａｓｔｎを使用してマッピングし、タグ１由来読みとりのパーセンテージを計数した。タグ１の数：マッチング読み取りは、以下のとおりであった：
ライブラリー１： ４０００読み取り（合計のうちの０．８％）
ライブラリー２： ６５００読み取り（合計のうちの１．３％）
ライブラリー３： ０読み取り（合計のうちの０％）
ライブラリー４： ０読み取り（合計のうちの０％）
ライブラリー１： ４０００読み取り（合計のうちの０．８％）
ライブラリー２： ６５００読み取り（合計のうちの１．３％）
ライブラリー３： ０読み取り（合計のうちの０％）
ライブラリー４： ０読み取り（合計のうちの０％）
ｑＰＣＲは、タグ１ ＨＭＷ物質の２％でスパイクしたライブラリーが、１２サイクルのライブラリー増幅を受けているにも拘わらず、タグ１由来ライブラリー挿入物の等しい割合を保持することを示した（図８）。
脱複合化の後、少なくとも５００，０００読み取りを、ライブラリー１～４の各々に関して得た。
タグ１由来読み取りは、構造が規則的である。すなわち、その可変領域は、不変領域に隣接している（図９）。
［（不変Ａ領域）－（可変Ｂ領域）－（不変Ｃ領域）］の反復ユニットの存在は、ＨＭＷタグ１ ＤＮＡがコンカテマーであることを示した。
タグ１ ＨＭＷは、比較的少ないエラーを含み、わずか数個のミスマッチが観察される。これは、シークエンシングエラーに起因させることはできない可能性がある。
一局面において、タグ１ ＨＭＷ ＤＮＡのスパイクインは、配列分析の後にタグ化ライブラリーの同定を可能にした。さらに、タグ１ ＨＭＷ ＤＮＡのスパイクインは、非常に少量（１ｎｇ）および多量（５０ｎｇ）のテンプレートＤＮＡにおいて有効であった。別の局面において、タグ１ ＤＮＡを、ＰＣＲ増幅したＮＧＳライブラリーにおいて保持した。さらに別の局面において、スパイクイン 対 サンプルＤＮＡの質量比は、タグ１ ＨＭＷ ＤＮＡでスパイクしたライブラリーにおいてタグ１に対してマッピングしたＩｌｌｕｍｉｎａの短い読み取りのパーセンテージによって反映された。
一局面において、タグ１ ＨＭＷ ＤＮＡのスパイクインは、配列分析の後にタグ化ライブラリーの同定を可能にした。さらに、タグ１ ＨＭＷ ＤＮＡのスパイクインは、非常に少量（１ｎｇ）および多量（５０ｎｇ）のテンプレートＤＮＡにおいて有効であった。別の局面において、タグ１ ＤＮＡを、ＰＣＲ増幅したＮＧＳライブラリーにおいて保持した。さらに別の局面において、スパイクイン 対 サンプルＤＮＡの質量比は、タグ１ ＨＭＷ ＤＮＡでスパイクしたライブラリーにおいてタグ１に対してマッピングしたＩｌｌｕｍｉｎａの短い読み取りのパーセンテージによって反映された。
実施例３：２つの別個のタグをスパイクインして、タグ化サンプルを特有に同定する能力を示す
ＨＭＷ ＤＮＡスパイクインタグを、実施例１に記載されるプロトコルに従ってＲＣＡ＿タグ＿１（配列番号１）およびＲＣＡ＿タグ＿２（配列番号５）から調製し、それによって、それぞれ、スパイクインタグであるタグ１およびタグ２を生じた。タグ１およびタグ２のライブラリーグリッドへのスパイクインは、表１に詳述される実験設計に従って試験した。
ＨＭＷ ＤＮＡスパイクインタグを、実施例１に記載されるプロトコルに従ってＲＣＡ＿タグ＿１（配列番号１）およびＲＣＡ＿タグ＿２（配列番号５）から調製し、それによって、それぞれ、スパイクインタグであるタグ１およびタグ２を生じた。タグ１およびタグ２のライブラリーグリッドへのスパイクインは、表１に詳述される実験設計に従って試験した。
微生物ゲノムＤＮＡサンプルを、１質量％、０．１質量％および０．０１質量％の、ＤＮＡタグであるタグ１またはタグ２のいずれかと合わせた。ＤＮＡを、音波剪断によって平均サイズ３００ｂｐまたは５００ｂｐへとフラグメント化し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ適合ライブラリーを、実施例２に記載される手順に従って異なるインデックスとともに構築した。シークエンシングを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ機器で行った。各タグにマッチする読み取りの数を、そのシークエンシングしたライブラリーの各々において計数し、結果をパートパーミリオン（ｐｐｍ）として報告した。
表２および表３は、ＤＮＡタグであるタグ１およびタグ２でスパイクしたライブラリーが、それぞれの参照にマッピングされた読み取りの数に基づいて同定できたことを例証する。表２および表３に示される全ての結果は、別段示されなければ、パーセンテージとして示される。さらに、表２および表３の結果は、表１に示される実験設計に相当する。
この実験において、参照に対する完全なマッチのみを許容した。これは、スパイクイン比と各タグに関して観察された読み取りの数との間の完璧ではない相関を説明する。
タグ１およびタグ２ ＨＭＷ物質は、スパイクインの異なるパーセンテージにおいて、種々の微生物に由来する全ゲノムシークエンシングライブラリーをタグ化するために成功裡に使用された。
実施例４：複数のポリメラーゼによって生成されるタグの設計およびシークエンシング
さらに１４種のタグを設計した。これらタグは、可変領域において＞８の編集距離を有する。ＨＭＷ ＤＮＡタグを、φ２９ ＤＮＡポリメラーゼおよびＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、これらタグの部分セットから合成した。これらＨＭＷ タグを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑプラットフォームを使用してシークエンシングして、純度および配列一致を検証した。それらタグは、以下のモノマー（すなわち、［Ａ－Ｂ－Ｃ］１）配列（Ｂ領域には下線を付す）を有した：
さらに１４種のタグを設計した。これらタグは、可変領域において＞８の編集距離を有する。ＨＭＷ ＤＮＡタグを、φ２９ ＤＮＡポリメラーゼおよびＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、これらタグの部分セットから合成した。これらＨＭＷ タグを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑプラットフォームを使用してシークエンシングして、純度および配列一致を検証した。それらタグは、以下のモノマー（すなわち、［Ａ－Ｂ－Ｃ］１）配列（Ｂ領域には下線を付す）を有した：
RCA_タグ_3:
RCA_タグ_4
RCA_タグ_5
RCA_タグ_6
RCA_タグ_7
RCA_タグ_8
RCA_タグ_9
RCA_タグ_10
RCA_タグ_11
RCA_タグ_12
RCA_タグ_13
RCA_タグ_14
RCA_タグ_15
RCA_タグ_16
φ２９およびＢｓｔ大フラグメント（ＬＦ）ＤＮＡポリメラーゼで生成したＨＭＷ ＤＮＡタグを、ゲル電気泳動を使用して分析した（図１０）。一般に、φ２９およびＢｓｔ ＬＦ ＤＮＡポリメラーゼで生成したＨＭＷタグは、純粋であり（表４）、ＨＭＷ ＤＮＡタグ１、２、４、５、７、１１、および１３のディープシークエンシング（ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）は、その推定される配列に対して非常に良好な一致を示した（図１１）。
タグ純度を、φ２９またはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ生成タグの部分セットをシークエンシングし、その得られたＩｌｌｕｍｉｎａの短い読み取りをタグ参照配列にマッピングすることによって測定した。極めて低いレベルの二次汚染が明らかとなった（＜０．１％）。これは、インデックス付加バーコードクロストークに起因した（表４）。
実施例５：タグの使用をスケールアップする能力を示すための９６種のタグの製造
さらなる８０種のｓｓＤＮＡオリゴを設計した。これらは、可変領域において＞８の編集距離を有する。
さらなる８０種のｓｓＤＮＡオリゴを設計した。これらは、可変領域において＞８の編集距離を有する。
ＨＭＷ ＤＮＡタグを、実施例１に記載されるプロトコルに従って、ｓｓＤＮＡオリゴから、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを使用して合成した。合計９６種のｓｓＤＮＡオリゴを使用した。これらは、タグ１～１６（配列番号１、５、および１１～２４）および表５に示されるとおりの８０種のオリゴのさらなるセット（配列番号２８～１０７）を含んだ。
表５を参照すると、そのオリゴの各々は、本明細書で記載されるとおりの［Ａ－Ｂ－Ｃ］モノマー配列形式（Ｂ領域には、下線を付す）に付着した。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ適合ライブラリーを、各タグから、ＫＡＰＡ Ｈｙｐｅｒ Ｐｌｕｓライブラリー調製キットを使用して作った（製造業者の説明に従って、ＤＮＡの３０分間の剪断、続いて、Ａテール付加およびアダプターライゲーション）。
その９６のライブラリーをプールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑプラットフォームでシークエンシングした。
トリミングしたＩｌｌｕｍｉｎａ配列を、タグ配列のコンカテマーに整列させて、そのタグに対して整列させた読み取りのパーセンテージを決定した。そのコンカテマーは、構造Ｘ２０－［Ａ－Ｂ－Ｃ］３－Ｙ２０を含み、ここでＸ２０およびＹ２０は各々、２０個の連続した縮重塩基の配列（すなわち、４種の核酸のうちのいずれかの組み合わせ）を表す。
図１２を参照すると、真の陽性および偽陰性の分布が、正しいタグ参照配列（真の陽性）および不正確なタグ参照配列（偽陰性）に対して整列させた全タグ読み取りのパーセンテージに基づいて決定された。
脱複合化の後に、少なくとも４０，０００読み取りを、ライブラリー１～ライブラリー９６の各々に関して得た。
正確なタグに対して整列させた読み取りのうちの９９％超（メジアン９９．９％）（全てのタグ配列にわたって類似の分布を有する）は、それによって、二次汚染なしで使用されるタグの数を増大させるという可能性を示す。さらに、０．５％未満（メジアン０．０６％）の偽陰性率は、最小限のクロストークで明確な同定を可能にするために、９６種のタグのセットの間には十分な変動性があることを示した。
実施例６：タグ配列へのメチル化ヌクレオチドの組み込み
一局面において、メチル化ヌクレオチドは、タグ配列へと組み込まれ得、これは、種々の適用に有用である。１もしくはこれより多くのメチル化ヌクレオチドを有するタグの一適用は、重亜硫酸シークエンシング（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）実験、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）実験、またはこれらの組み合わせに関するスパイクインコントロールを含む。一般に、ＭｅＤＩＰは、精製技術であり、この技術では、サンプルがメチル化ＤＮＡ配列に関して富化される。従って、１もしくはこれより多くのメチル化ヌクレオチドを有するタグは、メチル化タグの富化と一緒にサンプル中の任意のメチル化配列を提供するために、富化の前にサンプルに添加され得る。
一局面において、メチル化ヌクレオチドは、タグ配列へと組み込まれ得、これは、種々の適用に有用である。１もしくはこれより多くのメチル化ヌクレオチドを有するタグの一適用は、重亜硫酸シークエンシング（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）実験、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）実験、またはこれらの組み合わせに関するスパイクインコントロールを含む。一般に、ＭｅＤＩＰは、精製技術であり、この技術では、サンプルがメチル化ＤＮＡ配列に関して富化される。従って、１もしくはこれより多くのメチル化ヌクレオチドを有するタグは、メチル化タグの富化と一緒にサンプル中の任意のメチル化配列を提供するために、富化の前にサンプルに添加され得る。
１もしくはこれより多くのメチル化ヌクレオチドを有するタグは、さらに（または代わりに）、重亜硫酸シークエンシング実験に有用であり得る。一例では、タグにおけるメチル化ヌクレオチド 対 非メチル化ヌクレオチドの比（すなわち、メチル化比）は、重亜硫酸変換の程度を追跡するために変動され得る。さらに、そのメチル化比は、異なるレベルのメチル化を検出するために必要とされる重亜硫酸変換の量を同定するために、変動され得る。別の例では、異なるタグの組み合わせが提供され得、この場合、その異なるタグの各々は、別個のメチル化比またはメチル化ヌクレオチドの数を有する。一実施形態において、異なるタグの組み合わせは、少なくとも１個のメチル化ｄＣＴＰを有する第１のタグおよび非メチル化ｄＣＴＰのみを有する第２のタグ（すなわち、この第２のタグは、メチル化ｄＣＴＰを含まない）を含む。別の実施形態において、異なるタグの組み合わせは、第２のタグと比較した場合に、少なくとももう１個のメチル化ｄＣＴＰを有する第１のタグを含み得る。さらに別の実施形態において、異なるタグの組み合わせは、第２のタグと比較した場合に、等しい数のメチル化ｄＣＴＰを有する第１のタグを含み得る。この場合、その第１のタグは、その第２のタグとは異なるメチル化パターンを有する。その第１のタグおよびその第２のタグが、同じ核酸配列を（しかし異なるメチル化パターンを）有する場合には、その２種のタグの組み合わせは、単一の遺伝子座におけるメチル化の異なるレベルをまね得る。そのメチル化タグは、５－メチル－ｄＣＴＰを、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼでの重合工程の間に、ｄＣＴＰの代わりに（またはこれに加えて）含めることによって本明細書で記載されるように生成できた。
実施例７：１もしくはこれより多くのビオチン化ｄＮＴＰを有するタグ
別の実施形態において、１もしくはこれより多くのビオチン化ｄＮＴＰは、ここで記載されるように、タグへと（例えば、重合工程の間に）組みこまれ得る。例えば、ビオチン－１６－ｄＵＴＰは、ビオチン化塩基を含むプライマーを使用することによって、そのタグの合成の間にあるパーセンテージのビオチン化ヌクレオチドを含めることによってなど、およびこれらの組み合わせによって、タグ配列へと組み込まれ得る。ビオチン化タグは、ビオチン－ストレプトアビジンベースの捕捉（例えば、溶液中ハイブリッド捕捉（例えば、米国特許出願公開番号２０１２／００４６１７５（Ｒｏｄｅｓｃｈら）を参照のこと）を要するワークフロー中で有用であり得る。別の局面において、ビオチン化塩基をタグに付加することは、タグ精製または操作のために一般に有用であり得る。ビオチン化に加えて（または代わりとして）、タグは、別の同様な結合部分（例えば、ジゴキシゲニン）、または適切な結合部分とともに提供され得る。
別の実施形態において、１もしくはこれより多くのビオチン化ｄＮＴＰは、ここで記載されるように、タグへと（例えば、重合工程の間に）組みこまれ得る。例えば、ビオチン－１６－ｄＵＴＰは、ビオチン化塩基を含むプライマーを使用することによって、そのタグの合成の間にあるパーセンテージのビオチン化ヌクレオチドを含めることによってなど、およびこれらの組み合わせによって、タグ配列へと組み込まれ得る。ビオチン化タグは、ビオチン－ストレプトアビジンベースの捕捉（例えば、溶液中ハイブリッド捕捉（例えば、米国特許出願公開番号２０１２／００４６１７５（Ｒｏｄｅｓｃｈら）を参照のこと）を要するワークフロー中で有用であり得る。別の局面において、ビオチン化塩基をタグに付加することは、タグ精製または操作のために一般に有用であり得る。ビオチン化に加えて（または代わりとして）、タグは、別の同様な結合部分（例えば、ジゴキシゲニン）、または適切な結合部分とともに提供され得る。
実施例８：ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含むタグ
一実施形態において、タグは、タグの保存された領域のうちの少なくとも１つの中にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含むように設計され得る。ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、真核生物プロモーター配列、原核生物プロモーター配列、古細菌プロモーター配列、合成プロモーター配列、別の同様のプロモーター配列、またはこれらの組み合わせから選択され得る。プロモーター配列を含めることによって、ＤＮＡベースのタグをテンプレートとして使用してランオフ転写物を生成するために、ＲＮＡポリメラーゼでのＲＮＡベースのタグの合成が可能になり得る。ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を有するタグの一例としては、以下の一般的構造を有するタグが挙げられる：
一実施形態において、タグは、タグの保存された領域のうちの少なくとも１つの中にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含むように設計され得る。ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、真核生物プロモーター配列、原核生物プロモーター配列、古細菌プロモーター配列、合成プロモーター配列、別の同様のプロモーター配列、またはこれらの組み合わせから選択され得る。プロモーター配列を含めることによって、ＤＮＡベースのタグをテンプレートとして使用してランオフ転写物を生成するために、ＲＮＡポリメラーゼでのＲＮＡベースのタグの合成が可能になり得る。ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を有するタグの一例としては、以下の一般的構造を有するタグが挙げられる：
５’－［ＲＮＡ－ポリメラーゼ－プロモーター］－［可変領域］－［不変領域］－３’
上記で示されるように、そのタグは、５’から３’方向に以下を含む：ｉ）ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含む第１の領域、ｉｉ）可変領域を有する第２の領域、およびｉｉｉ）不変または規定された領域を有する第３の領域。タグを調製するにあたって使用するためのヌクレオチド配列の具体例としては、以下が挙げられる：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター
、可変配列
、および不変配列
（以下のとおり：
）。
、可変配列
、および不変配列
（以下のとおり：
）。
ヌクレオチド配列（配列番号２７）を、先の実施例で記載されるようにアニールおよび連結して、本明細書で記載されるとおりの鎖置換ポリメラーゼを使用して、長い２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の生成のために連結された環状テンプレートを提供する。その高分子量ｄｓＤＮＡ生成物は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの基質であり得、それによってそのタグＤＮＡの相当するＲＮＡへの転写を生じる。タグのＲＮＡ転写物は、そのタグの反復構造を含み、タグテンプレートの転写に固有の可変ランダムターミネーション（ｒａｎｄｏｍ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）に起因して、種々の長さのＲＮＡ生成物の一般に連続した分布を生じる。
タグのＲＮＡ転写物の合成のための一例のアプローチでは、実施例１で生成されるとおりの１μｇの高分子量ｄｓＤＮＡを、テンプレートとして、１００ユニットのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、１×Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ反応緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、各々０．５ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＴＴＰ、１ユニットのＲＮａｓｅインヒビター、ならびに５ｍＭ ＤＴＴを含む反応において使用し得る。その反応を、３７℃で２時間インキュベートし得、その後、得られたＲＮＡ転写物を、テンプレートＤＮＡをＤＮａｓｅ Ｉでまず消化し、続いて、ＲＮＡ転写物をエタノール沈殿させることによって、精製し得る。定量の後、そのタグのＲＮＡ転写物を、ＲＮＡ－ｓｅｑのためのライブラリー調製の前に、ｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを含むサンプルに添加し得る。
実施例９：サンプル収集容器におけるタグの包含
一局面において、本開示に従うタグは、別個に、またはサンプル収集システムの成分として提供され得る。タグがサンプル収集システムの成分として含められる場合、ライブラリー調製前の核酸サンプルへの添加のために、または核酸抽出前に粗製組織サンプルへの添加のために別個の成分としてタグを供給する代わりに、そのタグは、容器（例えば、サンプル収集チューブまたはバイアル）の中に提供され得る。一例では、タグは、収集バイアル（例えば、唾液収集バイアル、血液収集バイアルなど）の中に含められ得る。その収集バイアルは、この中に配置される組成物を既に含む、特有にラベルが付けられた（例えば、バーコード付加した）サンプル収集チューブとして提供され得る。この場合、その組成物は、収集バイアル上のラベルに特有または特異的である具体的なタグを含む。サンプル（例えば、血液、組織、唾液など）がそのタグを含む収集バイアルに添加される場合、そのサンプル、および従ってこの中に含まれる任意の核酸物質は、収集時点で消えないように混合され得る。収集時点でそのタグを含めることは、抽出、ライブラリー調製、およびシークエンシングワークフローの間の二次汚染または不正確なタグ割り当ての可能性を低減し得る。さらに別の例では、そのタグは、そのタグを固体収集表面（例えば、血液スポット（ガスリー）カード、口腔スワブ器具など）上に吸着させることによって、収集器具と組み合わせて提供される。
一局面において、本開示に従うタグは、別個に、またはサンプル収集システムの成分として提供され得る。タグがサンプル収集システムの成分として含められる場合、ライブラリー調製前の核酸サンプルへの添加のために、または核酸抽出前に粗製組織サンプルへの添加のために別個の成分としてタグを供給する代わりに、そのタグは、容器（例えば、サンプル収集チューブまたはバイアル）の中に提供され得る。一例では、タグは、収集バイアル（例えば、唾液収集バイアル、血液収集バイアルなど）の中に含められ得る。その収集バイアルは、この中に配置される組成物を既に含む、特有にラベルが付けられた（例えば、バーコード付加した）サンプル収集チューブとして提供され得る。この場合、その組成物は、収集バイアル上のラベルに特有または特異的である具体的なタグを含む。サンプル（例えば、血液、組織、唾液など）がそのタグを含む収集バイアルに添加される場合、そのサンプル、および従ってこの中に含まれる任意の核酸物質は、収集時点で消えないように混合され得る。収集時点でそのタグを含めることは、抽出、ライブラリー調製、およびシークエンシングワークフローの間の二次汚染または不正確なタグ割り当ての可能性を低減し得る。さらに別の例では、そのタグは、そのタグを固体収集表面（例えば、血液スポット（ガスリー）カード、口腔スワブ器具など）上に吸着させることによって、収集器具と組み合わせて提供される。
（均等物）
当業者は、慣用的実験法のみを使用して、本明細書で記載される発明の具体的実施形態に対する多くの均等物を認識するかまたは確かめ得る。本発明の範囲は、上記の説明に限定されるとは意図されないが、むしろ以下の特許請求の範囲に示されるとおりである。
当業者は、慣用的実験法のみを使用して、本明細書で記載される発明の具体的実施形態に対する多くの均等物を認識するかまたは確かめ得る。本発明の範囲は、上記の説明に限定されるとは意図されないが、むしろ以下の特許請求の範囲に示されるとおりである。
Claims (2)
- ＲＮＡ転写物を合成核酸タグから調製する方法であって、
該方法は、プロモーター配列を有する合成核酸タグを転写する工程であって、該合成核酸タグは、構造Ａ－Ｂ－Ｃの複数の反復ユニットを含む核酸配列を有し、該合成核酸タグは、以下の式：Ｘｉ－［Ａ－Ｂ－Ｃ］ｎ－Ｙｊによって表される全体構造をさらに有する工程を包含し、
ここで該合成核酸タグは、該構造Ａ－Ｂ－Ｃのｎ回反復を含み、該ｎは、少なくとも２であり、
ここで該Ａおよび該Ｃは、各々少なくとも８個の核酸の長さであり、かつ該Ａおよび該Ｃは、同じ長さおよび異なる長さのうちの一方であり、
ここで該Ｂは、少なくとも８個の核酸を含むものであり、
ここで該合成核酸タグは、Ｘのｉ回反復を含み、
ここで該合成核酸タグは、Ｙのｊ回反復を含み、
ここで該Ｘは、該Ｃ、別の核酸、および核酸改変のうちの少なくとも１つであり、
ここで該Ｙは、該Ａ、別の核酸、および核酸改変のうちの少なくとも１つであり、そして
ここで該Ｂは、ＢＬＡＳＴＮを参照することによって決定される、分析のための直接関連するサンプル中で見出される任意の配列とハイブリダイズしない配列を有し、そして、
該Ｂは、前記タグ中の個々のＢエレメント間に少なくとも８の編集距離を担保するために十分な長さを有するものであり、
ここで該ｉおよび該ｊは、１～１００から独立して選択される整数である、
前記方法。 - ＡおよびＣの各々は、そこにハイブリダイズされるプライマーが伸長され得るという点で、少なくとも１個のプライマーランディングパッド配列エレメントを含み、そして
さらにここでＡおよびＣは、逆方向性のプライマーが、ＡおよびＣの両方に同時にハイブリダイズし得、その結果増幅生成物が、該ハイブリダイズしたプライマーの伸長によって生成されるという点で、互いと適合性であるヌクレオチド配列を有する、
請求項１に記載の方法。
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011147415A (ja) | 2010-01-25 | 2011-08-04 | Hitachi Ltd | 核酸の均一増幅方法および高感度検出方法 |
| US20130072390A1 (en) | 2011-03-21 | 2013-03-21 | Affymetrix, Inc. | Methods for Synthesizing Pools of Probes |
Family Cites Families (19)
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|---|---|---|---|---|
| WO1990014441A1 (en) | 1989-05-22 | 1990-11-29 | Cetus Corporation | Methods for tagging and tracing materials with nucleic acids |
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| US6143495A (en) | 1995-11-21 | 2000-11-07 | Yale University | Unimolecular segment amplification and sequencing |
| CN1344808A (zh) * | 2000-09-29 | 2002-04-17 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种利用dna长度多态性分析技术将核酸应用于防伪的方法 |
| JP2003157004A (ja) * | 2001-11-21 | 2003-05-30 | Id Technica:Kk | 識別手段を付加する添加物及びその添加物を含有する識別情報保持物 |
| US20060073506A1 (en) * | 2004-09-17 | 2006-04-06 | Affymetrix, Inc. | Methods for identifying biological samples |
| JP2006094814A (ja) * | 2004-09-30 | 2006-04-13 | Nissan Motor Co Ltd | 情報化核酸及びこれを用いた情報化核酸組成物 |
| US8785130B2 (en) * | 2005-07-07 | 2014-07-22 | Bio-Id Diagnostic Inc. | Use of markers including nucleotide sequence based codes to monitor methods of detection and identification of genetic material |
| EP4108780A1 (en) * | 2006-06-14 | 2022-12-28 | Verinata Health, Inc. | Rare cell analysis using sample splitting and dna tags |
| EP2053132A1 (en) | 2007-10-23 | 2009-04-29 | Roche Diagnostics GmbH | Enrichment and sequence analysis of geomic regions |
| GB2472371B (en) * | 2009-04-24 | 2011-10-26 | Selectamark Security Systems Plc | Synthetic nucleotide containing compositions for use in security marking of property and/or for marking a thief or attacker |
| US20130224729A1 (en) * | 2009-08-12 | 2013-08-29 | President And Fellows Of Harvard College | Biodetection Methods and Compositions |
| CN102443628B (zh) * | 2011-11-01 | 2014-12-17 | 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 嵌合外源无关序列的核酸质控的制备方法 |
| JP2015521472A (ja) * | 2012-06-14 | 2015-07-30 | フレッド ハチンソン キャンサー リサーチ センター | 核酸分子における高感度変異検出のための組成物および方法 |
| CA2878694A1 (en) * | 2012-07-24 | 2014-01-30 | Sequenta, Inc. | Single cell analysis using sequence tags |
| CN102978283B (zh) * | 2012-11-20 | 2015-09-23 | 天昊生物医药科技（苏州）有限公司 | 用于生物样本核酸检测的分子内标质控方法及其试剂盒 |
| JP2014147415A (ja) * | 2013-01-30 | 2014-08-21 | Daiichi Shokai Co Ltd | 遊技機 |
| GB201302900D0 (en) * | 2013-02-19 | 2013-04-03 | Genome Res Ltd | Nucleic acid marker molecules for identifying and detecting cross contaminationof nucleic acid samples |
| WO2015047186A1 (en) * | 2013-09-30 | 2015-04-02 | Di Wu | Methods to profile molecular complexes by using proximity bar-coding |
-
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011147415A (ja) | 2010-01-25 | 2011-08-04 | Hitachi Ltd | 核酸の均一増幅方法および高感度検出方法 |
| US20130072390A1 (en) | 2011-03-21 | 2013-03-21 | Affymetrix, Inc. | Methods for Synthesizing Pools of Probes |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| DAUBENDIEK, S.L., et al.，"Rolling-circle RNA synthesis: circular oligonucleotides as efficient substrates for T7 RNA polymerase."，J. AM. CHEM. SOC.，1995年，Vol.117, No.29，pp.7818-7819 |
| FIRE, A. and XU, S.，"Rolling replication of short DNA circles."，PROC. NATL. ACAD. SCI. USA，1995年，Vol.92，pp.4641-4645 |
| QUAIL, M.A., et al.，"SASI-Seq: sample assurance spike-ins, and highly differentiating 384 barcoding for illumina sequencing."，BMC GENOMICS，2014年，Vol.15，110(pp.1-12) |
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