JP7048998B2

JP7048998B2 - インフルエンザウイルス産生用細胞、及びインフルエンザウイルスの産生方法

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Publication number: JP7048998B2
Application number: JP2020114286A
Authority: JP
Inventors: 義裕河岡; 登喜子渡邉; 英良川上; 真治渡邉
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2014-09-22
Filing date: 2020-07-01
Publication date: 2022-04-06
Anticipated expiration: 2035-09-18
Also published as: EP3199621B1; EP3708650B1; WO2016047595A1; US10369210B2; JP2020156516A; JP6730188B2; EP3199621A1; JPWO2016047595A1; EP3199621A4; US11964009B2; US20190314489A1; US20180104327A1; EP3708650A1

Description

本発明は、インフルエンザウイルスの増殖能が高く、ワクチン製造のためのインフルエンザウイルスを産生するために好適に用いられる生体外で培養可能な細胞、及び当該細胞を用いてインフルエンザウイルスを産生する方法に関する。
本願は、２０１４年９月２２日に、日本に出願された特願２０１４－１９２７５３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

インフルエンザウイルスは、毎年流行を引き起こし、ときには何百万人もの犠牲者を出すパンデミックを引き起こす。インフルエンザ感染症の予防は、主に、ワクチンの予防接種により行われる。ワクチンは、インフルエンザウイルス粒子又はその部分分解物を不活化したものである。インフルエンザワクチンの予防接種により、インフルエンザに罹患した場合に、肺炎等の重篤な合併症の出現や、入院、死亡などの危険性を軽減し得る。

現行のワクチンは、発育鶏卵にインフルエンザウイルスを接種することによって製造されている。このため、ワクチンの製造には大量の発育鶏卵の確保が必要である。また、製造には６か月ほどかかるので、突発的なワクチンの大量製造は難しい。加えて、卵成分によるアレルギー反応について考慮する必要がある。

さらに、鶏卵でインフルエンザウイルスを増やした場合には、ウイルス遺伝子に変異が入ることによって、ウイルスの抗原性が変わってしまうことが多い。現に、近年のＨ３Ｎ２型とＢ型のワクチンについては、選定されたワクチン株の抗原性は、流行株と一致していたにも関わらず、製造段階でワクチンウイルスの遺伝子に変異が入り、製造されたワクチンの抗原性が元々のワクチン株とは変わってしまった。そのため、「流行する株の予測があっていたにも関わらず、ワクチン効果が弱い」という事態に陥った（非特許文献１参照。）。

Kishida et al.，Clinical and Vaccine Immunology，2013，vol. 19，p.897～908． Neumann，et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1999，vol.96，p.9345～9350． Tobita，et al.，Medical microbiology and immunology，1975，vol.162，p.9～14.

鶏卵に替わる手段として、培養細胞を用いたワクチン製造がある。このワクチン製造は、欧米では既に認可されており、また、日本でも認可への動きはある。しかしながら、培養細胞ではウイルスの増殖性が鶏卵よりも悪いため、インフルエンザウイルスを培養細胞で効率良く増幅するシステムの開発が最重要課題となっている。

本発明は、インフルエンザウイルスの増殖能が高く、ワクチン製造のためのインフルエンザウイルスを産生するために好適に用いられる、培養可能な細胞、及び当該細胞を用いてインフルエンザウイルスを産生する方法を提供することを主たる目的とする。

本発明者らは、鋭意研究した結果、ヒト胚腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞の細胞溶解液を用いた免疫沈降法により、インフルエンザウイルスタンパク質と相互作用を有する１２９２個のヒトタンパク質を特定し、次いで、ＲＮＡ干渉を利用し、これらのヒトタンパク質の中から、発現量を抑制した場合に細胞の増殖性を大きく損なうことなく、インフルエンザウイルスの産生が顕著に向上されるタンパク質を特定することにより、本発明を完成させた。

すなわち、本発明に係るインフルエンザウイルス産生用細胞、インフルエンザウイルスの産生方法、及びインフルエンザウイルスワクチンの製造方法は、下記［１］～［１０］である。
［１］染色体中のＴＭＥＤ２遺伝子の発現が抑制されている、生体外で培養可能なＨＥＫ２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、又はＭＤＣＫ細胞であることを特徴とする、インフルエンザウイルス産生用細胞。
［２］ＴＭＥＤ２遺伝子が欠損又は破壊されている、前記［１］のインフルエンザウイルス産生用細胞。
［３］染色体中のＴＭＥＤ２遺伝子の発現が抑制されている、生体外で培養可能なＨＥＫ２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、又はＭＤＣＫ細胞に、インフルエンザウイルスを感染させた後、培養することを特徴とする、インフルエンザウイルスの産生方法。
［４］前記インフルエンザウイルスが、インフルエンザウイルスワクチンを製造するためのインフルエンザウイルスである、前記［３］のインフルエンザウイルスの産生方法。
［５］前記細胞が、ＴＭＥＤ２遺伝子が欠損又は破壊されている、前記［３］又は［４］のインフルエンザウイルスの産生方法。
［６］染色体中のＴＭＥＤ２遺伝子の発現が抑制されている、生体外で培養可能な細胞（ただし、ヒト自体を構成している細胞を除く。）に、インフルエンザウイルスを感染させた後、培養し、産生されたインフルエンザウイルスからインフルエンザウイルスワクチンを製造する、インフルエンザウイルスワクチンの製造方法。
［７］前記細胞が、ＴＭＥＤ２遺伝子が欠損又は破壊されている、前記［６］のインフルエンザウイルスワクチンの製造方法。
［８］前記細胞が、哺乳類由来の細胞である、前記［６］又は［７］のインフルエンザウイルスワクチンの製造方法。
［９］前記細胞が、ヒト由来の細胞である、前記［８］のインフルエンザウイルスワクチンの製造方法。
［１０］前記細胞が、腎臓由来の細胞である、前記［８］のインフルエンザウイルスワクチンの製造方法。

本発明に係るインフルエンザウイルス産生用細胞は、特定の遺伝子の発現が抑制されており、当該遺伝子の発現等が抑制されていない細胞よりも細胞内におけるインフルエンザウイルスの増殖性が高い。このため、当該インフルエンザウイルス産生用細胞を用いることにより、インフルエンザウイルスを効率よく増殖させることができ、特に、ワクチン製造のためのインフルエンザウイルスの産生を効率よく行うことができる。

実施例２において、各ｓｉＲＮＡを導入したＶｅｒｏ細胞のウイルス力価（コントロールに対する相対値（％））を算出した結果を示した図である。

本発明に係るインフルエンザウイルス産生用細胞は、生体外で培養可能な細胞（培養細胞）であって、発現が抑制されることによりインフルエンザウイルスの増殖促進効果を発揮する遺伝子（以下、「ＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子」ということがある。）の発現が抑制されている細胞である。当該細胞は、染色体中の少なくとも１種のＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子の発現が抑制されているため、当該細胞を用いることにより、効率よくインフルエンザウイルスを増殖させることができる。

本発明に係るインフルエンザウイルス産生用細胞において発現が抑制されているＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子としては、具体的には、ＡＣＴＧ１遺伝子、ＡＣＴＮ１遺伝子、ＡＴＣＡＹ遺伝子、ＣＣＴ６Ａ遺伝子、ＣＯＰＳ７Ｂ遺伝子、ＤＡＰ３遺伝子、ＥＲＬＩＮ２遺伝子、ＧＮＡＩ２遺伝子、ＧＴＦ３Ｃ５遺伝子、ＨＮＲＰＡＢ遺伝子、ＫＨＳＲＰ遺伝子、ＫＲＴ１８遺伝子、ＭＴＣＨ１遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ遺伝子、ＰＲＰＳ１遺伝子、ＲＡＢ１８遺伝子、ＲＡＢ３Ａ遺伝子、ＲＡＰ１Ｂ遺伝子、ＲＰＳ１９遺伝子、ＲＰＳ７遺伝子、Ｓ１００Ａ１０遺伝子、ＳＦＲＳ７遺伝子、ＳＬＣ２Ａ１２遺伝子、ＴＭＥＤ２遺伝子、及びＵＳＰ１０遺伝子が挙げられる。後記実施例に示すように、これらの遺伝子の発現が抑制された培養細胞、特にヒト由来の培養細胞では、発現抑制されていない細胞に比べて、インフルエンザウイルスの増殖性が良好であることに加えて、細胞自体の増殖性もさほど抑制されていない。つまり、細胞においてこれらの遺伝子の発現を抑制することにより、細胞自体の増殖性を過度に損なうことなく、インフルエンザウイルス増殖促進効果が得られる。また、これらの遺伝子は、１１種のインフルエンザウイルスタンパク質（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＳ２、及びＰＢ１－Ｆ２）のいずれかと直接的又は間接的に結合するタンパク質をコードしているため、これらの遺伝子がコードするタンパク質とインフルエンザウイルスタンパク質との相互作用が、インフルエンザウイルスの増殖抑制に重要な役割を果たすことも示唆される。

本発明に係るインフルエンザウイルス産生用細胞は、１種のＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子の発現が抑制されていてもよく、２種以上のＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子の発現が抑制されていてもよい。本発明に係るインフルエンザウイルス産生用細胞としては、ＡＣＴＧ１遺伝子、ＡＣＴＮ１遺伝子、ＤＡＰ３遺伝子、ＧＮＡＩ２遺伝子、ＧＴＦ３Ｃ５遺伝子、ＫＲＴ１８遺伝子、ＭＴＣＨ１遺伝子、ＰＲＰＳ１遺伝子、ＲＰＳ１９遺伝子、Ｓ１００Ａ１０遺伝子、ＳＦＲＳ７遺伝子、ＳＬＣ２Ａ１２遺伝子、ＵＳＰ１０遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ遺伝子、及びＴＭＥＤ２遺伝子からなる群より選択される１以上の発現が抑制されているものが好ましい。これらのＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子を発現抑制することによるインフルエンザウイルス増殖促進効果は、ヒト由来の細胞のみならず、サル由来の細胞又はイヌ由来の細胞においても確認されたためである。

本発明に係るインフルエンザウイルス産生用細胞としては、ＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子の発現量が、発現抑制前の同種の細胞における当該遺伝子の発現量の５０％以下にまで低下している細胞が好ましく、７５％以下にまで低下している細胞がより好ましく、８０％以下にまで低下している細胞がさらに好ましい。例えば、本発明に係るインフルエンザウイルス産生用細胞が、培養細胞株ＨＥＫ２９３細胞の１種のＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子の発現を抑制した細胞である場合、本発明に係るインフルエンザウイルス産生用細胞としては、当該ＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子の発現量が、ＨＥＫ２９３細胞における当該ＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子の発現量の５０％以下にまで低下する程度に当該ＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子の発現が抑制されている細胞が好ましい。

培養細胞におけるＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子の発現抑制は、ＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子の転写量（発現量）を減少させてもよく、ＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子自体を染色体から削除させてもよく、ＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子に変異を導入して破壊してもよい。ＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子を染色体から削除する場合、遺伝子の全長を削除してもよく、プロモーター部分等のように発現制御に関与する領域を部分的に削除してもよく、当該遺伝子の機能が欠損した部分タンパク質を発現するように当該遺伝子のコード領域を部分的に削除してもよい。遺伝子の転写量減少や遺伝子欠損、遺伝子破壊等は、常法により行うことができる。

本発明に係るインフルエンザウイルス産生用細胞としては、ＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子の発現抑制が一過性のものであってもよく、恒常的にＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子の発現が抑制されているものであってもよい。インフルエンザウイルス増殖促進効果の安定性の点から、本発明に係るインフルエンザウイルス産生用細胞としては、ＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子の発現が恒常的に抑制されている細胞が好ましい。

本発明に係るインフルエンザウイルス産生用細胞のうち、ＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子の発現抑制が一過性である細胞は、例えば、ＲＮＡ干渉を利用して製造することができる。具体的には、ＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子のｃＤＮＡの部分領域（ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）標的領域）のセンス鎖とアンチセンス鎖からなる二本鎖構造を有するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）を培養細胞に導入することにより製造できる。また、培養細胞内において、ｓｉＲＮＡ等を生産させることができるＲＮＡｉ誘導ベクターを培養細胞に導入してもよい。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びＲＮＡｉ誘導ベクターの作製は、標的とするＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列情報から、常法により設計し製造することができる。また、ＲＮＡｉ誘導ベクターは、市販の各種ＲＮＡｉベクターの塩基配列に、ＲＮＡｉ標的領域の塩基配列を挿入することによって作製することもできる。さらに、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びＲＮＡｉ誘導ベクターの培養細胞への導入は、例えば、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法等により行うことができる。

本発明に係るインフルエンザウイルス産生用細胞のうち、恒常的にＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子の発現が抑制されている細胞は、例えば、レトロウイルスベクターを介して培養細胞の染色体にｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等を組み込む方法により製造できる。ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを染色体に組み込むためのレトロウイルスベクター（ｓｉＲＮＡ発現用レトロウイルスベクター）は、例えば、レトロウイルスの複製に必要な構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖを欠失させ、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを組み込んだレトロウイルスプラスミドベクターを、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖを発現しているパッケージング細胞に導入することにより製造できる。ｓｉＲＮＡ発現用レトロウイルスベクターは、Retrovirus Packaging Kit Eco/Ampho（code 6160/6161）（タカラバイオ社製）等の市販のキットを用いて製造することもできる。ＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子のｓｉＲＮＡ等を発現させるためのｓｉＲＮＡ発現用レトロウイルスベクターを培養細胞に導入することにより、本発明に係るインフルエンザウイルス産生用細胞が得られる。

本発明に係るインフルエンザウイルス産生用細胞としては、ＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子自体を染色体から欠損（削除）させた細胞（ＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子欠損細胞）や、塩基の置換、欠失、又は挿入に係る変異を導入することによってＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子を破壊した細胞（ＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子破壊細胞）が特に好ましい。染色体に組み込まれたｓｉＲＮＡ等は継代により消失してしまう可能性が否定できないが、ＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子自体を欠損又は変異させた細胞では、継代によりＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子の発現量が回復するリスクがないためである。ＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子欠損細胞やＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子破壊細胞は、特定の遺伝子の染色体からの削除や遺伝子変異導入に通常使用される各種手法によって製造することができる。

例えば、人工ヌクレアーゼ（ＤＮＡに特異的に結合するドメインと、制限酵素ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインを連結させたキメラタンパク質）を用いることにより、ＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子破壊細胞を製造することができる。人工ヌクレアーゼは、ＤＮＡに特異的に結合するドメインにより染色体中の特定の領域（標的配列）に結合した後、制限酵素ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインが２量体を形成することによって染色体ＤＮＡを切断する。具体的には、例えば、標的のＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子について、染色体中の当該遺伝子領域中に切断部位を設定し、当該切断部位を挟む近接する２つの部分塩基配列をそれぞれ標的配列とする２種類の人工ヌクレアーゼを作製し、これらを培養細胞に導入させる。培養細胞内に導入された人工ヌクレアーゼは、染色体中のそれぞれの近接する標的配列に結合して２量体となり、染色体ＤＮＡを切断する。切断された染色体ＤＮＡが非相同末端連結修復又は相同組換え修復する際に変異（塩基の欠失、挿入、又は置換）が導入される結果、当該ＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子が破壊される。

人工ヌクレアーゼとしては、例えば、ＤＮＡ結合ドメインとしてＴＡＬ（Transcriptional Activator-Like）エフェクターを用いたＴＡＬＥＮ（TAL effecter nuclease）や、ＤＮＡ結合ドメインとしてZinc-Fingerを用いたＺＦＮ（Zinc Finger Nuclease）がある。これらの人工ヌクレアーゼは、標的とするＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子の塩基配列情報に基づき、常法により作製できる。また、例えば、GeneArt（登録商標） Precision TALs（ライフテクノロジーズ社製）等の市販のキットを用いて製造することもできる。

また、ＲＧＥＮ（RNA guided endonuclease）を用いることによっても、ＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子破壊細胞を製造することができる。ＲＧＥＮは、バクテリアの獲得免疫システムであるCRISPR/Casシステム由来のＲＮＡ誘導型人工ヌクレアーゼであり、染色体中の切断する標的配列を認識するガイドＲＮＡとＣａｓ９エンドヌクレアーゼとからなる。具体的には、まず、標的とするＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子の塩基配列情報に基づいてガイドＲＮＡを設計し、次いで、ガイドＲＮＡを細胞内で発現させるための発現ベクターと、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを細胞内で発現させるための発現ベクターとを、共に培養細胞に導入する。当該細胞内で発現したガイドＲＮＡは、染色体中の標的配列に結合し、この結合したガイドＲＮＡを同じく細胞内で発現したＣａｓ９エンドヌクレアーゼが認識して染色体ＤＮＡごと切断する。切断された染色体ＤＮＡが非相同末端連結修復又は相同組換え修復する際に変異（塩基の欠失、挿入、又は置換）が導入される結果、当該ＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子が破壊される。

人工ヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡを細胞内で発現させるための発現ベクター、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを細胞内で発現させるための発現ベクター等の培養細胞への導入は、例えば、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法等により行うことができる。

本発明に係るインフルエンザウイルス産生用細胞を作製するに当たり、ＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子の発現が抑制される培養細胞は、インフルエンザウイルスが感染して細胞内において増殖することが可能な培養細胞であれば特に限定されるものではなく、産生するインフルエンザウイルスの種類や宿主等を考慮して、各種培養細胞の中から適宜決定することができる。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、トラ等の哺乳類；ニワトリ、アヒル、ウズラ、ガチョウ、カモ、シチメンチョウ、セキセイインコ、オウム、オシドリ、ハクチョウ等の鳥類に由来する培養細胞を用いることができる。また、培養細胞が由来する組織も、特に限定されるものではなく、例えば、腎臓、肺、肝臓、皮膚、結合組織、卵巣、子宮、血球、リンパ組織、口腔、食道、胃、小腸、大腸、胎仔等に由来する培養細胞を用いることができる。具体的には、汎用されている培養細胞のうち、ＨＥＫ２９３細胞、ＭＤＣＫ（Madin-Darby canine kidney）細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ａ５４９細胞、Ｃａｌｕ－３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、３Ｔ３－Ｌ１細胞、ＣＨＯ細胞、ＤＦ－１細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＬ－６０細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｃａｃｏ－２細胞等が挙げられる。中でも、細胞の増殖性が良好であり、かつ取扱いが比較的容易であることから、ＨＥＫ２９３細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞がより好ましい。

なお、ヒトに由来する培養細胞とは、ヒトから採取された細胞を人為的に生体外で培養した細胞、又は当該細胞から継代培養された細胞を意味する。同様に、腎臓由来の細胞とは、動物の腎臓から採取された細胞を人為的に生体外で培養した細胞、又は当該細胞から継代培養された細胞を意味する。他の動物種又は組織由来の培養細胞も同様である。

本発明に係るインフルエンザウイルス産生用細胞は、ＦｌｕＶ増殖抑制遺伝子の発現が抑制される前の培養細胞と同様の条件で培養することができる。例えば、哺乳動物に由来する培養細胞の場合には、５％二酸化炭素雰囲気下、３７℃で培養することができる。培養に用いる培地としては、例えば、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＥＭＥＭ培地（イーグル最小必須培地）、ＭＥＭ（minimum essential medium）α培地、ＲＰＭＩ－１６４０培地等が挙げられる。これらの培地には、必要に応じて、血清、抗生物質、Ｌ－グルタミン等のアミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ビタミン類、インスリン、トランスフェリン、セレン、重炭酸ナトリウム塩等の各種添加剤を含有させることができる。

本発明に係るインフルエンザウイルス産生用細胞にインフルエンザウイルスを感染させた後、培養することにより、当該細胞内でインフルエンザウイルスが増殖する。増殖したインフルエンザウイルスは、培地中に分泌される。そこで、本発明に係るインフルエンザウイルス産生用細胞にインフルエンザウイルスを感染させる感染工程と、インフルエンザウイルスを感染させた細胞を培養培地中で培養する培養工程と、培養工程後、インフルエンザウイルスを含む培養上清を回収するウイルス回収工程と、により、インフルエンザウイルスを産生することができる。培養上清中のインフルエンザウイルスは、常法により精製することができる。

本発明に係るインフルエンザウイルス産生用細胞に感染させるインフルエンザウイルスは、いずれの型であってもよいが、Ａ型インフルエンザウイルス又はＢ型インフルエンザウイルスが好ましく、哺乳類又は鳥類に感染し得るインフルエンザウイルスがより好ましく、ヒトに感染し得るインフルエンザウイルスがさらに好ましい。

本発明に係るインフルエンザウイルス産生用細胞は、充分な増殖性を備えつつ、インフルエンザウイルスの増殖性も良好であるため、当該細胞により、インフルエンザウイルスを効率よく増殖させることができる。また、鶏卵内で増殖させた場合よりも、増殖の工程でインフルエンザウイルスに変異が生じるおそれが低い。このため、本発明に係るインフルエンザウイルス産生用細胞は、ワクチンを製造するためのインフルエンザウイルスの産生に好適に用いられる。具体的には、本発明に係るインフルエンザウイルス産生用細胞に感染させるウイルスを、インフルエンザウイルスワクチンを製造するためのインフルエンザウイルスとする。

次に、実施例等により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。

＜細胞の培養＞
以下の実施例において、ＨＥＫ２９３細胞及びＶｅｒｏ細胞は、１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）と抗生物質を含有させたＤＭＥＭ培地（シグマアルドリッチ社製）で、５％二酸化炭素雰囲気下、３７℃で培養した。ＭＤＣＫ細胞は、５％ＮＣＳ（ウシ新生児血清）含有ＥＭＥＭ培地（GIBCO社製）で、５％二酸化炭素雰囲気下、３７℃で培養した。

＜インフルエンザウイルス＞
以下の実施例において使用したインフルエンザウイルスは、特に記載のない限り、Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ＷＳＮ／３３，Ｈ１Ｎ１サブタイプ；ＷＳＮ）を用いた。当該ウイルスは、マウスに適応したヒト由来インフルエンザウイルスであり、リバースジェネティックスを用いた手法（非特許文献２参照。）により作製されたものであり、ＭＤＣＫ細胞中で増殖させた。また、ウイルスの力価は、ＭＤＣＫ細胞を用いたプラークアッセイにより測定した（非特許文献３参照。）。

［実施例１］
＜インフルエンザウイルスタンパク質と相互作用する宿主タンパク質の同定＞
本発明者らは、まず、免疫沈降法により、インフルエンザウイルスタンパク質と相互作用する宿主タンパク質を同定した。
具体的には、まず、１１種のインフルエンザウイルスタンパク質（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＳ２、及びＰＢ１－Ｆ２）について、それぞれ、Ｎ末端又はＣ末端にＦｌａｇタグを融合させたＦｌａｇ融合タンパク質をコードするプラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトとした。トランスフェクションは、TransIT 293 reagent（Mirus Bio Corp製）を用いて行った。トランスフェクションから２４時間培養した細胞を、細胞溶解バッファー（50 mM Tris-HCl (pH 7.5)，150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% Nonidet P-40, protease inhibitor mixture Complete Mini (Roche, Mannheim, Germany)）に混合し、４℃、１時間インキュベートすることにより溶解させてライセートを得た。得られたライセートを遠心分離処理して回収した上清に、抗Ｆｌａｇ抗体が結合したアフィニティゲル（anti-FLAG M2 Affinity Gel、シグマアルドリッチ社製）を混合して４℃、１８時間インキュベートした。その後、アフィニティゲルを、細胞溶解バッファーで３回、次いでＩＰ（免疫沈降）バッファー（50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA）で２回洗浄した後、０．５ｍｇ／ｍＬのＦＬＡＧペプチド（F1804，シグマアルドリッチ社製) を含有させたＩＰバッファーで４℃、２時間撹拌した。その後、遠心分離処理によりアフィニティゲルを除去し、上清を回収した。
回収された上清を、Ultrafree-MC filter（ミリポア社製）でフィルター濾過した後、含有されているタンパク質を、ｎａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（nanoflow liquid chromatography tandem mass spectrometry）分析により同定した。マススペクトリデータの解析には、Dina（ケーワイエーテクノロジーズ社製）を組み合わせたQ-STAR Elite（エービー・サイエックス社製）を用いた。免疫共沈降したＨＥＫ２９３細胞（宿主細胞）のタンパク質の同定は、得られたＭＳ／ＭＳシグナルを、ＲｅｆＳｅｑ（National Center for Biotechnology Informationヒトタンパク質データベース）と比較して行った。当該比較は、マスコットアルゴリズム（version 2.2.04；Matrix Science社製）を用い、下記の条件で行った：variable modifications, oxidation (Met), N-acetylation; maximum missed cleavages, 2; peptide mass tolerance, 200 ppm; MS/MS tolerance, 0.5 Da.）。タンパク質の同定は、マスコットスコアが有意に閾値を超えるＭＳ／ＭＳシグナルが少なくとも１つあることを条件とした。

この結果、３８８個の宿主タンパク質がＰＢ２タンパク質と免疫共沈降し、３２２個の宿主タンパク質がＰＢ１タンパク質と免疫共沈降し、３０４個の宿主タンパク質がＰＡタンパク質と免疫共沈降し、３５１個の宿主タンパク質がＨＡタンパク質と免疫共沈降し、５７４個の宿主タンパク質がＮＰタンパク質と免疫共沈降し、６７５個の宿主タンパク質がＮＡタンパク質と免疫共沈降し、６５９個の宿主タンパク質がＭ１タンパク質と免疫共沈降し、５３１個の宿主タンパク質がＭ２タンパク質と免疫共沈降し、１１３個の宿主タンパク質がＮＳ１タンパク質と免疫共沈降し、４２個の宿主タンパク質がＮＳ２タンパク質と免疫共沈降し、８１個の宿主タンパク質がＰＢ１－Ｆ２タンパク質と免疫共沈降した。つまり、合計１２９２個の宿主タンパク質が、１１種のインフルエンザウイルスタンパク質のいずれかと免疫共沈降した。

＜ｓｉＲＮＡ＞
次いで、免疫沈降により同定された１２９２個の宿主タンパク質をコードする遺伝子について、ＲＮＡ干渉を行い、これらのタンパク質が実際にインフルエンザウイルスの増殖に関与するか否かを調べた。使用するｓｉＲＮＡは、各宿主遺伝子について、それぞれ、ゲノムワイドＨｕｍａｎｓｉＲＮＡＬｉｂｒａｒｙ（FlexiTube siRNA；キアゲン社製）から２種類を選択して用いた。また、ネガティブコントロールとして、AllStars Negative Control siRNA（キアゲン社製）（コントロールｓｉＲＮＡ）を用いた。また、ＷＳＮウイルスのＮＰ遺伝子のｓｉＲＮＡ（GGA UCU UAU UUC UUC GGA GUU）は、シグマアルドリッチ社から購入した。
具体的には、まず、RNAiMAX Reagent（Invitrogen社製）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞に、２種類のｓｉＲＮＡを２５ｎＭずつ（最終濃度：５０ｎＭ）、２回トランスフェクションした。

＜細胞の生存性＞
ｓｉＲＮＡの２回目のトランスフェクションから２４時間経過後の細胞の生存性を、CellTiter－Glo assay system（プロメガ社製）を添付の指示書に従って用いて調べた。コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞の生細胞数に対する、各ｓｉＲＮＡを導入した細胞の生細胞数の割合を、細胞生存率（％）として算出した。

＜ｑＲＴ－ＰＣＲ＞
ｓｉＲＮＡのトランスフェクション前とトランスフェクションから４８時間経過後の細胞について、ｑＲＴ－ＰＣＲ（quantitative reverse transcription-PCR）を行い、ｓｉＲＮＡにより標的の宿主遺伝子の発現が抑制されたかを確認した。
具体的には、まず、前記＜ｓｉＲＮＡ＞と同様にしてｓｉＲＮＡをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、２回目のトランスフェクションから４８時間経過後の細胞を、前記細胞溶解バッファーに溶解させてライセートを調製した。調製されたライセートから、Maxwell 16 LEV simplyRNA Tissue Kit（プロメガ社製）を用いて、総ＲＮＡを抽出し、これを鋳型として、ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（東洋紡社製）又はSuperScript III Reverse Transcriptase（Invitrogen社製）を用いて逆転写反応を行った。合成されたｃＤＮＡを鋳型とし、各宿主遺伝子に特異的なプライマーセットとTHUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（東洋紡社製）を用いて、定量的ＰＣＲを行った。各宿主遺伝子のｍＲＮＡ発現量レベルの比較は、β－アクチンを内在性標準物質とし、ΔΔＣｔ法により算出した。コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞におけるｍＲＮＡ発現量に対する、各ｓｉＲＮＡを導入した細胞におけるｍＲＮＡ発現量の割合を、ノックダウン効率（％）として算出した。

＜ウイルスの増殖性＞
２つの２４ウェルディッシュに、前記＜ｓｉＲＮＡ＞と同様にしてｓｉＲＮＡをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、２回目のトランスフェクション後の細胞に５０ｐｆｕ（plaque-forming unit）のインフルエンザウイルスを感染させた。ウイルス感染から４８時間経過後、培養上清を回収し、ＭＤＣＫ細胞を用いたプラークアッセイにより、ウイルスの力価を調べた。各ｓｉＲＮＡを導入した細胞におけるウイルス力価の常用対数値を、コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞におけるウイルス力価の常用対数値で割った値を、ウイルス力価の変化量として算出した。

この結果、３２３個の宿主遺伝子において、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより遺伝子発現レベルが低下した。この３２３個のうち、２５個の宿主遺伝子では、細胞の生存率はいずれも６０％以上であり、細胞の増殖はあまり損なわれていないが、常用対数値で１以上インフルエンザウイルスの力価が向上した（すなわち、ウイルス力価の変化量が１以上）。前記２５個の宿主遺伝子のウイルス力価の変化量、及び細胞生存率（％）を、表１に示す。これらの結果から、これらの２５の遺伝子のうち少なくとも１の遺伝子の発現が抑制された培養細胞では、充分な増殖能を有し、かつインフルエンザウイルスの増殖能が高く、インフルエンザウイルス産生に好適であることが明らかである。

［実施例２］
アフリカミドリザル(Cercopithecus aethiops)の腎臓上皮細胞由来の培養細胞株Ｖｅｒｏ細胞に対して、表１に記載の２５の遺伝子の発現量を低下させ、インフルエンザウイルスの増殖性に対する影響を調べた。
各遺伝子の発現量の低下は、ＨＥＫ２９３細胞に代えてＶｅｒｏ細胞を用いた以外は、実施例１で用いたｓｉＲＮＡを用いて実施例１と同様にして行った。具体的には、実施例１の＜ｓｉＲＮＡ＞と同様にしてｓｉＲＮＡをＶｅｒｏ細胞にトランスフェクションし、２回目のトランスフェクション後の細胞に５０ｐｆｕのインフルエンザウイルスを感染させた。ウイルス感染から４８時間経過後、培養上清を回収し、ＭＤＣＫ細胞を用いたプラークアッセイにより、ウイルスの力価を調べた。各ｓｉＲＮＡを導入した細胞におけるウイルス力価（ｐｆｕ）を、コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞におけるウイルス力価（ｐｆｕ）で割った値を、ウイルス力価（コントロールに対する相対値（％））として算出した。算出結果を図１に示す。

この結果、前記２５種の遺伝子のうち、ＡＣＴＧ１遺伝子、ＡＣＴＮ１遺伝子、ＤＡＰ３遺伝子、ＧＮＡＩ２遺伝子、ＧＴＦ３Ｃ５遺伝子、ＫＲＴ１８遺伝子、ＭＴＣＨ１遺伝子、ＰＲＰＳ１遺伝子、ＲＰＳ１９遺伝子、Ｓ１００Ａ１０遺伝子、ＳＦＲＳ７遺伝子、ＳＬＣ２Ａ１２遺伝子、及びＵＳＰ１０遺伝子の１３種の遺伝子については、２種類のｓｉＲＮＡのうちの少なくとも一方を導入した細胞において、コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞よりもウイルス力価が高くなっていた。この結果から、これらの１３種の遺伝子の発現を抑制することにより、サル由来の培養細胞においても、ヒト由来の培養細胞と同様にインフルエンザウイルス増殖促進効果が得られることが明らかである。

なお、前記２５種の遺伝子のうち、残りの１２種の遺伝子については、ｓｉＲＮＡ導入によるインフルエンザウイルス増殖促進効果は確認できなかったが、これは、ヒトゲノムに基づいて作成されたｓｉＲＮＡを使用したため、ＲＮＡ干渉が不充分であり、各遺伝子の発現抑制がうまくいかなかったためと推察される。

［実施例３］
イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来の培養細胞株ＭＤＣＫ細胞に対して、表１に記載の２５の遺伝子の発現量を低下させ、インフルエンザウイルスの増殖性に対する影響を調べた。
具体的には、Ｖｅｒｏ細胞に代えてＭＤＣＫ細胞を用いたこと、及び各宿主遺伝子について、それぞれ、ゲノムワイドＨｕｍａｎｓｉＲＮＡＬｉｂｒａｒｙから２種類ではなく３種類のｓｉＲＮＡを選択して用いたこと以外は、実施例１と同様にして、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞にインフルエンザウイルスを感染させて培養し、培養上清のウイルス力価の変化量（各ｓｉＲＮＡを導入した細胞におけるウイルス力価の常用対数値を、コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞におけるウイルス力価の常用対数値で割った値）を調べた。測定結果を表２に示す。

この結果、ＵＳＰ１０遺伝子、ＫＲＴ１８遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ遺伝子、及びＴＭＥＤ２遺伝子の４種の遺伝子については、３種類のｓｉＲＮＡのうちの少なくとも一種類のｓｉＲＮＡを導入した細胞において、ウイルス力価の変化量が０．５以上であり、コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞よりもウイルス力価が高くなっていた。この結果から、これらの４種の遺伝子の発現を抑制することにより、イヌ由来の培養細胞においても、ヒト由来の培養細胞と同様にインフルエンザウイルス増殖促進効果が得られることが明らかである。

なお、２５種の遺伝子のうち、前記４種以外の遺伝子については、ｓｉＲＮＡ導入によるインフルエンザウイルス増殖促進効果は確認できなかった。これは、ヒトゲノムに基づいて作成されたｓｉＲＮＡを使用したため、ＲＮＡ干渉が不充分であり、各遺伝子の発現抑制がうまくいかなかったためと推察される。

［実施例４］
ＲＧＥＮにより、ＭＤＣＫ細胞中の表１に記載の２５種の遺伝子のうち、ＫＲＴ１８遺伝子及びＵＳＰ１０遺伝子の遺伝子破壊細胞を製造し、インフルエンザウイルスの産生能を調べた。

具体的には、まず、各遺伝子について、塩基配列情報に基づいて染色体中の切断する標的配列を認識するガイドＲＮＡを設計した。１つの標的遺伝子につき、２つのガイドＲＮＡを設計した。次いで、ガイドＲＮＡを細胞内で発現させるための発現ベクターと、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを細胞内で発現させるための発現ベクターとを、共にＭＤＣＫ細胞に導入した後、薬剤による選択を行った。薬剤選択により生き残ったクローンから、１つのガイドＲＮＡを導入した細胞につき０～２０個のクローンを標的の遺伝子の遺伝子破壊細胞としてピックアップし、個別に培養した。作出した各遺伝子の遺伝子破壊ＭＤＣＫ細胞は、ＭＥＭ（minimum essential medium)で、炭酸ガス培養器中で５％二酸化炭素雰囲気下、３７℃で培養した。

作出した遺伝子破壊ＭＤＣＫ細胞のインフルエンザウイルスの増殖効率を調べるために、各クローンを３穴ずつ、１２穴プレートに播種し、炭酸ガス培養器中、３７℃で数日間培養した。クローン当たり３穴ずつ播種したのは、triplicateで実験を行うためである。各穴の細胞について、コンフルエントになったのを確認した後、ＭＥＭで洗浄した後、０．１ｍＬのインフルエンザウイルスをＭＯＩ（multiplicity of infection、細胞一個あたりのウイルスの感染個数）がおよそ０．００１になるように感染させ、炭酸ガス培養器中、３７℃で１時間培養した。培養後、各穴からウイルス液を除去し、１μｇ／ｍＬトリプシンを含有するＭＥＭを１ｍＬ／穴ずつ添加し、さらに炭酸ガス培養器中、３７℃で２日間培養した。培養後の各穴の培養上清を回収し、ＭＤＣＫ細胞においてプラークアッセイを行い、ウイルス力価（ｐｆｕ）を測定した。各遺伝子破壊ＭＤＣＫ細胞のウイルス力価（ｐｆｕ）を、コントロール細胞（ＲＧＥＮにおいてガイドＲＮＡを含まない発現ベクターを導入したＭＤＣＫ細胞）におけるウイルス力価（ｐｆｕ）で割った値を、ウイルス力価（コントロールに対する相対値（％））として算出した。算出結果を表３に示す。表３中の各クローンのウイルス力価（コントロールに対する相対値（％））は、３穴の結果の平均値とｓｄで示す。

表３に示すように、ＫＲＴ１８遺伝子及びＵＳＰ１０遺伝子の遺伝子破壊細胞では、コントロール細胞に比べて高いウイルス力価を示し、コントロール細胞の３倍以上のウイルス力価を示すクローンもいくつかあった。これらの結果から、ＫＲＴ１８遺伝子又はＵＳＰ１０遺伝子の機能を破壊した培養細胞では、インフルエンザウイルスの産生能が高まることが示された。

Claims

染色体中のＴＭＥＤ２遺伝子の発現が抑制されている、生体外で培養可能なＨＥＫ２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、又はＭＤＣＫ細胞であることを特徴とする、インフルエンザウイルス産生用細胞。
ＴＭＥＤ２遺伝子が欠損又は破壊されている、請求項１に記載のインフルエンザウイルス産生用細胞。
染色体中のＴＭＥＤ２遺伝子の発現が抑制されている、生体外で培養可能なＨＥＫ２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、又はＭＤＣＫ細胞に、インフルエンザウイルスを感染させた後、培養することを特徴とする、インフルエンザウイルスの産生方法。
前記インフルエンザウイルスが、インフルエンザウイルスワクチンを製造するためのインフルエンザウイルスである、請求項３に記載のインフルエンザウイルスの産生方法。
前記細胞が、ＴＭＥＤ２遺伝子が欠損又は破壊されている、請求項３又は４に記載のインフルエンザウイルスの産生方法。
染色体中のＴＭＥＤ２遺伝子の発現が抑制されている、生体外で培養可能な細胞（ただし、ヒト自体を構成している細胞を除く。）に、インフルエンザウイルスを感染させた後、培養し、産生されたインフルエンザウイルスからインフルエンザウイルスワクチンを製造する、インフルエンザウイルスワクチンの製造方法。
前記細胞が、ＴＭＥＤ２遺伝子が欠損又は破壊されている、請求項６に記載のインフルエンザウイルスワクチンの製造方法。
前記細胞が、哺乳類由来の細胞である、請求項６又は７に記載のインフルエンザウイルスワクチンの製造方法。
前記細胞が、ヒト由来の細胞である、請求項８に記載のインフルエンザウイルスワクチンの製造方法。
前記細胞が、腎臓由来の細胞である、請求項８に記載のインフルエンザウイルスワクチンの製造方法。