JP7048567B2 - 二重特異性抗原結合ポリペプチド - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、２０１４年３月２１日出願の米国仮特許出願第６１／９６８，４３７号に基づく優先権を主張する。該出願の内容は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれる。

抗体および抗体様分子のような二重特異性抗原結合ポリペプチドは、同時に複数の抗原を標的とするそれらの能力のために治療薬として大いに期待されている。しかしながら、これらの分子の製造には課題がある。二重特異性抗体の場合、製造時に重鎖および軽鎖の誤対合が生じることが多く、それにより、二重特異性抗体の収量が低下し、精製が困難になる。

二重特異性抗体の製造に関する課題を解決するために、抗体定常領域または可変領域において複雑な技術が試みられている。例えば、二重特異性抗体は、個々の抗体のＶＨおよびＶＬをリンカーを介して遺伝子的に融合させて作製されてきた（例えば、ＵＳ２０１０／０２５４９８９Ａ１を参照のこと）。別の方法では、個々の抗体を、Ｆａｂ交換に関与するヒトＩｇＧ４のＦｃ中の残基の変異を用いて製造している（例えば、Van der Neut at al., Science (2007) 317: 1554を参照のこと）。さらに別の方法において、マウスクアドローマを二重特異性抗体を作製するために用いた。この方法において、マウスおよびラットの抗体は、元々のＶＨ／ＶＬ対ならびにラットおよびマウスＦｃからなる二重特異性抗体を主に形成する（例えば、Lindhofer et al., J Immunol. (1995) 155: 1246－1252を参照のこと）。最近では、二重特異性抗体は、抗原結合に寄与しない単一の共有の軽鎖を用いて製造されている（例えば、Merchant et al., Nature Biotechnology (1998) 16: 677－681を参照のこと）。しかしながら、これらの大きな抗体作製技術の努力にもかかわらず、二重特異性抗体は、依然として安定性が低く、機能的発現収量が低いままである。

従って、高度に発現され、容易に精製される、新規の抗原結合ポリペプチドのための技術が必要とされている。

米国特許出願第２０１０／０２５４９８９号明細書

Van der Neut at al., Science (2007) 317: 1554 Lindhofer et al., J Immunol. (1995) 155: 1246－1252 Merchant et al., Nature Biotechnology (1998) 16: 677－68

本発明は、高度に発現され、容易に精製され、高度に安定化され、かつそれらの標的抗原に対して高い親和性を有する、二重特異性抗原結合ポリペプチドを提供する。ある態様において、二重特異性抗原結合ポリペプチドは、ＰＤＧＦＲβおよびＨＥＲ２の両方に高い親和性で結合し、そしてＰＤＧＦＲβおよびＨＥＲ２活性の両方を阻害(antagonize)する。ある態様において、二重特異性抗原結合ポリペプチドは、ＰＤＧＦＲβおよびＶＥＧＦの両方に高い親和性で結合し、そしてＰＤＧＦＲβおよびＶＥＧＦ活性の両方を阻害する。本発明はまた、ＨＥＲ２に特異的に結合し、そしてＨＥＲ２活性を阻害する新規の抗原結合ポリペプチド（例えば、ＶＨドメイン）を提供する。かかる抗原結合ポリペプチドは、癌の処置に特に有用である。本発明はまた、抗原結合ポリペプチドをコードする核酸、組換え発現ベクターおよびかかる抗原結合ポリペプチドを製造するための宿主細胞を提供する。疾患（例えば、癌）を処置するための本発明の抗原結合ポリペプチドの使用方法もまた、本発明に包含される。

従って、一面において、本発明は、第二抗原に特異的に結合する第二ＶＨドメインにＣ末端で連結されている、第一抗原に特異的に結合する第一ＶＨドメインを含む抗体重鎖を含み、抗体軽鎖を含まない、単離された二重特異性抗原結合ポリペプチドを提供する。

ある態様において、該抗体重鎖は、アミノ酸リンカーを介して第二ＶＨドメインに遺伝子的に連結されている。特定の一態様において、該リンカーは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む。

ある態様において、該抗原結合ポリペプチドは、抗体軽鎖をさらに含み、該軽鎖は、抗原に特異的に結合するＶＬドメインを含み、該重鎖および軽鎖は自然に(naturally)対を形成する。特定の一態様において、ＶＬドメインは第一抗原に結合する。特定の一態様において、ＶＬドメインは第三抗原に結合する。特定の一態様において、第一抗原および第三抗原は同一分子内の異なる領域にある。特定の一態様において、第一抗原と第三抗原とは異なる分子上にある。

ある態様において、本発明は、本明細書に記載の２つの抗原結合ポリペプチドの二量体を含む抗原結合ポリペプチドを提供し、該２つの抗原結合ポリペプチドは、重鎖定常領域を介して自然に二量体化している。

ある態様において、第一抗原と第二抗原とは異なる。特定の一態様において、第一抗原および第二抗原は同一分子内の異なる領域にある。特定の一態様において、第一抗原と第二抗原とは異なる分子上にある。

ある態様において、第一抗原は、ヒトＰＤＧＦＲβまたはＨＥＲ２である。ある態様において、第二抗原は、ヒトＰＤＧＦＲβまたはＨＥＲ２である。

ある態様において、抗原結合ポリペプチドは、ヒトＨＥＲ２に特異的に結合するＶＨドメインを含み、かつ配列番号１、４、７および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む。ある態様において、ＶＨドメインは、配列番号２、５、８および１１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２をさらに含む。ある態様において、ＶＨドメインは、配列番号３、６、９および１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１をさらに含む。ある態様において、ＶＨドメインアミノ酸配列は、配列番号１３、１４、１５および１６からなる群より選択されるＶＨドメインアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する。ある態様において、ＶＨドメインは、配列番号１３、１４、１５および１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

ある態様において、抗原結合ポリペプチドは、ヒトＰＤＧＦＲβに特異的に結合するＶＨドメインを含み、かつ配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む。ある態様において、ＶＨドメインは、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２をさらに含む。ある態様において、ＶＨドメインは、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１をさらに含む。ある態様において、ＶＨドメインは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含む。

ある態様において、抗原結合ポリペプチドは、配列番号１８または２０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

ある態様において、抗原結合ポリペプチドは、ヒトＰＤＧＦＲβに特異的に結合するＶＬドメインを含み、かつ配列番号２９に記載のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む。ある態様において、ＶＬドメインは、配列番号３０に記載のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２をさらに含む。ある態様において、ＶＬドメインは、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１をさらに含む。ある態様において、ＶＬドメインは、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む。

ある態様において、抗原結合ポリペプチドは、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む。

別の面において、本発明は、配列番号１、４、７および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、ＨＥＲ２に特異的に結合する単離された抗原結合ポリペプチドを提供する。

ある態様において、抗原結合ポリペプチドは、配列番号１、４、７および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む。ある態様において、ＶＨドメインは、配列番号２、５、８および１１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２をさらに含む。ある態様において、ＶＨドメインは、配列番号３、６、９および１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１をさらに含む。ある態様において、ＶＨドメインは、配列番号１３、１４、１５および１６からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＶＨドメインは、配列番号１３、１４、１５および１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

別の面において、本発明は、配列番号１３、１４、１５および１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインと同じＨＥＲ２上のエピトープに結合する抗原結合ポリペプチドを提供する。ある態様において、抗原結合ポリペプチドはＶＨドメインを含む。

別の面において、本発明は、配列番号１３、１４、１５および１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインとＨＥＲ２に対する結合について競合する抗原結合ポリペプチドを提供する。ある態様において、抗原結合ポリペプチドはＶＨドメインを含む。

さらなる面において、本発明は、本発明の抗原結合ポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。

さらなる面において、本発明は、本発明の抗原結合ポリペプチドをコードする単離された核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。

さらなる面において、本発明は、本発明の抗原結合ポリペプチドを発現する宿主細胞を提供する。

さらなる面において、本発明は、本発明の抗原結合ポリペプチドを製造する方法であって、該抗原結合ポリペプチドが宿主細胞により産生されるような条件下で、本発明の結合ポリペプチドを発現可能な宿主細胞を培養することを含む方法を提供する。

さらなる面において、本発明は、本発明の抗原結合ポリペプチドおよび１つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

さらなる面において、本発明は、本発明の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、疾患または障害の処置法を提供する。ある態様において、該疾患または障害は癌（例えば、乳がんおよび卵巣癌）である。

図１は、本発明の例示的な二重特異性抗原結合ポリペプチドの概念図である。 図２は、本発明の例示的な二重特異性抗原結合ポリペプチドの概念図である。 図３は、本発明の例示的な二重特異性抗原結合ポリペプチドの概念図である。 図４は、本発明の例示的な二重特異性抗原結合ポリペプチドの概念図である。 図５は、還元および非還元条件下での、本発明の例示的な二重特異性抗原結合ポリペプチドのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。 図６は、ＨＥＫ２９３細胞培養上清中のＨＥＲ２／ＰＤＧＦＲβ二重特異性抗原結合ポリペプチドの発現を検出するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。 図７は、ＨＥＲ２およびＰＤＧＦＲβへのＨＥＲ２／ＰＤＧＦＲβ二重特異性抗原結合ポリペプチドの同時結合を測定するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。 図８は、ＨＥＲ２およびＰＤＧＦＲβを発現する細胞表面へのＨＥＲ２／ＰＤＧＦＲβ二重特異性抗原結合ポリペプチドの同時結合を測定するＦＡＣＳベースの結合アッセイの結果を示す。 図９は、本明細書に記載の例示的な抗ＨＥＲ２ ＶＨドメインのＢｉａｃｏｒｅ分析およびＦＡＣＳ分析の結果を示す。 図１０は、本明細書に記載の例示的な抗ＨＥＲ２ ＶＨドメインおよびｓｃＦｖ誘導体のＢｉａｃｏｒｅ分析およびＦＡＣＳ分析の結果を示す。 図１１は、ＳＫ－ＢＲ－３細胞の増殖に対する、抗ＨＥＲ２ ＶＨ Ｂ１２、トラスツズマブ、ペルツズマブおよびそれらの組み合わせの効果を測定するＭＴＳ細胞増殖アッセイの結果を示す。 図１２は、本発明の例示的な抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合ポリペプチドの概念図である。

詳細な説明
本発明は、高度に発現され、容易に精製され、高度に安定で、かつそれらの標的抗原に対して高い親和性を有する、二重特異性抗原結合ポリペプチドを提供する。ある態様において、二重特異性抗原結合ポリペプチドは、ＰＤＧＦＲβおよびＨＥＲ２の両方に高い親和性を有して結合し、ＰＤＧＦＲβおよびＨＥＲ２活性の両方を阻害する。ある態様において、二重特異性抗原結合ポリペプチドは、ＰＤＧＦＲβおよびＶＥＧＦの両方に高い親和性を有して結合し、ＰＤＧＦＲβおよびＶＥＧＦ活性の両方を阻害する。本発明はまた、ＨＥＲ２に特異的に結合し、ＨＥＲ２活性を阻害する、新規の抗原結合ポリペプチド（例えば、ＶＨドメイン）を提供する。かかる抗原結合ポリペプチドは、癌の処置に特に有用である。本発明はまた、抗原結合ポリペプチドをコードする核酸、組換え発現ベクターおよびかかる抗原結合ポリペプチドを産生する宿主細胞を提供する。疾患（例えば、癌）の処置のための本発明の抗原結合ポリペプチドの使用法もまた、本発明に包含される。

I. 定義
本発明がより容易に理解されるようにするために、特定の用語を最初に定義する。
本明細書で用いる用語“ＰＤＧＦＲβ”は、血小板由来増殖因子受容体βを意味する。ＰＤＧＦＲβヌクレオチドおよびポリペプチド配列は当技術分野でよく知られている。例示的なヒトＰＤＧＦＲβアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ ｄｅｐｏｓｉｔ ＧＩ：４５０５６８３に記載されており、例示的なマウスＰＤＧＦＲβアミノ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ ｄｅｐｏｓｉｔ ＧＩ：２２６３７１７５２に記載されている。

本明細書で用いる用語“ＨＥＲ２”は、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ－２を意味する。ＨＥＲ２ヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、当技術分野でよく知られている。例示的なヒトＨＥＲ２アミノ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ ｄｅｐｏｓｉｔ ＧＩ：５４７９２０９６に記載されており、例示的なマウスＨＥＲ２アミノ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ ｄｅｐｏｓｉｔ ＧＩ：５４８７３６１０に記載されている。

本明細書で用いる用語“ＶＥＧＦ”は、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＰＩＧＦ、タンパク質ならびにＶＥＧＦ_１２１、ＶＥＧＦ_１２１ｂ、ＶＥＧＦ_１４５、ＶＥＧＦ_１６５、ＶＥＧＦ_１６５ｂ、ＶＥＧＦ_１８９およびＶＥＧＦ_２０６を含むそのスプライスバリアントを含む、血管内皮細胞増殖因子ファミリーの全てのメンバーを意味する。ＶＥＧＦヌクレオチド配列およびポリペプチド配列は、当技術分野でよく知られている。例示的なヒトＶＥＧＦアミノ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ ｄｅｐｏｓｉｔ ＧＩ：３２６９９９９０に記載されており、例示的なマウスＶＥＧＦアミノ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ ｄｅｐｏｓｉｔ ＧＩ：ＧＩ：１６０３５８８１５に記載されている。

本明細書で用いる用語“二重特異性抗原結合ポリペプチド”は、２つまたはそれ以上の異なる抗原に同時に特異的に結合できる抗原結合ポリペプチドを意味する。

本明細書で用いる用語“抗原”は、抗原結合ポリペプチドにより認識される結合部位またはエピトープを意味する。

本明細書で用いる用語“抗体”は、ジスルフィド結合によって相互に連結された２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖の４本のポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を意味する。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨと省略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬと省略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域と、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より一定に保たれた領域とにさらに細分され得る。

本明細書で用いる用語、抗体の“抗原結合部位”には、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素化学的に得られる、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質が含まれる。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、抗体の可変ドメインおよび要すれば定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を含む、タンパク質分解または組み換え遺伝子操作技術のような好適な標準技術を用いて、完全長抗体分子から誘導され得る。抗原結合部位の非限定的な例には、（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；および、（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位が含まれる。二重特異性抗体（diabody）、三重特異性抗体（triabody）、四重特異性抗体（tetrabody）およびミニボディのような他の操作された分子もまた、“抗原結合部位”の表現に包含される。

本明細書で用いる用語“ＶＨドメイン”および“ＶＬドメイン”は、ＦＲ（フレームワーク領域）１、２、３および４ならびにＣＤＲ（相補性決定領域）１、２および３をそれぞれ含む、単鎖抗体可変重鎖および軽鎖ドメインを意味する（Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. (NIH Publication No. 91－3242, Bethesda)参照）。

本明細書で用いる用語“自然に(naturally)二量体化している”とは、天然に存在する四量体抗体分子と同様に、重鎖定常領域が連結される、抗原結合ポリペプチドの二量体を意味する。

本明細書で用いる用語“自然に(naturally)対を形成する”とは、天然に存在する四量体抗体分子と同様に、天然の重鎖／軽鎖相互作用部分(interface)を介して連結されている抗体重鎖および軽鎖対を意味する。

本明細書で用いる用語“ＣＤＲ”または“相補性決定領域”は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見いだされる不連続な抗原結合部位を意味する。これらの特定の領域は、Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609－6616 (1977). Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991)、Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901－917 (1987)、およびMacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732－745 (1996)（各々、引用によりその内容全体を本明細書中に包含させる）に記載されており、該定義には、互いに比較した場合、アミノ酸残基の重複（overlap）またはサブセットが含まれる。上記の文献のそれぞれによって定義されるようなＣＤＲを包含するアミノ酸残基は、比較のために記載される。好ましくは、用語“ＣＤＲ”は、配列比較に基づいて、Ｋａｂａｔにより定義されるＣＤＲである。

本明細書で用いる用語“フレームワーク（ＦＲ）アミノ酸残基”は、免疫グロブリン鎖のフレームワーク領域中のアミノ酸を意味する。本明細書で用いる用語“フレームワーク領域”または“ＦＲ領域”は、可変領域の一部であるが、ＣＤＲの一部ではない（例えば、ＣＤＲのＫａｂａｔの定義を使用）、アミノ酸残基を含む。

本明細書で用いる、用語“遺伝子的に連結された”とは、組換えＤＮＡ技術を用いる、２つまたはそれ以上のポリペプチドの連結を意味する。ある態様において、これは、２つまたはそれ以上のポリペプチドの融合物をコードするキメラ遺伝子の製造を伴う。

本明細書で用いる用語“～に特異的に結合する”は、少なくとも約１ｘ１０^－６Ｍ、１ｘ１０^－７Ｍ、１ｘ１０^－８Ｍ、１ｘ１０^－９Ｍ、１ｘ１０^－１０Ｍ、１ｘ１０^－１１Ｍ、１ｘ１０^－１２Ｍ、またはそれ以上のＫｄで抗原に結合する、および／または非特異的抗原に対する親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性で抗原に結合する、結合ポリペプチドの能力を意味する。しかしながら、結合ポリペプチドは、配列に関連のある２つまたはそれ以上の抗原に特異的に結合し得ることが、理解されなければならない。例えば、本発明の結合ポリペプチドは、ヒト抗原およびその抗原の非ヒトオルソログに特異的に結合し得る。

本明細書で用いる用語“ベクター”とは、それが連結されている別の核酸を輸送可能な核酸分子を意味することが意図される。あるタイプのベクターは、さらなるＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを意味する“プラスミド”である。別のタイプのベクターは、付加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされ得るウイルスベクターである。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自己複製可能である（例えば、複製およびエピソーム哺乳動物ベクターの細菌起点を有する細菌ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムと共に複製され得る。さらに、特定のベクターは、作動可能に連結された遺伝子の発現をもたらし得る。そのようなベクターは、本明細書中、“組換え発現ベクター”（または単に、“発現ベクター”）と呼ばれる。一般的に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミド形態であることが多い。用語“プラスミド”および“ベクター”は互換的に用いられ得る。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などの発現ベクターの他の形態を含むことを意図する。

本明細書で用いる用語“宿主細胞”は、組換え発現ベクターが導入された細胞を意味することが意図される。この用語は、特定の対象細胞のみでなく、その細胞の子孫も意味することが意図されると理解されるべきである。特定の修飾が変異または環境の影響のいずれかにより後の世代で起こり得るため、かかる子孫は、実際、親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書で用いる用語“宿主細胞”の範囲内に含まれる。

本明細書で用いる用語“ＰＤＧＦＲβ関連疾患または障害”は、ＰＤＧＦＲβ活性に関連する疾患状態および／または症状を含む。一般的なＰＤＧＦＲβ関連疾患または障害には、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）および癌が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で用いる用語“ＨＥＲ２関連疾患または障害”には、ＨＥＲ２活性と関連する疾患状態および/または症状が含まれる。例示的なＨＥＲ２関連疾患または障害としては、癌（例えば、乳癌および卵巣癌）が含まれるが、それに限定されない。

本明細書で用いる用語“ＶＥＧＦ関連疾患または障害”には、ＶＥＧＦ活性と関連する疾患状態および／または症状が含まれる。例示的なＶＥＧＦ関連疾患または障害としては、血管新生、例えば、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）および癌が含まれるが、それに限定されない。

本明細書で用いる用語“処置する”、“処置の”および“処置”は、本明細書に記載の治療または予防手段を意味する。“処置”の方法は、該疾患もしくは障害または疾患もしくは障害の再発の予防、治療、遅延、その重症度の低下もしくはその１つまたはそれ以上の症状の改善のため、またはそのような処置がない場合に予想される期間を超えて対象の生存を延長するために、該対象に、例えば、疾患または障害（例えば、癌）を有するか、または疾患または障害に罹りやすい素因を有する対象に、本発明の抗体または抗原結合部分を投与することを含む。

本明細書で用いる用語“有効量”は、対象に投与されるとき、疾患または障害の処置、予後予測または診断を行うのに十分な結合ポリペプチドの量を意味する。治療的有効量は、処置される対象および疾患状態、対象の体重および年齢、疾患状態の重篤度、投与方法などによって変わってよく、当業者により容易に決定され得る。投与量は、例えば約１ｎｇから約１０，０００ｍｇ、約１ｕｇから約５，０００ｍｇ、約１ｍｇから約１，０００ｍｇ、または約１０ｍｇから約１００ｍｇの範囲の本発明の結合ポリペプチドであり得る。投与量レジメンは、好適な治療応答を提供するように調整可能である。有効量はまた、結合ポリペプチドの何らかの毒性または有害な効果（すなわち、副作用）を最小化する、および／または有益な効果を増加する量である。

本明細書で用いる用語“対象”は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。

II. 抗ＨＥＲ２抗原結合ポリペプチド
一面において、本発明は、ＨＥＲ２に特異的に結合し、そしてＨＥＲ２活性を阻害(inhibit)する、抗原結合ポリペプチド（例えば、二重特異性抗原結合ポリペプチド、抗体またはその抗原結合フラグメント）を提供する。かかる結合ポリペプチドは、ＨＥＲ２関連疾患または障害（例えば、乳がんおよび卵巣がんなどの癌）の処置に特に有用である。

一般的に、本発明の抗ＨＥＲ２抗原結合ポリペプチドは、ＨＥＲ２に特異的に結合する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列を含む。発明の結合ポリペプチドに使用するのに好適な非限定的なＨＣＤＲ３配列は、本明細書中、配列番号１、４、７または１０に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。他の態様において、ＨＣＤＲ３配列は、配列番号１、４、７または１０に対して少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つなど）の保存的アミノ酸置換を含む、配列番号１、４、７または１０の変異体である。

本明細書に記載のＨＥＲ２結合ＨＣＤＲ３配列を組み込まれ得るポリペプチドは、抗体またはそのフラグメント（例えば、ＶＨドメイン）および免疫グロブリン様ドメインを含むが、それらに限定されない、本発明の抗原結合ポリペプチドを産生するために使用できる。好適な免疫グロブリン様ドメインには、フィブロネクチンドメイン（例えば、Koide et al. (2007), Methods Mol. Biol. 352: 95－109を参照のこと、その内容全体は引用により本明細書中に包含される）、ＤＡＲＰｉｎ（例えば、Stumpp et al. (2008) Drug Discov. Today 13 (15－16): 695－701を参照のこと、その内容全体は引用により本明細書中に包含される）、プロテインＡのＺドメイン（Nygren et al. (2008) FEBS J. 275 (11): 2668－76を参照のこと、その内容全体は引用により本明細書中に包含される）、リポカリン（例えば、Skerra et al. (2008) FEBS J. 275 (11): 2677－83を参照のこと、その内容全体は引用により本明細書中に包含される）、アフィリン（例えば、Ebersbach et al. (2007) J. Mol. Biol. 372 (1): 172－85を参照のこと、その内容全体は引用により本明細書中に包含される）、アフィチン（Affitins）（例えば、Krehenbrink et al. (2008). J. Mol. Biol. 383 (5): 1058－68を参照のこと、その内容全体は引用により本明細書中に包含される）、Ａｖｉｍｅｒ（例えば、Silverman et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23 (12): 1556－61を参照のこと、その内容全体は引用により本明細書中に包含される）、Ｆｙｎｏｍｅｒ（例えば、Grabulovski et al. (2007) J Biol Chem 282 (5): 3196－3204を参照のこと、その内容全体は引用により本明細書中に包含される）、およびクニッツドメインペプチド（例えば、Nixon et al. (2006) Curr Opin Drug Discov Devel 9 (2): 261－8を参照のこと、その内容全体は引用により本明細書中に包含される）が含まれるが、これらに限定されない。

ある態様において、抗ＨＥＲ２抗原結合ポリペプチドは、ＶＨドメインを含む抗体または抗体フラグメントを含む。本発明における使用に適する例示的なＣＤＲおよびＶＨドメインのアミノ酸配列は、本明細書の表１および２に記載されている。

ある態様において、抗ＨＥＲ２ ＶＨドメインは、表１に記載の重鎖ＨＣＤＲ２またはＨＣＤＲ１のアミノ酸配列のいずれか１つから独立して選択されるＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ１配列と共に、配列番号１、４、７または１０に記載のＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。

ある態様において、抗ＨＥＲ２抗原結合ポリペプチドは、それぞれ配列番号１、２および３；４、５および６；７、８および９；ならびに、１０、１１および１２からなる群より選択されるＨＣＤＲ３、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ１アミノ酸配列を含む。

ある態様において、抗ＨＥＲ２抗原結合ポリペプチドは、配列番号１３、１４、１５または１６に記載の少なくとも１つのＶＨアミノ酸配列を含む。

ある態様において、抗ＨＥＲ２抗原結合ポリペプチドは、配列番号１－１２からなる群より選択される１つまたはそれ以上のＣＤＲのアミノ酸配列を含み、ここで、１つまたはそれ以上のＣＤＲ領域アミノ酸配列は、少なくとも１つまたはそれ以上の保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４または５個の保存的アミノ酸置換）を含む。保存的アミノ酸置換には、あるクラスのアミノ酸を同じクラスのアミノ酸により置換することが含まれ、ここで、クラスとは、アミノ酸側鎖の共通の物理化学的特性および相同タンパク質において天然に見出だされる高置換頻度により定義される（例えば、標準Ｄａｙｈｏｆｆ頻度交換マトリックスまたはＢＬＯＳＵＭマトリックスにより決定される）。アミノ酸側鎖の６つの一般的なクラスが分類されており、クラスＩ（Ｃｙｓ）；クラスＩＩ（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）；クラスＩＩＩ（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ）；クラスＩＶ（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；クラスＶ（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）；およびクラスＶＩ（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）が含まれる。例えば、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＧｌｕなどの別のクラスＩＩＩ残基へのＡｓｐの置換は、保存的置換である。従って、抗ＰＤＧＦＲβ抗体における予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じクラスの別のアミノ酸残基で置換されている。抗原結合を排除しないアミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Brummell et al., Biochem. 32:1180－1187 (1993)； Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879－884 (1999)；および、Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412－417 (1997)を参照のこと、それぞれ、その内容全体は引用により本明細書中に包含される）。

ある態様において、本発明は、配列番号１３、１４、１５または１６に記載のＶＨ領域アミノ酸配列と約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨ領域アミノ酸配列および／またはＶＬ領域アミノ酸配列を含む、抗ＨＥＲ２抗原結合ポリペプチドを提供する。

ある態様において、抗ＨＥＲ２抗原結合ポリペプチドは、１．２ｎＭのＫｄでＨＥＲ２に結合する。ある態様において、抗ＨＥＲ２抗原結合ポリペプチドは、１．３９ｘ１０^５Ｍ^－１ｓ^－１の結合速度（on－rate）でＨＥＲ２に結合する。ある態様において、抗ＨＥＲ２抗原結合ポリペプチドは、１．６７ｘ１０^４ｓ^－１の解離速度（off－rate）でＨＥＲ２に結合する。ある態様において、抗ＨＥＲ２抗原結合ポリペプチドは、ｓｃＦｖ分子として形成されたとき、０．８７ｎＭのＫｄでＨＥＲ２に結合する。

ある態様において、抗ＨＥＲ２抗原結合ポリペプチドは、トラスツズマブ（ＣＡＳ＃１８０２８８－６９－１）および／またはペルツズマブ（ＣＡＳ＃３８０６１０－２７－５）とは異なるＨＥＲ２上のエピトープに結合する。ある態様において、抗ＨＥＲ２抗原結合ポリペプチドは、トラスツズマブおよび／またはペルツズマブと同じＨＥＲ２上のエピトープに結合する。ある態様において、抗ＨＥＲ２抗原結合ポリペプチドは、ＨＥＲ２への結合に関してトラスツズマブおよび／またはペルツズマブと競合する。

ある態様において、本明細書に記載の抗ＨＥＲ２抗原結合ポリペプチドは、ＨＥＲ２に結合することにより内在化される。特定の一態様において、該内在化する抗ＨＥＲ２抗原結合ポリペプチドは、細胞傷害性物質（例えば、抗癌剤）に連結されている。好適な非限定的な細胞障害性物質は本明細書に記載されている。

別の面において、本発明は、ＨＥＲ２上の同じエピトープに結合し、および／または配列番号１３、１４、１５または１６に記載のＶＨドメインアミノ酸配列を含む抗原結合ポリペプチドと競合する抗ＨＥＲ２抗原結合ポリペプチドを提供する。かかる抗体は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく競合アッセイを含む常套の競合結合アッセイを用いて同定することができる。

III. 二重特異性抗原結合ポリペプチド
別の面において、本発明は、第一および第二標的抗原に特異的に結合する二重特異性抗原結合ポリペプチドを提供する。任意の２つの抗原は、本発明の二重特異性抗原結合ポリペプチドを用いて標的化され得る。一般的に、本発明の二重特異性抗原結合ポリペプチドは、第一抗原に特異的に結合する第一ＶＨドメインを含む抗体重鎖を含み、ここで、該重鎖は、第二抗原に特異的に結合する第二ＶＨドメインに連結されている。

抗体重鎖は、当技術分野における認識手段（化学的および／または遺伝子的手段）を用いて第二ＶＨドメインに連結されていてよい。ある態様において、抗体重鎖および第二ＶＨドメインは、遺伝子的に連結されている。一態様において、抗体重鎖のＣ末端アミノ酸は、第二ＶＨドメインのＮ末端アミノ酸に連結されている。この結合は、直接、またはリンカーを仲介いて行われる。一態様において、抗体重鎖は、配列番号２３に記載の配列を含むアミノ酸リンカーを介して第二ＶＨドメインのＮ末端アミノ酸に連結されている。

ある態様において、二重特異性抗原結合ポリペプチドは、各抗体重鎖が第一抗原に特異的に結合する第一ＶＨドメインを含む２つの抗体重鎖の二量体であり、ここで、各抗体重鎖は、第二抗原に特異的に結合する第二ＶＨドメインに連結されている。二量体中の２つの抗体重鎖は、天然に存在する、四量体抗体分子に生じる結合と同じ方法で、天然の重鎖二量体結合部分(interface)を介して結合されている。このような構造を有する例示的な二重特異性抗原結合ポリペプチドを、本明細書中の図２および３に記載する。

ある態様において、二重特異性抗原結合ポリペプチドは、抗体軽鎖をさらに含む。ある態様において、軽鎖は、天然に存在する、四量体抗体分子に生じる結合と同じ方法で、天然に軽鎖／重鎖二量体結合部分を介して重鎖と自然に対を形成する。このような構造を有する例示的な二重特異性抗原結合ポリペプチドを、本明細書中の図１および４に記載する。

第一抗原および第二抗原は、同一でも異なっていてもよい。抗原が異なる場合、それらは、同一分子の異なる領域内または異なる分子上にあってよい。ある態様において、第一抗原および第二抗原は細胞表面受容体である。ある態様において、第一抗原は、ＰＤＧＦＲβまたはＨＥＲ２（例えば、ヒトＰＤＧＦＲβまたはＨＥＲ２）である。ある態様において、第二抗原は、ＰＤＧＦＲβまたはＨＥＲ２（例えば、ヒトＰＤＧＦＲβまたはＨＥＲ２）である。特定の一態様において、第一抗原はＰＤＧＦＲβであり、第二抗原はＨＥＲ２である。別の特定の態様において、第一抗原はＨＥＲ２であり、第二抗原はＰＤＧＦＲβである。

ある態様において、ある抗原（第一または第二抗原）は細胞表面受容体であり、別のある抗原（第一または第二抗原）は、リガンド（例えば、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦまたはＥＧＦなどの増殖因子）である。ある態様において、第一抗原は、ＰＤＧＦＲβまたはＶＥＧＦ（例えば、ヒトＰＤＧＦＲβまたはＶＥＧＦ）である。ある態様において、第二抗原はＰＤＧＦＲβまたはＶＥＧＦ（例えば、ヒトＰＤＧＦＲβまたはＶＥＧＦ）である。特定の一態様において、第一抗原はＰＤＧＦＲβであり、第二抗原はＶＥＧＦである。別の特定の態様において、第一抗原はＶＥＧＦであり、第二抗原はＰＤＧＦＲβである。かかる二重特異性抗原結合ポリペプチドは、ＡＭＤおよび癌などのＰＤＧＦＲβ関連疾患およびＶＥＧＦ関連疾患の処置において特に有用である。

第一抗原および第三抗原は、同一分子の異なる領域内または異なる分子上にあってよい。ある態様において、軽鎖は第一抗原に結合し、そして重鎖および軽鎖は、共作用して、第二抗原に対する単一結合部位を作成する。ある態様において、軽鎖は、第三の抗原に結合する。第一、第二および第三抗原が異なる場合、これは３つの特異性を有する抗原結合性ポリペプチドの産生を可能にすることに留意すべきである。このような分子もまた本発明に包含される。

任意の抗体重鎖、軽鎖、ＶＨドメイン、ＶＬドメインまたはＣＤＲアミノ酸配列は、本発明の抗原結合ポリペプチドに使用できる。例示的な抗体重鎖、軽鎖、ＶＨドメイン、ＶＬドメインおよびＣＤＲアミノ酸配列は、本明細書中、表１から４に記載される。

ある態様において、二重特異性抗原結合ポリペプチドは、本明細書に記載の抗ＰＤＧＦＲβ ＶＨドメイン（例えば、配列番号２４に記載のもの）ならびにＥＧＦＲファミリー受容体タンパク質（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、および／またはＨＥＲ４）に結合する抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む。該ＶＨおよびＶＬドメインを得ることができる好適な治療抗体には、トラスツズマブ（ＣＡＳ＃１８０２８８－６９－１）、ペルツズマブ（ＣＡＳ＃３８０６１０－２７－５）およびセツキシマブ（ＣＡＳ＃２０５９２３－５６－４）が含まれるが、これに限定されない。特定の一態様において、二重特異性抗原結合ポリペプチドは、図４に記載のように形成される。

ある態様において、二重特異性抗原結合ポリペプチドは、本明細書に記載の抗ＨＥＲ２ ＶＨドメイン（例えば、配列番号１３から１６に記載のもの）ならびにＥＧＦＲファミリーメンバー（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、および／またはＨＥＲ４）に結合する抗体のＶＨおよびＶＬを含む。該ＶＨおよびＶＬドメインを得ることができる好適な治療抗体には、トラスツズマブ（ＣＡＳ＃１８０２８８－６９－１）、ペルツズマブ（ＣＡＳ＃３８０６１０－２７－５）、およびセツキシマブ（ＣＡＳ＃２０５９２３－５６－４）が含まれるが、これに限定されない。特定の一態様において、二重特異性抗原結合ポリペプチドは、図１２に記載のように形成される。

ある態様において、本発明の二重特異性抗原結合ポリペプチドは、ヒトＨＥＲ２に特異的に結合する第一ＶＨドメインおよび／または第二ＶＨドメインを含む。ある態様において、抗ＨＥＲ２ＶＨドメインは、配列番号１、４、７または１０に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を、表１に記載の重鎖ＨＣＤＲ２またはＨＣＤＲ１アミノ酸配列の何れか１つから独立して選択されるＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ１配列と共に含む。ある態様において、抗ＨＥＲ２ＶＨドメインは、配列番号１、２および３；４、５および６；７、８および９；ならびに、１０、１１および１２のそれぞれからなる群のより選択されるＨＣＤＲ３、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ１アミノ酸配列を含む。ある態様において、抗ＨＥＲ２ＶＨドメインは、配列番号１３、１４、１５または１６に記載のアミノ酸配列を含む。

ある態様において、本発明の二重特異性抗原結合ポリペプチドは、ヒトＰＤＧＦＲβに特異的に結合する第一ＶＨドメインおよび／または第二ＶＨドメインを含む。ＰＤＧＦＲβに結合する任意のＶＨドメインは、本発明の方法に使用可能である。好適なＶＨドメインには、２０１２年１２月５日出願の米国出願第１３／７０５，９７８号（その内容全体は引用により本明細書中に包含される）に記載のものが含まれる。ある態様において、抗ＰＤＧＦＲβＶＨドメインは、配列番号２５に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。ある態様において、抗ＰＤＧＦＲβＶＨドメインは、配列番号２５、２６および２７のそれぞれに記載のＨＣＤＲ３、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ１アミノ酸配列を含む。ある態様において、抗ＰＤＧＦＲβＶＨドメインは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含む。

ある態様において、本発明の二重特異性抗原結合ポリペプチドは、ヒトＰＤＧＦＲβに特異的に結合するＶＬドメインを含む。ＰＤＧＦＲβに結合する任意のＶＬドメインは、本発明の方法に使用可能である。好適なＶＬドメインには、２０１２年１２月５日出願の米国出願第１３／７０５，９７８号に記載のものが含まれる。ある態様において、抗ＰＤＧＦＲβＶＬドメインは、配列番号２９に記載のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。ある態様において、抗ＰＤＧＦＲβＶＬドメインは、配列番号２９、３０および３１のそれぞれに記載のＨＣＤＲ３、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ１アミノ酸配列を含む。ある態様において、抗ＰＤＧＦＲβＶＬドメインは、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む。

特定の一態様において、本発明の二重特異性抗原結合ポリペプチドは、配列番号１８または２０に記載の重鎖を含む。

特定の一態様において、本発明の二重特異性抗原結合ポリペプチドは、配列番号２２に記載の抗体軽鎖を含む。

ある態様において、本発明の二重特異性抗原結合ポリペプチドは、少なくとも１つまたはそれ以上の保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５つなどの、保存的アミノ酸置換）を含む、１つまたはそれ以上のＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、重鎖または軽鎖を含む。保存的アミノ酸置換には、あるクラスのアミノ酸を同じクラスのアミノ酸により置換することが含まれ、ここで、クラスとは、アミノ酸側鎖の共通の物理化学的特性および相同タンパク質において天然に見られる高置換頻度により定義される（例えば、標準Ｄａｙｈｏｆｆ頻度交換マトリックスまたはＢＬＯＳＵＭマトリックスにより決定される）。アミノ酸側鎖の６つの一般的なクラスが分類されており、クラスＩ（Ｃｙｓ）；クラスＩＩ（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）；クラスＩＩＩ（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ）；クラスＩＶ（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；クラスＶ（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）；およびクラスＶＩ（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）が含まれる。例えば、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＧｌｕなどの別のクラスＩＩＩ残基へのＡｓｐの置換は、保存的置換である。従って、抗ＰＤＧＦＲβ抗体における予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じクラスの別のアミノ酸残基で置換されている。抗原結合を排除しないアミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Brummell et al., Biochem. 32:1180－1187 (1993)； Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879－884 (1999)；および、Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412－417 (1997)を参照のこと、それぞれ、その内容全体は引用により本明細書中に包含される）。

ある態様において、本発明は、本明細書に記載のＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、重鎖または軽鎖アミノ酸配列と約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を有する、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、重鎖または軽鎖アミノ酸配列を含む二重特異性抗原結合ポリペプチドを提供する。

ＩＶ．修飾された抗原結合ポリペプチド
ある態様において、本発明の抗原結合ポリペプチドは、１つまたはそれ以上の修飾を含んでいてよい。本発明の抗原結合ポリペプチドの修飾形態は、当技術分野で公知の何らかの技術を用いて作製可能である。

ｉ）免疫原性の低下
ある態様において、本発明の抗原結合ポリペプチド（例えば、二重特異性抗原結合ポリペプチド、抗体またはその抗原結合フラグメント）は、当該技術分野で認識された技術を用いて、それらの免疫原性を低下させるために修飾されている。例えば、抗体またはそのフラグメントは、キメラ化、ヒト化、および／または脱免疫化されていてよい。

ある態様において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、キメラであってよい。キメラ抗体とは、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体のような、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する抗体である。キメラ抗体またはそのフラグメントの作製法は、当技術分野で公知である。例えば、Morrison, Science 229:1202 (1985)； Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986)； Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191－202 (1989)；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および、同第４，８１６，３９７号（それらは、その内容全体が引用により本明細書中に包含される）を参照のこと。“キメラ抗体”を作製するために開発された技術（Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851－855 (1984)； Neuberger et al., Nature 312:604－608 (1984)； Takeda et al., Nature 314:452－454 (1985)）は、該分子の合成のために使用できる。例えば、マウス抗ＰＤＧＦＲβ抗体分子の結合特異性をコード化する遺伝子配列を、適当な生物活性のヒト抗体分子由来の配列と共に融合することができる。本明細書で用いるキメラ抗体は、異なる部分が、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体、例えば、ヒト化抗体などの、異なる動物種に由来する分子である。

別の態様において、本発明の抗体またはその抗原結合部分はヒト化されている。ヒト化抗体は、非ヒト抗体由来の１つまたはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト抗体分子に由来するフレームワーク領域を含んで、特異的結合性を有する。しばしば、ヒトフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換して、抗原結合を改変、好ましくは改善され得る。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法によって、例えば、特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための抗原結合および配列比較に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用をモデリングすることにより、同定される。（例えば、Queen et al., U.S. Pat. No. 5,585,089； Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)を参照のこと、その内容全体は引用により本明細書中に包含させる）。抗体は、当技術分野において公知の様々な技術、例えば、ＣＤＲ移植（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；および同第５，５８５，０８９号、それらの内容全体は引用により本明細書中に包含させる）、ベニヤリング（veneering）またはリサーフェイシング（resurfacing）（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６； Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489－498 (1991)； Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805－814 (1994)； Roguska. et al., PNAS 91:969－973 (1994)、それらの内容全体は引用により本明細書中に包含させる）、および鎖シャッフリング(chain shuffling)（米国特許第５，５６５，３３２号、その内容全体は引用により本明細書中に包含させる）を含む技術を用いてヒト化され得る。

ある態様において、脱免疫化は、ＰＤＧＦＲβ抗原結合ポリペプチド（例えば、抗体、またはその抗原結合部分）の免疫原性を低下させるために使用できる。本明細書で用いる用語“脱免疫化”は、ポリペプチド（例えば、抗体またはその抗原結合部分）を改変してＴ細胞エピトープを修飾することを含む（例えば、ＷＯ９８５２９７６Ａ１、ＷＯ００３４３１７Ａ２を参照のこと、それらの内容は引用により本明細書中に包含される）。例えば、本発明の出発ＰＤＧＦＲβ特異的抗体またはその抗原結合部分由来のＶＨおよびＶＬ配列は分析されてもよく、ヒトＴ細胞エピトープ“マップ”が、該配列内の配列相補性決定領域（ＣＤＲ）および他の重要な残基と関連させてエピトープの位置を示す各Ｖ領域から作成することができる。Ｔ細胞エピトープマップからの個々のＴ細胞エピトープは、最終抗体の活性を改変するリスクが低い代替的（alternative）アミノ酸置換を同定するために分析される。代替ＶＨおよびＶＬ配列の範囲は、アミノ酸置換の組合せを含むように設計され、次いで、これらの配列は、本明細書に記載の診断法および処置法において使用するために抗原結合ポリペプチドの範囲に組み込まれ、その後それらは機能に関して試験される。その後、修飾されたＶ領域およびヒトＣ領域を含む完全な重鎖および軽鎖遺伝子を、発現ベクターにクローニングし、次いで、プラスミドを全体抗体の産生のために細胞株に導入した。その後、抗体を適当な生化学的アッセイおよび生物学的アッセイで比較して、最適な変異体を同定する。

ｉｉ）エフェクター機能およびＦｃ修飾
本発明の抗原結合ポリペプチドは、一般的に、抗体定常領域（例えば、ＩｇＧ定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１、２、３または４定常領域）を含み、１つまたはそれ以上のエフェクター機能を仲介する。例えば、抗体定常領域への補体の１成分の結合は、補体系を活性化し得る。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン化および溶解に重要である。補体の活性化はまた、炎症反応を刺激し、自己免疫過敏症にも関与し得る。さらに、抗体は、細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する抗体Ｆｃ領域上のＦｃ受容体結合部位で、Ｆｃ領域を介して種々の細胞上の受容体に結合する。ＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（イプシロン受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）およびＩｇＭ（ミュー受容体）を含む抗体の異なるクラスに特異的な多くのＦｃ受容体がある。細胞表面上のＦｃ受容体への抗体の結合は、抗体被覆粒子の取り込みおよび破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解（抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用、またはＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症性メディエーターの放出、免疫グロブリンの胎盤通過および免疫グロブリン産生の制御を含む、多くの重要かつ多様な生物学的応答を引き起こす。好ましい態様において、本発明の抗原結合ポリペプチド（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）は、Ｆｃ－ガンマ受容体に結合する。さらに別の態様において、本発明の抗原結合ポリペプチドは、１つまたは複数のエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ活性）を欠く、および／またはＦｃγ受容体に結合できない、定常領域を含み得る。

本発明の特定の態様は、定常領域ドメインの１つまたはそれ以上における少なくとも１つのアミノ酸を、低下または増強されたエフェクター機能、非共有結合二量体化の能力、腫瘍の部位に局在する増加した能力、低下した血清半減期、またはほぼ同じ免疫原性を有する全体の改変されていない抗体と比較したとき増加した血清半減期などの所望の生化学的特性を提供するように、欠失させ、または他の方法で改変させた、抗原結合性ポリペプチドを含む。例えば、本明細書に記載の診断法および治療法において使用するための、ある抗体またはそのフラグメントは、免疫グロブリン重鎖と同様のポリペプチド鎖を含むが、１つまたはそれ以上の重鎖ドメインの少なくとも一部を欠く、ドメイン欠失抗体である。例えば、ある抗体において、修飾抗体の定常領域の１つのドメイン全体を欠失しており、例えば、ＣＨ２ドメインの全体または一部が欠失されている。

特定の他の態様において、抗原結合ポリペプチドは、異なる抗体イソ型由来の複数の定常領域（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のうち２つ以上由来の定常領域）を含む。他の態様において、抗原結合ポリペプチドは、キメラヒンジ（すなわち、異なる抗体イソ型のヒンジドメイン由来の複数のヒンジ部分、例えば、ＩｇＧ４分子由来の上部ヒンジドメインおよびＩｇＧ１中央ヒンジドメイン、を含むヒンジ）を含む。一態様において、抗原結合ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ４分子由来のＦｃ領域またはその一部ならびに該分子のコアヒンジ領域におけるＳｅｒ２２８Ｐｒｏ変異（ＥＵ番号付け）を含む。

ある態様において、Ｆｃ部分は、当技術分野で公知の技術を用いてエフェクター機能を増加または低下させるために変異されてよい。例えば、定常領域ドメインの欠失または不活性化（点変異または他の手段による）は、循環している修飾抗体のＦｃ受容体結合を減少させ、それによって腫瘍局在化を増加させ得る。他の場合において、本発明と一致する定常領域改変は補体結合を調節し、それにより、複合体形成している細胞毒素の血清半減期および非特異的結合を低減させることができる。定常領域のさらに他の修飾は、増加した抗原特異性または柔軟性のために増加した局在化を可能にするジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を修飾するために使用することができる。得られた生理的プロファイル、バイオアベイラビリティならびに腫瘍局在化、生体分布および血清半減期などの修飾の他の生化学的作用を、容易に、過度の実験を行うことなく周知の免疫学的技術を用いて測定および定量することができる。

ある態様において、本発明の抗体に用いるＦｃドメインは、Ｆｃ変異体である。本明細書で用いる用語“Ｆｃ変異体”は、該Ｆｃドメインが由来する、野生型Ｆｃドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を有するＦｃドメインを意味する。例えば、該ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１抗体に由来し、該ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃ変異体は、該Ｆｃドメインと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。

Ｆｃ変異体のアミノ酸置換(複数可)は、Ｆｃドメイン内の任意の位置（すなわち、任意のＥＵ慣用的なアミノ酸位置）に配置されてよい。一態様において、Ｆｃ変異体は、ヒンジドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位置に置換を含む。別の態様において、Ｆｃ変異体は、ＣＨ２ドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位置に置換を含む。別の態様において、Ｆｃ変異体は、ＣＨ３ドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位置に置換を含む。別の態様において、Ｆｃ変異体は、ＣＨ４ドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位置に置換を含む。

本発明の抗原結合ポリペプチドは、エフェクター機能および／またはＦｃＲ結合の改善（例えば、減少または増強）を付与することが知られている当該技術分野で認識されるＦｃ変異体を用いることができる。Ｆｃ変異体は、例えば、国際公開ＷＯ８８／０７０８９Ａ１、ＷＯ９６／１４３３９Ａ１、ＷＯ９８／０５７８７Ａ１、ＷＯ９８／２３２８９Ａ１、ＷＯ９９／５１６４２Ａ１、ＷＯ９９／５８５７２Ａ１、ＷＯ００／０９５６０Ａ２、ＷＯ００／３２７６７Ａ１、ＷＯ００／４２０７２Ａ２、ＷＯ０２／４４２１５Ａ２、ＷＯ０２／０６０９１９Ａ２、ＷＯ０３／０７４５６９Ａ２、ＷＯ０４／０１６７５０Ａ２、ＷＯ０４／０２９２０７Ａ２、ＷＯ０４／０３５７５２Ａ２、ＷＯ０４／０６３３５１Ａ２、ＷＯ０４／０７４４５５Ａ２、ＷＯ０４／０９９２４９Ａ２、ＷＯ０５／０４０２１７Ａ２、ＷＯ０５／０７０９６３Ａ１、ＷＯ０５／０７７９８１Ａ２、ＷＯ０５／０９２９２５Ａ２、ＷＯ０５／１２３７８０Ａ２、ＷＯ０６／０１９４４７Ａ１、ＷＯ０６／０４７３５０Ａ２およびＷＯ０６／０８５９６７Ａ２または米国特許第５，６４８，２６０号；同第５，７３９，２７７号；同第５，８３４，２５０号；同第５，８６９，０４６号；同第６，０９６，８７１号；同第６，１２１，０２２号；同第６，１９４，５５１号；同第６，２４２，１９５号；同第６，２７７，３７５号；同第６，５２８，６２４号；同第６，５３８，１２４号；同第６，７３７，０５６号；同第６，８２１，５０５号；同第６，９９８，２５３号；および、同第７，０８３，７８４号（それらは全て、引用によりその全体を本明細書中に包含させる。）に開示されたアミノ酸置換のいずれか１つを含んでいてよい。例示的一態様において、本発明の結合ポリペプチドは、ＥＵ位置２６８のアミノ酸置換（例えば、Ｈ２６８ＤまたはＨ２６８Ｅ）を含むＦｃ変異体を含み得る。別の例示的態様において、本発明の結合ポリペプチドは、ＥＵ位置２３９でのアミノ酸置換（例えば、Ｓ２３９ＤまたはＳ２３９Ｅ）および／またはＥＵ位置３３２でのアミノ酸置換（例えば、Ｉ３３２ＤまたはＩ３３２Ｑ）を含んでいてよい。

ある態様において、本発明の抗原結合ポリペプチドは、抗原非依存性エフェクター機能を変化させる、特に結合ポリペプチドの循環半減期を変化させる、アミノ酸置換を含むＦｃ変異体を含み得る。かかる抗原結合ポリペプチドは、これらの置換を欠く抗原結合ポリペプチドと比較したとき、ＦｃＲｎへの増加または減少した結合のいずれかを示し、従って、それぞれ、血清中半減期を増加または減少させる。ＦｃＲｎに対する改善された親和性を有するＦｃ変異体は、より長い血清半減期を有することが予想され、このような分子は、例えば、慢性疾患または障害を処置するために、投与された抗原結合ポリペプチドの長い血清半減期が望まれる場合、哺乳動物の処置に有用な応用をもたらす。対照的に、減少したＦｃＲｎ結合親和性を有するＦｃ変異体は、より短い半減期を有すると予想され、このような分子はまた、例えば、インビボ画像診断のため、または長時間循環系に存在するとき出発抗体が毒性の副作用を有する状況において、例えば、短縮された循環時間が有利であり得る場合、哺乳動物への投与に有用である。減少したＦｃＲｎ結合親和性を有するＦｃ変異体はまた、胎盤を通過する可能性が低く、従って、妊婦における疾患または障害の処置にも有用である。加えて、減少したＦｃＲｎ結合親和性が望まれ得る他の適用には、脳、腎臓、および／または肝臓への局在が望ましい用途が含まれる。例示的一態様において、本発明の改変された抗原結合ポリペプチドは、血管系から腎臓糸球体の上皮を横断する輸送を減少させた。別の態様において、本発明の改変された抗原結合ポリペプチドは、脳から血液脳関門（ＢＢＢ）を通過し、血管内への減少した輸送を示す。一態様において、改変されたＦｃＲｎ結合を有する抗体は、Ｆｃドメインの“ＦｃＲｎ結合ループ”内に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有するＦｃドメインを含む。ＦｃＲｎ結合ループは、アミノ酸残基２８０－２９９（ＥＵ番号付けに従う）から構成される。ＦｃＲｎ結合活性を改変された例示的なアミノ酸置換は、国際公開ＷＯ０５／０４７３２７（引用により本明細書中に包含させる）に記載されている。特定の例示的態様において、本発明の抗原結合ポリペプチドは、以下の置換：Ｖ２８４Ｅ、Ｈ２８５Ｅ、Ｎ２８６Ｄ、Ｋ２９０ＥおよびＳ３０４Ｄ（ＥＵ番号付け）の１つまたはそれ以上を有するＦｃドメインを含む。

他の態様において、本明細書に記載の診断法および処置法に使用するための抗原結合ポリペプチドは、グリコシル化を低減または排除するために改変される、定常領域、例えば、ＩｇＧ１重鎖定常領域を有する。例えば、本発明の抗原結合ポリペプチドはまた、抗体Ｆｃのグリコシル化を変化させるアミノ酸置換を含むＦｃ変異体を含み得る。例えば、該Ｆｃ変異体は、グリコシル化（例えば、Ｎ－またはＯ－結合グリコシル化）を低減させ得る。例示的態様において、Ｆｃ変異体は、アミノ酸位置２９７（ＥＵ番号付け）で通常見出される、Ｎ－結合型グリカンの減少したグリコシル化を含む。別の態様において、抗原結合ポリペプチドは、例えば、アミノ酸配列ＮＸＴまたはＮＸＳを含む、Ｎ－結合型グリコシル化モチーフの近くまたはグリコシル化モチーフ内のアミノ酸置換を有する。特定の態様において、抗原結合ポリペプチドは、アミノ酸位置２２８または２９９（ＥＵ番号付け）にてアミノ酸置換を有するＦｃ変異体を含む。より特定の態様において、抗原結合ポリペプチドは、Ｓ２２８ＰおよびＴ２９９Ａ変異（ＥＵ番号付け）を含むＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域を含む。

低減または改変されたグリコシル化を与える例示的アミノ酸置換は、国際公開ＷＯ０５／０１８５７２（その内容は、引用により本明細書中に包含させる）に記載されている。好ましい態様において、本発明の抗原結合ポリペプチドは、グリコシル化を排除するために修飾される。このような抗原結合ポリペプチドは、“ａｇｌｙ”抗原結合ポリペプチドと呼ばれ得る。理論は別にして、“ａｇｌｙ”抗原結合ポリペプチドは、インビボで改善された安全性および安定性プロファイルを有し得ると考えられる。典型的なａｇｌｙ抗原結合ポリペプチドは、それによってＰＤＧＦＲβを発現する正常な重要臓器へのＦｃ媒介性毒性の可能性を排除したＦｃエフェクター機能を欠いているＩｇＧ４抗体の非グリコシル化Ｆｃ領域を含む。さらに他の態様において、本発明の抗原結合ポリペプチドは、改変されたグリカンを含む。例えば、抗原結合ポリペプチドは、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７でＮ－グリカンのフコース残基の数の減少を有していてもよく、すなわち、脱フコシル化されていてよい。別の態様において、抗原結合性ポリペプチドは、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７でＮ－グリカンのシアル酸残基の変化した数を有していてもよい。

ｉｉｉ）共有結合
本発明の抗原結合ポリペプチドは、例えば、共有結合が結合ポリペプチドをその同族エピトープへの特異的結合から妨げないように、該結合ポリペプチドへの分子の共有結合により、修飾されていてよい。例えば、限定はしないが、本発明の抗原結合ポリペプチドは、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合などにより修飾され得る。多数の化学修飾のいずれかは、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化などを含むが、これに限定されない既知の技術によって行われ得る。さらに、誘導体は、１つまたはそれ以上の非古典的アミノ酸を含有していてよい。

本発明の抗原結合ポリペプチドは、さらに、ポリペプチドまたは他の組成物に、Ｎ－またはＣ－末端結合または化学的結合（共有結合および非共有結合を含む）して異種ポリペプチドに組換え融合されていてよい。例えば、抗原結合ポリペプチドは、検出アッセイにおける標識ならびに異種ポリペプチド、薬物、放射性核種、または毒素などのエフェクター分子として有用な分子に組み換え的に融合されるか、または連結されていてよい。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；および、ＥＰ３９６，３８７(それらはそれぞれ、その内容を引用により本明細書に包含させる)。

抗原結合ポリペプチドは、インビボ半減期を増加させるため、または当技術分野で公知の方法を用いて免疫アッセイで使用するために、異種ポリペプチドに融合され得る。例えば、一態様において、ＰＥＧは、インビボでの半減期を増加させるために、本発明の抗原結合ポリペプチドに結合され得る（Leong, S. R., et al., Cytokine 16:106 (2001)； Adv. in Drug Deliv. Rev. 54:531 (2002)；または、Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30:512 (2002)（それらの内容は、引用により本明細書に包含させる）を参照のこと）。

さらに、本発明の抗原結合ポリペプチドは、マーカー配列、例えば、それらの精製または検出を容易にするためのペプチドに融合され得る。好ましい態様において、マーカーのアミノ酸配列は、ｐＱＥベクター（QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), among others, many of which are commercially available. As described in Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821－824 (1989)（その内容は引用により本明細書中に包含させる）において提供されるタグなどのヘキサ－ヒスチジンペプチドであり、例えば、ヘキサ－ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグには、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する“ＨＡ”タグ（Wilson et al., Cell 37:767 (1984)、その内容は引用により本明細書中に包含させる）および“ｆｌａｇ”タグが含まれるが、これらに限定されない。

本発明の抗原結合ポリペプチドは、非結合型で使用されてもよく、または例えば、分子の治療特性を改善するために、標的検出を容易にするために、または患者の画像化もしくは治療のために、種々の分子の少なくとも１つに結合されていてよい。精製を行う際に、本発明の抗原結合ポリペプチドは、精製の前または後のいずれかで標識されるか、または結合され得る。特に、本発明の抗原結合ポリペプチドは、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的反応調節物質、医薬、またはＰＥＧに結合されていてよい。

本発明はさらに、診断薬または治療薬に結合されている本発明の抗原結合ポリペプチドを包含する。抗原結合ポリペプチドは、例えば、所定の処置および／または予防レジメンの有効性を決定するための、臨床試験手順の一部として、例えば、免疫細胞障害（例えば、ＣＬＬ）の発症または進行を監視することにより診断に使用することができる。検出は、検出可能な物質に抗原結合ポリペプチドを結合することにより容易にすることができる。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽電子放射断層撮影法を用いた陽電子放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが含まれる。例えば、本発明に係る診断薬として使用するための抗体に結合され得る金属イオンについて、米国特許第４，７４１，９００（その内容は引用により本明細書中に包含させる）を参照のこと。好適な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれる。好適な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれる。好適な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが含まれる。発光物質の例には、ルミノールが含まれる。生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが含まれる。そして、好適な放射性物質の例としては、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１１１Ｉｎまたは^９９Ｔｃが含まれる。

本明細書に記載の診断法および処置法における使用を目的とする抗原結合ポリペプチドは、細胞毒素（例えば、放射性同位体、細胞毒性薬、または毒素など）治療剤、細胞増殖抑制剤、生物学的毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的反応修飾因子、医薬、免疫学的活性リガンド（例えば、リンホカインまたは他の抗体、ここで得られた分子は、Ｔ細胞などの腫瘍細胞およびエフェクター細胞の両方に結合する）、またはＰＥＧに連結されていてよい。

別の態様において、本明細書に記載の診断法および処置法における使用を目的とする抗原結合ポリペプチドは、腫瘍細胞増殖を減少させる分子に連結されていてよい。他の態様において、本明細書に記載の組成物は、薬物またはプロドラッグに結合された抗体またはそのフラグメントを含んでいてよい。本発明のさらに他の態様は、リシン、ゲロニン、シュードモナス外毒素またはジフテリア毒素などの特定の生物毒素またはその細胞毒性フラグメントに結合された抗原結合ポリペプチドの使用を含む。使用する共役または非共役抗体の選択は、癌の種類や病期、補助治療（例えば、化学療法または外部放射線）の使用ならびに患者の状態によって異なる。当業者が、本明細書の教示を考慮してそのような選択を容易に行うことができることは理解され得る。

以前の研究において、同位体で標識された抗腫瘍抗体は、動物モデルにおいて、およびヒトのある場合において、腫瘍細胞を破壊するために成功裏に使用されてきたことが理解され得る。例示的な放射性同位元素には、^９０Ｙ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１２３Ｉ、^１１１Ｉｎ、^１０５Ｒｈ、^１５３Ｓｍ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^１６６Ｈｏ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅおよび^１８８Ｒｅが含まれる。放射性核種は、細胞死につながる、核ＤＮＡ内の複数の鎖切断を引き起こす電離放射線を形成することにより作用する。治療用複合体を作製するために使用される同位体は、一般的に、は短いパス長を有する、高エネルギーのアルファ－またはベータ－粒子を生成する。かかる放射性核種は、複合体が付着しているか、または内部にあるとき、それらが近接している細胞、例えば腫瘍細胞を殺す。それらは、非局在化した細胞にはほとんど影響を及ぼさない。放射性核種は、実質的に、非免疫原性である。

Ｖ．抗原結合ポリペプチドの発現
上記のように、本発明の抗原結合ポリペプチドを提供するために、単離された遺伝物質の操作に続いて、遺伝子を、一般的に、所望の量の抗原結合ポリペプチドを生成するために使用することができる宿主細胞への導入のために発現ベクターに挿入する。

用語“ベクター”または“発現ベクター”は、細胞内に導入し、そして細胞内で所望の遺伝子を発現するためのビークルとして、本発明に従って使用されるベクターを意味するために、明細書および特許請求の範囲の目的のために本明細書中で使用される。当業者に公知のように、かかるベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスおよびレトロウイルスからなる群より容易に選択され得る。一般的に、本発明に適合するベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローニングを容易にする適切な制限部位、ならびに真核細胞または原核細胞への導入および／もしくは該細胞内での複製能力を含み得る。

多数の発現ベクター系が、本発明の目的のために使用可能である。例えば、ベクターの１つのクラスは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶもしくはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルスなどの動物ウイルスに由来するＤＮＡ要素を利用する。他は、内部リボソーム結合部位を有する多シストロン系の使用を含む。さらに、その染色体にＤＮＡを組み込んだ細胞は、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする１つまたはそれ以上のマーカーを導入することにより選択することができる。マーカーは、栄養要求性宿主への原栄養能、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）または銅などの重金属への耐性を提供し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるべきＤＮＡ配列に直接結合されるか、または同時形質転換によって同じ細胞に導入され得る。さらなる要素はまた、ｍＲＮＡの最適な合成のために必要とされ得る。これらの要素は、シグナル配列、スプライスシグナル、転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルを含み得る。特に好ましい態様では、クローン化された可変領域遺伝子は、上記のように合成される重鎖および軽鎖定常領域遺伝子（好ましくは、ヒト）と共に発現ベクターに挿入される。

他の好ましい態様において、本発明の抗原結合ポリペプチドは、多シストロン性構築物を用いて発現させ得る。このような発現系において、抗体の重鎖および軽鎖のような目的の複数の遺伝子産物は、単一の多シストロン性構築物から産生され得る。これらの系は、有利には、真核宿主細胞において、本発明のポリペプチドの比較的高いレベルを提供するために、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を用いる。互換性のＩＲＥＳ配列は、引用によりその内容を本明細書に包含させる米国特許第６，１９３，９８０に記載されている。当業者は、かかる発現系が、本明細書に記載のポリペプチドの完全な範囲を効率的に産生するために使用され得ることを理解し得る。

より一般的には、抗体またはそのフラグメントをコードするベクターまたはＤＮＡ配列が一旦調製されると、該発現ベクターは、適当な宿主細胞に導入され得る。すなわち、宿主細胞を形質転換し得る。宿主細胞へのプラスミドの導入は、当業者に周知の種々の技術によって達成することができる。これらには、トランスフェクション（電気泳動およびエレクトロポレーションを含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープＤＮＡによる細胞融合、マイクロインジェクション、および無傷ウイルスによる感染が含まれるが、これらに限定されない。Ridgway, A. A. G. “Mammalian Expression Vectors” Chapter 24.2, pp. 470－472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988)(その内容は引用により本明細書中に包含される)を参照のこと。最も好ましくは、宿主へのプラスミド導入はエレクトロポレーションを仲介するものである。形質転換細胞は、軽鎖および重鎖の産生に好適な条件下で増殖させ、そして重鎖および／または軽鎖タンパク質合成についてアッセイされる。例示的なアッセイ技術には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光活性化セルソーター分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などが含まれる。

本明細書で用いる用語“形質転換”は、広義の意味で、遺伝子型を変化させ、その結果レシピエント細胞における変化をもたらす、レシピエント宿主細胞へのＤＮＡの導入を意味するために用いられ得る。

同様に、“宿主細胞”は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築された、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターで形質転換された細胞を意味する。組換え宿主からポリペプチドを単離するための方法の記載において、用語“細胞”および“細胞培養”は、明確に他に特記されない限り、抗体の由来源を示すために互換的に使用される。言い換えると、“細胞”からのポリペプチドの回収とは、遠沈全細胞から、または培地および懸濁細胞の両方を含有する細胞培養物からの何れかを意味し得る。

一態様において、抗原結合ポリペプチド発現のために使用される宿主細胞株は、哺乳動物起源のものである。当業者は、そこで発現されるべき所望の遺伝子産物に最も適している特定の宿主細胞株を決定することができる。例示的な宿主細胞株としては、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲ－）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ－１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、２９３（ヒト腎臓）が含まれるが、これに限定されない。一態様において、細胞株は、それから発現される抗体の改変されたグリコシル化、例えば、脱フコシル化（afucosylation）を提供する（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６．ＲＴＭ．（Ｃｒｕｃｅｌｌ）またはＦＵＴ８－ノックアウトＣＨＯ細胞株（Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ．ＲＴＭ．Ｃｅｌｌｓ）（Ｂｉｏｗａ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．））。一態様において、ＮＳ０細胞が使用され得る。ＣＨＯ細胞が特に好ましい。宿主細胞株は、一般的に、商業サービス、アメリカ培養細胞系統保存機関または公開された文献から入手可能である。

インビトロ産生では、大量の所望のポリペプチドを得るためのスケールアップが可能となる。組織培養条件下での哺乳動物細胞培養のための技術は、当技術分野において公知であり、例えばエアリフトリアクターまたは連続撹拌反応器中での均質懸濁培養、または例えば中空繊維(hollow fiber)中、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズ上またはセラミックカートリッジ上での固定化もしくは捕捉された細胞培養が含まれる。必要に応じて、および／または所望により、ポリペプチドの溶液は、慣用のクロマトグラフィー法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ－セルロースを用いるクロマトグラフィーおよび／または（免疫）親和性クロマトグラフィーにより精製することができる。

本発明の抗原結合ポリペプチドをコードする遺伝子はまた、細菌または酵母または植物細胞などの非哺乳動物細胞においても発現させ得る。これに関して、細菌などの種々の単細胞非哺乳動物微生物、すなわち、培養または発酵で増殖させることができる微生物も形質転換することができることが理解され得る。形質転換されやすい細菌には、大腸菌株またはサルモネラ株などの腸内細菌科のメンバー；枯草菌（Bacillus subtilis）などのバチルス；肺炎球菌；連鎖球菌、およびインフルエンザ菌が含まれる。細菌において発現されるとき、ポリペプチドは、封入体の一部となり得ることがさらに理解され得る。ポリペプチドは、単離され、精製され、次いで機能性分子に組み立てられる必要がある。

原核生物に加えて、真核微生物も使用することができる。出芽酵母または一般的なパン酵母は、真核微生物のうちでもっとも一般的に使用されているが、多くの他の株を一般的に利用可能である。出芽酵母での発現のために、例えば、プラスミドＹＲｐ７（Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)； Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979)； Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)、各々が引用によりその内容を本明細書中に包含される）が一般的に使用される。このプラスミドは、既に、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の変異株、例えばＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４－１（Jones, Genetics, 85:12 (1977)、その内容を引用により本明細書に包含させる）に対する選択マーカーを提供するＴＲＰ１遺伝子を含む。従って、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐｌ損傷の存在は、トリプトファンの不存在下での増殖による形質転換を検出する有効な環境を提供する。

ＶＩ．医薬製剤および抗原結合ポリペプチドの投与の方法
別の面において、本発明は、本明細書に記載の抗原結合ポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。

本発明の抗原結合ポリペプチドの製造法および対象へのその投与法は、当業者によく知られているか、または当業者によって容易に決定される。本発明の抗原結合ポリペプチドの投与経路は、経口、非経腸、吸入または局所投与であり得る。本明細書で用いる用語、非経腸には、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸または膣内投与が含まれる。非経腸投与の静脈内、動脈内、皮下および筋肉内の形態が一般的に好ましい。投与の全てのこれらの形態が明確に本発明の範囲内であると考えられるが、投与のための形態は、注射のための溶液、特に静脈内または動脈内注射または点滴のための溶液であり得る。通常、注射に適する医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸塩緩衝液、リン酸緩衝液またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、要すれば安定化剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含んでいてよい。しかしながら、本明細書の教示に適合する他の方法において、抗原結合ポリペプチドは、有害細胞集団の部位に直接送達され、それにより治療薬への罹患組織の曝露を増加させることができる。

非経腸投与のための製剤には、無菌の水溶液または非水溶液、懸濁液、およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体には、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール溶液／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれる。本発明では、薬学的に許容される担体には、０．０１－０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液または０．８％生理食塩水が含まれるが、これらに限定されない。他の一般的な非経腸ビークルには、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または固定油が含まれる。静脈内ビークルには、栄養補充液、電解質補給剤、例えばリンゲルデキストロースに基づくものなどが含まれる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどの防腐剤および他の添加物も存在してもよい。より具体的には、注射用に適した医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む。そのような場合、組成物は無菌でなければならず、容易に注射可能である程度に流動性であるべきである。それは、製造および貯蔵条件下で安定であるべきであり、好ましくは、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合は必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの種々の抗菌剤および抗真菌剤によって達成することができる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖類、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムなどを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン、を含めることによってもたらされ得る。

何れの場合においても、滅菌注射溶液は、必要に応じて本明細書に列挙した１つまたは複数の成分の組み合わせと共に適当な溶媒中に必要量の活性化合物（例えば、単独でまたは他の活性剤と組み合わせた、抗体）を組み込み、次いでろ過滅菌することにより製造できる。一般的に、分散液は、基本的な分散媒体および上記に列挙したものから必要な他の成分を含む滅菌ビークル中に活性化合物を組み込むことによって製造される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい製造法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、それにより、予め滅菌濾過した溶液から、活性成分の粉末と任意のさらなる所望の成分とを得る。注射用製剤は処理され、アンプル、バッグ、ボトル、シリンジ、またはバイアルなどの容器に充填され、そして当技術分野で公知の方法に従って無菌条件下で密封される。さらに、該製剤は、同時係属中の米国特許出願第０９／２５９，３３７号および同第０９／２５９，３３８号（それぞれ、その内容を引用により本明細書中に包含させる）に記載のようなキットの形態で包装され、販売され得る。そのような製品は、好ましくは、関連する組成物が、自己免疫疾患または腫瘍性疾患に罹患しているか、または罹患しやすい対象を処置するのに有用であることを示すラベルまたは添付文書を包含している。

上記の病状の処置のための本発明の安定化された抗原結合ポリペプチドの有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトか、または動物かどうか、他の投与される薬剤、ならびに処置が予防か、または治療かどうかを含む多くの異なる要因によって変化する。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も処置され得る。処置投与量は、安全性および有効性を最適化するために、当業者に公知の通常の方法を用いて決定され得る。

本発明の抗体を用いる受動免疫化のために、投与量は、対象の体重１ｋｇ当たり、例えば、約０．０００１から１００ｍｇ、より一般的には、０．０１から５ｍｇ（例えば、０．０２ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．５ｍｇ、０．７５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇなど）の範囲であり得る。例えば、投与量は、１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重、または１－１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。上記の範囲の中間用量もまた本発明の範囲内であることが意図される。

対象は、かかる用量を、毎日、隔日、毎週または経験的分析によって決定された任意の他のスケジュールに従って投与され得る。例示的な処置は、例えば少なくとも６ヶ月の、長期間にわたって複数回の投与を必要とする。さらなる例示的な処置レジメンは、２週間毎に１回、または月に１回、または３から６ヶ月毎に１回の投与を必要とする。例示的な投与スケジュールは、毎日１－１０ｍｇ／ｋｇもしくは１５ｍｇ／ｋｇ、隔日３０ｍｇ／ｋｇ、または毎週６０ｍｇ／ｋｇを含む。ある方法において、異なる結合特異性を有する２つまたはそれ以上の抗原結合ポリペプチドは、各抗体の投与が指示された範囲内に入る場合には、同時に投与され得る。

本発明の抗原結合ポリペプチドは、複数回投与され得る。単一投与量の間隔は、例えば、毎日、毎週、毎月または毎年とすることができる。間隔はまた、患者におけるポリペプチドまたは標的分子の血中濃度を測定することにより示されるところに従って不規則であってもよい。ある方法において、投与量は、特定の血漿抗体または毒素濃度、例えば、１－１０００ｕｇ／ｍｌまたは２５－３００ｕｇ／ｍｌを達成するように調整される。あるいは、抗原結合ポリペプチドは、製剤、より少ない頻度の投与が必要とされる場合に、持続放出製剤として投与することができる。投与量および頻度は、患者における抗原結合ポリペプチドの半減期に依存して変化する。一般的に、ヒト化抗原結合ポリペプチドは、最長の半減期を示し、次いでキメラ抗原結合ポリペプチドおよび非ヒト抗原結合ポリペプチドである。一態様において、本発明の抗原結合ポリペプチドは、非コンジュゲート形態で投与することができる。別の態様において、本発明の抗原結合ポリペプチドは、コンジュゲート形態で複数回投与することができる。さらに別の態様において、本発明の抗原結合ポリペプチドは、非コンジュゲート形態で投与し、その後、コンジュゲート形態で投与することができるか、またはその逆が可能である。

投与量および投与頻度は、処置が予防または治療であるかどうかによって変化し得る。予防的適用において、本発明の抗体またはそのカクテルを含む組成物は、その患者の抵抗力を高めるために、疾患状態にない患者に投与される。このような量は、 “予防的有効用量”と定義されている。この使用において、正確な量は、患者の健康状態および全身免疫によっても変わるが、一般的に、１用量当たり、０．１から２５ｍｇ、とりわけ０．５から２．５ｍｇの範囲である。比較的低い投与量が、長期間にわたって比較的低頻度の間隔で投与される。ある患者は、彼らの残りの全生存期間にわたって処置を受け続ける。

治療的適用において、比較的短い間隔で比較的高い投与量（例えば、放射性免疫複合体についてより一般的に使用される５から２５ｍｇの投与量ならびに細胞毒－薬物コンジュゲート分子についてより高用量と共に、１用量当たり、約１から４００ｍｇ／ｋｇの抗体）が、疾患の進行が低減または停止するまで、好ましくは患者が疾患症状の一部または完全な改善を示すまで、必要とされることがある。その後、本特許発明方法は、予防的レジメで継続され得る。

一態様において、対象は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子（例えば、ベクター中）を用いて処置され得る。ポリペプチドをコードする核酸の用量は、患者当たり、約１０ｎｇから１ｇ、１００ｎｇから１００ｍｇ、１ｕｇから１０ｍｇ、または３０－３００ｕｇのＤＮＡの範囲である。感染性ウイルスベクターのための用量は、１用量当たり、１０－１００またはそれ以上のビリオンで変化する。

治療剤は、予防的処置および／または塗料的処置のために、非経腸、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内または筋肉内投与により投与され得る。筋肉内注射または静脈内注入は、本発明の抗体の投与に好ましい。ある方法において、治療用抗体またはそのフラグメントは、頭蓋内に直接注射される。ある方法において、抗体またはそのフラグメントは、徐放性組成物またはＭｅｄｉｐａｄ^ＴＭ装置などのデバイスとして投与される。

本発明の抗原結合ポリペプチドは、必要に応じて、（例えば、予防的または治療的）処置を必要とする障害または病状を処置するのに有効な他の薬剤と組み合わせて投与されてよい。好ましいさらなる薬剤は、当該技術分野において認識され、標準的に、特定の障害のために投与されるものである。

本発明の^９０Ｙ－標識された抗体の有効な単回処置投与量（すなわち、治療的有効量）は、約５から約７５ｍＣｉ、より好ましくは約１０から約４０ｍＣｉの範囲である。^１３１Ｉ－標識された抗原結合ポリペプチドの有効な単回処置の非骨髄破壊投与量は、約５から約７０ｍＣｉ、より好ましくは約５から約４０ｍＣｉの範囲である。^１３１Ｉ－標識された抗体の有効な単回処置の甲状腺組織を破壊する投与量（Ablation dosage）（すなわち、自家骨髄移植を必要とするかもしれない）は、約３０から約６００ｍＣｉ、より好ましくは約５０から約５００ｍＣｉ未満の範囲である。

臨床実験の多くが^１３１Ｉおよび^９０Ｙを用いて得られているが、他の放射性標識が当技術分野で公知であり、同様の目的に使用されている。さらに他の放射性同位体は、画像化するために使用される。例えば、本発明の範囲と適合するさらなる放射性同位元素としては、^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、^３２Ｐ、^５７Ｃｏ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^７７Ｂｒ、^８１Ｒｂ、^８１Ｋｒ、^８７Ｓｒ、^１１３Ｉｎ、^１２７Ｃｓ、^１２９Ｃｓ、^１３２Ｉ、^１９７Ｈｇ、^２０３Ｐｂ、^２０６Ｂｉ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、^２１２Ｐｂ、^２１２Ｂｉ、^４７Ｓｃ、^１０５Ｒｈ、^１０９Ｐｄ、^１５３Ｓｍ、^１８８Ｒｅ、^１９９Ａｕ、^２２５Ａｃ、^２１１Ａおよび^２１３Ｂｉが含まれるが、これらに限定されない。この点において、α、γおよびβ放射体は、本発明において全て互換性がある。さらに、本明細書に記載の観点から、当業者が過度の実験なしに選択した治療をコースと互換性のある放射性核種を容易に決定できることが認められる。この目的のため、既に臨床診断に使用されているさらなる放射性核種には、^１２５Ｉ、^１２３Ｉ、^９９Ｔｃ、^４３Ｋ、^５２Ｆｅ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、ならびに^１１１Ｉｎが含まれる。抗体はまた、標的化した免疫療法における使用可能性のために種々の放射性核種で標識されている（Peirersz et al. Immunol. Cell Biol. 65: 111－125 (1987)、引用によりその内容を本明細書中に包含される）。これらの放射性核種には、^１８８Ｒｅおよび^１８６Ｒｅならびにより少ない程度の^１９９Ａｕおよび^６７Ｃｕが含まれる。米国特許第５，４６０，７８５は、そのような放射性同位体に関するさらなるデータを提供し、引用によりその内容全体が本明細書に包含される。

上記のように、本発明の抗原結合ポリペプチドは、哺乳動物の障害のインビボでの処置のために薬学的に有効な量で投与され得る。この点に関して、本明細書に記載の抗原結合ポリペプチドは、投与を容易にし、そして活性剤の安定性を促進するように製剤され得ることが理解され得る。好ましくは、本発明による医薬組成物は、生理食塩水、非毒性緩衝液、防腐剤などの、薬学的に許容される、非毒性の滅菌担体を含む。本発明の目的のために、治療剤にコンジュゲートまたは非コンジュゲートされた本発明の抗原結合ポリペプチドの薬学的に有効量は、標的に対する効果的な結合を達成するため、および利益を達成するため、例えば、疾患もしくは障害の症状を改善するために、または物質もしくは細胞を検出するために、十分な量を意味する。腫瘍細胞の場合、ポリペプチドは、好ましくは、新生物または免疫反応性細胞上の選択された免疫反応性抗原と相互作用し、そしてそれらの細胞の細胞死の増加をもたらすことができる。もちろん、本発明の医薬組成物は、ポリペプチドの薬学的に有効量を提供するために、単一または複数の用量で投与され得る。

本発明の範囲に合わせて、本発明の抗原結合ポリペプチドは、治療効果または予防効果を生じるのに十分な量で、上記の処置法に従いヒトまたは他の動物に投与され得る。本発明の抗原結合ポリペプチドは、本発明の抗体を、公知の技術に従って、常套の薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせることにより調製される従来の剤形でヒトまたは他の動物に投与され得る。薬学的に許容される担体または希釈剤の形態および特性は、併用される活性成分の量、投与法および他の周知の可変因子（variable）により記載されることが、当業者により認識され得る。当業者は、本発明のポリペプチドの１つまたはそれ以上の種類を含むカクテルが特に有効であることを証明し得ることをさらに理解し得る。

ＶＩＩ．疾患または障害を治療する方法
本発明の抗原結合ポリペプチドは、ＨＥＲ２および／またはＰＤＧＦＲβなどの細胞表面受容体の活性をアンタゴナイズするのに有用である。従って、別の面において、本発明は、本発明の１つまたはそれ以上の抗原結合ポリペプチドを含む医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することにより、ＰＤＧＦＲβ－および／またはＨＥＲ２－関連疾患または障害を処置するための方法を提供する。

ある態様において、本明細書に記載の抗ＰＤＧＦＲβ、抗ＨＥＲ２、および／または二重特異性抗原結合ポリペプチド（例えば、配列番号１３－１６、１７－２２、および／または２４に記載のもの）は、さらなる治療剤と組み合わせて投与される。好適な治療分子には、ＥＧＦＲファミリー受容体活性の阻害剤（例えば、トラスツズマブ（ＣＡＳ＃１８０２８８－６９－１）、ペルツズマブ（ＣＡＳ＃３８０６１０－２７－５）、セツキシマブ（ＣＡＳ＃２０５９２３－５６－４）、およびエルロチニブ（ＣＡＳ＃１８３３２１－７４－６）が含まれるが、これらに限定されない。特定の一態様において、抗ＰＤＧＦＲβ／抗ＨＥＲ２二重特異性抗原結合ポリペプチドは、トラスツズマブおよび／またはペルツズマブと組み合わせて投与される。特定の一態様において、抗ＨＥＲ２単一特異性抗原結合ポリペプチドは、トラスツズマブおよび／またはペルツズマブと組み合わせて投与される。

処置の影響を受けやすい疾患または障害には、癌、例えば乳がんおよび卵巣癌が含まれるが、これに限定されない。

当業者は、有効な非毒性量の抗体（または、さらなる治療剤）が、ＰＤＧＦＲβおよび／またはＨＥＲ２関連疾患または障害を処置する目的を達成し得るかどうかを、常套の試験により決定することができる。例えば、ポリペプチドの治療的に活性な量は、疾患ステージ（例えば、ステージＩ対ステージＩＶ）、対象の年齢、性別、合併症（例えば、免疫抑制状態または疾患）および体重、ならびに対象において所望の応答を誘発する抗体の能力などの要因によって変化し得る。投与量レジメンは、最適な治療応答を提供するように調整することができる。例えば、いくつかの分割用量を毎日投与してもよく、または治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例的に減少させることができる。しかしながら、一般に、有効な投与量は、１日あたり体重１ｋｇ当たり、約０．０５から１００ｍｇ、より好ましくは約０．５から１０ｍｇの範囲であると予期される。
本発明の好ましい態様を次に記載する：
［項１］
第二抗原に特異的に結合する第二ＶＨドメインにＣ末端で連結されている、第一抗原に特異的に結合する第一ＶＨドメインを含む抗体重鎖を含み、
抗体軽鎖を含まない、
単離された二重特異性抗原結合ポリペプチド。
［項２］
抗体重鎖が、アミノ酸リンカーを仲介して第二ＶＨドメインに遺伝子的に連結されている、上記項１に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項３］
リンカーが、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む、上記項２に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項４］
抗体軽鎖をさらに含む、上記項１から３のいずれか一項に記載の抗原結合ポリペプチドであって、該軽鎖が、抗原に特異的に結合するＶＬドメインを含み、該重鎖および軽鎖は自然に対を形成している、ポリペプチド。
［項５］
ＶＬドメインが第一抗原に結合する、上記項４に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項６］
ＶＬドメインが第三抗原に結合する、上記項４に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項７］
上記項１から６のいずれか一項に記載の２つの抗原結合ポリペプチドの二量体を含む抗原結合ポリペプチドであって、該２つの抗原結合ポリペプチドが、重鎖定常領域を介して自然に二量体化している、抗原結合ポリペプチド。
［項８］
第一抗原と第二抗原とが異なる、上記項１から７のいずれか一項に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項９］
第一抗原および第二抗原が同一分子の異なる領域内にある、上記項１から８のいずれか一項に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項１０］
第一抗原および第二抗原が異なる分子上にある、上記項１から９のいずれか一項に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項１１］
第一抗原および第三抗原が同一分子の異なる領域内にある、上記項１から１０のいずれか一項に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項１２］
第一抗原および第三抗原が異なる分子上にある、上記項１から１１のいずれか一項に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項１３］
第一抗原がヒトＰＤＧＦＲβまたはＨＥＲ２である、上記項１から１２のいずれか一項に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項１４］
第二抗原がヒトＰＤＧＦＲβまたはＨＥＲ２である、上記項１から１３のいずれか一項に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項１５］
ヒトＨＥＲ２に特異的に結合するＶＨドメインを含み、かつ配列番号１、４、７および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む、上記項１から１４のいずれか一項に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項１６］
ＶＨドメインが、配列番号２、５、８または１１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２をさらに含む、上記項１５に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項１７］
ＶＨドメインが、配列番号３、６、９または１２からなる群より選択得されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１をさらに含む、上記項１６に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項１８］
配列番号１３、１４、１５および１６からなる群より選択されるＶＨドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインのアミノ酸配列を含む、上記項１５に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項１９］
ＶＨドメインが、配列番号１３、１４、１５および１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、上記項１５に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項２０］
ヒトＰＤＧＦＲβに特異的に結合するＶＨドメインを含み、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む、上記項１から１９のいずれか一項に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項２１］
ＶＨドメインが、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２をさらに含む、上記項２０に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項２２］
ＶＨドメインが、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１をさらに含む、上記項２０に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項２３］
配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む、上記項２０に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項２４］
配列番号１８または２０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、上記項２０に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項２５］
ヒトＰＤＧＦＲβに特異的に結合するＶＬドメインを含み、配列番号２９に記載のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、上記項１から２４のいずれか一項に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項２６］
ＶＬドメインが、配列番号３０に記載のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２をさらに含む、上記項２５に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項２７］
ＶＬドメインが、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１をさらに含む、上記項２５に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項２８］
ＶＬ配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、上記項２５に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項２９］
配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖を含む、上記項２５に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項３０］
配列番号１、４、７および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、ＨＥＲ２に特異的に結合する単離された抗原結合ポリペプチド。
［項３１］
配列番号１、４、７および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＶＨドメインを含む、上記項３０に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項３２］
ＶＨドメインが、配列番号２、５、８または１１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２をさらに含む、上記項３１に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項３３］
ＶＨドメインが、配列番号３、６、９または１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１をさらに含む、上記項３１に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項３４］
配列番号１３、１４、１５および１６からなる群より選択されるＶＨドメインのアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインのアミノ酸配列を含む、上記項３１に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項３５］
ＶＨドメインが、配列番号１３、１４、１５および１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、上記項３１に記載の抗原結合ポリペプチド。
［項３６］
配列番号１３、１４、１５および１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインと同じＨＥＲ２上のエピトープに結合する、抗原結合ポリペプチド。
［項３７］
配列番号１３、１４、１５および１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインとＨＥＲ２に対する結合について競合する、抗原結合ポリペプチド。
［項３８］
上記項１から３７のいずれか一項に記載の抗原結合ポリペプチドをコードする単離された核酸。
［項３９］
上記項３８に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
［項４０］
上記項３９に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
［項４１］
抗原結合ポリペプチドが宿主細胞により産生されるような条件下で、上記項４０に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗原結合ポリペプチドの製造法。
［項４２］
上記項１から３７のいずれか一項に記載の抗原結合ポリペプチドおよび１つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
［項４３］
上記項４２に記載の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、疾患または障害の処置法。
［項４４］
該疾患または障害が癌である、上記項４３に記載の方法。

ＶＩＩＩ．実施例
本発明は、さらに限定するものとして解釈されるべきではない以下の実施例によりさらに説明される。配列表、図面ならびに本明細書中に引用した全ての文献、特許および公開された特許出願の内容は、引用により明示的に本明細書に包含される。

実施例１．ＨＥＲ２／ＰＤＧＦＲβ二重特異性抗原結合ポリペプチドの調製
種々のＨＥＲ２／ＰＤＧＦＲβ二重特異性抗原結合ポリペプチドフォーマットをコードする遺伝子を合成し、哺乳動物発現ベクター中にクローニングした。次いで、構築物を、標準的なプロトコルに従ってＨＥＫ２９３細胞中に一過性にトランスフェクトした。上清を回収し、発現について試験した。二重特異性フォーマット２（表４に記載の配列番号１８）の発現された二量体のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを、図５に記載する。該ゲルは、非還元条件下で、期待値１２５Ｄａのポリペプチドが発現されたこと（レーン２）、およびこれは、還元条件下で、期待値６２．５ｋＤａの単量体に解離されること（レーン１）を示す。

実施例２．ＥＬＩＳＡを用いたＨＥＲ２／ＰＤＧＦＲβ二重特異性抗原結合ポリペプチド発現の評価
ＥＬＩＳＡアッセイは、細胞上清中のＨＥＲ２／ＰＤＧＦＲβ二重特異性抗原結合ポリペプチドの発現をアッセイするために開発された。すなわち、２ｕｇ／ｍＬの抗ヒトＦｃ抗体を、一晩、Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｉｍｍｕｌｏｎプレート上に捕捉し、そしてスーパーブロックでブロッキングした。上清を連続希釈し、プレート上にローディングした。培養培地を同様に希釈し、陰性対照として並行してローディングした。二重特異性抗原結合ポリペプチドを、抗ヒトＦａｂ特異的ＨＲＰを用いて検出した。図６に記載の結果は、ＥＬＩＳＡアッセイが、ＨＥＫ２９３細胞上清において二重特異性抗原結合ポリペプチドを検出可能であることを示す。

実施例３．ＥＬＩＳＡを用いたＨＥＲ２／ＰＤＧＦＲβ二重特異性抗原結合ポリペプチドの同時抗原結合の検出
ＥＬＩＳＡアッセイは、ＨＥＲ２／ＰＤＧＦＲβ二重特異性抗原結合ポリペプチドのＨＥＲ２およびＰＤＧＦＲβへの同時結合を検出するために開発された。すなわち、２ｕｇ／ｍＬのヒトＨｅｒ２－Ｆｃ融合タンパク質（Ｈｉｓエピトープタグを含まない）を、一晩、Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｉｍｍｕｌｏｎプレート上に捕捉し、そしてスーパーブロックでブロッキングした。二重特異性抗原結合ポリペプチドを含むＨＥＫ２９３細胞上清を連続希釈し、プレート上にローディングした。１時間インキュベーション後、プレートを洗浄し、１００ｎＭのヒトＰＤＧＦＲβ－Ｆｃ融合（Ｈｉｓエピトープタグを含む）を該プレートに適用し、１時間インキュベートした。二重特異性ＡｂのＨｅｒ２およびＰＤＧＦＲβへの結合を、抗ＨｉｓＨＲＰを用いて検出した。図７に記載の結果は、二重特異性抗原結合ポリペプチドが、ＨＥＲ２およびＰＤＧＦＲβの両方に同時に結合できることを示す。

実施例４．ＨＥＲ２／ＰＤＧＦＲβ二重特異性抗原結合ポリペプチドのＦＡＣＳベースの結合アッセイ
ＦＡＣＳベースの結合アッセイは、細胞の表面上に発現されたとき、ＨＥＲ２／ＰＤＧＦＲβ二重特異性抗原結合ポリペプチドのＨＥＲ２およびＰＤＧＦＲβへの同時結合を検出するために開発された。具体的には、ＨＥＲ２を構成的に過剰発現する２００ｕｌのＨＥＫ２９３細胞、またはＰＦＧＦＲβを一過性に過剰発現するＨＥＫ２９３細胞、またはｍｏｃｋをトランスフェクトされた対照細胞を、新鮮な９６ウェルプレートに１ｍｌ当たり１００万個の細胞で播種した。細胞を４℃で維持して、受容体の内在化を回避した。フォーマット２またはフォーマット３のＨＥＲ２／ＰＤＧＦＲβ二重特異性抗原結合ポリペプチド（表４ならびに図２および３を参照のこと）を含むＨＥＫ２９３細胞上清を、２５ｎＭの組換えヒトＰＤＧＦＲβ－ＣＦ６４７または組換えヒトＨｅｒ２－ＣＦ６４７と共にインキュベートし、二重特異性／標識されたタンパク質複合体を形成させた。インキュベーション後、１００ｕｌの各上清を、適当なＨＥＲ２発現細胞、ＰＤＧＦＲβ発現細胞、または対照細胞に添加し、４℃で２時間振とうしながらインキュベートして、二重特異性／標識されたタンパク質複合体を細胞表面ＨＥＲ２およびＰＤＧＦＲβへ結合させた。インキュベーション後、細胞を、１５００ｒｐｍで４分間遠心してペレット化し、２００ｕｌの新鮮な完全培地で１回洗浄し、そして最終容量２００ｕｌの新鮮な完全培地中に再懸濁した。蛍光標識されたＰＤＧＦＲβ－ＣＦ６４７またはＨｅｒ２－ＣＦ６４７の該細胞への結合を、Ｇｕａｖａフローサイトメーター（Millipore）を用いて決定した。Ｘ軸方向の正のシフトは、標識されたＰＤＧＦＲβ－ＣＦ６４７またはＨｅｒ２－ＣＦ６４７の細胞との結合を示すと考えられた。

これらの実験において、抗ＰＤＧＦＲ抗体または抗ＨＥＲ２抗体、培地のみおよびＣＦ６４７標識した受容体を陰性対照として用いた。２５ｎＭのＣＦ６４７標識したＨＥＲ２抗体または５０ｎＭのＣＦ６４７標識したＰＤＧＦＲβ抗体を、それぞれ、ＨＥＲ２およびＰＤＧＦＲβ発現細胞の陽性対照として用いた。

これらの実験の結果を図８に示す。このデータは、フォーマット２およびフォーマット３のＨＥＲ２／ＰＤＧＦＲβ二重特異性抗原結合ポリペプチドの両方が、細胞表面ＨＥＲ２およびＰＤＧＦＲβに同時に結合できたことを示す。

実施例４．例示的抗ＨＥＲ２ ＶＨドメインのＨＥＲ２への結合の分析。
Ｂ８抗ＨＥＲ２ ＶＨドメイン（配列番号１３）のＨＥＲ２への結合動態を、表面プラズモン共鳴アッセイ（Biacore）を用いて分析した。図９に示すように、Ｂ８ ＶＨドメインは、１．２ｎＭのＫｄを示し、１．３９ｘ１０^５Ｍ^－１ｓ^－１の会合速度（on－rate）および１．６７ｘ１０^４ｓ^－１の解離速度（off－rate）を示した。

トラスツズマブおよび／またはペルツズマブとの結合に対して競合するＢ８ ＶＨドメインの能力を、ＦＡＣＳベースのアッセイを用いて分析した。図９に示した結果は、Ｂ８ ＶＨドメインが、トラスツズマブおよびペルツズマブと同時にＨＥＲ２に結合し得ることを実証した。これらのデータは、抗ＨＥＲ２ ＶＨドメインが、トラスツズマブおよびペルツズマブのいずれよりも、ＨＥＲ２上の異なるエピトープに結合することを示している。

Ｂ８ ＶＨドメインをｓｃＦｖ中に再フォーマットして、ＨＥＲ２に対する結合親和性を決定した。図１０に示す結果は、Ｂ８ ｓｃＦｖが０．８７ｎＭのＫｄを示したことを示す。

実施例５．細胞増殖アッセイ
Ｂ１２抗ＨＥＲ２ ＶＨドメイン（配列番号１４）、トラスツズマブ、またはペルツズマブの、単独または組み合わせでの、ＳＫ－ＢＲ－３細胞の増殖を阻害する能力を、ＭＴＳ細胞増殖アッセイを用いて決定した。図１１に示す結果は、Ｂ１２ ＶＨ、トラスツズマブおよびペルツズマブの組合せが、各薬剤の単独使用またはトラスツズマブおよびペルツズマブのみの組合せで得られる結果よりも、細胞増殖のより大きな阻害をもたらしたことを示した。これらのデータは、Ｂ１２ ＶＨが、トラスツズマブおよびペルツズマブの細胞増殖阻害を増強するために使用可能であることを示している。

Claims (6)

1. 抗原結合ポリペプチドの単離されたＶＨドメインであって、該単離されたＶＨドメインが配列番号１３のアミノ酸配列を含み、該単離されたＶＨドメインがヒトＨＥＲ２に特異的に結合する、抗原結合ポリペプチドの単離されたＶＨドメイン。
2. 単離されたＶＨドメインが、表面プラズモン共鳴アッセイによる測定で１．２ｎＭ以下のＫｄでヒトＨＥＲ２に結合する、請求項１に記載の抗原結合ポリペプチドの単離されたＶＨドメイン。
3. 請求項１または２に記載の抗原結合ポリペプチドの単離されたＶＨドメインをコードする単離された核酸。
4. 請求項３に記載の核酸を含むベクター。
5. 請求項４に記載のベクターを含む細胞。
6. 請求項１または２に記載の抗原結合ポリペプチドの単離されたＶＨドメインおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

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