JP7046381B2 - リポタンパク質代謝障害の治療のための化合物 - Google Patents

Description

本開示は、リポタンパク質代謝障害の治療のための、プロタンパク質転換酵素サブチリシン様／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）の阻害剤としてのヘパリンアナログの使用に関する。

背景
アテローム性動脈硬化症によって生じる冠状動脈疾患は、欧州および米国における主要な死亡原因である。アテローム性動脈硬化症の発症における主なリスク因子は、循環におけるコレステロール含有低比重リポタンパク質（ＬＤＬコレステロールまたはＬＤＬ－Ｃ）粒子の増加した濃度を有する高コレステロール血症である。ＬＤＬコレステロール粒子の代謝は、コレステロールの合成と食事摂取を平衡化するように高度に調節されて、体内でのコレステロールに対する要求に応える。ＬＤＬコレステロールの代謝回転における主要な調節因子はＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）であり、ＬＤＬＲの欠如または機能障害によって生じる家族性高コレステロール血症を有する患者によって説明されるように、ＬＤＬ粒子の細胞取り込みを仲介し、循環におけるＬＤＬコレステロールの濃度を低下させる。

ＬＤＬコレステロールの血漿中濃度を低下する有効な戦略は細胞中のＬＤＬＲ濃度を増加することであり、ＬＤＬコレステロールを低下させるために現在最も幅広く使用されている医薬品はスタチンである。スタチンはコレステロールの合成を阻害しＬＤＬＲの発現を上方調節し、このため全体として循環ＬＤＬコレステロール量の低下をもたらす。しかし、かなりの数の患者がスタチンに応答しない、または様々な副作用のためにスタチンに耐容性がない。さらに、スタチンはまた、ＬＤＬＲの強力な負の調節因子として最近同定されたプロタンパク質転換酵素サブチリシン様／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）の発現を増加し（Ｓｅｉｄａｈら，２０１４）、これによってＬＤＬコレステロールに対する有効な効果を妨げる。

ＰＣＳＫ９を標的にすることは、血漿ＬＤＬ－Ｃを低下するための最近の戦略である（Ｌａｇａｃｅら，２００６）。細胞中のＬＤＬＲ濃度はＬＤＬＲを結合するＰＣＳＫ９の能力によって低下され、これによってリサイクルを損ない、受容体のリソソーム分解を高める。ＰＣＳＫ９機能獲得変異は、増加したＬＤＬＲの分解によって循環ＬＤＬ－Ｃの有意な増加をもたらす。これに反し、ＰＣＳＫ９機能喪失変異を有する個体は、ＬＤＬ－Ｃ濃度の低下を示し、冠動脈性心臓疾患の事象をほとんど示さない。いくつかの主な製薬会社が高コレステロール血症の改善のためにＰＣＳＫ９を標的とする治療戦略について承認を得ている。ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ結合部位に対するＰＣＳＫ９特異抗体の投与は、フェーズＩＩＩ臨床試験においてＬＤＬ－Ｃの血漿中濃度を低下すると報告されている（Ｍｕｌｌａｒｄ （２０１５）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ；Ｓｈｅｒｉｄａｎ（２０１５） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。しかし、ＰＣＳＫ９血漿濃度は約６ｎＭである（Ｌａｋｏｓｋｉら，２００９）のに対しＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲ結合定数は１２０～６２０ｎＭの範囲であり（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら，２００７、Ｆｉｓｈｅｒら，２００７）、ＰＣＳＫ９が生理学的に関連する濃度で直接的にＬＤＬＲを結合しない可能性を高くしている。さらに、ＰＣＳＫ９は肝臓でのみＬＤＬＲを標的にし、例えば、高量のＬＤＬＲも発現するステロイドホルモン産生組織では標的にせず、肝臓特異的共受容体の必要性を示唆する（Ｓｅｉｄａｈら，２０１４）。このため、ＬＤＬＲは主要なＰＣＳＫ９受容体でありそうにない。代わりに、未知の受容体（受容体Ｘ）が循環ＰＣＳＫ９を捕捉し、続いてこれをＬＤＬＲに送達し得る。この受容体に対するＰＣＳＫ９結合の阻害は従って、ＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲ相互作用の阻害に比べて優れた戦略である。

本発明者らはＰＣＳＫ９がヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に対する結合モチーフを有することを発見した。このモチーフに導入される変異ならびにヘパリンによるＨＳＰＧへの結合の阻害は、ＰＣＳＫ９誘発性分解に対してＬＤＬＲを保護する。ＰＣＳＫ９とＨＳＰＧの間の相互作用の阻害は、ＰＣＳＫ９阻害抗体の臨床試験に比べて優れた治療能力を有する（Ｃｈａｎら，２００９）。重要なことに、ＰＣＳＫ９におけるＨＳＰＧ結合モチーフは、ＬＤＬＲ結合表面のものと異なる。ＨＳＰＧは１つ以上のヘパラン硫酸グリコサミノグリカン鎖によって置換されるコアタンパク質からなる。ヘパリンはヘパラン硫酸（ＨＳ）と構造が密接に関連するグリコサミノグリカンの群である。ヘパリンおよびＨＳはともに、ウロン酸（グルクロン酸（ＧｌｃＡ）またはイズロン酸（ＩｄｏＡ））およびＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮ）からなる反復するジサッカライド単位から構成され、それらはＯ－および／またはＮ－硫酸化され得る。ヘパリンはヘパラン硫酸の高度に硫酸化された変種である。ＨＳＰＧは高度にグルコシル化されたタンパク質であり、ＨＳＰＧ結合モチーフを有するタンパク質リガンドを結合し、例えば成長因子などの限局的蓄積を生じる（ＸｕおよびＥｓｋｏ，２０１４）。データは、ＰＣＳＫ９がＨＳＰＧを結合すること、およびその相互作用がＰＣＳＫ９中のＨＳＰＧ結合モチーフの部位特異的変異誘発によって消失され、ヘパリンを結合できないＰＣＳＫ９変異体をもたらしＬＤＬＲを分解する能力の低下を示すことを示す。さらに、ヘパリンまたはヘパリンアナログとの細胞のインキュベーションは、培地中のＰＣＳＫ９の増加した濃度を伴う、ＬＤＬＲの増加した量を生じる。まとめると、本例で概説される結果は、ＰＣＳＫ９機能がＨＳＰＧの結合に依存し、ＰＣＳＫ９とＨＳＰＧの間の相互作用が抑制されるときに細胞のＬＤＬＲ量が増加することを示す。

このため、ＨＳＰＧは細胞表面ＬＤＬＲのＰＣＳＫ９仲介分解に重要である。本結果は、ＨＳＰＧがＬＤＬＲのＰＣＳＫ９誘発性下方調節において重要な機能を有することを示す。

ＰＣＳＫ９とＨＳＰＧの間の相互作用部位は、ＰＣＳＫ９機能をブロッキングする際、特にＬＤＬＲ量に対するＰＣＳＫ９の影響を阻害する際に標的にされ得る。このためリポタンパク質代謝の障害の治療における新規戦略が開示される。

第一態様では、本発明は被験体におけるリポタンパク質代謝の障害の治療での使用のための、式（Ｉ）の一般構造を有する化合物、

またはその医薬的に許容可能な塩、溶媒和物、多型、もしくは互変異性体を含む組成物に関し、
ここで、
－Ｒ^１はアルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルキルスルホニル、置換アルキルスルホニル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、エステル、アミド、アシル、置換アシル、アミノ、置換アミノ、チオアルキル、置換チオアルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、水素、およびハロゲンからなる群から選択され、
－各Ｒ^２は独立して－ＯＳＯ_３ ^－、－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＮＨＳＯ_３ ^－、－ＮＨＯＣＨ_３および－ＯＰＯ_３ ^２－からなる群から選択され、
－各Ｒ^３は独立して－ＯＳＯ_３ ^－、－ＯＨおよび－ＯＰＯ_３ ^２－からなる群から選択され、
－各Ｒ^４は独立して－ＯＳＯ_３ ^－、－ＯＨ、－ＯＰＯ_３ ^２－および－Ｈからなる群から選択され、
－各Ｒ^５は独立して－ＣＨ_２ＯＳＯ_３ ^－、－ＣＨ_２ＯＨ、－ＣＯＯ^－および－ＣＨ_２ＯＰＯ_３ ^２－からなる群から選択され、
－ｎは１以上の整数である。

一つの態様では、本発明はＬＤＬＲの分解を阻害する方法に関し、当該方法は本明細書で定められる化合物を含む組成物を投与することを含む。

別の態様では、本発明はそれを必要とする被験体における血漿リポタンパク質の濃度を低下するための方法に関し、当該方法は本明細書で定められる化合物または医薬組成物を当該被験体に投与するステップを含む。一つの実施形態では、リポタンパク質はＬＤＬ－Ｃである。

肝細胞表面でのＨＳＰＧによるＰＣＳＫ９の捕捉およびＬＤＬＲに対するその後の提示を示す提唱モデルの図である。ＬＤＬＲはＬＤＬ－Ｃ粒子を循環から取り込み、それらを分解のためにリソソームに送達し、一方、受容体（ＬＤＬＲ）はエンドソームでのカーゴの放出後に細胞表面に再循環される。ＰＣＳＫ９への結合時にＬＤＬＲそれ自体はリソソームで分解される。肝細胞表面上のＨＳＰＧは、ＰＣＳＫ９を捕捉しそれをＬＤＬＲに提示すると提唱され、これによってＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲ複合体形成のための最適な条件を確実にする。従って、ＰＣＳＫ９の高活性は、細胞表面でのＬＤＬＲ量の低下および血漿コレステロールの増加をもたらし、一方、ＰＣＳＫ９活性の阻害は血漿コレステロール濃度を低下させ冠状動脈疾患の進行を遅らせる。 （Ａ）左右の矢印によってそれぞれ示されるＬＤＬＲ結合部位およびＨＳＰＧ結合部位を有するＰＣＳＫ９の空間充填モデルを示す。（Ｂ）示される正電荷アミノ酸（Ｒ：アルギニン、Ｈ：ヒスチジン）を有するＰＣＳＫ９（ＰＤＢ ＩＤ：２ＰＭＷ）中の予測されるＨＳＰＧ結合部位（Ｐｉｐｅｒら，２００７）の静電表面（赤色が負、青色が正）でのヘパリンペンタサッカライド（ＳＡＮＯＲＧ、棒状）である。（Ｃ）ＰＣＳＫ９（リボン）中のＨＳＰＧ結合部位へのＳＡＮＯＲＧの重ね合わせである。（Ｄ）ヘパリナーゼの有無における処理後にＰＣＳＫ９を発現する非透過性ＨｅｐＧ２細胞（白色）である。核をＨｏｅｃｈｓｔによって染色した（暗灰色）。（Ｅ）ヘパリンへのＰＣＳＫ９結合をヘパリンアフィニティークロマトグラフィーによって分析した。ＰＣＳＫ９を５００ｍＭのＮａＣｌ濃度でカラムから溶出した。 表示されるアミノ酸残基がアラニンに変異されたＰＣＳＫ９変異体をＣＨＯ細胞で一時的に発現させた。（Ａ）細胞溶解物および培地の抗ＰＣＳＫ９ウェスタンブロッティングは、すべてのＰＣＳＫ９変異体の発現ならびに細胞溶解物中のプロタンパク質（プロＰＣＳＫ９）から成熟ＰＣＳＫ９への正確なプロセシング、および細胞の培地中への成熟ＰＣＳＫ９の分泌を示した。偽トランスフェクション細胞ではＰＣＳＫ９の発現は検出されなかった。（Ｂ）一時的にトランスフェクションされたＣＨＯ細胞の培地に分泌されたＰＣＳＫ９変異体をアフィニティークロマトグラフィー、続いて抗ＰＣＳＫ９を用いる画分のウェスタンブロッティングによって分析した。すべての変異体は表示位置でアラニン置換を有する。野生型（ＷＴ）ＰＣＳＫ９および変異体Ｒ１６５Ｒ１６７は０．３～０．４ＭのＮａＣｌに相当する画分に溶出され、一方、ＰＣＳＫ９変異体Ｒ９６Ｒ９７およびＲ１０４Ｒ１０５はヘパリンに対する親和性低下を示し、通過画分または第一画分で認められた。ＰＣＳＫ９変異体Ｒ９３Ｒ１０４Ｒ１０５Ｈ１３９およびＲ９３Ｒ９６Ｒ９７Ｒ１０４Ｒ１０５Ｈ１３９はフロースルーにのみ認められ、ヘパリンに結合しなかった。（Ｃ）ＨＳＰＧ結合領域は、ＬＤＬＲフラグメント（ＰＤＢ：３Ｐ５Ｂ）との複合体でのＰＣＳＫ９の表面描写でのＰＣＳＫ９の空間充填モデルで示されるように、ＬＤＬＲ結合部位と反対側に位置する。ＬＤＬＲフラグメントはβプロペラ領域、ＥＧＦ領域ＡおよびＢ、ならびにＬ７を含み、ＰＣＳＫ９のＣ端、触媒領域、およびプロドメインが基本ラセンで示される。モデル化ヘパリンフラグメントは棒状で示される。（Ｄ）ＨｅｐＧ２細胞の培養培地からの内因性ＰＣＳＫ９およびアポＥは、アフィニティークロマトグラフィーおよびウェスタンブロッティングによって分析される場合、ヘパリンに対して同様な結合を示した。 ＷＴ ＰＣＳＫ９（１０ｎＭ）と１８時間インキュベーションされたＨｅｐＧ２細胞は、変異体（Ｒ９３Ｒ９６Ｒ９７Ｒ１０４Ｒ１０５Ｈ１３９）ＰＣＳＫ９（ｍｕｔ４）とインキュベーションされた細胞よりも有意に低い量のＬＤＬＲを示す。ＬＤＬ受容体量をウェスタンブロッティングによって評価し（Ａ）、ＧＡＰＤＨ量をコントロールとして示す。棒グラフ（Ｂ）はデンシトメトリーによって定量されたＬＤＬＲの平均値（ｎ＝３）を、平均の標準誤差（ＳＥＭ）とともに示す。結果はスチューデントｔ検定を用いて評価した。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 ヘパリン（５０Ｕ／ｍＬ）と２４時間インキュベーションされたＨｅｐＧ２細胞はウェスタンブロッティングによって評価される、ＬＤＬＲ量の増加を示す（Ａ）。ＧＡＰＤＨ量をコントロールとして示す。棒グラフ（Ｂ）はデンシトメトリーによって定量されたＬＤＬＲの平均値（ｎ＝４）を平均の標準誤差（ＳＥＭ）とともに示す。ヘパリンとのインキュベーションも、ＥＬＩＳＡによって測定されるとき、培地中のＰＣＳＫ９量の増加をもたらす（Ｃ）。棒グラフは平均ＰＣＳＫ９濃度をＳＥＭとともに示す（ｎ＝４）。結果はスチューデントｔ検定を用いて評価した。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ Ｐ＜０．０００１。（Ｄ）非透過処理ＨｅｐＧ２細胞のＰＬＡ分析は、ＬＤＬＲとＰＣＳＫ９の間の共局在がヘパリン（５０Ｕ／ｍＬ）との細胞のインキュベーションで著しく低下したことを示した。 （Ａ）細胞フリーＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲ結合アッセイ（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ヘパリン（５および５０Ｕ／ｍＬ）が、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ結合領域を標的にするコントロール阻害剤抗ＰＣＳＫ９抗体（５ｎＭ）（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ７１２０７）と対照的に、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲとの直接的相互作用を阻害しないことを認めた。結合アッセイにおいて、固定化ＬＤＬＲに結合するビオチニル化ＰＣＳＫ９からの化学発光シグナルを定量し、結果はここで阻害剤を加えないサンプルからのシグナルに対して基準化して示される。棒グラフは平均値（ｎ＝３）を標準偏差誤差バーとともに示す。結果はスチューデントｔ検定を用いて評価した。＊＊＊＊＊ｐ＜０．００００１、Ｙ軸：阻害剤無添加に対する％。（Ｂ）ＥＬＩＳＡによって測定された培地中のＰＣＳＫ９に対するヘパリンの用量依存的効果（ｎ＝３）。Ｙ軸：培地中のＰＣＳＫ９（％）。（Ｃ）ＲＴ－ＰＣＲによる細胞溶解物中のｍＲＮＡ量の定量的分析。 ヘパリンアナログであるアリクストラ（フォンダパリヌクス，ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｐｈａｒｍａ）の増加する濃度（０～２５０μｇ／ｍＬ）と２４時間インキュベーションされたＨｅｐＧ２細胞はＬＤＬＲ量を高めた。ＧＡＰＤＨのウェスタンブロッティングを負荷コントロールとして示す。 （Ａ）フラグミン（１００Ｕ／ｍＬ）およびイノヘップ（１００Ｕ／ｍＬ）と１８時間ンキュベーションした後のＨｅｐＧ２細胞でのＬＤＬＲのウェスタンブロッティングは、低分子量ヘパリンのこれら２種の治療用調製物が、ヘパリン（５０Ｕ／ｍＬ）の効果に匹敵して細胞のＬＤＬＲ量を増加できることを示す。ＧＡＰＤＨのウェスタンブロッティングを負荷コントロールとして示す。（Ｂ）１０μｇのＰＣＳＫ９単独でのまたは５０Ｕヘパリンと組み合わせた静脈投与１時間後のマウスの肝臓中のＬＤＬＲ量を示すウェスタンブロッティングである。５０μｇのメンブラン調製物を加えた。ウェスタンブロットでコントロールとして示されるソルチリンは、ＰＣＳＫ９誘発性分解の標的ではないことが以前に示されたＰＣＳＫ９受容体である。（Ｃ）Ｂ）のバンドの定量をデンシトメトリーによって定量し、ドットプロットは各サンプルの個別量をビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）を注射されたコントロールに対するパーセントとして、平均値およびＳＥＭとともに示す。ＰＣＳＫ９とヘパリンを共注射されたマウスは、ＬＤＬＲの有意に高い量を示す（６０．３±１２．３％ＬＤＬＲ対２４．０±４．０４％、ｎ＝７マウス／群、ｐ＝０．０１５７、両側スチューデントｔ検定）。 （Ａ）ヘパリン模倣剤硫酸デキストラン（２００μｇ／ｍＬ）と２４時間インキュベーションした後のＨｅｐＧ２細胞でのＬＤＬＲのウェスタンブロッティングであり、この化合物が細胞のＬＤＬＲ量を強力に増加し得ることを示す。比較のためヘパリン（５０Ｕ／ｍＬ）を示す。ＧＡＰＤＨを負荷コントロールとして示す。（Ｂ）ＬＤＬＲ量のデンシトメトリー定量は、硫酸デキストラン（０～２００μｇ／ｍＬ）とのインキュベーション後のＨｅｐＧ２細胞中のＬＤＬＲ量の濃度依存的増加を示す。棒グラフはＬＤＬＲ平均を未処理細胞に対する％としてＳＥＭ誤差バーとともに示す。（Ｃ）ＰＣＳＫ９および硫酸デキストランのマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）結合曲線である。Ｙ軸：蛍光シグナル。Ｘ軸：硫酸デキストランまたはデキストラン濃度、Ｋ_Ｄ＝１８０μＭ。丸：硫酸デキストラン。正方形：デキストラン。（Ｄ）硫酸ペントサン（０～２００μｇ／ｍＬ）と２４時間インキュベーションした後のＨｅｐＧ２細胞でのＬＤＬＲのウェスタンブロッティングおよびデンシトメトリー定量（Ｅ）であり、５０～２００μｇ／ｍＬの硫酸ペントサンで処理された細胞由来の溶解物中でのＬＤＬＲの４倍の増加を示す。棒グラフはＬＤＬＲ平均を未処理細胞に対する％としてＳＥＭ誤差バーとともに示す。（Ｆ）ＰＣＳＫ９および硫酸ペントサンについてのＭＳＴ結合曲線である。Ｙ軸：蛍光シグナル。Ｘ軸：硫酸ペントサン濃度。丸：硫酸ペントサン、Ｋ_Ｄ＝３８１μＭ。正方形：コントロール。（Ｇ）スラミン（０～２００μｇ／ｍＬ）と２４時間インキュベーションした後のＨｅｐＧ２細胞でのＬＤＬＲの定量である。棒グラフはＬＤＬＲ平均を未処理細胞に対する％としてＳＥＭ誤差バーとともに示す。スラミンとインキュベーションしたＨｅｐＧ２細胞でのＬＤＬＲの代表的なウェスタンブロッティングを（Ａ）に示す。（Ｈ）ＰＣＳＫ９およびスラミンについてのＭＳＴ結合曲線である。Ｙ軸：蛍光シグナル。Ｘ軸：スラミン濃度。丸：スラミン、Ｋ_Ｄ＝１９０μＭ、正方形：コントロール。（Ｉ）ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドＳ－ｄＣ－３６（０～５．０μＭ）と２４時間インキュベーションした後のＨｅｐＧ２細胞でのＬＤＬＲのウェスタンブロッティングおよびデンシトメトリー定量（Ｊ）であり、細胞受容体量の濃度依存的増加を示す。棒グラフはＬＤＬＲ平均を未処理細胞に対する％としてＳＥＭ誤差バーとともに示す。結果はスチューデントｔ検定を用いて評価した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。（Ｋ）ＰＣＳＫ９およびＳ－ｄＣ－３６についてのＭＳＴ結合曲線である。Ｙ軸：蛍光シグナル。Ｘ軸：Ｓ－ｄＣ－３６濃度。丸：Ｓ－ｄＣ－３６、Ｋ_Ｄ＝４．８μＭ。正方形：コントロール。 ＰＣＳＫ９（１０μｇ）の注射前のヘパリナーゼＩの注入は、ＬＤＬＲのＰＣＳＫ９誘発性分解を完全に阻害する。代表的なサンプルのウェスタンブロッティング（Ａ）およびＬＤＬＲの棒グラフ定量（Ｂ）を示す。ウェスタンブロッティングでは、ＧＡＰＤＨを負荷コントロールとして使用する。ｅ：空レーン。コントロールはｎ＝７、ＰＣＳＫ９はｎ＝６、ヘパリナーゼはｎ＝５、ヘパリナーゼ／ＰＣＳＫ９はｎ＝５。ＰＣＳＫ９（１０μｇ）およびヘパリン（５０Ｕ）またはスラミン（３００μｇ）を共注射されたマウスは、ＰＣＳＫ９を単独で注射されたマウスと比べて有意に高いＬＤＬＲ量を示す（Ｃ）。コントロールはｎ＝１５、ＰＣＳＫ９はｎ＝１０、ＰＣＳＫ９／ヘパリンはｎ＝７、ＰＣＳＫ９／スラミンはｎ＝３。（Ｄ）ヘパリン（５０Ｕ）の静脈内注射後に、ネズミＰＣＳＫ９特異的ＥＬＩＳＡによって評価したＰＣＳＫ９の血漿中濃度である。 １０μｇのＰＣＳＫ９単独でのまたは５０μｇのＰＣＳＫ９阻害抗体５Ｅ１１と組み合わせた静脈内投与後１時間のマウスの肝臓中のＬＤＬＲ量である。 棒グラフは、蛍光色素Ｂｏｄｉｐｙによって標識された１０ｎｇ／ｍＬのＬＤＬ粒子とインキュベーションした４時間後にスラミン（２００μｇ／ｍＬ）と一昼夜インキュベーションした後のＨｅｐＧ２細胞中の相対的蛍光シグナルを示す。スラミンによるＰＣＳＫ９の阻害はＬＤＬの取り込みを２倍増加する。 （Ａ）および（Ｂ）の棒グラフは、１００μＭスラミンまたはＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼ阻害剤であるメバスタチンおよびシンバスタチンとのインキュベーションの２４および４８時間後にウェスタンブロッティングによって評価したＨｅｐＧ２細胞中のＬＤＬＲ量を示す。スラミンとインキュベーションされた細胞は、スタチンとインキュベーションされた細胞より高いＬＤＬＲ量を示す。 （Ａ）ＰＣＳＫ９と細胞外マトリックスグリカンの間の相互作用の、合成グリカンマイクロアレイを用いた精査。異なるヘパリンフラグメントに対する結合のみを示す。天然ヘパリンは陽性コントロールとして含まれる。（Ｂ）グリカンマイクロアレイで使用されたヘパリン下位構造を示す。ＰＣＳＫ９と相互作用する構造は、［４）－α－ＧｌｃＮ－６，Ｎ－二硫酸（１→４）－α－ＩｄｏＡ－２－硫酸－（１→］の反復を含む。 （Ａ）変異されたＨＳＰＧ結合部位（Ｒ９３Ｒ９６Ｒ９７Ｒ１０４Ｒ１０５Ｈ１３９，ｍｕｔ４）を有するＰＣＳＫ９（１０μｇ）は、マウスにおける注射で肝ＬＤＬＲ分解（各ｎ＝３）を誘発するのに効果的ではない。ウェスタンブロットの定量を（Ｂ）に示す。（Ｃ）ＰＣＳＫ９は西欧型食餌で飼育されたマウス中の全コレステロールを有意に増加するが、ＰＣＳＫ９ ｍｕｔ４は増加しない（コントロールはｎ＝２５、ＰＣＳＫ９はｎ＝１２、ＰＣＳＫ９ ｍｕｔ４はｎ＝９）。（Ｄ）注射されたＰＣＳＫ９ ｍｕｔ４は、ＨＳＰＧによる捕捉の低下およびＬＤＬＲによる排除に則して、ＰＣＳＫ９ ＷＴに比べて高い濃度で循環に残存した。 （Ａ）化合物（Ｘ）のＰＣＳＫ９－ヘパリン相互作用を阻害する能力を、ＰＣＳＫ９（１μｇ／ｍＬ）を阻害剤の存在下でヘパリン－セファロースビーズによって沈殿させるアッセイで試験した。一昼夜インキュベーション後、ビーズをペレット化し、上清中の非沈殿化ＰＣＳＫ９（遊離ＰＣＳＫ９）をＥＬＩＳＡによって評価した。棒グラフは、表示のように増加する濃度の化合物（Ｘ）を含むサンプル中の遊離ＰＣＳＫ９（％）を、ヘパリン－セファロースビーズを添加しないサンプル中のＰＣＳＫ９濃度（添加コントロール）に対して基準化して示す。陰性コントロールサンプルは阻害剤を加えずにインキュベーションし、陽性サンプルは可溶性ヘパリン（５ｍｇ／ｍＬ）とインキュベーションした。平均値をＳＥＭとともに示す（ｎ＝２）。（Ｂ）化合物（Ｘ）の表示の濃度と一昼夜インキュベーションしたＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬＲの代表的なウェスタンブロッティングである。棒グラフは、ＷＢの定量を示す（ＳＥＭを伴う平均値、ｎ＝２）。コントロール細胞は阻害剤を無添加で（陰性コントロール）または５００μｇ／ｍＬヘパリンを添加して（陽性コントロール）インキュベーションした。（Ｃ）ＰＣＳＫ９（０．４ｍｇ／ｋｇ）による注射の１時間前に、ＰＣＳＫ９阻害剤化合物（Ｘ）（０．１３ｍｇ／ｋｇ）またはエボロクマブ（８ｍｇ／ｋｇ）を注射されたマウス（ＢＡＬＢ６／ｃＪＲｊ、雄、１０週齢）の肝臓サンプル中のＬＤＬＲ量である。肝臓サンプルをＰＣＳＫ９注射の１時間後に収集した。コントロール群はＰＣＳＫ９またはＮａＣｌの注射前にＮａＣｌ（０．９％）を注射された。棒グラフは、平均値をＳＥＭとともに示す。ＮａＣｌ／ＮａＣｌ群はｎ＝３、ＮａＣｌ／ＰＣＳＫ９群はｎ＝５、エボロクマブ／ＰＣＳＫ９群はｎ＝５、化合物（Ｘ）／ＰＣＳＫ９群はｎ＝８。 （Ａ）表示濃度でのヘパリンヘキサマーまたは１８マーと一昼夜インキュベーションしたＨｅｐＧ２細胞中のＬＤＬＲ量のウェスタンブロッティングである。（Ｂ）棒グラフは、ＷＢの定量を示す（ＳＥＭを伴う平均値、ｎ＝２）。 （Ａ）イノヘップのサイズ排除クロマトグラフィーによって得られる溶出プロファイル。表示分画のＰＣＳＫ９阻害活性を続いてＨｅｐＧ２細胞で試験した。（Ｂ）サイズ排除画分（２０μＭ）とインキュベーションされたＨｅｐＧ２細胞中のＬＤＬＲ量を示すウェスタンブロッティングである。画分Ｈ６との一昼夜インキュベーションは細胞ＬＤＬＲを５倍増加し、この画分をさらに強アニオン交換（ＳＡＸ）クロマトグラフィーを用いて分画した（図１９）。 （Ａ）イノヘップ画分Ｈ６の強アニオン交換（ＳＡＸ）クロマトグラフィーによって得られた溶出プロファイルである。（Ｂ）選択されたＳＡＸ画分と一昼夜インキュベーションされたＨｅｐＧ２細胞でのＬＤＬＲのウェスタンブロッティング。ＳＡＸ画分Ｉ１、Ｉ８、およびＩ９はＰＣＳＫ９阻害活性を有するヘパリンフラグメントを含み、試験した濃度（５００ｎＭ）でＬＤＬＲ量を最大で２倍増加する。 ヘパリン－アルブミンへのＰＣＳＫ９結合のビアコア分析。分析は、ヘパリン－アルブミン（シグマ、Ｈ０４０３）またはアルブミン（シグマ、Ａ４５０３）のいずれかと結合されたセンサーチップを使用した。（Ａ）ＰＣＳＫ９のヘパリン－アルブミンへの結合。（Ｂ）ＰＣＳＫ９のアルブミンへの結合。ＰＣＳＫ９はヘパリン－アルブミンに７００ｐＭの親和定数で結合し、アルブミンと結合されたセンサーチップへの結合は認められなかった。干渉アッセイを実施してＰＣＳＫ９と化合物（Ｘ）の間の結合を評価した。（Ｃ）増加する濃度の化合物（Ｘ）とプレインキュベーションしたＰＣＳＫ９を、ヘパリン－アルブミンと結合されたセンサーチップに注入した。結合曲線は、化合物（Ｘ）がＰＣＳＫ９のヘパリン－アルブミンセンサーチップへの結合を５０ｎＭの推定ＩＣ５０で阻害することを示した。 （Ａ）スクロースオクタ硫酸の構造。（Ｂ）棒グラフは、表示のスクロースオクタ硫酸濃度の存在下でのヘパリン－セファロースビーズによるＰＣＳＫ９の沈殿を示す。非沈殿ＰＣＳＫ９（遊離ＰＣＳＫ９）のパーセントを、ヘパリン－セファロースビーズを加えないサンプル中のＰＣＳＫ９濃度（添加コントロール）に対して計算した。陽性コントロールサンプルを可溶性ヘパリン（５ｍｇ／ｍＬ）とインキュベーションした。平均値をＳＥＭとともに示す（ｎ＝３～２）。

定義
用語「アシル」は、本明細書で使用されるとき、少なくとも１つのオキソ部分（－Ｃ＝Ｏ）を含む後述のアルキル基を意味する。

用語「アルカン」は、飽和の直鎖、分枝および／または環式カルボヒドリドを指す。当該アルカンは一般式Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋２のものであり得る。いくつかの実施形態では、当該アルカンは環構造を含む。

用語「アルケニル」は、本明細書で使用されるとき、アルケンから１つの－Ｈの除去によって得られる置換基を指す。アルケンは少なくとも１つの二重結合を含む任意の非環式炭化水素であり得る。しばしば、アルケニルは一般式－Ｃ_ｎＨ_２ｎ－１を有する。

用語「アルキル」はアルカンから１つの－Ｈの除去によって得られる置換基を指す。

用語「アルキニル」は、本明細書で使用されるとき、アルキンから１つの－Ｈの除去によって得られる置換基を指す。アルキンは少なくとも１つの三重結合を含む任意の非環式炭化水素であり得る。しばしば、アルキニルは一般式－Ｃ_ｎＨ_２ｎ－３を有する。

用語「アルキルスルホニル」は、末端基または架橋基であり得る－Ｓ（Ｏ）_２－アルキル基を指す。

用語「アミド」は、官能基ＲＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”を指す。

用語「アミノ」は、本明細書で使用されるとき、一般式

の置換基を指す。波線は置換基の結合点を示す。このためアミノは、例えば－ＮＨ_２または－ＮＨ－であり得る。

用語「アレーン」は、本明細書で使用されるとき、芳香族単環または多環炭化水素を指す。

用語「アリール」は、本明細書で使用されるとき、環中のＣからの１つの－Ｈの除去によってアレーンから得られる置換基を指す。本発明で使用される有用なアリールの例は、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、およびピレニルを含む。

用語「エステル」は、官能基ＲＣＯＯＲ’を指す。

用語「ハロゲン」は、本明細書で使用されるとき、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒおよび－Ｉからなる群から選択される置換基を指す。

用語「ヘパリンアナログ」は、ヘパリンと構造的に類似する化合物を指す。

用語「ヘパリン模倣剤」は、機能的にヘパリンのような、すなわちヘパリンを模倣する挙動を示す化合物を指す。本用語はこのため、構造的に類似している化合物だけでなく、異なる構造だがヘパリンと同様な機能性を有する化合物の両方を、本開示の文脈で含む。

用語「ヘテロアルキル」は、本明細書で使用されるとき、１つ以上の炭素がＳ、Ｏ、Ｐ、およびＮから選択されるヘテロ原子によって交換されているアルキル基を指す。

用語「ヘテロアリール」は、本明細書で使用されるとき、ヘテロアレーンの環構造中の原子からの１つの－Ｈの除去によって当該ヘテロアレーンから得られる置換基を指す。ヘテロアレーンは、環構造に１つ以上のヘテロ原子を含む単環または多環芳香族化合物である。当該ヘテロ原子は、好ましくはＳ、Ｎ、およびＯからなる群から選択される。本発明で使用される有用なヘテロアリールの非限定的な例は、アゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、フラニル、およびチオフェニルを含む。

ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）量：対象個体に対する最適なＬＤＬ－Ｃ量は、各個体の根底にある心臓疾患リスクに応じて変動する。健常個体では、ＬＤＬ－Ｃコレステロール量は理想的には２．６～３．３ｍｍｏｌ／Ｌ（または１００～１２９ｍｇ／ｄＬ）未満である。３．４～４．１ｍｍｏｌ／Ｌまたは１３０～１５９ｍｇ／ｄＬの量は境界で高く、４．１～４．９ｍｍｏｌ／Ｌまたは１６０～１８９ｍｇ／ｄＬの量は高く、４．９ｍｍｏｌ／Ｌまたは１８９ｍｇ／ｄＬを超える量は非常に高い。心臓疾患のリスクのある個体では、２．６ｍｍｏｌ／Ｌまたは１００ｍｇ／ｄＬ未満の量が推奨され、一方、１．８ｍｍｏｌ／Ｌまたは７０ｍｇ／ｄＬ未満の量が心臓疾患の非常に高いリスクのある個体にとって望ましい。

低比重リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）量：細胞におけるＬＤＬＲの合成は、細胞内遊離コレステロールの量によって調節され、コレステロールが細胞の必要性に対して過剰である場合、ＬＤＬＲの転写が阻害されるであろう。ＬＤＬＲ量は、限定されないが、ウェスタンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ、およびフローサイトメトリーなどの、従来技術で知られている方法によって推定できる。

用語「低分子量ヘパリン」は、限定されたサイズのヘパリンの群を指す。天然ヘパリンは種々の長さまたは分子量の分子鎖からなる。例えば、５０００～４０，０００ダルトン超である種々の分子量の鎖が、多分散系の医薬品グレードのヘパリンを構成する。低分子量ヘパリンはこれに反し、ポリサッカライドの短鎖のみからなる。低分子量ヘパリンは、８０００Ｄａ未満の平均分子量を有するヘパリン塩として定められ、全鎖の少なくとも６０％が８０００Ｄａ未満の分子量を有する。これらは、ポリマーヘパリンの分画化または脱重合化などの、従来技術の当業者に知られている様々な方法によって得られる。

用語「リポタンパク質代謝障害」は、脂質恒常性の障害およびこれらと関連する障害を指し、例として、糖尿病、肥満、メタボリック症候群、黄色腫、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、脂質異常症、高トリグリセリド血症、高脂血症、シトステロール血症、高血圧、狭心症、急性冠状動脈症候群、冠状動脈性心臓病、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、血管炎症および敗血症を含む。
ＰＣＳＫ９量：ＰＣＳＫ９の血漿中濃度は一般集団において３０～３０００ｎｇ／ｍＬで変動し、中央値は一般的に男性より女性で高い。ＰＣＳＫ９量はＬＤＬ－Ｃ量と相関する。

用語「モノサッカライド単位」は、本明細書で使用されるとき、炭水化物の最も基本的な単位を指し、アルドース、ケトースおよび幅広い種々の誘導体を含む。１つを超えるモノサッカライド単位が結合されるならば、結合は個別にαもしくはβ（１→２）、αもしくはβ（１→３）またはαもしくはβ（１→４）であり得る。好ましくは、結合はαまたはβ（１→４）である。モノサッカライド単位はアルドースまたはケトースであり得る。

用語「置換された」は、化学化合物と関連して本明細書で使用されるとき、別の部分によって置換される水素基を指す。このため、「Ｘで置換された」は、化学化合物と関連して本明細書で使用されるとき、Ｘで置換される水素基を指す。同様に、「置換Ｘ」はＸを指し、ここで１つの水素基が別の部分によって置換されている。例として、「置換アルキル」はアルキル－Ｒを指し、ここでＲは－Ｈ以外の任意の部分である。

用語「置換基」は、化学化合物と関連して本明細書で使用されるとき、水素原子の代わりに置換される原子または原子群を指す。

用語「チオアルキル」は、本明細書で使用されるとき、一般式－Ｓ－アルキルの置換基を指す。

用語「チオアリール」は、本明細書で使用されるとき、一般式－Ｓ－アリールの置換基を指す。

本発明の詳細説明
本発明は請求項で定められる通りである。

ヘパリンアナログ
本発明は、一つの態様では、被験体におけるリポタンパク質代謝の障害の治療に使用するための化合物を含む組成物に関する。化合物は一般的にはヘパリンアナログである。ヘパリンアナログの例は、本明細書に参考によって援用される、Ｒ．Ｌｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（編集），Ｈｅｐａｒｉｎ－Ａ Ｃｅｎｔｕｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（ヘパリン－進歩の世紀、実験薬理学のハンドブック） ２０７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ ２０１２に記載される。

一つの態様では、本発明のヘパリンアナログは、被験体におけるリポタンパク質代謝の障害の治療での使用のための、式（Ｉ）の一般構造、

またはその医薬的に許容可能な塩、溶媒和物、多型、もしくは互変異性体を有し、
ここで、
－Ｒ^１はアルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルキルスルホニル、置換アルキルスルホニル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、エステル、アミド、アシル、置換アシル、アミノ、置換アミノ、チオアルキル、置換チオアルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、水素、およびハロゲンからなる群から選択され、
－各Ｒ^２は独立して－ＯＳＯ_３ ^－、－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＮＨＳＯ_３ ^－、－ＮＨＯＣＨ_３および－ＯＰＯ_３ ^２－からなる群から選択され、
－各Ｒ^３は独立して－ＯＳＯ_３ ^－、－ＯＨおよび－ＯＰＯ_３ ^２－からなる群から選択され、－－各Ｒ^４は独立して－ＯＳＯ_３ ^－、－ＯＨ、－ＯＰＯ_３ ^２－および－Ｈからなる群から選択され、
－各Ｒ^５は独立して－ＣＨ_２ＯＳＯ_３ ^－、－ＣＨ_２ＯＨ、－ＣＯＯ^－および－ＣＨ_２ＯＰＯ_３ ^２－からなる群から選択され、
－ｎは１以上の整数である。

一つの実施形態では、ｎは１、２、３または４である。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物におけるＲ^１は式（ＩＩ）の基を含み、

ここで、
－ＸはＣＨ_２またはＳＯ_２であり、
－ｍは独立して１以上の整数である。

一つの実施形態では、ｍは１、２、３、４、５または６である。一つの実施形態では、Ｒ^１は式（ＸＩ）の基を含む。

いくつかの実施形態では、Ｒ^１は置換ヘテロアルキルである。当該置換ヘテロアルキルはモノサッカライド単位を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｒ^１は少なくとも１つのモノサッカライド単位、少なくとも２つのモノサッカライド単位など、少なくとも３つのモノサッカライド単位など、少なくとも４つのモノサッカライド単位などを含む。好ましい実施形態では、式（Ｉ）におけるｎは、Ｒ^１が少なくとも１つのモノサッカライド単位を含むとき、１である。

一つの実施形態では、Ｒ^１はさらにアルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルキルスルホニル、置換アルキルスルホニル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、エステル、アミド、アシル、置換アシル、アミノ、置換アミノ、チオアルキル、置換チオアルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、水素、およびハロゲンからなる群から選択される部分を含む。

一つの実施形態では、Ｒ^１は式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）、式（ＸＩＸ）、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩＸ）、式（ＸＸＸ）、式（ＸＸＸＩ）、－ＰＥＧ２０００－ＯＭｅ、および－ＰＥＧ５０００－ＯＭｅからなる群から選択される基を含む。

別の実施形態では、Ｒ^１は式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）、式（ＸＩＸ）、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩＸ）、式（ＸＸＸ）、式（ＸＸＸＩ）、－ＰＥＧ２０００－ＯＭｅ、および－ＰＥＧ５０００－ＯＭｅからなる群から選択される基からなる。

いくつかの実施形態では、化合物はヘパリン模倣剤である。当該ヘパリン模倣剤はＰＩ－８８をベースとした誘導体であり得る。ＰＩ－８８（式（ＸＸＩＩＩ）、ここでＲ^８は－ＰＯ_３ ^２－であり、Ｒ^９は個別に－ＳＯ_３ ^－または－Ｈである、下記参照）は高度に硫酸化され、モノリン酸化されたマンノースオリゴサッカライドの混合物であり、ヘパラナーゼ阻害剤であることが知られている。

このため、いくつかの実施形態では、式（Ｉ）中のｎは１であり、Ｒ^１は式（ＸＶ）の基を含み、ここでｓは１以上の整数である。一つの実施形態では、ｓは１、２または３である。

一つの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は式（ＸＸＩＶ）の化合物であり、ここでｐは１以上の整数である。

好ましい実施形態では、化合物は、
Ａ．式（ＸＸＩＶ）の化合物であり、ここでｐは２であり、Ｒ^１は式（ＸＸ）である、
Ｂ．式（ＸＸＩＶ）の化合物であり、ここでｐは２であり、Ｒ^１は式（ＸＶＩＩ）である、
Ｃ．式（ＸＸＩＶ）の化合物であり、ここでｐは２であり、Ｒ^１は式（ＸＶＩＩＩ）である、
Ｄ．式（ＸＸＩＶ）の化合物であり、ここでｐは３であり、Ｒ^１は式（ＸＶＩＩ）である、
Ｅ．式（ＸＸＩＶ）の化合物であり、ここでｐは０であり、Ｒ^１は式（ＸＶＩＩ）である、
Ｆ．式（ＸＸＩＶ）の化合物であり、ここでｐは１であり、Ｒ^１は式（ＸＶＩＩ）である、
Ｇ．式（ＸＸＩＶ）の化合物であり、ここでｐは１であり、Ｒ^１は式（ＸＩＸ）である、
Ｈ．式（ＸＸＩＶ）の化合物であり、ここでｐは３であり、Ｒ^１は式（ＸＸ）である、または
Ｉ．式（ＸＸＩＶ）の化合物であり、ここでｐは３であり、Ｒ^１は式（ＸＸＩＸ）である。

一つの実施形態では、ｐは１であり、式（Ｉ）の化合物は式（ＸＸＶ）の化合物である。

好ましい実施形態では、化合物は、
Ｊ．式（ＸＸＶ）の化合物であり、ここでＲ^１は式（ＸＶＩＩ）である、または
Ｋ．式（ＸＸＶ）の化合物であり、ここでＲ^１は式（ＸＩＸ）である。

一つの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は構造（ＩＸ）を有する。

一つの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は式（ＸＸＶＩ）の化合物であり、ここでｑは１以上の整数である。一つの実施形態では、ｑは１、２または３である。

一つの実施形態では、Ｒ^１０は－Ｏ－Ｒ^１である。別の実施形態では、Ｒ^１０は式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、－Ｏ－式（ＸＶＩ）、－Ｏ－式（ＸＶＩＩ）、－Ｏ－式（ＸＶＩＩＩ）、－Ｏ－式（ＸＩＸ）および－Ｏ－式（ＸＸ）からなる群から選択される基を含む。別の実施形態では、Ｒ^１０は式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、－Ｏ－式（ＸＶＩ）、－Ｏ－式（ＸＶＩＩ）、－Ｏ－式（ＸＶＩＩＩ）、－Ｏ－式（ＸＩＸ）、－Ｏ－式（ＸＸ）および－Ｏ－式（ＸＸＩＸ）からなる群から選択される基からなる。

好ましい実施形態では、化合物は、
Ｌ．式（ＸＸＶＩ）の化合物であり、ここでｑは２であり、Ｒ^１０は－Ｏ－式（ＸＶＩＩ）である、
Ｍ．式（ＸＸＶＩ）の化合物であり、ここでｑは２であり、Ｒ^１０は式（ＸＸＩ）である、
Ｎ．式（ＸＸＶＩ）の化合物であり、ここでｑは１であり、Ｒ^１０は式（ＸＶＩＩ）である、
Ｏ．式（ＸＸＶＩ）の化合物であり、ここでｑは２であり、Ｒ^１０は－Ｏ－式（ＸＸＩＩ）である、
Ｐ．式（ＸＸＶＩ）の化合物であり、ここでｑは１であり、Ｒ^１０は－Ｏ－式（ＸＶＩＩ）である、
Ｑ．式（ＸＸＶＩ）の化合物であり、ここでｑは２であり、Ｒ^１０は－Ｏ－式（ＸＶＩＩＩ）である、
Ｒ．式（ＸＸＶＩ）の化合物であり、ここでｑは１であり、Ｒ^１０は－Ｏ－式（ＸＶＩＩＩ）である、
Ｓ．式（ＸＸＶＩ）の化合物であり、ここでｑは０であり、Ｒ^１０は－Ｏ－式（ＸＶＩＩ）である、または
Ｔ．式（ＸＸＶＩ）の化合物であり、ここでｑは０であり、Ｒ^１０は－Ｏ－式（ＸＸＩ）である。

一つの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は式（ＸＸＶＩＩ）の化合物である。

好ましい実施形態では、化合物は式（ＸＸＶＩＩ）であり、Ｒ^１０は式（ＸＶＩＩ）である。

一つの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は式（ＸＸＶＩＩＩ）の化合物である。

好ましい実施形態では、化合物は、
Ｕ．式（ＸＸＶＩＩＩ）の化合物であり、ここでＲ^１０は－Ｏ－式（ＸＶＩＩ）であり、Ｒ^１１はＨであり、Ｒ^１２はＯＲ^９である、または
Ｖ．式（ＸＸＶＩＩＩ）の化合物であり、ここでＲ^１０は式（ＸＸＩ）であり、Ｒ^１１はＯＲ^９であり、Ｒ^１２はＨである。

一つの実施形態では、化合物は一般構造式（ＸＩＩ）を有する。

一つの実施形態では、Ｒ^２は－ＯＳＯ_３ ^－である。別の実施形態では、Ｒ^３は－ＯＳＯ_３ ^－である。別の実施形態では、Ｒ^４は－ＯＳＯ_３ ^－である。別の実施形態では、Ｒ^５は－ＣＨ_２ＯＳＯ_３ ^－である。好ましい実施形態では、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４は－ＯＳＯ_３ ^－であり、Ｒ^５は－ＣＨ_２ＯＳＯ_３ ^－である。一つの実施形態では、Ｒ^９は－ＯＳＯ_３ ^－である。

一つの実施形態では、医薬的に許容可能な塩はナトリウム塩である。

一つの実施形態では、化合物は一般構造式（ＸＩＩＩ）を有する。

好ましい実施形態では、ｎは２、３または４である。

一つの実施形態では、化合物は一般構造式（ＸＩＶ）を有する。

好ましい実施形態では、式（Ｉ）の化合物は式（Ｘ）の化合物である。

好ましい実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、３β－コレスタニル２，３，４，６－テトラ－Ｏ－スルホ－α－Ｄ－グルコピラノシル－（１→４）－２，３，６－トリ－Ｏ－スルホ－α－Ｄ－グルコピラノシル－（１→４）－２，３，６－トリ－Ｏ－スルホ－α－Ｄ－グルコピラノシル－（１→４）－２，３，６－トリ－Ｏ－スルホ－β－Ｄ－グルコピラノシドトリデカナトリウム塩である。

一つの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は一般構造（ＩＩＩ）を有し、

ここで、
－Ｒ^１はアルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルキルスルホニル、置換アルキルスルホニル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、エステル、アミド、アシル、置換アシル、アミノ、置換アミノ、チオアルキル、置換チオアルキル、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、水素、およびハロゲンからなる群から選択され、
－各Ｒ^２およびＲ^６は独立して－ＯＳＯ_３ ^－、－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＮＨＳＯ_３ ^－、－ＮＨＯＣＨ_３および－ＯＰＯ_３ ^２－からなる群から選択され、
－各Ｒ^３およびＲ^７は独立して－ＯＳＯ_３ ^－、－ＯＨおよび－ＯＰＯ_３ ^２－からなる群から選択され、
－各Ｒ^５およびＲ^８は独立して－ＣＨ_２ＯＳＯ_３ ^－、－ＣＨ_２ＯＨ、－ＣＯＯ^－および－ＣＨ_２ＯＰＯ_３ ^２－からなる群から選択され、
－各Ｒ^４は独立して－ＯＳＯ_３ ^－、－ＯＨ、－ＯＰＯ_３ ^２－および－Ｈからなる群から選択され、
－ｎは１以上の整数である。

一つの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は一般構造（ＩＶ）を有する。

一つの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は一般構造（Ｖ）を有する。

一つの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は一般構造（ＶＩ）を有する。

ヘパリンおよび硫酸ヘパリンは反復するジサッカライド単位からなる。一つの実施形態では、式（ＩＩＩ）～（ＶＩ）の化合物における反復単位の数は１である。別の実施形態では、式（ＩＩＩ）～（ＶＩ）の化合物における反復単位の数は２である。別の実施形態では、式（ＩＩＩ）～（ＶＩ）の化合物における反復単位の数は３である。別の実施形態では、式（ＩＩＩ）～（ＶＩ）の化合物における反復単位の数は４である。別の実施形態では、式（ＩＩＩ）～（ＶＩ）の化合物における反復単位の数は５である。別の実施形態では、式（ＩＩＩ）～（ＶＩ）の化合物における反復単位の数は６である。別の実施形態では、式（ＩＩＩ）～（ＶＩ）の化合物における反復単位の数は７である。別の実施形態では、式（ＩＩＩ）～（ＶＩ）の化合物における反復単位の数は８である。別の実施形態では、式（ＩＩＩ）～（ＶＩ）の化合物における反復単位の数は９である。別の実施形態では、式（ＩＩＩ）～（ＶＩ）の化合物における反復単位の数は１０である。

一つの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は一般構造（ＶＩＩ）を有する。

一つの実施形態では、化合物は一般構造（ＶＩＩＩ）を有する。

特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物はヘパリンＩであり、次の構造を有する。

特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物はヘパリンＶＩＩであり、次の構造を有する。

いくつかの実施形態では、化合物はさらに当該化合物に共役体化されるアルブミン結合部分を含む。一つの実施形態では、アルブミン結合部分は脂肪酸であり、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノール酸、リノエライジン酸、α－リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択され得る。

いくつかの実施形態では、胆汁酸が式（Ｉ）の化合物に共役体化される。一つの実施形態では、共役体化胆汁酸は、コール酸、タウロコール酸、グリココール酸、タウロケノデオキシコール酸、グリコケノデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、およびリトコール酸からなる群から選択される。

一つの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式：

の樹状構造に末端アミノ基（Ｒ）を介して共有結合される。

ヘパリンアナログのＰＣＳＫ９への結合
いくつかの実施形態では、ヘパリンアナログはＨＳＰＧのＰＣＳＫ９への結合を阻害できる。いくつかの実施形態では、ヘパリンアナログは本明細書において後述されるようにＰＣＳＫ９のアミノ酸残基のいずれかに結合する。ＨＳＰＧが変異体へのＰＣＳＫ９の結合を阻害できる化合物も本発明の範囲内であることが、本開示全体を通して理解されるであろう。ＰＣＳＫ９の変異体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と本質的に同じ配列を有するポリペプチドと理解され、例えば、変異体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のいくつかの残基の保存的置換を有する。

いくつかの実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のアミノ酸残基７８～１６７位の少なくとも１個、ＰＣＳＫ９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のアミノ酸残基７８～９２位の少なくとも１個など、アミノ酸残基９３～９７位の少なくとも１個など、アミノ酸残基９８～１０３位の少なくとも１個など、アミノ酸残基１０４～１０５位の少なくとも１個など、アミノ酸残基１０６～１３５位の少なくとも１個など、アミノ酸残基１３６～１３９位の少なくとも１個など、アミノ酸残基１４０～１６４位の少なくとも１個など、アミノ酸残基１６５～１６７位の少なくとも１個などを含むＰＣＳＫ９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のＨＳＰＧ結合領域内の領域を特異的に認識し結合する。

本明細書において、ＰＣＳＫ９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のアミノ酸残基７８～１６７位の少なくとも１個、ＰＣＳＫ９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のアミノ酸残基７８～１６７位の少なくとも２個など、少なくとも５個など、少なくとも１０個など、少なくとも１５個など、少なくとも２０個など、少なくとも２５個など、少なくとも３０個など、少なくとも３５個など、少なくとも４０個など、少なくとも４５個など、少なくとも５０個など、少なくとも５５個など、少なくとも６０個など、少なくとも６５個など、少なくとも７０個など、少なくとも７５個など、少なくとも８０個など、少なくとも８５個など、すべてなどを含むＰＣＳＫ９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のＨＳＰＧ結合部位内における領域を特異的に認識し結合する化合物が提供される。

いくつかの実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のアミノ酸残基７８～９２位の少なくとも１個、アミノ酸残基９３～９７位の少なくとも１個など、アミノ酸残基９８～１０３位の少なくとも１個など、アミノ酸残基１０４～１０５位の少なくとも１個など、アミノ酸残基１０６～１３５位の少なくとも１個など、アミノ酸残基１３６～１３９位の少なくとも１個など、アミノ酸残基１４０～１６４位の少なくとも１個など、アミノ酸残基１６５～１６７位の少なくとも１個など、ＰＣＳＫ９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のアミノ酸残基７８～１６７位の少なくとも１個などを含む領域を特異的に認識し結合する。

いくつかの実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のアミノ酸残基７８～９２位、アミノ酸残基９３～９７位など、アミノ酸残基９８～１０３位など、アミノ酸残基１０４～１０５位など、アミノ酸残基１０６～１３５位など、アミノ酸残基１３６～１３９位など、アミノ酸残基１４０～１６４位など、アミノ酸残基１６５～１６７位などの少なくとも１つを含む領域を特異的に認識し結合する。

このため、一つの実施形態では、化合物はアミノ酸残基７８～１６７位を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識し結合する。別の実施形態では、化合物はアミノ酸残基７８～９５位を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識し結合する。別の実施形態では、化合物はアミノ酸残基９６～１００位を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識し結合する。別の実施形態では、化合物はアミノ酸残基１０１～１０５位を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識し結合する。別の実施形態では、化合物はアミノ酸残基１０６～１１０位を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識し結合する。別の実施形態では、化合物はアミノ酸残基１１１～１１５位を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識し結合する。別の実施形態では、化合物はアミノ酸残基１１６～１２０位を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識し結合する。別の実施形態では、化合物はアミノ酸残基１２１～１２５位を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識し結合する。別の実施形態では、化合物はアミノ酸残基１２６～１３０位を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識し結合する。別の実施形態では、化合物はアミノ酸残基１３１～１３５位を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識し結合する。別の実施形態では、化合物はアミノ酸残基１３６～１４０位を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識し結合する。別の実施形態では、化合物はアミノ酸残基１４１～１４５位を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識し結合する。別の実施形態では、化合物はアミノ酸残基１４６～１５０位を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識し結合する。別の実施形態では、化合物はアミノ酸残基１５１～１５５位を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識し結合する。別の実施形態では、化合物はアミノ酸残基１５６～１６０位を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識し結合する。別の実施形態では、化合物はアミノ酸残基１６１～１６７位を含むＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位内の領域を特異的に認識し結合する。

このため、ＰＣＳＫ９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のＲ９３、Ｒ９６、Ｒ９７、Ｒ１０４、Ｒ１０５、Ｋ１３６、Ｈ１３９、Ｒ１６５およびＲ１６７からなる群から選択される１個以上のアミノ酸、ＰＣＳＫ９のＲ９３、Ｒ９６、Ｒ９７、Ｒ１０４、Ｒ１０５、Ｋ１３６、Ｈ１３９、Ｒ１６５およびＲ１６７からなる群から選択される１個のアミノ酸など、２個のアミノ酸など、３個のアミノ酸など、４個のアミノ酸など、５個のアミノ酸など、６個のアミノ酸など、７個のアミノ酸など、８個のアミノ酸など、すべてなどに結合する化合物が提供される。

このため一つの実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＲ９３に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＲ９６に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＲ９７に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＲ１０４に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＲ１０５に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＫ１３６に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＨ１３９に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＲ１６５に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＲ１６７に結合する。

一つの実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＲ９６におよびＲ９７に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＲ１０４およびＲ１０５に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＫ１３６およびＨ１３９に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＲ９３およびＨ１３９に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＲ９３、Ｒ１０４、Ｒ１０５およびＨ１３９に結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＲ１６５およびＲ１６７と結合する。別の実施形態では、化合物はＰＣＳＫ９のＲ９３、Ｒ９６、Ｒ９７、Ｒ１０４、Ｒ１０５およびＨ１３９に結合する。

ＬＤＬＲおよびＬＤＬ－Ｃ量
本明細書で開示される化合物のＰＣＳＫ９への結合は、当該化合物が存在しないときの結合と比べてＬＤＬＲへの低下されたＰＣＳＫ９の結合をもたらす。これは次に、当該化合物の存在しないときの量と比べて、肝細胞由来細胞株などのＬＤＬＲ発現細胞株から派生する細胞の、例えばそれらの表面における、増加されたＬＤＬＲ量をもたらす。

いくつかの実施形態では、化合物は前述で定められるヘパリンアナログであり、そのＰＣＳＫ９への結合は、当該ヘパリンアナログが存在しない結合と比べてＬＤＬＲへの低下されたＰＣＳＫ９の結合をもたらす。これは次に、当該化合物の存在しないときの量と比べて、肝細胞由来細胞株などのＬＤＬＲ発現細胞株から派生する細胞の増加されたＬＤＬＲ量をもたらす。

いくつかの実施形態では、化合物のＰＣＳＫ９への結合は、当該化合物が存在しないときの分解と比べて低下されたＬＤＬＲのリソソーム分解をもたらす。特定の実施形態では、化合物は前述で定められるヘパリンアナログであり、ヘパリンアナログのＰＣＳＫ９への結合は、当該ヘパリンアナログが存在しないときの分解と比べて低下されたＬＤＬＲのリソソーム分解をもたらす。

いくつかの実施形態では、化合物のＰＣＳＫ９への結合は、当該化合物が存在しないときと比べて低下されたＬＤＬ－Ｃの血漿中濃度をもたらす。用語「血漿中ＬＤＬ－Ｃ濃度」は、血漿中のＬＤＬ－Ｃの濃度、すなわちＬＤＬ－Ｃタンパク質の量を指すと理解される。特定の実施形態では、化合物は前述で定められるヘパリンアナログであり、ヘパリンアナログのＰＣＳＫ９への結合は、当該ヘパリンアナログが存在しないときと比べて低下されたＬＤＬ－Ｃの血漿中濃度をもたらす。

ＬＤＬ－Ｃの血漿中濃度はインビボまたはインビトロで測定され得る。血漿ＬＤＬ－Ｃの血漿中濃度を測定する方法は従来技術で知られており、限定されないが、ウェスタンブロット、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、超遠心分離、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）および酵素比色測定が挙げられる。

リポタンパク質代謝の障害
本明細書において、リポタンパク質代謝の障害の治療での使用のための化合物を含む組成物が提供される。従って、本明細書においてリポタンパク質代謝の障害の治療のための医薬品の調製のための、本明細書で定められる化合物の使用も提供される。また、それを必要とする被験体におけるリポタンパク質代謝の障害の治療方法での使用のための、前述で定められる化合物が開示される。ＰＣＳＫ９の配列は、被験体間で変化し得、例えば、保存的置換をもたらし得る個体特異的ＳＮＰがいくつかの個体で認められ得る。このようなＰＣＳＫ９変異体へのＨＳＰＧの結合を阻害する化合物はまた本発明の範囲内であることが、本開示全体を通して理解されるであろう。

いくつかの実施形態では、リポタンパク質代謝の障害は異常なＰＣＳＫ９血漿中濃度に関連する。他の実施形態では、リポタンパク質代謝の障害は肝細胞などのＬＤＬＲ発現細胞の表面における異常なＬＤＬＲ量に関連する。リポタンパク質代謝の障害はまた、異常なＰＣＳＫ９血漿中濃度および肝細胞などのＬＤＬＲ発現細胞の表面における異常なＬＤＬＲ量に関連し得る。ＰＣＳＫ９血漿中濃度はヒトでは３０～３０００ｎｇ／ｍＬで変動する。異常なＰＣＳＫ９血漿中濃度は、健常な個体における平均濃度と有意に異なるＰＣＳＫ９の血漿中濃度を指す。いくつかの実施形態では、異常なＰＣＳＫ９血漿中濃度は、健常な個体における平均濃度よりも有意に高い。同様に、肝細胞などの表面における異常なＬＤＬＲ量は、健常な個体における平均量と有意に異なるＬＤＬＲ量を指す。いくつかの実施形態では、肝細胞などのＬＤＬＲ発現細胞の表面における異常なＬＤＬＲ量は、健常な個体における平均量よりも有意に低い。

いくつかの実施形態では、障害はＬＤＬ－Ｃの異常な量、特にＬＤＬ－Ｃの高い量によって特徴付けられる。

リポタンパク質代謝の障害は、脂質恒常性の障害およびこれと関連する障害であり、例として、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、脂質異常症、高脂血症、高トリグリセリド血症、シトステロール血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、冠状動脈性心臓病、メタボリック症候群、急性冠状動脈症候群、黄色腫、高血圧、狭心症、肥満、糖尿病、血管炎症および敗血症を含む。このような障害は、例えば、リポタンパク質粒子の構造的タンパク質における、様々な型のリポタンパク質を認識する細胞受容体における、または脂肪を分解する酵素における欠陥によって生じ得る。このような欠陥の結果として、脂質が血管の壁に沈着されるようになり得る。

高コレステロール血症（または脂質異常症）は、血中コレステロールの高い量の存在である。それは高脂血症（血中脂肪の高量）および高リポタンパク質血症（血中リポタンパク質の高量）の形態である。混合脂質異常症は、しばしばＨＤＬコレステロールの低い量を伴うＬＤＬコレステロール量およびトリグリセリド量の上昇である。家族性高コレステロール血症はＬＤＬＲ遺伝子中の変異によって生じる遺伝性障害であり、血中の高いコレステロール量、特にＬＤＬコレステロールによって特徴付けられる。

高トリグリセリド血症は、血中トリグリセリドの高い量を示す。トリグリセリドの高量はアテローム性動脈硬化症と関連し、高コレステロール血症が存在しない場合でさえ、心臓血管疾患に罹り易くする。非常に高いトリグリセリド量はまた、急性膵炎のリスクを増加する。

シトステロール血症またはフィトステローム血症は、例えば高コレステロール血症、腱および結節黄色腫、アテローム動脈硬化症の早発をもたらす、食事性ステロールの過吸収および低下した胆汁排泄によって特徴付けられる稀な常染色体劣性遺伝性脂質代謝障害である。

アテローム性動脈硬化症（動脈硬化性血管疾患またはＡＳＶＤとしても知られる）は動脈硬化症の特定の型であり、動脈壁が生きた活性白血球（炎症を生じる）および死んだ細胞の残渣の両方を含む白血球の浸潤および蓄積の結果として肥厚し、コレステロールおよびトリグリセリドを含む。アテローム性動脈硬化症は従って、動脈壁における白血球の慢性炎症応答によって動脈血管に影響を及ぼす症候群である。

動脈硬化症は、動脈壁の肥厚化、硬化、および弾性喪失を含む症状である。

冠状動脈性心臓病は、アテローム硬化性動脈疾患、アテローム硬化性心臓血管病、冠状動脈心臓病または虚血性心臓病としても知られており、最も一般的なタイプの心臓病であり、心臓発作の原因である。本疾患は心臓の動脈の内壁に沿って蓄積するプラークによって生じ、動脈内腔を狭め心臓への血流を低下する。

メタボリック症候群はエネルギーの利用および蓄積の障害であり、腹部（中心性）肥満、血圧の上昇、空腹時グルコースの上昇、高い血清トリグリセリド、および低い高比重コレステロール量の５つの医学的症状のうち３つの同時発生によって診断される。メタボリック症候群は心臓血管疾患、特に心不全、および糖尿病の発症リスクを高める。メタボリック症候群は、メタボリック症候群Ｘ、心血管代謝症候群、症候群Ｘ、インスリン抵抗性症候群、リーベン症候群、およびＣＨＡＯＳ（オーストラリアで）としても知られている。メタボリック症候群および前糖尿病は、異なる組み合わせのバイオマーカーで診断されるだけで、同じ障害であると考えられる。

急性冠状動脈症候群は、冠状動脈における血流低下に起因する症状の一群を指し、心筋の一部が適切に機能できない、または機能しなくなる。

黄色腫はリポドーシスの皮膚徴候であり、脂質が皮膚内の大型泡沫細胞に蓄積する。黄色腫は高脂血症と関連する。

高血圧症または血圧上昇は、動脈性高血圧と呼ばれることもあり、動脈の血圧が上昇する慢性的な医学的症状である。

狭心症（またはアンギナ）は、冠状動脈の閉塞または発作由来の心筋の虚血にしばしば起因する胸痛、圧迫、または圧搾の感覚を指す。狭心症は貧血症、不整脈および心不全から生じ得るが、その主な原因は冠状動脈疾患である。

肥満は、過剰な体脂肪が健康に対して負の影響を有し得る程度まで蓄積されている医学的症状であり、平均寿命の短縮および／または健康問題の増加、例えば心臓疾患、２型糖尿病、閉塞性睡眠時無呼吸、ある種の癌、および骨関節炎のリスクの増加などをもたらす。

真性糖尿病は、一般的に糖尿病と呼ばれ、長い期間にわたって高い血糖量である代謝疾患の一群である。いくつかの型の糖尿病があり、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病および妊娠糖尿病が含まれる。１型糖尿病は、膵臓のランゲルハンス島のインスリン産生β細胞の喪失によって特徴付けられ、インスリン欠乏をもたらす。２型糖尿病はインスリン抵抗性によって特徴付けられ、比較的低下したインスリン分泌と結び付けられ得る。インスリンに対する体組織の不完全な応答性は、インスリン受容体を含むと考えられる。妊娠糖尿病は２型糖尿病と類似しており、全妊婦の約２～１０％で発生する。

敗血症は、感染に対する体の応答がそれ自体の組織および器官を傷害するときに生じる、生命を脅かす可能性がある感染の合併症である。感染の際、ＬＤＬ受容体も、循環からのリポポリサッカライドなどの細菌性脂質の除去に関与する。ＰＣＳＫ９阻害は、敗血症の患者の治療における病原性脂質排除を増加する有用な戦略であり得る（Ｗａｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１６）。

リポタンパク質代謝障害の治療
リポタンパク質代謝の障害の治療を必要とする個体または被験体は、リポタンパク質代謝の障害を有する、有することが疑われる、または有するリスクのある個体である。いくつかの実施形態では、治療を必要とする個体は哺乳動物、好ましくはヒトである。

好ましい実施形態では、リポタンパク質代謝の障害は、脂質異常症、高コレステロール血症および冠状動脈性心臓病からなる群から選択される。好ましい実施形態では、リポタンパク質代謝の障害は冠状動脈性心臓病である。

いくつかの実施形態では、治療は予防的である。

いくつかの実施形態では、治療は本明細書で開示される化合物を当該被験体に投与するステップを含む。化合物は体重ｋｇあたり０．１～１０００ｍｇの１日投与量で投与され得る。このためいくつかの実施形態では、化合物は体重ｋｇあたり０．１～１０００ｍｇの１日投与量で投与され、体重ｋｇあたり０．２～９００ｍｇなど、体重ｋｇあたり０．３～８００ｍｇなど、体重ｋｇあたり０．５～７００ｍｇなど、体重ｋｇあたり１．０～５００ｍｇなど、体重ｋｇあたり５～４００ｍｇなど、体重ｋｇあたり１０～３００ｍｇなど、体重ｋｇあたり２５～２５０ｍｇなど、体重ｋｇあたり５０～２００ｍｇなど、体重ｋｇあたり７５～１５０ｍｇなど、体重ｋｇあたり１００～１２５ｍｇなどである。いくつかの実施形態では、化合物は体重ｋｇあたり０．１～１０００ｍｇの１日投与量で投与され、体重ｋｇあたり０．１～１０ｍｇなど、体重ｋｇあたり１０～２５ｍｇなど、体重ｋｇあたり２５～５０ｍｇなど、体重ｋｇあたり５０～１００ｍｇなど、体重ｋｇあたり１００～２５０ｍｇなど、体重ｋｇあたり２５０～５００ｍｇなど、体重ｋｇあたり５００～７５０ｍｇなど、体重ｋｇあたり７５０～１０００ｍｇなどである。

本発明によって治療される徴候の根底にある病因は、患者の血中ＬＤＬ－Ｃの増加された量である。このため、本発明の一つの態様は、ＬＤＬＲの分解を阻害する方法に関し、それはＬＤＬＲに対するＬＤＬ－Ｃの増加された結合をもたらす。このため、患者は一般式（Ｉ）で定められる化合物を投与することによって治療される。

従って、それを必要とする被験体における血漿ＬＤＬ－Ｃ濃度を低下するための方法が本明細書において提供され、当該方法は本明細書で定められる化合物または医薬組成物を当該被験体に投与するステップを含む。血漿ＬＤＬ－Ｃ濃度は、前述のように、従来技術で知られている任意の方法によってインビボまたはインビトロで測定できる。

一つの態様では、本発明は、それを必要とする被験体における血漿リポタンパク質濃度を低下するための方法に関し、当該方法は本明細書で定められる化合物または医薬組成物を当該被験体に投与するステップを含む。

医薬組成物
本明細書で定められる少なくとも１種類の化合物を含む医薬組成物も本明細書において開示される。いくつかの実施形態では、組成物は本明細書で開示される１種類の化合物を含む。他の実施形態では、組成物は２種類以上の化合物を含み、３種類以上の化合物など、４種類以上の化合物など、５種類以上の化合物などを含む。

いくつかの実施形態では、組成物はさらに、
－ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲとの結合を阻害する抗体、
－スタチン、
－コレスチラミン
－コレステロール吸収阻害剤、例えばエゼチミブ、
の少なくとも１種類を含む。

いくつかの実施形態では、組成物は、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ結合部位に結合する抗体などの抗ＰＣＳＫ９抗体、またはスタチンなどの別の化合物と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、組成物はロデルシズマブ、ラルパンシズマブ、アリロクマブ、エボロクマブおよびボコシズマブからなる群から選択される抗体とともに投与される。

このためいくつかの実施形態では、医薬組成物は本明細書で定められる少なくとも１種類の化合物、およびＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を阻害する抗体、スタチンまたはコレスチラミンからなる群から選択される少なくとも１種類の追加化合物を含む。一つの実施形態では、医薬組成物は本明細書で定められる１種類の化合物、およびＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を阻害する抗体を含む。一つの実施形態では、医薬組成物は本明細書で定められる１種類の化合物およびスタチンを含む。一つの実施形態では、医薬組成物は本明細書で定められる１種類の化合物およびコレスチラミンを含む。一つの実施形態では、医薬組成物は本明細書で定められる１種類の化合物、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を阻害する抗体およびスタチンを含む。一つの実施形態では、医薬組成物は本明細書で定められる１種類の化合物、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を阻害する抗体およびコレスチラミンを含む。一つの実施形態では、医薬組成物は本明細書で定められる１種類の化合物、コレスチラミンおよびスタチンを含む。一つの実施形態では、医薬組成物は本明細書で定められる１種類の化合物、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合を阻害する抗体、スタチンおよびコレスチラミンを含む。

医薬組成物は任意に１種類以上の医薬的に許容可能な担体添加剤を含み、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（薬学の科学および実践）１９９５，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．で報告されているように、従来技術によって調製される。組成物は、例えば、カプセル、錠剤、エアゾール、溶液、懸濁液または局所適用などの標準的な剤形で提供され得る。一般的に、本発明の医薬組成物は、例えば静脈内または皮下注射などによる非経口投与用に製剤化され、アンプル、プレフィルドシリンジ、小容量注入における単位用量剤形、または添加される保存剤とともに多回用量容器で提供され得る。組成物は、油性または水性賦形剤中の懸濁液、溶液、またはエマルションなどの剤形、例えば水性ポリエチレングリコール中の溶液を用い得る。組成物は経口摂取に適したものであり得る。これは特に小分子組成物と関連する。油性または非水性の担体、希釈剤、溶媒または賦形剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物オイル（例えば、オリーブオイル）、および注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）を含み、保存剤、湿潤剤、乳化剤または懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの製剤用薬剤を含み得る。あるいは、有効成分は、適切な賦形剤、例えば殺菌したパイロジェンフリー水を用いて使用前に構成するために、殺菌した固体の無菌分離、または溶液からの凍結乾燥によって得られる粉末剤形であり得る。オイルは非経口製剤において有用であり、石油、動物、植物、および合成オイルを含む。このような製剤で有用なオイルの具体的な例は、ピーナッツ、ダイズ、ゴマ、メンミ、コーン、オリーブ、石油、およびミネラルを含む。非経口製剤における使用に適した脂肪酸は、オレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸を含む。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルが適切な脂肪酸エステルの例である。非経口製剤は一般的に、溶液中に有効成分を重量で約０．５～約２５％など、約０．０００１～約２５％含む。保存剤および緩衝剤が使用され得る。注射部位の刺激を最小限にする、または排除するために、このような組成物は約１２～約１７の親水性－親油性バランス（ＨＬＢ）を有する１種類以上の非イオン性界面活性剤を含み得る。このような製剤における界面活性剤の量は、一般的に重量で約０．０００００１～約１５％の範囲であり、重量で約０．０００００１～約５％または重量で約５～約１５％などである。適切な界面活性剤は、ソルビタンモノオレエートなどのポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル、およびプロピレンオキシドとプロピレングリコールの縮合によって生成される、疎水性塩基を有するエチレンオキシドの高分子量付加物を含む。非経口製剤は、アンプルおよびバイアルなどの容器に密封された単位用量または多回用量で提供され得、使用直前に注射のために例えば水などの無菌液体賦形剤の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。

しかし、本発明による薬剤送達の主な経路は、薬剤を血流に導入して最終的に関連組織を標的にするために、非経口である。

一つの実施形態では、薬剤は、生物学的に活性な物質が与えられる動物のいずれかの粘膜を通過するように投与され、例えば、鼻腔、膣、眼、口腔、生殖器、肺、胃腸管、または直腸など、好ましくは鼻腔または口腔で投与される。

好ましい実施形態では、本発明の薬剤は非経口的、すなわち静脈内、筋肉内、脊髄内、皮下、鼻腔内、直腸内、膣内または腹腔内投与によって投与される。非経口投与の皮下および筋肉内剤形が一般的に好ましい。このような投与に適した投与剤形は、従来技術によって調製され得る。化合物はまた、吸入によって投与され得、それは鼻腔内および経口吸入投与による。このような投与に適した投与剤形、エアゾール製剤または計量式吸入器などは、従来技術によって調製され得る。

一つの実施形態では、本発明による医薬組成物は、注射によるなどの非経口投与用に製剤化される。

さらなる実施形態では、本発明による医薬組成物は、静脈内、筋肉内、脊髄内、腹腔内、皮下、ボーラスまたは持続投与のために製剤化される。

投与の速度および頻度は症例ごとに基づき医師によって決定され得る。一つの実施形態では、投与は３０分～２４時間の間隔で行われ、１～６時間など、１日１回などである。

治療期間は障害の重度に応じて変動し得る。一つの実施形態では、治療期間は１～２８日であり、２～２５日など、５～２０日など、７～１５日などである。慢性症例では、治療期間は終生であり得る。

投与量は患者の特性、ならびに投与の手段および方式に基づいて担当の医師によって決定され得る。本発明の一つの実施形態では、前述で本明細書において定められる医薬組成物の有効化合物の投与量は、ｋｇ体重あたり０．１～１０００ｍｇである。

投与量は、ボーラス投与として、または持続投与として投与され得る。ボーラス投与に関して、医薬組成物は１日１回など、３０分～２４時間の間隔で投与され得る。

いくつかの実施形態では、組成物のｐＨはｐＨ４～１０である。

いくつかの実施形態では、組成物は経口投与用に製剤化される。

いくつかの実施形態では、組成物は非経口投与用に製剤化される。特定の実施形態では、非経口投与は注射による。このような非経口は、静脈内、筋肉内、脊髄内、腹腔内、皮下、ボーラスまたは継続投与であり得る。

一つの実施形態では、本明細書で開示される組成物は血清中で安定なヘパリンアナログである。

また本明細書において、特に投与後に非毒性である、前述で定められる化合物が提供される。いくつかの実施形態では、化合物は投与後に非毒性であるヘパリンアナログである。

例
例１：ＰＣＳＫ９中のＨＳＰＧ結合部位のマッピング。
ＰＣＳＫ９（ＰＤＢ：２ＰＭＷ）の静電表面を試験し（図２Ｂ）、ＰＣＳＫ９プロドメインに位置する６個の表面暴露された塩基性残基からなる推定ヘパリン結合部位を特定した。結合部位は９３、９６、９７、１０４、および１０５位のアルギニン（Ｒ）残基および１３９位のヒスチジン（Ｈ）によって形成され、これはヘパリンペンタサッカライド（ＳＡＮＯＲＧ）の硫酸基と完全な対を示す（Ｈｅｒｂｅｒｔら，１９９６）（Ｈｅｒｂｅｒｔら，１９９６）（図２Ｂおよび２Ｃ）。この部位はＰＣＳＫ９の不活性触媒領域に位置するＬＤＬＲ結合表面の反対側に認められる（図２Ａ）。ＬＤＬＲ（ＰＤＢ：３Ｐ５Ｂ）との複合体におけるＰＣＳＫ９の共結晶構造へのヘパリンフラグメントの結合は、硫酸ヘパラン結合がその後のＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲ複合体形成を可能にすることを示唆する（図３Ｃ）。

例２：ヘパリナーゼ処理はインビトロでＰＣＳＫ９細胞表面会合を阻害しかつインビボでＰＣＳＫ９誘発性分解に対しＬＤＬ受容体を保護する。
本発明者らはＨＳＰＧがＰＣＳＫ９の捕捉に関与し得ると推測した。このため、ＰＣＳＫ９を安定に発現するヒト肝細胞由来ＨｅｐＧ２細胞をヘパリナーゼＩで処理した。酵素ヘパリナーゼＩは硫酸ヘパランＧＡＧ鎖をウロン酸とＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンの間の１，４Ｏ－結合で切断し、これによって細胞表面硫酸ヘパラン鎖を取り除く。

ＰＣＳＫ９で安定にトランスフェクションされたＨｅｐＧ２細胞を、カバーガラスあたり５０．０００個で播種し一昼夜インキュベーションし、その後ＰＢＳ中のヘパリナーゼＩ（シグマアルドリッチ、Ｈ２５１９）（０．０００２ＵＮ／ｍＬ）またはＰＢＳのみを添加した。細胞を３７℃で１時間インキュベーションしてから４％パラホルムアルデヒドで固定し、非透過細胞を第一および第二抗体によって免疫染色した。核をＨｏｅｃｈｓｔ色素（シグマアルドリッチ）で視覚化した。画像をＺｅｉｓｓ ＬＳＭ７８０で取得した。

実際に、処理は表面ＰＣＳＫ９染色の強度の顕著な低下をもたらし、ＨＳＰＧがＰＣＳＫ９細胞結合にとって重要であることを示唆した（図２Ｄ）。

インビボでのＰＣＳＫ９活性に対する硫酸ヘパランＧＡＧの酵素的除去の効果を試験するため、１０～１２週齢雄ＢＡＬＢ６／ｃＪＲｊマウスに、ＰＣＳＫ９（１０μｇ）の注射５分前に、尾静脈カテーテルを通して投与するヘパリナーゼＩ（３０Ｕ）を注入した。コントロールマウスでは、ヘパリナーゼ注射および／またはＰＣＳＫ９注射を０．９％生理食塩水の注射に代えた。ヘパリナーゼ注入の間、マウスはマスクを通して継続的に投与されるイソフルランによって軽く麻酔された。注射１時間後、マウスを屠殺し肝細胞サンプルを収集し、タンパク質の抽出およびウェスタンブロットによるＬＤＬＲ量の評価前に急速凍結した（図１０Ａ）。ヘパリナーゼＩの注射はＰＣＳＫ９誘発性分解からＬＤＬＲを完全に防ぎ、ＨＳＰＧがインビボでのＬＤＬＲのＰＣＳＫ９誘発性分解において有用であることを示す（図１０ＡおよびＢ）。

ＰＣＳＫ９と硫酸ヘパランＧＡＧ鎖の間の直接的な相互作用を確認するため、ヘパリンと共有結合されたセファロースビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーを使用した。

精製ＰＣＳＫ９を、ＰＢＳ中の５ｍＬのＨｉＴｒａｐヘパリンＨＰカラム（ＧＥヘルスケア）に加えた。カラムをＡｋｔａ Ｐｒｉｍｅに接続し、５カラム容量の１０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ７．４）で洗浄した。ＰＣＳＫ９を１０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ７．４）と２ＭのＮａＣｌの直線勾配を用いて溶出し、画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。測定された導電率に基づき、溶出プロファイルを変換係数０．０６５ｍＳ／ｍＭ ＮａＣｌを用いてＮａＣｌ濃度の関数に変換した。精製ＰＣＳＫ９はヘパリンカラムに保持され約５００ｍＭのＮａＣｌ濃度で溶出され（図２Ｅ）、ヘパリンとの強くて高い特異的相互作用を示した。

別の実験では、目的のＰＣＳＫ９変異体でトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞またはＣＨＯ細胞からの条件化培地を、１０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（結合緩衝液）中のヘパリンセファロースＣＬ－６Ｂビーズ（ＧＥヘルスケア）とインキュベーションした。ローター上で４℃にて一昼夜インキュベーション後に、ビーズを結合緩衝液で洗浄し、その後ＮａＣｌの濃度を高めてヘパリン結合タンパク質をバッチ溶出した。添加、フロースルー、および溶出画分中のＰＣＳＫ９をウェスタンブロッティングによって評価した。

ＨｅｐＧ２細胞の条件化培地由来の内因性ＰＣＳＫ９もヘパリンと結合し、十分確立されているＨＳＰＧ結合タンパク質であるアポＥと同様の溶出プロファイルを示すことを認めた。（図３Ｄ）。

例３：ＰＣＳＫ９／ＨＳＰＧ相互作用にとって重要な残基の同定。
ＰＣＳＫ９／ＨＳＰＧ相互作用に関与する重要な残基をさらに絞り込むため、ＨＳＰＧ結合モチーフに点変異を有するＰＣＳＫ９変異体をクローニングし発現させた。変異はＰＣＲによって導入し、３Ｄ構造モデル結合によって同定された荷電アミノ酸アルギン（Ａｒｇ／Ｒ）、リジン（Ｌｙｓ／Ｋ）、およびヒスチジン（Ｈｉｓ／Ｈ）を、アラニン（Ａｌａ／Ａ）などの中性残基によって置換した。

ヒト野生型および下記のアラニン置換変異体を分析した。
野生型ＰＣＳＫ９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
変異体Ｒ９３
変異体Ｒ９６Ｒ９７
変異体Ｒ１０４Ｒ１０５
変異体Ｒ１６５Ｒ１６７
変異体Ｒ９３Ｒ１０４Ｒ１０５Ｈ１３９Ａ
変異体Ｒ９３Ｒ９６Ｒ９７Ｒ１０４Ｒ１０５Ｈ１３９

不適切に折り畳まれたＰＣＳＫ９は一般的に、プロペプチドに切断されず、従って小胞体に留まるため、ＰＣＳＫ９変異体の正しい折り畳みを、それらのプロセシングおよび分泌をモニタリングすることによって評価できる。プロＰＣＳＫ９の成熟タンパク質へのプロセシングおよび成熟ＰＣＳＫ９変異体の分泌を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の一時的トランスフェクション、続いて細胞溶解物および周辺培地中のＰＣＳＫ９のウェスタンブロット分析によって評価した（図３Ａ）。

ヘパリンに結合するＰＣＳＫ９変異体タンパク質の能力を、アフィニティークロマトグラフィー、続いて抗ＰＣＳＫ９抗体によるウェスタンブロッティングによって評価した。目的のＰＣＳＫ９変異体でトランスフェクションしたＣＨＯ細胞からの条件化培地を、１０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（結合緩衝液）中のヘパリンセファロースＣＬ－６Ｂビーズ（ＧＥヘルスケア）とインキュベーションした。ローター上で４℃にて一昼夜インキュベーション後に、ビーズを結合緩衝液で洗浄し、その後ＮａＣｌの濃度を高めてヘパリン結合タンパク質をバッチ溶出した。添加、フロースルー、および溶出画分中のＰＣＳＫ９をウェスタンブロッティングによって評価した。

変異体Ｒ９３、Ｒ９６Ｒ９７およびＲ１０４Ｒ１０５は野生型ＰＣＳＫ９または変異体Ｒ１６５Ｒ１６７と比べてヘパリンに対して低い親和性を示し、変異体Ｒ９３Ｒ１０４Ｒ１０５Ｈ１３９およびＲ９３Ｒ９６Ｒ９７Ｒ１０４Ｒ１０５Ｈ１３９はヘパリンを結合せず、フロースルーにのみ認められる（図３Ｂ）。

例４：変異されたＨＳＰＧ結合領域を有するＰＣＳＫ９変異体はＬＤＬ受容体分解を誘発できない。
精製ＰＣＳＫ９変異体を細胞アッセイで試験して、野生型ＰＣＳＫ９と比較してＬＤＬＲの分解を誘発するそれらの能力を試験した。ＬＤＬＲ分解の誘発は、野生型ＰＣＳＫ９（ＷＴ）または上記ＰＣＳＫ９変異体とのＨｅｐＧ２細胞のインキュベーションによって分析し、ＬＤＬＲ量をウェスタンブロッティングによって評価した。ＨｅｐＧ２細胞を１２ウェルプレートにウェルあたり２５０．０００個の密度で接種した。一昼夜インキュベーション後、培地をＰＣＳＫ９ＷＴまたは変異体Ｒ９３Ｒ９６Ｒ９７Ｒ１０４Ｒ１０５Ｈ１３９を含む新鮮な培地と交換した。細胞を収集し１８時間インキュベーション後に溶解し、ＬＤＬＲ量をウェスタンブロッティングおよびデンシトメトリーによる定量によって評価した。

変異体Ｒ９３Ｒ９６Ｒ９７Ｒ１０４Ｒ１０５Ｈ１３９とインキュベーションされた細胞中のＬＤＬＲ量は、ＷＴ ＰＣＳＫ９とインキュベーションされた細胞中で測定された量と比べて顕著に高く（約２倍）（図４ＡおよびＢ）、ＨＳＰＧ結合領域内の変異がＰＣＳＫ９誘発性ＬＤＬＲ分解の低下をもたらしたことを示す。

例５：ヘパリンおよびヘパリンアナログはＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲ複合体形成を妨げる。
近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）を用いて、外因的に加えられたヘパリンが内因性ＰＣＳＫ９の結合に対し細胞表面ＨＳＰＧと競合し、これによってＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲ複合体形成を妨げるかどうか試験した（Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇら，２００６）。

ＰＬＡ（Ｄｕｏｌｉｎｋ（登録商標）ＩＩ，Ｏｌｉｎｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、第一抗体として抗ＰＣＳＫ９（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ３８８８）、および抗ＬＤＬＲ（Ａｂｃａｍ、ａｂ５２８１８）を用いて、製造業者のプロトコルに従って実施した。互いに３０ｎｍ以内に位置するＰＣＳＫ９とＬＤＬＲを、環状オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションしローリングサイクル増幅を開始させるオリゴヌクレオチド共役体化第二抗体によって視覚化する。増幅されたＤＮＡを、相補的な蛍光標識オリゴヌクレオチドの添加によって視覚化する（Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇら，２００６）。

このアッセイを非透過処理ＨｅｐＧ２細胞中の内因性の細胞表面ＰＣＳＫ９およびＬＤＬＲに対して用いて、ＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲ複合体の多量なクラスターが観察された（図５Ｄ）。これらはヘパリンとのインキュベーションで数および強度の両方が顕著に低下され、ＨＳＰＧへのＰＣＳＫ９結合が、その後の細胞表面ＬＤＬＲとの複合体形成において役に立つことを示唆する。

ＨｅｐＧ２細胞のヘパリン（５０Ｕ／ｍＬ、１８時間）とのインキュベーションはＬＤＬＲタンパク質の２～３倍高い量をもたらした（図５Ａ～５Ｂ）ことを認め、同様な効果が低分子量ヘパリンの他の２種の治療用調製物で観察された（図８Ａ）。

ヘパリン処理したＨｅｐＧ２細胞中の細胞ＬＤＬＲの増加は用量依存的であり、培地中のＰＣＳＫ９の顕著な増加を伴った（図６Ｂ）。ＰＣＳＫ９濃度をＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手したヒト（ＤＰＣ９００）Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキットを用いて、製造業者のプロトコルに従って測定した。

ヘパリンによって誘発された細胞ＬＤＬＲおよび細胞外ＰＣＳＫ９の増加は、最も高いヘパリン濃度でのＰＣＳＫ９以外、ｍＲＮＡでの変化を認めなかったため、翻訳後の段階で生じた（図６Ｃ）。

ＨｅｐＧ２細胞からのＲＮＡ抽出をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ調製キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いて行い、続いての０．５μｇＲＮＡ鋳型からのｃＤＮＡ合成をｉＳｃｒｉｐｔ（商標）ｃＤＮＡ合成キット（ＢＩＯＲＡＤ）を用いて実施した。リアルタイムＰＣＲを以下のプライマーを用いてｉＱ ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎスーパーミックスおよびｉＴａｑ（商標）ポリメラーゼにより実施して、ＬＤＬＲ（フォワードプライマー５’ＡＣＧＧＣＧＴＣＴＣＴＴＣＣＴＡＴＧＡＣＡ３’、リバースプライマー５’ＣＣＣＴＴＧＧＴＡＴＣＣＧＣＡＡＣＡＧＡ３’）、ＰＣＳＫ９（フォワードプライマー５’ＣＣＴＧＧＡＧＣＧＧＡＴＴＡＣ－ＣＣＣＴ３’、リバースプライマー５’ＣＴＧＴＡＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＴＡＧＧＡＧＡ３’）、およびＧＡＰＤＨ（フォワードプライマー５’ＡＣＡＡＣＴＴＴＧＧＴＡＴＣＧＴＧＧＡＡＧＧ３’、リバースプライマー５’ＧＣＣＡＴＣＡＣＧＣＣＡＣＡ－ＧＴＴＴＣ３’）の転写物を検出した。

２５Ｕ／ｍＬヘパリンが、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの２倍増加にも関わらず、ＬＤＬＲの約２．５倍の増加から証明されるようにＰＣＳＫ９活性と効果的に拮抗することを認めた（図８Ｂ）。

ヘパリン（５０Ｕ／ｍＬ）と２４時間インキュベーションされたＨｅｐＧ２細胞はウェスタンブロッティングによって評価したとき、ＬＤＬＲ量の増加を示した（図５Ａ）。ＬＤＬＲ量をデンシトメトリーによっても定量した（ｎ＝４）（図５Ｂ）。ヘパリンとのインキュベーションは、ＥＬＩＳＡによって測定されるとき、培地におけるＰＣＳＫ９量の増加ももたらした（図５Ｃ）。

ヘパリンは、製造業者のプロトコルに従いＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲ結合アッセイ（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって分析するとき、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲの間の直接的な相互作用に干渉しない（図６Ａ）。簡単に説明すると、ＬＤＬＲ細胞外領域でコーティングされたマイクロタイタープレートウェルを、ヘパリン（５または５０Ｕ／ｍＬ）またはＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ結合領域に対する抗ＰＣＳＫ９抗体（（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｏ．７１２０７）の存在下で、ビオチニル化ＰＣＳＫ９とインキュベーションした。洗浄後、ウェルをホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジンとインキュベーションし、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ細胞外領域への結合をＨＲＰ基質の添加および化学発光マイクロプレートリーダーを用いるシグナルの測定によって評価した。

ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲの間の相互作用はヘパリンの添加によって影響されず、ヘパリンのＰＣＳＫ９への結合は、ＰＣＳＫ９と細胞表面ＨＳＰＧの相互作用を妨げることによってＬＤＬＲ分解の低下をもたらすことが示される。

フォンダパリヌクス（アリクストラ）（２５、１００、または２５０μｇ／ｍＬ）と２４時間インキュベーションしたＨｅｐＧ２細胞は、ウェスタンブロッティングによって評価したとき、ＬＤＬＲ量の増加を示した（図７）。これらの結果は、フォンダパリヌクスなどのヘパリンアナログのＰＣＳＫ９との結合は、ＰＣＳＫ９と細胞表面ＨＳＰＧの相互作用を妨げることによってＬＤＬＲ分解の低下をもたらすことを示す。

例６：ヘパリン模倣剤はＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲ相互作用を妨げる。
ヘパリンの構造を模倣するいくつかの分子が多くの治療適用のためにここ１００年にわたって開発されており、いくつかが現在臨床使用されている。これらはヘパリン模倣剤と称され、様々なオリゴサッカライド、オリゴヌクレオチドおよびナフタレン誘導体を含む、多様な化学系統に属する。ヘパリン模倣剤のサブセットを、ＨｅｐＧ２細胞中でＰＣＳＫ９を結合しＬＤＬＲを増加するそれらの能力について試験した（図９）。

ＰＣＳＫ９とリガンド（スラミン、硫酸デキストラン５０００、デキストラン５０００、硫酸ペントサンおよびＳ－ｄＣ－３６）の間の平衡結合親和性を、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）（Ｊｅｒａｂｅｋ－Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎら，２０１１）を用いて評価した。ＰＣＳＫ９をＭＯ－Ｌ００３ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ Ｂｌｕｅ－ＮＨＳ標識キット（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって標識し、色素に対するタンパク質のモル比１：１の標識効率を達成した。ＰＣＳＫ９を１００ｎＭの最終濃度で加えた。非標識結合パートナーを１：１希釈（ＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０）で用量設定し、最大濃度はスラミンで１５．４ｍＭ、硫酸デキストラン５０００で２．３ｍＭ、デキストラン５０００で２．３ｍＭ、硫酸ペントサンで１６．３ｍＭ、およびＳ－ｄＣ－３６で２５０μＭだった。ＭＳＴ測定を、２０％ＬＥＤおよび８０％ＭＳＴ出力を用いてＭｏｎｏｌｉｔｈ ＮＴ．１１５装置（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって標準処理したキャピラリー（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で実施した。レーザーのオンおよびオフ時間はそれぞれ５秒および３５秒だった。陰性コントロールは、全１６本のキャピラリーでＭＳＴ緩衝液中の１００ｎＭの標識ＰＣＳＫ９を用いて、上記と同一条件で実施した。結合曲線を、スラミン、硫酸デキストラン５０００およびＳ－ｄＣ－３６について８０％ＭＳＴ出力の温度ジャンプ相から、硫酸ペントサンについて８０％ＭＳＴ出力の熱拡散＋温度ジャンプ相から得た。各結合パートナーについて、シグモイド型用量－応答曲線をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６によってフィッティングして平均ＫＤ値を得た。ＰＣＳＫ９の蛍光消失が高濃度のスラミンの存在下で観察されたため、変性試験を、ＰＣＳＫ９を１０％ＳＤＳで前処理しサンプルを９０ｏＣで１５分間加熱してからＭＳＴ装置で分析することによって実施した。これは消失効果を排除し、非変性条件下のＰＣＳＫ９の蛍光消失が実際のリガンド結合事象に起因することを示した。

硫酸化オリゴサッカライドである硫酸デキストラン（図９Ｃ）および硫酸ペントサン（図９Ｆ）はＭＳＴを用いて測定したとき、ともにＰＣＳＫ９にそれぞれ１７９．５μＭおよび３８１．３μＭの親和性で結合し、細胞ＬＤＬＲの用量依存的増加をもたらし（図９Ａ～Ｂおよび図９Ｄ～Ｅ）、コントロールと比べて約４００％のプラトーに達し、このアッセイにおいてスタチンの最大効果よりも著しく優れていた。相互反応は、非硫酸化デキストランがＰＣＳＫ９に対する親和性を示さなかったように、硫酸基の存在に依存した。硫酸化ナフタレン誘導体であるスラミンは、アフリカ睡眠病の抗寄生虫剤であり、１９０μＭの親和性でＰＣＳＫ９と結合し（図９Ｈ）最大で１５倍のＬＤＬＲの増加（図９Ａ、９Ｇ）をもたらし、蛍光標識ＬＤＬ粒子の細胞内取り込みの増加を伴うった（図１２）。さらに３６マー一本鎖ＤＮＡ分子（ホスホロチオアートオリゴデオキシシチジン、Ｓ－ｄＣ－３６）を試験し、それが４．８μＭのＫＤでＰＣＳＫ９を結合し（図９Ｋ）、この濃度範囲で強力な阻害効果を示したことを認めた（図９Ｉ～Ｊ）。

例７：ＰＣＳＫ９は特定の糖組成物および硫酸化パターンに選択性を示す。
ＰＣＳＫ９の負電荷糖との相互作用の特異性および選択性を詳細に調査するため、ヘパリンの所定の鎖長および硫酸化パターンを含む固定された合成細胞外マトリックスグリカン（図１４Ａ）ならびに関連するグリコサミノグリカンである硫酸ケラタンおよび硫酸デルマタンからなるグリカンマイクロアレイへのＰＣＳＫ９結合を分析した。

硫酸ヘパラン／ヘパリンの合成オリゴサッカライド、硫酸ケラタン、硫酸デルマタンおよび５ｋＤ天然ヘパリン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を含む細胞外マトリックスグリカンマイクロアレイを、２５０μＭスポッティング溶液を用いて既に報告されているように調製した（Ｈｅｃｈｔら，２００９、ｄｅ Ｐａｚら，２００６）。スポッティング後に、マイクロアレイスライドを湿潤なチャンバー中で一昼夜インキュベーションし、続いて水で３回洗浄し、５０ｍＭエタノールアミン溶液、ｐＨ９．により５０℃で１時間クエンチングして残存反応基を除いた。スライドを水で３回洗浄し、ＰＢＳ中の１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、ｐＨ７．４で室温で１時間ブロッキングし、遠心分離（５分、３００×ｇ）により乾燥した。１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ－ＰＢＳで希釈したＰＣＳＫ９（２５μｇ／ｍＬ）を湿潤なチャンバー中で４℃一昼夜インキュベーションした。０．１％（ｖ／ｖ）ツイーン－ＰＢＳによる３回洗浄ステップ後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳで希釈されプレインキュベーションされた０．１μｇ／ｍＬヒト化抗ＰＣＳＫ９ｍＡｂおよび５μｇ／ｍＬヤギ抗ヒトＩｇＧＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とのインキュベーションを室温で１時間実施した。スライドを０．１％（ｖ／ｖ）ツイーン－ＰＢＳで３回洗浄し、水で１回すすぎ遠心分離により乾燥した。データ取得のため、スライドをＧｅｎｅＰｉｘ４３００マイクロアレイスキャナー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａ，ＵＳＡ）を用いて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７を６３５ｎｍで励起してスキャンした。光増幅装置（ＰＭＴ）値を、飽和なしにスキャンを示すように設定した。中央蛍光値をＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ７ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により決定した。

ＰＣＳＫ９は、それぞれ３回および２回の反復を含む硫酸ヘパラン／ヘパリン構造ＩおよびＶＩＩの結合から明らかなように、［４）－α－ＧｌｃＮ－６，Ｎ－二硫酸（１→４）－α－ＩｄｏＡ－２－硫酸－（１→］からなるヘパランジサッカライド反復に対する選択性を示した（図１４Ｂ）。１つの反復のみからなる硫酸ヘパラン／ヘパリン下位構造では結合が観察されず、効率的な結合には最小限２回反復が必要とされた。ＧｌｃＮのアミノ基における硫酸基およびＧｌｃＮの炭素６位およびＩｄｏＡの炭素２位におけるエステル結合した硫酸基の必要性も、硫酸ヘパラン／ヘパリン下位構造であるヘパランＩ、ヘパランＩＩおよびヘパランＩＩＩへの結合を比較することにより明らかだった。

これらの結果は、特定の糖組成および硫酸化パターンに対するＰＣＳＫ９の優先性を実証した（図１４Ｂ）。

例８：低分子量ヘパリンの治療用調製物はＬＤＬＲをＰＣＳＫ９により誘発される分解に対して保護する。
低分子量ヘパリン調製物であるフラグミン（１～１００Ｕ／ｍＬ）またはイノヘップ（１～１００Ｕ／ｍＬ）と一昼夜インキュベーションされたＨｅｐＧ２細胞は、ウェスタンブロッティングで評価したとき、増加したＬＤＬＲ量を示した（図８Ａ）。フラグミンおよびイノヘップの効果は、ヘパリン（図５Ａ）およびペンタサッカライドであるアリクストラ（図７）の効果に匹敵した。

これらの結果は、鋳型としてヘパリン：ＰＣＫＳ９複合体を用いる構造をベースとした薬剤設計が、小分子ＰＣＳＫ９阻害剤の開発に適していることを示す。

例９：ヘパリンはインビボでＬＤＬＲをＰＣＳＫ９により誘発される分解から保護する。
マウス（ＢＡＬＢ６／ｃＪＲｊ）に１０μｇのヒト組換えＰＣＳＫ９単独のまたはヘパリン（５０Ｕ）と組み合わせた単回静脈投与（尾静脈）を実施した。注射の１時間後、マウスを屠殺し肝組織を収集した。膜タンパク質調製物でのＬＤＬＲのウェスタンブロット分析は、ヘパリンとの共注射を受けたマウスは、ＰＣＳＫ９単独を注射されたマウスと比べて有意に高い肝ＬＤＬＲ量を示した（図８Ｂ、図８Ｃで定量）。

これらの結果は、ＰＣＳＫ９：ヘパリン相互作用が小分子ＰＣＳＫ９阻害剤の開発のための枠組みをもたらし得ることを示す。

例１０：スタチン治療に応答しない患者においてＬＤＬコレステロールを低下する。
増加したＬＤＬコレステロールを有する患者はスタチン治療を処方される。患者はスタチン治療に応答しない。患者は次いでヒトＰＣＳＫ９中のＨＳＰＧ結合部位をブロックするように設計されるヘパリンアナログを含む組成物の２５～５００ｍｇの皮下注射による治療を処方される。注射を１～２８日の間隔で実施する。ＬＤＬ－Ｃ量の顕著な低下が認められ、ヘパリンアナログの非経口投与がスタチン治療に応答しない患者においてＬＤＬ－Ｃ量の低下をもたらし得ることを示す。

例１１：ＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合部位に対するヘパリンアナログを用いてＬＤＬコレステロールを低下する。
増加したＬＤＬコレステロールを有する患者は、ヒトＰＣＳＫ９中のＨＳＰＧ結合部位をブロックするように設計されるヘパリンアナログの投与を処方される。化合物は０．１～３０ｍｇ／ｋｇの用量にて経口で投与される。ＬＤＬ－Ｃ量の顕著な低下が認められ、ヒトＰＣＳＫ９中のＨＳＰＧ結合部位をブロックするように設計されるヘパリンアナログの経口投与が患者においてＬＤＬ－Ｃ量の低下をもたらし得ることを示す。

例１２：スタチン治療に応答しない患者においてＬＤＬコレステロールを低下する。
患者は増加したＬＤＬ－Ｃ量に対してスタチン治療を受ける。しかし、ＬＤＬ－Ｃの最初の低下後に、スタチンにより誘発されたＰＣＳＫ９の発現増加によって、治療はＬＤＬ－Ｃ量を有意に低下させることに成功しない。

スタチンに加えて、患者はＨＳＰＧのＰＣＳＫ９への結合を阻害する化合物を投与される。投与は毎週、スタチンと組み合わせた化合物の低用量（２５～１５０ｍｇ）で行われる。ＬＤＬ－Ｃ量の顕著な低下が認められ、所望のＬＤＬ－Ｃ量にいたる。

この例は、スタチンをベースとする治療にヘパリンアナログの投与を補充することによって、ＬＤＬ－Ｃ量をうまく低下し得ることを示す。

例１３：変異されたＨＳＰＧ結合部位を有するＰＣＳＫ９はＬＤＬコレステロール量を増加できない。
野生型ＰＣＳＫ９およびＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合変異体を、ＣＧジヌクレオチドフリー発現プラスミド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）の流体力学尾注射によってマウスの肝臓で過剰発現させ、これらのプラスミドはＣＧ塩基対のメチル化によって不活性化する傾向がある従来のプラスミドと比べて長期の発現を示す。野生型ＰＣＳＫ９の過剰発現は、ＬＤＬＲの分解の増加を誘発し、血清ＬＤＬコレステロールの上昇をもたらし、これによって「機能獲得」変異体として作用する。ＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ変異体は、「機能喪失」変異体として作用し、ＬＤＬ受容体の分解低下によって血清ＬＤＬコレステロール量増加を低く上昇させる。

結果は、動物におけるＬＤＬ受容体の分解におけるＰＣＳＫ９のＨＳＰＧ結合領域の重要な役割を実証する。

例１４：ヘパリンおよびヘパリン模倣剤とのＰＣＳＫ９の相互作用に基づいた小分子ＰＣＳＫ９阻害剤の構造をベースとした設計。
小分子量ヘパリンおよびヘパリンアナログの中から選択された候補化合物を、ＨｅｐＧ２細胞培養アッセイでＰＣＳＫ９機能を阻害しＬＤＬＲ量を増加するそれらの能力について試験する。ヘパリンアナログであるフォンダパリヌクス（商標名アリクストラ）を対照化合物として使用する。得られる構造情報を使用して３～５種のファルマコフォアモデルを導き、それを使用して３百万の入手可能な化合物の既存データベースをスクリーニングする。多様性に基づく５０種の化合物のコレクションを、ＨｅｐＧ２細胞における機能的試験のために選択する。良好な阻害剤は分子結合モデルの校正および購入可能な化合物の第二スクリーニングを促進する。５０種の化合物を、購入およびインビトロ試験のために選択する。３種の最も有望な候補を引き続きマウスモデルで試験して、肝臓中のＬＤＬＲ量および血漿中のコレステロールに対する影響をインビボで評価する。

例１５：ＰＣＳＫ９阻害剤候補の試験。
ＰＣＳＫ９阻害剤候補の前臨床試験を、ＬＤＬＲについてヘテロ接合（ＬＤＬＲ＋／－）であり、内因性ネズミＰＣＳＫ９プロモーターの制御下でヒトＰＣＳＫ９の発現を有する冠状動脈疾患マウスモデルを用いて実施する。西洋型食餌で飼育されたマウスをＰＣＳＫ９阻害剤により６～８ヶ月間治療し、解剖した大動脈での脂肪沈着のオイルレッドＯ染色後に顕微鏡によりアテローム硬化性プラーク領域を評価する。コレステロールの血漿濃度を実験期間中２ヶ月毎にＥＬＩＳＡにより評価する。

これらの試験は、血清コレステロールを低下するＰＣＳＫ９阻害剤候補物質の能力評価を可能にする。

例１６：硫酸デキストランおよびペントサンはＬＤＬＲをＰＣＳＫ９誘発性分解から保護する。
修飾ポリサッカライド化合物のヘパリン模倣剤系で、硫酸デキストラン（図９Ａ～Ｂ）およびペントサン（図９Ｄ～Ｅ）を、ＨｅｐＧ２細胞をベースとしたインビトロ細胞アッセイで試験した。一昼夜インキュベーション後の、ＬＤＬＲ量をウェスタンブロッティングによって評価し、硫酸デキストラン（０～２００μｇ／ｍＬ）による治療でＬＤＬＲの最大で３倍の上方調節を伴うＬＤＬＲの濃度依存的増加を示した。ペントサン（０～２００μｇ／ｍＬ）インキュベーションは、５０μｇ／ｍＬからの濃度で４倍のＬＤＬＲ増加をもたらした。

例１７：肝ＬＤＬＲ量に対するペントサンの効果。
ポリ硫酸ペントサンを、ヒトＰＣＳＫ９を発現するマウスに注射して、ＰＣＳＫ９誘発性分解に対してＬＤＬＲを保護する本物質の能力を評価する。

これらの試験は、ペントサンの投与がインビボでＬＤＬＲ量の増加をもたらすことを確証する。

例１８：血清コレステロール量に対するペントサンの効果。
増加した血清コレステロールを有する患者をポリ硫酸ペントサンの経口または皮下注射によって治療して、血清コレステロールを低下させる本物質の能力を評価する。ポリ硫酸ペントサンは、製造業者による経口用量の摂取後２時間の中央値で消化管から吸収される。コレステロール量を次いで測定する。

これらの試験は、ペントサンが血清コレステロール量の低下をもたらすことを確証する。

例１９：イノヘップ画分のＰＣＳＫ９阻害効果。
イノヘップ（低分子量ヘパリン）は５０００～８０００Ｄａのサイズ範囲のヘパリンフラグメントを含み、ＰＣＳＫ９活性の強力な阻害剤である。ＰＣＳＫ９阻害フラグメントをさらに同定するため、イノヘップをサイズ排除クロマトグラフィーにより分画した（図１８Ａ）。得られた画分を、ＰＣＳＫ９を阻害し細胞のＬＤＬＲ量を増加するそれらの能力についてＨｅｐＧ２細胞をベースとしたアッセイで試験した（図１８Ｂ）。このアッセイでは、多くの画分がサッカライド濃度２０μＭとの一昼夜インキュベーション後にＬＤＬＲ量を増加する（２～５倍）ことが認められた。最も高いＬＤＬＲ量はサイズ除外画分Ｈ６で得られ、これを続いて強アニオン交換（ＳＡＸ）クロマトグラフィーに供した（図１９Ａ）。ＨｅｐＧ２細胞を得られたＳＡＸ画分（５００ｎＭ）とインキュベーションし、ＬＤＬＲ量を評価した（図１９Ｂ）。ＳＡＸ画分Ｉ１、Ｉ８、およびＩ９はＰＣＳＫ９阻害活性を有するヘパリン画分を含み、試験した濃度（５００ｎＭ）でＬＤＬＲ量を最大で２倍増加する。

例２０：化合物（Ｘ）はビアコアアッセイにおいてヘパリンへのＰＣＳＫ９の結合を阻害する。
アルブミン（シグマ、Ａ４５０３）またはヘパリン－アルブミン（シグマ、Ｈ０４０３）のいずれかと結合されたセンサーチップを用いるビアコア分析を使用して、ＰＣＳＫ９とヘパリンの間の相互作用を評価した。分析は、ＰＣＳＫ９が７００ｐＭの親和定数でヘパリン－アルブミンに結合し（図２０Ａ）、アルブミンと結合されたコントロールセンサーチップへの結合は認められない（図２０Ｂ）ことを示した。ビアコア分析を用いる干渉アッセイを実施して化合物（Ｘ）とＰＣＳＫ９の間の結合を評価した。１００ｎＭのＰＣＳＫ９溶液を増加する濃度（０ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭおよび１０μＭ）の化合物（Ｘ）とインキュベーションし、溶液をついでヘパリン－アルブミンと結合されたセンサーチップに注入した。結合曲線は、化合物（Ｘ）が５０ｎＭの推定ＩＣ５０でヘパリン－アルブミンセンサーチップへのＰＣＳＫ９の結合を阻害することを示した（図２０Ｃ）。

例２１：化合物（Ｘ）はヘパリン－セファロースビーズへのＰＣＳＫ９の結合を阻害する。
ヘパリン／硫酸ヘパランへのＰＣＳＫ９の結合の化合物（Ｘ）阻害をヘパリン－セファロース結合アッセイで試験した。ヘパリン－セファロースビーズ（２μＬ）を、１５０μＬの１０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４の全容量中で増加する濃度（０～５００μｇ／ｍＬ）の化合物（Ｘ）を加えてＰＣＳＫ９（１μｇ／ｍＬ）とインキュベーションした。４℃で一昼夜回転後に、ビーズをペレット化し上清中の非沈殿化ＰＣＳＫ９（遊離ＰＣＳＫ９）の濃度をＥＬＩＳＡによって評価した。各サンプル中の遊離ＰＣＳＫ９の濃度を、ヘパリン－セファロースビーズ無添加サンプル中のＰＣＳＫ９（添加コントロール）に対して基準化した。陽性コントロールとして、可溶性ヘパリン（５ｍｇ／ｍＬ）を含むサンプルを含めた（図１６Ａ）。化合物（Ｘ）（５００～２００μｇ／ｍＬ）は本アッセイにおいて、ヘパリン－セファロースとのＰＣＳＫ９の相互作用を完全に阻害した。比較として、可溶性ヘパリンの添加は５０％阻害をもたらした。これらの結果は、化合物（Ｘ）がインビトロでヘパリンへのＰＣＳＫ９の結合を効率的に阻害することを示す。

例２２：化合物（Ｘ）はインビトロでＰＣＳＫ９に対してＬＤＬＲを保護する。
化合物（Ｘ）（０～２００μｇ／ｍＬ）と２４時間インキュベーションされたＨｅｐＧ２細胞は、細胞溶解物のウェスタンブロッティングにより評価しデンシトメトリーにより定量したときに、濃度依存的に増加するＬＤＬＲ量を示した（図１６Ｂ）。コントロール細胞を添加剤無添加（陰性コントロール）または５００μｇ／ｍＬヘパリン添加（陽性コントロール）とインキュベーションした。ＬＤＬＲ量を添加剤無添加でインキュベーションされたＨｅｐＧ２細胞の溶解物中で認められる量に対して計算した。化合物（Ｘ）インキュベーションは、最大で１２倍高いＬＤＬＲ量をもたらした。比較のため、ヘパリン（５００μｇ／ｍＬ）とインキュベーションされた細胞は、約３倍高いＬＤＬＲを示した。

これらの実験は、化合物（Ｘ）がＨｅｐＧ２細胞中でＰＣＳＫ９誘発性分解に対してＬＤＬＲを保護することを示す。

例２３：化合物（Ｘ）はインビボでＬＤＬＲのＰＣＳＫ９誘発性分解を阻害する。
マウス（ＢＡＬＢ６／ｃＪＲｊ）にＰＣＳＫ９（１０μｇ）を注射する６０分前に、３．２μｇ化合物（Ｘ）の単回静脈内（尾静脈）投与を実施した。肝ＬＤＬＲのＰＣＳＫ９誘発性分解をＰＣＳＫ９注射の６０分後にウェスタンブロッティングによって評価し、デンシトメトリーによって定量した（図１６Ｃ）。コントロールマウスは、ＮａＣｌまたは市販のＰＣＳＫ９阻害モノクローナル抗体（Ａｍｇｅｎ）であるコントロール阻害剤エボロクマブ（２００μｇ）を注射された。ＬＤＬＲ量をＮａＣｌのみ注射されたマウスでのＬＤＬＲ量に対して算出した。ＬＤＬＲ量は阻害剤の前注射なしにＰＣＳＫ９を注射されたマウスで５０％低下し、一方、化合物（Ｘ）（０．１３ｍｇ／ｋｇ）またはエボロクマブ（８ｍｇ／ｋｇ）を注射されたマウスで低下は認められなかった。これらの試験は、ＰＣＳＫ９注射前の化合物（Ｘ）の投与が、非常に低い投与量でエボロクマブと同様に効率よくＬＤＬＲを保護することを示す。

例２４：ＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬ－コレステロール排除に対する化合物（Ｘ）の効果。
９６ウェルに接種したＨｅｐＧ２細胞を化合物（Ｘ）（２００μｇ／ｍＬ）と一昼夜インキュベーションする。翌日にＤｉＩ蛍光色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識されたＬＤＬ粒子（５μｇ／ｍＬ）を加え、３７℃で４時間インキュベーションする。ＰＢＳによる細胞の洗浄後に、ＬＤＬ粒子の細胞取り込みを励起／放出５５２／５７３ｎｍで評価する。－８０℃での一昼夜インキュベーション後に、ウェルあたりの細胞数をＣｙＱｕａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量する。
これらの試験は、ＰＣＳＫ９活性の化合物（Ｘ）阻害が、インビトロでＬＤＬコレステロールの取り込みを増加することを確証する。

例２５：ヒトにおける血清ＬＤＬ－コレステロール量に対する化合物（Ｘ）の効果。
増加した血清ＬＤＬ－コレステロール量を有する患者を化合物（Ｘ）（適量）の週１回静脈内注射によって６週間治療して、ＬＤＬ－コレステロール低下治療としての化合物（Ｘ）の能力を評価する。ＬＤＬ－コレステロール（ＨＰＬＣ）を、治療前および治療期間中に週１回サンプリングされる血液で測定する。
これらの試験は、化合物（Ｘ）が高コレステロール血症を有するヒトで血清ＬＤＬ－コレステロールを低下することを確証する。

例２６：硫酸化ヘキサマーおよび１８マーヘパリンはインビトロでＰＣＳＫ９機能を阻害する。
ＨｅｐＧ２細胞を、ジサッカライドあたり平均１．３の硫酸を含む不均一に硫酸化されたヘキサマーまたは１８マーのオリゴサッカライドの０～２００μｇ／ｍＬとインキュベーションした。一昼夜インキュベーション後に、細胞を収集し細胞のＬＤＬＲ量をウェスタンブロッティングにより分析し（図１７Ａ）デンシトメトリーにより定量した（図１７Ｂ）。これらのヘパリンのいずれかとインキュベーションされた細胞は、試験した最高濃度（２００μｇ／ｍＬ）でコントロールと比べて６～８倍増加した細胞ＬＤＬＲ量を示す。さらに、ヘキサマーは１０μｇ／ｍＬの低い濃度で強力なＰＣＳＫ９阻害効果を有する。

例２７：スクロースオクタ硫酸はヘパリン－セファロースビーズへのＰＣＳＫ９の結合を阻害する。
ヘパリン／硫酸ヘパランへのＰＣＳＫ９の結合のスクロースオクタ硫酸（図２１Ａ）阻害を、ヘパリン－セファロース結合アッセイで試験した。ヘパリン－セファロースビーズ（２μＬ）を、１５０μＬの１０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４の全容量中でＰＣＳＫ９（１μｇ／ｍＬ）および増加する濃度（０～５００μｇ／ｍＬ）のスクロースオクタ硫酸とインキュベーションした。４℃で一昼夜回転後に、ビーズをペレット化し上清中の非沈殿化ＰＣＳＫ９（遊離ＰＣＳＫ９）の濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。遊離ＰＣＳＫ９のパーセントは、ヘパリン－セファロースビーズ無添加のサンプル中のＰＣＳＫ９濃度（添加コントロール）に対して計算した（図２１Ｂ）。５００～２５０μｇ／ｍＬ濃度でスクロースオクタ硫酸は、本アッセイにおいてヘパリン－セファロースならびに５ｍｇ／ｍＬ可溶性ヘパリン（陽性コントロール）によるＰＣＳＫ９沈殿を阻害した。これらの結果は、スクロースオクタ硫酸がインビトロでヘパリンへのＰＣＳＫ９の結合を効率的に阻害することを示す。

配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：ＰＣＳＫ９タンパク質－ＮＣＢＩ登録番号：ＮＧ＿００９０６１．１
ＭＧＴＶＳＳＲＲＳＷＷＰＬＰＬＬＬＬＬＬＬＬＬＧＰＡＧＡＲＡＱＥＤＥＤＧＤＹＥＥＬＶＬＡＬＲＳＥＥＤＧＬＡＥＡＰＥＨＧＴＴＡＴＦＨＲＣＡＫＤＰＷＲＬＰＧＴＹＶＶＶＬＫＥＥＴＨＬＳＱＳＥＲＴＡＲＲＬＱＡＱＡＡＲＲＧＹＬＴＫＩＬＨＶＦＨＧＬＬＰＧＦＬＶＫＭＳＧＤＬＬＥＬＡＬＫＬＰＨＶＤＹＩＥＥＤＳＳＶＦＡＱＳＩＰＷＮＬＥＲＩＴＰＰＲＹＲＡＤＥＹＱＰＰＤＧＧＳＬＶＥＶＹＬＬＤＴＳＩＱＳＤＨＲＥＩＥＧＲＶＭＶＴＤＦＥＮＶＰＥＥＤＧＴＲＦＨＲＱＡＳＫＣＤＳＨＧＴＨＬＡＧＶＶＳＧＲＤＡＧＶＡＫＧＡＳＭＲＳＬＲＶＬＮＣＱＧＫＧＴＶＳＧＴＬＩＧＬＥＦＩＲＫＳＱＬＶＱＰＶＧＰＬＶＶＬＬＰＬＡＧＧＹＳＲＶＬＮＡＡＣＱＲＬＡＲＡＧＶＶＬＶＴＡＡＧＮＦＲＤＤＡＣＬＹＳＰＡＳＡＰＥＶＩＴＶＧＡＴＮＡＱＤＱＰＶＴＬＧＴＬＧＴＮＦＧＲＣＶＤＬＦＡＰＧＥＤＩＩＧＡＳＳＤＣＳＴＣＦＶＳＱＳＧＴＳＱＡＡＡＨＶＡＧＩＡＡＭＭＬＳＡＥＰＥＬＴＬＡＥＬＲＱＲＬＩＨＦＳＡＫＤＶＩＮＥＡＷＦＰＥＤＱＲＶＬＴＰＮＬＶＡＡＬＰＰＳＴＨＧＡＧＷＱＬＦＣＲＴＶＷＳＡＨＳＧＰＴＲＭＡＴＡＶＡＲＣＡＰＤＥＥＬＬＳＣＳＳＦＳＲＳＧＫＲＲＧＥＲＭＥＡＱＧＧＫＬＶＣＲＡＨＮＡＦＧＧＥＧＶＹＡＩＡＲＣＣＬＬＰＱＡＮＣＳＶＨＴＡＰＰＡＥＡＳＭＧＴＲＶＨＣＨＱＱＧＨＶＬＴＧＣＳＳＨＷＥＶＥＤＬＧＴＨＫＰＰＶＬＲＰＲＧＱＰＮＱＣＶＧＨＲＥＡＳＩＨＡＳＣＣＨＡＰＧＬＥＣＫＶＫＥＨＧＩＰＡＰＱＥＱＶＴＶＡＣＥＥＧＷＴＬＴＧＣＳＡＬＰＧＴＳＨＶＬＧＡＹＡＶＤＮＴＣＶＶＲＳＲＤＶＳＴＴＧＳＴＳＥＧＡＶＴＡＶＡＩＣＣＲＳＲＨＬＡＱＡＳＱＥＬＱ＊

参考
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Ｍｕｎｃｋ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ（１９９９）ＥＭＢＯ Ｊ １８（３）：５９５－６０４．
ＭｃＣｏｙ，Ａ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｂｅｔａ－ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ’ｓ ｈｅｐａｒｉｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００３．３２６（３）：ｐ．８２３－３３．
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Ｐｉｐｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００７）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２００７．１５（５）：ｐ．５４５－５２．
Ｒｅｉｔｅｒ Ｙ，Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｕ， ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１５）：１８３２７－３１．
Ｓｅｉｄａｈ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．２０１４ Ｍａｒ １４；１１４（６）：１０２２－３６．ｄｏｉ：１０．１１６１／ＣＩＲＣＲＥＳＡＨＡ．１１４．３０１６２１
Ｓｈｅｒｉｄａｎ（２０１３）．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３ Ｄｅｃ；３１（１２）：１０５７－８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ１２１３－１０５７．
Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３，９９５－１０００（２００６）．
Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎａｔ Ｍｅｄ １：１１１９－１１２１．
Ｖｉｌｌｉｅｒｓ ＢＲ，Ｓｔｅｉｎ Ｖ，Ｈｏｌｌｆｅｌｄｅｒ Ｆ．（２０１０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２３（１）：１－８．
Ｗａｌｌｅｙ Ｋ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ．２０１６ Ｏｃｔ；２２（５）：４６４－９
Ｗａｒｄ ＥＳ，Ｇｕｓｓｏｗ Ｄ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ＡＤ，Ｊｏｎｅｓ ＰＴ，Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６．
Ｗｏｚｎｉａｋ－Ｋｎｏｐｐ Ｇ，Ｓｔａｄｌｍａｎｎ Ｊ，Ｒｕｋｅｒ Ｆ（２０１２） ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（１）：ｅ３００８３．
Ｙａｂｕｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６８（２５）：１８８１８－２３．
Ｘｕ ａｎｄ Ｅｓｋｏ（２０１４）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１４；８３：１２９－５７

Claims (15)

1. 被験体におけるリポタンパク質代謝の障害の治療での使用のための
   式（Ｉ）：
   

   

   の一般構造を有する化合物、またはその医薬的に許容可能な塩、溶媒和物、多型、もしくは互変異性体を含む組成物であって、
   ここで、
   －Ｒ^１は
   ａ）式（ＸＩ）：
   

   

   または
   ｂ）式（ＩＩ）：
   

   

   （ここでＸはＳＯ_２であり、ｍは独立して１以上の整数である）、
   から選択される式を有する基を含み、
   －各Ｒ^２は独立して－ＯＳＯ_３ ^－、および－ＮＨＳＯ_３ ^－からなる群から選択され、
   －各Ｒ^３は独立して－ＯＳＯ_３ ^－、および－ＯＨからなる群から選択され、
   －各Ｒ^４は独立して－ＯＳＯ_３ ^－、および－ＯＨからなる群から選択され、
   －各Ｒ^５は独立して－ＣＨ_２ＯＳＯ_３ ^－、および－ＣＯＯ^－からなる群から選択され、
   －ｎは３～１０の整数であり、
   ここで前記リポタンパク質代謝の障害は糖尿病、肥満、メタボリック症候群、黄色腫、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、脂質異常症、高トリグリセリド血症、高脂血症、シトステロール血症、高血圧、狭心症、急性冠状動脈症候群、冠状動脈性心臓病、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、血管炎症および敗血症からなる群から選択される、
   組成物。
2. Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４が－ＯＳＯ_３ ^－であり、Ｒ^５が－ＣＨ_２ＯＳＯ_３ ^－である、請求項１に記載の使用のための組成物。
3. 前記化合物が一般構造式（ＸＩＩ）：
   

   

   を有し、ここでＲ^１０が－Ｏ－Ｒ^１であり、かつｎが２～９の整数である、請求項１または請求項２に記載の使用のための組成物。
4. 前記化合物が一般構造式（ＸＸＶＩ）：
   

   

   を有し、ここでｑが１～８の整数であり、Ｒ^９は－ＳＯ_３ ^－であり、かつ
   Ｒ^１０は－Ｏ－Ｒ^１である、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
5. 前記化合物が一般構造式（ＸＩＶ）：
   

   

   を有し、ここでＲ^１０が－Ｏ－Ｒ^１である、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
6. 前記化合物が一般構造（ＩＩＩ）：
   

   

   を有し、ここで、
   －Ｒ^１は
   ａ）式（ＸＩ）：
   

   

   または
   ｂ）式（ＩＩ）：
   

   

   （ここでＸはＳＯ_２であり、ｍは独立して１以上の整数である）、
   から選択される式を有する基を含み、
   －Ｒ^２は－ＯＳＯ_３ ^－であり、
   －Ｒ^３は独立して－ＯＳＯ_３ ^－、および－ＯＨからなる群から選択され、
   －Ｒ^５は独立して－ＣＨ_２ＯＳＯ_３ ^－、および－ＣＯＯ^－からなる群から選択され、
   －各Ｒ^４は独立して－ＯＳＯ_３ ^－、および－ＯＨからなる群から選択され、
   －Ｒ^６は独立して－ＯＳＯ_３ ^－、および－ＮＨＳＯ^３－からなる群から選択され、
   －Ｒ^７は独立して－ＯＳＯ_３ ^－、および－ＯＨからなる群から選択され、
   －Ｒ^８は独立して－ＣＨ_２ＯＳＯ_３ ^－であり、
   －ｎは２～５の整数である、
   請求項１に記載の使用のための組成物。
7. 前記化合物が一般構造（ＩＶ）：
   

   

   を有する、請求項１または請求項６に記載の使用のための組成物。
8. 前記化合物が一般構造（Ｖ）：
   

   

   を有する、請求項１または請求項６に記載の使用のための組成物。
9. 前記化合物が一般構造（ＶＩＩ）：
   

   

   を有する、または
   前記化合物が一般構造（ＶＩＩＩ）：
   

   

   を有する、請求項１または請求項６～８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
10. Ｒ^１が式（ＸＶＩＩ）：
    

    

    の基を含む、または前記基からなる、請求項１に記載の使用のための組成物。
11. 前記化合物が
    （１）．式（Ｘ）の化合物である、
    

    

    （２）．以下式のヘパリンＩである、または
    

    

    （３）．以下式のヘパリンＶＩＩである、
    

    

    請求項１に記載の使用のための組成物。
12. 前記化合物が、前記式ＸＸＶＩの化合物であって、かつｑは２でありかつＲ^１０は－Ｏ－式（ＸＶＩＩ）である、請求項４に記載の使用のための組成物。
13. 前記化合物が、前記式ＸＸＶＩの化合物であって、かつｑは１でありかつＲ^１０は－Ｏ－式（ＸＶＩＩ）である、請求項１０に記載の使用のための組成物。
14. 前記化合物が前記化合物に共役体化された、胆汁酸のアルブミン結合部分をさらに含む、または前記化合物が以下の式の樹状構造に末端アミノ基（R）を介して共有結合する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
    

    
15. 前記化合物がＰＣＳＫ９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のＲ９３、Ｒ９６、Ｒ９７、Ｒ１０４、Ｒ１０５、Ｋ１３６、Ｈ１３９、Ｒ１６５およびＲ１６７からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸に結合する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

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