JP6928742B2

JP6928742B2 - 分枝鎖状ポリエーテル骨格上の蛍光色素の多量体化に基づく明るい蛍光色素

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Publication number: JP6928742B2
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Inventors: ドーゼクリスティアン
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Filing date: 2016-05-27
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Description

背景
本発明は、向上した輝度を有する蛍光色素及びその使用方法に関する。

抗体にコンジュゲートされた蛍光色素は、一般に、免疫蛍光分析に使用されている。抗体、蛍光色素、フローサイトメーター、フローソーター及び蛍光顕微鏡の大多数の変形は、過去２０年間で、標的細胞の特異的な検出及び単離を可能にするために開発されてきた。免疫蛍光技術における問題の１つは、例えば、より良い検出器、フィルタシステム又は修飾蛍光色素によって強化され得る、蛍光放射の検出閾値である。

従来の小分子蛍光色素分子の制限は、それらの制限された輝度にある。従って、生体分子は、典型的には、蛍光色素コンジュゲートの輝度を高めるために、複数の色素分子で標識される。前述の蛍光色素分子、例えば、ローダミン又はシアニンの殆どが、平面芳香族発色団を含有し、これらは、低蛍光で又は蛍光なしで色素−色素二量体につながる疎水性相互作用を起こしやすい。その結果、標識された生体分子の蛍光強度は、当該生体分子の蛍光色素標識の程度に比例しない。より高い標識度（ＤＯＬ）では、単一色素の蛍光強度は、二量体、三量体又は多量体の形成によって引き起こされる自己消光機構のために更に減少する可能性がある。

これらの望ましくない形成は、水溶性を増加させる平坦な芳香族色素分子に置換基を追加することによって、ある程度まで低減された。文献に記載された適切な置換基は、色素分子に電荷を付与する可能性があり、これは、例えば、米国特許第５，２６８，４８６号及び同第６，９７７，３０５号、同第６，１３０，１０１号及びPanchuk-Voloshinaら、J. Histochem. Cytochem. 47(9), 1179 (1999年)に記載されたスルホン酸基、又は例えば、ＷＯ２０１３０５６７２０号に記載されたリン酸基などである。他の適切な二量体化還元置換基は、嵩高い水溶性ポリマー、例えば、特許出願ＷＯ２００９０７８９７０号に記載されたポリエチレングリコール、又は米国特許第６，９１３，７４３号及び同第７，６５５，２１７号に記載された荷電デンドリマーである。これらの置換色素の生体分子コンジュゲートは、非置換親色素のコンジュゲートよりも高い標識度（ＤＯＬ）でより高い輝度を達成するが、まだ、非置換親色素に関してより高いＤＯＬでも、蛍光強度と標識生体分子の標識度との間に線形比例からのずれが存在する。

コンジュゲートの輝度は、また、生体分子の活性を失うことなく機能化し得る、生体分子上で利用可能な官能化部位の数によって制限される。結果として、生体分子コンジュゲートのＤＯＬはまだ制限されており、例えば、抗体（ＩｇＧ）について、それらは、典型的には、親水性標識の場合で４〜８の範囲である（R. P. Haugland, Current Protocols in Cell Biology (2000年) 16.5.1〜16.5.22）。結果として、これらのコンジュゲートの輝度は、まだ、例えば、フィコエリトリン（ＰＥ）又はアロフィコシアニン（ＡＰＣ）などのフィコビリタンパク質のコンジュゲートよりも劣っている。

フィコビリタンパク質とその生体分子コンジュゲートの高い蛍光強度は、フィコビリタンパク質内の複数の蛍光体サブユニットの存在に起因する。Ｒ−フィコエリトリンは、例えば、３４個のフィコビリン蛍光体サブユニットを含有する（A. N. Glazer, J. Appl. Phycol. 6, 105 （１９９４年））。従って、ＰＥ又はＡＰＣなどのフィコビリタンパク質の生体分子コンジュゲートは、非生理的な溶媒、温度、及びｐＨ値に対する限定された安定性、並びにそれらの限定された光安定性及びそれらの一般的に制限された貯蔵寿命などのそれらのタンパク質の性質に由来する欠点にもかかわらず、例えば、フローサイトメトリーにおいてよく知られている。別の欠点は、単一の蛍光アッセイ内での多重化機能を制限する異なる色の入手可能性が制限されていることである。

励起蛍光体の自己消光を防止する精密な超分子構造中に蛍光団を配置することにより、フィコビリタンパク質のような蛍光特性を有する多発色団構造を構築しようとする試みがなされてきた。Benvinら、J. Am. Chem. Soc. 129(7), 2025 （２００７年）は、超分子ＤＮＡテンプレートにインターカレートされた蛍光色素について記載している。しかしながら、この方法の欠点は、ＤＮＡ骨格内での蛍光体の非共有結合である。ＤＮＡ骨格のうち色素分子の移行は、蛍光信号の損失につながり得る。多色実験の場合、異なって標識されたＤＮＡ骨格間での色素交換は偽陽性の蛍光シグナルにつながる可能性がある。複数の色を利用するマルチパラメータ実験の場合、共有結合した蛍光体を使用することが望ましい。

生体分子標識用の明るい蛍光色素の別のクラスは、例えば、米国特許第８，１５８，４４４号、同第８，３５４，２３９号、及び同第８，８０２，４５０号及び同第８，３６２，１９３号、同第８，４５５，６１３号、及び同第８，５７５，３０３号に記載されたポリフルオレンなどの、半導体ポリマーに基づく蛍光ポリマーである。これらのポリマーは、複数の蛍光体サブユニットも含んでおり、ポリマー内の有効共役長は９〜１０モノマーサブユニットに限定されている。

水溶性骨格における従来の蛍光色素分子の多量体化によるより明るい蛍光色素の製造は、これまでに、生体分子の標識にとって有用な化合物をもたらしていない。例えば、デキストランの蛍光標識に関する推奨は、３０００ＭＷ範囲のデキストラン当たり０．３〜０．７色素分子、１０，０００ＭＷ範囲で０．５〜２色素分子、４０，０００ＭＷ範囲で２〜４色素分子及び７０，０００ＭＷ範囲で３〜６色素分子である。それらの大きなサイズと嵩高さのために、これらの色素多量体は、生体分子の標識に利益を提供せず、また、フィコビリタンパク質様の蛍光強度を有する生体分子コンジュゲートを製造するには不適切である。より高い標識度で蛍光標識されたデキストランは、色素−色素相互作用のために消光を示す。これは、米国特許第５，７１９，０３１号での使用を見出し、その際、デキストラン蛍光色素コンジュゲートの標識度は、蛍光消光を供給するのに十分に高い。デキストラン蛍光色素コンジュゲートの酵素分解は、酵素消化過程の定量化のために使用される蛍光発光シグナルの増強を伴う。

フィコビリタンパク質と蛍光ポリマーを制限せずにフィコビリタンパク質様の蛍光強度をもたらす、生体分子を標識するための改良された蛍光色素に対するかなりの必要性が依然として残っている。

概要
従って、本発明の課題は、高い蛍光強度、低い非特異的バックグラウンド染色及び固定化に対する安定性を有する蛍光色素標識を提供することであった。

驚くべきことに、マルチアームポリエチレングリコールなどの分枝鎖状ポリエーテル骨格（scaffold）上で多量体化した蛍光色素が、顕著な消光なしで高度に蛍光性であることが判明した。また、ポリエーテル骨格は、蛍光色素の非特異的に結合する傾向を減少させると思われる。

一態様では、本発明は、光安定性と、温度、ｐＨ、及び溶媒などの異なる環境条件に対する安定性とに関して、蛍光色素標識の特性を調整することが可能である。本発明の別の態様では、広い範囲の異なる励起及び発光波長が提供される。本発明の別の態様では、生体分子蛍光色素コンジュゲート中に存在する蛍光体サブユニットの数が多いにも関わらず、生体分子活性の保持がもたらされる。

本発明では、活性又は増加した非特異的結合の損失なしに、高程度の蛍光体標識を生体分子に導入することが可能である。例えば、抗体の場合、１０を上回る、好ましくは１５以上の蛍光体ＤＯＬが達成され、その結果、フィコビリタンパク質コンジュゲート様の蛍光強度と低い非特異的バックグラウンド染色とを有する抗体蛍光色素コンジュゲートがもたらされる。

従って、本発明の対象は、一般式Ｉ：

（式中、
Ｃは、２０〜２００個の原子を含むコア部分であり；
Ｓは、１〜１０個の炭素原子を含む同一又は異なるエーテル残基であり；
ｎは、２〜５００の範囲の整数であり；
ｍは、０〜５００の範囲の整数であり；
ｘは、２〜５０の範囲の整数であり；
ｙは、１〜５０の範囲の整数であり；
Ｒは、生体分子との共有結合を形成可能な反応性基を含む同一又は異なる残基であり；
Ｆは、（Ｓ）_ｎに共有結合した同一又は異なる蛍光体である）
による蛍光色素である。

コア部分Ｃは、ポリエーテル残基（Ｓ）_ｎ及び（Ｓ）_ｍのための複数（ｘ＋ｙ）個の結合点を提供する。Ｒは、抗原のような細胞構造を認識する生体分子と共有結合を形成可能な反応性基を含む。

様々な例示的な詳細を、ここで、以下の図を参照して説明する：

図１ａ〜１ｅは、以下のものとコンジュゲートしたＣＤ４抗体（クローンＶｉｔ４）で染色された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の、フローサイトメトリーによって測定されたドットプロットの比較を示す：図１ａフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）；図１ｂ分枝状ＰＥＧで多量体化されたフルオレセイン（ＰＥＧ−ＦＡＭ）；図１ｃアレクサフルオロ４８８（ＡＦ４８８）；図１ｄ分枝状ＰＥＧで多量体化されたアレクサフルオロ４８８（ＰＥＧ−ＡＦ４８８）、又は（１ｅ）Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）。図２は、ＦＩＴＣ、分枝鎖状ＰＥＧ上で多量体化されたフルオレセイン（ＰＥＧ−ＦＡＭ）、アレクサフルオロ４８８（ＡＦ４８８）、分枝鎖状ＰＥＧ上で多量体化されたアレクサフルオロ４８８（ＰＥＧ−ＡＦ４８８）又はＰＥとコンジュゲートしたＣＤ４抗体（クローンＶｉｔ４）で染色した５つの異なるドナーのＴヘルパー細胞（ＣＤ４強陽性）の、フローサイトメトリーによって測定された中央値蛍光強度（ＭＦＩ）及び染色指数（ＳＩ）を示す。図３は、従来のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）にコンジュゲートされたヒトＣＤ４に対する抗体（クローンＶｉｔ４）による染色と比較して、ＣＤ４に対する前記抗体にコンジュゲートされた８分枝状ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＦＡＭ）上で多量体化されたフルオレセインに関するＴヘルパー細胞の染色における増加しているＤＯＬの効果を示す。抗体染色濃度は、全ての場合において３μｇ／ｍｌである。図４ａは、ＣＤ４−ＰＥＧ−ＦＡＭ染色された非固定化及びメタノール固定化Ｔヘルパー細胞のヒストグラムプロットを示し；図４ｂは、ＣＤ４−ＰＥ染色された非固定化及びメタノール固定化Ｔヘルパー細胞を示す。

全ての図において、ＰＥＧサブユニットを有する蛍光色素は、本発明によるものである。

詳細な説明
本発明による蛍光色素は、当業者に公知であり且つ本特許出願の実施例に更に開示されているような標準的な化学物質によって製造することができる。

例として、本発明による好ましい蛍光色素を、以下の一般式ＩＩ及びＩＩＩに示す：

式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）において、Ｚは、Ｆ及びＲのうち少なくとも１つであり、ｐは、ｎ及びｍのうち少なくとも１つである（それぞれのポリエーテル枝がＦ又はＲに結合するかどうかに依存するが、但し、少なくとも２つのＦ及び少なくとも１つの基Ｒが含まれることを条件とする）。Ｆ、Ｒ、ｎ及びｍは既に開示されているような意味を有する。

蛍光体Ｆ
本発明で使用される蛍光体Ｆは、ポリエーテル骨格を介してコア部分Ｃに結合（coupled）され、また、如何なる有機蛍光色素分子であってよい。典型的には、かかる蛍光体は、有機色素レーザーにおけるレーザー色素としての使用を見出されている。生体分子にコンジュゲートされ得る置換されたバージョンは、フローサイトメトリー及び蛍光顕微鏡における標識としての使用が見出されている。

好ましくは、蛍光体Ｆは、キサンテン色素、ローダミン色素、クマリン色素、シアニン色素、ピレン色素、オキサジン色素、ピリジルオキサゾール色素及びピロメテン色素からなる群から選択される。

本発明の変形例では、蛍光体Ｆはスルホン酸基、ホスホン酸基、リン酸基、ポリエーテル基、スルホンアミド基及び炭酸基からなる群から選択される１つ以上の水溶性付与置換基で置換されている。サーモフィッシャーサイエンティフィック社によって提供されるアレクサフルオロファミリーの色素などのスルホン酸置換基を有する蛍光色素を使用することが特に有利である。蛍光体当たりのスルホン酸置換度は、即ち、ローダミン色素又はシアニン色素の場合、２以上であり得る。非スルホン化色素と比べたスルホン化色素の使用は、図２に見られるようなポリエーテル骨格上に多量体化された蛍光体の更に明るいコンジュゲートをもたらす：分枝状ＰＥＧ上で多量体化されたアレクサフルオロ４８８（ＰＥＧ−ＡＦ４８８）のＣＤ４コンジュゲートで染色されたＴヘルパー細胞は、分枝状ＰＥＧ上で多量体化されたフルオレセイン（ＰＥＧ−ＦＡＭ）のＣＤ４コンジュゲートで染色されたＴヘルパー細胞（平均ＭＦＩ５５）のほぼ２倍明るい（平均ＭＦＩ９８）。

蛍光体Ｆは、当該技術分野で公知の方法によって、即ち、アミノ末端基を有する分枝鎖状ポリエーテル骨格を有するアミノ基又はチオール基に対して反応性の基を有する蛍光色素を反応させることによって、ポリエーテル骨格に結合させることができる。

コア部分Ｃ
コア部分Ｃは、ｘ＋ｙ個のポリエーテル残基（Ｓ）_ｎ及び（Ｓ）_ｍの結合を可能にする、１〜１００個の炭素原子を含む任意の構造であってよい。

本発明にとって有用なコア部分は、ポリヒドロキシ化合物、ポリアミノ化合物及びポリチオ化合物である。好ましいのは、ポリヒドロキシ化合物、例えば、エーテル結合を介する３〜４個のポリエーテル残基のための結合点として４つのヒドロキシル基を有するペンタエリスリトール、エーテル結合を介する３〜６個のポリエーテル枝のための結合点として６つのヒドロキシル基を有するジペンタエリスリトール、エーテル結合を介する３〜８個のポリエーテル枝のための結合点として８つのヒドロキシル基を有するトリペンタエリスリトール又はヘキサグリセロールである。

ポリエーテル残基Ｓ
ポリエーテル残基（Ｓ）_ｎ及び（Ｓ）_ｍは、モノマーサブユニットＳ当たり１〜１０個、好ましくは１〜４個の酸素原子をそれぞれ有し得るエーテルモノマー単位Ｓからなる。これらのポリエーテル枝は、ホモポリマー又はコポリマー、即ち、交互又はブロックコポリマーであり得る。ポリエーテル残基（Ｓ）_ｎ及び（Ｓ）_ｍは、特に、２つ以上の酸素原子を有するモノマー単位Ｓが使用される場合、直鎖状又は分枝鎖状であってよい。本発明の好ましい実施態様では、ポリエーテル残基は、ポリエチレングリコール鎖を含む、即ち、Ｓは残基ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−を表し、ｎ、ｍは独立して１０〜２００の範囲の整数である。

本発明の特に有用な実施態様では、市販のマルチアームポリエチレングリコール（分枝状ＰＥＧ）は、コア部分及びポリエーテル枝を含む骨格として働く。マルチアームポリエチレングリコールは、例えば、Nanocs Inc.又はＮＯＦ社によって市販されている。

反応性基Ｒ
本発明による蛍光色素は、反応性基を含む基Ｒを介して生体分子に結合される。基Ｒは、アミノ基及びチオール基のような官能基を用いて、生体分子の反応性基を介して共有結合を形成することができるものとする。Ｒ又は（Ｓ）_ｍ／（Ｓ）_ｎのいずれかは、それぞれの他の基と共有結合を形成し得るサブユニットを含む。例えば、ポリエーテル基（Ｓ）_ｍ／（Ｓ）_ｎは、例えば、カルボキシ官能基を含むＲ基と反応し得るアミノ末端基と一緒に市販されている。当業者であれば、適切な化学物質を選択するのは困難ではない。かかる反応性基を含むＲの例は、例えば、活性エステル、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、テトラフルオロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、スルホジクロロフェニルエステル、イミドエステル、イソチオシアネート、イソシアネート、ハロゲン化スルホニル、ハロゲン化アシル、アシルアジド、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、アルデヒド、グリオキサール、マレイミド、ヨードアセトアミド、ヒドラジン、アジドニトロフェニル、ホスホルアミダイト、アルキン、アルキルアジド、ジエン又はアリル基である。

共有結合の形成は、適切な反応性基を有する反応性基質と反応可能な官能基である反応性基Ｒを介しても可能である。カップリング反応に適した官能基は、例えば、アミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、又はカルボキシル基から構成され得る。

なお、蛍光体同士がくっつかないようにして、色素−色素相互作用を防止するために、低反応性の更なる反応性基Ｒ’をポリエーテル枝に使用することも考えられる。これらの低反応性基Ｒ’は水素原子、アルキル基、トリフルオロアルキル基、アリール基、ハロゲン基、スルホニル基、スルホン酸基、ホスホン酸基、スルホンアミド基、又はこれらの組み合わせであってよい。上記反応性基Ｒの少なくとも１つは、本発明による蛍光色素の性能にとって必要である。

蛍光生体分子コンジュゲート
本発明の別の対象は、それぞれ天然又は組換えによる、免疫グロブリン、抗体、断片化抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、ジ−ｓｃＦｖからなる群から選択される少なくとも１つの生体分子に対して基Ｒを介してコンジュゲートされた既に開示されているような１つ以上の蛍光色素を含む蛍光生体分子コンジュゲートである。

本発明の生体分子コンジュゲートは、生体分子と蛍光色素の反応性基Ｒとの反応によってか、又は活性化された生体分子と蛍光色素の適切な官能基Ｒとの反応によって製造される。

本発明の蛍光色素とのコンジュゲートに適した生体分子は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、核酸、脂質、及びこれらの組み合わせであってよい。これらの生体分子は、分析物、細胞表面マーカー、抗原などを標識、検出及び定量するために、前記分析物、細胞表面マーカー、抗原などの結合パートナーと結合することができる。

断片化された抗体は、これらの種類の分子を含む共有結合及び非共有結合コンジュゲートを含む組換え手法によって合成され得る。

本発明の一実施態様では、生体分子は、ペプチド／ＭＨＣ複合体、細胞接着又は共刺激分子用の受容体、受容体リガンド、抗原、ハプテン結合剤、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、アプタマー、プライマー及びリガーゼ基質からなる群から選択される。好ましくは、受容体は、例えば、細胞接着又は共刺激分子用の部分であり、ハプテン結合剤は、アビジン、ストレプトアビジン又はニュートラビジンである。核酸は、例えば、アプタマー、プライマー、又はリガーゼ用の基質であってよい。

蛍光体標識された分枝鎖状ポリエーテル骨格で標識されたビオチン結合剤、例えば、アビジン、ストレプトアビジン又はニュートラビジンは、ビオチン化された一次検出分子の更に倍増した多重ビオチン化の効果により、前記一次検出分子を介して高感度の検出を可能にする。

本発明の一実施態様では、生体分子は、それぞれ４〜６個の蛍光体基を有する２〜７個の蛍光ポリエーテル標識を有するＩｇＧ抗体であり、その結果、抗体分子当たり８〜４０個の色素分子の蛍光体ＤＯＬ、好ましくは１０を上回る蛍光体単位の蛍光体ＤＯＬ、最も好ましくは１５以上の蛍光体単位のＤＯＬが得られる。

本発明の更に別の実施態様では、生体分子コンジュゲートは１つ以上の蛍光色素を含み、その際、少なくとも１つの生体分子は、包括的に、それぞれ１〜１０個の蛍光体Ｆを含む２〜２０個の蛍光色素とコンジュゲートされている。２つ以上の蛍光色素が生体分子コンジュゲートに存在することが好ましい。

産業上の利用可能性
本発明の生体分子コンジュゲート及び／又は蛍光色素は、特に、生体分子コンジュゲートにより認識される特定のセットの抗原を利用する細胞の検出、計数又は分離に有用である。

従って、本発明の別の対象は、フローサイトメトリーによる及び／又は蛍光顕微鏡による、本発明による蛍光生体分子コンジュゲートによって標識された細胞又は組織の分析方法である。結果的に、本方法は、上記のような蛍光生体分子コンジュゲートで標識すること、及びフローサイトメトリー及び蛍光顕微鏡のうち少なくとも１つを実行することを含み得る。

本発明の別の実施態様では、標識された細胞の１つ以上の集団が試料から検出され、標的細胞として分離される。好ましくはコンジュゲートにより検出された細胞は、静電気力、圧電力、機械的分離又は光音響手段により試料から分離される。このような分離に適しているのは、特に、フローソーターであり、例えば、ＥＰ１４１８７２１５．０号又はＥＰ１４１８７２１４．３号に開示されているような、ＦＡＣＳ又はＭＥＭＳベースのセルソーターシステムである。

本発明の別の実施態様では、細胞又は組織試料における生体分子コンジュゲートの結合標的の位置が蛍光顕微鏡によって決定される。蛍光顕微鏡の適切な方法としては、落射蛍光顕微鏡、共焦点レーザー走査型顕微鏡、多光子顕微鏡、全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡、単一平面照明顕微鏡（ＳＰＩＭ）及び超解像顕微鏡法、例えば、発光枯渇刺激（ＳＴＥＤ）顕微鏡、確率的光学再構成顕微鏡（ＳＴＯＲＭ）、光活性化局在性顕微鏡（ＰＡＬＭ）、又は鉛直型空間変調照明（ＳＭＩ）顕微鏡が挙げられる。

実施例
実施例１
工程Ａ：８アームＰＥＧ上で多量体化されたＡＦ４８８（ＰＥＧ−ＡＦ４８８）の調製
アミノＰＥＧ（８アーム）を、１０ｍｇ／ｍＬの濃度でｐＨ７の０．５ＭのＰＢＳ緩衝液に溶解させた。ＤＭＳＯ（２ｍｇ／ｍＬ）に溶解したＡＦ４８８、ＮＨＳエステルを、２０倍のモル過剰で添加し、暗所で３０分間室温でインキュベートした。遊離色素を、標準的な条件下でＳＥＣにより除去した。生じたＰＥＧ−ＡＦ４８８は、５．７のＤＯＬを有していた。

ＰＥＧ−ＦＡＭは、ＮＨＳ−フルオレセイン（ＮＨＳ−ＦＡＭ）を使用して同様の手順によって得られる。

工程Ｂ：ＣＤ４抗体とＰＥＧ−ＡＦ４８８とのカップリング
工程Ａで得られたＰＥＧ−ＡＦ４８８（リン酸緩衝生理食塩水中で２．５ｍｇ／ｍＬ）を、１０倍モル過剰のＳＭＣＣを加えて、室温で１時間インキュベートすることにより活性化した。平行して、ＣＤ４抗体（クローンＶｉｔ４）を、１０ミリモル／Ｌジチオスレイトールと１時間反応させることによって還元した。マレイミド活性化ＰＥＧ−ＡＦ４８８及び還元された抗体の両方に、セファデックスＧ２５上で２ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水との緩衝液交換を行った。マレイミド活性化ＰＥＧ−ＡＦ４８８を添加して、１５倍過剰で抗体を還元し、暗所にて室温で１時間インキュベートした。反応生成物をＳＥＣにより精製する。得られたＣＤ４−ＰＥＧ−ＡＦ４８８は、１３．２のＤＯＬを有していた。

ＣＤ４を、同じプロトコルを使用してＰＥＧ−ＦＡＭに結合させる。

工程Ｃ：８アームＰＥＧ上で多量化した蛍光色素にコンジュゲートされたＣＤ４抗体によるＰＢＭＣの染色
染色実験のために、１０^６個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、それぞれ、２ｍＭのＥＤＴＡ及び０．５％のＢＳＡを含有する１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁する。細胞を、３μｇ／ｍＬで、工程Ｂで得られたそれぞれのＣＤ４抗体コンジュゲートを用いて染色し、室温で１０分間インキュベートする。対比染色を、死細胞の排除のためにＣＤ３−ＡＰＣ及びヨウ化プロピジウムを用いて行う。

Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）又は非多量体化蛍光色素ＦＩＴＣ又はＡＦ４８８とコンジュゲートされた市販のＣＤ４抗体を、比較のために使用する。

細胞を、暗所にて室温で１０分間インキュベートする。洗浄を、２ｍＭのＥＤＴＡ及び０．５％ＢＳＡを含有する１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水中で遠心分離し、再懸濁することにより行う。染色した細胞をＭＡＣＳＱｕａｎｔ１０アナライザで分析する。図１は、以下を使用する側方散乱（ＳＳＣ）に対する蛍光強度のドットプロットの例を示す：図１ａフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）；図１ｂ分枝状ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＦＡＭ）で多量体化されたフルオレセイン；図１ｃアレクサフルオロ４８８（ＡＦ４８８）；図１ｄ分枝状ＰＥＧ（ＰＥＧ−ＡＦ４８８）で多量体化されたアレクサフルオロ４８８、又は（１ｅ）フローサイトメトリーによって測定されたＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）。

図２は、５人のドナーのＰＢＭＣに関する中央値蛍光強度（ＭＦＩ）と染色指数（ＳＩ）の結果を示す。

本発明による蛍光色素で標識された抗体で染色された細胞は、親蛍光色素で標識された抗体で染色された細胞の少なくとも２倍明るく、フィコビリタンパク質標識抗体（ＣＤ４−ＰＥ）で標識された細胞と同等である。図３は、従来のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）にコンジュゲートされているヒトＣＤ４（クローンＶｉｔ４）に対する抗体を用いた染色と比較して、前記抗体にコンジュゲートされた８分岐ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＦＡＭ）上で多量体化されたフルオレセインのＴヘルパー細胞の染における増加したＤＯＬの効果を示す。抗体染色濃度は全ての場合において３μｇ／ｍＬである。

これは、特に、蛍光色素もＡＦ４８８（アレクサフルオロ）としてスルホン化されている場合に有利である。８アームＰＥＧ（ＰＥＧ−ＡＦ４８８）上で多量体化されたＡＦ４８８で標識された得られた抗体コンジュゲートは、８アームＰＥＧ上で多量体化されたフルオレセインから作られた対応するコンジュゲートの約２倍明るい。

実施例２：メタノール固定化の染色強度への影響
末梢血単核細胞を、対比染色としてヨウ化プロピジウムを除き、実施例１に記載されているように染色する。メタノール固定化のために、１ｍＬのメタノールを１００μＬ
の細胞懸濁液に添加し、氷上で３０分間インキュベートする。細胞を２回洗浄し、２ｍＭのＥＤＴＡ及び０．５％のＢＳＡを含有する１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁する。染色して固定化した細胞を、非固定化細胞と比較してＭＡＣＳＱｕａｎｔ１０アナライザで分析する。図４ａ及び４ｂは、ＣＤ４−ＰＥＧ−ＦＡＭ染色した非固定化及びメタノール固定化Ｔヘルパー細胞（図４ａ）と、ＣＤ４−ＰＥ染色した非固定化及びメタノール固定化Ｔヘルパー細胞（図４ｂ）とのヒストグラムプロットを示す。ＣＤ４−ＰＥＧ−ＦＡＭの蛍光強度は、メタノール固定化に対して安定であり、一方、ＣＤ４−ＰＥの蛍光強度は、５倍の減少を示す。

従って、本発明の蛍光生体分子コンジュゲート及び／又は蛍光色素は、固定化などの環境の影響に対して改善された安定性を示す。

様々な詳細を、上記に概説された例示的な実施、様々な代替、修正、変形、改良、及び／又は実質的な同等物に関連して説明してきたが、公知であるか又は現在予期されていない又は予期されない可能性があるか否かは、前述の開示を検討する際に明らかになり得る。従って、上記の例示的な実施は、限定ではなく例示することが意図されている。

Claims

一般式Ｉ：

（式中、
Ｃは、２０〜２００個の原子を含むコア部分であり；
Ｓは、１〜１０個の炭素原子を含む同一又は異なるエーテル残基であり；
ｎは、２〜５００の範囲の整数であり；
ｍは、０〜５００の範囲の整数であり；
ｘは、２〜５０の範囲の整数であり；
ｙは、１〜５０の範囲の整数であり；
Ｒは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、テトラフルオロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、スルホジクロロフェニルエステル、イミドエステル、イソチオシアネート、イソシアネート、ハロゲン化スルホニル、ハロゲン化アシル、アシルアジド、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、アルデヒド、グリオキサール、マレイミド、ヨードアセトアミド、ヒドラジン、アジドニトロフェニル、ホスホルアミダイト、アルキン、アルキルアジド、ジエン又はアリル基からなる群から選択される反応性基を含む同一又は異なる残基であり；
Ｆは、キサンテン色素、ローダミン色素、クマリン色素、シアニン色素、ピレン色素、オキサジン色素、ピリジルオキサゾール色素及びピロメテン色素からなる群から選択される同一又は異なる蛍光体である）
による蛍光色素であって、Ｃ、Ｓ、ｎ、ｍ、ｘ及びｙは、一般式Ｉと同じものから選択され、
一般式（ＩＩ）

で示され、
その式中、Ｚ＝Ｆ又はＲであり、且つｐ＝ｎ又はｍであり、
一般式（ＩＩ）が少なくとも２つのＦ及び少なくとも１つの基Ｒを含むことを条件とする構造を特徴とする、前記蛍光色素。
一般式Ｉ：

（式中、
Ｃは、２０〜２００個の原子を含むコア部分であり；
Ｓは、１〜１０個の炭素原子を含む同一又は異なるエーテル残基であり；
ｎは、２〜５００の範囲の整数であり；
ｍは、０〜５００の範囲の整数であり；
ｘは、２〜５０の範囲の整数であり；
ｙは、１〜５０の範囲の整数であり；
Ｒは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、テトラフルオロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、スルホジクロロフェニルエステル、イミドエステル、イソチオシアネート、イソシアネート、ハロゲン化スルホニル、ハロゲン化アシル、アシルアジド、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、アルデヒド、グリオキサール、マレイミド、ヨードアセトアミド、ヒドラジン、アジドニトロフェニル、ホスホルアミダイト、アルキン、アルキルアジド、ジエン又はアリル基からなる群から選択される反応性基を含む同一又は異なる残基であり；
Ｆは、キサンテン色素、ローダミン色素、クマリン色素、シアニン色素、ピレン色素、オキサジン色素、ピリジルオキサゾール色素及びピロメテン色素からなる群から選択される同一又は異なる蛍光体である）
による蛍光色素であって、Ｃ、Ｓ、ｎ、ｍ、ｘ及びｙは、一般式Ｉと同じものから選択され、
一般式（ＩＩＩ）

で示され、
その式中、Ｚ＝Ｆ又はＲであり、且つｐ＝ｎ又はｍであり、
一般式（ＩＩＩ）が少なくとも２つのＦ及び少なくとも１つの基Ｒを含むことを条件とする構造を特徴とする、前記蛍光色素。
蛍光体Ｆがスルホン酸基、ホスホン酸基、リン酸基、スルホンアミド基、ポリエーテル基及び炭酸基からなる群から選択される１つ以上の水溶性付与置換基で置換される、請求項１又は２に記載の蛍光色素。
それぞれ天然又は組換え由来の、免疫グロブリン、抗体、断片化抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、ジ−ｓｃＦｖからなる群から選択される少なくとも１つの生体分子に基Ｒを介してコンジュゲートされた請求項１から３までのいずれか１項に記載の１つ以上の蛍光色素を含む、蛍光生体分子コンジュゲート。
ペプチド／ＭＨＣ複合体、細胞接着又は共刺激分子用の受容体、受容体リガンド、抗原、ハプテン結合剤、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、アプタマー、プライマー及びリガーゼ基質からなる群から選択される少なくとも１つの生体分子に基Ｒを介してコンジュゲートされた請求項１から３までのいずれか１項に記載の１つ以上の蛍光色素を含む、蛍光生体分子コンジュゲート。
少なくとも１つの生体分子が、それぞれ１〜１０個の蛍光体Ｆを含む請求項１から３までのいずれか１項に記載の蛍光体色素２〜２０個とコンジュゲートされている、請求項４又は５に記載の蛍光生体分子コンジュゲート。
フローサイトメトリー及び／又は蛍光顕微鏡によって請求項４から６までのいずれか１項に記載の蛍光生体分子コンジュゲートによって標識された細胞又は組織の分析方法。