JP6925777B2

JP6925777B2 - 検体管理方法

Info

Publication number: JP6925777B2
Application number: JP2015248250A
Authority: JP
Inventors: 達也大草
Original assignee: Techno Science Co Ltd
Current assignee: Techno Science Co Ltd
Priority date: 2015-12-21
Filing date: 2015-12-21
Publication date: 2021-08-25
Anticipated expiration: 2035-12-21
Also published as: JP2017112841A

Description

本発明は、ＤＮＡ、蛋白質、又は代謝物などの網羅的解析、すなわちオミクス解析における検体管理方法に関する。本発明によれば、特に遺伝子解析などにおいて、解析対象の検体の取り違えを防止することができる。

２００３年に人類が最初に３０億の全ゲノム配列の解読を成し遂げて（非特許文献１）以来、「次世代ＤＮＡシーケンサー」の進歩は著しい。現在では、１週間で全ゲノム配列の解析が可能である。また、全ゲノム配列のうちエクソンと呼ばれる配列であれば、１日で解析が可能である。エクソンは、全ゲノムの約２％に相当する約６千万の配列からなる。全エクソン配列は、約２万個の蛋白質の情報を持ち、がんなどの疾患の原因となる遺伝子変化の多くが存在する。これらの遺伝子変化を検出することによって、患者毎に最適の治療が行うことが可能であり、いわゆる個別化医療が、すでに医療分野で進展しつつある。

更に、遺伝子（ゲノミクス）以外にも、ＲＮＡ解析（トランスクリプトミクス）、蛋白質解析（プロテオミクス）、又は代謝物解析（メタボロミクス）などの網羅的解析（オミクス検査）が開発されており、革新的な診断・治療技術が臨床現場に応用されつつある。

「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」（英国）２００４年、第４３１巻、ｐ．９３１−９４５

前記オミクス検査を行うための解析機器の目覚ましい性能向上の一方で、臨床現場においては、試料をゲノムシーケンサーにセットするまでの前処理工程（例えば、手術で切除した組織からの遺伝子、タンパク質、又は代謝物等の抽出）は手作業であり、定まった機器、及び手順もなかった。臨床現場において、患者検体の取り違えはあってはならないことである。特に、医療に関する場合は、検体の取り違えは、病気の診断の誤り、治療の選択の誤りにつながるため、深刻な健康被害を及ぼす可能性がある。特に、遺伝子解析では、生涯変わることのない固有の情報を扱うことから、可能な限り取り違え防止の手段を講じる必要がある。現在は、バーコードを用いた検体管理を行っているが、検体の採取、保存、解析などの多くの工程において、前後の同一性を担保するやり方では限界があった。すなわち、これらのオミクス検査の技術が、広く臨床施設に普及するためには、検体の取り違え防止を含めた検査における品質の担保が重要となっている。
従って、本発明の目的は、患者検体の取り違えを防止する検体管理方法を提供することである。

本発明者は、患者検体の取り違えを防止する検体管理方法について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、解析対象以外の遺伝子、タンパク質、アミノ酸、糖類、又は脂質を解析検体に添加し、それらを検体の確認のためのマーカーとすることによって、検体の取り違えを防止できることを見出した。すなわち、採取された検体に、解析対象以外の情報を有する物質、例えば解析する遺伝子に存在しない塩基配列を有する遺伝子、解析するタンパク質に存在しないアミノ酸配列を有するタンパク質、解析するタンパク質に存在しないアミノ酸、解析する糖類に存在しない糖類、解析する脂質に存在しない脂質を加え、それらの配列等を検体のマーキングに用いることによって、取り違えを防止することができることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］（１）解析対象以外の遺伝子、タンパク質、アミノ酸、糖類、及び脂質からなる群から選択されるマーカーを解析される検体に添加する工程、を含むことを特徴とする、検体管理方法、
［２］更に、（２）前記検体、並びに前記遺伝子の情報、タンパク質の情報、アミノ酸の情報、糖類の情報、及び脂質の情報からなる群から選択されるマーカーの情報を解析する工程、及び（３）前記マーカー情報が検出されることを確認する工程、を含む、［１］の検体管理方法、
［３］前記マーカー情報が識別子に変換され、検体容器に前記マーカー情報に対応する識別子が貼付されている、［１］又は［２］の検体管理方法、
［４］前記遺伝子情報が、塩基配列、メチル化、脱メチル化、構造変化及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、前記タンパク質情報が、アミノ酸配列、糖鎖、メチル化、脱メチル化、アセチル化、脱アセチル化、リン酸化、脱リン酸化、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２又は３に記載の検体管理方法、
［５］前記識別子が、バーコード又は２次元バーコード（ＱＲコード（登録商標））である、［３］又は［４］の検体管理方法、
［６］前記解析が、ゲノムシークエンス、質量解析、又は核磁気共鳴解析である、［１］〜［５］のいずれかの検体管理方法、
［７］解析対象以外の遺伝子、タンパク質、アミノ酸、糖類、及び脂質からなる群から選択されるマーカー、並びに前記遺伝子の情報、タンパク質の情報、アミノ酸の情報、糖類の情報、及び脂質の情報からなる群から選択されるマーカーの情報を変換した識別子を含む、検体管理用キット、
［８］前記遺伝子情報が、塩基配列、メチル化、脱メチル化、構造変化、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、前記タンパク質情報が、アミノ酸配列、糖鎖、メチル化、脱メチル化、アセチル化、脱アセチル化、リン酸化、脱リン酸化、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、［７］の検体管理用キット、
［９］前記識別子が、バーコード又は２次元バーコードである、［７］又は［８］の検体管理用キット、及び
［１０］前記解析が、ゲノムシークエンス、質量解析、又は核磁気共鳴解析である、［７］〜［９］のいずれかの検体管理用キット、
に関する。

本発明の検体管理方法又は検体管理用キットによれば、オミクス解析に供する検体の取り違えを、シンプルな方法によって効果的に防止することができる。また、本発明によれば、検体に加えたマーカーの情報（例えば遺伝子配列又はアミノ酸配列）を検体の情報解析と同時に読み取り、検体の容器に貼付した識別子（例えば、バーコード）と照合することで、検体の取り違えが容易に検出可能となり、間違えのない解析結果を臨床現場に返却することができる。すなわち、本発明はシンプルで画期的な検体管理方法である。

実施例１で作製した解析する検体に添加する遺伝子を含む薄層フィルム（Ａ）、及び前記薄層フィルム及びバーコードを含む検体管理用キット（Ｂ）を示した写真である。本発明の検体管理方法に用いることのできるバーコードリーダーを開閉扉部分に装着したゲノムシークエンサーを示した図である。添加した遺伝子を含む検体をゲノムシーケンサーで解析した結果を示す図である。

［１］検体管理方法
本発明の検体管理方法は、解析対象以外の遺伝子、タンパク質、アミノ酸、糖類、及び脂質からなる群から選択されるマーカーを解析される検体に添加する工程を含む。更に、本発明の検体管理方法は、（２）前記検体、並びに前記遺伝子の情報、タンパク質の情報、アミノ酸の情報、糖類の情報、及び脂質の情報からなる群から選択されるマーカーの情報を解析する工程、及び（３）前記マーカー情報が検出されることを確認する工程、を含むことができる。

《添加工程（１）》
本発明における添加工程（１）においては、解析対象以外の遺伝子又はタンパク質などのマーカーを解析される検体に添加するが、具体的には遺伝子又はタンパク質などのマーカーを解析される検体に添加する態様に加えて、逆に遺伝子又はタンパク質などのマーカーに解析される検体を加える態様を含む。

（解析対象以外のマーカー）
解析対象以外のマーカーは、検査において解析される対象でなければ、特に限定されるものではない。例えば、遺伝子マーカー及びタンパク質マーカーにおいて、塩基配列又はアミノ酸配列を解析する場合、それらの配列は、ほぼ自由に設計することができ、患者個人ごとに割り当てることが可能である。採取した際に割り当てた配列が解析結果に出現すれば取り違えがなかったことを担保できる。
また、遺伝子のエクソンの塩基配列を解析する場合は、イントロンの遺伝子を用いることも可能である。すなわち、解析される検体に、添加する遺伝子等が含まれていても、その遺伝子等が解析対象でなければ、「解析対象以外の遺伝子」として用いることができる。
また、アミノ酸、糖類、又は脂質をマーカーとして用いる場合、代謝物に含まれていないアミノ酸、糖類、又は脂質であれば、特に限定されるものではない。すなわち、アミノ酸、糖類、又は脂質は、代謝物を解析する場合のマーカーとして用いることが好ましい。

例えば、添加する遺伝子は、特に限定されるものではなく、天然の遺伝子、又は合成遺伝子を挙げることができるが、塩基配列などを自由に設計できることから、合成遺伝子が好ましい。遺伝子の長さも特に限定されるものではないが、好ましくは50塩基〜1,000塩基であり、より好ましくは100塩基〜300塩基である。例えば、天然の遺伝子を用いる場合は、適当な長さに切断して用いることが好ましい。
本明細書において「遺伝子」とは、比較的鎖長の短い、所謂オリゴマヌクレオチドなどを含むものである。遺伝子の種類としては、例えばＤＮＡ又はＲＮＡを含む。

例えば、添加するタンパク質は、特に限定されるものではなく、天然のタンパク質、又は合成タンパク質を挙げることができるが、アミノ酸配列などを自由に設計できることから、合成タンパク質が好ましい。タンパク質の長さも特に限定されるものではないが、好ましくは10残基〜50残基であり、より好ましくは10残基〜20残基である。例えば、天然のタンパク質を用いる場合は、適当な長さに切断して用いることが好ましい。
本明細書において「タンパク質」とは、比較的鎖長の短い、所謂ペプチド、又はオリゴペプチドなどを含むものである。

添加する遺伝子又はタンパク質などのマーカーは、限定されるものではないが、解析に影響を与えない形状で添加することが好ましい。具体的には、水溶液、ゲル状、粒子状、顆粒状、錠剤、又はフィルム状などの形態で添加することができる。

（識別子）
前記遺伝子の情報又はタンパク質などのマーカーの情報は、限定されるものではないが、好ましくは識別子に変換される。変換された識別子を用いることにより、簡便に且つ間違いなく、検体の管理を行うことができる。

識別子としては、本分野で知られているものを制限なく使用することが可能であるが、例えばバーコード、又は２次元バーコードを挙げることができる。これらの識別子をラベルとして、検体の含まれている容器に添付することが好ましい。このラベルのバーコード又は２次元バーコードなどをバーコードリーダー又は２次元バーコードリーダーなどで読み込み、解析結果に含まれる遺伝子の情報又はタンパク質などのマーカーの情報と比較することによって、検体の取り違えなどがないか確認することができる。すなわち、解析結果が出力された際に、自動的にラベル情報と解析結果が一致するかを自動的にソフトウェアが判断することができる。

遺伝子の情報としては、限定されるものではないが、塩基配列、メチル化、脱メチル化、構造変化又はそれらの組み合わせを挙げることができる。また、タンパク質の情報も、特に限定されるものではないが、アミノ酸配列、糖鎖、メチル化、脱メチル化、アセチル化、脱アセチル化、リン酸化、脱リン酸化、又はそれらの組み合わせをあげることができる。本発明においては、これらの情報を識別子に変換して、マーカーとして用いることができる。

《解析工程（２）》
本発明の解析工程（２）においては、検体、並びに前記遺伝子の情報、タンパク質の情報、アミノ酸の情報、糖類の情報、及び脂質の情報からなる群から選択されるマーカーの情報を解析する。すなわち、検体と、マーカーの混合物において、それぞれの情報を解析する。

（抽出工程）
検体の情報（例えば、塩基配列、又はアミノ酸配列）を解析するために、前記混合物は、核酸、蛋白質、又は代謝物などを抽出する工程を行うことが好ましい。抽出方法は、それぞれの抽出する対象物、解析する情報などに応じて、適宜選択することができるが、通常、抽出工程は複数の工程からなる。一方で、加えた遺伝子の固有の遺伝子配列情報、又はタンパク質のアミノ酸配列情報、アミノ酸、糖類、又は脂質などの情報を、例えばバーコード化したラベルを作成する。このラベルを、各工程で使用する組織検体、中間抽出物、最終精製抽出物を入れる容器に貼付することが好ましい。

（解析方法）
本発明に用いる検体の解析方法は、特に限定されないが、例えば塩基配列解析（例えば、ゲノムシークエンス）、アミノ酸配列解析、質量解析、又は核磁気共鳴解析を挙げることができる。
例えば、塩基配列解析の場合、前記抽出工程で抽出された検体の核酸及び添加された遺伝子の塩基配列を、公知の方法によって解析することができる。

《確認工程（３）》
本発明の確認工程（３）においては、前記遺伝子情報、タンパク質情報、アミノ酸情報、糖類情報、又は脂質情報が、解析結果において検出されることを確認する。
例えば、添加された遺伝子の情報（例えば、塩基配列）が、前記解析工程（２）でその塩基配列が検出されたか否かを確認する。同じ塩基配列が検出されれば、検体が同じであると判断される。ここで、添加された遺伝子の塩基配列が検出されず、検体には含まれるはずのない塩基配列が検出されれば、検体の取り違えが起こった可能性が高いと判断される。

この場合、検体が含まれている容器に添付された塩基配列の情報である識別子と比較することにより、容易に検体の確認ができる。具体的には、貼付された容器に貼付したラベルは、バーコードリーダーを用いて読み取り、各工程間の容器の同一性の確認、及び記録に用いる。最終工程において、全エクソン解析を例にすると、ゲノムシーケンサーなどの解析機器により、読み取られた配列の中に、最初に組織検体に加えた固有の配列も含まれる。その塩基配列とバーコードラベルで読み取られた一連の情報が一致した場合、一連の工程での取り違えがなかったことが担保できる。蛋白質、代謝物など他のオミクス解析においても同様の手法が適用することができる。

［１］検体管理用キット
本発明の検体管理用キットは、解析対象以外の遺伝子、タンパク質、アミノ酸、糖類、及び脂質からなる群から選択されるマーカー、並びに前記遺伝子の情報、タンパク質の情報、アミノ酸の情報、糖類の情報、及び脂質の情報からなる群から選択されるマーカーの情報を変換した識別子を含む。
本発明の検体管理用キットに用いる「解析対象以外の遺伝子、タンパク質、アミノ酸、糖類、及び脂質からなる群から選択されるマーカー」、「伝子の情報、タンパク質の情報、アミノ酸の情報、糖類の情報、及び脂質の情報からなる群から選択されるマーカーの情報」及び「識別子」は、前記「［１］検体管理方法」に記載のものを用いることができる。

前記解析対象以外の遺伝子又はタンパク質などのマーカーは、解析に影響を与えない形状、例えば水溶液、ゲル状、粒子状、顆粒状、錠剤、又はフィルム状などの形態で、検体管理用キットに含むことができる。また、識別子は、例えばバーコード又は２次元バーコードとして、検体管理用キットに含むことができる。

具体的な検体管理用キットの態様としては、図１Ｂに示したように、バーコードリーダーラベルと遺伝子を含むフィルムを同梱したブリスターパックの形態で提供することができる。更に、遺伝子を含む溶液を含むチューブ及びそのチューブにバーコードリーダーラベルを添付した形態で提供してもよい。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
本例では、遺伝子解析、特に全エクソン解析について記述するが、本発明は、遺伝子に限定されるものではなく、蛋白質、代謝物などの生体物質であればすべてに適用可能である。

《実施例１》
本実施例では、遺伝子として、合成遺伝子フラグメントをフィルムの形態で含むキットを作製した。
（イ）合成遺伝子フラグメントの設計とフィルムの作製
以下の配列をもつ遺伝子フラグメント３種類を設計した。これらの配列は、いずれもエクソン配列には存在しないイントロンと呼ばれる配列（１７番染色体に存在するＴＰ５３遺伝子のイントロン部分）を参照して設計した。すなわち、全エクソン配列の解析結果には含まれないユニークな配列である。

ＫＡＤＡＩ−１：
CCACTAAATCCCCAAGACTTCCTAAATGTGCACCCTATTCCCAACTCCCTTCCTGTATTTTTTTTTTTTTTTTGAGATGGAGTCTCTCTCTGTCACCTAGGCTGGAGCACAGTGGCATGATCTCAGCTCACTGCAACCTCTACCTTCCGGGTTCAAGCCATTCTCCTGCCTCAGTCTCCCGAGTAGCTGGGATTACA

前記の配列を得るために、２つのプライマーを合成した。
ＫＡＤＡＩ−１ｓ：CCACTAAATCCCCAAGAC
ＫＡＤＡＩ−１aｓ：TGTAATCCCAGCTACTCG
前記２つのプライマーを用いて、ヒトＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により、前記の「ＫＡＤＡＩ−１」の遺伝子を得た。

上記遺伝子フラグメントを加えたコラーゲン溶液（３ｍｇ／ｍＬ、ＣｅｌｌｍａｔｒｉｘＴｙｐｅＩ−Ａ：新田ゼラチン社製）を平板なシャーレ上に添加し、濃アンモニア雰囲気下、ゲル化させ、その後、５６℃で乾燥させ、薄層フィルムを作製した（図１Ａ）。得られたフラグメントを含む薄層フィルム及びフラグメントの遺伝子配列情報を持つバーコードリーダーラベルとを同梱したブリスターパック（検体管理用キット）を作製した（図１Ｂ）。

《実施例２》
本実施例では、実施例１で得られたブリスターパックを用いて、本発明の検体管理方法を実施した。
本発明の検体管理方法に用いるゲノムシークエンサーを作製した。具体的には、サンプルの取り違え防止のために、検体識別用のバーコード認識機能をゲノムシーケンサーに組み込んだ。検体の採取の際にフィルムとして加えた遺伝子配列情報を、いくつかの工程を経て最終的にゲノムシーケンサーに読み込み照合させるために、チップと呼ばれる部分に、配列情報を持つバーコードとして貼付した。チップを収納するゲノムシーケンサーの開閉扉部分にバーコードリーダーを装着することで、他のチップとの読み間違えなどの防止を図ることができる。

図２に示すように、ゲノムシーケンサーの開閉扉部分にバーコードリーダーを装着した。なお、扉はバーコードリーダー取り付け用に作製したものである。装着されたバーコードリーダーによって、バーコードの読み取り機能を確認した。

ヒト細胞からＤＮＡを調製する前に、前記ブリスターパックの薄層フィルムを加えた。ヒト細胞を専用採取器具で採取し、保存容器、前処理装置、及び改造ゲノムシーケンサーを用い、ゲノムのシークエンスを行った。

具体的には、ヒト細胞からのＱＩＡａｍｐＤＮＡＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いＤＮＡを抽出した。ゲノムシーケンスは、ライフテクノロジーズ社のＩｏｎＡｍｐｌｉＳｅｑ^TM ＥｘｏｍｅＫｉｔを用いた。

改造ゲノムシーケンサーのバーコードで読み込んだ情報と同じＣＣＡＣＴＡＡＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＣＴＴという配列が、解析結果に存在することが示された（図３Ａ及びＢの四角で囲んだ部分）。

《比較例１》
本比較例では、前記ブリスターパックを用いずに、ゲノムシークエンスを行った。
ブリスターパックを用いなかったことを除いては、実施例２の操作を繰り返した。ＣＣＡＣＴＡＡＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＣＴＴの塩基配列は、解析結果に検出されなかった（図３Ｂ）本発明の検体管理方法により、検体の取り違え防止が可能であることが示された。

《実施例３》
本実施例では、ＰＵＣ−Ｔ遺伝子を用いて、キットの作製及び検体管理方法を実施した。ＫＡＤＡＩ−１遺伝子に代えて、以下の合成オリゴから作製したｐＵＣ１８ベクター由来のＰＵＣ−Ｔ遺伝子を用いたことを除いては、実施例１及び２の操作を繰り返した。改造ゲノムシーケンサーのバーコードで読み込んだ情報と同じＰＵＣ−Ｔ遺伝子に特徴的な塩基配列が、解析結果に存在することを確認した。
ＰＵＣ−Ｔ配列：5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACTTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCATACCGACTGCCCATAGAG

《実施例４》
本実施例では、ＰＵＣ−Ｇ遺伝子を用いて、キットの作製及び検体管理方法を実施した。ＫＡＤＡＩ−１遺伝子に代えて、以下の合成オリゴから作製したｐＵＣ１８ベクター由来のＰＵＣ−Ｇ遺伝子を用いたことを除いては、実施例１及び２の操作を繰り返した。改造ゲノムシーケンサーのバーコードで読み込んだ情報と同じＰＵＣ−Ｇ遺伝子に特徴的な塩基配列が、解析結果に存在することを確認した。
ＰＵＣ−Ｇ配列：5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACGTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCATACCGACTGCCCATAGAGAGG

《実施例５》
本実施例では、ＰＵＣ−Ａ遺伝子を用いて、キットの作製及び検体管理方法を実施した。ＫＡＤＡＩ−１遺伝子に代えて、以下の合成オリゴから作製したｐＵＣ１８ベクター由来のＰＵＣ−Ａ遺伝子を用いたことを除いては、実施例１及び２の操作を繰り返した。改造ゲノムシーケンサーのバーコードで読み込んだ情報と同じＰＵＣ−Ａ遺伝子に特徴的な塩基配列が、解析結果に存在することを確認した。
ＰＵＣ−Ａ配列：5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACATGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCATACCGACTGCCCATAGAGAGG

本発明の検体管理方法及び検体管理用キットは、遺伝子（ゲノミクス）、ＲＮＡ解析（トランスクリプトミクス）、蛋白質解析（プロテオミクス）、又は代謝物解析（メタボロミクス）などのオミクス解析において、検体の取り違え防止のための検体管理に効果的に用いることができる。

Claims

（１）解析対象以外の遺伝子マーカーを解析される検体に添加する工程、
（２）前記検体、並びに前記遺伝子の情報を次世代全ゲノムシークエンス又は次世代全エクソンゲノムシークエンスにより解析する工程、及び
（３）前記マーカー情報が検出されることを確認する工程、
を含み、前記マーカー情報が識別子に変換され、検体容器に前記マーカー情報に対応する識別子が貼付されていることを特徴とする、ゲノムシークエンスの検体管理方法。
前記識別子が、バーコード又は２次元バーコードである、請求項１に記載のゲノムシークエンスの検体管理方法。
解析対象以外の遺伝子マーカー、並びに前記遺伝子の情報を変換した識別子を含む、次世代全ゲノムシークエンス又は次世代全エクソンゲノムシークエンスの検体管理用キット。
前記識別子が、バーコード又は２次元バーコードである、請求項３に記載の次世代全ゲノムシークエンス又は次世代全エクソンゲノムシークエンスの検体管理用キット。