JP6920334B2 - 偏光に基づく蛍光核酸検出 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１６年３月２５日に出願された米国仮出願第６２／３１３，４２７号の優先権を主張する。

技術分野
本開示は、偏光に基づく蛍光核酸検出に関する。

生物学的サンプルは、核酸の特定の配列（例えば、核酸の特定の配列を有するリボ核酸分子）の存在および有病率について頻繁に検査されている。場合によっては、核酸の特定の配列の存在および有病率は、特定の生物学的または病原性プロセス、特定の疾患の進行、または対象の他の何らかの生物学的状態に関する洞察を提供することができる。

発明の概要
一態様では、サンプルにおいて標的核酸分子を検出する方法は、サンプルを反応液とインキュベートするステップを含む。反応液は、複数のＤＮＡポリメラーゼ分子、複数の検出器核酸分子、および複数のレポーター分子を含む。各検出器核酸分子は、標的核酸分子の第２の核酸配列に相補的な第１の核酸配列、およびＤＮＡポリメラーゼ分子に特異的に結合するアプタマーを含む。各レポーター分子は、第３の核酸配列、レポーター分子の第３の核酸配列に結合したプライマー分子、およびレポーター分子の第３の核酸配列に結合したフルオロフォアを含む。複数の検出器核酸分子の各検出器核酸分子は、１つ以上の対応する標的核酸分子とハイブリダイズするように構成される。各ハイブリダイズした検出器核酸分子は、ＤＮＡポリメラーゼ分子が不活性化されるように、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ分子に結合するように構成される。この方法はまた、励起光をサンプルに向けてフルオロフォアによる蛍光を誘導するステップ、蛍光の異方性のレベルを測定するステップ、および蛍光の異方性のレベルに基づいて、サンプルの標的核酸分子の存在または非存在を判定するステップを含む。

この態様の実施態様は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。
いくつかの実施態様では、複数のレポーター分子の各レポーター分子について、複数のＤＮＡポリメラーゼ分子を、レポーター分子からフルオロフォアを切断するように構成することができる。ＤＮＡポリメラーゼ分子を不活性化すると、レポーター分子からのフルオロフォアの切断を阻害することができる。

いくつかの実施態様では、励起光をサンプルに向けるステップは、偏光をサンプルに向けるステップを含むことができる。

いくつかの実施態様では、蛍光の異方性のレベルを測定するステップは、第１の偏光を有する蛍光を検出するステップと、第１の偏光とは異なる第２の偏光を有する蛍光を検出するステップと、第１の偏光を有する検出された蛍光および第２の偏光を有する検出された蛍光に基づいて、蛍光の異方性のレベルを判定するステップとを含むことができる。

いくつかの実施態様では、サンプルの標的核酸分子の存在または非存在を判定するステップは、測定された異方性のレベルが閾値以上であると判定するステップ、および測定された異方性のレベルが閾値以上であると判定するステップに応答して、標的核酸分子がサンプルに存在すると判定するステップを含むことができる。

いくつかの実施態様では、サンプルの標的核酸分子の存在または非存在を判定するステップは、測定された異方性のレベルが閾値未満であると判定するステップ、および測定された異方性のレベルが閾値未満であると判定するステップに応答して、標的核酸分子がサンプルに非存在であると判定するステップを含むことができる。

いくつかの実施態様において、標的核酸分子は、リボ核酸（ＲＮＡ）分子であり得る。
いくつかの実施態様で、この方法は、測定された異方性のレベルに基づいて、サンプルにおける細菌の存在を判定するステップをさらに含むことができる。

いくつかの実施態様では、この方法は、測定された異方性のレベルに基づいて、サンプルの２つ以上のタイプの細菌を区別するステップをさらに含むことができる。

いくつかの実施態様では、方法は、測定された異方性のレベルに基づいて癌の兆候を検出するステップをさらに含むことができる。

いくつかの実施態様では、この方法は、サンプルを第２の反応液とインキュベートするステップをさらに含むことができる。反応液は、複数の第２のＤＮＡポリメラーゼ分子、複数の第２の検出器核酸分子、および複数の第２のレポーター分子を含むことができる。各第２の検出器核酸分子は、第２の標的核酸分子の第５の核酸配列に相補的な第４の核酸配列、および第２のＤＮＡポリメラーゼ分子に特異的に結合する第２のアプタマーを含むことができる。各第２のレポーター分子は、第７の核酸配列、第２のレポーター分子の第７の核酸配列に結合する第２のプライマー分子、および第７のレポーター分子の第７の核酸配列に結合する第２のフルオロフォアを含むことができる。

複数の第２の検出器核酸分子の各第２の検出器核酸分子は、１つ以上の対応する第２の標的核酸分子とハイブリダイズするように構成することができる。さらに、各ハイブリダイズした第２の検出器核酸分子は、第２のＤＮＡポリメラーゼ分子が不活性化されるように、１つ以上の第２のＤＮＡポリメラーゼ分子に結合するように構成できる。

第２の励起光をサンプルに向けて、第２のフルオロフォアによる第２の蛍光を誘導することができる。第２の蛍光の異方性のレベルを測定することができ、第２の蛍光の異方性のレベルに基づいて、サンプルの第２の標的核酸分子の存在または非存在を判定することができる。

別の態様では、サンプルの標的核酸分子を検出するためのシステムは、１つ以上のコンピュータプロセッサと、１つ以上のコンピュータプロセッサに通信可能に連結された１つ以上の測定アセンブリとを含む。各測定アセンブリは、サンプルを受け入れるように構成された検出領域と、１つ以上のコンピュータプロセッサによって構成および制御されて、検出領域のサンプルに励起光を向けるライトアセンブリと、第１の光検出器アセンブリと、第２の光検出器アセンブリとを含む。第１および第２の光検出器アセンブリは、１つ以上のコンピュータプロセッサによって構成および制御されて、検出領域のサンプルから放出される蛍光の異方性のレベルを測定する。１つ以上のコンピュータプロセッサは、蛍光の異方性のレベルに基づいて、サンプルの標的核酸分子の存在または非存在を判定するように構成される。

この態様の実施態様は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。
いくつかの実施態様では、ライトアセンブリは、光源と、光源と検出領域との間に配置された第１の偏光子とを含むことができる。

いくつかの実施態様では、第１の光検出器アセンブリは、第１のフォトダイオードと、第１のフォトダイオードと検出領域との間に配置された第２の偏光子とを含むことができる。

いくつかの実施態様では、第２の光検出器アセンブリは、第２のフォトダイオードと、第２のフォトダイオードと検出領域との間に配置された第３の偏光子とを含むことができる。第２の偏光子の偏光は、第３の偏光子の偏光とは異なることができる。

いくつかの実施態様では、１つ以上のコンピュータプロセッサをハウジングに封入することができる。１つ以上の測定アセンブリは、通信インターフェースを介してハウジングに可逆的に取り付けることができる。

いくつかの実施態様では、システムは、複数の測定アセンブリを含むことができる。
いくつかの実施態様では、システムは、加熱アセンブリをさらに含むことができる。加熱アセンブリは、システムの動作中に、１つ以上の測定アセンブリのそれぞれの検出領域に熱を加えるように構成できる。

いくつかの実施態様では、システムは、システムの外部の計算装置からデータを送信し、および／またはデータを受信するように構成された無線トランシーバをさらに含むことができる。

いくつかの実施態様では、コンピュータ装置は、スマートフォンまたはタブレットコンピュータとすることができる。

いくつかの実施態様では、ライトアセンブリは、１つ以上のコンピュータプロセッサによって構成および制御されて、検出領域のサンプルに第１の波長を有する励起光を向け、第２の波長を有する励起光を検出領域のサンプルに向けることができ、ここで第１の波長は第２の波長とは異なる。

いくつかの実施態様では、ライトアセンブリは、１つ以上のコンピュータプロセッサによって構成および制御されて、交互に、検出領域のサンプルに第１の波長を有する励起光を向け、第２の波長を有する励起光を、ある期間、検出領域のサンプルに向けることができる。

別の態様では、サンプル調製装置は、サンプルを封入するように構成された第１の区画と、反応液を封入するように構成された第２の区画と、第１の区画と第２の区画との間に配置された隔壁と、第２の区画内に封入された反応液が第１の区画のサンプルと混合するように、加えられた力に応答して隔壁を穿刺するように構成されたプランジャとを含む。

この態様の実施態様は、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。
いくつかの実施態様では、プランジャは、サンプル調製装置の長手方向軸に沿って第２の区画の少なくとも一部を通って延びるシャフトと、シャフトに機械的に連結されたフランジとを含むことができる。フランジは、第２区画の外部にあってもよい。

いくつかの実施態様では、プランジャは、力がフランジに加えられたときに、シャフトを使用して隔壁を穿刺するように構成することができる。

別の態様では、キットは、本明細書に記載のシステムの実施態様および本明細書に記載のサンプル調製装置の実施態様を含む。

別の態様では、方法は、ポリメラーゼ分子、フルオロフォアを含む受容体分子、および標的核酸の存在下で、ポリメラーゼ分子がフルオロフォアを切断するのを阻害するように構成された検出器分子を含むサンプルを提供するステップを含む。この方法はまた、サンプルからの蛍光異方性のレベルを検出して、サンプルの標的核酸の存在または非存在を判定するステップを含む。

１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載されている。他の特徴および利点は、説明および図面ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。

核酸の標的配列を検出するための例示的なプロセスの図である。 例示的な検出器核酸分子および例示的なレポーター分子の図である。 サンプルの蛍光異方性を測定するための例示的な機器の図である。 例示的な測定アセンブリの図である。 サンプルの蛍光異方性を測定するための例示的なモジュール式機器の写真である。 サンプルの蛍光異方性を測定するための例示的なモジュール式機器の写真である。 サンプルの蛍光異方性を測定するための例示的なモジュール式機器の写真である。 サンプルの蛍光異方性を測定するための例示的な一体型機器の図である。 サンプルの蛍光異方性を測定するための例示的な一体型機器の図である。 例示的なサンプル調製装置の図である。 図６Ａに示すサンプル調製装置の使用例の図である。 核酸分子を単離または抽出するための例示的な装置の図である。 核酸分子を単離または抽出するための例示的な装置の図である。 核酸分子を単離または抽出するための例示的な装置の図である。 核酸分子を単離または抽出するための例示的な装置の図である。 機器に関連する例示的な制御アプリケーションの図である。 機器に関連する例示的な制御アプリケーションの図である。 機器に関連する例示的な制御アプリケーションの図である。 サンプルの標的核酸分子を検出する例示的なプロセスのフローチャートの図である。 例示的なコンピュータシステムの図である。 例示的なシステムまたは核酸の標的配列を検出する回路図である。 例示的なシステムまたは核酸の標的配列を検出する回路図である。 例示的なシステムまたは核酸の標的配列を検出する回路図である。 例示的なシステムと市販の卓上ベンチトップ型プレートリーダとの性能の比較を示すプロットである。 例示的なシステムを使用して、５つの異なるＨＡＩ病原体から得られた測定値を示すプロットである。 異なる細菌濃度を有するサンプルについての例示的なシステムの検出感度を示す棒グラフである。 キャリーオーバー汚染に関するウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）媒介制御の概略図である。 システムのアッセイに対するｄＵＴＰの例示的な効果を示す棒グラフである。 例示的な汚染制御技術の結果を示す棒グラフである。 例示的なシステムと従来のベンチトップ型装置との性能の比較を示す棒グラフである。 例示的なシステムを使用して、例示的な新鮮な試薬および保存された試薬を用いて得られた測定値を示す棒グラフである。 例示的なシステムを使用して、例示的な新鮮な試薬および保存された試薬を用いて得られた測定値を示す棒グラフである。 例示的な検出器核酸分子を示す図である。 例示的なシステムを用いて実施した特異度試験の結果を示すグラフである。 例示的なシステムを用いて実施した特異度試験の結果を示すグラフである。 図２２と図２３に示す特異度の試験の結果を確認するために行った電気泳動バンドシフト分析を示す写真である。 例示的なシステムを用いて薬物耐性および病原性因子を検出した結果を示すグラフである。 例示的なシステムを用いて薬物耐性および病原性因子を検出した結果を示すグラフである。 臨床サンプルをアッセイするための例示的なプロセスを示す。 例示的なシステムを用いた臨床サンプルから得られた測定値を示すグラフである。 例示的なシステムを用いた臨床サンプルから得られた測定値を示すグラフである。 例示的なシステムを用いて得られた結果と、ｑＰＣＲによって得られた結果との比較を示す図である。 例示的な細胞およびその突然変異の状態を示す。 例示的なシステムの検出の特異度を改善するためのプロセスの結果を示す。 例示的な細胞およびそれらの分泌するエキソソームにおける体細胞突然変異のプロファイリングを示す。

核酸の配列を検出するためのシステムおよび技術が、本明細書に記載されている。本明細書に記載される１つ以上の実施態様は、蛍光ベースの技術を使用して核酸の特定の配列（例えば、対象の特定の生物学的状態を示す配列）を有する核酸分子の存在または非存在を同定するために使用され得る。得られた情報は、（例えば、介護者が診断を行うこと、および／またはより情報に基づいた方法で治療を行うことを可能にすることにより）対象に対してより効果的なケアを提供するために使用され得る。

いくつかの場合において、本明細書に記載された実施態様は、医療関連感染（ＨＡＩ）などの生物学的状態を、ＨＡＩ病原体（例えば、特定の細菌種）の存在を検出することによって検出するために使用され得る。ある場合には、本明細書に記載された実施態様は、癌の発生および進行を検出するために使用され得る。

図１Ａは、サンプル内の生物学的粒子が核酸の標的配列（例えば、特定の生物学的状態を示す核酸の配列）を含むかどうかを検出するためのプロセスの例を示す概略図である。図１Ａに示すように、生物学的粒子（例えば、細菌を含有するサンプル）を含有するサンプル１０２が得られる。図１Ａの例に示す生物学的粒子は細菌を含むが、サンプル１０２は、例えば、１つ以上の様々な微生物、細胞、ウイルスまたは病原体を含み得る。本実施例では、サンプルの細菌を改変（例えば溶解）して、細菌内に含まれる核酸１０４を抽出する。細菌から抽出された核酸分子１０４は、標的核酸配列（例えば、１６Ｓ ｒＲＮＡまたはｍＲＮＡの領域）を含み得、（例えば、非対称逆転写（ＲＴ）ＰＣＲを介して）増幅させる。

増幅後、反応液をサンプルと混合する。反応液は、（ｉ）検出器核酸分子１０６、および（ｉｉ）レポーター分子１０８の２つの試薬を含む。さらに、ＤＮＡポリメラーゼ分子１１４は、反応液−サンプル混合物と混合させる。

検出器核酸分子１０６は、標的核酸配列に相補的な第１の核酸配列１１０を含む。検出器核酸分子１０６は、ＤＮＡポリメラーゼ分子１１４に特異的に結合するアプタマー１１２をさらに含む。

実際には、第１の核酸配列１１０は、検出されている標的核酸分子１０４に応じて異なり得る。場合によっては、第１の核酸配列１１０は、検出器核酸分子１０６が特定の生物学的状態（例えば、ＨＡＩまたは癌）を示す核酸配列に選択的に結合するように設計することができる。場合によっては、第１の核酸配列１１０は、検出器核酸分子１０６が特定のタイプの生物（例えば、特定のタイプの細菌）を示す核酸配列に選択的に結合するように設計することができる。

各レポーター分子１０８は、第２の核酸配列１１６、第２の核酸配列１１６に結合したプライマー分子１１８、および核酸配列に結合したフルオロフォア１２０を含む。

第１の場合において、核酸分子１０４は標的核酸配列を含まない。標的核酸分子１０４が存在しない場合、ＤＮＡポリメラーゼ１１４は次いでレポーター分子１０８に結合し、レポーター分子１０８からＤＮＡ分子を合成する。合成反応中、ＤＮＡポリメラーゼは、レポーター分子１０８からフルオロフォアを切断する。次いで、第１の波長を有する光（例えば、偏光された光）が混合物に向けられる。フルオロフォアが入射光によって励起されると、フルオロフォアは第２の異なる波長で発光し、それは検出することができる。結合していないフルオロフォア１１２の比較的高い拡散運動のために、混合物によって放射される光は、比較的低い蛍光異方性（例えば、第２の異なる方向に沿って偏光された放射光に対する、第１の方向に沿って偏光された放射光の比）を示す。

第２の場合において、核酸分子１０４は標的核酸配列を含む。この場合、検出器核酸分子１０６は標的核酸分子１０４とハイブリダイズし、検出器核酸分子１０６を安定化させる。得られたハイブリダイズした検出器核酸分子１０６はＤＮＡポリメラーゼ１１４に結合し、ＤＮＡポリメラーゼ１１４の酵素活性を不活性化する。その結果、ＤＮＡの合成は阻害され、レポーター分子１０８のフルオロフォア１２０はレポーター分子１０８から切断されない。

次いで、第１の波長を有する光（例えば、偏光された光）が混合物に向けられる。励起されたフルオロフォアは、検出可能な第２の異なる波長で発光する。第１の場合とは対照的に、検出された光の蛍光異方性は、例えば、依然として結合しているフルオロフォアの比較的低い拡散率のために、比較的高くなり得る。

したがって、標的核酸分子の存在または非存在は、サンプルを反応液とインキュベートし、サンプルにおいて蛍光を誘導し、得られた蛍光の異方性を測定することによって、確認することができる。

例示的な検出器核酸分子１０６および例示的なレポーター分子１０８を、図１Ｂに示している。図１Ｂに示されるように、検出器核酸分子１０６は、標的核酸配列に相補的な第１の核酸配列１１０を含む。検出器核酸分子１０６は、ＤＮＡポリメラーゼ分子１１４に特異的に結合するアプタマー１１２を含む。例示的な核酸配列を図１Ｂに示しているが、これらは単なる例であることが理解される。実際には、（例えば、異なる標的核酸配列をプローブするために）他の核酸配列も使用することができる。

さらに、図１Ｂに示すように、各レポーター分子１０８は、第２の核酸配列１１６、第２の核酸配列１１６に結合したプライマー分子１１８、および第２の核酸配列１１６に結合したフルオロフォア１２０を含む。

図２は、サンプルの蛍光異方性を測定するための例示的な機器２００の概略図である。場合によっては、システム２００は、偏光異方性診断（ＰＡＤ）装置と称する。

機器２００は、デジタル搬送波信号（例えば、周期的な時間の経過とともに変化するデジタル信号）を生成するマイクロコントローラ２０２を含む。デジタル搬送波信号は、デジタル／アナログ変換器（ＤＡＣ）２０４を使用してアナログ搬送波信号に変換される。アナログ搬送波信号は、測定アセンブリ２５０に送信される。

測定アセンブリ２５０は、ＤＡＣ２０４からアナログ搬送波信号を受信し、アナログ搬送波信号を増幅し、増幅された搬送波信号を照明アセンブリ２０８（例えば、１つ以上の発光ダイオード（ＬＥＤ）を含むアセンブリ）を供給するドライバ２０６を含む。照明アセンブリ２０８は、増幅された搬送波信号に応答して点灯し、搬送波信号に従って、時間において変化する励起光を生成する。励起光は、サンプル２１０（例えば、対象由来の生物学的サンプルを含む、検出器核酸分子およびレポーター分子を有する反応液と共にインキュベートされたサンプル）に向けられる。誘導された蛍光の強度は、光検出器アセンブリ２１２（例えば、１つ以上の光検出器（ＰＤ）を含むアセンブリ）を使用して測定される。

光検出器アセンブリ２１２の出力は、対応する増幅器２１４によって増幅され、信号処理モジュール２１６を使用して処理される。信号処理モジュール２１６は、（例えば、搬送波信号の中心周波数に一致する中心周波数を有するバンドパスを使用して）増幅器２１４の出力をフィルタリングし、フィルタリングされた出力をＤＡＣ２０４からのアナログ搬送波信号と混合する。信号処理モジュール２１６は、出力の信号対雑音比（ＳＮＲ）を増加させるために「ロックイン」処置（以下にさらに説明する）を実行する。信号処理モジュール２１６は、図１Ａにおいて別個の構成要素として示されているが、必ずしもそうである必要はない。例えば、いくつかの実施態様では、信号処理モジュール２１６は、光検出器アセンブリ２１２の一部として実装され得る。いくつかの実施態様では、信号処理モジュール２１６は、マイクロコントローラ２０２の一部として実装することができる。

処理モジュールの出力は、アナログデジタル変換器２１８を使用してデジタル信号に変換され、解釈および／またはさらなる処理のためにマイクロコントローラ２０２に送信される。

機器２００はまた、機器が他の計算装置と通信することを可能にする通信インターフェース２２０を含む。一例として、通信インターフェース２２０は、外部計算装置（例えば、他の計算装置の中でもスマートフォン、パーソナルコンピュータ、タブレットコンピュータ）との通信を容易にするために、接続ポート（例えば、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）ポート）および／またはワイヤレストランシーバ（例えば、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）またはＷｉ−Ｆｉトランシーバ）を含み得る。場合によっては、外部計算装置を使用して、機器を初期化および構成し、機器からデータを表示し、機器からのデータを処理し、および／または将来検索するためにデータを保存することができる。

図３に、測定アセンブリ２５０の例がより詳細に示されている。図３に示すように、照明アセンブリは、ＬＥＤ３０２、直線偏光子３０４、およびレンズ３０６を含む。ＬＥＤ３０２は、駆動電流（例えば、ドライバ２０６によって供給される）に応答して、励起光を生成する。励起光は、直線偏光子３０４によって直線状に偏光され、レンズ３０６を用いて検出領域３０８に集束される。サンプル３１０が検出領域３０８に挿入されると、直線状に偏光された励起光は、サンプルのフルオロフォアを励起し、フルオロフォアが蛍光を発する。

サンプルから放出された蛍光は、光検出器アセンブリ２１２によって測定される。この例では、サンプルの両側に２つの別個の光検出器アセンブリが設けられている。各光検出器アセンブリ２１２は、直線偏光子３１２と、フィルタ３１４と、レンズ３１６と、フォトダイオード３１８とを含む。レンズ３１６は、（蛍光に関連しない光の波長を減衰および／または除去するために）サンプル領域３０８からフィルタ３１４を経て、また直線偏光子３１２を通ってフォトダイオード３１８へと蛍光の焦点を合わせる。各直線偏光子３１２の偏光は異なる（例えば、１つの直線偏光子３１２の偏光は別の直線偏光子３１２の偏光に直交することができる）。したがって、各フォトダイオード３１８は、サンプル領域３０８の蛍光強度の異なる方向成分を測定する。

図３に示すように、複数の光検出器アセンブリ２１２を使用して、蛍光の異方性を測定することができる。例えば、第１の光検出器アセンブリ２１２からの第１のフォトダイオード３１８を使用して、励起光偏光に対する蛍光強度（Ｉ_x）の平行な偏光成分を測定することができ、第２の光検出器アセンブリ２１２からの第２のフォトダイオード３１８を使用して、励起光の偏光に対する蛍光強度（Ｉ_y）の垂直な偏光成分を測定することができる。蛍光の異方性ｒは、以下のように計算することができる。

ｒ＝（Ｉ_x−Ｉ_y）（Ｉ_x＋２Ｉ_y）^-1
本明細書で説明するものとして、「ロックイン」測定技術を使用して、測定のＳＮＲを高めることができる。例えば、ｒが強度に依存しないという事実を利用して、測定された励起光の強度は（例えば、マイクロコントローラ２０２によって生成され、ＤＡＣ２０４を使用して変換されるものとして）搬送波の周波数で変調することができる。その後、ホモダイン信号経路を介して放射信号を周波数ロックすることができる。

本明細書に記載するものとして、標的核酸分子の存在または非存在は、サンプルにおいて誘導された蛍光の異方性を測定することによって確かめることができる。例えば、比較的高いレベルの異方性（例えば、特定の閾値以上）が、標的核酸分子の存在を示すことができるか、比較的低いレベルの異方性（例えば、特定の閾値未満）が、標的核酸分子が存在しないことを示すことができる。閾値は、経験的に決定することができる（例えば、標的核酸分子を含むことが既知の陽性サンプルおよび標的核酸分子を有さないことが既知の陰性サンプルを用いて実験を行い、得られた蛍光異方性のレベルを測定することによる）。

場合によっては、サンプルにおいて誘導された蛍光の異方性を測定することによって、標的核酸の相対的存在量を確認することができる。例えば、異方性のレベルの上昇は、標的核酸の存在量または量の増加に対応し得る。さらに、異方性のレベルの下降は、標的核酸の存在量または量の減少に対応し得る。認められた異方性のレベルと標的核酸の存在量との間の関係は、（例えば、既知の量の標的核酸分子を有するサンプルを用いて実験を行い、得られた蛍光異方性のレベルを測定することによって）経験的に決定することができる。

サンプルの蛍光異方性を測定するための機器２００は、任意の数の測定アセンブリ２５０を含むことができる。いくつかの実施態様では、機器２００は、一度に単一の測定を行うための単一の測定アセンブリ２５０を含むことができる。これは、例えば、機器２００のコスト、複雑さ、および／またはサイズを低減するのに有益であり得る。いくつかの実施態様では、機器２００は、複数の別個の測定アセンブリ２５０を含み、複数の測定を並列および／または連続して行うことができる。これは、例えば、複数のサンプルをより迅速かつ／またはより効率的に分析することができるので有益であり得る。例として、図２に示すように、機器は４つの測定アセンブリ２５０を含むことができる。

場合によっては、測定アセンブリ２５０を機器２００に可逆的に着脱することができるように、機器２００をモジュール式にすることができる。これは、例えば、使用者が機器２００をより容易に（例えば、部品を選択的に交換することによって）機能させることを可能にするので、有用であり得る。さらに、これにより、使用者は、必要に応じて機器２００をカスタマイズすることができる。

例示的なモジュール式機器４００が図４Ａに示されている。機器４００は、基地局４０２と、モジュール４０４ａ〜４０４ｄとを含む。基地局４０２は、モジュール４０４ａ〜４０４ｄ（例えば、図２に示すような、マイクロコントローラ２０２、ＤＡＣ２０４、増幅器２１４、信号処理モジュール２１６、ＡＤＣ２１８、および／または通信インターフェース２２０）の各々に共通な構成要素を含む。各モジュール４０４ａ〜４０４ｄは、測定モジュール２５０を含む。モジュール４０４ａ〜４０４ｄおよび基地局４０２は、１つ以上の通信インターフェース４０６（例えば、ポートまたはコネクタ）を介して通信可能に連結することができる。

図４Ｂは、モジュール４０４ａの分解図を示す。モジュール４０４ａは、ハウジング４０８と、支持フレーム４１０と、蓋４１２とを含む。図４Ｃに示すように、ハウジング４０８は、その底部内面に沿って配置された照明アセンブリ２０８を含む。支持フレーム４１０は、ハウジング４０８に挿入され、照明アセンブリ２０８および光検出器アセンブリを検出領域３０８の周りに固定する。蓋４１２は、サンプル（例えば、サンプルを含む試験管などの容器）を検出領域３０８に挿入することができる開口４１４を画定する。

場合によっては、機器は複数の測定アセンブリを単一の統合システムに含めることができる。例えば、図５Ａは、６４個の測定アセンブリ２５０を有する機器５００と、（図２に示すようなマイクロコントローラ２０２、ＤＡＣ２０４、増幅器２１４、信号処理モジュール２１６、ＡＤＣ２１８、および／または通信インターフェース２２０などの測定アセンブリ２５０の各々に共通の構成要素を含む）エンクロージャ５０２とを示す。

機器５００はまた、使用者に情報を表示する、および／または使用者からの入力を受信する（例えば、タッチベースのコマンド）表示装置５０４（例えば、タッチセンシティブディスプレイスクリーン）を含む。

機器５００はまた、測定アセンブリ２５０に挿入されたサンプルを加熱および／または冷却する加熱アセンブリ５０６（例えば、電動式加熱ブロック）を含む。これは、例えば、機器５００がサーモサイクラーとして機能することを可能にし、ＰＣＲの性能を促進することができるので有用であり得る。

場合によっては、加熱アセンブリ５０６は、正の温度係数（ＰＴＣ）の加熱要素を含むことができる。ＰＴＣ加熱要素は、加熱アセンブリ５０６のフィードバック制御を単純化するのに有用であり得る。例えば、ＰＴＣ加熱要素は、最初は熱を急速に発生させるために電気抵抗が低い。温度が上昇すると、抵抗が増加して電流を自己調整し、過熱を防止する。

図５Ｂに、機器５００の単一の測定アセンブリ２５０がより詳細に示されている。図５Ｂに示すように、各測定アセンブリは、照明アセンブリ２０８と、検出領域３０８の周りに配置された２つの光検出器アセンブリ２１２とを含む。測定のために、サンプル（例えば、サンプルを含む容器）を検出領域３０８に挿入することができる。

場合によっては、検出器核酸分子、レポーター分子、およびＤＮＡポリメラーゼ分子の複数のセットを併用して、複数の異なる標的核酸分子を検出することができる。

例えば、第１のセットは、第１の標的核酸分子を検出するために使用され得る。第１のセットは、第１の検出器核酸分子、第１のフルオロフォアを有する第１のレポーター分子、および第１のＤＮＡポリメラーゼ分子を含み得る。第１の検出器核酸分子は、第１の核酸分子の核酸配列に相補的な第１の核酸配列を含む。第１の検出器核酸分子はまた、（例えば、第１の検出器核酸分子が第１の標的核酸分子とハイブリダイズするとき）第１のＤＮＡポリメラーゼ分子に特異的に結合する第１のアプタマーも含む。

第１の標的核酸分子の存在下で、第１のＤＮＡポリメラーゼ分子は不活性化される。この場合、第１のフルオロフォアが入射光によって励起されると、第１のフルオロフォアによって放射される光は、比較的高い蛍光異方性を示す。第１の標的核酸分子が存在しない場合、第１のＤＮＡポリメラーゼ分子は第１のレポーター分子に結合し、第１のレポーター分子からＤＮＡ分子を合成する。この場合、第１のフルオロフォアが入射光によって励起されると、第１のフルオロフォアによって放射される光は、比較的低い蛍光異方性を示す。したがって、第１の標的核酸分子の存在または非存在は、第１のフルオロフォアに関連する蛍光異方性に基づいて確認することができる。さらに、第２のセットは、第２の標的核酸分子を検出するために使用され得る。第２のセットは、第２の検出器核酸分子、第２のフルオロフォア（例えば、異なる励起波長および／または第１のフルオロフォアとは異なる発光波長を有する）を有する第２のレポーター分子および第２のＤＮＡポリメラーゼ分子を含むことができる。第２の検出器核酸分子は、第２の核酸分子の核酸配列に相補的な第２の核酸配列を含む。第２の検出器核酸分子はまた、（例えば、第２の検出器核酸分子が第２の標的核酸分子とハイブリダイズするとき）第２のＤＮＡポリメラーゼ分子に特異的に結合する第２のアプタマーも含む。

第２の標的核酸分子の存在下で、第２のＤＮＡポリメラーゼ分子は不活性化される。この場合、第２のフルオロフォアが入射光によって励起されると、第２のフルオロフォアによって放射される光は、比較的高い蛍光異方性を示す。第２の標的核酸分子が存在しない場合、第２のＤＮＡポリメラーゼ分子は第２の第１のレポーター分子に結合し、第２のレポーター分子からＤＮＡ分子を合成する。この場合、第２のフルオロフォアが入射光によって励起されると、第１のフルオロフォアによって放射される光は、比較的低い蛍光異方性を示す。したがって、第２の標的核酸分子の存在または非存在は、第２のフルオロフォアに関連する蛍光異方性に基づいて確認することができる。

サンプルは、検出器核酸分子、レポーター分子、およびＤＮＡポリメラーゼ分子の複数のセットと同時にインキュベートすることができる。続いて、異なる波長を有する光（例えば、異なるフルオロフォアの励起波長に対応する）をサンプルに向けることができ、サンプルによって放射される光の強度は、異なる複数の波長（例えば、異なるフルオロフォアの発光波長に対応する）に応じて測定できる。したがって、異なる標的核酸分子の存在または非存在は、各フルオロフォアに付随する蛍光異方性に基づいて確認することができる。

場合によっては、機器は、異なるタイプのフルオロフォアが選択的に励起され、それらの蛍光異方性が観察されるように、異なる波長に従って励起光を生成する照明アセンブリを含むことができる。例えば、照明アセンブリは、第１の波長（第１のフルオロフォアの励起波長に対応する）に応じて光を放出する第１のＬＥＤと、異なる第２の波長（第２のフルオロフォアの励起波長に対応する）に応じて光を放出する第２のＬＥＤとを有し得る。機器は、第１および第２のフルオロフォアをそれぞれ探るために第１および第２のＬＥＤを選択的に活性化することができる。ある場合には、機器は、各タイプのフルオロフォアについて複数の測定値を得るために、ある期間にわたって交互に第１および第２のＬＥＤを周期的に作動させることができる。場合によっては、機器は第１および第２のＬＥＤの活性化と同期して光検出器アセンブリを選択的に作動させることもできるので、実質的に第１または第２のＬＥＤが発光しているときにのみ測定値が得られる。

２つの異なるセットの検出器核酸分子、レポーター分子、およびＤＮＡポリメラーゼ分子の使用が上記に記載されているが、これは単なる例示である。場合によっては、３つ以上のセットの検出器核酸分子、レポーター分子、およびＤＮＡポリメラーゼ分子を用いて、３つ以上の異なる標的核酸分子を検出することができる。同様に、機器は、異なるタイプのフルオロフォアが選択的に励起でき、それらの蛍光異方性が観察できるように、任意の数の異なる波長に応じて励起光を生成するように構成された光アセンブリを含むことができる。

場合によっては、サンプル調製装置を用いてサンプルの調製を簡略化することができる。例示的なサンプル調製装置６００を図６Ａに示す。装置６００は、第１の区画６０２および第２の区画６０４を画定し、それらは隔壁６０６によって分離される。隔壁６０６は、各内容物が混合されないように、区画６０２を第２の区画６０４から封止する。場合によっては、隔壁６０６は、プラスチックの膜または箔のシート（例えば、アルミニウム箔）であってもよい。

装置６００はまた、区画６０２と区画６０４の内容物が混合するように、加えられた力に応答して隔壁６０６を穿刺するように構成されたプランジャ６１８を含む。プランジャ６１８は、装置６００の長手方向軸６１０に沿って区画６０４を通って延びるシャフト６０８と、区画６０４の外側にあり、装置６００から突出するフランジ６１２とを含む。プランジャ６１８を装置６００内にさらに移動させるために、フランジ６１２に（例えば、使用者および／または機械的アクチュエータまたはフランジ６１２をプレスするサーボにより）力を加えることができる。プランジャ６１８が装置６００内に十分に押し込まれると、シャフト６０８は隔壁６０６を（例えば、棘付き先端部を介して）穿刺し、区画６０２および６０４の内容物を混合させることができるようになる。

装置６００は、サンプルを本明細書に記載された機器での使用のために迅速かつ簡便に調製することを可能にする。例えば、図６Ｂに示すように、装置６００は、区画６０４内の反応液６１４および区画６０２内のＰＣＲ試薬６１６を予め装填することができる。ＰＣＲ試薬６１６は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、プライマー、および緩衝液を含み得る（例えば、ＤＮＡ標的を検出する場合）。ＰＣＲ試薬６１６は、逆転写酵素も含むことができる（例えば、ＲＮＡ標的を検出する場合）。

使用者は、ＰＣＲ試薬と混合するように、サンプル６２０を区画６０２に置くことができる。使用者は、ＰＣＲを介してサンプル６２０の標的核酸分子を増幅するために、装置６００をサーモサイクラー（例えば、機器５００または別個のサーモサイクラー）に配置することができる。増幅が完了した後、フランジ６１２をプレスすることができ、隔壁を穿刺し、反応液をサンプル６２０に放出させる。続いて、サンプル６２０をインキュベートし、蛍光異方性を測定して（例えば、本明細書に記載の１つ以上の機器を使用して）標的核酸配列の存在または非存在を判定することができる。

場合によっては、測定機器によって分析される前に、サンプルを処理して核酸分子（例えば、ＲＮＡ分子）を単離または抽出することができる。例として、図７Ａは、核酸抽出装置７００の断面図を示す。装置７００は、弁７０６（例えば、三方弁）を介して流体連通するサンプルリザーバ７０２および捕捉チャンバ７０４を含む。装置７００はまた、流体サンプルをサンプルリザーバ７０２に置くための入口７０８、流体サンプルを捕捉チャンバ７０４から取り出すための出口７１０、および装置７００から廃棄物を除去するための廃棄物出口７１２を含む。

弁７０６は、入口７０８、出口７１０、および／または廃棄物出口７１２の間で流体の向きを変えるように調節することができる。例えば、第１の位置において、弁７０６は、入口７０８と出口７１０との間の物質の流れを可能にすることができる（例えば、サンプルを、入口７０８からサンプルリザーバ７０２および捕捉チャンバ７０４を通り、また出口７１０から運ぶ）。第２の位置では、弁７０６は、捕捉チャンバ７０４を汚染することなく、入口７０８と廃棄物出口７１２との間の材料の流れを可能にする（例えば、洗浄緩衝液または他の材料を運ぶため）。例えば、いくつかの場合には、磁気的に標識されたサンプル（例えば、磁気ビーズに捕捉されたエキソソーム）を（例えば外部磁石を用いて）サンプルリザーバ７０２に固定化し、サンプルを洗浄することができる（例えば洗浄緩衝液を用いて）。洗浄中、洗浄緩衝液が捕捉チャンバ７０４に入らず、代わりに廃棄物出口７１２を介して除去されるように、弁７０６を第２の位置に設定することができる。

捕捉チャンバ７０４の一部を通る側面図が、図７Ｂにより詳細に示されている。捕捉チャンバ７０４は、その中に充填されたいくつかの正に帯電したガラスビーズ７１４を含む。高塩条件下では、負に荷電した核酸分子がガラスビーズの表面に結合する。続いて、塩の濃度を低下させ、出口７１０から溶離剤を収集することによって、核酸分子を回収することができる。図７Ｂに示すように、捕捉チャンバ７０４は、流体流を可能にしながら捕捉チャンバ７０４内にビーズ７１４を保持する堰式バリア７１６を含む。

いくつかの場合において、装置７００は、基板（例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ））のフィーチャを機械加工、エッチングまたは成形し、（例えば、基板の上に重ねられた１つ以上のカバーまたはプレートを使用して）フィーチャを封止することによって、構築することができる。例えば、図７Ｃおよび図７Ｄには、装置７００の組立図および分解図がそれぞれ示されている。図７Ｃおよび図７Ｄに示すように、装置７００は、サンプルリザーバ７０２および捕捉チャンバ７０４がその上に画定される基板７２０を含むことができる。装置７００はまた、入口７０８、出口７１０、および廃棄物出口７１２を画定するカバー７３０を含むことができる。弁７０６は、サンプルリザーバ７０２と捕捉チャンバ７０４との間の流体の流れを調整するために、カバー７３０に挿入される。

本明細書で説明しているように、場合によっては、外部計算装置（例えば、スマートフォン、パーソナルコンピュータ、タブレットコンピュータなど）を使用して、機器の初期化および構成、機器からのデータの表示、機器からのデータの処理、および／または将来の検索のためにデータを記憶することができる。場合によっては、消費者がこれらのタスクを実行できるようにする計算装置用の制御アプリケーションを消費者に提供することができる。

例示すると、図８Ａ〜図８Ｃは、機器に関連する制御アプリケーションを実行するスマートフォン８００を示す。制御アプリケーションは、機器を初期化および構成し（図８Ａ）、機器からデータを見て（図８Ｂ）、将来検索するためにデータを処理および／または記憶する（図８Ｃ）ための様々なオプションを提示するグラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）８１０を使用者に提示する。図８Ｃに示すように、場合によっては、データを地理的情報（例えば、各測定が行われた場所）と組み合わせることができ、データをグラフィカルマップの形で視覚的に提示することができる。これは、例えば、使用者が異なる地理的位置から異なるサンプルを処理し、それぞれの位置に従って測定値を視覚的に整理したい場合に有用であり得る。

サンプルの標的核酸分子を検出する例示的なプロセス９００を図９に示す。
サンプルを反応液とインキュベートする（ステップ９０２）。

サンプルは、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、唾液、尿、痰、膿、および／または食物のような生物学的流体を含むことができる。サンプルに含まれる生物学的粒子は、例えば、微生物、細胞（任意の原核細胞または真核細胞を含む）、細胞小器官、細胞外小胞（例えば、エキソソーム）、ウイルス、真菌、藻類または天然に存在するか、サンプルに人工的に導入した他の種類の生物学的粒子を含み得る。生物学的粒子として使用することができる細胞の例としては、血中循環腫瘍細胞、赤血球、白血球、精子、および卵が挙げられるが、これらに限定されない。

反応液は、複数のＤＮＡポリメラーゼ分子、複数の検出器核酸分子、および複数のレポーター分子を含む。

各検出器核酸分子は、標的核酸分子の第２の核酸配列に相補的な第１の核酸配列、およびＤＮＡポリメラーゼ分子に特異的に結合するアプタマーを含む。標的核酸分子は、リボ核酸（ＲＮＡ）分子であり得る。

各レポーター分子は、第３の核酸配列、レポーター分子の第３の核酸配列に結合したプライマー分子、およびレポーター分子の第３の核酸配列に結合したフルオロフォアを含む。

様々な異なるフルオロフォアを使用することができる。例示的なフルオロフォアには、Ａｌｅｘａ ４０５およびＣａｓｃａｄｅ ｂｌｕｅ（励起波長４００ｎｍおよび発光波長４２０ｎｍを有する）、Ａｌｅｘａ ４８８およびＦＩＴＣ（励起波長４９３ｎｍおよび発光波長５１８ｎｍを有する）、Ａｌｅｘａ ５４６、Ａｌｅｘａ ５５５、Ｃｙ３、およびＴＲＩＴＣ（励起波長５５０ｎｍおよび発光波長５６８ｎｍを有する）、Ａｌｅｘａ ５９４およびＴｅｘａｓ ｒｅｄ（励起波長５９３ｎｍおよび発光波長６１８ｎｍを有する）、Ａｌｅｘａ ６３３（励起波長６３８ｎｍおよび発光波長６５８ｎｍを有する）、Ａｌｅｘａ ６４７およびＣｙ５（励起波長６４６ｎｍおよび発光波長６７４ｎｍを有する）、Ａｌｅｘａ ６８０およびＣｙ５．５（励起波長６８２ｎｍおよび発光波長７１５ｎｍを有する）、およびＩＲＤｙｅ ８００（励起波長７７０ｎｍおよび発光波長７９４ｎｍを有する）が含まれる。実施態様に応じて、他のフルオロフォアも使用することができる。

様々な異なるアプタマーを使用することができる。例えば、Ｔａｑポリメラーゼを不活性化するために、以下の配列の１つを有するアプタマーを使用することができる：ＣＡＡＧＡＣＧ ｇｇＣＧｇｇＴＧＴｇｇＴＡｇｇ ＣＧＣＣＣＧＴＧ、ＡＣＴＴＧＡＴ ｇｇＣＧｇｇＴＧＴｇｇＴＡｇｇ ＣＧＣＣＡＴＣＴ、ＡＣＴＴＧＡＴ ｇｇＣＧｇｇＴＴＴｇｇＴＡｇｇ ＣＧＣＣＧＴＣＧ、ＡＣＴＧＧＡＴ ｇｇＣＧｇｇＴＴＴｇｇＴＡｇｇ ＣＧＣＣＡＴＣＴ、ＡＣＡＴＧＡＴ ｇｇＣＧｇｇＴＧＴｇｇＴＡｇｇ ＣＧＴＣＧＴＣＴ、ＡＣＡＴＧＡＴ ｇｇＣＧｇｇＴＴＴｇｇＴＡｇｇ ＣＧＣＣＧＴＣＴ、ＣＡＡＧＡＣＧ ｇｇＣＧｇｇＴＴＴｇｇＴＡｇｇ ＣＧＣＣＣＧＡＧ、ＣＡＡＧＡＣＧ ｇｇＣＧｇｇＴＴＴｇｇＧＡｇｇ ＣＧＣＣＣＧＡＧ、ＡＣＴＴＧＡＴ ｇｇＣＧｇｇＴＴＴｇｇＴＡｇｇ ＣＧＣＣＣＴＣＴ、ＣＡＡＧＡＣＧ ｇｇＣＧｇｇＴＴＴｇｇＴＡｇｇ ＣＧＣＣＧＴＣＴ、ＡＣＴＴＧＡＴ ｇｇＣＧｇｇＴＴＴｇｇＴＡｇｇ ＣＧＣＣＣＣＡＧ、ＡＣＴＴＧＡＴ ｇｇＴＧｇｇＴＴＴｇｇＴＡｇｇ ＣＧＣＣＧＴＣＴ、ＡＣＡＧＡＣＧ ｇｇＣＧｇｇＴＴＴｇｇＴＡｇｇ ＣＧＣＣＧＡＣＴ、ＣＣＴＧＡＣＧ ｇｇＣＧｇｇＴＴＴｇｇＴＡｇｇ ＣＧＣＣＧＴＣＴ、およびＡＣＡＧＡＣＧ ｇｇＣＧｇｇＴＴＣｇｇＴＡｇｇ ＣＧＣＣＣＴＡＧ。実施態様に応じて、他の配列を有するアプタマーも使用することができる。場合によっては、アプタマーは、指数関数的濃縮（ＳＥＬＥＸ）プロセスによるリガンドの系統的進化によって生成することができる。

複数の検出器核酸分子の各検出器核酸分子は、１つ以上の対応する標的核酸分子とハイブリダイズするように構成される。さらに、各ハイブリダイズした検出器核酸分子は、ＤＮＡポリメラーゼ分子が不活性化されるように、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ分子に結合するように構成される。

フルオロフォアにより蛍光を誘導するべく励起光をサンプルに向ける（ステップ９０４）。一例として、フルオロフォアの励起波長に対応する第１の波長を有する光（例えば、偏光）を生成するために、照明アセンブリを有する機器を使用することができる。

蛍光の異方性のレベルが測定される（ステップ９０６）。一例として、フルオロフォアの発光波長に対応する第２の異なる波長の光を検出するために、照明アセンブリを有する機器を使用することができる。第２の異なる方向に沿って偏光される放射光に対する第１の方向に沿って偏光された放射光の比を判定することによって、蛍光の異方性を求めることができる。例えば、命令は、第１の偏光を有する蛍光、および第１の偏光とは異なる第２の偏光を有する蛍光を検出することができる。蛍光の異方性のレベルは、第１の偏光を有する検出された蛍光、および第２の偏光を有する検出された蛍光に基づいて判定できる。

サンプルの標的核酸分子の存在または非存在を、蛍光の異方性のレベルに基づいて判定する（ステップ９０８）。

例えば、第１の場合において、核酸分子は標的核酸配列を含まない。標的核酸分子が存在しない場合、ＤＮＡポリメラーゼは次いでレポーター分子に結合し、レポーター分子からＤＮＡ分子を合成する。合成反応中、ＤＮＡポリメラーゼは、レポーター分子からフルオロフォアを切断する。次いで、第１の波長を有する光（例えば、偏光された光）が混合物に向けられる。フルオロフォアが入射光によって励起されると、フルオロフォアは第２の異なる波長で発光し、それは検出することができる。結合していないフルオロフォアの比較的高い拡散運動のために、混合物によって放射される光は、比較的低い蛍光異方性を示す。

第２の場合において、核酸分子は標的核酸配列を含む。この場合、検出器核酸分子は標的核酸分子とハイブリダイズし、検出器核酸分子を安定化させる。得られたハイブリダイズした検出器核酸分子はＤＮＡポリメラーゼに結合し、ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を不活性化する。その結果、ＤＮＡの合成は阻害され、レポーター分子のフルオロフォアはレポーター分子から切断されない。第１の場合とは対照的に、検出された光の蛍光異方性は、例えば、依然として結合しているフルオロフォアの比較的低い拡散率のために、比較的高くなり得る。

したがって、標的核酸分子の存在または非存在は、サンプルを反応液とインキュベートし、サンプルにおいて蛍光を誘導し、得られた蛍光の異方性を測定することによって、確認することができる。

場合によっては、測定した異方性のレベルが閾値以上であることを判定することによって、サンプルの標的核酸分子の存在または非存在を判定することができる。測定された異方性のレベルが閾値以上であるという判定に応じて、標的核酸分子がサンプルに存在するという判定を下すことができる。

さらに、測定した異方性のレベルが閾値未満であることを判定することによって、サンプルの標的核酸分子の存在または非存在を判定することができる。測定された異方性のレベルが閾値未満であるという判定に応じて、標的核酸分子がサンプルに非存在であるという判定を下すことができる。

場合によっては、測定された異方性のレベルに基づいて、サンプルに細菌が存在していると判定することができる。場合によっては、測定された異方性のレベルに基づいて、サンプルの２種以上の細菌が区別できる。場合によっては、測定された異方性のレベルに基づいて、癌の兆候を検出することができる。

場合によっては、異なる標的核酸分子を検出できるように、サンプルを２つ以上の反応液とインキュベートすることができる。例えば、サンプルは、第２の反応液に含めることができる。反応液は、複数の第２のＤＮＡポリメラーゼ分子、複数の第２の検出器核酸分子、および複数の第２のレポーター分子を含むことができる。各第２の検出器核酸分子は、第２の標的核酸分子の第５の核酸配列に相補的な第４の核酸配列、および第２のＤＮＡポリメラーゼ分子に特異的に結合する第２のアプタマーを含むことができる。各第２のレポーター分子は、第７の核酸配列、第２のレポーター分子の第７の核酸配列に結合する第２のプライマー分子、および第７のレポーター分子の第７の核酸配列に結合する第２のフルオロフォアを含むことができる。

複数の第２の検出器核酸分子の各第２の検出器核酸分子は、１つ以上の対応する第２の標的核酸分子とハイブリダイズするように構成することができる。さらに、各ハイブリダイズした第２の検出器核酸分子は、第２のＤＮＡポリメラーゼ分子が不活性化されるように、１つ以上の第２のＤＮＡポリメラーゼ分子に結合するように構成できる。

第２の励起光をサンプルに向けて、第２のフルオロフォアによる第２の蛍光を誘導することができる。第２の蛍光の異方性のレベルを測定することができ、第２の蛍光の異方性のレベルに基づいて、サンプルの第２の標的核酸分子の存在または非存在を判定することができる。

本明細書で説明される主題および動作のいくつかの実施態様は、本明細書に開示された構造およびそれらの構造的均等物を含む、アナログ電子回路、デジタル電子回路、またはコンピュータソフトウェア、ファームウェア、またはハードウェア、あるいはそれらの１つ以上の組み合わせにおいて実施し得る。例えば、いくつかの実施態様では、機器２００、４００、および／または５００は、アナログ電子回路、デジタル電子回路、またはコンピュータソフトウェア、ファームウェア、またはハードウェア、またはそれらの１つ以上の組み合わせを利用して少なくとも一部を実施することができる。いくつかの実施態様では、ＤＡＣ（例えば、ＤＡＣ２０４）、測定アセンブリ（例えば、測定アセンブリ２５０）、増幅器（例えば、増幅器２１４）、信号処理モジュール（例えば、信号処理モジュール２１６）、ＡＤＣ（例えば、ＡＤＣ２１８）、および／またはマイクロコントローラ（例えば、マイクロコントローラ２０２）が、アナログ電子回路、デジタル電子回路、またはコンピュータソフトウェア、ファームウェア、またはハードウェア、またはそれらの１つ以上の組み合わせを利用して少なくとも一部を実施することができる。場合によっては、プロセス９００は、デジタル電子回路、またはコンピュータソフトウェア、ファームウェア、またはハードウェア、またはそれらの１つ以上の組み合わせを利用して少なくとも一部を実施することができる。

本明細書で説明されるいくつかの実施態様は、アナログ電子回路、デジタル電子回路、コンピュータソフトウェア、ファームウェア、またはハードウェア、またはそれらの１つ以上の組み合わせの１つ以上の群またはモジュールとして実施することができる。様々なモジュールを使用することができるが、各モジュールを区別する必要はなく、複数のモジュールを同じアナログ電子回路、デジタル電子回路、コンピュータソフトウェア、ファームウェア、またはハードウェア、またはそれらの組み合わせで実装することができる。

本明細書に記載されているいくつかの実施態様は、データ処理機によって実行されるか、データ処理機の動作を制御するためのコンピュータ記憶媒体において符号化された１つ以上のコンピュータプログラム、すなわちコンピュータプログラム命令の１つ以上のモジュールとして実装することができる。例えば、図８Ａ〜図８Ｃに関連して本明細書で説明した制御アプリケーションは、コンピュータプログラムとして実施することができる。コンピュータ記憶媒体は、コンピュータ可読記憶装置、コンピュータ可読記憶基板、ランダムまたはシリアル・アクセス・メモリ・アレイまたは装置、またはそれらの１つ以上の組み合わせであることができ、またはこれらに含まれ得る。さらに、コンピュータ記憶媒体は伝播信号ではないが、コンピュータ記憶媒体は、人工的に生成された伝播信号でコード化されたコンピュータプログラム命令のソースまたは行先とすることができる。コンピュータ記憶媒体は、１つ以上の別個の物理的構成要素または媒体（例えば、複数のＣＤ、ディスク、または他の記憶装置）であってもよく、またはこれらに含まれてもよい。

「データ処理機」という用語は、例えば、プログラム可能なプロセッサ、コンピュータ、チップに関するシステム、または前述のものの複数のものまたはそれらの組み合わせを含む、データを処理するためのあらゆる種類の器械、装置および機械を包含する。器械は、ＦＰＧＡ（フィールドプログラマブルゲートアレイ）またはＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路）などの専用論理回路を含むことができる。器械は、ハードウェアに加えて、問題のコンピュータプログラム用の実行環境を生成するコード、例えば、プロセッサファームウェアを構成するコード、プロトコルスタック、データベース管理システム、オペレーティングシステム、クロスプラットフォームランタイム環境、仮想マシン、またはそれらのうちの１つ以上の組み合わせを含むことができる。器械および実行環境は、ウェブサービス、分散コンピューティングおよびグリッドコンピューティングインフラストラクチャなど、様々な異なるコンピューティングモデルインフラストラクチャを実現することができる。

コンピュータプログラム（プログラム、ソフトウェア、ソフトウェアアプリケーション、スクリプト、またはコードとしても公知）は、コンパイルまたはインタプリタ型言語、宣言的または手続き的な言語を含む、任意の形式のプログラミング言語で記述することができる。コンピュータプログラムは、ファイルシステムのファイルに対応させることができるが、必ず対応させる必要はない。プログラムは、他のプログラムまたはデータ（例えば、マークアップ言語のドキュメントに格納された１つ以上のスクリプト）を保持するファイルの一部、問題のプログラム専用の単一ファイル、または複数のコーディネートされたファイル（例えば、１つ以上のモジュール、サブプログラム、またはコードの一部を格納するファイル）に格納できる。コンピュータプログラムは、１つのコンピュータで、または１つのサイトに位置するか複数のサイトに分散され、通信ネットワークによって相互接続された複数のコンピュータで実行されるように配置することができる。

本明細書で説明するプロセスおよびロジックフローの一部は、入力されたデータを操作して出力を生成することによって動作を実行する１つ以上のコンピュータプログラムを実行する、１つ以上のプログラマブルプロセッサによって実行できる。専用論理回路、例えばＦＰＧＡ（フィールドプログラマブルゲートアレイ）またはＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路）によって、プロセスおよび論理フローはまた実行することができ、また器械は専用論理回路として実装することができる。

コンピュータプログラムの実行に適したプロセッサは、例として、汎用マイクロプロセッサおよび専用マイクロプロセッサ、および任意の種類のデジタルコンピュータのプロセッサを含む。一般に、プロセッサは、読み出し専用メモリまたはランダムアクセスメモリ、またはその両方から命令およびデータを受信する。コンピュータは、命令に従って動作を実行するためのプロセッサと、命令およびデータを記憶するための１つ以上のメモリ装置とを含む。コンピュータはまた、磁気、光磁気ディスク、または光ディスクなどのデータを格納するための１つ以上の大容量記憶装置からデータを受信すること、データを転送すること、またはその両方を含んでもよく、あるいはそのために動作可能に連結されてもよい。しかし、コンピュータはそのような装置を有する必要はない。コンピュータプログラム命令およびデータを格納するのに適した装置は、例えば半導体メモリ装置（例えば、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリ装置など）、磁気ディスク（例えば、内蔵ハードディスク、リムーバブルディスクなど）、光磁気ディスク、およびＣＤ−ＲＯＭおよびＤＶＤ−ＲＯＭディスクなどのあらゆる形態の不揮発性メモリ、メディアおよびメモリ装置を含む。プロセッサおよびメモリは、専用論理回路で補完しても、それに組み込んでもよい。

使用者との対話を提供するために、使用者に情報を表示するための表示装置（例えば、モニタまたは他のタイプの表示装置）と、キーボードおよびポインティング装置（例えば、マウス、トラックボール、タブレット、タッチセンシティブスクリーン、または他のタイプのポインティング装置）を有するコンピュータにおいて操作を実施することができ、キーボードおよびポインティング装置によって、使用者がコンピュータに入力をすることができる。他の種類の装置を使用して、使用者との対話を提供することもできる。例えば、使用者に提供されるフィードバックは、任意の形態の感覚フィードバック、例えば、視覚フィードバック、聴覚フィードバック、または触覚フィードバックであり得る。また、使用者からの入力は、音響、音声、または触覚での入力を含む任意の形態で受信することができる。さらに、コンピュータは、使用者によって使用される装置とドキュメントを送受信することによって使用者と対話することができる。例えば、ウェブブラウザから受信した要求に応答して、使用者のクライアント装置のウェブブラウザにウェブページを送信することによってなされる。

コンピュータシステムは、単一の計算装置、または互いに近接してまたは互いにほぼ遠隔で動作し、通常は通信ネットワークを介して相互作用する複数のコンピュータを含むことができる。通信ネットワークの例には、ローカルエリアネットワーク（「ＬＡＮ」）およびワイドエリアネットワーク（「ＷＡＮ」）、ネットワーク間（例えば、インターネット）、衛星リンクを含むネットワーク、およびピアツーピアネットワーク（例えば、アドホックピアツーピアネットワーク）が挙げられる。クライアントとサーバとの関係は、それぞれのコンピュータ上で実行され、互いにクライアント−サーバ関係を有するコンピュータプログラムによって生じ得る。

図１０は、プロセッサ１０１０、メモリ１０２０、記憶装置１０３０、および入出力装置１０４０を含む例示的なコンピュータシステム１０００を示す。各構成要素１０１０、１０２０、１０３０、１０４０は、例えばシステムバス１０５０によって相互接続することができる。プロセッサ１０１０は、システム１０００内での実行のための命令を処理することができる。いくつかの実施態様では、プロセッサ１０１０は、シングルスレッドプロセッサ、マルチスレッドプロセッサ、または別のタイプのプロセッサである。プロセッサ１０１０は、メモリ１０２０または記憶装置１０３０に格納された命令を処理することができる。メモリ１０２０および記憶装置１０３０は、システム１０００内に情報を格納することができる。

入出力装置１０４０は、システム１０００に対する入出力動作を提供する。いくつかの実施態様では、入出力装置１０４０は、１つ以上のネットワークインターフェース装置、例えばイーサネット（登録商標）カード、シリアル通信装置、例えばＲＳ−２３２ポート、および／または無線インターフェース装置、例えば８０２．１１カード、３Ｇ無線モデム、４Ｇ無線モデムなどを含み得る。いくつかの実施態様では、入出力装置は、入力データを受信し、出力データを他の入出力装置、例えばキーボード、プリンタおよび表示装置１０６０に送信するように構成されたドライバ装置を含むことができる。いくつかの実施態様では、モバイル計算装置、モバイル通信装置、および他の装置を使用することができる。

応用例
本明細書に記載の実施態様は、対象における生物学的状態を示す様々な核酸配列の検出および定量化を含む、様々な異なる適用において使用することができる。いくつかの場合において、核酸配列の検出および定量は、特定の生物学的または病原性プロセス、特定の疾患の特定の進行、または他の何らかの生物学的状態に関する洞察を提供することができる。

様々な応用例を、以下および実施例のセクションでより詳細に論じる。
医療関連感染（ＨＡＩ）の検出
医療関連感染（ＨＡＩ）および薬剤耐性病原体の出現は、医療上の大きな問題である。任意の所与の日に、２５人の入院患者の１人が感染し、９人中１人が死に至る。ＨＡＩは、入院期間の延長、長期にわたる障害、および新しい抗菌薬の需要から生じる重大な社会経済的負担を招く。米国では、毎年６０万人を超える患者がＨＡＩを発症し、ＨＡＩ関連の費用は総計年間１０００億〜１５００億ドルになると推定されている。病原菌の迅速かつ高感度の検出により、適切な抗生物質による治療の適時開始が可能になり、疾患の広がりを防ぎ、病院、家庭および他の場の設定における感染源を特定することができるようになる。

本明細書に記載された１つ以上の実施態様は、迅速で費用効果の高いＨＡＩの診断を可能にする。いくつかの実施態様では、検出プローブが標的の細菌の核酸を認識するとき、機器が蛍光異方性の変化を計測する。検出はレシオメトリックであり、蛍光強度に依存せず、アッセイを環境因子に対してロバストにする。

さらに、いくつかの実施態様では、複数レベルのオンサイトでのＨＡＩの診断が可能である。例えば、実施態様は、（ｉ）サンプルの調製およびマルチウェル検出のための使い捨てカートリッジを備えたコンパクトディスク、（ｉｉ）洗浄ステップを伴わない核酸増幅および検出を行うアッセイ、（ｉｉｉ）アッセイプロトコルにおける埋め込まれた汚染制御、（ｉｖ）細菌負荷、病原体のタイプ、抗生物質の耐性および病原性を評価するための配列特異的プローブのライブラリーを含み得る。

例えば、本明細書に記載のシステムは、グラム陰性大腸菌、肺炎桿菌、アシネトバクター・バウマンニ、シュードモナス・エルジノーサおよびグラム陽性黄色ブドウ球菌を含むが、これらに限定されない臨床関連のＨＡＩ病原体を検出するために使用することができる。このシステムは、単一の細菌レベルまでの感度を検出し、薬物耐性を判定し、および／または病原性の状態を判定するために使用できる。本明細書に記載されるシステムは、細菌培養物に匹敵する検出精度を達成するために使用され得る。本明細書に記載されるシステムは、細菌培養物に比べて送達時間をはるかに短い（約２時間）ものにでき、また現場で操作することを可能にし得る。

癌の検出
病原菌の検出に加えて、システムの実施は、癌突然変異の検出に拡大することができる。実証するために、本発明者らは、癌の突然変異を識別すべく対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応を使用し、エキソソームＲＮＡに存在する突然変異を標的としており、これは細胞のＤＮＡよりも癌患者の縦断的なモニタリングに適している場合がある。さらに、識別力を向上させるために、対立遺伝子特異的プライマーの３’末端から２番目の塩基に追加のミスマッチが導入された。システムと組み合わせたこの戦略を用いて、エキソソームＲＮＡの癌突然変異を成功裏にプロファイリングした。さらに、エキソソームの突然変異状態が、細胞ゲノムＤＮＡで得られたものと良好に相関していることを確認した。

実施例
以下の実施例において本発明をさらに記載する。実施例は、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１−ＨＡＩの検出
ＲＮＡ抽出装置の作製：
装置は、射出成形によってプラスチックで作られた。型の金属ブロックは、最初に、チャネル、チャンバ、およびポートなどの表面構造がプラスチック製カートリッジの上部および下部にある構造に対して消極的に形作られるように機械加工した。マイクロビーズをＲＮＡ捕捉チャンバに閉じ込めるために、チャンバの出口側に堰の形状の物理的バリアを設計した。装置の上部と下部を鋳造工場（Ｋｏｒｅａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ＆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）にて射出成形した。毎分２つを超える装置が製造された。上部と下部を接着し、三方弁を挿入した。流体接続は、ポリエチレンチューブを流体ポートに挿入することによって行われた。

ＲＮＡ抽出装置の作製
流体カートリッジをガラスビーズ（直径約３０μｍ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）で充填した。ビーズをエタノール（７５％；Ｓｉｇｍａ）に懸濁し、入口から導入した。ビーズは、チャンバの出口側の堰式物理的バリアにＲＮＡ捕捉チャンバ内に保持された（図７Ａおよび図７Ｂ参照）。ビーズ捕捉後、過剰のエタノールを回収し、除去した。次いで、装置全体にＲＮａｓｅＺａｐ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＲＮａｓｅフリー水（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびエタノールを繰り返し流して、乾燥させた。すべての流体流は、手動でシリンジを操作することによって生成された。

検出用機器
光学的立方体の照明源は、発光ダイオード（ＬＥＤ；λ＝４７０ｎｍ；Ｔｈｏｒｌａｂｓ）、二色性フィルム偏光子（偏光効率＞９９％；Ｔｈｏｒｌａｂｓ）および凸レンズ（焦点距離ｆ＝８ｍｍ）を含んでいた。検出部は凸レンズ（ｆ＝８ｍｍ）、ロングパスフィルター（ＥＬ０５００；Ｔｈｏｒｌａｂｓ）、二色性フィルム偏光子、およびフォトダイオード（Ｓ１２２３、浜松）を有していた。変調された制御信号をカスタム設計のＬＥＤドライバ（ＬＦ３５６、Ｔｅｘａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）に供給するために、１６ビットのデジタル／アナログコンバータ（ＬＴＣ１５９７；Ｌｉｎｅａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用した。フォトダイオードからの信号は、特注の電流増幅器（ＡＤ５４９；Ａｎａｌｏｇ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって増幅された。ロックイン検出のために、増幅された信号をバンドパスフィルタ（中心周波数１ｋＨｚ、帯域幅１００Ｈｚ）に通し、搬送波信号と混合し、ローパスフィルタ（時定数１ｍｓ）を通過させた。調整された信号は、１６ビットのアナログデジタルコンバータ（ＬＴＣ１８６７；Ｌｉｎｅａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によりデジタル化した。マイクロコントローラ（Ａｒｄｕｉｎｏ ＭＥＧＡ ２５６０）は、ＵＳＢ ２．０またはＢｌｕｅｔｏｏｔｈインターフェースを介して、多重化のため光源を制御し、リアルタイムでのデータ記録を実行し、外部の装置（コンピュータ、スマートフォン）と通信するようにプログラムした。システム全体は、基地局の内部に収納された９Ｖバッテリで動力の供給をした。単一の光学測定（１つの立方体）での典型的な電力消費は約４００ｍＷであり、各試験に約３０秒かかった。

図１１Ａは、例示的な電流増幅回路（ＡＤ５４９；Ａｎａｌｏｇ Ｄｅｖｉｃｅｓ）、アクティブバンドパスフィルタ、アナログロックイン回路（ＡＤ６３０；Ａｎａｌｏｇ Ｄｅｖｉｃｅｓ）、およびローパスフィルタを示す。図１１Ｂは、構成可能な８チャネルアナログ入力マルチプレクサ（ＭＵＸ）を備えた１６ビットのアナログデジタルコンバータ（ＬＴＣ１８６７；Ｌｉｎｅａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の例を示している。図１１Ｃは、変調された制御信号をＬＥＤドライバに送達するための１６ビットのデジタルアナログコンバータ（ＬＴＣ１５９７；Ｌｉｎｅａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の例を示している。

スマートフォン用アプリ
システムの操作とデータの記録を容易にするために、カスタム設計のＡｎｄｒｏｉｄ Ａｐｐを作製した。制御ソフトウェアは、ＭＩＴ Ａｐｐ Ｉｎｖｅｎｔｏｒ ２を使用して設計した。アプリは、システムとスマートフォンを接続し、蛍光異方性検出のためのトリガ信号を送信した。測定されたデータを電話機に送り返して、タイムスタンプとＧＰＳ座標を組み合わせた。

信号の検出
蛍光異方性値は、励起波長を４７０ｎｍ、発光波長を５２５ｎｍでそれぞれ測定した。蛍光異方性（ｒ）は、以下の式を用いて計算した。

ｒ＝（Ｉ_x−Ｉ_y）（Ｉ_x＋２Ｉ_y）^-1
式中、Ｉ_xは放出偏光子が励起偏光子と平行である場合、Ｉ_yは放出偏光子が励起偏光子と垂直である場合の放出強度であった。検出限界（ＬＯＤ）は、細菌のないサンプルのバックグラウンド信号よりも高い３倍の標準偏差（ｓ．ｄ．）で閾値を設定することによって推定した。ベンチトップ型装置（Ｓａｐｐｈｉｒｅ ２；Ｔｅｃａｎ）との比較のために、Δｒ＝ｒ−ｒ_FAMを測定し、それにおいてｒ_FAMがＦＡＭ−ＤＮＡ（６２．５ｎＭ）の存在下のみの蛍光異方性であり、ｒがそのテンプレートと共にＦＡＭ−ＤＮＡ（６２．５ｎＭ）が存在している中での蛍光異方性であった。異なる量のハイブリダイズしたＦＡＭ−ＤＮＡを生成するために、テンプレートの濃度（１０、２０、３０、４０、５０および６０ｎＭ）を変化させた。

プローブの設計
ＤＮＡのオリゴヌクレオチドを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成した。ＤＮＡ配列のリストを表１、２、３および４に要約する。

病原性細菌の一般的および種特異的検出のために、異なる細菌属（ＮＣＢＩヌクレオチドデータベース由来）の個々の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列をＭｅｇＡｌｉｇｎソフトウェア（ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて整列させ、保存および可変領域の両方を標的配列として選択した。抗生物質耐性および病原性因子の検出のために、（ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースからの）ｎｕｃ、ｆｅｍＢ、ｍｅｃＡおよびＰａｎｔｏｎ−Ｖａｌｅｎｔｉｎｅロイコシジン（ＰＶＬ）の特定の領域を標的配列として選択した。検出キーは、一本鎖捕捉配列（長さ２０〜２５ヌクレオチド）によって連結されるヘアピン構造を有するように設計された。

マスターミックスの凍結乾燥：
検出キー（４００ｎＭ）、レポーター（１５０ｎＭ）、プライマー（１５０ｎＭ）およびＦＡＭ標識ＤＮＡ（１２５ｎＭ）を２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、および６ｍＭのＭｇＣｌ_２中で混合することで、オールインワンＰＡＤミックス（２０μＬ）を作り出した。この混合物を最初に液体窒素にて凍結させた後、Ｖｉｒｔｉｓ Ｆｒｅｅｚｅｍｏｂｉｌｅ ２５ＥＬ Ｆｒｅｅｚｅ Ｄｒｙｅｒ（ＳＰ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で乾燥させた。凍結乾燥した試薬を室温で保存し、使用前に、２０μＬのＵｌｔｒａ ｐｕｒｅ ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー蒸留水（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加することにより再構成した。

培養された細菌の実験：
すべての細菌は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。細菌培養物をベンダー推奨培地の対数期中期まで増殖させた：Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の大腸菌（＃２５９２２）、トリプシン大豆ブロス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のシュードモナス・エルジノーサ（＃１４２）、肺炎桿菌（＃４３８１６）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（＃ＢＡＡ−１７２０および＃ＢＡＡ−１７０７）、ニュートリエントブロス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のアシネトバクター・バウマンニ（＃１５１４９）、ブドウ球菌のブロス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の黄色ブドウ球菌（＃２５９２３）。遠心分離（６０００ｇ、１０分）により細菌を回収し、予め加熱したＴｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でペレットを再懸濁した。再懸濁した細胞を、滅菌した破砕ビーズ（０．１ｍｍ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を入れた２ｍＬ Ｓａｆｅ−Ｌｏｃｋチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に移し、ボルテックスミキサーを用いて溶解させた。遠心分離後、上清を新しいチューブに移した。

ＲＮＡの抽出
同体積のエタノールと混合した細菌溶解物をＲＮＡ抽出チャンバに流し、そこでＲＮＡを充填ガラスビーズで捕捉した。Ｄｉｒｅｃｔ−ｚｏｌ ＲＮＡ ＰｒｅＷａｓｈ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）およびＲＮＡ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いたその後のフラッシングを利用して、微量の不純物およびカオトロピック塩を除去した。最後に、ＲＮａｓｅフリーの水においてＲＮＡを溶出させた。流体カートリッジと市販のカラム（Ｚｙｍｏ−ＳｐｉｎＴＭ Ｃｏｌｕｍｎ、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）との比較のために、細菌溶解物を２つのアリコートに分けた。１つのサンプルを市販のカラムで処理し、もう１つを流体カートリッジで処理した。電気泳動アッセイ（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ、２１００；Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して、抽出されたＲＮＡの品質を確認した。キットに提供されたＲＮＡ分子量ラダー（ＲＮＡ ６０００ナノチップ；Ａｇｉｌｅｎｔ）を基準として使用し、電気泳動操作を製造業者のプロトコルごとに行った。この分析では、１〜１０の範囲のＲＮＡ完全性番号（ＲＩＮ）をサンプルに割り当てており、１は相当分解されたＲＮＡを示し、１０は完全にインタクトなＲＮＡを示す。

システムのアッセイ
一本鎖ｃＤＮＡは、ＰｒｏｍｅｇａのＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍでランダムプライミングを用いて、製造業者のプロトコルに従って合成した。次いで、２．５μＬのｃＤＮＡ、０．８μＭの過剰なプライマーおよび０．０８μＭの制限プライマー（表４参照）、１×ＰＣＲ反応緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、および２または３ｍＭのＭｇＣｌ_２）、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ、０．４ｍＭのｄＵＴＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ＵのＡｎｔａｒｃｔｉｃ Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ ＵＤＧ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）および２．５ＵのＭａｘｉｍａ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有する２５μＬの総反応容量で、非対称ＰＣＲ増幅を行った。小型サーモサイクラー（ＭｉｎｉＰＣＲ；Ａｍｐｌｙｕｓ）での非対称ＰＣＲのために、以下のサイクリング条件を使用した：２５℃で１０分間および９４℃で４分間；９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間の３５サイクル；および７２℃で１０分間の拡張ステップ。ベンチトップ型サーモサイクラー（ＭａｓｔｅｒＣｙｃｌｅｒ；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて、反応条件は２５℃で１０分間、９４℃で４分間；９４℃で５秒間、５６℃で１５秒間、および７２℃で１５秒間の３５サイクル；７２℃で最終１０分間であった。２０μＬのＰＣＲ溶液を、室温で１５分間、テンプレート（７５ｎＭ）、プライマー（７５ｎＭ）およびＦＡＭ標識ＤＮＡ（６２．５ｎＭ）で予め形成された検出キー（２００ｎＭ）およびレポーターからなる一体型ＰＡＤミックスと混合し、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、および４ｍＭのＭｇＣｌ_２で総容量が４０μＬとなるようにした。

キャリーオーバー汚染のＵＤＧ媒介制御
キャリーオーバー汚染を模倣するために、ｄＵＴＰ含有増幅産物（キャリーオーバー汚染物質）を新しい反応サンプルに添加した。キャリーオーバー汚染物質のコピー数は約１０７であった。ＰＣＲ反応後の単一のエアロゾルは、典型的には１０６もの増幅産物を含む（２６）。等量の制限プライマーおよび過剰なプライマーを使用したことを除いて、上記で概説したのと同じ手順に従ってｄＵＴＰ含有アンプリコンを調製した。得られたアンプリコンを、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ回収キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて精製し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ １０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて２６０ｎｍで吸光度を測定することによって定量した。コピー数は、変換係数２６ｋＤａ／アンプリコンに基づいて推定した。

臨床サンプル
本研究はＰａｒｔｎｅｒｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄによって承認された。過剰なサンプルおよび廃棄されたサンプルは、感染した体液または膿瘍について臨床的疑念のある９人の対象から採取され、ドレナージについて言及された。検体は、ＭＧＨ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｒａｄｉｏｌｏｇｙの医師による日常的な画像誘導アプローチを用いて収集し、ＰＡＤアッセイによって盲目的に分析した。検体（５００μＬ）をＴｒｉｚｏｌよりも濃縮されたＴｒｉｚｏｌ ＬＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１．５ｍＬと混合し、純粋な細菌培養と同じＲＮＡ抽出手順を適用した。

電気泳動バンドシフト実験
２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、および４ｍＭのＭｇＣｌ_２に１００または２００ｎＭの検出キー、ＰＣＲ産物および１２．５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有する溶液を、室温で２０分間インキュベートした。この溶液を６×添加緩衝液と混合し、２０％ポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で電気泳動に供した。分析は、１×ＴＢＥ（１００ｍＭのトリス、９０ｍＭのホウ酸塩、１ｍＭのＥＤＴＡ）で、１５０Ｖで１６０分間、４℃で実施した。ＧｅｌＲｅｄ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）染色の後、ＵＶトランスイルミネーターを用いてゲルをスキャンした。ＤＮＡポリメラーゼは、色素による蛍光も、染色もされなかった。

定量的リアルタイムＰＣＲ
インビトロで培養した細菌または臨床サンプル由来のｃＤＮＡを、１ｘＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒミックス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＰＡＤアッセイに使用した０．４μＭ特異的プライマーと混合した。その後、ＵＤＧ活性化（５０℃、２分）、開始（９５℃、２分）；４０サイクルの変性（９５℃、５秒）；アニーリング（５６℃、１５秒）；拡張（７２℃、３０秒）という条件で、７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で熱循環を実施した。７５００ Ｆａｓｔソフトウェアが、蛍光信号が所与の一様な閾値の信号を超える最初のＰＣＲサイクルを表すＣｔ値を自動的に計算する。テンプレートなしの対照（ＮＴＣ）は検出されず、確立された閾値を４０サイクルにわたって交差させず、Ｃｔ値４１が任意に得られた。ΔＣｔは、ＮＴＣのＣｔ値から検体のＣｔ値を引くことによって得た（２８）。

この例では、市販のプレートリーダ（Ｓａｐｐｈｉｒｅ ２、Ｔｅｃａｎ）に対してシステムをベンチマークテストにかけた。異なる蛍光異方性のサンプルを調製するために、遊離のフルオレセイン標識ＤＮＡ（ＦＡＭ−ＤＮＡ；高蛍光異方性）とテンプレート結合ＦＡＭ−ＤＮＡ（低異方性）との比を変えた。観察されたｒの値は、図１２に示すように、プレートリーダとシステムとの間の優れた一致（Ｒ₂＞９９％）を示し、システムの精度を確認するのに役立った。

細菌量を測定するユニバーサルキー
一部の応用で、複数の異なる生物学的粒子（例えば、病原体）を検出するための「ユニバーサル検出キー」を設計してもよい。すなわち、このシステムは、複数の異なる生物学的粒子にわたって共通している特定の標的核酸配列を検出することができる単一の検出キーと共に使用することができる。異なる細菌種における１６Ｓ ｒＲＮＡの保存領域を標的とするように設計された単一のユニバーサルキー（ＵＮＩキー）の例を表１に示す（図１Ｂも参照）。

場合によっては、共通レポータープローブを設計することも可能である。例えば、共通レポータープローブを、様々な異なる検出標的のために使用することができる。ＦＡＭ−ＤＮＡ、そのプライマーおよびテンプレートを含む例示的な共通レポータープローブを図１Ｂに示す。システムの出力はΔｒ＝ｒ−ｒ₀と定義され、この場合ｒ₀はＤＮＡポリメラーゼとレポーターのみを含有する対照サンプルの蛍光異方性である。

代表的なＨＡＩ病原体（大腸菌、肺炎桿菌、アシネトバクター・バウマンニ、シュードモナス・エルジノーサ、および黄色ブドウ球菌）を検出するために、設計されたアッセイ（ＵＮＩ−ＰＡＤ）を適用した。異なる細菌種間で、濃度が一致したサンプルにおいて一貫したΔｒの値が得られた（一元配置分散分析、Ｐ＝０．８８５７、図１３参照）。図１３に示すように、異なるＨＡＩ病原体（１０^６ＣＦＵ／ｍＬ）がシステムで検出された。信号のレベルは、濃度が一致した細菌サンプル間で統計的に同一であった。この結果は、ＵＮＩ−ＰＡＤを使用して総細菌量を推定することを支持した。

次に、連続的に希釈した細菌サンプルを用いて滴定実験を行った（図１４参照）。図１４に示すように、異なる細菌濃度（大腸菌、１０^−１〜１０^８ＣＦＵ／ｍＬ）を有するサンプルを、連続希釈によって調製した。検出の限界は、単一細菌のレベルであった。ＣＦＵ、コロニー形成単位。閾値は、細菌を含まないサンプルのバックグラウンド信号より高い３×ｓ．ｄ．に設定した。このアッセイは、＞１０^４コロニー形成単位（ＣＦＵ）に亘るダイナミックレンジを達成した。検出の限界は一桁のＣＦＵにまで下がった。

すべての実験を３回実施した。グラフは平均±ｓ．ｄ．として表示する。
ポイントオブケア操作のためのアッセイ
本明細書で説明するシステムは、ポイントオブケア（ＰＯＣ）に応用するためにも使用することができる。ＰＯＣ核酸検査における１つの主要な問題は、ＰＣＲ産物によるサンプルの汚染（例えば、キャリーオーバー汚染）によって引き起こされる偽陽性を制御することである。このような影響を最小限に抑えるために、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）法を採用した。ＰＣＲの間にデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）をデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）に置換することにより、すべてのアンプリコンをウラシル含有ＤＮＡ骨格にすることができた。ＵＤＧを適用し、これらのアンプリコンを切断した。それは、真正のＤＮＡテンプレートを保持しながら、ＰＣＲ反応からのキャリーオーバー汚染物質を選択的に破壊した（図１５参照）。この方法がアッセイと適合することが確認された。ｄＵＴＰがＤＮＡ標的においてｄＴＴＰを置換した場合、信号レベルは同じままであった（図１６参照）。図１６に示すように、ｄＴＴＰを使用した元のアッセイ条件（左）と比較して、ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置き換えた場合（右）に差異は認められなかった。認められた両方の場合のΔｒ値は統計的に同一であった（両側ｔ検定、Ｐ＞０．９９）。

次に、この汚染制御の有効性を検証した。キャリーオーバー汚染物質として、ｄＵＴＰ含有ＰＣＲ産物（１０７アンプリコン）をサンプルに添加した。ＵＤＧ処理なしでは、細菌標的のない陰性対照は偽陽性を示した（図１７参照）。この信号はＵＤＧの添加により排除され、真の細菌標的を含むサンプルのみが高値Δｒを示した（図１７参照）。

システムの可搬性を最大限にするために、さらに小型サーモサイクラー（ＭｉｎｉＰＣＲ；Ａｍｐｙｌｕｓ）とシステムを組み合わせた。ＰＯＣシステムの性能は、従来のベンチトップ型装置の性能と一致した（図１８参照）。図１８に示すように、ベンチトップ型装置とＰＯＣ−ＰＡＤの性能は統計的に同一であった（両側ｔ検定、Ｐ＞０．６９）。

また、輸送および保管を容易にするために、すべての化学試薬（検出キー、レポーターなど）を凍結乾燥した。試薬は、周囲条件下で２週間以上保存した後も、その活性を保持していた。新鮮な薬剤と保存した薬剤（図１９および図２０参照）で、統計学的に同一のΔｒ値（両側ｔ検定、Ｐ＞０．６４）が認められた。すべての実験を３回実施し、データは平均±ｓ．ｄ．として表示した。

病原体分類のためのディファレンシャルキー
いくつかの場合、異なる検出キー（ＨＡＩキー）のセットを、ＨＡＩを引き起こす病原体を識別するために設計することができる。一例では、各キーは、異なる細菌種において１６Ｓ ｒＲＮＡの超可変領域を標的とするように設計されてもよい。ディファレンシャル検出キーが設計された細菌種の例を表２に示す。

属種間の配列相同性は、非特異的結合を最小にするために＜５０％に保たれた。検証時、ＨＡＩキーは特異度が高いと推測された。例えば、大腸菌類のキー（図２１参照）は意図された標的でのみ高信号（Δｒ）を示し、一方で標的外への信号は高生物学的バックグラウンド（他の細菌種の１０^６ＣＦＵ、図２２参照）でも無視できるものであった。同様に、他のＨＡＩキーは、最小限のクロストークで優れた特異度を示した（図２３参照）。電気泳動バンドシフト分析は、相補的な標的アンプリコンの存在下で検出キーがＤＮＡポリメラーゼに結合し、その触媒活性を阻害することを確認した（図２４参照）。図２４に示すように、レーンＡ：アンプリコンのみ、レーンＢ：アンプリコンと新たなバンドを製造した検出キーとの結合、レーンＣ：アンプリコンと検出キーのハイブリッド用のバンドにシフトしたＢにＤＮＡポリメラーゼを追加したもの、を産生した。これにより、検出キーとＤＮＡポリメラーゼとの間の結合が確認された。

次に、さらなる細菌表現型検査のために、抗生物質耐性および病原性（ＡＲＶキー）用のプローブを調製した。これらのキーは、病原体に抗生物質耐性をもたらしたり、病原体を高度に病原性にしたりする細菌遺伝子を標的とした。モデルのシステムとして、ｍｅｃＡ、ＰＶＬ、ｎｕｃおよびｆｅｍＢ遺伝子のサンプルをプロファイリングした。ｍｅｃＡは、共通の多剤耐性ＨＡＩ病原体である黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に対するメチシリン耐性を付与する決定因子である。ＰＶＬ、ｎｕｃおよびｆｅｍＢは、黄色ブドウ球菌の病原性に寄与する病原性因子である。医療関連感染ＭＲＳＡ（ｍｅｃＡ＋、ＰＶＬ−）および市中感染型ＭＲＳＡ（ｍｅｃＡ＋、ＰＶＬ＋）という既知の遺伝子型を有する２つの代表的なＭＲＳＡ株を使用した。対照サンプルは、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）（ｍｅｃＡ−）、大腸菌（ｍｅｃＡ−、ＰＶＬ−、ｎｕｃ−、ｆｅｍＢ−）およびシュードモナス・エルジノーサ（ｍｅｃＡ−、ＰＶＬ−、ｎｕｃ−、ｆｅｍＢ−）（表３参照）であった。

ＡＲＶ−ＰＡＤは、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）（図２４、図２５Ａおよび図２５Ｂを参照）とよく合致しており、正確に遺伝子型同定された細菌である。図２５Ａに示すように、細菌種におけるｍｅｃＡ、ＰＶＬ、ｎｕｃおよびｆｅｍＢのリアルタイムＰＣＲ検出を行った。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎアッセイを使用した。ＰＡＤアッセイとｑＰＣＲのアッセイの比較を図２５Ｂに示す。

臨床での応用
本明細書に記載のシステムは、臨床的なＨＡＩの診断にも使用することができる。例えば、本明細書に記載されるシステムは、特定のＨＡＩ病原体の存在、全細菌負荷（例えば、ユニバーサルキーを用いる）、または抗生物質耐性／病原性状態を同定するために使用され得る。アッセイは、細菌溶解から開始し、続いてプラスチック製カートリッジを用いて核酸を回収した。核酸増幅後、全細菌負荷（ＵＮＩキー）、ＨＡＩ病原体（ＨＡＩキー）、および抗生物質耐性／病原性状態（ＡＲＶキー）について、サンプルを並行して分析した（図２６参照）。総アッセイ時間は約２時間であり、必要なサンプルの容量は約４０μＬであった。

患者サンプルを採取し、臨床微生物学実験室でシステムの検査（２時間）と従来の培養（３〜５日）に分けた。すべての検出キー（ＵＮＩ、ＨＡＩ、ＡＲＶ）の検査結果を図２７および図２８に示す。図２７に示すように、細菌量（ＵＮＩ）、ＨＡＩ種（ＨＡＩ）の存在および耐性／病原性状態（ＡＲＶ）について、異なる患者からの９つのサンプルをシステムによって処理した。また、臨床サンプルを臨床病理検査室（培養およびｑＰＣＲ）によって検証した。ＰＡＤと病理学的報告は互いに合致した。ＵＮＩ−ＰＡＤ陰性のサンプルもまた、ＨＡＩ−ＰＡＤでは陰性であり、サンプルのトリアージのためのユニバーサルな検出の可能な使用を示唆している。６つのＵＮＩ−ＰＡＤ陽性サンプルのうち、ＨＡＩ−ＰＡＤは５つのサンプルのＨＡＩ病原体を検出し、その識別の結果は細菌培養情報と一致した。１人の患者（Ｎｏ．６）は細菌量で陽性であったが、ＨＡＩキーで陰性であった。その患者は後でプロビデンシア・レットゲリ（現在のＨＡＩ−ＰＡＤでは標的とされていない）に感染していることが判明した。黄色ブドウ球菌陽性のサンプル（患者番号２）について、ＡＲＶ−ＰＡＤはｍｅｃＡ−状態（すなわち、ＭＳＳＡ）を示した。この結果は、ＭＲＳＡ陰性病理報告およびｑＰＣＲと一致した（図２８および図２９参照）。

考察
医療関連感染（ＨＡＩ）は、現代の医療において遍在し、扱いにくい費用のかかる問題となっている。ＨＡＩにより抗生物質耐性の出現が増加し、重大な罹患率および死亡率になり、入院が延長する。この風土病をコントロールするための重要な任務の１つは、地元の病院やコミュニティセンターに、より効果的なモニタリングシステムを備えさせることである。本明細書で説明されるシステムの実施態様は、それらの設定において迅速なＨＡＩ検出を可能にすることができる。検出システムは、操作の複雑さを最小限に抑えてコンパクトで使いやすいものである。このアッセイは包括的であり、細菌の全体的な負荷、病原体の種類、抗生物質の耐性および病原性の因子を評価する。

いくつかの機能により、システムは現場での操作に理想的である。第１に、センシングスキーム（蛍光異方性）は、環境的なノイズに対して本質的にロバストである。さらに、感度を大幅に向上させる光学ロックイン技術を採用した。第２に、アッセイの流れは最小限の複雑さと実習時間を伴う。処分できるプラスチック製のチップを使用して核酸を回収し、残りの工程を洗浄ステップなしで単一の管で行う。アッセイプロトコルはまた、キャリーオーバー汚染物質を自動的に溶解するように洗練され、それによって偽陽性を最小化する。第３に、プラットフォームは非常に手頃な価格である。このシステムは、比較的単純な電子部品を有し、並列検出のために容易に拡張することができる。射出成形されたカートリッジを作ることは、高性能の再現性、少ないサンプル間の相互汚染、低コストなどの利点をもたらす。最後に、システムは包括的なスクリーニングのためにスケーラブルである。共通蛍光レポーターをすべての検出標的に使用することができるため、検出および信号プローブの分離は、このようなアッセイを費用対効果の高いものにし得る。すでに３５種類超の標的について検出プローブを設計している（表２参照）。増加性のアッセイのコストは比較的低い。

パイロット臨床試験では、システムの精度は細菌培養の精度と同等であった。培養とは対照的に、システムのアッセイは速く（約２時間）、多重化され、費用効果があった。

場合によっては、システムは独立型の閉鎖型システムとすることができ、サンプルの調製、サーモサイクリング、および検出機能はすべて１つの装置に収容することができる。このようなシステムは、サンプルの汚染、使用者の干渉またはその両方からの誤った結果を効果的に排除し、「サンプル・イン・アンド・アンサー・アウト」の試験を提供することができる。場合によっては、特にＤＮＡの増幅のためにアッセイ時間を短縮することができる。例えば、５分以内に全ＰＣＲ反応を完了させることができる光量子サーモサイクリングシステムを使用することができる。等温増幅もまた使用することができる。いくつかの等温反応は、２０分で完了することができ、これは、総アッセイ時間を＜１時間まで短くさせ得る。等温増幅を使用すると、ハードウェアの要件を簡素化でき、バッテリ駆動装置を使用可能にすることができる。さらに、試験ライブラリーは、より広範な病原体および抗生物質耐性スクリーニングに対して期待することができる。システムのプローブのモジュラー特性は、宿主応答因子（例えば、インターロイキン−４、血小板由来増殖因子−Ｂ鎖、単球走化性タンパク質−１、およびＣＸＣモチーフケモカイン１０）（２３）ならびに他のウイルス性、真菌性および寄生性のマーカーなどのさらなる標的の組み込みを容易にすることができる。

実施例２−癌の検出
図３０に、この実施例で使用された細胞およびそれらのそれぞれの変異の状態を要約している。癌突然変異の検出のために、アレル特異的ＰＣＲを用いて癌突然変異を識別した。アレル特異的ＰＣＲのキーは、３’末端が突然変異体サンプルにおいてのみ完全に一致するプライマーである。しかし、アレル特異的ＰＣＲ技術の潜在的な限界は、低い識別力であり、野生型サンプルにおける誤った増幅のために誤った陽性信号をもたらし得る。

この低い識別力を改善するために、Ｎ−２位での追加のミスマッチがプライマーに導入された。図３１に示すように、プライマーが追加のＮ−２ミスマッチを含む場合、野生型サンプルにおける誤った増幅は、変異サンプル（Ｇ１２ＤおよびＧ１２Ｖ）における増幅反応を妨害することなく有意に抑制されることが認められた。これは、非特異的増幅を大幅に減少させることによってＡＳＰＣＲの識別能力を劇的に増加させた。

この改変されたアレル特異的ＰＣＲ技術をＰＡＤシステムで用いた。説明したように、増幅産物は突然変異サンプルの存在下でのみ産生され、結果的に高い蛍光異方性の値を誘導した。この戦略に基づいて、癌細胞およびエキソソームにおける突然変異状態がプロファイリングされた。図３２は、細胞における体細胞突然変異（５×１０^４細胞に相当するＤＮＡ量）およびそれらの分泌エキソソーム（１０^９のエキソソームに相当するｃＤＮＡ量）のプロファイリングを示す。予想通り、突然変異サンプル（ＡＳＰＣ１、ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６、およびＨＴ２９）のみが高い蛍光異方性値を示し、一方で増幅産物を産生しなかった野生型サンプル（ＳＫＢＲ３）が低い蛍光異方性値を示した。ＧＡＰＤＨは、検査されたすべての細胞において常に発現されるハウスキーピング遺伝子として使用された。

図３１に示すように、特異度を向上させるために、対立遺伝子特異的プライマーの３’末端から２番目の塩基に追加のミスマッチを導入した。これは、非特異的増幅を大幅に減少させることによってＡＳＰＣＲの識別能力を劇的に増加させた。

図３２は、細胞における体細胞突然変異（５×１０^４細胞に相当するＤＮＡ量）およびそれらの分泌エキソソーム（１０^９のエキソソームに相当するｃＤＮＡ量）のプロファイリングを示している。

複数の実施形態を記載してきた。それにもかかわらず、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更がなされ得ることが理解されるであろう。したがって、他の実施形態は、添付の特許請求の範囲内にある。

Claims (5)

1. サンプルの標的核酸分子を検出する方法であって、
   （ａ）サンプルを第１の反応液および第２の反応液とインキュベートするステップであり、ここで前記第１の反応液が、
   （ｉ）複数の第１のＤＮＡポリメラーゼ分子、
   （ｉｉ）複数の第１の検出核酸分子であって、各第１の検出核酸分子が第１の標的核酸分子の第２の核酸配列に相補的な第１の核酸配列および前記第１のＤＮＡポリメラーゼ分子に特異的に結合する第１のアプタマーを含む、複数の検出核酸分子、および、
   （ｉｉｉ）複数の第１のレポーター分子であって、各第１のレポーター分子が第３の核酸配列、前記第１のレポーター分子の前記第３の核酸配列に結合した第１のプライマー分子、および前記第１のレポーター分子の前記第３の核酸配列に結合した第１のフルオロフォアを含む、複数の第１のレポーター分子を含み、
   前記複数の第１の検出核酸分子の各第１の検出核酸分子は、１つ以上の対応する第１の標的核酸分子とハイブリダイズするように構成されており、前記複数の第１のレポーター分子の各第１のレポーター分子について、前記複数の第１のＤＮＡポリメラーゼ分子は、前記第１のレポーター分子から前記第１のフルオロフォアを切断するように構成されており、
   各ハイブリダイズした第１の検出核酸分子は、前記第１のＤＮＡポリメラーゼ分子が不活性化されるように１つ以上の前記第１のＤＮＡポリメラーゼ分子に結合するように構成されており、前記第１のＤＮＡポリメラーゼ分子を不活性化することにより、前記第１のフルオロフォアの前記第１のレポーター分子からの切断が阻害され、
   前記第２の反応液が、
   （ｉ）複数の第２のＤＮＡポリメラーゼ分子、
   （ｉｉ）複数の第２の検出核酸分子であって、各第２の検出核酸分子が第２の標的核酸分子の第５の核酸配列に相補的な第４の核酸配列および前記第２のＤＮＡポリメラーゼ分子に特異的に結合する第２のアプタマーを含む、複数の第２の検出核酸分子、および、
   （ｉｉｉ）複数の第２のレポーター分子であって、各第２のレポーター分子が第６の核酸配列、前記第２のレポーター分子の前記第６の核酸配列に結合した第２のプライマー分子、および前記第２のレポーター分子の前記第６の核酸配列に結合した第２のフルオロフォアを含む、複数の第２のレポーター分子を含み、
   前記複数の第２の検出核酸分子の各第２の検出核酸分子は、１つ以上の対応する第２の標的核酸分子とハイブリダイズするように構成されており、
   各ハイブリダイズした第２の検出核酸分子は、前記第２のＤＮＡポリメラーゼ分子が不活性化されるように１つ以上の前記第２のＤＮＡポリメラーゼ分子に結合するように構成されている、ステップ、
   （ｂ）第１の励起光を前記サンプルに向けて前記第１のフルオロフォアによる第１の蛍光を誘導するステップであり、前記第１の励起光を前記サンプルに向けるステップは、
   第１の周波数を有する第１の搬送信号を生成することと、
   前記第１の搬送信号に基づいて前記第１の励起光を生成することとを含む、ステップ、
   （ｃ）前記第１の蛍光の異方性のレベルを測定するステップであり、前記第１の蛍光の異方性のレベルを測定するステップは、
   前記サンプルと光学的に連結される光検出器の第１の光検出信号を測定することと、
   第１のフィルタリングされた信号を得るための中心周波数として第１の周波数を有する第１のバンドパスフィルタを用いて前記第１の光検出器信号をフィルタリングすることと、
   第１の合成された信号を得るために第１のフィルタリングされた信号を第１の搬送信号と混合することと、
   第１の出力信号を得るためにローパスフィルタを用いて前記第１の混合された信号をフィルタリングすることと、
   前記第１の出力信号に基づいて前記第１の蛍光の異方性のレベルを判定することとを含む、ステップ
   、および、
   （ｄ）前記第１の蛍光の異方性のレベルに基づいて、前記サンプルの前記第１の標的核酸分子の存在または非存在を判定するステップ、
   （ｅ）第２の励起光を前記サンプルに向けて前記第２のフルオロフォアによる第２の蛍光を誘導するステップであり、前記サンプルに前記第２の励起光を誘導することは、
   第２の周波数を有する第２の搬送信号を生成することと、
   前記第２の搬送信号に基づいて前記第２の励起光を生成することとを含む、ステップ、
   （ｆ）前記第２の蛍光の異方性のレベルを測定するステップであり、前記第２の蛍光の異方性のレベルを測定するステップは、
   前記サンプルと光学的に連結される光検出器の第２の光検出信号を測定することと、
   第２のフィルタリングされた信号を得るための中心周波数として第２の周波数を有する第２のバンドパスフィルタを用いて前記第２の光検出信号をフィルタリングすることと、
   第２の合成された信号を得るために第２のフィルタリングされた信号を第２の搬送信号と混合することと、
   第２の出力信号を得るためにローパスフィルタを用いて前記第２の混合された信号をフィルタリングすることと、
   前記第２の出力信号に基づいて前記第２の蛍光の異方性のレベルを判定することとを含む、ステップ
   、および、
   （ｇ）前記第２の蛍光の異方性のレベルに基づいて、前記サンプルの前記第２の標的核酸分子の存在または非存在を判定するステップ、を含み、
   前記第１の励起光が第１の波長を備え、前記第２の励起光が前記第１の波長とは異なる第２の波長を備える、または
   前記第１の蛍光が第１の波長の光を含み、前記第２の蛍光が前記第１の波長とは異なる第２の波長の光を含む、方法。
2. 前記第１の励起光を前記サンプルに向けるステップが、第１の偏光を前記サンプルに向けるステップを含む、および／または前記第１の蛍光の異方性のレベルを測定するステップが、
   第１の偏光を有する第１の蛍光を検出することと、
   前記第１の偏光とは異なる第２の偏光を有する第１の蛍光を検出することと、
   前記第１の偏光を有する前記検出された第１の蛍光および前記第２の偏光を有する前記検出された第１の蛍光に基づいて、前記第１の蛍光の異方性のレベルを判定することと、を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記サンプルの前記第１の標的核酸分子の存在または非存在を判定するステップは、
   前記測定された前記第１の蛍光の異方性のレベルが第１の閾値以上であると判定するステップ、および、
   前記測定された前記第１の蛍光の異方性のレベルが前記第１の閾値以上であると判定するステップに応答して、
   前記前記第１の標的核酸分子が前記サンプルに存在すると判定するステップ、および／または前記サンプルの前記第１の標的核酸分子の存在または非存在を判定するステップは、
   前記測定された前記第１の蛍光の異方性のレベルが第１の閾値未満であると判定するステップ、および、
   前記測定された前記第１の蛍光の異方性のレベルが前記第１の閾値未満であると判定するステップに応答して、前記第１の標的核酸分子が前記サンプルに非存在であると判定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記第１の標的核酸分子、前記第２の標的核酸分子、またはその両方がリボ核酸（ＲＮＡ）分子である、請求項１に記載の方法。
5. 前記測定された前記第１の蛍光の異方性のレベルに基づいて、前記サンプルの細菌の存在を判定するステップをさらに含む、および／または前記測定された前記第１の蛍光の異方性のレベルに基づいて、前記サンプルの２つ以上のタイプの細菌を区別するステップをさらに含む、および／または前記測定された前記第１の蛍光の異方性のレベルに基づいて癌の徴候を検出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

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