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JP6990169B2 - カルボキシ末端に官能基を有するポリヒドロキシアルカン酸とその製造方法 - Google Patents

カルボキシ末端に官能基を有するポリヒドロキシアルカン酸とその製造方法 Download PDF

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Description

本発明は、カルボキシ末端に官能基を有する新規なポリヒドロキシアルカン酸とその製造方法に関する。特に、３位にヒドロキシ基を有する微生物産生のＲ－３－ヒドロキシアルカン酸の単独ポリマーまたは共重合ポリマー［ポリ（Ｒ－３－ヒドロキシアルカン酸）］とその製造方法に関する。
ポリヒドロキシアルカン酸（以下、「ＰＨＡ」と略す）は、多くの微生物種の細胞内にエネルギー貯蔵物質として生産、蓄積される熱可塑性ポリエステルである。微生物によって様々な天然の炭素源から生産されるＰＨＡは、土中や水中の微生物により完全に生分解されるため、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれる。従って、ＰＨＡは生態系への悪影響がほとんどない環境調和型のプラスチックであると言える。近年、環境汚染、廃棄物処理、石油資源の観点から、合成プラスチックによる社会問題が深刻になるに伴って、ＰＨＡが環境にやさしいグリーンプラスチックとして注目され、その実用化が切望されている。
微生物中に最初に発見されたＰＨＡは、３－ヒドロキシ酪酸（以下、「３ＨＢ」と略す）のホモポリマーであるポリヒドロキシブチレート（以下、「ＰＨＢ」と略す）である。ＰＨＢは高結晶性であり、結晶化度が高いため硬くて脆く、しかも融点付近の温度（１８０℃）で速やかに熱分解するため、溶融加工性が低く実用範囲は極めて限られるという問題を有している。
そこで、ＰＨＢの結晶化度を下げて脆性を改善するため、他の３－ヒドロキシアルカン酸をＰＨＢ骨格中に導入する試みがなされた。例えば、３－ヒドロキシプロピオン酸（以下、「３ＨＰ」と略す）、４－ヒドロキシ酪酸（以下、「４ＨＢ」と略す）、５－ヒドロキシ吉草酸（以下、「５ＨＶ」と略す）などの側鎖を持たない直鎖状モノマーや、乳酸、３－ヒドロキシ吉草酸（以下、「３ＨＶ」と略す）、３－ヒドロキシヘキサン酸（以下、「３ＨＨｘ」と略す）などのの側鎖を有するモノマーについて、ＰＨＢ骨格への導入がこれまでに報告されている。導入するモノマーの種類やその共重合比率によって得られるＰＨＡの物性は大きく変化するが、基本的にどのモノマーを導入してもＰＨＢの結晶化度が低下するため、ＰＨＢと比べて溶融加工性が改善する。
ＰＨＡの用途をさらに広げるためには、上記のようなＰＨＡとは大きく異なる物性を有する新たなＰＨＡを生産する技術開発が必要である。そのためには、単純にＰＨＡ主鎖の長さや直鎖の大きさを変化させるだけではなく、ＰＨＡの側鎖やカルボキシ末端に何らかの官能基を導入することが有効と考えられる。
これまでに、ＰＨＡの側鎖に官能基を導入した例として、特許文献１では炭素数６～１４の中鎖ＰＨＡの側鎖にチオエステルを導入したことが報告されている。また、非特許文献１には、炭素数６～１４の中鎖ＰＨＡの側鎖に、分岐鎖アルキル基、シクロヘキシル基、ハロゲン化アルキル、アセトキシ基、エステル、アルコシキ基、エポキシ基、チオール基、シアノ基、ニトロ基、フェニル基やベンゾイル基などの芳香環化合物を導入した例がまとめられている。
これら官能基の導入は、ＰＨＡの物性を大きく変化させるだけでなく、上記官能基を更に化学的に修飾するための反応起点を付与する点でも重要である。例えば非特許文献３では、チオール－エンクリック反応を用いて、ＰＨＡ側鎖の二重結合に蛍光物質やペプチドを修飾したことが報告されている。また非特許文献４では、チオール－エンクリック反応を用いて、ＰＨＡ側鎖の二重結合にヒドロキシ基やカルボキシ基を導入し、ＰＨＡの撥水性を変化させたことが報告されている。さらに非特許文献４では多分岐構造化合物と反応させることで、ＰＨＡを架橋できたことも報告されている。さらに非特許文献５では、側鎖にアジド基を有するＰＨＡを生産し、アルキン－アジドクリック反応を用いて上記側鎖を修飾した例が報告されている。
このようにＰＨＡに官能基を導入し、それを標的に化学修飾する方法は、ＰＨＡの物性を変化させる上で有用である。しかしながら、上記のようにＰＨＡ側鎖の官能基を用いる場合、反応制御が非常に難しい。例えば上記多分岐構造化合物を用いて架橋する場合、架橋点が多いとＰＨＡはゲル化してしまうが、架橋点が少ないと架橋による物性改変の効果が得られない。また、１分子のＰＨＡ鎖上に複数の反応基が存在することで、反応後の生成物は多様な化合物の混合物となってしまうという課題も有していた。
一方、非特許文献６には、ＰＨＡのカルボキシ末端に官能基を導入した例が報告されている。詳細には非特許文献６には、ＩＶ型ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有するＢａｃｉｌｌｕｓ属微生物を１．３－プロパンジオール、２－プロピン－１－オール、３－メルカプト－１－プロパノール、ベンジルアルコールの存在下で培養すると、ＰＨＢのカルボキシ末端に１－プロパノール基、１－プロピニル基、１－プロパンチオール基、ベンジル基が導入されて、これらの非存在下で培養した場合に比べて分子量が低下することが報告されている。更に上記非特許文献６には、２－プロペン－１－オールや３－ブチン－１－オールの存在下で培養しても、分子量低下は観察されなかったことも報告されている。
ＷＯ２０１２／０３８５７２
Ｍａｒｔａ Ｔｏｒｔａｊａｄａ， Ｌｕｉｚｉａｎａ Ｆｅｒｒｅｉｒａ ｄａ Ｓｉｌｖａ， Ｍａｒｉａ Ａｕｘｉｌｉａｄｏｒａ Ｐｒｉｅｔｏ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ．１６， ｐｐ．１－１５， ２０１３ Ｈｅｎｒｙ Ｅ． Ｖａｌｅｎｔｉｎ， Ｐｉｅｒｒｅ Ａ． Ｂｅｒｇｅｒ， Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｊ． Ｇｒｕｙｓ， Ｍａｒｉａ Ｆｉｌｏｍｅｎａ ｄｅ Ａｎｄｒａｄｅ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ， Ｍｕｎｈｔｉｅｎ Ｔｒａｎ，Ｊａｗｅｄ Ａｓｒａｒ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ｖｏｌ．３２， ｐｐ．７３８９－７３９５， １９９９ Ｋｅｎｊｉ Ｔａｊｉｍａ， Ｋｏｓｕｋｅ Ｉｗａｍｏｔｏ， Ｙａｓｕｈａｒｕ Ｓａｔｏ， Ｒｙｏｓｕｋｅ Ｓａｋａｉ， Ｔｏｓｈｉｆｕｍｉ Ｓａｔｏｈ， Ｔｏｈｒｕ Ｄａｉｒｉ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ．１００， ｐｐ．４３７５－４３８３， ２０１６ Ａｌｅｘ Ｃ． Ｌｅｖｉｎｅ， Ｇｒａｈａｍ Ｗ． Ｈｅｂｅｒｌｉｇ， Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｔ． Ｎｏｍｕｒａ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ｖｏｌ．８３， ｐｐ．３５８－３６５， ２０１６ Ａｔａｈｕａｌｐａ Ｐｉｎｔｏ， Ｊｓｅｓｓｉｃａ Ｈ． Ｃｉｅｓｌａ， Ａｄｒｉａｎａ Ｐａｕｌｕｃｃｉ， Ｂｒａｄｌｅｙ Ｐ． Ｓｕｔｌｉｆｆ， Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｔ． Ｎｏｍｕｒａ， ＡＣＳ Ｍａｃｒｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ， Ｖｏｌ．５， ｐｐ．２１５－２１９， ２０１６ Ｍａｎａｍｉ Ｈｙａｋｕｔａｋｅ， Ｓａｔｏｓｈｉ Ｔｏｍｉｚａｗａ， Ｉｍａｉ Ｓｕｇａｈａｒａ， Ｅｍｉ Ｍｕｒａｔａ， Ｋｏｕｈｅｉ Ｍｉｚｕｎｏ， Ｈｉｄｅｋｉ Ａｂｅ， Ｔａｋｅｈａｒｕ Ｔｓｕｇｅ, Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ， ｖｏｌ．１１７， ｐｐ．９０－９６， ２０１５
前述したとおり非特許文献６にはＰＨＡのカルボキシ末端に官能基が導入された化合物が記載されているが、実際に製造できたのは僅か４つであり、例えばアルキニル基についてプロピニル基は導入できたがブチニル基は導入できなかったことが記載されている。本発明の課題は、化学修飾可能でその反応制御が容易な、カルボキシ末端に官能基を有する各種新規のＰＨＡを製造できる方法、およびこうした従来製造ではなかったＰＨＡを提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＰＨＡの側鎖ではなくカルボキシ末端に特定の官能基を含有するＰＨＡの製造に成功し、本発明を完成するに至った。
本発明の詳細は以下のとおりである。
１．繰り返し単位が下記一般式（１）
［－Ｃ*ＨＲ1－ＣＨ2－ＣＯ－Ｏ－］ ・・・（１）
（式中、Ｒ1はＣnＨ2n+1で表されるアルキル基であり、ｎは１～１５の整数であり、＊は不斉であることを表す。）
で示されるＲ－３－ヒドロキシアルカン酸の単独又は共重合ポリマーであって、該ポリマーが単独ポリマーであるか共重合ポリマーであるかに応じて、カルボキシ末端に以下に示す基が結合しているポリヒドロキシアルカン酸。
（１）単独ポリマーである時にカルボキシ末端に結合する基
炭素数４～８のアルキニル基、
炭素数３～８のアルケニル基、
炭素数２、４～８のメルカプトアルキル基、
炭素数３～８のアジド化アルキル基、または
アルキル基の炭素数が２～６のアリル（ポリ）オキシアルキル基
（２）共重合ポリマーである時にカルボキシ末端に結合する基
炭素数３～８のアルキニル基、
炭素数３～８のアルケニル基、
炭素数２～８のメルカプトアルキル基、
炭素数３～８のアジド化アルキル基、または
アルキル基の炭素数が２～６のアリル（ポリ）オキシアルキル基
２．カルボキシ末端に、アルキン基（アルキニル基と同義）、アルケン基（アルケニル基と同義）、チオール基（メルカプト基）またはアジド基が導入された微生物産生ポリヒドロキシアルカン酸であり、
前記ヒドロキシアルカン酸が３－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキプロピオン酸、４－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシ吉草酸、５－ヒドロキシ吉草酸、３－ヒドロキシヘキサン酸、６－ヒドロキシヘキサン酸、３－ヒドロキシヘプタン酸、３－ヒドロキシオクタン酸、３－ヒドロキシノナン酸、３－ヒドロキシデカン酸、３－ヒドロキシウンデカン酸、３－ヒドロキシドデカン酸から選ばれる複数種で構成されているポリヒドロキシアルカン酸。
３．カルボキシ末端に、アルキン基、アルケン基、チオール基またはアジド基が導入された微生物産生ポリヒドロキシアルカン酸であり、
前記ヒドロキシアルカン酸が３－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキプロピオン酸、４－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシ吉草酸、５－ヒドロキシ吉草酸、３－ヒドロキシヘキサン酸、６－ヒドロキシヘキサン酸、３－ヒドロキシヘプタン酸、３－ヒドロキシオクタン酸、３－ヒドロキシノナン酸、３－ヒドロキシデカン酸、３－ヒドロキシウンデカン酸、３－ヒドロキシドデカン酸から選ばれる単一種で構成されており、
前記アルキン基が、ブチニル基、ペンチニル基、又はヘキシニル基であり、
前記アルケン基が、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、又はヘキセニル基であり、
前記チオール基が、メルカプトエチル基、メルカプトブチル基、メルカプトペンチル基、又はメルカプトヘキシル基であるポリヒドロキシアルカン酸。
４．モノマーユニットとして少なくとも３－ヒドロキシ酪酸を含む上記１～３のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカン酸。
５．モノマーユニットとしてさらに３－ヒドロキシヘキサン酸を含む上記４に記載のポリヒドロキシアルカン酸。
６．上記１～５のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカン酸を製造する方法であって、
アルキン基、アルケン基、チオール基、アジド基、またはアリル基を有するアルコールを用いて、ポリヒドロキシアルカン酸を生産可能な微生物を培養する工程を含む、カルボキシ末端に、アルキン基、アルケン基、チオール基、アジド基、又はアリル基が導入されたポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
７．アルキン基、アルケン基、チオール基、アジド基、またはアリル基を有する炭素数２～８のアルコールを用いて、ポリヒドロキシアルカン酸を生産可能なＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属に属する微生物を培養する工程を含む、カルボキシ末端に、アルキン基、アルケン基、チオール基、アジド基、又はアリル基が導入されたポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
８．前記アルコールが第一級アルコールである上記６または７に記載の製造方法。
９．前記微生物が、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子を有する微生物である上記６～８のいずれかに記載の製造方法。
１０．前記微生物が、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属に属する微生物である上記８または９に記載の製造方法。
１１．前記微生物が、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒを宿主とする形質転換体である上記７または１０に記載の製造方法。
１２．上記１～５のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカン酸の末端のアルキン基、アルケン基、チオール基、アジド基、またはアリル基がさらに化学修飾された化合物。
１３．上記１～５のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカン酸、または上記１２に記載の化合物を含有する成形体。
本発明によれば、カルボキシ末端に特定の官能基を有する全く新規のＰＨＡを製造することができる。本発明のＰＨＡは、フィルムやシートなどの成形体を製造するための添加剤として使用することで従来のＰＨＡの物性改善が期待できるだけでなく、上記官能基をさらに化学修飾することで多様な構造体への誘導が可能であると考えられる。
図１は、実施例８の1Ｈ－ＮＭＲチャートである。 図２は、実施例１６の1Ｈ－ＮＭＲチャートである。 図３は、比較例１の1Ｈ－ＮＭＲチャートである。
以下、本発明について、さらに詳細に説明する。
本発明のＰＨＡは、繰り返し単位が下記一般式（１）
［－Ｃ*ＨＲ1－ＣＨ2－ＣＯ－Ｏ－］ ・・・（１）
（式中、Ｒ1はＣnＨ2n+1で表されるアルキル基であり、ｎは１～１５の整数であり、＊は不斉炭素であることを表す。）
で示されるＲ－３－ヒドロキシアルカン酸（以下、「３ＨＡ」と略す）の単独又は共重合ポリマー（以下、これらのポリマーを「Ｐ３ＨＡ」と略す）であって、Ｐ３ＨＡが単独ポリマーであるか共重合ポリマーであるかに応じて、カルボキシ末端に以下に示す基が結合しているものである。好ましくは該カルボキシ基を含むエステル結合に以下の基が結合しており、ＰＨＡの末端に、三重結合、二重結合、メルカプト基（チオール基）、アリル基を有するものである。
（１）単独ポリマーである時にカルボキシ末端に結合する基
炭素数４～８のアルキニル基、炭素数３～８のアルケニル基、炭素数２、４～８のメルカプトアルキル基、炭素数３～８のアジド化アルキル基、またはアルキル基の炭素数が２～６のアリル（ポリ）オキシアルキル基
（２）共重合ポリマーである時にカルボキシ末端に結合する基
炭素数３～８のアルキニル基、炭素数３～８のアルケニル基、炭素数２～８のメルカプトアルキル基、炭素数３～８のアジド化アルキル基、またはアルキル基の炭素数が２～６のアリル（ポリ）オキシアルキル基
なお、前述した非特許文献６には、上記一般式（１）においてｎ＝１である３ＨＢのホモポリマーであって、そのカルボキシ末端にプロピニル基（炭素数３のアルキニル基）およびメルカプトプロピル基（炭素数３のアルキル基を有するチオール基）が開示されているに過ぎず、本発明とは官能基の種類が相違する。また、両者は使用する微生物種が相違する。
すなわち本発明のＰＨＡは、３ＨＡを主要モノマーユニットとし、Ｐ３ＨＡと称される、微生物から生産されるポリエステル樹脂である。本発明のＰＨＡを構成するモノマーユニットとしては、例えば３ＨＢ（上記一般式（１）において、ＣnＨ2n+1で表されるアルキル基Ｒ1のｎ＝１）、３ＨＶ（ｎ＝２）、３ＨＨｘ（ｎ＝３）、３－ヒドロキシヘプタン酸（ｎ＝４）、３－ヒドロキシオクタン酸（ｎ＝５）、３－ヒドロキシノナン酸（ｎ＝６）、３－ヒドロキシデカン酸（ｎ＝７）、３－ヒドロキシウンデカン酸（ｎ＝８）、３－ヒドロキシドデカン酸（ｎ＝９）などが挙げられる。
本発明のＰＨＡにおけるモノマーユニットは、単一種で構成されていても良いし、複数種で構成されていても良い。複数種のモノマーユニットを含む場合、２種類以上の３ＨＡを共重合させたものであってもよいし、１種または２種以上の３ＨＡに対し、４ＨＢ等の４－ヒドロキシアルカン酸を共重合させたものであってもよい。本発明のＰＨＡとしては、モノマーユニットとして、少なくとも３ＨＢを含んでいることが好ましい。本発明のＰＨＡは、モノマーユニットとして上記３ＨＢのみからなるＰＨＢであってもよく、３ＨＢとその他のモノマーユニットからなる共重合体であっても良い。３ＨＢ以外のモノマーユニットとして、前述したモノマーユニットのほか、３ＨＰ、４ＨＢ、５ＨＶ、６－ヒドロキシヘキサン酸（６－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｎａｔｅ；以下、「６ＨＨｘ」と略す）などが挙げられる。このような共重合体の例として、３ＨＨｘをさらに有するＰｏｌｙ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨｘ）（以下、「ＰＨＢＨ」と略す）、３ＨＶをさらに有するＰｏｌｙ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ）、４ＨＶをさらに有するＰｏｌｙ（３ＨＢ－ｃｏ－４ＨＶ）などが挙げられる。これらのうちＰＨＢＨが好ましい。
本発明のＰＨＡが共重合体である場合の各モノマーユニットの共重合比率は特に限定されないが、３ＨＢをモノマーユニットとして含有する場合、その共重合比率は、５０モル％以上であることがより好ましく、６０モル％以上であることがさらに好ましく、７０モル％以上であることが一層好ましく、８０モル％以上であることが特に好ましい。また本発明のＰＨＡがＰＨＢＨである場合、３ＨＨｘ共重合比率の下限は、１モル％が好ましく、２モル％がより好ましく、３モル％がさらに好ましい。またその上限は、２０モル％が好ましく、１５モル％がより好ましく、１２モル％がさらに好ましい。
上述したように本発明のＰＨＡは、ポリマー主鎖のカルボキシ末端に、特定の官能基としてアルキニル基、アルケニル基、チオール基（メルカプト基）、アジド基、またはアリル基が導入されていることを特徴とする。本発明のＰＨＡのカルボキシ末端は、アルキル鎖を介してアルキニル基、アルケニル基、チオール基、アジド基を有しており、またオキシアルキル鎖を介してアリル基を有する。
上記炭素数３～８のアルキニル基として、直鎖状または分岐状のプロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、へプチニル基、オクチニル基が挙げられる。分岐はない方、すなわち直鎖が好ましい。炭素数は３～６であることが好ましく、なかでもプロピニル基、ブチニル基、ヘキシニル基が好ましい例として挙げられる。
上記炭素数３～８のアルケニル基として、直鎖状または分岐状のプロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、へプテニル基、オクテニル基が挙げられる。分岐はない方、すなわち直鎖が好ましい。炭素数は３～６であることが好ましく、なかでもプロペニル基、ブテニル基、ヘキセニル基が好ましい例として挙げられる。
上記炭素数２～８のメルカプトアルキル基として、直鎖状または分岐状のメルカプトエチル基、メルカプトプロピル基、メルカプトブチル基、メルカプトペンチル基、メルカプトヘキシル基、メルカプトヘプチル基、メルカプトオクチル基が挙げられる。分岐はない方、すなわち直鎖が好ましい。炭素数は２～６であることが好ましく、３～６であることがより好ましい。例えばメルカプトエチル基、メルカプトプロピル基が好ましい例として挙げられる。
上記炭素数３～８のアジド化アルキル基として、直鎖状または分岐状のアジド化プロピル基、アジド化ブチル基、アジド化ペンチル基、アジド化ヘキシル基、アジド化ヘプチル基が挙げられる。分岐はない方、すなわち直鎖が好ましい。炭素数は３～６であることが好ましく、なかでもアジド化プロピル基、アジド化ブチル基が好ましい例として挙げられる。
アルキル基の炭素数が２～６のアリル（ポリ）オキシアルキル基として、オキシアルキルを１～３有するものが挙げられ、好ましくは１である。オキシアルキル基としては例えばオキシエチル基、オキシプロピル基、オキシブチル基、オキシペンチル基、オキシヘキシル基が挙げられ、なかでもオキシエチル基、オキシプロピル基、オキシブチル基が好ましい例として挙げられる。分岐はない方、すなわち直鎖が好ましい。アリル（ポリ）オキシアルキル基の総炭素数は２～６であることが好ましく、例えばアリルオキシエチル基、アリルオキシプロピル基、アリルオキシブチル基が挙げられる。
本発明のＰＨＡは上記の通り特定の官能基をカルボキシル基末端に有していることを特徴とするが、ポリマー側鎖にもさらに官能基を有していてもかまわない。但し、本発明のＰＨＡをさらに化学修飾して新たな誘導体を合成する場合には、反応制御の観点からカルボキシル基末端にのみ官能基を有しているのが好ましい。
本発明のＰＨＡの分子量は限定されないが、下記本発明の製造方法を利用する場合、比較的低分子量のＰＨＡが得られる傾向がある。例えば重量平均分子量（Ｍw）として、５０００～２０００００００程度、使用目的によっては８０００～３０００００程度やさらに１００００～１０００００程度であっても差し支えない。また数平均分子量（Ｍn）として３０００～１５０００００程度、使用目的によっては５０００～１００００００程度やさらに７０００～８０００００程度であっても差し支えない。
上述した本発明のＰＨＡを生産する方法としては、上記特定の官能基をカルボキシ末端に導入できるよう、上記アルキニル基、アルケニル基、チオール基、アジド基、またはアリル基を有するアルコールを用いてＰＨＡを合成可能な微生物（以下、「本発明の微生物」と言う）を培養する方法（以下、「本発明の製造方法」と言う）が挙げられる。前記アルコールとしては、第一級アルコールが好ましい。
このようなアルコールとしては、例えば２－プロピン－１－オール、３－ブチン－１－オール、４－ペンチン－１－オール、５－ヘキシン－１－オール；２－プロペン－１－オール、３－ブテン－１－オール、４－ペンテン－１－オール、５－ヘキセン－１－オール；２－メルカプトエタノール、３－メルカプトプロパノール、４－メルカプトブタノール、５－メルカプトペンタノール、６－メルカプトヘキサノール；４－アジドブタン－１－オール、５－アジドペンタン－１－オール、６－アジドヘキサン－１－オール；エチレングリコールモノアリルエーテル、プロピレングリコールモノアリルエーテル、テトラメチレングリコールモノアリルエーテル、ペンタメチレングリコールモノアリルエーテルなどが挙げられる。なかでも、２－プロペン－１－オール、３－ブテン－１－オール、５－ヘキセン－１－オール、２－プロピン－１－オール、３－ブチン－１－オール、５－ヘキシン－１－オール、２－メルカプトエタノール、３－メルカプトプロパノール、エチレングリコールモノアリルエーテルなどが好ましい例として挙げられる。これ以外にも、アルキル鎖部分に分岐構造を有するアルコールや、ヒドロキシ基を複数有するアルコール、あるいはアルキニル基、アルケニル基、チオール基、アジド基、またはアリル基を複数有するアルコールを使用しても良い。また、これらのアルコールは、単独種で使用しても良いし、複数種を併用しても良い。
本発明の製造方法では、微生物菌体内でのＰＨＡ合成における連鎖移動反応において、上記アルコールが停止剤として機能していると考えられる。その場合、どのようなアルコールが停止剤として機能するのかは、本発明の微生物が有するＰＨＡ合成酵素のアルコールに対する基質特異性に依存する。本発明の製造方法においては、上記本発明の微生物が、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ（アエロモナス）属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ（ラルストニア）属またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス）属由来のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子（以下、「ＰＨＡ合成酵素遺伝子」と略す）を有する微生物であるのが好ましく、さらに具体的には、ＰＨＡ合成酵素遺伝子として、配列番号１に記載するアミノ酸配列からなる、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ（アエロモナス キャビエ）由来で、かつ１４９番目のアスパラギンがセリンに、１７１番目のアスパラギン酸がグリシンにそれぞれ人工的に置き換えられたＰＨＡ合成酵素遺伝子、配列番号２に記載するアミノ酸配列からなる、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ（ラルストニア ユートロファ）由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子、配列番号３に記載するアミノ酸配列からなる、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｓｐ．６１－３由来で、３２５番目のセリンがトレオニンに、４７７番目のセリンがアルギニンに、４８１番目のグルタミンがアルギニンにそれぞれ人工的に置き換えられたＰＨＡ合成酵素遺伝子等がより好ましい例としてあげられるが、これらに限定されない。Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来ＰＨＡ合成酵素は炭素数３～６のヒドロキシアルカン酸ＣｏＡを基質とすることが知られているため、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物を使用することで、３ＨＢ、３ＨＰ、４ＨＢ、３ＨＶ、５ＨＶ、および３ＨＨｘからなるホモポリマー、あるいはこれらのモノマーユニットからなる共重合ＰＨＡが生産できる。また、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属由来ＰＨＡ合成酵素は炭素数３～５のヒドロキシアルカン酸ＣｏＡを基質とすることが知られているため、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属由来ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物を使用することで、３ＨＢ、３ＨＰ、４ＨＢ、３ＨＶ、および５ＨＶからなるホモポリマー、あるいはこれらのモノマーユニットからなる共重合ＰＨＡが生産できる。また、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来ＰＨＡ合成酵素は炭素数３～１２のヒドロキシアルカン酸ＣｏＡを基質とすることが知られているため、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物を使用することで、３ＨＢ、３ＨＰ、４ＨＢ、３ＨＶ、５ＨＶ、３ＨＨｘ、６ＨＨｘ、３－ヒドロキシヘプタン酸、３－ヒドロキシオクタン酸、３－ヒドロキシノナン酸、３－ヒドロキシデカン酸、３－ヒドロキシウンデカン酸、３－ヒドロキシドデカン酸からなるホモポリマー、あるいはこれらのモノマーユニットからなる共重合ＰＨＡが生産できる。
本発明の微生物種は特に限定されず、細菌、または真菌のいずれであってもよい。例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ（アシネトバクター）属、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ（アエロモナス）属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（アルカリゲネス）属、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ（アルロクロマチウム）属、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ（アゾリゾビウム）属、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ（アゾトバクター）属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（バチルス）属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ（バークホルデリア）属、Ｃａｎｄｉｄａ（カンジダ）属、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ（カウロバクター）属、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（クロモバクテリウム）属、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ（コマモナス）属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ（カプリアビダス）属、Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ（エクトチオドスピラ）属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（クレブシエラ）属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（メチロバクテリウム）属、Ｎｏｃａｒｄｉａ（ノカルディア）属、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ（パラコッカス）属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス）属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ（ラルストニア）属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ（リゾビウム）属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ（ロドバクター）属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ（ロドコッカス）属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ（ロドスピリルム）属、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ（リケッチア）属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（サッカロミセス）属、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ（シノリゾビウム）属、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ（スフィンゴモナス）属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ（シネコシスティス）属、Ｔｈｉｏｃｏｃｃｕｓ（チオコッカス）属、Ｔｈｉｏｃｙｓｔｉｓ（チオキスチス）属、Ｖｉｂｒｉｏ（ビブリオ）属、Ｗａｕｔｅｒｓｉａ（ウォーテルシア）属、またはＺｏｏｇ／Ｌｏｅａ（ゾオグ／ロエア）属に属する微生物が挙げられる。中でもＡｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属等に属する微生物が好ましく、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属に属する微生物がより好ましく、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属に属する微生物がさらにより好ましい。本発明の微生物して特に好ましいのは、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ（カプリアビダス ネカトール）である。
本発明の微生物が元来ＰＨＡ合成酵素遺伝子を持たない場合、あるいは微生物がもともと有するＰＨＡ合成酵素遺伝子が所望するＰＨＡ合成酵素遺伝子ではない場合、遺伝子組換え法によって例えば上記好ましいＰＨＡ合成酵素遺伝子を宿主となる微生物に導入した形質転換体を使用することも出来る。ＰＨＡ合成酵素遺伝子を宿主に導入する方法としては、プラスミドで保持する形式であっても良いし、または染色体の任意の位置に導入する形式であっても良い。この際、宿主がもともと有するＰＨＡ合成酵素遺伝子は、機能が失われている方が好ましい。該ＰＨＡ合成酵素遺伝子の機能を欠失する方法としては、一例として、該ＰＨＡ合成酵素遺伝子を全長にわたって、または部分的に欠損する方法、または該ＰＨＡ合成酵素遺伝子への塩基の付加、欠失、または置換によって、生産されるＰＨＡ合成酵素の機能が欠損する方法などが挙げられる。ＤＮＡの挿入または置換の具体的な方法については、例えば、Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ． ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，J．，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載の方法を参考にすればよい。
本発明の製造方法においては、ＰＨＡを生産する場合の炭素源として上記アルコールを単独で使用しても良いが、上記アルコールを大量に培養に使用すると微生物の成育に影響がある可能性が高いことから、上記アルコールとそれ以外の炭素源を併用するのが好ましい。そのようなアルコール以外の炭素源としては、本発明の微生物が資化可能な炭素源であれば任意の原料を使用することができる。そのような炭素源としては、特に限定されないが、好ましくは、グルコース、フルクトース、スクロースなどの糖類、パーム油、パーム核油（Ｐａｌｍ Ｋｅｒｎｅｌ Ｏｉｌ；以下、「ＰＫＯ」と略す）、コーン油、やし油、オリーブ油、大豆油、菜種油、ヤトロファ油などの油脂、その分画油類もしくはその精製副産物、またはラウリン酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸などの脂肪酸、それらの誘導体等が好ましい。また、酵母エキスやポリペプトンなども使用することができる。より好ましくは、パーム油、パーム核油などの植物油脂、またはパーム油やパーム核油を分別した低融点分画であるパームオレイン、パームダブルオレイン、もしくはパーム核油オレイン、ＰＦＡＤ（パーム油脂肪酸蒸留物）、ＰＫＦＡＤ（パーム核油脂肪酸蒸留物）、または菜種油の脂肪酸蒸留物といった油脂の精製副産物等であり、食糧との競合を避ける観点からは前記油脂の精製副産物が特に好ましい。
本発明の製造方法においては、上記アルコール、アルコール以外の炭素源、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、およびその他の有機栄養源を含む培地を用いて、前記微生物を培養することが好ましい。窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、尿素、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えばリン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。そのほかの有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、トレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
本発明の製造方法において、培地中における上記アルコールの濃度は特に限定されないが、効率よく本発明のＰＨＡを生産するためには、その下限は０．０１ｇ／Ｌであるのが好ましく、０．０５ｇ／Ｌがさらに好ましく、０．１ｇ／Ｌがより好ましい。上限としては、上述したように微生物の成育に対する影響を押さえるという観点から、５ｇ／Ｌ程度が好ましく、３ｇ／Ｌがさらに好ましく、２ｇ／Ｌがより好ましい。さらにアルコールとしてメルカプトアルコールを使用する場合には０．８ｇ／Ｌ以下の濃度で使用するのが特に好ましい。
それ以外の培養温度、培養時間、培養時ｐＨ、培地等の条件は、本発明の微生物において通常使用される培養条件でよい。
本発明の製造方法において、微生物菌体からＰＨＡを回収する方法は、特に限定されないが、例えば次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出する。このＰＨＡを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、その濾液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収する。
本発明のＰＨＡは、カルボキシ末端に導入された特定のアルケニル基、アルキニル基、チオール基、アジド基、またはアリル基を介して、化学反応により、さらに任意の化合物に転位させる、即ち化学修飾することもできる。例えば、本発明のＰＨＡがカルボキシ末端にアルケニル基、またはアルキニル基を有する場合、チオール基を含有する化合物を、チオール－エンクリック反応、またはチオール－インクリック反応によって転位させることができる。逆に、本発明のＰＨＡがカルボキシ末端にチオール基を有する場合、アルケニル基、またはアルキニル基を含有する化合物を、チオール－エンクリック反応、またはチオール－インクリック反応によって転位させることができる。あるいは、本発明のＰＨＡがカルボキシ末端にアルキニル基を有する場合、アジド基を含有する化合物を、アルキン－アジドクリック反応によって転位させることができる。逆に、本発明のＰＨＡがカルボキシ末端にアジド基を有する場合、アルキニル基を含有する化合物を、アルキン－アジドクリック反応によって転位させることができる。このような化学修飾によって得られる誘導体も、本発明の範疇である。さらには、本発明のＰＨＡや、上記その誘導体である化合物を含有する樹脂成形体も本発明の範疇である。前記樹脂成形体においては、本発明のＰＨＡやその誘導体である化合物を単独で使用してもよく、従来公知のＰＨＡと混合して使用することも出来る。
本発明のＰＨＡがポリマー主鎖の末端にのみ官能基を有する場合、反応後の生成物を限定することができ、より好ましい。例えば、側鎖に二重結合を有するＰＨＡと、カルボキシ末端にチオール基を有するＰＨＡを反応させることで、グラフトポリマーへと誘導することができる。また、カルボキシ末端にアルケン基を有するＰＨＡを、ペンタエリトリトールテトラキス（３－メルカプトプロピオナート）のような多分岐構造を有するチオール化合物に転位させれば、多分岐型ＰＨＡへと誘導することもできる。あるいは、カルボキシ末端にアルケン基が導入されたＰＨＡを含有する樹脂組成物を、フィルム、シート、不織布などに加工し、その後にチオール化合物を転位させることで、樹脂成形物の表面修飾をすることができる。
さらに、本発明のＰＨＡを利用してデンドリマーを構成すれば、生体適合性の高い医療用材料や、適度な徐放性を有する農業用資材を提供することもできる。
本願は、２０１６年３月２５日に出願された日本国特許出願第２０１６－０６２２７８号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１６年３月２５日に出願された日本国特許出願第２０１６－０６２２７８号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、菌株の育種、ＰＨＡに含まれるモノマーユニット共重合比率の分析方法、ＰＨＡの分子量の分析方法は以下の通りである。
（菌株の育種）
本明細書の実施例における遺伝子操作は、前述のＧｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ． ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，J．（２０１２）に記載されている方法で行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主などは市場の供給者から購入し、その取扱説明書に従って使用することができる。なお、実施例等に用いられる酵素は、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。
（ＰＨＡに含まれるモノマーユニット共重合比率の分析方法）
ＰＨＡに含まれるモノマーユニット共重合比率は、ＮＭＲを用いて分析した。具体的には、得られたＰＨＡ２ｍｇを重クロロホルム２ｍＬに溶かし、試料管に移して測定に供した。検出された各ピークの面積から、モノマーユニットの共重合比率を算出した。
（ＰＨＡの分子量の分析方法）
ＰＨＡの分子量は、ゲルパーミッションクロマトグラフィー法により分析した。ＰＨＡを１．５ｇ／Ｌの濃度でクロロホルムに溶解し、Φ＝０．２μｍフィルターで濾過して得られた濾液を分析サンプルとした。測定システムは島津製作所のＧＰＣシステムを使用した。カラムはＳｈｏｄｅｘ ＧＰＣ Ｋ－８０６Ｌ（昭和電工）を２本直列に接続した状態で使用し、カラムオーブンは４０℃に設定した。移動相はクロロホルムを使用し、流速は１．０ｍＬ／分とした。分子量標品としては、、約７００万、約１９０万、約３５万、約１９万、約３万、約２千のポリスチレンを使用した。標品６点の分析結果から検量線を作成し、これを元にＰＨＡの分子量（重量平均分子量Ｍw、および数平均分子量Ｍn）を算出した。
（ＰＨＡのカルボキシ末端構造の確認）
1Ｈ－ＮＭＲを用いてカルボキシ末端に所定の基が導入されているか確かめた。1Ｈ－ＮＭＲの測定は、日本電子製ＮＭＲ機器を用い、室温にて、５００ＭＨｚ、ＳＣＡＮ回数２５６回程度の条件で行った。データ解析は、ＡＬＩＣＥ２ ｆｏｒ ｗｉｎｄｏｗｓ ｖｅｒ．４を用いて行なった。下記実施例８、１６については、具体的な結果を図１、図２に示す。比較のため、比較例１の結果も図３に示す。
２－プロペン－１－オールを０．２ｇ／Ｌ含有する培地における、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産
微生物としては、ＷＯ２０１５／１１５６１９号記載のＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を使用した。ＫＮＫ－００５ ｔｒｃｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株は、染色体上のｐｈａＺ１遺伝子およびｐｈａＺ６遺伝子を全長欠失し、ｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号４に記載のＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来の変異型ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有し、ｐｈａＪ４ｂ遺伝子上流に配列番号５記載の発現調節配列が挿入された菌株である。
（培養）
上記微生物を以下の条件で培養した。
種母培地の組成は、１０ｇ／Ｌ 肉エキス、１０ｇ／Ｌ バクトトリプトン、２ｇ／Ｌ酵母エキス、９ｇ／Ｌ リン酸二水素ナトリウム１２水和物、１．５ｇ／Ｌ リン酸水素二カリウムとした。
ＰＨＡ生産培地の組成は、１１ｇ／Ｌ リン酸水素二ナトリウム１２水和物、１．９ｇ／Ｌ リン酸水素二カリウム、１．３ｇ／Ｌ 硫酸アンモニウム、５ｍＬ／Ｌ マグネシウム溶液、１ｍＬ／Ｌ 微量金属塩溶液とした。マグネシウム溶液は、水に２００ｇ／Ｌ 硫酸マグネシウム七水和物を溶かして調製した。微量金属塩溶液は、０．１Ｎ塩酸に、０．２１８ｇ／Ｌ 塩化コバルト六水和物、１６．２ｇ／Ｌ 塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物、１０．３ｇ／Ｌ 塩化カルシウム二水和物、０．１１８ｇ／Ｌ 塩化ニッケル六水和物、０．１５６ｇ／Ｌ 硫酸銅五水和物を溶かして調製した。
菌株のグリセロールストック溶液５０μＬを種母培地１０ｍＬに接種し、３０℃で２４時間振盪培養した。得られた培養液を前培養液とした。
ＰＨＡ生産培養は、フラスコで行った。５００ｍＬ容量の振盪フラスコにＰＨＡ生産培地５０ｍＬを入れた。植菌直前に、マグネシウム溶液を２５０μＬ、微量金属溶液を５０μＬ、ＰＫＯを１ｇ添加し、さらに２－プロペン－１－オールを０．２ｇ／Ｌとなるように添加した。培地調製後、振盪フラスコに前培養液を５００μＬ接種し、３０℃で７２時間振盪培養を行った。
（精製）
培養終了後、遠心分離によって菌体を回収し、水で懸濁した後、終濃度３％（ｗ／ｖ）となるようにラウリル硫酸ナトリウムを添加した。調製した菌体溶液を、氷冷しながら超音波で処理し、菌体を破砕した。破砕菌体溶液から遠心分離によってＰＨＡを沈殿として回収し、水およびエタノールで１回ずつ洗浄した後、沈殿を６０℃で２時間真空乾燥して、精製ＰＨＡとして取得した。
得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表１に示す。
２－プロペン－１－オールを１．０ｇ／Ｌ含有する培地における、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産
実施例１と同様に、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。ただし、ＰＨＡ生産培養において培地中に添加する２－プロペン－１－オールの終濃度は１．０ｇ／Ｌとした。得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表１に示す。
３－ブテン－１－オールを０．２ｇ／Ｌ含有する培地における、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産
実施例１と同様に、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。ただし、ＰＨＡ生産培養において２－プロペン－１－オールの代わりに、３－ブテン－１－オールを終濃度０．２ｇ／Ｌとなるよう培地中に添加した。得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表１に示す。
３－ブテン－１－オールを１．０ｇ／Ｌ含有する培地における、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産
実施例３と同様に、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。ただし、ＰＨＡ生産培養において培地中に添加する３－ブテン－１－オールの終濃度は１．０ｇ／Ｌとした。得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表１に示す。
５－ヘキセン－１－オールを０．２ｇ／Ｌ含有する培地における、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産
実施例１と同様に、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。ただし、ＰＨＡ生産培養において２－プロペン－１－オールの代わりに、５－ヘキセン－１－オールを終濃度０．２ｇ／Ｌとなるよう培地中に添加した。得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表１に示す。
５－ヘキセン－１－オールを１．０ｇ／Ｌ含有する培地における、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産
実施例５と同様に、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。ただし、培地中に添加する５－ヘキセン－１－オールの終濃度は１．０ｇ／Ｌとした。得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表１に示す。
２－プロピン－１－オールを０．２ｇ／Ｌ含有する培地における、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産
実施例１と同様に、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。ただし、ＰＨＡ生産培養において２－プロペン－１－オールの代わりに、２－プロピン－１－オールを終濃度０．２ｇ／Ｌとなるよう培地中に添加した。得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表１に示す。
２－プロピン－１－オールを１．０ｇ／Ｌ含有する培地における、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産
実施例７と同様に、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。ただし、培地中に添加する２－プロピン－１－オールの終濃度は１．０ｇ／Ｌとした。得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表１に示す。
３－ブチン－１－オールを０．２ｇ／Ｌ含有する培地における、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産
実施例１と同様に、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。ただし、ＰＨＡ生産培養において２－プロペン－１－オールの代わりに、３－ブチン－１－オールを終濃度０．２ｇ／Ｌとなるよう培地中に添加した。得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表１に示す。
３－ブチン－１－オールを１．０ｇ／Ｌ含有する培地における、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産
実施例９と同様に、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。ただし、培地中に添加する３－ブチン－１－オールの終濃度は１．０ｇ／Ｌとした。得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行いった。その結果を表１に示す。
５－ヘキシン－１－オールを０．２ｇ／Ｌ含有する培地における、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産
実施例１と同様に、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。ただし、ＰＨＡ生産培養において２－プロペン－１－オールの代わりに、５－ヘキシン－１－オールを終濃度０．２ｇ／Ｌとなるよう培地中に添加した。得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表１に示す。
５－ヘキシン－１－オールを１．０ｇ／Ｌ含有する培地における、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産
実施例１１と同様に、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。ただし、培地中に添加する５－ヘキシン－１－オールの終濃度は１．０ｇ／Ｌとした。得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表１に示す。
２－メルカプトエタノールを０．２ｇ／Ｌ含有する培地における、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産
実施例１と同様に、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。ただし、ＰＨＡ生産培養において２－プロペン－１－オールの代わりに、２－メルカプトエタノールを終濃度０．２ｇ／Ｌとなるよう培地中に添加した。得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表１に示す。
３－メルカプトプロパノールを０．２ｇ／Ｌ含有する培地における、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産
実施例１と同様に、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。ただし、ＰＨＡ生産培養において２－プロペン－１－オールの代わりに、３－メルカプトプロパノールを終濃度０．２ｇ／Ｌとなるよう培地中に添加した。得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表１に示す。
エチレングリコールモノアリルエーテルを０．２ｇ／Ｌ含有する培地における、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産
実施例１と同様に、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。ただし、ＰＨＡ生産培養において２－プロペン－１－オールの代わりに、エチレングリコールモノアリルエーテルを終濃度０．２ｇ／Ｌとなるよう培地中に添加した。得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表１に示す。
エチレングリコールモノアリルエーテルを１．０ｇ／Ｌ含有する培地における、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産
実施例１５と同様に、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。ただし、培地中に添加するエチレングリコールモノアリルエーテルの終濃度は１．０ｇ／Ｌとした。得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表１に示す。
（比較例１）特定のアルコールなどを含有しない培地における、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産
ＰＨＡ生産培養において培地中に２－プロペン－１－オールを添加しない以外は、実施例１と同様に、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表１に示す。
（比較例２）２－アミノエタノール塩酸塩を０．２ｇ／Ｌ含有する培地における、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産
実施例１と同様に、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。ただし、ＰＨＡ生産培養において２－プロペン－１－オールの代わりに、２－アミノエタノール塩酸塩を終濃度０．２ｇ／Ｌとなるよう培地中に添加した。得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表１に示す。
（比較例３）２－アミノエタノール塩酸塩を１．０ｇ／Ｌ含有する培地における、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産
比較例２と同様に、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。ただし、培地中に添加する２－アミノエタノール塩酸塩の終濃度は１．０ｇ／Ｌとした。得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表１に示す。
（比較例４）３－アミノプロパノール塩酸塩を０．２ｇ／Ｌ含有する培地における、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産
実施例１と同様に、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。ただし、ＰＨＡ生産培養において２－プロペン－１－オールの代わりに、３－アミノプロパノール塩酸塩を終濃度０．２ｇ／Ｌとなるよう培地中に添加した。得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表１に示す。
（比較例５）２－アミノエタノール塩酸塩を１．０ｇ／Ｌ含有する培地における、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産
比較例４と同様に、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。ただし、培地中に添加する３－アミノプロパノール塩酸塩の終濃度は１．０ｇ／Ｌとした。得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表１に示す。
（比較例６）１，２－エタンジチオールを０．２ｇ／Ｌ含有する培地における、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産
実施例１と同様に、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。ただし、ＰＨＡ生産培養において２－プロペン－１－オールの代わりに、１，２－エタンジチオールを終濃度０．２ｇ／Ｌとなるよう培地中に添加した。得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表１に示す。
（比較例７）１，３－プロパンジチオールを０．２ｇ／Ｌ含有する培地における、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産
実施例１と同様に、ＫＮＫ－００５ ｔｒｃ－ｐｈａＪ４ｂ／ΔｐｈａＺ１，２，６株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。ただし、ＰＨＡ生産培養において２－プロペン－１－オールの代わりに、培地中に１，３－プロパンジチオールを終濃度０．２ｇ／Ｌとなるよう添加した。得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表１に示す。
Figure 0006990169000001
（結果と考察）
表１の結果から、アルキニル基、アルケニル基、チオール基またはアリル基を有するアルコールを培地中に添加してＰＨＡ生産微生物を培養した実施例１～１６では、これらアルコールを添加していない比較例１と比べ、得られたＰＨＡの分子量が、重量平均分子量（Ｍw）、数平均分子量（Ｍn）ともに低下したことから、添加したアルコールが停止剤として機能し、その結果、カルボキシ末端に、アルケニル基、アルキニル基、チオール基またはアリル基が導入されたＰＨＡが生産されていると推察できる。ただし、５－ヘキセン－１－オールを添加した場合には、その培地中への添加濃度が１ｇ／Ｌの場合のみ、ＰＨＡの大幅な分子量低下が認められた。
図１、図２はそれぞれ、実施例８、１６の1Ｈ－ＮＭＲチャートである。比較のため、図３に比較例１の1Ｈ－ＮＭＲチャートを示す。図３に比べ、図１では４．７ｐｐｍ付近にプロピニル基中のメチレンプロトンに帰属されるピークが現れており、また図２では４．５ｐｐｍ、５．９ｐｐｍ付近にアリル基に帰属されるピークが現れており、これらの基が導入されていることが分かる。
一方、比較例２～５では、２－アミノエタノールや３－アミノ－１－プロパノールを培地中に添加してもＰＨＡの分子量低下は認められなかった。この結果は、これらのアミノアルコールが微生物により代謝されたことが原因と考えられる。また、比較例６、７でも、１，２－エタンジチオールや１，３－プロパンジチオールは培地中に添加してもＰＨＡの分子量低下が認められず、ジチオールは停止剤としては機能しないと考えられる。
以上の結果から、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物を、アルキニル基、アルケニル基、チオール基またはアリル基を有するアルコールを培地中に添加して培養することにより、カルボキシ末端に、アルケニル基、アルキニル基、チオール基またはアリル基を導入されたＰＨＡが生産できることが示唆された。
（製造例１）Ｈ１６ ΔｐｈａＺ１，２，６株の作製
Ｈ１６ΔｐｈａＺ１，２，６株を作製するにあたって、まず、ＷＯ２０１４／０６５２５３号記載のＫＮＫ－００５ ΔｐｈａＺ１，２，６株をもとに、ＰＨＡ合成酵素遺伝子が破壊されたＨ１６ ΔｐｈａＣ１ ΔｐｈａＺ１，２，６株を以下の手順で作製した。ＫＮＫ－００５ ΔｐｈａＺ１，２，６株は、染色体上のｐｈａＺ１遺伝子およびｐｈａＺ６遺伝子を全長欠失し、ｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号５に記載のＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する菌株である。
まずＫＮＫ－００５ ΔｐｈａＺ１，２，６株のＰＨＡ合成酵素遺伝子を全長欠損するためのプラスミドを作製した。Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号６および配列番号７で示したＤＮＡをプライマーペアとして、ＰＣＲを行った。ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓ（東洋紡）を用いた。同様に、配列番号８および配列番号９で示したＤＮＡをプライマーペアとして、ＰＣＲを行った。上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号６および配列番号９で示したＤＮＡをプライマーペアとして、同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍｉＩで消化した。このＤＮＡ断片を、特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢをＳｍｉＩで消化して得られたＤＮＡ断片と、ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ、東洋紡）を用いて連結し、ｐｈａＣ１遺伝子より上流の塩基配列、およびｐｈａＣ１遺伝子より下流の塩基配列を有するＰＨＡ合成酵素遺伝子破壊用プラスミドｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－ΔｐｈａＣ１ＵＬを作製した。
このＰＨＡ合成酵素遺伝子破壊用プラスミドｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－ΔｐｈａＣ１ＵＬを大腸菌Ｓ１７－１株（ＡＴＣＣ４７０５５）に導入し、ＫＮＫ－００５ ΔｐｈａＺ１，２，６株とＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ）上で混合培養して接合伝達を行った。
上記接合伝達後の菌株から、２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン硫酸塩を含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム ７水和物０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）上で生育する菌株を選択し、前記プラスミドがＫＮＫ－００５ ΔｐｈａＺ１，２，６株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ）で２世代培養した後、１５％のショ糖を含むＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地で生育する菌株を選択した。得られた菌株から染色体上にある配列番号５記載のＰＨＡ合成酵素遺伝子が全長欠失された菌株をＰＣＲにより選別し、うち１株をＨ１６ ΔｐｈａＣ１ ΔｐｈａＺ１，２，６株と命名した。Ｈ１６ ΔｐｈａＣ１ ΔｐｈａＺ１，２，６株は、Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株を親株とし、染色体上のｐｈａＺ１遺伝子およびｐｈａＺ６遺伝子を全長欠失し、ｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＣ１遺伝子が全長欠失された菌株である。
次に、得られたＨ１６ ΔｐｈａＣ１ ΔｐｈａＺ１，２，６株をもとに、配列番号１０記載のＣ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株由来のｐｈａＣ１遺伝子が挿入されたＨ１６ ΔｐｈａＣ１，２，６株を以下の手順で作製した。
まずＣ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株のｐｈａＣ１遺伝子を染色体上に挿入するためのプラスミドを作製した。Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号６および配列番号９で示したＤＮＡをプライマーペアとして、ＰＣＲを行った。ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓを用いた。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍｉＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢをＳｍｉＩで消化して得られたＤＮＡ断片と、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、ｐｈａＣ１遺伝子より上流の塩基配列、ｐｈａＣ１遺伝子、およびｐｈａＣ１遺伝子より下流の塩基配列を有するＰＨＡ合成酵素遺伝子破壊用プラスミドｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－ｐｈａＣRe＋ＵＬを作製した。
上記ＰＨＡ合成酵素遺伝子破壊と同様の手順で、Ｈ１６ ΔｐｈａＣ１ ΔｐｈａＺ１，２，６株を親株とし、ｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－ｐｈａＣRe＋ＵＬが染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地で２世代培養した後、１５％のショ糖を含むＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地で生育する菌株を選択した。得られた菌株から染色体上にあるｐｈａＣ１遺伝子が挿入された菌株をＰＣＲにより選別し、うち１株をＨ１６ ΔｐｈａＺ１，２，６株と命名した。Ｈ１６ ΔｐｈａＺ１，２，６株は、Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株を親株とし、染色体上のｐｈａＺ１遺伝子およびｐｈａＺ６遺伝子を全長欠失し、ｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ由来の野生型ＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子を染色体上に有する菌株である。
（製造例２）ＲｅＳＫ００３株の作製
製造例１記載のＨ１６ ΔｐｈａＣ１ ΔｐｈａＺ１，２，６株をもとに、染色体上に配列番号１１に記載する塩基配列からなるＰＨＡ合成酵素遺伝子が挿入されたＲｅＳＫ００３株を作製した。配列番号１１に記載する塩基配列からなるＰＨＡ合成酵素遺伝子は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｓｐ．６１－３由来で、３２５番目のセリンがトレオニンに、４７７番目のセリンがアルギニンに、４８１番目のグルタミンがアルギニンにそれぞれ人工的に置き換えられた、配列番号３記載のアミノ酸配列からなるＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子である。
まず、配列番号１２記載の発現調節配列下で、配列番号１３記載のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｓｐ．６１－３株由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子を発現するプラスミドｐＣＵＰ２－ＲＥＰ－ｐｈａＣ１Psを作製した。配列番号１１記載の発現調節配列は、Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒ Ｈ１６株由来のｐｈａＣＡＢオペロンのプロモーターである。Ｃ． ｎｅｃａｔｏｒＨ１６株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１４および配列番号１５で示したＤＮＡをプライマーペアとして、ＰＣＲを行った。ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓを用いた。同様に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｓｐ．６１－３株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１６および配列番号１７で示したＤＮＡをプライマーペアとして、ＰＣＲを行った。上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号１４および配列番号１７で示したＤＮＡをプライマーペアとして、同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化した。このＤＮＡ断片を、特開２００７－２５９７０８号公報記載のベクターｐＣＵＰ２をＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化して得られたＤＮＡ断片と、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、上記プラスミドｐＣＵＰ２－ＲＥＰ－ｐｈａＣ１Psを作製した。
次に、ｐＣＵＰ２－ＲＥＰ－ｐｈａＣ１Psを鋳型とし、配列番号１４および配列番号１８で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。同様に、配列番号１９および配列番号２０で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。同様に、配列番号２１および配列番号１７で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。上記ＰＣＲで得られた３種類のＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号１４および配列番号１７で示したＤＮＡをプライマーペアとして、同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化した。このＤＮＡ断片を、特開２００７－２５９７０８号公報記載のベクターｐＣＵＰ２をＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化して得られたＤＮＡ断片と、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、上記プラスミドｐＣＵＰ２－ＲＥＰ－ｐｈａＣ１Ps S325T,S477R,Q481Rを作製した。
次に、配列番号１１記載のＰＨＡ合成酵素遺伝子を染色体上に挿入するためのプラスミドを作製した。ｐＣＵＰ２－ＲＥＰ－ｐｈａＣ１Ps S325T,S477R,Q481Rを鋳型とし、配列番号６および配列番号２２で示したＤＮＡをプライマーペアとして、ＰＣＲを行った。ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓを用いた。同様に、配列番号２３および配列番号９で示したＤＮＡをプライマーペアとしてＰＣＲを行った。上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号６および配列番号９で示したＤＮＡをプライマーペアとして、同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｍｉＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢをＳｍｉＩで消化して得られたＤＮＡ断片と、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、ｐｈａＣ１遺伝子より上流の塩基配列、配列番号１１記載のＰＨＡ合成酵素遺伝子、およびｐｈａＣ１遺伝子より下流の塩基配列を有するＰＨＡ合成酵素遺伝子破壊用プラスミドｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－ΔｐｈａＣ１ＵＬ：：ＳＴＳＲＱＲを作製した。
製造例１記載のＰＨＡ合成酵素遺伝子挿入と同様の手順で、Ｈ１６ ΔｐｈａＣ１ ΔｐｈａＺ１，２，６株を親株とし、ｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－ΔｐｈａＣ１ＵＬ：：ＳＴＳＲＱＲを用いて、配列番号１１記載のＰＨＡ合成酵素遺伝子を染色体上に挿入した。得られた菌株をＲｅＳＫ００３株と命名した。ＲｅＳＫ００３株は、Ｈ１６ ΔｐｈａＣ１ ΔｐｈａＺ１，２，６株を親株とし、配列番号１１記載のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来の変異型ＰＨＡ合成酵素遺伝子が染色体上に挿入された菌株である。
２－プロペン－１－オールを１．０ｇ／Ｌ含有する培地における、Ｈ１６ ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産
実施例１と同様の方法で、製造例１で作製したＨ１６ ΔｐｈａＺ１，２，６株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。ただし、培地中に添加する２－プロペン－１－オールの終濃度は１．０ｇ／Ｌとした。得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表２に示す。
２－プロピン－１－オールを１．０ｇ／Ｌ含有する培地における、Ｈ１６ ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産
実施例１５と同様の方法で、製造例１で作製したＨ１６ ΔｐｈａＺ１，２，６株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。ただし、ＰＨＡ生産培養において培地中に２－プロペン－１－オールの代わりに、２－プロピン－１－オールを終濃度１．０ｇ／Ｌとなるよう培地中に添加した。得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表２に示す。
（比較例８）特定のアルコールを含有しない培地における、Ｈ１６ ΔｐｈａＺ１，２，６株によるＰＨＡの生産 ＰＨＡ生産培養において培地中に２－プロペン－１－オールをは添加しない以外は、実施例１５と同様の方法で、製造例１で作製したＨ１６ ΔｐｈａＺ１，２，６株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表２に示す。
Figure 0006990169000002
（結果と考察）
表２の結果から、２－プロペン－１－オールまたは２－プロピン－１－オールを培地中に添加した実施例１７、１８では、これらアルコールを添加していない比較例８と比べ、ＰＨＡの分子量がＭw、Ｍnともに低下したことから、添加したアルコールが停止剤として機能し、その結果、カルボキシ末端に、プロペニル基またはプロピニル基が導入されたＰＨＡが生産されていると推察できる。以上の結果から、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属由来ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物を、アルキニル基またはアルケニル基を有するアルコールを培地中に添加して培養することによりカルボキシ末端に、アルケニル基またはアルキニル基が導入されたＰＨＡが生産できることが示唆された。
２－プロペン－１－オールを１．０ｇ／Ｌ含有する培地における、ＲｅＳＫ００３株によるＰＨＡの生産
実施例１と同様の方法で、製造例２で作製したＲｅＳＫ００３株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。ただし、培地中に添加する２－プロペン－１－オールの終濃度は１．０ｇ／Ｌとした。得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表３に示す。
２－プロピン－１－オールを１．０ｇ／Ｌ含有する培地における、ＲｅＳＫ００３株によるＰＨＡの生産
実施例１９と同様の方法で、製造例１で作製したＲｅＳＫ００３株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。ただし、ＰＨＡ生産培養において２－プロペン－１－オールの代わりに、２－プロピン－１－オールを終濃度１．０ｇ／Ｌとなるよう培地中に添加した。得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表３に示す。
（比較例９）特例のアルコールを含有しない培地における、ＲｅＳＫ００３株によるＰＨＡの生産
ＰＨＡ生産培養において培地中に２－プロペン－１－オールを添加しない以外は、実施例１７と同様の方法で、製造例１で作製したＲｅＳＫ００３株を培養、精製し精製ＰＨＡを取得した。た得られたＰＨＡについて、モノマーユニット共重合比率と分子量の分析を行った。その結果を表３に示す。
Figure 0006990169000003
（結果と考察）
表３の結果から、２－プロペン－１－オールまたは２－プロピン－１－オールを添加した実施例１９、２０では、これらアルコールを添加していない比較例９と比べ、ＰＨＡの分子量がＭw、Ｍnともに低下したことから、添加したアルコールが停止剤として機能し、その結果、カルボキシ末端に、プロペニル基またはプロピニル基が導入されたＰＨＡが生産されていると推察できる。以上の結果から、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物を、アルキニル基またはアルケニル基を有するアルコールを培地中に添加して培養することによりカルボキシ末端に、アルケニル基またはアルキニル基が導入しされたＰＨＡが生産できることが示唆された。

Claims (12)

  1. 繰り返し単位が下記一般式（１）
    ［－Ｃ*ＨＲ1－ＣＨ2－ＣＯ－Ｏ－］ ・・・（１）
    （式中、Ｒ1はＣnＨ2n+1で表されるアルキル基であり、ｎは１～９の整数であり、＊は不斉炭素であることを表す。）
    で示されるＲ－３－ヒドロキシアルカン酸の単独又は共重合ポリマーであって、該ポリマーが単独ポリマーであるか共重合ポリマーであるかに応じて、カルボキシ末端に以下に示す基が結合しており、数平均分子量７０００～１５０００００を有することを特徴とするポリヒドロキシアルカン酸。
    （１）単独ポリマーである時にカルボキシ末端に結合する基
    炭素数４～８のアルキニル基、
    炭素数３～８のアルケニル基、
    炭素数２、４～８のメルカプトアルキル基、または
    アルキル基の炭素数が２～６のアリル（ポリ）オキシアルキル基、
    （２）共重合ポリマーである時にカルボキシ末端に結合する基
    炭素数３～８のアルキニル基、
    炭素数３～８のアルケニル基、
    炭素数２～８のメルカプトアルキル基、または
    アルキル基の炭素数が２～６のアリル（ポリ）オキシアルキル基
  2. カルボキシ末端に、アルキン基、アルケン基、チオール基またはアリル基が導入された微生物産生ポリヒドロキシアルカン酸であり、
    前記ヒドロキシアルカン酸が３－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシプロピオン酸、４－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシ吉草酸、５－ヒドロキシ吉草酸、３－ヒドロキシヘキサン酸、６－ヒドロキシヘキサン酸、３－ヒドロキシヘプタン酸、３－ヒドロキシオクタン酸、３－ヒドロキシノナン酸、３－ヒドロキシデカン酸、３－ヒドロキシウンデカン酸、３－ヒドロキシドデカン酸から選ばれる複数種で構成され、数平均分子量７０００～１５０００００を有することを特徴とするポリヒドロキシアルカン酸。
  3. カルボキシ末端に、アルキン基、アルケン基、チオール基またはアリル基が導入された微生物産生ポリヒドロキシアルカン酸であり、
    前記ヒドロキシアルカン酸が３－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシプロピオン酸、４－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシ吉草酸、５－ヒドロキシ吉草酸、３－ヒドロキシヘキサン酸、６－ヒドロキシヘキサン酸、３－ヒドロキシヘプタン酸、３－ヒドロキシオクタン酸、３－ヒドロキシノナン酸、３－ヒドロキシデカン酸、３－ヒドロキシウンデカン酸、３－ヒドロキシドデカン酸から選ばれる単一種で構成されており、
    前記アルキン基が、ブチニル基、ペンチニル基、又はヘキシニル基であり、
    前記アルケン基が、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、又はヘキセニル基であり、
    前記チオール基が、メルカプトエチル基、メルカプトブチル基、メルカプトペンチル基、又はメルカプトヘキシル基であり、
    前記アリル基が、アリルオキシエチル基、アリルオキシプロピル基、又はアリルオキシブチル基であり、
    数平均分子量７０００～１５０００００を有することを特徴とするポリヒドロキシアルカン酸。
  4. Ｒ－３－ヒドロキシアルカン酸の共重合ポリマーであって、モノマーユニットとして少なくとも３－ヒドロキシ酪酸を含む請求項１または２に記載のポリヒドロキシアルカン酸。
  5. Ｒ－３－ヒドロキシアルカン酸の単独重合ポリマーであって、モノマーユニットが３－ヒドロキシ酪酸である請求項１または３に記載のポリヒドロキシアルカン酸。
  6. モノマーユニットとしてさらに３－ヒドロキシヘキサン酸を含む請求項４に記載のポリヒドロキシアルカン酸。
  7. 請求項１～６のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカン酸を製造する方法であって、
    アルキン基、アルケン基、チオール基、またはアリル基を有するアルコールを用いて、ポリヒドロキシアルカン酸を生産可能な微生物を培養する工程を含み、
    前記微生物が、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子を有する微生物であり、カルボキシ末端に、アルキン基、アルケン基、チオール基、またはアリル基が導入されたポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
  8. 請求項１～６のいずれかに記載のポリヒドロキシアルカン酸を製造する方法であって、
    アルキン基、アルケン基、チオール基、またはアリル基を有する炭素数２～８のアルコールを用いて、ポリヒドロキシアルカン酸を生産可能なＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属に属する微生物を培養する工程を含む、カルボキシ末端に、アルキン基、アルケン基、チオール基、またはアリル基が導入されたポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
  9. 前記アルコールが第一級アルコールである請求項７または８に記載の製造方法。
  10. 前記微生物が、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒを宿主とする形質転換体である請求項８に記載の製造方法。
  11. 請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヒドロキシアルカン酸のカルボキシ末端のアルキニル基、アルケニル基、またはチオール基がさらに化学修飾された化合物であって、以下の（１）または（２）を満たす化合物。
    （１）ポリヒドロキシアルカン酸のカルボキシ末端のアルケニル基またはアルキニル基に、チオール基を含有する化合物をチオール－エンクリック反応またはチオール－インクリック反応により転位させてなる化合物、
    （２）ポリヒドロキシアルカン酸のカルボキシ末端のチオール基に、アルケニル基またはアルキニル基を含有する化合物をチオール－エンクリック反応またはチオール－インクリック反応により転位させてなる化合物
  12. 請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヒドロキシアルカン酸、または請求項１１に記載の化合物を含有する成形体。
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