JP6963667B2 - メッセンジャーｒｎａのカプセル化 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その開示がその全体において参照により本明細書に組み込まれる、２０１４
年７月２日に出願された、米国仮特許出願第６２／０２０，１６３号に対する優先権を主
張する。

メッセンジャーＲＮＡ療法（ＭＲＴ）は、様々な疾患の処置のためのますます重要な手
法となっている。ＭＲＴは、患者の体内でのｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の産
生のためにその治療を必要とする患者へのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の投与を必
然的に含む。脂質ナノ粒子は、ｍＲＮＡの効率的なインビボでの送達のためにｍＲＮＡを
カプセル化するためによく使用される。しかしながら、ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を産生
するための現行の方法は、カプセル化効率が乏しい、低いｍＲＮＡ回収及び／または不均
質な粒子サイズという問題を抱える。

本発明は、なかでも、脂質ナノ粒子製剤及びｍＲＮＡカプセル化のための改善されたプ
ロセスを提供する。特に、本発明は、混合する前にｍＲＮＡ溶液及び／または脂質溶液を
前もって加熱することが、有意に改善されたカプセル化効率、ｍＲＮＡ回収率、及びより
均質かつより小さい粒子サイズ（例えば、１００ｎｍ未満）をもたらすという驚くべき発
見に基づく。

ゆえに、いくつかの実施形態では、本発明は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を脂
質ナノ粒子内にカプセル化するプロセスであって、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混合するス
テップを含み、ｍＲＮＡ溶液及び／または脂質溶液が、周囲温度を超える所定の温度であ
る、前記プロセスを提供する。いくつかの実施形態では、本発明に好適な所定の温度は、
約３０℃、３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、または７０℃以
上である。いくつかの実施形態では、本発明に好適な所定の温度は、約２５〜７０℃、約
３０〜７０℃、約３５〜７０℃、約４０〜７０℃、約４５〜７０℃、約５０〜７０℃、ま
たは約６０〜７０℃の範囲である。特定の実施形態では、本発明に好適な所定の温度は、
約６５℃である。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液及び脂質溶液は、混合前に別々に所定の温度ま
で加熱される。いくつかの実施形態では、混合する前に、ｍＲＮＡ溶液は、所定の温度ま
で加熱され、脂質溶液は、周囲温度である。いくつかの実施形態では、周囲温度のｍＲＮ
Ａ原液を加熱された緩衝液に加えて所定の温度にすることによって、ｍＲＮＡ溶液は所定
の温度まで加熱される。いくつかの実施形態では、緩衝液は、約４．５以下（例えば、約
４．４、４．２、４．０または３．８以下）のｐＨを有する。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液及び脂質溶液は、低パルス流ポンプにより混合
される。いくつかの実施形態では、好適なポンプは、ギアポンプである。いくつかの実施
形態では、好適なポンプは、蠕動ポンプである。いくつかの実施形態では、好適なポンプ
は、渦巻きポンプである。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約１５０〜２５０ｍｌ／分、２５０〜５０
０ｍｌ／分、５００〜１０００ｍｌ／分、１０００〜２０００ｍｌ／分、２０００〜３０
００ｍｌ／分、３０００〜４０００ｍｌ／分、または４０００〜５０００ｍｌ／分の範囲
の流速で混合される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約２００ｍｌ／分、約
５００ｍｌ／分、約１０００ｍｌ／分、約２０００ｍｌ／分、約３０００ｍｌ／分、約４
０００ｍｌ／分、または約５０００ｍｌ／分の流速で混合される。

いくつかの実施形態では、脂質溶液は、約２５〜７５ｍｌ／分、約７５〜２００ｍｌ／
分、約２００〜３５０ｍｌ／分、約３５０〜５００ｍｌ／分、約５００〜６５０ｍｌ／分
、約６５０〜８５０ｍｌ／分、または約８５０〜１０００ｍｌ／分の範囲の流速で混合さ
れる。いくつかの実施形態では、脂質溶液は、約５０ｍｌ／分、約１００ｍｌ／分、約１
５０ｍｌ／分、約２００ｍｌ／分、約２５０ｍｌ／分、約３００ｍｌ／分、約３５０ｍｌ
／分、約４００ｍｌ／分、約４５０ｍｌ／分、約５００ｍｌ／分、約５５０ｍｌ／分、約
６００ｍｌ／分、約６５０ｍｌ／分、約７００ｍｌ／分、約７５０ｍｌ／分、約８００ｍ
ｌ／分、約８５０ｍｌ／分、約９００ｍｌ／分、約９５０ｍｌ／分、または約１０００ｍ
ｌ／分の流速で混合される。

いくつかの実施形態では、本発明に係るプロセスは、クエン酸塩緩衝液をｍＲＮＡ原液
と混合することによりｍＲＮＡ溶液をまず生成するステップを含む。ある特定の実施形態
では、好適なクエン酸塩緩衝液は、約１０ｍＭクエン酸塩、約１５０ｍＭ ＮａＣｌ、約
４．５のｐＨを含有する。いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡ原液は、ｍＲＮＡを
、約０．１０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ、または
約１００ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で含有する。

いくつかの実施形態では、クエン酸塩緩衝液は、約１００〜３００ｍｌ／分、３００〜
６００ｍｌ／分、６００〜１２００ｍｌ／分、１２００〜２４００ｍｌ／分、２４００〜
３６００ｍｌ／分、３６００〜４８００ｍｌ／分、または４８００〜６０００ｍｌ／分の
間の範囲の流速で混合される。いくつかの実施形態では、クエン酸塩緩衝液は、約２２０
ｍｌ／分、約６００ｍｌ／分、約１２００ｍｌ／分、約２４００ｍｌ／分、約３６００ｍ
ｌ／分、約４８００ｍｌ／分、または約６０００ｍｌ／分の流速で混合される。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ原液は、約１０〜３０ｍｌ／分、約３０〜６０ｍｌ
／分、約６０〜１２０ｍｌ／分、約１２０〜２４０ｍｌ／分、約２４０〜３６０ｍｌ／分
、約３６０〜４８０ｍｌ／分、または約４８０〜６００ｍｌ／分の間の範囲の流速で混合
される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ原液は、約２０ｍｌ／分、約４０ｍｌ／分、
約６０ｍｌ／分、約８０ｍｌ／分、約１００ｍｌ／分、約２００ｍｌ／分、約３００ｍｌ
／分、約４００ｍｌ／分、約５００ｍｌ／分、または約６００ｍｌ／分の流速で混合され
る。

いくつかの実施形態では、脂質溶液は、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上のヘルパ
ー脂質、１つ以上のコレステロール系脂質及びＰＥＧ脂質をエタノール中に含有する。い
くつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液及び脂質溶液が２０％エタノール中へと混合され、
脂質ナノ粒子の懸濁液を結果もたらす。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、タン
ジェンシャルフローろ過によりさらに精製される。

いくつかの実施形態では、精製されたナノ粒子の約５０％、５５％、６０％、６５％、
７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９
９％超が、約１００ｎｍ未満（例えば、約９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、約８０ｎ
ｍ、約７５ｎｍ、約７０ｎｍ、約６５ｎｍ、約６０ｎｍ、約５５ｎｍ、または約５０ｎｍ
未満）のサイズを有する。いくつかの実施形態では、実質的に全ての精製されたナノ粒子
が、１００ｎｍ未満（例えば、約９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、約８０ｎｍ、約７
５ｎｍ、約７０ｎｍ、約６５ｎｍ、約６０ｎｍ、約５５ｎｍ、または約５０ｎｍ未満）の
サイズを有する。

いくつかの実施形態では、精製されたナノ粒子の約７０％、７５％、８０％、８５％、
９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超が、約４０〜９０ｎｍ（例えば、約
４０〜８５ｎｍ、約４０〜８０ｎｍ、約４０〜７５ｎｍ、約４０〜７０ｎｍ、約４０〜６
５ｎｍ、または約４０〜６０ｎｍ）の範囲のサイズを有する。いくつかの実施形態では、
実質的に全ての精製されたナノ粒子が、約４０〜９０ｎｍ（例えば、約４０〜８５ｎｍ、
約４０〜８０ｎｍ、約４０〜７５ｎｍ、約４０〜７０ｎｍ、約４０〜６５ｎｍ、または約
４０〜６０ｎｍ）の範囲のサイズを有する。

いくつかの実施形態では、精製されたナノ粒子は、約８０％、８５％、９０％、９５％
、９６％、９７％、９８％、または９９％を超えるカプセル化効率を有する。いくつかの
実施形態では、本発明に係るプロセスは、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、
８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超えるｍＲＮＡの回
収をもたらす。

いくつかの実施形態では、本発明は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を脂質ナノ粒
子内にカプセル化するプロセスであって、（ａ）ｍＲＮＡ溶液及び／または脂質溶液を、
周囲温度を超える所定の温度まで別々に加熱すること；（ｂ）脂質ナノ粒子の懸濁液を生
成するために加熱したｍＲＮＡ溶液及び／または加熱した脂質溶液を混合すること；及び
（ｃ）脂質ナノ粒子を精製することを含む、前記プロセスを提供する。

別の態様では、本発明は、本明細書に記載のプロセスによって生成される脂質ナノ粒子
の組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、精製された脂質ナノ粒子を含
む組成物であって、精製された脂質ナノ粒子の約９０％超が、約１００ｎｍ未満（例えば
、約９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、約８０ｎｍ、約７５ｎｍ、約７０ｎｍ、約６５
ｎｍ、約６０ｎｍ、約５５ｎｍ、または約５０ｎｍ未満）の個別の粒子サイズを有し、精
製された脂質ナノ粒子の約７０％超が、各個別の粒子内にｍＲＮＡをカプセル化する、前
記組成物を提供する。いくつかの実施形態では、精製された脂質ナノ粒子の約９５％、９
６％、９７％、９８％、または９９％超が、約１００ｎｍ未満（例えば、約９５ｎｍ、約
９０ｎｍ、約８５ｎｍ、約８０ｎｍ、約７５ｎｍ、約７０ｎｍ、約６５ｎｍ、約６０ｎｍ
、約５５ｎｍ、または約５０ｎｍ未満）の個別の粒子サイズを有する。いくつかの実施形
態では、実質的に全ての精製された脂質ナノ粒子が、約１００ｎｍ未満（例えば、約９５
ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、約８０ｎｍ、約７５ｎｍ、約７０ｎｍ、約６５ｎｍ、約
６０ｎｍ、約５５ｎｍ、または約５０ｎｍ未満）の個別の粒子サイズを有する。いくつか
の実施形態では、精製された脂質ナノ粒子の約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％
、９６％、９７％、９８％、または９９％超が、各個別の粒子内にｍＲＮＡをカプセル化
する。いくつかの実施形態では、実質的に全ての精製された脂質ナノ粒子が、各個別の粒
子内にｍＲＮＡをカプセル化する。いくつかの実施形態では、本発明に係る組成物は、少
なくとも約１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、または１０００ｍｇの
カプセル化されたｍＲＮＡを含有する。

いくつかの実施形態では、各個別の脂質ナノ粒子は、１つ以上のカチオン性脂質、１つ
以上のヘルパー脂質、１つ以上のコレステロール系脂質及びＰＥＧ脂質を含む。いくつか
の実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、Ｃ１２−２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭ
Ａ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＩＣＥ（イミダゾール系）、、ＨＧＴ５０
００、ＨＧＴ５００１、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、Ｄ
ＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ及びＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬ
ｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、Ｄ
ＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴ
Ｃ２−ＤＭＡ、ＨＧＴ４００３、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。

いくつかの実施形態では、１つ以上の非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ（１，２−ジステ
アロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−
ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ
−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３
−フォスホチジルコリン）ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホ
スホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホ
スホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ
−（１’−ｒａｃ−グリセロール））から選択される。

いくつかの実施形態では、１つ以上のコレステロール系脂質は、コレステロールまたは
ＰＥＧ化コレステロールである。いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＥＧ修飾された
脂質は、Ｃ_６−Ｃ_２０長さのアルキル鎖（複数可）を有する脂質に共有付着した最大で５
ｋＤａまでの長さのポリ（エチレン）グリコール鎖を含有する。

いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含有するｍＲＮＡをカプセル化するために使用される。いくつかの実施形態では、本発明は、未修飾であるｍＲＮＡをカプセル化するために使用される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を脂質ナノ粒子内にカプセル化するプロセスであって、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混合するステップを含み、前記ｍＲＮＡ溶液及び／または前記脂質溶液が、周囲温度を超える所定の温度である、前記プロセス。
（項目２）
前記所定の温度が、約３０℃、３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、または７０℃であるかそれを超える、項目１に記載のプロセス。
（項目３）
前記所定の温度が、約２５〜７０℃、約３０〜７０℃、約３５〜７０℃、約４０〜７０℃、約４５〜７０℃、約５０〜７０℃、または約６０〜７０℃の範囲である、項目１または２に記載のプロセス。
（項目４）
前記所定の温度が、約６５℃である、先行項目のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目５）
前記ｍＲＮＡ溶液及び前記脂質溶液が、前記混合の前に別々に前記所定の温度まで加熱される、先行項目のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目６）
前記混合の前に、前記ｍＲＮＡ溶液が前記所定の温度まで加熱され、前記脂質溶液が周囲温度である、項目１〜４のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目７）
周囲温度のｍＲＮＡ原液を加熱された緩衝液に加えて前記所定の温度にすることによって、前記ｍＲＮＡ溶液が前記所定の温度まで加熱される、先行項目のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目８）
前記緩衝液が、約４．５以下のｐＨを有する、項目７に記載のプロセス。
（項目９）
前記ｍＲＮＡ溶液及び前記脂質溶液が、低パルス流ポンプにより混合される、先行項目のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１０）
前記ポンプが、ギアポンプである、項目９に記載のプロセス。
（項目１１）
前記ポンプが、渦巻きポンプである、項目９に記載のプロセス。
（項目１２）
前記ｍＲＮＡ溶液が、約１５０〜２５０ｍｌ／分、２５０〜５００ｍｌ／分、５００〜１０００ｍｌ／分、１０００〜２０００ｍｌ／分、２０００〜３０００ｍｌ／分、３０００〜４０００ｍｌ／分、または４０００〜５０００ｍｌ／分の範囲の流速で混合される、先行項目のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１３）
前記ｍＲＮＡ溶液が、約２００ｍｌ／分、約５００ｍｌ／分、約１０００ｍｌ／分、約２０００ｍｌ／分、約３０００ｍｌ／分、約４０００ｍｌ／分、または約５０００ｍｌ／分の流速で混合される、先行項目のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１４）
前記脂質溶液が、約２５〜７５ｍｌ／分、約７５〜２００ｍｌ／分、約２００〜３５０ｍｌ／分、約３５０〜５００ｍｌ／分、約５００〜６５０ｍｌ／分、約６５０〜８５０ｍｌ／分、または約８５０〜１０００ｍｌ／分の範囲の流速で混合される、先行項目のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１５）
前記脂質溶液が、約５０ｍｌ／分、約１００ｍｌ／分、約１５０ｍｌ／分、約２００ｍｌ／分、約２５０ｍｌ／分、約３００ｍｌ／分、約３５０ｍｌ／分、約４００ｍｌ／分、約４５０ｍｌ／分、約５００ｍｌ／分、約５５０ｍｌ／分、約６００ｍｌ／分、約６５０ｍｌ／分、約７００ｍｌ／分、約７５０ｍｌ／分、約８００ｍｌ／分、約８５０ｍｌ／分、約９００ｍｌ／分、約９５０ｍｌ／分、または約１０００ｍｌ／分の流速で混合される、先行項目のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１６）
前記プロセスが、クエン酸塩緩衝液をｍＲＮＡ原液と混合することにより前記ｍＲＮＡ溶液をまず生成するステップを含む、先行項目のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目１７）
前記クエン酸塩緩衝液が、約１０ｍＭクエン酸塩、約１５０ｍＭ ＮａＣｌ、約４．５のｐＨを含む、項目１６に記載のプロセス。
（項目１８）
前記ｍＲＮＡ原液が、前記ｍＲＮＡを、約１ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で含む、項目１６または１７に記載のプロセス。
（項目１９）
前記クエン酸塩緩衝液が、約１００〜３００ｍｌ／分、３００〜６００ｍｌ／分、６００〜１２００ｍｌ／分、１２００〜２４００ｍｌ／分、２４００〜３６００ｍｌ／分、３６００〜４８００ｍｌ／分、または４８００〜６０００ｍｌ／分の間の範囲の流速で混合される、項目１６〜１８のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２０）
前記クエン酸塩緩衝液が、約２２０ｍｌ／分、約６００ｍｌ／分、約１２００ｍｌ／分、約２４００ｍｌ／分、約３６００ｍｌ／分、約４８００ｍｌ／分、または約６０００ｍｌ／分の流速で混合される、項目１６〜１９のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２１）
前記ｍＲＮＡ原液が、約１０〜３０ｍｌ／分、約３０〜６０ｍｌ／分、約６０〜１２０ｍｌ／分、約１２０〜２４０ｍｌ／分、約２４０〜３６０ｍｌ／分、約３６０〜４８０ｍｌ／分、または約４８０〜６００ｍｌ／分の間の範囲の流速で混合される、項目１６〜２０のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２２）
前記ｍＲＮＡ原液が、約２０ｍｌ／分、約４０ｍｌ／分、約６０ｍｌ／分、約８０ｍｌ／分、約１００ｍｌ／分、約２００ｍｌ／分、約３００ｍｌ／分、約４００ｍｌ／分、約５００ｍｌ／分、または約６００ｍｌ／分の流速で混合される、項目１６〜２１のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２３）
前記脂質溶液が、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上のヘルパー脂質、１つ以上のコレステロール系脂質及びＰＥＧ脂質をエタノール中に含む、先行項目のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２４）
前記ｍＲＮＡ溶液及び前記脂質溶液が、２０％エタノール中へと混合され、脂質ナノ粒子の懸濁液を結果もたらす、先行項目のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２５）
前記脂質ナノ粒子が、タンジェンシャルフローろ過によりさらに精製される、項目２４に記載のプロセス。
（項目２６）
前記精製されたナノ粒子の約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超が、１００ｎｍ未満のサイズを有する、項目２５に記載のプロセス。
（項目２７）
実質的に全ての前記精製されたナノ粒子が、１００ｎｍ未満のサイズを有する、項目２６に記載のプロセス。
（項目２８）
前記精製されたナノ粒子の約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超が５０〜８０ｎｍの範囲のサイズを有する、項目２５〜２７のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目２９）
実質的に全ての前記精製されたナノ粒子が、５０〜８０ｎｍの範囲のサイズを有する、項目２５〜２８のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目３０）
前記精製されたナノ粒子が、約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超えるカプセル化率を有する、項目２５〜２９のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目３１）
前記プロセスが、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超えるｍＲＮＡの回収をもたらす、先行項目のいずれか一項に記載のプロセス。
（項目３２）
脂質ナノ粒子内にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をカプセル化するプロセスであって、ａ．ｍＲＮＡ溶液及び／または脂質溶液を、周囲温度を超える所定の温度まで別々に加熱すること；
ｂ．脂質ナノ粒子の懸濁液を生成するために前記加熱したｍＲＮＡ溶液及び／または前記加熱した脂質溶液を混合すること；及び
ｃ．前記脂質ナノ粒子を精製することを含む、前記プロセス。
（項目３４）
先行項目のいずれか一項に記載のプロセスにより生成された脂質ナノ粒子の組成物。
（項目３５）
精製された脂質ナノ粒子を含む組成物であって、前記精製された脂質ナノ粒子の約９０％超が約１００ｎｍ未満のサイズの個別の粒子を有し、前記精製された脂質ナノ粒子の約７０％超が各個別の粒子内にｍＲＮＡをカプセル化している、前記組成物。
（項目３６）
前記精製された脂質ナノ粒子の約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超が、約１００ｎｍ未満の個別粒子サイズを有する、項目３５に記載の組成物。
（項目３７）
実質的に全ての前記精製された脂質ナノ粒子が、約１００ｎｍ未満の個別の粒子サイズを有する、項目３５または３６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３８）
前記精製された脂質ナノ粒子の約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超が、各個別の粒子内にｍＲＮＡをカプセル化する、項目３５〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３９）
実質的に全ての前記精製された脂質ナノ粒子が、各個別の粒子内にｍＲＮＡをカプセル化する、項目３５〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４０）
前記組成物が、少なくとも１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、または１０００ｍｇのカプセル化されたｍＲＮＡを含む、項目３５〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４１）
各個別の脂質ナノ粒子が、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上のヘルパー脂質、１つ以上のコレステロール系脂質及びＰＥＧ脂質を含む、項目３５〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４２）
前記１つ以上のカチオン性脂質が、Ｃ１２−２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＩＣＥ（イミダゾール系）、、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ及びＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ、ＨＧＴ４００３、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目２４に記載のプロセスまたは項目４１に記載の組成物。
（項目４３）
前記１つ以上の非カチオン性脂質が、ＤＳＰＣ（１,２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１,２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１,２−（ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１,２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスホチジルコリン）ＤＰＰＥ（１,２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（、２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））から選択される、項目２４に記載のプロセスまたは項目４１に記載の組成物。
（項目４４）
前記１つ以上のコレステロール系脂質が、コレステロールまたはＰＥＧ化コレステロールである、項目２４に記載のプロセスまたは項目４１に記載の組成物。
（項目４５）
１つ以上のＰＥＧ修飾された脂質が、Ｃ_６−Ｃ_２０長さのアルキル鎖（複数可）を有する脂質に共有付着した最大で５ｋＤａまでの長さのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む、項目２４に記載のプロセスまたは項目４１に記載の組成物。
（項目４６）
前記ｍＲＮＡが、１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含む、先行項目のいずれか一項に記載のプロセスまたは組成物。
（項目４７）
前記ｍＲＮＡが、未修飾である、先行項目のいずれか一項に記載のプロセスまたは組成物。

本発明の他の特性、目的、及び利点は、以下の発明を実施するための形態、図面及び特
許請求の範囲において明らかである。しかしながら、発明を実施するための形態、図面、
及び特許請求の範囲は、本発明の実施形態を示す一方で、制限ではなく、例示としてのみ
与えられることが理解されるべきである。本発明の範囲内で種々の変更及び修正が、当業
者には明らかになるだろう。

図面は、例示のみを目的とし、制限を目的としない。

均質流ポンプを用いた例示的な規模を大きくした脂質ナノ粒子カプセル化ｍＲＮＡの製剤プロセスの概略図を示す。 脂質ナノ粒子の例示的な精製及び緩衝液交換システムを示す。 蠕動ポンプを用いた例示的な規模を大きくした脂質ナノ粒子カプセル化ｍＲＮＡ製剤プロセスの概略図を示す。 精製及び緩衝液交換のための代替の例示的なタンジェンシャルフローろ過システムを示す。 蠕動ポンプを用いた例示的な規模を大きくした脂質ナノ粒子カプセル化ｍＲＮＡ製剤プロセスの代替的な概略図を示す。

定義
本発明がより容易に理解されるために、ある特定の用語を最初に以下に定義する。以下
の用語及び他の用語に対する追加の定義は、本明細書全体を通して明記する。

おおよそまたは約：本明細書で用いるとき、「おおよそ」または「約」という用語は、
対象となる１つ以上の値に適用されるとき、記された基準値に類似する値を指す。ある特
定の実施形態では、「おおよそ」または「約」という用語は、別段の記述がない限り、ま
たは文脈からそうでないと明確でない限り、（かかる数字が可能な値の１００％を超える
場合を除いて）記された基準値のいずれかの方向（より大きいまたはより小さい）で、２
５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１
１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ未満
に入る値の範囲を指す

カプセル化：本明細書で用いるとき、「カプセル化」という用語または文法的等価物は
、個別のｍＲＮＡ分子をナノ粒子内に閉じ込めるプロセスを指す。

改善する、増加させる、または低下させる：本明細書で用いるとき、「改善する」「増
加させる」または「低下させる」という用語または文法的等価物は、本明細書に記載の処
置の開始前の同じ個体での測定値、または本明細書に記載の処置の不在下での対照対象（
または複数の対照対象）における測定値などの、ベースライン測定値に対する値を示す。
「対照対象」は、処置される対象と大体同じ年齢の、処置される対象と同じ形態の疾患に
罹患している対象である。

不純物：本明細書で用いるとき、「不純物」という用語は、標的材料または化合物の化
学組成とは異なる、限られた量の液体、気体、または固体の内部物質を指す。不純物は、
混入物とも称される。

インビトロ：本明細書で用いるとき、「インビトロ」という用語は、多細胞生物内より
むしろ人工的環境下、例えば、試験管または反応槽内、細胞培養物内等で生じる事象を指
す。

インビボ：本明細書で用いるとき、「インビボ」という用語は、ヒト及び非ヒト動物な
どの多細胞生物内で生じる事象を指す。細胞をベースとするシステムの文脈において、本
用語は、（例えば、インビトロシステムと反対に）生存細胞内で生じる事象を指すように
使用されてよい。

単離された：本明細書で用いるとき、「単離された」という用語は、（１）（天然及び
／または実験設定のいずれかで）最初に産生された時にそれが会合していた成分の少なく
ともいくつかから分離されている、ならびに／または（２）人の手により産生された、調
製された、及び／または製造されている、物質及び／または実体を指す。単離された物質
及び／または実体は、それらが最初は会合していた他の成分の約１０％、約２０％、約３
０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９
２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、また
は約９９％超から分離されてよい。いくつかの実施形態では、単離された薬剤は、約８０
％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６
％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％を超えて純粋である。本明細書で用
いるとき、物質は、実質的に他の成分を含まない場合に「純粋」である。本明細書で用い
るとき、単離された物質及び／または実体の純度率（％）の算出は、賦形剤（例えば、緩
衝液、溶媒、水等）を含むべきでない。

メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：本明細書で用いるとき、「メッセンジャーＲＮＡ
（ｍＲＮＡ）」という用語は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドを指す。ｍＲＮＡは、本明細書で用いるとき、修飾及び未修飾ＲＮＡの両方を包含す
る。ｍＲＮＡは、１つ以上のコード領域及び非コード領域を含有してよい。

核酸：本明細書で用いるとき、「核酸」という用語は、その最も広い意味において、ポ
リヌクレオチド鎖に組み込まれているまたは組み込まれることができる任意の化合物及び
／または物質を指す。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介して
ポリヌクレオチド鎖に組み込まれているまたは組み込まれることができる化合物及び／ま
たは物質である。いくつかの実施形態では、「核酸」は、個別の核酸残基（例えば、ヌク
レオチド及び／またはヌクレオシド）を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、個
別の核酸残基を含むポリヌクレオチド鎖を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、
ＲＮＡならびに単鎖及び／または二重鎖ＤＮＡ及び／またはｃＤＮＡを包含する。さらに
は、「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」という用語及び／または同様の用語は、核酸類似
体、すなわち、ホスホジエステル主鎖以外を有する類似体を含む。例えば、いわゆる「ペ
プチド核酸」は、当該分野で既知であり、主鎖にてホスホジエステル結合の代わりにペプ
チド結合を有し、本発明の範囲内であると考えられる。「アミノ酸配列をコードするヌク
レオチド配列」という用語は、互いの変性したものである及び／または同じアミノ酸配列
をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質及び／またはＲＮＡをコードす
るヌクレオチド配列は、イントロンを含んでよい。核酸は、天然源から精製されることが
できる、組み換え発現システムを使用して産生されることができる、及び任意選択で精製
される、化学的に合成されること等ができる。適切な場合、例えば、化学的に合成された
分子の場合、核酸は、化学的に修飾された塩基または糖、主鎖修飾等を有する類似体など
のヌクレオシド類似体を含むことができる。核酸配列は、別段の指定がない限り、５’か
ら３’方向で存在する。いくつかの実施形態では、核酸は、天然ヌクレオシド（例えば、
アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキ
シチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）；ヌクレオシド類似体（例え
ば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メ
チルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル
−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、
Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ
５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノ
シン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、及び
２−チオシチジン）；化学的に修飾された塩基；生物学的に修飾された塩基（例えば、メ
チル化塩基）；挿入された塩基；修飾された糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボ
ース、２’−デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）；及び／または修飾さ
れたリン酸基（例えば、ホスホロチオエート及び５’−Ｎ−ホスホラミダイト結合）であ
るか、これを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、送達を促進するまたは達成する
ために化学的に修飾されていない核酸（例えば、ヌクレオチド及び／またはヌクレオシド
を含む、ポリヌクレオチド及び残基）を意味する「未修飾核酸」に特異的に関連する。

塩：本明細書で用いるとき、「塩」という用語は、酸と塩基間の中和反応から結果生じ
るまたは生じ得るイオン性化合物を指す。

実質的に：本明細書で用いるとき、「実質的に」という用語は、全てまたはほぼ全ての
程度または度合いの対象となる特徴または特性を呈する定性的状態を指す。生物学分野の
当業者は、生物学的及び化学的現象が、もしあっても、完成する及び／または完成へと進
むもしくは絶対的結果を達成するまたは回避することがめったにないことを理解するだろ
う。「実質的に」という用語は、それゆえ、本明細書で、多くの生物学的及び化学的現象
に固有の完全性の潜在的な欠如を捕らえるように使用される。

収率：本明細書で用いるとき、「収率」という用語は、出発物質としての総ｍＲＮＡと
比較してカプセル化後に回収されたｍＲＮＡの割合（％）を指す。いくつかの実施形態で
は、「回収」という用語は、「収率」という用語と互換可能に使用される。

本発明は、脂質ナノ粒子を製剤する及びｍＲＮＡをカプセル化するための改善されたプ
ロセスを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ）を脂質ナノ粒子内にカプセル化するプロセスであって、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混
合するステップを含み、ｍＲＮＡ溶液及び／または脂質溶液が、周囲温度を超える所定の
温度である、前記プロセスを提供する。

本発明の様々な態様は、以下の項において詳細に記載される。項の使用は、本発明を制
限することを意図しない。各項は、本発明の任意の態様に適用することができる。本出願
では、「または」の使用は、別段の記述がない限り、「及び／または」を意味する。

ｍＲＮＡ
本発明は、任意のｍＲＮＡをカプセル化するために使用されてよい。ｍＲＮＡは、典型
的には、ＤＮＡからリボソームへと情報を運ぶＲＮＡのタイプであると考えられる。ｍＲ
ＮＡの存在は、典型的には、非常に短く、プロセシング及び翻訳を含み、それに分解が続
く。典型的には、真核生物では、ｍＲＮＡプロセシングは、Ｎ末端（５’）端への「キャ
ップ」の付加、及びＣ末端（３’）端への「尾部」の付加を含む。典型的なキャップは、
７−メチルグアノシンキャップであり、これは、５’−５’−三リン酸結合を通して第一
の転写されたヌクレオチドに結合するグアノシンである。キャップの存在は、ほとんどの
真核細胞において見いだされるヌクレアーゼに対する耐性の提供において重要である。尾
部は、典型的には、ポリアデニル化事象であり、それによりポリアデニル部分はｍＲＮＡ
分子の３’末端に付加される。この「尾部」の存在は、エクソヌクレアーゼ分解からｍＲ
ＮＡを保護する役割を果たす。メッセンジャーＲＮＡは、リボソームによりタンパク質を
構成する一連のアミノ酸へと翻訳される。

ｍＲＮＡは、任意の様々な既知の方法に従って合成されてよい。例えば、本発明に係る
ｍＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）を介して合成されてよい。簡潔には、ＩＶＴは、
典型的には、プロモーターを含有する線状または環状のＤＮＡ鋳型、リボヌクレオチド三
リン酸のプール、ＤＴＴ及びマグネシウムイオンを含み得る緩衝系と、適切なＲＮＡポリ
メラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ）、デオキシリボヌク
レアーゼＩ、ピロホスファターゼ、及び／またはリボヌクレアーゼ阻害薬とで実行する。
厳密な条件は、具体的な用途に従って変動するだろう。

いくつかの実施形態では、インビトロで合成されたｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ合成中に使用
される様々な酵素及び他の試薬を含む望ましくない不純物を除去するために製剤及びカプ
セル化の前に精製されてよい。

本発明は、様々な長さのｍＲＮＡを製剤及びカプセル化するために使用してよい。いく
つかの実施形態では、本発明は、約１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、
３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ
、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、または２０ｋｂ以上の長さのイ
ンビトロで合成されたｍＲＮＡを製剤及びカプセル化するために使用してよい。いくつか
の実施形態では、本発明は、約１〜２０ｋｂ、約１〜１５ｋｂ、約１〜１０ｋｂ、約５〜
２０ｋｂ、約５〜１５ｋｂ、約５〜１２ｋｂ、約５〜１０ｋｂ、約８〜２０ｋｂ、または
約８〜１５ｋｂの範囲の長さのインビトロで合成されたｍＲＮＡを製剤及びカプセル化す
るために使用してよい。

本発明は、未修飾であるｍＲＮＡまたは典型的に安定性を向上させる１つ以上の修飾を
含有するｍＲＮＡを製剤する及びカプセル化するために使用してよい。いくつかの実施形
態では、修飾は、修飾されたヌクレオチド、修飾された糖リン酸塩主鎖、５’及び／また
は３’非翻訳領域から選択される。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの修飾は、ＲＮＡのヌクレオチドの修飾を含んでよ
い。本発明に係る修飾されたｍＲＮＡは、例えば、主鎖修飾、糖修飾または塩基修飾を含
むことができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、プリン（アデニン（Ａ）、グア
ニン（Ｇ））またはピリミジン（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））を、
ならびにプリン及びピリミジンの修飾されたヌクレオチド類似体または誘導体として、例
えば、１−メチル−アデニン、２−メチル−アデニン、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペ
ンテニル−アデニン、Ｎ６−メチル−アデニン、Ｎ６−イソペンテニル−アデニン、２−
チオ−シトシン、３−メチル−シトシン、４−アセチル−シトシン、５−メチル−シトシ
ン、２，６−ジアミノプリン、１−メチル−グアニン、２−メチル−グアニン、２，２−
ジメチル−グアニン、７−メチル−グアニン、イノシン、１−メチル−イノシン、シュー
ドウラシル（５−ウラシル）、ジヒドロ−ウラシル、２−チオ−ウラシル、４−チオ−ウ
ラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウラシル、５−（カルボキシヒ
ドロキシメチル）−ウラシル、５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−カ
ルボキシメチルアミノメチル−ウラシル、５−メチル−２−チオ−ウラシル、５−メチル
−ウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、５−メチルアミノメチル−
ウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオ−ウラシル、５’−メトキシカルボニル
メチル−ウラシル、５−メトキシ−ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル
、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、１−メチル−シュードウラシル、キューオシン、．
ベータ．−Ｄ−マンノシル−キューオシン、ワイブトキソシン、及びホスホロアミド酸、
ホスホロチオエート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホネート、７−デアザグアノシ
ン、５−メチルシトシン及びイノシンを含むがこれらに限定されない、天然に生じるヌク
レオチド及び／またはヌクレオチド類似体（修飾されたヌクレオチド）から合成されてよ
い。そのような類似体の調製は、例えば、その開示が参照によりその全範囲において本明
細書に含まれる米国特許第４，３７３，０７１号、米国特許第４，４０１，７９６号、米
国特許第４，４１５，７３２号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，５０
０，７０７号、米国特許第４，６６８，７７７号、米国特許第４，９７３，６７９号、米
国特許第５，０４７，５２４号、米国特許第５，１３２，４１８号、米国特許第５，１５
３，３１９号、米国特許第５，２６２，５３０号及び同第５，７００，６４２号から当業
者に既知である。

典型的に、ｍＲＮＡ合成は、Ｎ末端（５’）端への「キャップ」の付加、及びＣ末端（
３’）端への「尾部」の付加を含む。キャップの存在は、ほとんどの真核細胞において見
いだされるヌクレアーゼに対する耐性の提供において重要である。「尾部」の存在は、エ
クソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護する役割を果たす。

ゆえに、いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’キャップ構造を含む。５’キャッ
プは、典型的には以下のように付加される：まず、ＲＮＡ末端ホスファターゼが末端リン
酸基の１つを５’ヌクレオチドから取り除き、末端リン酸を２つ残し；次いで、グアノシ
ン三リン酸（ＧＴＰ）がグアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸に付加され、
５’５’５三リン酸結合を生じさせ：次いで、グアニンの７−窒素がメチルトランスフェ
ラーゼによってメチル化される。２’−Ｏ−メチル化は、７−メチルグアノシン三リン酸
残基後の第一塩基及び／または第二塩基でも生じ得る。キャップ構造に例には、ｍ７Ｇｐ
ｐｐＮｐ−ＲＮＡ、ｍ７ＧｐｐｐＮｍｐ−ＲＮＡ及びｍ７ＧｐｐｐＮｍｐＮｍｐ−ＲＮＡ
（ｍは、２’−Ｏメチル残基を指す）が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’及び／または３’非翻訳領域を含む。いく
つかの実施形態では、５’非翻訳領域は、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響する１つ以
上のエレメント、例えば、鉄応答エレメントを含む。いくつかの実施形態では、５’非翻
訳領域は、約５０〜５００ヌクレオチドの長さであってよい。

いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞内のｍＲ
ＮＡの位置の安定性に影響するタンパク質に対する結合部位、またはｍｉＲＮＡに対する
１つ以上の結合部位の１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、５
０〜５００ヌクレオチドの長さまたはそれより長くてよい。

インビトロ転写反応から提供されるｍＲＮＡがいくつかの実施形態で望ましくあり得る
一方で、ｍＲＮＡの他の源が、本発明の範囲内であると企図され、それには細菌、真菌類
、植物、及び／または動物から産生されたｍＲＮＡを含む。

本発明は、様々なタンパク質をコードするｍＲＮＡを製剤する及びカプセル化するため
に使用してよい。本発明に好適なｍＲＮＡの非限定的な例には、脊髄運動ニューロン１（
ＳＭＮ）、アルファ−ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、アルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳ
Ｓ１）、ホタルルシフェラーゼ、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、フェニルアラニンヒドロキシラ
ーゼ（ＰＡＨ）、及び嚢胞性線維症膜コンダクタンス受容体（ＣＦＴＲ）をコードするｍ
ＲＮＡが挙げられる。例示的なｍＲＮＡ配列は、実施例の項において詳述される。

ｍＲＮＡ溶液
ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡが脂質ナノ粒子内にカプセル化され得るように脂質溶液と混合さ
れる溶液中で提供されてよい。好適なｍＲＮＡ溶液は、様々な濃度でカプセル化されるｍ
ＲＮＡを含有する任意の水溶液であってよい。例えば、好適なｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡ
を、約０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．０６ｍｇ／ｍｌ、０．０７ｍｇ／
ｍｌ、０．０８ｍｇ／ｍｌ、０．０９ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．１５ｍｇ／ｍ
ｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．
６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、または１．０
ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で含有してよい。いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡ溶液は
、ｍＲＮＡを、約０．０１〜１．０ｍｇ／ｍｌ、０．０１〜０．９ｍｇ／ｍｌ、０．０１
〜０．８ｍｇ／ｍｌ、０．０１〜０．７ｍｇ／ｍｌ、０．０１〜０．６ｍｇ／ｍｌ、０．
０１〜０．５ｍｇ／ｍｌ、０．０１〜０．４ｍｇ／ｍｌ、０．０１〜０．３ｍｇ／ｍｌ、
０．０１〜０．２ｍｇ／ｍｌ、０．０１〜０．１ｍｇ／ｍｌ、０．０５〜１．０ｍｇ／ｍ
ｌ、０．０５〜０．９ｍｇ／ｍｌ、０．０５〜０．８ｍｇ／ｍｌ、０．０５〜０．７ｍｇ
／ｍｌ、０．０５〜０．６ｍｇ／ｍｌ、０．０５〜０．５ｍｇ／ｍｌ、０．０５〜０．４
ｍｇ／ｍｌ、０．０５〜０．３ｍｇ／ｍｌ、０．０５〜０．２ｍｇ／ｍｌ、０．０５〜０
．１ｍｇ／ｍｌ、０．１〜１．０ｍｇ／ｍｌ、０．２〜０．９ｍｇ／ｍｌ、０．３〜０．
８ｍｇ／ｍｌ、０．４〜０．７ｍｇ／ｍｌ、または０．５〜０．６ｍｇ／ｍｌの範囲の濃
度で含有してよい。いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡを、最大
で約５．０ｍｇ／ｍｌ、４．０ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、１．
０ｍｇ／ｍｌ、．０９ｍｇ／ｍｌ、０．０８ｍｇ／ｍｌ、０．０７ｍｇ／ｍｌ、０．０６
ｍｇ／ｍｌ、または０．０５ｍｇ／ｍｌまでの濃度で含有してよい。

典型的には、好適なｍＲＮＡ溶液は、緩衝剤及び／または塩も含有してよい。通常、緩
衝剤は、ＨＥＰＥＳ、硫酸アンモニウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢
酸ナトリウム、リン酸カリウム及びリン酸ナトリウムを含むことができる。いくつかの実
施形態では、緩衝剤の好適な濃度は、約０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、０．５ｍＭ〜９０ｍＭ
、１．０ｍＭ〜８０ｍＭ、２ｍＭ〜７０ｍＭ、３ｍＭ〜６０ｍＭ、４ｍＭ〜５０ｍＭ、５
ｍＭ〜４０ｍＭ、６ｍＭ〜３０ｍＭ、７ｍＭ〜２０ｍＭ、８ｍＭ〜１５ｍＭ、または９〜
１２ｍＭの範囲であってよい。いくつかの実施形態では、緩衝剤の好適な濃度は、約０．
１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ、６ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、
２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、または５０ｍＭ以上で
ある。

例示的な塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、及び塩化カリウムを含むことがで
きる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液中の塩の好適な濃度は、約１ｍＭ〜５００
ｍＭ、５ｍＭ〜４００ｍＭ、１０ｍＭ〜３５０ｍＭ、１５ｍＭ〜３００ｍＭ、２０ｍＭ〜
２５０ｍＭ、３０ｍＭ〜２００ｍＭ、４０ｍＭ〜１９０ｍＭ、５０ｍＭ〜１８０ｍＭ、５
０ｍＭ〜１７０ｍＭ、５０ｍＭ〜１６０ｍＭ、５０ｍＭ〜１５０ｍＭ、または５０ｍＭ〜
１００ｍＭの範囲であってよい。好適なｍＲＮＡ溶液中の塩濃度は、約１ｍＭ、５ｍＭ、
１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、
９０ｍＭ、または１００ｍＭ以上である。

いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡ溶液は、約３．５〜６．５、３．５〜６．０
、３．５〜５．５．、３．５〜５．０、３．５〜４．５、４．０〜５．５、４．０〜５．
０、４．０〜４．９、４．０〜４．８、４．０〜４．７、４．０〜４．６、または４．０
〜４．５の範囲のｐＨを有してよい。いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡ溶液は、
約３．５、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８
、４．９、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．１、６．３、及び６
．５以下のｐＨを有してよい。

様々な方法を使用して本発明に好適なｍＲＮＡ溶液を調製してよい。いくつかの実施形
態では、ｍＲＮＡは、本明細書に記載の緩衝液に直接溶解してよい。いくつかの実施形態
では、ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡ原液をカプセル化のために脂質溶液と混合する前に、緩
衝液と混合することによって生成されてよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は
、ｍＲＮＡ原液をカプセル化のために脂質溶液と混合する直前に、緩衝液と混合すること
によって生成してよい。いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡ原液は、約０．２ｍｇ
／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、
１．０ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、または１
．６ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、３．５ｍｇ
／ｍｌ、４．０ｍｇ／ｍｌ、４．５ｍｇ／ｍｌ、または５．０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で水
中にｍＲＮＡを含有してよい。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ原液は、ポンプを使用して緩衝液と混合される。例
示的なポンプには、限定されないが、ギアポンプ、蠕動ポンプ及び渦巻きポンプが挙げら
れる。

典型的には、緩衝液は、ｍＲＮＡ原液のそれよりも大きい割合で混合される。例えば、
緩衝液は、ｍＲＮＡ原液の割合より少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７
倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、または２０倍大きい割合で混合されてよい。いくつか
の実施形態では、緩衝液は、約１００〜６０００ｍｌ／分（例えば、約１００〜３００ｍ
ｌ／分、３００〜６００ｍｌ／分、６００〜１２００ｍｌ／分、１２００〜２４００ｍｌ
／分、２４００〜３６００ｍｌ／分、３６００〜４８００ｍｌ／分、４８００〜６０００
ｍｌ／分、または６０〜４２０ｍｌ／分）の範囲の流速で混合されてよい。いくつかの実
施形態では、緩衝液は、約６０ｍｌ／分、１００ｍｌ／分、１４０ｍｌ／分、１８０ｍｌ
／分、２２０ｍｌ／分、２６０ｍｌ／分、３００ｍｌ／分、３４０ｍｌ／分、３８０ｍｌ
／分、４２０ｍｌ／分、４８０ｍｌ／分、５４０ｍｌ／分、６００ｍｌ／分、１２００ｍ
ｌ／分、２４００ｍｌ／分、３６００ｍｌ／分、４８００ｍｌ／分、または６０００ｍｌ
／分以上の流速で混合される。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ原液は、約１０〜６００ｍｌ／分（例えば、約５〜
５０ｍｌ／分、約１０〜３０ｍｌ／分、約３０〜６０ｍｌ／分、約６０〜１２０ｍｌ／分
、約１２０〜２４０ｍｌ／分、約２４０〜３６０ｍｌ／分、約３６０〜４８０ｍｌ／分、
または約４８０〜６００ｍｌ／分）の範囲の流速で混合される。いくつかの実施形態では
、ｍＲＮＡ原液は、約５ｍｌ／分、１０ｍｌ／分、１５ｍｌ／分、２０ｍｌ／分、２５ｍ
ｌ／分、３０ｍｌ／分、３５ｍｌ／分、４０ｍｌ／分、４５ｍｌ／分、５０ｍｌ／分、６
０ｍｌ／分、８０ｍｌ／分、１００ｍｌ／分、２００ｍｌ／分、３００ｍｌ／分、４００
ｍｌ／分、５００ｍｌ／分、または６００ｍｌ／分以上の流速で混合される。

脂質溶液
本発明に従い、脂質溶液は、ｍＲＮＡをカプセル化するための脂質ナノ粒子を形成する
のに好適な脂質の混合物を含有する。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、エタ
ノールをベースとする。例えば、好適な脂質溶液は、純エタノール（すなわち、１００％
エタノール）中に溶解された所望の脂質の混合物を含有し得る。別の実施形態では、好適
な脂質溶液は、イソプロピルアルコールをベースとする。別の実施形態では、好適な脂質
溶液は、ジメチルスルホキシドをベースとする。別の実施形態では、好適な脂質溶液は、
限定されないが、エタノール、イソプロピルアルコール及びジメチルスルホキシドを含む
好適な溶媒の混合物である。

好適な脂質溶液は、様々な濃度で所望の脂質の混合物を含有してよい。例えば、好適な
脂質溶液は、約０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／
ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、４．０ｍｇ／ｍｌ、５．０ｍｇ／ｍｌ、６．０ｍｇ／ｍｌ、７
．０ｍｇ／ｍｌ、８．０ｍｇ／ｍｌ、９．０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍ
ｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、または１００
ｍｇ／ｍｌ以上の総濃度で所望の脂質の混合物を含有してよい。いくつかの実施形態では
、好適な脂質溶液は、約０．１〜１００ｍｇ／ｍｌ、０．５〜９０ｍｇ／ｍｌ、１．０〜
８０ｍｇ／ｍｌ、１．０〜７０ｍｇ／ｍｌ、１．０〜６０ｍｇ／ｍｌ、１．０〜５０ｍｇ
／ｍｌ、１．０〜４０ｍｇ／ｍｌ、１．０〜３０ｍｇ／ｍｌ、１．０〜２０ｍｇ／ｍｌ、
１．０〜１５ｍｇ／ｍｌ、１．０〜１０ｍｇ／ｍｌ、１．０〜９ｍｇ／ｍｌ、１．０〜８
ｍｇ／ｍｌ、１．０〜７ｍｇ／ｍｌ、１．０〜６ｍｇ／ｍｌ、または１．０〜５ｍｇ／ｍ
ｌの範囲の総濃度で所望の脂質の混合物を含有してよい。いくつかの実施形態では、好適
な脂質溶液は、最大で約１００ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ
／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ
／ｍｌ、または１０ｍｇ／ｍｌまでの総濃度で所望の脂質の混合物を含有してよい。

任意の所望の脂質は、ｍＲＮＡをカプセル化するために好適な任意の比率で混合されて
よい。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、カチオン性脂質、ヘルパー脂質（例
えば、非カチオン性脂質及び／またはコレステロール脂質）及び／またはＰＥＧ化脂質を
含む所望の脂質の混合物を含有する。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、１つ
以上のカチオン性脂質、１つ以上のヘルパー脂質（例えば、非カチオン性脂質及び／また
はコレステロール脂質）及び１つ以上のＰＥＧ化脂質を含む所望の脂質の混合物を含有す
る。

カチオン性脂質
本明細書で用いるとき、「カチオン性脂質」という語句は、生理的ｐＨなどの、選択さ
れたｐＨで実効正電荷を有する多くの脂質種のいずれかを指す。いくつかのカチオン性脂
質は、文献において記載されており、その多くが市販されている。本発明の組成物及び方
法において使用するのに特に好適なカチオン性脂質には、その両方が参照により本明細書
に組み込まれる、国際特許公開ＷＯ２０１０／０５３５７２（及び特に、段落［００２２
５］で記載されるＣ１２−２００）及びＷＯ２０１２／１７０９３０において記載される
ものが含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法に好適なカチオン性
脂質には、２０１２年３月２９日に出願された、米国仮特許出願第６１／６１７，４６８
号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のイオン化可能なカチオン性脂質、例え
ば、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，
１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−１５，１８−ジエン−１−アミン（ＨＧＴ５００
０）、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−
９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−４，１５，１８−トリエン−１−アミン（Ｈ
ＧＴ５００１）、及び（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）
−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−５，１５，１８−トリエン−
１−アミン（ＨＧＴ５００２）が含まれる。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法に好適なカチオン性脂質には、その
両方が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３０６３４６８及び“Ｌｉｐｉｄ
Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ Ｒ
ＮＡ”という表題の米国仮特許出願に記載のカチオン性脂質が含まれる。いくつかの実施
形態では、カチオン性脂質は、式Ｉ−ｃ１−ａ：

式中、各Ｒ^２は、独立して、水素またはＣ_１−３アルキルであり；
各ｑは、独立して、２〜６であり；
各Ｒ’は、独立して、水素またはＣ_１−３アルキルであり；
各Ｒ^Ｌは、独立して、Ｃ_８−１２アルキルである、
の化合物またはその医薬的に許容され得る塩を含む。

いくつかの実施形態では、各Ｒ^２は、独立して、水素、メチルまたはエチルである。い
くつかの実施形態では、各Ｒ^２は、独立して、水素またはメチルである。いくつかの実施
形態では、各Ｒ^２は、水素である。

いくつかの実施形態では、各ｑは、独立して、３〜６である。いくつかの実施形態では
、各ｑは、独立して、３〜５である。いくつかの実施形態では、各ｑは、４である。

いくつかの実施形態では、各Ｒ’は、独立して、水素、メチルまたはエチルである。い
くつかの実施形態では、各Ｒ’は、独立して、水素またはメチルである。いくつかの実施
形態では、各Ｒ’は、独立して、水素である。

いくつかの実施形態では、各Ｒ^Ｌは、独立して、Ｃ_８−１２アルキルである。いくつか
の実施形態では、各Ｒ^Ｌは、独立して、ｎ−Ｃ_８−１２アルキルである。いくつかの実施
形態では、各Ｒ^Ｌは、独立して、Ｃ_９−１１アルキルである。いくつかの実施形態では、
各Ｒ^Ｌは、独立して、ｎ−Ｃ_９−１１アルキルである。いくつかの実施形態では、各Ｒ^Ｌ
は、独立して、Ｃ_１０アルキルである。いくつかの実施形態では、各Ｒ^Ｌは、独立して、
ｎ−Ｃ_１０アルキルである。

いくつかの実施形態では、各Ｒ^２は、独立して、水素またはメチルであり；各ｑは、独
立して、３〜５であり；各Ｒ’は、独立して、水素またはメチルであり；各Ｒ^Ｌは、独立
して、Ｃ_８−１２アルキルである。

いくつかの実施形態では、各Ｒ^２は、水素であり；各ｑは、独立して、３〜５であり；
各Ｒ’は、水素であり；各Ｒ^Ｌは、独立して、Ｃ_８−１２アルキルである。

いくつかの実施形態では、各Ｒ^２は、水素であり；各ｑは、４であり；各Ｒ’は、水素
であり；各Ｒ^Ｌは、独立して、Ｃ_８−１２アルキルである。

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、式Ｉ−ｇ：

式中、各Ｒ^Ｌは、独立して、Ｃ_８−１２アルキルである、の化合物またはその医薬的に許
容され得る塩を含む。いくつかの実施形態では、各Ｒ^Ｌは、独立して、ｎ−Ｃ_８−１２ア
ルキルである。いくつかの実施形態では、各Ｒ^Ｌは、独立して、Ｃ_９−１１アルキルであ
る。いくつかの実施形態では、各Ｒ^Ｌは、独立して、ｎ−Ｃ_９−１１アルキルである。い
くつかの実施形態では、各Ｒ^Ｌは、独立して、Ｃ_１０アルキルである。いくつかの実施形
態では、各Ｒ^Ｌは、ｎ−Ｃ_１０アルキルである。

ある特定の実施形態では、好適なカチオン性脂質は、ｃＫＫ−Ｅ１２、または（３，６
−ビス（４−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン−２，５−
ジオン）である。ｃＫＫ−Ｅ１２の構造を以下に示す：

いくつかの実施形態では、本発明に好適な１つ以上のカチオン性脂質は、Ｎ−［１−（
２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド
または「ＤＯＴＭＡ」であってよい（Ｆｅｉｇｎｅｒら、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号）。他の
好適なカチオン性脂質には、例えば、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシル
アミドまたは「ＤＯＧＳ」、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボ
キサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムまたは「ＤＯＳＰＡ」（
Ｂｅｈｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２（１９８９）
；米国特許第５，１７１，６７８号；米国特許第５，３３４，７６１号）、１，２−ジオ
レオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパンまたは「ＤＯＤＡＰ」、１，２−ジオレ
オイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパンまたは「ＤＯＴＡＰ」が挙げられる。

さらなる例示的なカチオン性脂質には、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチ
ル−３−アミノプロパンまたは「ＤＳＤＭＡ」、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジ
メチル−３−アミノプロパンまたは「ＤＯＤＭＡ」、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，
Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンまたは「ＤＬｉｎＤＭＡ」、１，２−ジリノレニルオ
キシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンまたは「ＤＬｅｎＤＭＡ」、Ｎ−ジオレイ
ル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリドまたは「ＤＯＤＡＣ」、Ｎ，Ｎ−ジステアリ
ル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム（ａｒｎｒｎｏｎｉｕｍ）ブロミドまたは「ＤＤＡＢ
」、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒ
ドロキシエチルアンモニウムブロミドまたは「ＤＭＲＩＥ」、３−ジメチルアミノ−２−
（コレスタ−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−
９，１２−オクタデカジエンオキシ）プロパンまたは「ＣＬｉｎＤＭＡ」、２−［５’−
（コレスタ−５−エン−３−ベータ−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチ
ル−１−（シス，シス−９’，ｌ−２’−オクタデカジエンオキシ）プロパンまたは「Ｃ
ｐＬｉｎＤＭＡ」、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミンまたは
「ＤＭＯＢＡ」、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパ
ンまたは「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」、２，３−ジリノレオイルオキシ−Ν，Ν−ジメチルプ
ロピルアミンまたは「ＤＬｉｎＤＡＰ」、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジリノレイルカルバミル−
３−ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」、１，２−ジリノレオイ
ルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」、２，２−ジリ
ノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソランまたは「ＤＬｉｎ−−
ＤＭＡ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラ
ンまたは「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ」、及び２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ
）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）−
Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ））（ＷＯ２０１０／０４２
８７７；Ｓｅｍｐｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２−１７６（２０
１０）を参照されたい）、またはそれらの混合物が挙げられる（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．ら、Ｊ
Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０７：２７６−２８７（２００５）；Ｍｏ
ｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３−１
００７（２００５）；ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／１２１３４８Ａ１）。いくつかの実施形
態では、カチオン性脂質の１つ以上は、イミダゾール、ジアルキルアミノ、またはグアニ
ジウム部分の少なくとも１つを含む。

いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、ＸＴＣ（２，２−ジリノレイ
ル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン）、ＭＣ３（（（６Ｚ，９Ｚ
，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イ
ル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート）、ＡＬＮＹ−１００（（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ
）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニ
ル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン）
）、ＮＣ９８−５（４，７，１３−トリス（３−オキソ−３−（ウンデシルアミノ）プロ
ピル）−Ｎ１，Ｎ１６−ジウンデシル−４，７，１０，１３−テトラアザヘキサデカン−
１，１６−ジアミド）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプ
ロパン）、ＨＧＴ４００３（ＷＯ２０１２／１７０８８９、その教示はそれらの全体が参
照により本明細書に組み込まれる）、ＩＣＥ（ＷＯ２０１１／０６８８１０、その教示は
それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ＨＧＴ５０００（米国仮特許出願
第６１／６１７，４６８号、その教示はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれ
る）またはＨＧＴ５００１（シスまたはトランス）（仮特許出願第６１／６１７，４６８
号）、ＷＯ２０１０／０５３５７２に開示されているものなどのアミノアルコールリピド
イド、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯ
ＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、Ｄ
ＬｉｎＤＭＡ（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．；Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ．；Ｂｒｅｍｎｅｒ，Ｋ．；Ｍａｃ
Ｌａｃｈｌａｎ，Ｉ．“Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎｆ
ｌｕｅｎｃｅｓ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｅｎｃａｐｓ
ｕｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ”Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２００５，１０
７，２７６−２８７）、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（Ｓｅｍｐｌｅ，Ｓ．Ｃ．ら、“Ｒａ
ｔｉｏｎａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ ｓｉＲ
ＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０，２８，１７２−１
７６）、Ｃ１２−２００（Ｌｏｖｅ，Ｋ．Ｔ．ら、“Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ ｍａｔｅｒ
ｉａｌｓ ｆｏｒ ｌｏｗ−ｄｏｓｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ
”ＰＮＡＳ ２０１０，１０７，１８６４−１８６９）から選択されてよい。

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中の
総脂質の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％
、５５％、６０％、６５％、または７０％を構成する。いくつかの実施形態では、カチオ
ン性脂質（複数可）は、重量またはモルで、総脂質混合物の約３０〜７０％（例えば、約
３０〜６５％、約３０〜６０％、約３０〜５５％、約３０〜５０％、約３０〜４５％、約
３０〜４０％、約３５〜５０％、約３５〜４５％、または約３５〜４０％）を構成する。

非カチオン性／ヘルパー脂質
本明細書で用いるとき、「非カチオン性脂質」という語句は、任意の中性、双性イオン
またはアニオン性の脂質を指す。本明細書で用いるとき、「アニオン性脂質」という語句
は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで、正味負電荷を持つ多くの脂質種のいずれかを
指す。非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレ
オイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰ
ＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスフ
ァチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（Ｄ
ＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオ
レオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジ
ルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレ
ート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ
）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチ
ジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチル
ＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタ
ノールアミン（ＳＯＰＥ）、またはそれらの混合物を含むがこれらに限定されない。

いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中
の総脂質の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０
％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％または７０％を構成してよい。いくつかの
実施形態では、非カチオン性脂質（複数可）は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中の
総脂質の約３０〜５０％（例えば、約３０〜４５％、約３０〜４０％、約３５〜５０％、
約３５〜４５％、または約３５〜４０％）を構成する。

コレステロール系脂質
いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、１つ以上のコレステロール系脂質を含む
。例えば、好適なコレステロール系カチオン性脂質は、例えば、ＤＣ−Ｃｈｏｉ（Ｎ，Ｎ
−ジメチル−Ｎ−エチルカルボキサミドコレステロール）、１，４−ビス（３−Ｎ−オレ
イルアミノ−プロピル）ピペラジン（Ｇａｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ
ｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）；Ｗｏｌｆら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
２３，１３９（１９９７）；米国特許第５，７４４，３３５号）、またはＩＣＥを含む
。いくつかの実施形態では、コレステロール系脂質（複数可）は、重量またはモルで、好
適な脂質溶液中の総脂質の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％
、６０％、または７０％を構成する。いくつかの実施形態では、コレステロール系脂質（
複数可）は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中の総脂質の約３０〜５０％（例えば、
約３０〜４５％、約３０〜４０％、約３５〜５０％、約３５〜４５％、または約３５〜４
０％）を構成する。

ＰＥＧ化脂質
いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、１つまたは複数のＰＥＧ化脂質を含む。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾されたリン脂質及び誘導化された脂質、例えば、
Ｎ−オクタノイル−スフィンゴシン−１−［スクシニル（メトキシポリエチレングリコー
ル）−２０００］（Ｃ８ＰＥＧ−２０００セラミド）を含む、誘導体化されたセラミド（
ＰＥＧ−ＣＥＲ）の使用も本発明により企図される。企図されるＰＥＧ修飾された脂質は
、Ｃ_６−Ｃ_２０長さのアルキル鎖（複数可）で脂質に共有付着する最大で５ｋＤａまでの
長さのポリエチレングリコール鎖を含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態で
は、ＰＥＧ修飾されたまたはＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ化コレステロールまたはＰＥＧ−２
Ｋである。いくつかの実施形態では、特に有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖（
例えば、Ｃ_１４またはＣ_１８）を有するＰＥＧ−セラミドである。

ＰＥＧ修飾されたリン脂質及び誘導体化脂質は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中
の総脂質の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、また
は７０％を構成してよい。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質脂質（複数可）は、重
量またはモルで、好適な脂質溶液中の総脂質の約３０〜５０％（例えば、約３０〜４５％
、約３０〜４０％、約３５〜５０％、約３５〜４５％、または約３５〜４０％）を構成す
る。

カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール系脂質、及びＰＥＧ修飾された脂
質の例示的な組み合わせを実施例の項にて記載する。例えば、好適な脂質溶液は、ｃＫＫ
−Ｅ１２、ＤＯＰＥ、ｃｈｏｌ、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、
コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ５０００、ＤＯＰＥ、ｃｈｏｌ、及び
ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、ｃｈｏｌ、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；
ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＰＰＣ、ｃｈｏｌ、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；Ｃ１２−２００、ＤＰ
ＰＣ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ５０００、ＤＰＰＣ、ｃｈｏｌ
、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；またはＨＧＴ５００１、ＤＰＰＣ、ｃｈｏｌ、及びＤＭＧ−
ＰＥＧ２Ｋを含有してよい。脂質混合物を含むカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び
／またはＰＥＧ修飾された脂質の選択、ならびにそのような脂質の相互に対する相対的モ
ル比は、選択された脂質（複数可）の特徴、ならびにカプセル化されるｍＲＮＡの特徴及
び性質に基づく。さらなる考慮事項は、例えば、アルキル鎖の飽和、ならびに選択された
脂質（複数可）のサイズ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、膜融合性、及び毒性を含む。ゆえに、モ
ル比は適宜調整されてよい。

混合プロセス
本発明は、ｍＲＮＡカプセル化効率及び回収率に及ぼす温度の予期しない効果の発見に
基づく。ゆえに、いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の、ｍＲＮＡ溶液
と脂質溶液を混合することによって脂質ナノ粒子中にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）
をカプセル化するプロセスであって、ｍＲＮＡ溶液及び／または脂質溶液が周囲温度を超
える所定の温度まで加熱される前記プロセスを提供する。本明細書で用いるとき、「周囲
温度」という用語は、室温の温度、または加熱または冷却無しに、対象となる目的物（例
えば、ｍＲＮＡ溶液または脂質溶液）を囲む温度を指す。いくつかの実施形態では、周囲
温度は、約２０〜２５℃の範囲の温度を指す。

それゆえ、周囲温度を超える所定の温度は、典型的には約２５℃を超える。いくつかの
実施形態では、本発明に好適な所定の温度は、約３０℃、３７℃、４０℃、４５℃、５０
℃、５５℃、６０℃、６５℃、または７０℃以上である。いくつかの実施形態では、本発
明に好適な所定の温度は、約２５〜７０℃、約３０〜７０℃、約３５〜７０℃、約４０〜
７０℃、約４５〜７０℃、約５０〜７０℃、または約６０〜７０℃の範囲である。特定の
実施形態では、本発明に好適な所定の温度は、約６５℃である。

ｍＲＮＡ溶液、または脂質溶液、またはその両方は、混合の前に周囲温度を超える所定
の温度まで加熱されてよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液及び脂質溶液は、混
合の前に別々に所定の温度まで加熱される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液及び
脂質溶液は、周囲温度で混合されるが、それから混合後所定の温度まで加熱される。いく
つかの実施形態では、脂質溶液は、所定の温度まで加熱され、周囲温度でｍＲＮＡ溶液と
混合される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、所定の温度まで加熱され、周囲
温度で脂質溶液と混合される。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、周囲温度のｍＲＮＡ原液を加熱された緩衝
液に加えて所望の所定の温度を達成することによって所定の温度まで加熱される。

ｍＲＮＡ溶液及び脂質溶液は、ポンプを使用して混合されてよい。カプセル化手順は、
広範な規模で生じることができるため、所望の規模に適応するために異なるタイプのポン
プを使用してよい。しかしながら、概して、低パルス流ポンプを使用することが望ましい
。本明細書で用いるとき、低パルス流ポンプは、安定した流速で連続的な流れを確立する
ことができる任意のポンプを指す。好適なポンプの種類には、これらに限定されないが、
ギアポンプ及び渦巻きポンプが含まれる。例示的なギアポンプには、これらに限定されな
いが、Ｃｏｌｅ−ＰａｒｍｅｒまたはＤｉｅｎｅｒのギアポンプが含まれる。例示的な渦
巻きポンプには、これらに限定されないが、ＧｒａｉｎｇｅｒまたはＣｏｌｅ−Ｐａｒｍ
ｅｒにより製造されたものが含まれる。

ｍＲＮＡ溶液及び脂質溶液は、様々な流速で混合されてよい。典型的には、ｍＲＮＡ溶
液は、脂質溶液のそれを超える割合で混合されてよい。例えば、ｍＲＮＡ溶液は、脂質溶
液のそれより少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０
倍、１５倍、または２０倍大きい割合で混合されてよい。

混合に好適な流速は、規模に基づいて決定されてよい。いくつかの実施形態では、ｍＲ
ＮＡ溶液は、約４０〜４００ｍｌ／分、６０〜５００ｍｌ／分、７０〜６００ｍｌ／分、
８０〜７００ｍｌ／分、９０〜８００ｍｌ／分、１００〜９００ｍｌ／分、１１０〜１０
００ｍｌ／分、１２０〜１１００ｍｌ／分、１３０〜１２００ｍｌ／分、１４０〜１３０
０ｍｌ／分、１５０〜１４００ｍｌ／分、１６０〜１５００ｍｌ／分、１７０〜１６００
ｍｌ／分、１８０〜１７００ｍｌ／分、１５０〜２５０ｍｌ／分、２５０〜５００ｍｌ／
分、５００〜１０００ｍｌ／分、１０００〜２０００ｍｌ／分、２０００〜３０００ｍｌ
／分、３０００〜４０００ｍｌ／分、または４０００〜５０００ｍｌ／分の範囲の流速で
混合される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約２００ｍｌ／分、約５００ｍ
ｌ／分、約１０００ｍｌ／分、約２０００ｍｌ／分、約３０００ｍｌ／分、約４０００ｍ
ｌ／分、または約５０００ｍｌ／分の流速で混合される。

いくつかの実施形態では、脂質溶液は、約２５〜７５ｍｌ／分、２０〜５０ｍｌ／分、
２５〜７５ｍｌ／分、３０〜９０ｍｌ／分、４０〜１００ｍｌ／分、５０〜１１０ｍｌ／
分、７５〜２００ｍｌ／分、２００〜３５０ｍｌ／分、３５０〜５００ｍｌ／分、５００
〜６５０ｍｌ／分、６５０〜８５０ｍｌ／分、または８５０〜１０００ｍｌ／分の範囲の
流速で混合される。いくつかの実施形態では、脂質溶液は、約５０ｍｌ／分、約１００ｍ
ｌ／分、約１５０ｍｌ／分、約２００ｍｌ／分、約２５０ｍｌ／分、約３００ｍｌ／分、
約３５０ｍｌ／分、約４００ｍｌ／分、約４５０ｍｌ／分、約５００ｍｌ／分、約５５０
ｍｌ／分、約６００ｍｌ／分、約６５０ｍｌ／分、約７００ｍｌ／分、約７５０ｍｌ／分
、約８００ｍｌ／分、約８５０ｍｌ／分、約９００ｍｌ／分、約９５０ｍｌ／分、または
約１０００ｍｌ／分の流速で混合される。

典型的には、ｍＲＮＡ溶液及び脂質溶液は、脂質が、ｍＲＮＡをカプセル化するナノ粒
子を形成することができるように、溶液中に混合される。そのような溶液は、製剤または
カプセル化溶液とも称される。好適な製剤またはカプセル化溶液は、エタノールなどの溶
媒をベースとしてよい。例えば、好適な製剤またはカプセル化溶液は、約１０％エタノー
ル、約１５％エタノール、約２０％エタノール、約２５％エタノール、約３０％エタノー
ル、約３５％エタノール、または約４０％エタノールをベースとしてよい。

好適な製剤またはカプセル化溶液は、イソプロピルアルコールなどの溶媒をベースとし
てよい。例えば、好適な製剤またはカプセル化溶液は、約１０％イソプロピルアルコール
、約１５％イソプロピルアルコール、約２０％イソプロピルアルコール、約２５％イソプ
ロピルアルコール、約３０％イソプロピルアルコール、約３５％イソプロピルアルコール
、または約４０％イソプロピルアルコールをベースとしてよい。

好適な製剤またはカプセル化溶液は、ジメチルスルホキシドなどの溶媒をベースとして
よい。例えば、好適な製剤またはカプセル化溶液は、約１０％ジメチルスルホキシド、約
１５％ジメチルスルホキシド、約２０％ジメチルスルホキシド、約２５％ジメチルスルホ
キシド、約３０％ジメチルスルホキシド、約３５％ジメチルスルホキシド、または約４０
％ジメチルスルホキシドをベースとしてよい。

好適な製剤またはカプセル化溶液は、緩衝剤または塩も含有してよい。例示的な緩衝剤
は、ＨＥＰＥＳ、硫酸アンモニウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナ
トリウム、リン酸カリウム及びリン酸ナトリウムを含んでよい。例示的な塩は、塩化ナト
リウム、塩化マグネシウム、及び塩化カリウムを含んでよい。

精製
典型的には、製剤及びカプセル化の後、脂質ナノ粒子は、精製される及び／または濃縮
される。様々な精製技術を使用してよい。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、タ
ンジェンシャルフローろ過を使用して精製される。クロスフローろ過とも称される、タン
ジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）は、ろ過される材料が、フィルタを通り抜けるよりむ
しろ接線的に通過するろ過の種類である。ＴＦＦでは、望ましくない透過水はフィルタを
通り抜ける一方で、所望の被保持物はフィルタに沿って通り下流に集められる。従来のデ
ッドエンドろ過において通常遭遇するものと反対に、ＴＦＦでは、典型的には、所望の材
料が被保持物中に含有されていることに留意することが重要である。

ろ過される材料に依存して、ＴＦＦは、精密ろ過または限外ろ過のいずれかのために使
用される。精密ろ過は、典型的には、フィルタが、０．０５μｍから１．０μｍの間、両
端値を含む、の孔サイズを有する事例として定義され、一方で限外ろ過は、典型的には、
０．０５μｍ未満の孔サイズを有するフィルタを必然的に含む。孔サイズは、特定のフィ
ルタに対する分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）とも称される、公称分画分子量（ＮＭＷＬ）
も決定し、典型的には、精密ろ過膜は、１，０００キロダルトン（ｋＤａ）を超えるＮＭ
ＷＬを有し、限外ろ過フィルタは、１ｋＤａから１，０００ｋＤａの間のＮＭＷＬを有す
る。

タンジェンシャルフローろ過の主要な利点は、従来の「デッドエンド」ろ過中に凝集し
てフィルタを遮断し得る非透過性粒子（ときに「ろ過ケーキ」とも称される）が、代わり
にフィルタの表面に沿って運ばれることである。この利点により、概してフィルタを除去
して清掃する必要がなくなり、そのため作業中断時間が著しく低下するために、タンジェ
ンシャルフローろ過は連続運転を要する工業プロセスにおいて広く使用されることが可能
になる。

タンジェンシャルフローろ過は、なかでも、濃縮及びダイアフィルトレーションを含む
いくつかの目的のために使用することができる。濃縮は、それにより溶質分子が保持され
る一方で溶媒が溶液から除去される、プロセスである。試料を効率的に濃縮するために、
保持される溶質分子の分子量よりも実質的に低いＮＭＷＬまたはＭＷＣＯを有する膜が使
用される。通常、当業者は、標的分子（複数可）の分子量を３〜６倍下回るＮＭＷＬまた
はＭＷＣＯを有するフィルタを選択し得る。

ダイアフィルトレーションは、それにより、小さい望ましくない粒子がフィルタを通り
抜け、一方で大きな所望のナノ粒子が、溶液中のそのナノ粒子の濃度を変えることなく、
被保持物中に維持される、分画プロセスである。ダイアフィルトレーションは、溶液から
塩また反応緩衝液を除去するためにしばしば使用される。ダイアフィルトレーションは、
連続的または非連続的であってよい。連続ダイアフィルトレーションでは、ダイアフィル
トレーション溶液は、ろ液が生成される速度と同じ速度で試料へと加えられる。非連続ダ
イアフィルトレーションでは、溶液をまず希釈し、次いで濃縮して出発濃度へと戻す。非
連続ダイアフィルトレーションは、所望の濃度のナノ粒子に達するまで反復されてよい。

精製された及び／または濃縮された脂質ナノ粒子は、例えば、ＰＢＳなどの所望の緩衝
液中で製剤されてよい。

ｍＲＮＡをカプセル化するナノ粒子の提供
本発明に係るプロセスは、従来技術のプロセスと比較して、より均質で小さい粒子サイ
ズ（例えば、１００ｎｍ未満）、ならびに、著しく改善されたカプセル化効率及び／また
はｍＲＮＡ回収率をもたらす。

ゆえに、本発明は、本明細書に記載の精製されたナノ粒子を含む組成物を提供する。い
くつかの実施形態では、組成物中の精製されたナノ粒子の大半、すなわち、精製されたナ
ノ粒子の約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％
、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超は、約１００ｎｍ未満（例えば、約
９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、約８０ｎｍ、約７５ｎｍ、約７０ｎｍ、約６５ｎｍ
、約６０ｎｍ、約５５ｎｍ、または約５０ｎｍ未満）のサイズを有する。いくつかの実施
形態では、実質的に全ての精製されたナノ粒子が、１００ｎｍ未満（例えば、約９５ｎｍ
、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、約８０ｎｍ、約７５ｎｍ、約７０ｎｍ、約６５ｎｍ、約６０
ｎｍ、約５５ｎｍ、または約５０ｎｍ未満）のサイズを有する。

加えて、狭いナノ粒子サイズ範囲を有するより均質なナノ粒子が、本発明のプロセスに
よって達成される。例えば、本発明により提供される組成物中の精製されたナノ粒子の約
７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超
が、約４０〜９０ｎｍ（例えば、約４０〜８５ｎｍ、約４０〜８０ｎｍ、約４０〜７５ｎ
ｍ、約４０〜７０ｎｍ、約４０〜６５ｎｍ、または約４０〜６０ｎｍ）の範囲のサイズを
有する。いくつかの実施形態では、実質的に全ての精製されたナノ粒子が、約４０〜９０
ｎｍ（例えば、約４０〜８５ｎｍ、約４０〜８０ｎｍ、約４０〜７５ｎｍ、約４０〜７０
ｎｍ、約４０〜６５ｎｍ、または約４０〜６０ｎｍ）の範囲のサイズを有する。

いくつかの実施形態では、本発明により提供される組成物中のナノ粒子の分散性、また
は分子のサイズにおける均質性の尺度（ＰＤＩ）は、約０．１６未満（例えば、約０．１
５、０．１４、０．１３、０．１２、０．１１、０．１０、０．０９、または０．０８未
満）である。

いくつかの実施形態では、本発明により提供される組成物中の精製された脂質ナノ粒子
の約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％
超が、各個別の粒子内にｍＲＮＡをカプセル化する。いくつかの実施形態では、組成物中
の実質的に全ての精製された脂質ナノ粒子が、各個別の粒子中にｍＲＮＡをカプセル化す
る。

いくつかの実施形態では、本発明に係る組成物は、少なくとも約１ｍｇ、５ｍｇ、１０
ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、または１０００ｍｇのカプセル化されたｍＲＮＡを含有
する。いくつかの実施形態では、本発明に係るプロセスは、約６０％、６５％、７０％、
７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超
えるｍＲＮＡの回収をもたらす。

本発明のある特定の化合物、組成物及び方法が、ある特定の実施形態に従って特異性と
ともに記載されている一方で、以下の実施例は、本発明の化合物を単に例示する役割を果
たし、それを制限することを意図しない。

実施例１．ナノ粒子カプセル化プロセスに及ぼす温度の効果
この実施例は、ナノ粒子カプセル化プロセス中の温度の増加が、収率及び／またはカプ
セル化効率の増加をもたらすことを実証する。

脂質材料
以下の実施例に記載する製剤は、別段の指定がない限り、様々な核酸材料をカプセル化
するように設計された１つ以上のカチオン性脂質、ヘルパー脂質（例えば、非カチオン性
脂質及び／またはコレステロール脂質）及びＰＥＧ化脂質を採用する様々な比率の多成分
の脂質混合物を含有する。本プロセスのためのカチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰ（１，２−
ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイル
−３−ジメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル
−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．；Ｐａｌ
ｍｅｒ，Ｌ．；Ｂｒｅｍｎｅｒ，Ｋ．；ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｉ．“Ｃａｔｉｏｎｉｃ
ｌｉｐｉｄ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌ
ａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ
ｓ”Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２００５，１０７，２７６−２８７）、ＤＬｉｎ−ＫＣ２
−ＤＭＡ（Ｓｅｍｐｌｅ，Ｓ．Ｃ．ら、“Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｃａ
ｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０，２８，１７２−１７６）、Ｃ１２−２００（Ｌｏｖｅ，Ｋ．
Ｔ．ら、“Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｌｏｗ−ｄｏｓｅ ｉ
ｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ”ＰＮＡＳ ２０１０，１０７，１８６４
−１８６９）、ｃＫＫ−Ｅ１２（３，６−ビス（４−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）
アミノ）ブチル）ピペラジン−２，５−ジオン）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、Ｈ
ＧＴ４００３、ＩＣＥ、ジアルキルアミノ系、イミダゾール系、グアニジウム系等を含む
ことができるが、これらに限定されない。ヘルパー脂質は、ＤＳＰＣ（１，２−ジステア
ロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓ
ｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−
３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−
フォスホチジルコリン）ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホス
ホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホス
ホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−
（１’−ｒａｃ−グリセロール））、コレステロール等を含むことができるが、これらに
限定されない。ＰＥＧ化脂質は、Ｃ６−Ｃ２０長さのアルキル鎖（複数可）で脂質に共有
付着する最大で５ｋＤａまでの長さのポリ（エチレン）グリコール鎖を含むことができる
が、これに限定されない。

メッセンジャーＲＮＡ材料
コドン最適化ヒト脊髄運動ニューロン１（ＳＭＮ）メッセンジャーＲＮＡ、アルギニノ
コハク酸合成酵素（ＡＳＳ１）メッセンジャーＲＮＡ、修飾嚢胞性線維症膜コンダクタン
ス制御因子（ＳＮＩＭ（登録商標）ＣＦＴＲ、２５％シュードウリジン、２５％５−メチ
ル−シチジン）メッセンジャーＲＮＡ、ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）メッセンジャー
ＲＮＡ、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）メッセンジャーＲＮＡ、フェニルアラニンヒドロキシラー
ゼ（ｐｈｅｌｙａｌａｎｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）（ＰＡＨ）メッセンジャーＲ
ＮＡ及びアルファ−ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）メッセンジャーＲＮＡを、遺伝子をコー
ドするプラスミドＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写により合成し、その後、５‘キャップ
構造（キャップ１）（Ｆｅｃｈｔｅｒ，Ｐ．；Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，Ｇ．Ｇ．“Ｒｅｃｏｇ
ｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｃａｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｂｙ ｖｉｒａｌ ａ
ｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００５
，８６，１２３９−１２４９）及びゲル電気泳動により決定されたおおよそ２５０ヌクレ
オチドの長さの３’ポリＡ尾部が付加された。各ｍＲＮＡ生成物中に存在する５’及び３
’非翻訳領域は、それぞれＸ及びＹとして表され、（下に）記載のように定義される。
コドン最適化ヒト脊髄運動ニューロン１（ＳＭＮ）ｍＲＮＡ：
ＸＡＵＧＧＣＣＡＵＧＡＧＣＡＧＣＧＧＡＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＵＧＣＣＣ
ＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＵＧＣＵＧＵＵＣＡＧＧＡＧＡＧＧＣＡＣＣＧＧＣＣ
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ヒトアルファ−ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）ｍＲＮＡ：
ＸＡＵＧＣＡＧＣＵＧＡＧＧＡＡＣＣＣＡＧＡＡＣＵＡＣＡＵＣＵＧＧＧＣＵＧＣＧＣＧ
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コドン最適化ヒトアルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ１）ｍＲＮＡ：
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コドン最適化ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ：
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コドン最適化ヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ｍＲＮＡ：
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コドン最適化嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）ｍＲＮＡ：
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５’及び３’ＵＴＲ配列
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脂質ナノ粒子製剤
脂質の混合物（カチオン性脂質、ヘルパー脂質、双生イオン脂質、ＰＥＧ脂質等）のエ
タノール性溶液を調製して、報告された容量にし、選択された温度まで加熱した。個別に
、ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭクエン酸塩／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を
、１ｍｇ／ｍＬの原液から調製し、選択された温度まで５〜１０分間加熱した。

小規模製剤については、脂質溶液を、シリンジポンプを使用してｍＲＮＡ水溶液に迅速
に注入し（３．７１ｍＬ／秒）、結果得られた懸濁液を振とうして、脂質ナノ粒子を含む
２０％エタノールを得た。結果得られたナノ粒子懸濁液を、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で
ダイアフィルトレーションし、濃縮し、２〜８℃で保管した。

２５℃での代表的な実施例
ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＯＰＥ、Ｃｈｏｌ及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの５０ｍｇ／ｍＬエタノ
ール性溶液の一定分量を混合し、エタノールで希釈して３ｍＬの最終容量とした。個別に
、ＦＦＬ ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭクエン酸塩／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４
．５）を、１ｍｇ／ｍＬの原液から調製した。脂質溶液を、ｍＲＮＡ水溶液に迅速に注入
し、振とうして２０％エタノールの最終懸濁液を得た。結果得られたナノ粒子懸濁液をろ
過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でダイアフィルトレーションし、濃縮し、２〜８℃で保
管した。最終濃度＝０．２０ｍｇ／ｍＬ ＦＦＬ ｍＲＮＡ（カプセル化）。Ｚ_ａｖｅ＝
９１ｎｍ ＰＤＩ（０．１６）。

３７℃での製剤
ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＯＰＥ、Ｃｈｏｌ及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの５０ｍｇ／ｍＬエタノ
ール性溶液の一定分量を混合し、エタノールで希釈して３ｍＬの最終容量とした。個別に
、ＦＩＸ ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭクエン酸塩／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４
．５）を１ｍｇ／ｍＬの原液から調製した。脂質溶液を、ｍＲＮＡ水溶液に迅速に注入し
、振とうして２０％エタノールの最終懸濁液を得た。結果得られたナノ粒子懸濁液をろ過
し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でダイアフィルトレーションし、濃縮し、２〜８℃で保管
した。最終濃度＝０．２０ｍｇ／ｍＬ ＦＩＸ ｍＲＮＡ（カプセル化）。Ｚ_ａｖｅ＝６
４ｎｍ；ＰＤＩ（０．１２）。

６５℃での製剤
ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＯＰＥ、Ｃｈｏｌ及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの５０ｍｇ／ｍＬエタノ
ール性溶液の一定分量を混合し、エタノールで希釈して３ｍＬの最終容量とした。個別に
、ＦＩＸ ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭクエン酸塩／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４
．５）を１ｍｇ／ｍＬの原液から調製した。脂質溶液を、ｍＲＮＡ水溶液に迅速に注入し
、振とうして２０％エタノールの最終懸濁液を得た。結果得られたナノ粒子懸濁液をろ過
し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でダイアフィルトレーションし、濃縮し、２〜８℃で保管
した。最終濃度＝０．２０ｍｇ／ｍＬ ＦＩＸ ｍＲＮＡ（カプセル化）。Ｚ_ａｖｅ＝７
３ｎｍ；ＰＤＩ（０．１３）。

ナノ粒子カプセル化プロセスに及ぼす温度の効果
エタノール脂質溶液及びｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭクエン酸塩／１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、ｐＨ４．５）の両方を、製剤プロセスの前に異なる選択温度で加熱して、製剤の
最終収率及びカプセル化効率に及ぼす温度の効果を決定した。

ナノ粒子製剤プロセスに及ぼす温度の効果を、サイズ、サイズ分散性、カプセル化効率
及び収率（または回収）について評価した。例示的なデータを表１に示す。見られるよう
に、温度における増加（例えば、周囲温度を超える）は、カプセル化効率及び／または収
率／回収の増加、ならびに粒子サイズ及び／またはサイズ分散性の低下をもたらす。

実施例２．規模を大きくした製剤プロセス
本実施例は、増加した温度でｍＲＮＡをカプセル化するための例示的な規模を大きくし
た製剤プロセスを例証する。

例示的な規模を大きくした製剤プロセスを図１に示す。Ｉｓｍａｔｅｃのプログラム可
能なデジタル駆動ポンプ（Ｃｏｌｅ Ｐａｒｍｅｒ型番ＣＰ７８００８−１０）を使用し
た。ＭｉｃｒｏｐｕｍｐのＡマウント吸引シューポンプヘッド ３１６ ＳＳ本体／グラ
ファイトギア／ＰＴＦＥシール、０．０８４ｍＬ／ｒｅｖ、内部バイパス無し（Ｃｏｌｅ
Ｐａｒｍｅｒ型番０７００２−２７）及びＰｈａｒｍａ Ｐｕｒｅのチューブサイズ＃
１４、０．０６“ＩＤ、１／１６”（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｌａｂｓ品番ＡＣＴＵ−Ｐ１４
−２５Ｎ）を使用した。

ナノ粒子製剤及びｍＲＮＡのカプセル化は、エタノール脂質溶液とｍＲＮＡをクエン酸
塩緩衝液（１０ｍＭクエン酸塩緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）中で「Ｔ」
ジャンクション（または「Ｙ」ジャンクション）を使用して混合することにより調製され
る。ｍＲＮＡを含むクエン酸塩緩衝液及び脂質を含むエタノール溶液の例示的な流速は、
それぞれ、２００ｍｌ／分及び５０ｍｌ／分である。このプロセス中に、両方のポンプを
同時に開始する。製剤の開始時及び終了時の分画は廃棄し、中間製剤のみを収集した。正
確な流速及び低パルス流は、このプロセスの２つの重要なパラメータである。

精製及び緩衝液交換
上記ステップから得た製剤の精製及び緩衝液交換を、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｌａｂｓから
のＫｒｏｓＦｌｏ（登録商標）Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩＩｉタンジェンシャルフローろ過シ
ステムで、修飾ポリエーテルスルホン中空糸フィルタモジュールを使用して行う。緩衝液
交換は、６倍容量の滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で、連続ダイアフィルトレーション形態に
おいて行う。図２を参照されたい。製剤を、サイズ（ＰＤＩ）及びカプセル化（収率）に
ついて分析する。例示的なデータを表２に表す。

このプロセスを使用して、非常に狭い粒子サイズ範囲、及び高いカプセル化効率（例え
ば、９０％を超える平均）が達成される。

低パルス均質流の重要性を検査するために、ある程度の脈動流を有する蠕動ポンプを製
剤プロセスのために使用した。図３を参照されたい。ｍＲＮＡを含むクエン酸塩緩衝液及
び脂質を含む純エタノールを、それぞれ、２００ｍｌ／分及び５０ｍｌ／分の流速で混合
した。例示的な結果を表３に示した。見ることができるように、このプロセス内での蠕動
ポンプの使用は、より大きなサイズを有するナノ粒子の製剤をもたらす。これは、脈動流
を要因とする非均質な混合による可能性が高い。

等価物及び範囲
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を、認識す
るだろう、または通常の実験のみを使用して確認することができるだろう。本発明の範囲
は、上記の説明により制限されることを意図しないが、以下の特許請求の範囲に明記され
る。

Claims (13)

1. 嚢胞性線維症コンダクタンス制御タンパク質をコードするｍＲＮＡをカプセル化する脂質ナノ粒子を含むナノ粒子製剤であって、
   ここで、嚢胞性線維症コンダクタンス制御タンパク質をコードする該ｍＲＮＡは、４ｋｂを超える長さを有し、８５％以上のカプセル化効率で該脂質ナノ粒子内でカプセル化され、
   ここで、該脂質ナノ粒子は、８０ｎｍ以下の平均サイズおよび０．１９以下の均質性の尺度（ＰＤＩ）を有する、
   ナノ粒子製剤。
2. 前記脂質ナノ粒子が、１つまたは複数のカチオン性脂質、１つまたは複数のヘルパー脂質、および１つまたは複数のＰＥＧ脂質を含む、請求項１に記載のナノ粒子製剤。
3. 前記１つまたは複数のカチオン性脂質が、Ｃ１２−２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＩＣＥ（イミダゾール系）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＤＤＡＢ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ、およびＨＧＴ４００３からなる群より選択される、請求項２に記載のナノ粒子製剤。
4. 前記１つまたは複数のヘルパー脂質が、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスホチジルコリン）、ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、およびＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））から選択される、請求項２に記載のナノ粒子製剤。
5. 前記脂質ナノ粒子が、１つまたは複数のコレステロール系脂質をさらに含む、請求項２に記載のナノ粒子製剤。
6. 前記脂質ナノ粒子が、０．１２以下のＰＤＩを有する、請求項１に記載のナノ粒子製剤。
7. 前記脂質ナノ粒子が、０．１０以下のＰＤＩを有する、請求項１に記載のナノ粒子製剤。
8. 前記脂質ナノ粒子が、９０％を超えるカプセル化効率を有する、請求項１に記載のナノ粒子製剤。
9. 前記脂質ナノ粒子が、９５％を超えるカプセル化効率を有する、請求項１に記載のナノ粒子製剤。
10. ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子が、１を超える脂質／ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）Ｎ／Ｐ比を有する、請求項１に記載のナノ粒子製剤。
11. 前記ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子が、約２〜約６の脂質／ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）Ｎ／Ｐ比を有する、請求項１０に記載のナノ粒子製剤。
12. 前記脂質ナノ粒子が、ＰＥＧ修飾された脂質を含む、請求項１に記載のナノ粒子製剤。
13. 前記脂質ナノ粒子中の総脂質の少なくとも５％がＰＥＧ修飾された脂質である、請求項１２に記載のナノ粒子製剤。

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