JP6949364B2 - 神経細胞伸長促進剤 - Google Patents

Description

本発明は、神経細胞伸長促進剤に関する。

近年、高齢化社会に備えて、認知症の研究が進んでいる。認知症の発症原因には、様々なものが知られているが、その中でも神経細胞の損傷及び変性に起因するものが多い。神経細胞は、長い神経突起を伸ばしており、刺激情報を伝達するために特殊化した細胞である。そこで、従来より、神経細胞の損傷及び変性を抑制する医薬の開発がなされてきた。

特開２０１０−２０２５５９号公報 特開２０１５−０５１９２７号公報

出願人は、長年、わさび成分を用いた医薬品及び機能性食品を開発してきた（特許文献１、２）。出願人は、わさび成分を用いて、神経細胞の伸長を促進させることを試みた。
本発明はかかる事情に鑑みてなされたものであり、神経細胞の伸長を促進させることができる神経細胞伸長促進剤を提供することを課題とする。

本発明の神経細胞伸長促進剤は、６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート類又はその配糖体と、
不飽和脂肪酸およびポリフェノールの群から選ばれる１種以上と、
を有する。

本発明の神経細胞伸長促進剤によれば、神経細胞の伸長を促進させることができる。

神経細胞の説明図である。 実験例１の伸長試験結果を示す図である。 実験例２の６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート（６−ＭＳＩＴＣ）の毒性試験結果を示す図である。 実験例２のクルクミンの毒性試験結果を示す図である。 実験例２のＤＨＡの毒性試験結果を示す図である。 実験例２のイソラムネチンの毒性試験結果を示す図である。

本実施形態の神経細胞伸長促進剤は、（Ａ）６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート（以下、「６−ＭＳＩＴＣ」ともいう。）類又はその配糖体等のイソチオシアネート類と、（Ｂ）不飽和脂肪酸、及び（Ｃ）ポリフェノールの群から選ばれる１種以上と、を有する。

（Ａ）イソチオシアネート類
本実施形態において、イソチオシアネート類は、−ＮＣＳ基を有する化合物をいう。イソチオシアネート類は、例えば、側鎖として脂肪族又は芳香族の基を有するとよい。脂肪族の基を有するイソチオシアネート類としては、例えば、イソプロピルイソチオシアネート、イソブチルイソチオシアネート、２−ブチルイソチオシアネート、イソアミルイソチオシアネート、アミルイソチオシアネート、アリルイソチオシアネート、３−ブテニルイソチオシアネート、４−ペンテニルイソチオシアネート、５−ヘキセニルイソチオシアネート、６−ヘプテニルイソチオシアネート、３−メチルチオプロピルイソチオシアネート、４−メチルチオブチルイソチオシアネート、５−メチルチオペンチルイソチオシアネート、６−メチルチオヘキシルイソチオシアネート、７−メチルチオヘプチルイソチオシアネート、４−メチルスルフィニルブチルイソチオシアネート、５−メチルスルフィニルペンチルイソチオシアネート、６−メチルスルフィニルへキシルイソチオシアネート、６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート類（６−ＭＳＩＴＣ類）、及び７−メチルスルフィニルヘプチルイソチオシアネートの群から選ばれた１種以上が挙げられ、中でも、４−メチルスルフィニルブチルイソチオシアネート、５−メチルスルフィニルペンチルイソチオシアネート、６−ＭＳＩＴＣ類、７−メチルスルフィニルヘプチルイソチオシアネートがよい。芳香族の基を有するイソチオシアネート類としては、例えば、フェネチルイソチオシアネートが挙げられる。

本実施形態において、イソチオシアネート類は、配糖体も含む概念である。
本実施形態において、イソチオシアネート類の中で好ましいのは、６−ＭＳＩＴＣ類又はその配糖体である。

本実施形態において、６−ＭＳＩＴＣ類とは、６−ＭＳＩＴＣ及び６−ＭＳＩＴＣ類似体を含む意味である。６−ＭＳＩＴＣは、以下の化学式で表される。

本実施形態において、６−ＭＳＩＴＣ類似体は、６-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートの天然に存在する類似体、及び合成して得られる天然に存在しない６-メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートの類似体を含む。例えば、６-メチルチオヘキシルイソチオシアネート（硫黄が酸化されていない、すなわちメチルスルフィド基を有する構造）及び６-メチルスルフォニルヘキシルイソチオシアネート（硫黄が過酸化された、すなわち、メチルスルフォニル基を含む構造）等を指す。

本実施形態に用いられる６−ＭＳＩＴＣ類は、例えば、アブラナ科植物に含まれている。アブラナ科の中でも、本わさびおよび／または西洋わさびは、多くの６−ＭＳＩＴＣ類を含んでいる。

本実施形態に用いられる６−ＭＳＩＴＣ類は、化学的な合成法により得ることができるが、植物から抽出・精製したものでもよい。６−ＭＳＩＴＣ類の原料となり得る植物としては、例えば、バティス科（Ｂａｔａｃｅａｅ）、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、ブレッシュネイデラ科（Ｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒａｃｅａｅ）、フウチョウソウ科（Ｃａｐｐａｒａｃｅａｅ）、パパイア科（Ｃａｒｉｃａｃｅａｅ）、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）、ギロステモン科（Ｇｙｒｏｓｔｅｍｏｎａｃｅａｅ）、リムナンテス科（Ｌｉｍｎａｎｔｈａｃｅａｅ）、ワサビノキ科（Ｍｏｒｉｎｇａｃｅａｅ）、ペンタディプランドラ科（Ｐｅｎｔａｄｉｐｌａｎｄｒａｃｅａｅ）、ヤマゴボウ科（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａｃｅａｅ）、トベラ科（Ｐｉｔｔｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、モクセイソウ科（Ｒｅｓｅｄａｃｅａｅ）、サルウァドラ科（Ｓａｌｖａｄｏｒａｃｅａｅ）、トウァリア科（Ｔｏｖａｒｉａｃｅａｅ）、ノウゼンハレン科（Ｔｒｏｐａｅｏｌａｃｅａｅ）、の植物等を挙げることができる。具体的には、例えば、わさび（Ｗａｓａｂｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）［別名：本わさび］、西洋わさび（Ａｒｍｏｒａｃｉａ ｒｕｓｔｉｃａｎａ）［別名：山わさび］、Ｂａｔｉｓ ｍａｒｉｔｉｍａ（和名不詳）、からし（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）、ブロッコリー（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ．ｉｔａｌｉｃａ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ナズナ（Ｃａｐｓｅｌｌａ ｂｕｒｓａ―ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クレソン（Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、Ｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ（和名不詳）、ケッパー（Ｃａｐｐａｒｉｓ ｓｐｉｎｏｓａ）、パパイア（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）、Ｄｒｙｐｅｔｅｓ ｒｏｘｂｕｒｇｈｉｉ（和名不詳別名）；Ｐｕｔｒａｎｊｉｖａ ｒｏｘｂｕｒｇｈｉｉ（和名不詳）、Ｔｅｒｓｏｎｉａ ｂｒｅｖｉｐｅｓ（和名不詳）、Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ（和名不詳）、ワサビノキ（Ｍｏｒｉｎｇａ ｏｌｅｉｆｅｒａ）、Ｐｅｎｔａｄｉｐｌａｎｄｒａ ｂｒａｚｚｅａｎａ（和名不詳）、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、Ｂｕｒｓａｒｉｓ ｓｐｉｎｏｓａ ｖａｒ．ｉｎｃａｎａ（和名不詳）、シノブモクセイソウ（Ｒｅｓｅｄａ ａｌｂａ）、Ｓａｌｖａｄｏｒａ ｐｅｒｓｉｃａ（和名不詳）、Ｔｏｖａｒｉａ ｐｅｎｄｕｌａ（和名不詳）、キンレンカ（Ｔｒｏｐａｅｏｌｕｍ ｍａｊｕｓ）等が挙げられる。ただし、本開示で用いることができる６−ＭＳＩＴＣ類は、上記の植物から得られるものに限定されるものではなく、６−ＭＳＩＴＣ類を含有するすべての天然資源を原料として用いることができる。

前記植物の抽出・精製方法としては、例えば、アブラナ科植物であるわさびや西洋わさびから６−ＭＳＩＴＣ類を抽出する方法等を挙げることができる。好ましい抽出方法は特許３９１９４８９号公報によって公開されている。

本実施形態において、６−ＭＳＩＴＣ類の配糖体は、６−ＭＳＩＴＣ類に糖残基が結合した化合物である。６−ＭＳＩＴＣ類に結合する糖残基は、グルコース、ラムノース、フルクトース及びガラクトースからなる群より選択される１以上の糖であるとよく、更にグルコースが好ましい。糖残基は単糖又は多糖のいずれでもよいが、単糖が好ましい。単糖とは、単糖分子からなる糖をいう。多糖とは、２以上の単糖分子が結合した糖鎖をいう。多糖は、２以上１０以下の単糖が結合して形成されていることがよく、さらに２以上５以下の単糖が結合して形成されていることが好ましい。

６−ＭＳＩＴＣ類に結合している糖残基の結合位置は、ＮＣＳ基部分であるとよく、さらに、Ｓに結合していることが好ましい。
６−ＭＳＩＴＣ類の配糖体は、例えば、グルコヘスペリンがある。グルコヘスペリンは、以下の化学式で表される化合物である。

６−ＭＳＩＴＣ類の配糖体は、本わさびなど、６−ＭＳＩＴＣ類の配糖体を含む植物から得ることができる。例えば、当該植物について、加熱（電磁波、遠赤外線、焼成等も含む）、乾燥、凍結、酵素処理、化学的処理等の方法により酵素反応を停止させた後、水、有機溶媒などによる溶媒抽出又は圧搾、乾燥、粉砕、精製、酵素反応、化学反応等の手段を行うことにより、６−ＭＳＩＴＣ類の配糖体を抽出又は分離、精製を行う。また、６−ＭＳＩＴＣ類の配糖体は、化学的に合成して得ることもできる。

（Ｂ）不飽和脂肪酸
不飽和脂肪酸は、１又は２以上の二重結合を有する脂肪酸をいう。２以上の二重結合を有する不飽和脂肪酸がよい。不飽和脂肪酸の炭素数は特に限定しないが、１２〜２４がよく、更に１５〜２４が好ましく、１８〜２２が望ましい。

不飽和脂肪酸が有する二重結合の位置は、ω３位、ω６位、及びω９位のいずれか１箇所以上であることがよい。特に、不飽和脂肪酸は、ω３脂肪酸であることが好ましい。
ω３脂肪酸は、脂肪酸の少なくともω３位に二重結合を有する不飽和脂肪酸をいう。ω３脂肪酸としては、例えば、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６（△^{４，７，１０，１３，１６，１９}））、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、２２：５（△^{７，１０，１３，１６，１９}））、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５（△^{５，８，１１，１４，１７}））、α−リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３（△^{９，１２，１５}））が挙げられる。

ω３脂肪酸は、魚介類及び/又は魚油から抽出されるとよい。ＤＨＡは、例えば、青魚に含まれる。ＥＰＡは、例えば、タラ、ニシン、サバ、サケ、イワシ、オキアミなどの魚油に含まれる。この中、ＤＨＡ、ＥＰＡがよく、さらに、ＤＨＡが望ましい。

（Ｃ）ポリフェノール
本実施形態において、ポリフェノールは、分子内に複数のフェノール性のヒドロキシ基を持つ化合物の総称をいう。ポリフェノールは、クルクミノイド及びフラボノイドの群から選ばれる１種以上からなることがよい。

クルクミノイドは、以下の式（Ｉ）で表されるとよい。

（式中、Ａｒは、ＯＨ基を有する芳香族基を示す。）
クルクミノイドは、クルクミンジメトキシクルクミン、ビスジメトキシクルクミンが挙げられ、この中、クルクミンが好ましい。クルクミンの中には、以下の式（Ｉ−Ｉ）から（Ｉ−ＩＶ）に示すものが例示される。

クルクミンを有する成分としては、例えば、ウコンエキス、ウコン色素、又はターメリック色素などが挙げられる。
クルクミノイドはウコンから抽出されるとよい。クルクミンを含むクルクミノイドは、例えば、ウコン等を原料として有機溶媒、アルコール溶媒などを用いた抽出分離法、合成方法により得ることができる。

フラボノイドは、下記の式（ＩＩ）で表されるフラボノールであることが好ましい。

（式中、Ｘは−Ｏ⁻又は−ＯＨを示し、Ｙは−Ｏ⁻又は−ＯＨを示し、Ｚは−Ｏ⁻又は−ＯＨを示し、Ｘ、Ｙ及びＺには、あわせて２以上の−ＯＨを有する。ｎは１〜４の整数を示し、ｍは１〜５の整数を示す。）
フラボノールとしては、以下の式（ＩＩ−Ｉ）〜（ＩＩ−ＸＩ）に示すものが挙げられる。この中、式（ＩＩ−ＩＩＩ）で示されるイソラムネチンが好ましい。

イソラムネチンを含有する成分としては、例えば、イチョウ（銀杏）エキスが挙げられる。
フラボノイドはイチョウ葉から抽出されるとよい。フラボノイドは、フラボノイドを含む植物から既知の方法により抽出する方法、又は既知の合成方法により得ることができる。イソラムネチンは、イチョウの葉から既知の方法で抽出することができる。

本実施形態の神経細胞伸長促進剤は、６−ＭＳＩＴＣ類、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、クルクミン、イソラムネチンをそれぞれ単独又は２以上の組合せを有するとよい。
本実施形態の神経細胞伸長促進剤は、以下の成分の組み合わせを有していてもよい。
・６−ＭＳＩＴＣ類及びＤＨＡ、
・６−ＭＳＩＴＣ類及びクルクミン、
・６−ＭＳＩＴＣ類及びイソラムネチン。

本実施形態の神経細胞伸長促進剤が、（Ａ）６−ＭＳＩＴＣ類及び（Ｂ）ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を有する場合、（Ａ）６−ＭＳＩＴＣ類に対する（Ｂ）ＤＨＡのモル比は、０．２以上４００以下であることがよく、０．２以上８０以下が好ましく、更には０．２以上１６以下が望ましい。

本実施形態の神経細胞伸長促進剤が（Ａ）６−ＭＳＩＴＣ類及び（ＣＩ）クルクミンを有する場合、（Ａ）６−ＭＳＩＴＣ類に対する（ＣＩ）クルクミンのモル比は、０．０４以上２５以下であることがよく、０．０４以上１以下であることが好ましく、更には０．２以上１以下であることが望ましい。

本実施形態の神経細胞伸長促進剤が（Ａ）６−ＭＳＩＴＣ類及び（ＣＩＩ）イソラムネチンを有する場合、（Ａ）６−ＭＳＩＴＣ類に対する（ＣＩＩ）イソラムネチンのモル比は、０．００８以上５以下であることがよく、０．００８以上１．０以下であることが好ましく、０．００８以上０．２以下であることが望ましい。

これらの場合には、神経突起を伸長させる効果を更に効果的に促進させることができる。
本実施形態の神経細胞伸長促進剤の投与量は、患者の年齢、性別、体重、用法、用量などを考慮することにより決定される。用法としては、経口投与、血管注射、外用・塗布などが挙げられる。経口投与の場合、神経細胞伸長促進剤における６−ＭＳＩＴＣ類の１日あたりの投与量は１０μｇ〜１００ｍｇ／日がよく、不飽和脂肪酸の投与量は１００ｍｇ／日〜１０ｇ／日がよく、ポリフェノールの投与量は０．１ｍｇ／日〜１０ｇ／日がよい。

本実施形態の神経細胞伸長促進剤の用法が血管注射である場合、神経細胞伸長促進剤における６−ＭＳＩＴＣ類の一日あたりの投与量は１μｇ／日〜５ｍｇ／日がよく、不飽和脂肪酸の投与量は１ｍｇ／日〜１００ｍｇ／日がよく、ポリフェノールの投与量は０．１μｇ／日〜１ｍｇ／日がよい。

本実施形態の神経細胞伸長促進剤は、更に、添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、抗酸化剤、コーティング剤、着色剤、矯味矯臭剤、界面活性剤、可塑剤等を配合することができる。

また、本発明の効果を損なわない範囲で、抗アレルギー剤、清涼剤、ビタミン類、他の生薬を配合することもできる。
本実施形態の神経細胞伸長促進剤は、食品、医薬部外品、医薬品に含有されてもよい。

本実施形態の神経細胞伸長促進剤を含有する食品の形態は任意であり、限定されるものではない。具体的な食品の形態としては、例えば、一般食品、一般飲料、サプリメント、健康食品、機能性表示食品、特定保健用食品などの保健機能食品及び特定用途食品、清涼飲料水、茶飲料、ドリンク剤、ワイン等のアルコール飲料、菓子、米飯類、パン類、麺類、惣菜類、調味料等が挙げられる。

本実施形態の神経細胞伸長促進剤を含有する医薬部外品及び医薬品の用法は任意であり、限定されるものではないが、例えば、内用・外用剤等が挙げられる。
本実施形態の神経細胞伸長促進剤を含有する化粧品及び医薬部外品の剤形は限定されるものではないが、例えば、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、液剤、等が挙げられる。

本実施形態の神経細胞伸長促進剤は、神経細胞の突起伸長を促進する。本実施形態の神経細胞伸長促進剤は、神経細胞に関与する病気又は症状を予防又は治療するために用いることができる。

本実施形態の神経細胞伸長促進剤は、認知症、２型糖尿病、アルツハイマー型認知症、糖尿病、パーキンソン病、伝達性海綿状脳症 いわゆる「狂牛病」、ハンチントン病、甲状腺髄様癌、不整脈、動脈硬化症、関節リウマチ、大動脈中膜アミロイド、プロラクチン産生腫瘍、家族性アミロイドポリニューロパチー、遺伝的非ニューロパチー性アミロイドーシス、透析アミロイドーシス、フィンランド型アミロイドーシス、格子状角膜ジストロフィ、脳アミロイドアンギオパチー、全身性ALアミロイドーシス、封入体筋炎（Sporadic Inclusion Body Myositis）、褐色細胞腫、骨髄炎、多発性骨髄腫、脳炎、髄膜炎、プレアルツハイマー病、軽度認知障害、早期アルツハイマー病、後期アルツハイマー病、加齢に関連した認知症、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルー・ゲーリッグ病）、プリオン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、レビー小体病、フリードライヒ運動失調症、脳卒中、遺伝的脳障害、統合失調症、うつ病、双極性障害、注意欠如多動性障害（ＡＤＨＤ）、自閉症、アスペルガー症候群、およびダウン症候群などの症状の改善に有効である。

（実験例１）
各種成分を用いたＰＣ１２細胞の突起伸長試験を、以下のように実施した。
（１）各種成分調製
（ａ）６−ＭＳＩＴＣ（成分１）
６−ＭＳＩＴＣ（金印株式会社製）を入手した。本実施例で用いる６−ＭＳＩＴＣは、化学的な合成法により得た。６−ＭＳＩＴＣの化学合成法は具体的に説明すると以下のとおりである。

原理的にはKjaer等の方法に従う（Kjaer等, Acta chem.. Scand., 11, 1298, 1957）。６−クロロヘキサノールを用い、ＣＨ_３−ＳＮａと還流して６−メチルチオヘキサノールを得る。これに塩化チオニル（ＳＯＣｌ_２）を作用させて、６−クロロヘキシルメチルサルファイドを得る。次にガブリエル法を用いて、フタルイミドカリウム塩により、アミノ基を導入し、Ｎ−（６−メチルチオヘキシル）−フタルイミドを生成する。これにヒドラジン水和物を加えて還流し、６−メチルチオヘキシルアミンを得た後、チオカルボニルクロライドを作用させて、６−メチルチオヘキシルイソチオシアネートを得る。

さらに、得られた６−メチルチオヘキシルイソチオシアネートを、ｍ−クロロ過安息香酸でメチルチオ基を酸化し、６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート（６−ＭＳＩＴＣ）を得る（Morimitsu et. al., J.Biol.Chem., 277, 3456, 2002）。

また、本発明に関わる６−ＭＳＩＴＣは、アブラナ科植物等に含まれており、これらの植物からの溶媒抽出もしくは粉砕によって得ることもできる。
１００ｍｇの６−ＭＳＩＴＣをＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）溶媒に溶解して、１００ｍＭの６−ＭＳＩＴＣを有する６−ＭＳＩＴＣ溶液を調製した。
（ｂ）ＤＨＡ（成分２）
ＤＨＡ（ナカライテスク社製、製品番号14122-64）を入手した。このＤＨＡは、青魚から抽出したものである。１００ｍｇのＤＨＡをＤＭＳＯ溶媒に溶解して、１００ｍＭのＤＨＡを有するＤＨＡ溶液を調製した。
（ｃ）クルクミン（成分３）
クルクミン（ＣＡＳ番号４５８−３７−７、東京化成工業社製、製品番号Ｃ２３０２）を入手した。クルクミンは、以下の化学式で表される。

このクルクミンは、合成したものである。６７．５６ｍｇのクルクミンをＤＭＳＯ溶媒に溶解して、２００ｍＭのクルクミンを有するクルクミン溶液を調製した。
（ｄ）イソラムネチン（成分４）
イソラムネチン（ＥＸＴＲＡＳＹＮＴＨＥＳＥ社製、製品番号１１２０Ｓ）を入手した。イソラムネチンは、銀杏の葉から抽出したものである。１０ｍｇのイソラムネチンについてピペットを用いてＤＭＳＯ溶媒に溶解して、１０ｍＭのイソラムネチンを有するイソラムネチン溶液を調製した。

（２）培地調製
以下の成分を含む増殖培地Ａと分化培地Ｂとを準備した。
（ａ）増殖培地Ａの成分
ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ，ナカライテスク社製、製品番号０８４５８−４５）
１０ｗｔ％の馬血清（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、製品番号１６０５０−１２２）
５ｗｔ％牛血清（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、製品番号１０４３７−０２８）
１ｗｔ％ペニシリンストレプトマイシン（ナカライテスク社製、製品番号２６２５３−８４）
（ｂ）分化培地Ｂの成分
ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ，ナカライテスク社製、製品番号０８４５８−４５）
２ｗｔ％馬血清（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、製品番号１６０５０−１２２）
１ｗｔ％ペニシリンストレプトマイシン（ナカライテスク社製、製品番号２６２５３−８４）
（３）ＰＣ１２細胞増殖
細胞培養用フラスコ（ＴＰＰ社製）に、上記の増殖培地Ａを入れ、更に、ＰＣ１２細胞（理化学研究所製、製品番号ＲＣＢ０００９）を入れて増殖させた。ＰＣ１２細胞は、ラットの副腎髄質由来の褐色細胞腫で、神経細胞分化のモデルである。ＰＣ１２細胞は、コンフルエントが８０−９０％となったときに、増殖培地Ａを入れた新しいフラスコに、増殖培地Ａを入れた新しいフラスコに、増殖したＰＣ１２細胞を入れて、継代した。細胞が増殖した培養液と、新しい増殖培地Ａとの割合は、１：５（体積比）とした。このような継代を３回以上繰り返した。このような継代を３回以上繰り返した。

（４）ＰＣ１２細胞分化
９６ウェルプレートの各ウェルに、（３）で得た継代後のＰＣ１２細胞を５×１０^４／ｍｌ濃度で含む増殖培地Ａを１００μｌずつ播種した。一晩室温に放置して、ＰＣ１２細胞を安定化させた。プレートを遠心回転させて、プレートの各ウェルにＰＣ１２細胞を沈降させた。上澄み液を除去した。ＰＣ１２細胞が沈降している各ウェルに、分化培地Ｂを１００μｌずつ入れて攪拌して、ＰＣ１２細胞を分化培地Ｂに懸濁させた。

各ウェル内の培地にＮＧＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、製品番号Ｎ２５１３）を加えた。すべてのウェル内の培地に含まれるＮＧＦ濃度が５０ｎｇ／ｍｌであった。
更に、各ウェル内の培地に、（１）で調製した各種成分１〜４を１種類で又は２種類の組合せで各種濃度となるように加え、それぞれ試料１〜３９とした。表１には、各ウェル内の培地における、各試料を構成する成分の濃度を示した。

プレートを二酸化炭素インキュベータ（５％ＣＯ_２、３７℃）内に入れて、ＰＣ１２細胞を７２時間培養した。
（５）細胞伸長の評価
（４）の培養後に、プレートを遠心回転させてウェルに細胞を沈降させて、上澄み液を除去した。各ウェルに沈降しているＰＣ１２細胞について３枚の顕微鏡画像（明視野、×１０画像、１ウェル３枚）を撮影した。画像に映ったＰＣ１２細胞の全細胞の形状を観察した。図１に示すように、ＰＣ１２細胞は、分化が進むと、細胞体１から突起２が伸長する。ＰＣ１２細胞の全細胞数と、細胞体１の長径Ｌ１よりも長い長さＬ２の突起２を持つ細胞の数とをカウントした。長径Ｌ１よりも長い長さＬ２の突起を持つ細胞の数を全細胞数で除すことで、ＰＣ１２細胞が伸長した伸長割合を得た。各画像には、それぞれ、少なくとも８０以上のＰＣ１２細胞が現れていた。全画像に映るＰＣ１２細胞の合計は７２０以上であった。伸長割合は、全画像に映るすべてのＰＣ１２細胞の平均値で示した。各ＰＣ１２細胞についての伸長割合は、図２に示した。図２において、「Ｍ」、「Ｃ」、「Ｄ」、「Ｉ」は、順に、「６−ＭＳＩＴＣ」、「クルクミン」、「ＤＨＡ」、「イソラムネチン」を意味する。図３〜図６においても同様である。図２においてτは統計的に有意であることを意味している。＊は成分を２つ組み合わせたことで相乗効果が認められたものを意味する。ここで、相乗効果とは、各成分を単独で用いたときの伸長割合の和よりも、両者を組み合わせて使用する方が伸長割合が大きいことをいう。

図２に示すように、６−ＭＳＩＴＣ、クルクミン、ＤＨＡ、イソラムネチンのいずれかが培地に含まれることにより、これらを含まない場合に比べて、細胞伸長効果が高められた。６−ＭＳＩＴＣの細胞伸長効果は、クルクミン、ＤＨＡ、イソラムネチンに比べて高かった。

６−ＭＳＩＴＣを培地に加えた場合には、６−ＭＳＩＴＣが０．１μＭ、０．５μＭ、２．５μＭのときに、ＰＣ１２細胞について有意な伸長促進が認められた。クルクミンを培地に加えた場合には、クルクミンが０．１μＭ、０．５μＭ、２．５μＭのときに、ＰＣ１２細胞について有意な伸長促進が認められた。ＤＨＡを培地に加えた場合には、ＤＨＡが０．５μＭ、２．５μＭ、４０μＭのときに、ＰＣ１２細胞について有意な伸長促進が認められた。イソラムネチンを培地に加えた場合には、イソラムネチンが０．０２μＭ、０．１μＭ、０．５μＭのときに、ＰＣ１２細胞について有意な伸長促進が認められた。

６−ＭＳＩＴＣとそれ以外の成分との２種類が組み合わされることにより、１種類の成分を用いた場合に比べて、伸長割合が高かった。６−ＭＳＩＴＣとクルクミンとの組み合わせの場合には、６−ＭＳＩＴＣが０．１〜２．５μＭ、クルクミンが０．１〜２．５μＭであるときに伸長割合が効果的に高くなった。６−ＭＳＩＴＣとＤＨＡとの組み合わせの場合には、６−ＭＳＩＴＣが０．１〜２．５μＭ、ＤＨＡが０．５〜４０μＭであるときに伸長割合が効果的に高くなった。６−ＭＳＩＴＣとイソラムネチンとの組み合わせの場合には、６−ＭＳＩＴＣが０．１μＭ、２．５μＭ、イソラムネチンが０．０２〜０．５μＭであるときに伸長割合が効果的に高くなった。

（実験例２）
ＰＣ１２細胞に対する各成分の毒性について、ＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉ−ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ， ｙｅｌｌｏｗ ｔｅｔｒａｚｏｌｅ）試薬を用いて調査した。
ＰＣ１２細胞に対する各成分の毒性を調査するために、培地に添加する成分以外の点で、上記（実験例１）の（１）〜（４）と同様に、ＰＣ１２細胞を培養した。（４）において各ウェル内の分化培地Ｂに添加される成分は、６−ＭＳＩＴＣ（成分１）、クルクミン（成分３）、ＤＨＡ（成分２）、又はイソラムネチン（成分４）のいずれかである。分化培地Ｂ中での各成分の濃度は、６−ＭＳＩＴＣ（成分１）については、０（コントロール）、２．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、４０μＭ、８０μＭ、１６０μＭとし、クルクミン（成分３）については、０（コントロール）、２．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、４０μＭとし、ＤＨＡ（成分２）については、０（コントロール）、２．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、４０μＭ、８０μＭ、１６０μＭとし、イソラムネチン（成分４）については、０（コントロール）、２．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭとした。

上記（実験例１）の（４）ＰＣ１２細胞分化においてＰＣ１２細胞を７２時間培養した後、ＭＴＴ試薬（ナカライテスク社製、製品番号２３５４７−２１、ＭＴＴ５ｍｇ／ｍｌ ｉｎリン酸緩衝生理食塩水）を１０μｌ／ウェル添加した。更に、二酸化炭素インキュベータ（５％ＣＯ_２、３７℃）内に入れて、ＰＣ１２細胞を４時間培養した。

プレートを遠心回転させてウェルに細胞を沈降させて、上澄み液を除去した。各ウェルにＤＭＳＯを１００μｌ／ウェル添加し、振とう攪拌して、ＰＣ１２細胞をＤＭＳＯに懸濁させて細胞液を得た。

各ウェル内の細胞液について、それぞれ４９０ｎｍの吸光度を測定した。コントロールの細胞液の吸光度を分母、各試料を含む培養液で培養したＰＣ１２細胞の細胞液の吸光度を分子とする分数を小数に変換した値をもとめ、この値をＭＴＴアッセイとして示した。６−ＭＳＩＴＣ、クルクミン、ＤＨＡ、及びイソラムネチンを用いた場合の測定結果を、順に、図３、図４、図５、図６に示した。

６−ＭＳＩＴＣ、クルクミン、ＤＨＡ、及びイソラムネチンを用いた場合には、これらを用いなかった場合（コントロール）に比べて、ＭＴＴアッセイが高かった。このことから、６−ＭＳＩＴＣ、クルクミン、ＤＨＡ、及びイソラムネチンは、毒性の低い成分であることがわかった。

Claims (3)

1. ６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートと、
   ドコサヘキサエン酸と、
   を有効成分として有し、
   ｉ）前記６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートの濃度が２．５μｍｏｌ／Ｌであり、前記ドコサヘキサエン酸の濃度が０．５−４０μｍｏｌ／Ｌであるか、
   ｉｉ）前記６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートの濃度が０．５μｍｏｌ／Ｌであり、前記ドコサヘキサエン酸の濃度が２．５μｍｏｌ／Ｌであるか、または
   ｉｉｉ）前記６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートの濃度が０．１μｍｏｌ／Ｌであり、前記ドコサヘキサエン酸の濃度が４０μｍｏｌ／Ｌである、
   神経細胞伸長促進剤。
2. ６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートと、
   イソラムネチンと、
   を有効成分として有し、
   前記６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートの濃度が２．５μｍｏｌ／Ｌであり、前記イソラムネチンの濃度が０．０２−０．５μｍｏｌ／Ｌである、
   神経細胞伸長促進剤。
3. ６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートと、
   クルクミンと、
   を有効成分として有し、
   前記６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートの濃度が２．５μｍｏｌ／Ｌであり、前記クルクミンの濃度が０．５−２．５μｍｏｌ／Ｌである、
   神経細胞伸長促進剤。

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