JP6815477B2 - 顕微鏡装置および観察方法並びに顕微鏡装置制御プログラム - Google Patents

Description

本発明は、観察対象が収容された容器が設置されたステージを、観察対象の像を結像させる結像光学系に対して移動させることによって、観察対象全体の像を結像する顕微鏡装置および観察方法並びに顕微鏡装置制御プログラムに関する。

従来、ＥＳ（Embryonic Stem）細胞およびｉＰＳ（Induced Pluripotent Stem）細胞などの多能性幹細胞や分化誘導された細胞などを顕微鏡などで撮像し、その画像の特徴を捉えることで細胞の分化状態などを判定する方法が提案されている。

ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞は、種々の組織の細胞に分化する能力を備え、再生医療、薬の開発、および病気の解明などにおいて応用が可能なものとして注目されている。

一方、上述したように細胞を顕微鏡で撮像する際、高倍率な広視野画像を取得するため、いわゆるタイリング撮影を行うことが提案されている。具体的には、たとえばウェルプレートなどの培養容器の範囲内を結像光学系によって走査し、観察位置毎の画像を撮像した後、その観察位置毎の画像を結合する。

そして、このようなタイリング撮影を行う場合には、培養容器内の各観察位置においてオートフォーカス制御を行うことによって、ボケの少ない高画質な画像を取得することが提案されている（特許文献１〜特許文献４を参照）。

特開２０１０−１９１２９８号公報 特開２００６−３６５３号公報 特開２００９−１９８５２５号公報 特開２００８−４６３２７号公報

ここで、上述したようにタイリング撮影においてオートフォーカス制御を行う場合、撮影時間の短縮の観点から、オートフォーカス制御を高速かつ高精度に行うことが重要である。

しかしながら、たとえば培養容器として複数のウェルを有するウェルプレートを使用し、そのウェルプレート全体を結像光学系によって走査し、各観察位置についてオートフォーカス制御を行いながらタイリング撮影をする場合、各ウェルの底部の厚さは、製造上の誤差などに起因してウェル毎に異なる。また、培養容器のステージ上への設置の仕方によっては、ステージに対して培養容器の底面が傾いた状態で設置されて設置誤差が生じ、これにより各ウェルの底面の高さが大きく異なる場合がある。

一方で、顕微鏡装置におけるオートフォーカス制御は、圧電素子などを用いて対物レンズを移動させることによって行われるが、対物レンズの駆動範囲には限界がある。

したがって、ウェルの底面（観察対象設置面）の位置を検出してオートフォーカス制御を行う場合、隣接するウェル間で底部の厚さが大きく異なる場合または上述した設置誤差が大きい場合には、各ウェルの底面の位置が大きく異なるため、対物レンズの駆動範囲に収まらずに適切なオートフォーカス制御ができなかったり、合焦するまでに長い時間を要したりする問題がある。

この問題に対し、培養容器の底部の厚さのばらつきおよび培養容器の設置誤差をプレ計測し、その計測結果に基づいてオートフォーカス制御を行うことが考えられるが、このようなプレ計測を撮影動作（培養容器をステージ上に設置してから走査計測が終了するまでの動作）とは別に行うようにしたのでは、そのプレ計測の時間だけ撮影時間が長くなってしまう。

本発明は、上記の問題に鑑み、オートフォーカス制御をより効率的に行い、撮影時間の短縮を図ることができる顕微鏡装置および観察方法並びに顕微鏡装置制御プログラムを提供することを目的とする。

本発明の一態様による顕微鏡装置は、観察対象が収容される容器が設置されるステージと、容器内の観察対象の像を結像させる対物レンズを有する結像光学系と、ステージ上への容器の設置を受け付ける初期セット位置と、結像光学系によって容器内の各観察位置が走査される走査計測位置との間でステージを移動させるステージ駆動部と、走査計測位置において、ステージおよび結像光学系の少なくとも一方を移動させることによって、結像光学系で容器内の各観察位置を走査する走査制御部と、観察位置毎のオートフォーカス制御を行うオートフォーカス制御部と、ステージが初期セット位置から走査計測位置まで移動する間に、容器のフォーカス情報を検出するフォーカス情報検出部とを備え、オートフォーカス制御部が、ステージが走査計測位置に移動した際、フォーカス情報に基づいて、観察位置毎のオートフォーカス制御を行う。

また、上記本発明の一態様による顕微鏡装置において、フォーカス情報検出部は、フォーカス情報として容器の底面の位置を検出することができる。

また、上記本発明の一態様による顕微鏡装置において、フォーカス情報検出部は、容器の底面の少なくとも３か所を検出することができる。

また、上記本発明の一態様による顕微鏡装置においては、ステージ上に設置される容器の種類情報を取得する容器情報取得部を備えることができ、ステージ駆動部は、容器の種類情報に基づいて、初期セット位置から走査計測位置までのステージの移動経路を変更することができる。

また、上記本発明の一態様による顕微鏡装置においては、容器として、複数のウェルを有するウェルプレートを用いることができる。

また、上記本発明の一態様による顕微鏡装置においては、結像光学系を挟んで走査の方向に並べて設けられた少なくとも２つの変位センサを備えることができ、オートフォーカス制御部は、結像光学系が容器内の一の観察位置に到達する前に、先行して変位センサによって検出された一の観察位置における容器の鉛直方向の位置と、フォーカス情報とに基づいて、オートフォーカス制御を行うことができる。

また、上記本発明の一態様による顕微鏡装置において、上記変位センサは、フォーカス情報検出部として兼用することができ、ステージ駆動部は、ステージが初期セット位置から走査計測位置まで移動する間において、変位センサ上をステージが通過するように移動させることができる。

また、上記本発明の一態様による顕微鏡装置において、フォーカス情報検出部は、上記変位センサとは異なるフォーカス情報検出用の変位センサを有することができる。

また、上記本発明の一態様による顕微鏡装置において、初期セット位置から走査計測位置までのステージの移動経路は、複数方向の移動経路を有することができる。

本発明の一態様による観察方法は、観察対象が収容される容器が設置されたステージを、容器の設置を受け付ける初期セット位置からその初期セット位置とは異なる走査計測位置まで移動させ、走査計測位置において、容器内の観察対象の像を結像させる対物レンズを有する結像光学系およびステージの少なくとも一方を移動させることによって、容器内の各観察位置を走査して観察対象を観察する観察方法において、ステージが初期セット位置から走査計測位置まで移動する間に、容器のフォーカス情報を検出し、ステージが走査計測位置に移動した際、フォーカス情報に基づいて、容器内の観察位置毎のオートフォーカス制御を行う。

本発明の一態様による顕微鏡装置制御プログラムは、観察対象が収容される容器が設置されたステージを、容器の設置を受け付ける初期セット位置から走査計測位置まで移動させる手順と、走査計測位置において、容器内の観察対象の像を結像させる対物レンズを有する結像光学系およびステージの少なくとも一方を移動させることによって、容器内の各観察位置を走査させる手順とをコンピュータに実行させる顕微鏡装置制御ブログラムであって、ステージが初期セット位置から走査計測位置まで移動する間に、容器内のフォーカス情報を検出する手順と、ステージが走査計測位置に移動した際、フォーカス情報に基づいて、容器内の観察位置毎のオートフォーカス制御を行う手順をコンピュータに実行させる。

本発明の顕微鏡装置および観察方法並びに顕微鏡制御プログラムによれば、ステージが初期セット位置から走査計測位置まで移動する間に、容器のフォーカス情報を検出し、ステージが走査計測位置に移動した際、フォーカス情報に基づいて、容器内の観察位置毎のオートフォーカス制御を行うようにしたので、培養容器の底部の厚さに大きなばらつきがあったり、培養容器の設置誤差があったとしても、オートフォーカス制御をより効率的に行うことができ、かつ撮影動作中にプレ計測などを行わないので、撮影時間の短縮を図ることができる。

本発明の顕微鏡装置の一実施形態を上方から見た概略構成図 本発明の顕微鏡装置の一実施形態の具体的な構成を示す図 ステージの概略構成を示す斜視図 結像光学系の構成を示す模式図 培養容器が６つのウェルを有するウェルプレートである場合のステージの移動経路を示す図 図５に示す移動経路に沿ってステージが移動した際における培養容器の底面の検出場所を示す図 本発明の顕微鏡装置の一実施形態を用いた顕微鏡観察システムの概略構成を示すブロック図 培養容器内における観察位置の走査位置を示す図 本発明の顕微鏡装置の一実施形態を用いた顕微鏡観察システムの作用を説明するためのフローチャート ステージが往路移動している場合において使用する変位センサを説明するための図 ステージが復路移動している場合において使用する変位センサを説明するための図 本発明の顕微鏡装置のその他の実施形態を用いた顕微鏡観察システムの概略構成を示すブロック図 培養容器が２４ウェルのウェルプレートである場合のステージの移動経路を示す図 初期設定用の変位センサを設けた顕微鏡装置の一例を示す図

以下、本発明の顕微鏡装置の一実施形態を用いた顕微鏡観察システムについて、図面を参照しながら詳細に説明する。図１は、本実施形態の顕微鏡観察システムにおける顕微鏡装置１０を上方から見た図である。

顕微鏡装置１０は、観察対象が収容された培養容器５０（本発明の容器に相当する）が設置されたステージ５１を、結像光学系１４に対してＸ方向およびＹ方向に移動させることによって、培養容器５０内の各観察位置を走査し、各観察位置の像を結像光学系１４によって結像する。ここで、Ｘ方向およびＹ方向は、それぞれ、結像光学系１４の光軸方向に直交する。また、Ｘ方向およびＹ方向は、互いに直交する。

そして、本実施形態の顕微鏡装置１０においては、図１に示すように、初期セット位置Ｐ１と、走査計測位置Ｐ２とが予め設定されており、ステージ５１は、まず、初期セット位置Ｐ１に配置された後、走査計測位置Ｐ２まで移動する。

初期セット位置Ｐ１は、ステージ５１上への培養容器５０の設置を受け付ける部分である。すなわち、ステージ５１は、まず初期セット位置Ｐ１に配置され、ユーザは、初期セット位置Ｐ１に配置されたステージ５１上に培養容器５０を設置する。初期セット位置Ｐ１は、図１に示すように、走査計測位置Ｐ２とは別の位置に設けられている。本実施形態の顕微鏡装置１０においては、走査計測位置Ｐ２にヒートガラスＧが設置されているため、走査計測位置Ｐ２に配置されたステージ５１上に、培養容器５０を直接設置することができない。

そこで、走査計測位置Ｐ２とは異なる場所に設けられた初期セット位置Ｐ１までステージ５１を一旦退避させ、ステージ５１上に培養容器５０を設置可能なように構成されている。なお、ヒートガラスＧは、ステージ５１の上方に設けられ、所定の温度に温められている。このヒートガラスＧを用いてインキュベータなどから取り出された培養容器５０を温めることによって、培養容器５０が結露などによって曇るのを防止することができる。

走査計測位置Ｐ２においては、上述したようにステージ５１が、結像光学系１４に対してＸ方向およびＹ方向に移動し、これにより培養容器５０内の各観察位置が結像光学系１４によって走査される。

図２は、顕微鏡装置１０の具体的な構成を示す図である。本実施形態の顕微鏡装置１０は、観察対象である培養された細胞の位相差画像を撮像する。顕微鏡装置１０は、具体的には、図１に示すように、白色光を出射する白色光源１１と、コンデンサレンズ１２と、スリット板１３と、結像光学系１４と、結像光学系駆動部１５と、検出部１８と、撮像素子１９とを備えている。白色光源１１、コンデンサレンズ１２、スリット板１３および撮像素子１９は、図１のＺ方向に延びる結像光学系１４の光軸上に配置される。なお、図２においては、上述したヒートガラスＧを図示省略している。

図３は、ステージ５１の一例を示す図である。ステージ５１の中央には、矩形の開口５１ａが形成されている。この開口５１ａを形成する枠部材の上に培養容器５０が設置され、培養容器５０内の細胞の位相差像が開口５１ａを通過するように構成されている。

本実施形態においては、培養容器５０として、細胞が収容される複数のウェルを備えたウェルプレートを用いる。ただし、ウェルプレートに限らず、その他シャーレまたはディッシュなどを用いてもよい。また、培養容器５０に収容される細胞としては、ｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞といった多能性幹細胞、幹細胞から分化誘導された神経、皮膚、心筋および肝臓の細胞、並びに人体から取り出された皮膚、網膜、心筋、血球、神経および臓器の細胞などがある。

スリット板１３には、白色光源１１から出射された白色光を遮光する遮光板に対して白色光を透過するリング形状のスリットが設けられる。白色光がスリットを通過することによってリング状の照明光Ｌが形成される。

図４は、結像光学系１４の詳細な構成を示す図である。結像光学系１４は、図４に示すように、位相差レンズ１４ａおよび結像レンズ１４ｄを備えている。そして、位相差レンズ１４ａは、対物レンズ１４ｂおよび位相板１４ｃを備えている。位相板１４ｃは、照明光Ｌの波長に対して透明な透明板に対して位相リングを形成したものである。なお、上述したスリット板１３のスリットの大きさは、位相板１４ｃの位相リングと共役な関係にある。

位相リングは、入射された光の位相を１／４波長ずらす位相膜と、入射された光を減光する減光フィルタとがリング状に形成される。位相リングに入射された直接光は、位相リングを通過することによって位相が１／４波長ずれ、かつ、その明るさが弱められる。一方、観察対象によって回折された回折光は大部分が位相板１４ｃの透明板を通過し、その位相および明るさは変化しない。

対物レンズ１４ｂを有する位相差レンズ１４ａは、図２に示す結像光学系駆動部１５によって対物レンズ１４ｂの光軸方向に移動する。なお、本実施形態においては、対物レンズ１４ｂと光軸方向とＺ方向（鉛直方向）とは同じ方向である。位相差レンズ１４ａのＺ方向への移動によってオートフォーカス制御が行われ、撮像素子１９によって撮像される位相差画像のコントラストが調整される。また、本実施形態においては、対物レンズ１４ｂを光軸方向に移動させることによってオートフォーカス制御を行うようにしたが、これに限らず、ステージ５１をＺ方向に移動させることによって、オートフォーカス制御を行うようにしてもよい。

また、位相差レンズ１４ａの倍率を変更可能な構成としてもよい。具体的には、異なる倍率を有する位相差レンズ１４ａまたは結像光学系１４を交換可能に構成するようにしてもよい。位相差レンズ１４ａまたは結像光学系１４の交換は、自動的に行うようにしてもよいし、ユーザが手動で行うようにしてもよい。

結像光学系駆動部１５は、たとえば圧電素子のようなアクチュエータを備え、後述するオートフォーカス制御部２２から出力された制御信号に基づいて駆動する。なお、結像光学系駆動部１５は、位相差レンズ１４ａを通過した位相差画像をそのまま通過させる構成となっている。また、結像光学系駆動部１５の構成は圧電素子に限らず、位相差レンズ１４ａをＺ方向に移動可能であればよく、その他の公知な構成を用いることができる。

結像レンズ１４ｄは、位相差レンズ１４ａおよび結像光学系駆動部１５を通過した位相差画像が入射され、入射された位相差画像を撮像素子１９に結像する。

撮像素子１９は、結像レンズ１４ｄによって結像された位相差画像を撮像する。撮像素子１９としては、ＣＣＤ（Charge-Coupled Device）イメージセンサやＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）イメージセンサなどが用いられる。撮像素子としては、ＲＧＢ（Red Green Blue）のカラーフィルタが設けられた撮像素子を用いてもよいし、モノクロの撮像素子を用いるようにしてもよい。

検出部１８は、ステージ５１に設置された培養容器５０の底面のＺ方向（鉛直方向）の位置を検出する。検出部１８は、具体的には、第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂを備える。

第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂは、結像光学系１４（対物レンズ１４ｂ）を挟んで、Ｘ方向（走査方向）に並べて設けられている。本実施形態における第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂはレーザ変位計であり、培養容器５０にレーザ光を照射し、その反射光を検出することによって、培養容器５０の底面のＺ方向の位置を検出する。なお、培養容器５０の底面とは、培養容器５０の底部と観察対象である細胞との境界面であり、すなわち観察対象設置面である。

検出部１８によって検出された培養容器５０のＺ方向の位置情報は、後述するオートフォーカス制御部２２に出力され、オートフォーカス制御部２２は、入力された位置情報に基づいて、結像光学系駆動部１５を制御し、オートフォーカス制御を行う。

より具体的には、本実施形態の顕微鏡装置１０においては、結像光学系１４がステージ５１上の培養容器５０の所定の観察位置に到達する前に、先行してその観察位置における培養容器５０のＺ方向の位置情報を第１の変位センサ１８ａまたは第２の変位センサ１８ｂによって検出する。そして、結像光学系１４が、上記観察位置に到達した際に、第１の変位センサ１８ａまたは第２の変位センサ１８ｂによって検出された位置情報に基づいて、結像光学系駆動部１５を制御し、オートフォーカス制御を行う。

ここで、上述したように培養容器５０のＺ方向に位置情報に基づいて、結像光学系駆動部１５を制御してオートフォーカス制御を行う際、圧電素子などからなる結像光学系駆動部１５の駆動範囲には限界がある。一方で、ウェルプレートなどのプラスチック製の培養容器５０は、その底部の厚さの製造上のばらつきによって各ウェルの底面の位置にばらつきが生じ、結像光学系駆動部１５の駆動範囲内では、適切なオートフォーカス制御をできない場合がある。また、培養容器５０のステージ５１上への設置の仕方によっては、ステージ５１に対して培養容器５０の底面が傾いた状態で設置されて設置誤差が生じ、結像光学系駆動部１５の駆動範囲内では、適切なオートフォーカス制御をできない場合がある。

そこで、本実施形態においては、上述したような培養容器５０の底部の厚さのばらつきおよび培養容器５０の設置誤差を予め計測し、その計測結果に基づいて、結像光学系駆動部１５自体をＺ方向に移動させることによってオートフォーカス制御の初期設定を行い、結像光学系駆動部１５の駆動範囲内において適切にオートフォーカス制御可能なようにする。

具体的には、本実施形態の顕微鏡装置１０においては、図２に示すように、結像光学系１４および結像光学系駆動部１５並びに検出部１８が、保持部１６に設置されて保持されている。そして、保持部１６には初期調整機構１７が設けられており、初期調整機構１７によって保持部１６がＺ方向に移動する。初期調整機構１７は、たとえばパルスモータなどを備える。本実施形態においては、上述した計測結果に基づいて、初期調整機構１７を制御することによってオートフォーカス制御の初期設定を行う。

ただし、上述したように培養容器５０の底部の厚さのばらつきなどの計測を、撮影動作（培養容器５０をステージ５１上に設置してから走査計測が終了するまでの動作）とは別に行うようにしたのでは、その計測時間だけ余計に長くなってしまう。

そこで、本実施形態においては、培養容器５０の底部の厚さのばらつきおよび培養容器５０の設置誤差の計測を撮影動作の間に行う。具体的には、ステージ５１が初期セット位置Ｐ１から走査計測位置Ｐ２まで移動する間に、培養容器５０の底部の厚さのばらつきおよび培養容器５０の設置誤差の計測を行う。図５は、培養容器５０が、６つのウェルを有するウェルプレートである場合のステージ５１の移動経路を示す。図５に示すように、初期セット位置Ｐ１から走査計測位置Ｐ２までのステージ５１の移動経路は、複数方向の移動経路を有する。

そして、ステージ５１は、初期セット位置Ｐ１から走査計測位置Ｐ２まで移動する間に、第１の変位センサ１８ａと第２の変位センサ１８ｂの上方を通過するように移動する。これによりステージ５１上に設置された培養容器５０の底面が、第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂによって検出される。なお、本実施形態においては、検出部１８が、本発明のフォーカス情報検出部に相当する。本実施形態において、フォーカス情報とは、培養容器５０の底面のＺ方向の位置情報である。

具体的には、図６に示すように、培養容器５０が、図５に示すＰＰ１の位置まで移動した場合には、培養容器５０のウェルＷ１の底面のＺ方向の位置情報が第２の変位センサ１８ｂによって検出され、かつ、ウェルＷ３の底面のＺ方向の位置情報が第１の変位センサ１８ａによって検出される。そして、培養容器５０が、図５に示すＰＰ２の位置まで移動した場合には、培養容器５０のウェルＷ４の底面のＺ方向の位置情報が第２の変位センサ１８ｂによって検出され、かつ、ウェルＷ６の底面のＺ方向の位置情報が第１の変位センサ１８ａによって検出される。次いで、培養容器５０が、図５に示すＰＰ３の位置まで移動した場合には、培養容器５０のウェルＷ５の底面のＺ方向の位置情報が第２の変位センサ１８ｂによって検出される。本実施形態においては、ウェルＷ２の底面のＺ方向の位置情報は、第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂのいずれにも検出されない。

このように、培養容器５０の底面のＺ方向の位置情報の少なくとも３か所を検出することが好ましく、より好ましくは４か所以上である。また、本実施形態のように培養容器５０としてウェルプレートを用いる場合には、少なくとも３つのウェルの底面のＺ方向の位置情報を検出することが好ましく、より好ましくは４つ以上のウェルである。

ステージ５１が初期セット位置Ｐ１から走査計測位置Ｐ２まで移動する間に第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂによって検出された培養容器５０の底面のＺ方向の位置情報は、オートフォーカス制御部２２に出力される。オートフォーカス制御部２２は、入力された培養容器５０の底面のＺ方向の位置情報に基づいて、培養容器５０内の各観察位置におけるオートフォーカス制御の中心値を算出する。なお、本実施形態におけるオートフォーカス制御の中心値とは、対物レンズ１４ｂを光軸方向に移動させてオートフォーカス制御を行う際における対物レンズ１４ｂのＺ方向の初期位置を示す値である。

本実施形態においては、上述したように５つのウェルの底面のＺ方向の位置情報を検出するので、この５つのＺ方向の位置情報を用いて、補間演算などを行うことによって、培養容器５０内の各観察位置におけるオートフォーカス制御の中心値を算出する。なお、オートフォーカス制御部２２が、５つのＺ方向の位置情報を用いて、培養容器５０全体の底面を推定し、その推定された培養容器５０全体の底面に基づいて、各観察位置の中心値を算出するようにしてもよい。

オートフォーカス制御部２２は、培養容器５０の各観察位置のオートフォーカス制御を行う場合、結像光学系１４が各観察位置に到達した際、初期設定として、上述したように算出された各観察位置のオートフォーカス制御の中心値を用いて初期調整機構１７を制御し、これにより保持部１６をＺ方向に移動させる。具体的には、対物レンズ１４ｂのＺ方向の位置が、上記中心値の位置となるように保持部１６をＺ方向に移動させる。

次いで、上述したように観察位置に到達する前に先行して第１の変位センサ１８ａまたは第２の変位センサ１８ｂによって検出された位置情報に基づいて、結像光学系駆動部１５を制御し、オートフォーカス制御を行う。

なお、本実施形態においては、培養容器５０内の全ての観察位置についてオートフォーカス制御を行うが、必ずしもこれに限らず、たとえば２以上の観察位置毎にオートフォーカス制御を行うようにしてもよい。本発明における「観察位置毎にオートフォーカス制御を行う」とは、このような２以上の観察位置毎にオートフォーカス制御を行う方法も含む。

次に、顕微鏡装置１０を制御する顕微鏡制御装置２０の構成について説明する。図７は、本実施形態の顕微鏡観察システムの構成を示すブロック図である。なお、顕微鏡装置１０については、顕微鏡制御装置２０の各部により制御される一部の構成のブロック図を示している。

顕微鏡制御装置２０は、顕微鏡装置１０全体を制御し、特に、オートフォーカス制御部２２、走査制御部２３および表示制御部２４を備える。

顕微鏡制御装置２０は、中央処理装置、半導体メモリおよびハードディスクなどを備えたコンピュータから構成され、ハードディスクに本発明の観察装置制御プログラムの一実施形態がインストールされている。そして、この観察装置制御プログラムが中央処理装置によって実行されることによって、図７に示すオートフォーカス制御部２２、走査制御部２３および表示制御部２４が機能する。

オートフォーカス制御部２２は、上述したようにステージ５１が初期セット位置Ｐ１から走査計測位置Ｐ２まで移動する間に第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂによって検出された培養容器５０のＺ方向の位置情報に基づいて、培養容器５０内の各観察位置のオートフォーカス制御の中心値を算出する。そして、オートフォーカス制御部２２は、培養容器５０内の各観察位置のオートフォーカス制御の際、その算出した中心値に基づいて、初期調整機構１７を制御して保持部１６をＺ方向に移動させて初期設定を行う。

さらに、オートフォーカス制御部２２は、培養容器５０内の各観察位置のオートフォーカス制御の際、上述した初期設定を行った後に、第１の変位センサ１８ａまたは第２の変位センサ１８ｂによって先行して検出された培養容器５０の各観察位置のＺ方向の位置情報に基づいて、結像光学系駆動部１５を制御する。そして、結像光学系駆動部１５の駆動によって結像光学系１４の対物レンズ１４ｂが光軸方向に移動し、最終的なオートフォーカス制御が行われる。

走査制御部２３は、ステージ駆動部２１を駆動制御し、これによりステージ５１をＸ−Ｙ平面内において移動させる。ステージ駆動部２１は、圧電素子などを有するアクチュエータから構成される。

走査制御部２３は、ステージ駆動部２１を駆動制御することによって、上述したようにステージ５１を初期セット位置Ｐ１から走査計測位置Ｐ２まで移動させ、走査計測位置Ｐ２において、ステージ５１をＸ方向およびＹ方向に移動させ、培養容器５０内における観察位置を２次元状に走査し、各観察位置の位相差画像を撮像する。図８は、培養容器５０内における観察位置の走査位置を走査経路Ｍで示した図である。

図８に示すように、ステージ５１のＸ方向およびＹ方向の移動によって走査開始位置Ｓから走査終了位置Ｅまで走査経路Ｍに沿って結像光学系１４が走査される。すなわち、ステージ５１のＸ方向についての往復移動とＹ方向への移動を繰り返し行うことによって、培養容器５０内の観察位置が２次元状に走査される。

次に、図７に戻り、表示制御部２４は、顕微鏡装置１０によって撮像された各観察位置の位相差画像を結合することによって、１枚の合成位相差画像を生成し、その合成位相差画像を表示装置３０に表示させる。

表示装置３０は、上述したように表示制御部２４によって生成された合成位相差画像を表示し、たとえば液晶ディスプレイなどを備える。また、表示装置３０をタッチパネルによって構成し、入力装置４０と兼用するようにしてもよい。

入力装置４０は、マウスやキーボードなどを備え、ユーザによる種々の設定入力を受け付ける。本実施形態の入力装置４０は、たとえば位相差レンズ１４ａの倍率の変更指示およびステージの移動速度の変更指示などの設定入力を受け付ける。

次に、本実施形態の顕微鏡観察システムの作用について、図９に示すフローチャートを参照しながら説明する。

まず、ステージ５１が初期セット位置Ｐ１に移動して設置される（Ｓ１０）。そして、観察対象である細胞が収容された培養容器５０が、ステージ５１上に設置される（Ｓ１２）。

初期セット位置Ｐ１において、ステージ５１上の培養容器５０が設置された後、ステージ５１は、初期セット位置Ｐ１から走査計測位置Ｐ２まで移動する（Ｓ１４）。具体的には、ステージ５１は、図５に示した移動経路に沿って移動し、図８に示す培養容器５０内の走査開始位置Ｓが、第２の変位センサ１８ｂ上に位置するところまで移動する。

また、ステージ５１が初期セット位置Ｐ１から走査計測位置Ｐ２まで移動する間に、上述したように第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂによって、培養容器５０の底面のＺ方向の位置が検出される（Ｓ１６）。

Ｓ１６において検出された培養容器５０の底面のＺ方向の位置情報は、オートフォーカス制御部２２によって取得され、オートフォーカス制御部２２は、入力されたＺ方向の位置情報に基づいて、各観察位置のオートフォーカス制御の中心値を算出する（Ｓ１８）。

次いで、走査計測位置Ｐ２において、ステージ５１がＸ方向に移動することによって走査計測が開始される（Ｓ２０）。具体的には、まず、最初の観察位置について、オートフォーカス制御部２２が、Ｓ１８で算出された中心値に基づいて初期調整機構１７を制御し、保持部１６をＺ方向に移動させて初期設定を行う（Ｓ２２）。

そして、オートフォーカス制御部２２は、上述した初期設定を行った後に、第１の変位センサ１８ａまたは第２の変位センサ１８ｂによって先行して検出された最初の観察位置のＺ方向の位置情報に基づいて、結像光学系駆動部１５を制御し、最終的なオートフォーカス制御を行う（Ｓ２４）。そして、結像光学系１４によって最初の観察位置の位相差画像が結像され、撮像素子１９によって撮像される（Ｓ２６）。撮像素子１９によって撮像された最初の観察位置の位相差画像は、表示制御部２４に出力される。

そして、全ての観察位置が走査されたか否かが判定され（Ｓ２８）、全ての観察位置が走査されていない場合には（Ｓ２８，ＮＯ）、ステージ５１がさらにＸ方向およびＹ方向に移動し、Ｓ２２〜Ｓ２６までの処理が繰り返して行われる。本実施形態においては、上述したように各観察位置について、第１の変位センサ１８ａまたは第２の変位センサ１８ｂによって先行して培養容器５０の底面のＺ方向の位置検出が行われ、位置検出が行われた観察位置まで結像光学系１４が移動した時点において、位相差画像の撮像が行われる。すなわち、ある観察位置の位相差画像の撮像と、その観察位置よりも走査方向について前側の位置における培養容器５０のＺ方向の位置検出とが並行して行われる。また、図１０の矢印方向にステージ５１が往路移動している場合には、第２の変位センサ１８ｂによって培養容器５０の底面のＺ方向の位置が検出され、図１１の矢印方向にステージ５１が復路移動している場合には、第１の変位センサ１８ａによって培養容器５０の底面のＺ方向の位置が検出される。なお、上述したオートフォーカス制御の中心値に基づく初期設定については、結像光学系１４が観察位置に到達する前に行うようにしてもよいし、結像光学系１４が観察位置に到達した時点において行うようにしてもよい。

そして、ステージ５１がＸ方向およびＹ方向に移動することによって、結像光学系１４によって全ての観察位置が走査された場合には（Ｓ２８，ＹＥＳ）、走査計測を終了する。

次いで、表示制御部２４によって各観察位置の位相差画像が結合されて合成位相差画像を生成され（Ｓ３０）、その生成された合成位相差画像が表示装置３０に表示される（Ｓ３２）。

上記実施形態の顕微鏡観察システムによれば、ステージ５１が初期セット位置Ｐ１から走査計測位置Ｐ２まで移動する間に、培養容器５０の底面のＺ方向の位置を検出し、ステージ５１が走査計測位置に移動した際、その検出した培養容器５０の底面のＺ方向の位置に基づいてオートフォーカス制御の初期設定を行うようにしたので、培養容器の底部の厚さに大きなばらつきがあったり、培養容器の設置誤差があったとしても、オートフォーカス制御をより効率的に行うことができ、かつ撮影動作中にプレ計測などを行わないので、撮影時間の短縮を図ることができる。

なお、上記実施形態においては、６ウェルのウェルプレートを用いるようにしたが、その他１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェルなどのウェルプレートを用いるようにしてもよい。その場合、できるだけウェルプレートの全体に亘って配置された複数のウェルの底面を検出するため、初期セット位置Ｐ１から走査計測位置Ｐ２までのステージ５１の移動経路をウェルプレートの種類（容器の種類）に応じて変更するようにしてもよい。具体的には、図１２に示すように、顕微鏡制御装置２０において、容器の種類情報を取得する容器情報取得部２５をさらに設けるようにしてもよい。そして、容器情報取得部２５によって取得された容器の種類の情報に基づいて、走査制御部２３がステージ駆動部２１を制御し、ステージ５１の移動経路を変更するようにしてもよい。

なお、容器の種類の情報については、たとえばユーザが入力装置４０を用いて設定入力するようにしてもよいし、培養容器５０に対して、培養容器５０の種類の情報を記憶した記憶媒体を設け、その記憶媒体から培養容器５０の種類の情報を読み出して取得するようにしてもよい。上記記憶媒体としては、バーコードおよびＩＣ（Integrated Circuit）チップなどがある。

図１３は、培養容器５０として２４ウェルのウェルプレートを用いた場合におけるステージ５１（培養容器５０）の移動経路を示した図である。この場合のステージ５１の移動経路も複数方向の移動経路からなる。２４ウェルのウェルプレートを用いた場合、まず、初期セット位置Ｐ１から位置ＰＰ４まで培養容器５０が到達した時点において、第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂによって２つのウェルの底面のＺ方向の位置が検出される。その後、位置ＰＰ５、位置ＰＰ６および位置ＰＰ７までそれぞれ培養容器５０が到達した時点において、第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂによって２つのウェルの底面のＺ方向の位置が順次検出される。図１３に示すような移動経路でステージ５１を移動させることによって、ウェルプレートの全体に亘って配置された複数のウェルの底面を検出することができる。これにより、各観察位置のオートフォーカス制御の中心値を算出する際の補間の精度を向上させることができる。

また、上記実施形態においては、初期セット位置Ｐ１から走査計測位置Ｐ２までステージ５１が移動する際、第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂによって培養容器５０の底面のＺ方向の位置を検出するようにしたが、これに限らず、図１４に示すように、第１の変位センサ１８ａおよび第２の変位センサ１８ｂと別に、初期設定用（フォーカス情報検出用）の変位センサ６０を設けるようにしてもよい。そして、初期セット位置Ｐ１から走査計測位置Ｐ２までステージ５１が移動する際、ステージ５１が変位センサ６０上を通過するようにし、これにより変位センサ６０によって培養容器５０の底面のＺ方向の位置を検出するようにしてもよい。この場合、変位センサ６０が、本発明のフォーカス情報検出部に相当する。

また、上記実施形態においては、ステージ５１を移動させることによって、培養容器５０内の観察位置を走査するようにしたが、これに限らず、結像光学系１４、検出部１８および撮像素子１９などからなる撮影系を移動させるようにしてもよい。また、ステージ５１と撮影系との両方を移動させるようにしてもよい。

また、上記実施形態は、本発明を位相差顕微鏡に適用したが、本発明は、位相差顕微鏡に限らず、微分干渉顕微鏡および明視野顕微鏡などのその他の顕微鏡に適用するようにしてもよい。

１０ 顕微鏡装置
１１ 白色光源
１２ コンデンサレンズ
１３ スリット板
１４ 結像光学系
１４ａ 位相差レンズ
１４ｂ 対物レンズ
１４ｃ 位相板
１４ｄ 結像レンズ
１５ 結像光学系駆動部
１６ 保持部
１７ 初期調整機構
１８ 検出部
１８ａ 第１の変位センサ
１８ｂ 第２の変位センサ
１９ 撮像素子
２０ 顕微鏡制御装置
２１ ステージ駆動部
２２ オートフォーカス制御部
２３ 走査制御部
２４ 表示制御部
２５ 容器情報取得部
３０ 表示装置
４０ 入力装置
５０ 培養容器
５１ ステージ
５１ａ 開口
６０ 初期設定用の変位センサ
Ｅ 走査終了位置
Ｇ ヒートガラス
Ｌ 照明光
Ｍ 走査経路
Ｐ１ 初期セット位置
Ｐ２ 走査計測位置
ＰＰ１〜ＰＰ７ 培養容器の位置
Ｓ 走査開始位置
Ｗ１〜Ｗ６ ウェル

Claims (10)

1. 観察対象が収容される容器が設置されるステージと、
   前記容器内の前記観察対象の像を結像させる対物レンズを有する結像光学系と、
   前記ステージ上への前記容器の設置を受け付ける初期セット位置と、前記結像光学系によって前記容器内の各観察位置が走査される走査計測位置との間で前記ステージを移動させるステージ駆動部と、
   前記走査計測位置において、前記ステージおよび前記結像光学系の少なくとも一方を移動させることによって、前記結像光学系で前記容器内の各観察位置を走査する走査制御部と、
   前記対物レンズを前記結像光学系の光軸方向に移動させることにより前記観察位置毎のオートフォーカス制御を行うオートフォーカス制御部と、
   前記容器が設置された前記ステージが前記初期セット位置から前記走査計測位置まで前記ステージ駆動部の駆動により前記光軸方向と直交する方向に移動している最中に、前記ステージと共に移動する前記容器の底面の位置を検出することによって前記容器のフォーカス情報である前記容器の底面の位置を検出するフォーカス情報検出部とを備え、
   前記オートフォーカス制御部が、前記ステージが前記走査計測位置に移動した際、前記フォーカス情報である前記容器の底面の位置に基づいて前記オートフォーカス制御の初期位置に調整された前記対物レンズを、前記初期位置から前記光軸方向に移動させることにより前記観察位置毎のオートフォーカス制御を行う顕微鏡装置。
2. 前記フォーカス情報検出部が、前記容器の底面の少なくとも３か所を検出する請求項１記載の顕微鏡装置。
3. 前記ステージ上に設置される前記容器の種類情報を取得する容器情報取得部を備え、
   前記ステージ駆動部が、前記容器の種類情報に基づいて、前記初期セット位置から前記走査計測位置までの前記ステージの移動経路を変更する請求項１又は２記載の顕微鏡装置。
4. 前記容器が、複数のウェルを有するウェルプレートである請求項１から３いずれか１項記載の顕微鏡装置。
5. 前記結像光学系を挟んで前記走査の方向について並べて設けられた少なくとも２つの変位センサを備え、
   前記オートフォーカス制御部が、前記結像光学系が前記容器内の観察位置に到達する前に、先行して前記変位センサによって検出された前記観察位置における前記容器の鉛直方向の位置と、前記フォーカス情報とに基づいて、前記オートフォーカス制御を行う請求項１から４いずれか１項記載の顕微鏡装置。
6. 前記変位センサが、前記フォーカス情報検出部として兼用され、
   前記ステージ駆動部が、前記ステージが前記初期セット位置から前記走査計測位置まで移動する間において、前記変位センサ上を前記ステージが通過するように移動させる請求項５記載の顕微鏡装置。
7. 前記フォーカス情報検出部が、前記変位センサとは異なるフォーカス情報検出用の変位センサを有する請求項５記載の顕微鏡装置。
8. 前記初期セット位置から前記走査計測位置までの前記ステージの移動経路が、複数方向の移動経路を有する請求項１から７いずれか１項記載の顕微鏡装置。
9. 観察対象が収容される容器が設置されたステージを、前記容器の設置を受け付ける初期セット位置から該初期セット位置とは異なる走査計測位置まで移動させ、前記走査計測位置において、前記容器内の前記観察対象の像を結像させる対物レンズを有する結像光学系および前記ステージの少なくとも一方を移動させることによって、前記容器内の各観察位置を走査して前記観察対象を観察する観察方法において、
   前記容器が設置された前記ステージが前記初期セット位置から前記走査計測位置まで前記結像光学系の光軸方向と直交する方向に移動している最中に、前記ステージと共に移動する前記容器の底面の位置を検出することによって前記容器のフォーカス情報である前記容器の底面の位置を検出し、
   前記ステージが前記走査計測位置に移動した際、前記フォーカス情報である前記容器の底面の位置に基づいてオートフォーカス制御の初期位置に調整された前記対物レンズを、前記初期位置から前記光軸方向に移動させることにより前記容器内の観察位置毎のオートフォーカス制御を行う観察方法。
10. 観察対象が収容される容器が設置されたステージを、前記容器の設置を受け付ける初期セット位置から走査計測位置まで移動させる手順と、前記走査計測位置において、前記容器内の前記観察対象の像を結像させる対物レンズを有する結像光学系および前記ステージの少なくとも一方を移動させることによって、前記容器内の各観察位置を走査させる手順とをコンピュータに実行させる顕微鏡装置制御ブログラムであって、
    前記容器が設置された前記ステージが前記初期セット位置から前記走査計測位置まで前記結像光学系の光軸方向と直交する方向に移動している最中に、前記ステージと共に移動する前記容器の底面の位置を検出することによって前記容器内のフォーカス情報である前記容器の底面の位置を検出する手順と、
    前記ステージが前記走査計測位置に移動した際、前記フォーカス情報である前記容器の底面の位置に基づいてオートフォーカス制御の初期位置に調整された前記対物レンズを、前記初期位置から前記光軸方向に移動させることにより前記容器内の観察位置毎のオートフォーカス制御を行う手順を前記コンピュータに実行させる顕微鏡装置制御プログラム。