JP6811983B2 - 網膜神経節細胞死抑制活性を有する経口用組成物 - Google Patents

Description

本発明は、オロット酸又はオロット酸の塩を含有する、網膜神経節細胞死抑制活性を有する経口用組成物や、緑内障患者に投与するための網膜神経節細胞死抑制剤等に関する。

日本では、世界一速く高齢者人口の割合が増加しているため、様々な眼病の罹患率が上昇している。とりわけ１９９０年以降緑内障が激増し、現在、厚生労働省の調査で失明原因の第一位となっている。緑内障は、緑内障性視神経症とも定義され、視神経が障害されることにより視野の障害をきたす疾患であって、眼圧の上昇、網膜神経節細胞喪失等が症状として観察されるが、現時点では点眼薬による眼圧下降が治療の第一選択となっている。例えば、眼圧降下剤としての８−アザプロスタグランジン類似体（例えば、特許文献１参照）や、アデノシンＡ２ａ受容体作動作用を有する緑内障を治療あるいは予防するための医薬組成物（例えば、特許文献２参照）についての報告もある。したがって、眼圧の上昇に対しては、種々の点眼薬の進歩によりかなり良好な眼圧コントロールが得られることができるようになってきているが、眼圧下降効果だけでは網膜神経節細胞喪失に伴う緑内障の進行を十分に止められないといわれている。また、緑内障性視神経障害の原因の１つには、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）のアポトーシスがあるといわれ、日本では、正常眼圧でも緑内障が進行する患者が多いことが知られている。また、血流促進が正常眼圧緑内障（ＮＴＧ）向けに有効と考えられており、カシスアントシアニンが有効であるとの報告がある（特許文献３等参照）。特に日本では正常眼圧緑内障が多いので眼圧低下に依存しない、網膜神経節細胞の保護や賦活化治療が求められている。

一方、オロット酸は、微生物やネズミの成長促進因子として注目を浴びたが、オロット酸にアミノ酸を併用することによりオロット酸単独よりも有意に尿酸値を低下させることができるという知見をもとに、オロット酸又はその塩、及びアミノ酸を有効成分として含有する尿酸値低下用組成物（例えば、特許文献４等参照）が提案されている。

また、グルタチオン及び／若しくはオロット酸を含有する口内炎の予防又は治療用組成物（例えば、特許文献５等参照）や、オロット酸又はその塩を有効成分として含有する持久力向上剤及びかかる持久力向上剤を含む医薬品・食品（例えば、特許文献６等参照）や、オロット酸を含有するタバコの煙を吸入することにより引き起こされる疾患の治療用組成物（例えば、特許文献７等参照）が提案されている。

特開２０１４−１２２２５０号公報 特開２０１２−０４６５１３号公報 特開２００７−０５５９０３号公報 特開２０１１−０９８８９６号公報 特表２００８−５１２３８１号公報 特開２０１１−１３６９０７号公報 特開２０１１−０２６２０４号公報

本発明の課題は、網膜神経節細胞死抑制活性を有する組成物、及びその組成物の網膜神経節細胞死抑制剤や緑内障の予防剤としての用途を提供することにある。

本発明者らは、オロット酸の有用性について長期間にわたり検討を重ねてきており、オロット酸が、経腸投与、静脈内投与、吸引投与又は経口投与をした場合に、種々多様な効果を奏することを確認してきた。一方で、本発明者らは、緑内障を治療するための成分についても探索を続け、様々な成分を調製してきたが、満足できる効果をあげる成分を見つけることができていなかった。そんな中、上記の投与方法によって緑内障に対する効果があることは報告されていなかったオロット酸を、ラットに経口投与したところ、オロット酸は視神経障害による網膜神経節細胞死に対して抑制効果を示すことを確認し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明を以下に示す。
（１）オロット酸又はオロット酸の塩を含有する、網膜神経節細胞死抑制活性を有する経口用組成物。
（２）網膜神経節細胞死が視神経障害により引き起こされることを特徴とする上記（１）記載の経口用組成物。
（３）緑内障患者に投与するための、上記（１）又は（２）記載の経口用組成物を含むことを特徴とする網膜神経節細胞死抑制剤。
（４）非緑内障患者に投与するための、上記（１）又は（２）記載の経口用組成物を含むことを特徴とする網膜神経節細胞死予防剤。
その他の形態として、オロット酸又はオロット酸の塩を有効成分として含有する経口用の網膜神経節細胞死抑制剤又は網膜神経節細胞死予防剤を挙げることができる。

本発明によれば、緑内障を治療、改善及び／又は予防をすることができる。

オロット酸による網膜細胞の保護作用を示す図である。図中、横軸は、抗酸化剤を含まない培地（ＡＯ（−））及び抗酸化剤を含む培地（ＡＯ（＋））におけるオロット酸濃度を示し、縦軸は細胞増殖アッセイにおけるｒｆｕ（relative fluorescence units；相対蛍光単位）を示す。 オロット酸溶液を投与したラットと水を投与したラットにおける網膜神経節細胞層におけるｍｍ^２当たりの生細胞の数を示す。

本発明の網膜神経節細胞死抑制活性を有する経口用組成物としては、オロット酸又はその塩を含有する経口用組成物であれば特に制限されないが、オロット酸又はその塩を有効成分とする経口用の網膜神経節細胞死抑制剤や網膜神経節細胞死予防剤の形態を好適に例示することができる。上記オロット酸は、ウラシル−６−カルボン酸とも呼ばれるが、ＩＵＰＡＣ命名法によると「１，２，３，６−テトラヒドロ−２,６−ジオキソ−４−ピリミジンカルボン酸」で表される複素芳香環化合物の一種である。

上記オロット酸は、例えば、オロット酸生産能を有するコリネバクテリウム属細菌を培養し、培養物中にオロット酸を生成蓄積させ、これを採取する製造法（特公平７-１０２３５号参照）等、微生物を用いた発酵法により、培養液中に生成蓄積させることが可能であり、上記培養物から、すでに公知にされている通常の精製手段、例えば、沈澱法、イオン交換樹脂や活性炭等によるクロマトグラフィー法などの分離精製法を用いることにより精製、採取することができる。また、公知の化学合成法等を用いて調製することもできる。さらに市販品を用いることもできる。

上記オロット酸の塩としては、医薬的に許容される塩であれば特に限定されないが、オロット酸塩を水に溶解した場合に、水溶液が中性から弱酸性を示し、保存中に沈殿や析出するおそれが少ないコリン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩を挙げることができ、飲料の場合にはこれら水溶性の塩が好ましい。また、カプセルや錠剤などサプリメントとして摂取する場合には水溶性である必要はないことから、難溶性のナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩等の金属塩を挙げることができる。また、オロット酸はカルニチンとも塩を形成し可溶化することができ、カルニチン塩（Ｌ−カルニチンオロチン酸）は溶解性がよいが水溶液は低ｐＨとなるため、必要に応じてグアノシン等のプリン塩基や塩基性アミノ酸を添加することによりｐＨを弱酸性に高めることができる。なお本発明におけるオロット酸の水溶性の塩には、オロット酸と塩基とを単体で水に溶解させた場合に、上記のオロット酸の水溶性の塩が溶解したときと同様の態様、すなわち、水溶液中でオロット酸のイオンと、カウンターカチオンとが電離して共存する態様を呈する、オロット酸と塩基との組合せを便宜上含めることができる。かかるオロット酸と塩基との組合せとしては、例えば、オロット酸フリー体又はオロット酸一水和物等のオロット酸水和物と、リジン、アルギニン、又はオルニチンとの組合せ；具体的には、オロット酸フリー体とリジン、オロット酸フリー体とアルギニン、オロット酸フリー体とオルニチン、オロット酸一水和物とリジン、オロット酸一水和物とアルギニン、オロット酸一水和物とオルニチンの組合せ等を好適に挙げることができる。

本発明の経口用組成物の作用効果としては、視神経障害による網膜神経節細胞の細胞死（アポトーシス）の抑制能、網膜神経節細胞層における生細胞数維持能、又はこれらの作用に付随する緑内障予防能、緑内障改善能又は緑内障治療能；弱視等視神経細胞の異常に起因する難治療性疾患の治療能；を挙げることができる。本発明の網膜神経節細胞死抑制剤や網膜神経節細胞死予防剤としては、上記本発明の経口用組成物の作用効果を奏するものであれば特に制限されず、本発明の経口用組成物を網膜神経節細胞死抑制剤や網膜神経節細胞死予防剤として使用する場合の剤型としては、錠剤、カプセル剤、細粒剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、懸濁液等に製剤化された剤型を挙げることができ、特に、嚥下することが困難な高齢者等に対しては、口中において速やかな崩壊性を示す崩壊性錠剤や、シロップ剤、懸濁液等の液剤が好ましい。また、本発明の経口用組成物は医薬用途の他、液剤、カプセル剤等のサプリメントの形態とすることもできる。

上記網膜神経節細胞死抑制剤や網膜神経節細胞死予防剤の製剤化にあたっては、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤等の各種調剤用配合成分を添加することができる。

また、本発明の経口用組成物を投与する対象（者）としては、原発性開放隅角緑内障、正常眼圧緑内障、混合型緑内障、続発緑内障等の視神経障害を生じる緑内障の患者や、弱視、難治療性視神経症、緑内障に罹患していない対象（非緑内障患者）であっても、かかる緑内障を予防する必要のある／予防を希望する者を挙げることができる。

本発明の網膜神経節細胞死抑制剤や網膜神経節細胞死予防剤の投与態様としては、投与される対象の健康状態、症状の軽重、年齢、体重、医師の判断等に応じて適宜設定することができるが、細胞死抑制効果を得るためにはある程度長期間の投与が必要であり、また、高濃度単回投与ではなく、同じ量を数回に分けて投与することが必要であるという観点から、ヒトへの経口投与の場合は、オロット酸換算で、１ｍｇ〜６ｇ／ｄａｙ、好ましくは１０ｍｇ〜３ｇ／ｄａｙ、より好ましくは５０ｍｇ〜１ｇ／ｄａｙ、さらに好ましくは１００ｍｇ〜６００ｍｇ／ｄａｙの投与量を、１日１回、２回、３回、４回又は５回に分けて投与する態様を例示することができる。具体的には、１００〜２００ｍｇを含有するサプリメントを１日１〜３回投与する態様を好適に挙げることができる。治療のための投与期間としては、例えば、１週間、２週間、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１年、１年３ヶ月、１年６ヶ月、１年９ヶ月、２年又は２年以上を挙げることができ、予防のための投与期間としては、例えば、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１年、１年３ヶ月、１年６ヶ月、１年９ヶ月、２年又は２年以上を挙げることができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

［網膜細胞の保護作用］
網膜神経節細胞を含む網膜細胞に対するオロット酸による細胞保護作用を、初代培養網膜神経細胞を用いて確認した。酸化ストレスが緑内障に関与することが知られており、抗酸化作用のある成分の摂取が緑内障を改善することが示唆されている。そこで、網膜細胞をシングルセルにすることによりストレスを与えるとともに、抗酸化剤が添加されていない培地で網膜細胞を培養することにより、酸化ストレス負荷に対するオロット酸の細胞保護作用を検討した。また、抗酸化剤とオロット酸を併用した培地においても、オロット酸の細胞保護作用を検討した。

８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄）から摘出した眼球から網膜を単離し、Ｇｅｎｔｌ ＭＡＣＳを用いて細胞分離を行いシングルセルの状態にした。シングルセルの状態の網膜細胞について１．４×１０^５細胞／５０μＬ／ウェルを９６ウェルプレートへ播種し、３７℃にて１５分間培養した。神経細胞の培養・増殖に適した抗酸化作用を有する成分を含む培地であるＢ−２７サプリメント（gibco, #17504-001）（ライフテクノロジー社製）（以下、「Ｂ−２７培地」ともいう）に、オロット酸の終濃度がそれぞれ０、２５ｐｐｍ、５０ｐｐｍとなるように、５０μＬのオロット酸をアルギニン水溶液に溶解したオロット酸調製液を各ウェルに添加し、３７℃にてさらに２時間培養した。同様に、上記Ｂ２７サプリメントから細胞の酸化ストレス障害によるアポトーシスを抑制するとされる５つの抗酸化成分（ビタミンＥ、酢酸ビタミンＥ、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ及びグルタチオン）を除く事でアポトーシスが亢進されると考えられる培地 (gibco, #10889-038) （ライフテクノロジー社製）（以下、「Ｂ−２７−ＡＯ培地」ともいう）に、オロット酸の終濃度がそれぞれ０、２５ｐｐｍ、５０ｐｐｍとなるように、５０μＬのオロット酸をアルギニン水溶液に溶解したオロット酸調製液を各ウェルに添加し、３７℃にてさらに２時間培養した。その後、細胞増殖測定用試薬Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（インビトロジェン社製）を各ウェルに１０μＬ添加して、３７℃にて１８時間培養した。高感度蛍光マイクロプレートリーダーＭＡＣＳ ＧＥＭＩＮＥにて、蛍光強度（Ｅｘ＝５６０ｎｍ，Ｅｍ＝５９０ｎｍ）を測定することで細胞のViabilityを定量的に評価した。結果を図１に示す。

（結果）
図１から明らかなとおり、Ｂ−２７−ＡＯ培地において、オロット酸を添加しない場合（Ｂ−２７−ＡＯ control）と比較して、２５ｐｐｍ又は５０ｐｐｍのオロット酸を添加した場合は、有意に網膜細胞のViabilityが改善したことが確認された。また、Ｂ−２７培地において、オロット酸を添加しない場合（Ｂ−２７control）と比較して、２５ｐｐｍ又は５０ｐｐｍのオロット酸を添加した場合は、有意に網膜細胞のViabilityが改善したことが確認された。したがって、抗酸化剤の添加の有無にかかわらず、２５ｐｐｍという非常に低い濃度のオロット酸添加によって細胞のViability改善効果がもたらされ、オロット酸が網膜細胞において細胞保護効果を有することが確認された。

［視神経切断モデルを用いた検討］
（ラット飲水量の測定）
９匹のラット（ＳＤ系雄性ラット、日本チャールズリバー社製、４〜５週齢、平均体重約１００ｇ）について、入荷後１週間の通常飼育による馴化を経て試験を開始した。事前にラット１匹の１日当たりの飲水量を数日間測定し、実験期間の平均と想定される体重２５０ｇでの１日の飲水量は３０ｍＬ／匹程度であることを確認した。飲水投与を２ヶ月間行うので、ラットの成長に伴う飲水量の変化を考え、２週間毎に体重測定と飲水量測定を行った。

（オロット酸溶液の調製）
被検ラットにオロット酸フリー体・一水和物（協和発酵バイオ社製）を５００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量で動物に経口投与するため、以下のとおりオロット酸溶液を調製した。オロット酸の溶解性を増加させるためにカルニチンを添加した。調製方法は以下のとおりである。
（１）カルニチン（ロンザジャパン社製）８．４ｇを水道水９００ｍＬに溶解する。
（２）スターラーで攪拌し、完全に溶解した後にオロット酸フリー体・一水和物（協和発酵バイオ社製）４．２ｇを添加し溶解する。
（３）メスシリンダーに移し水道水で１Ｌに合わせる。
かかる方法で調製したオロット酸溶液を４℃にて保存した。

（オロット酸溶液投与）
上記オロット酸溶液は給水瓶で自由摂取させ、２週間毎に体重測定と飲水量測定を行った。コントロールラットには水道水を与えた。オロット酸溶液は１週間に２回交換するようにした。オロット酸溶液投与は２ヶ月間行った。

（視神経切断モデルラットの作製）
２ヶ月間のオロット酸溶液投与後、セボフルランで軽く吸入麻酔後に、ネンブタール４０ｍｇ／ｋｇを筋注投与した。前記ラットを保定台に固定し、眼球上方結膜を一部切開した。両手で２本の４５度曲がりマイクロ摂子で組織を避け、視神経を露出した（疼痛カテゴリーＣ）。マイクロ剪刀で視神経のみを切断し、１％フルオロ金（ＦＧ）を染み込ませた２ｍｍ^３の止血用ゼラチンスポンジ（スポンゼル、アステラス製薬社製）を視神経断端に留置することにより、網膜神経節細胞のＦＧ標識を行った。結膜を整復し、抗菌剤眼軟膏を点入した。以上のとおり片眼のみ視神経断端処置を行い、僚眼は無処置とした。術後はオロット酸溶液投与を継続した。

（網膜神経節細胞数計測による評価）
視神経断端処置後１０日目にラットをセボフルラン麻酔下で頚椎脱臼した上、眼球を摘出して、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）にて網膜を固定し、フラットマウント標本を作製後、網膜神経節細胞を計数、定量した。一網膜あたり、９０度ずつ移動して４ヶ所、当該４ヶ所について同心円状に中心部から周辺部にかけて３ヶ所ずつ、合計１２ヶ所の領域で、蛍光顕微鏡でＦＧラベルされた網膜神経節細胞の写真を撮影した。各写真の中で、５００ピクセル四方の範囲で平均的な細胞体の分布を示す部分の細胞数を計数し、網膜神経節細胞の細胞密度を算出した。保温処置により覚醒を確認し、ゲージに戻した。

（結果）
図２より明らかなとおり、コントロール群（５匹）と比較すると、オロット酸溶液投与群（４匹）のいずれも網膜神経節細胞層における生細胞の数が有意に多かった。したがって、視神経断端処置前の２ヶ月間のオロット酸溶液投与により、オロット酸は視神経障害による網膜神経節細胞死に対して顕著に抑制効果を示すことが確認された（図１参照）。

（まとめ）
以前の実験で、今回の実験と同量のオロット酸溶液をゾンデでの単回投与で１週間与えた場合は有意な結果は得られなかったことから、次の２点が考えられた。
１）細胞死抑制効果を得るためにはある程度長期間の投与が必要である。
２）高濃度単回投与ではなく、同じ量を数回に分けて接種することが必要である。

本発明は、緑内障等の網膜神経節細胞の損傷に起因する眼疾患を予防、改善、治療することができる点で、医療分野において有用である。

Claims (4)

1. オロット酸又はオロット酸の塩（ただし、オロット酸リチウムを除く）を含有する、網膜神経節細胞死の抑制又は予防のための経口用組成物。
2. 網膜神経節細胞死が視神経障害により引き起こされることを特徴とする請求項１記載の経口用組成物。
3. 緑内障患者に投与するための、請求項１又は２記載の経口用組成物を含むことを特徴とする網膜神経節細胞死抑制剤。
4. 非緑内障患者に投与するための、請求項１又は２記載の経口用組成物を含むことを特徴とする網膜神経節細胞死予防剤。