JP6810690B2

JP6810690B2 - 疾患組織に対する選択性を有するファルマコフォアを含む組成物およびその生成方法

Info

Publication number: JP6810690B2
Application number: JP2017527192A
Authority: JP
Inventors: マン，デイヴィッド; ルースラーティ，エルキ; コマツ，マサノブ
Original assignee: Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute; Vascular Biosciences Inc
Current assignee: Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute; Vascular Biosciences Inc
Priority date: 2014-08-06
Filing date: 2015-08-04
Publication date: 2021-01-13
Anticipated expiration: 2035-08-04
Also published as: WO2016022610A1; US11642391B2; JP2017532366A; CN106794217A; EP3177309A4; EP3177309A1; EP3177309B1; US20230414704A1; US20190022170A1

Description

［連邦政府支援の研究に関する陳述］
本発明は、アメリカ国立衛生研究所（National Institute of Health (NIH)）からのSTTRグラント（助成）番号R41 GM099174およびVITA契約番号HHSN268201400006Cの下で政府支援によってなされた。

［関連出願］
本出願は、2014年8月6日に出願された米国仮出願第62/034,046号および2015年5月13日に出願された米国仮出願第62/161,121号の優先権を主張するものであり、それらの内容は参照によって組み込まれるものとする。

［発明の分野］
本発明は、異常細胞および病変組織に選択的に局在化、結合、および内在化する分子に特に着目した創薬および開発の分野一般に関連する。

ファルマコフォアは、治療的に活性な分子の保存された分子的特徴であって、その分子がその生物学的活性を発揮するのに必要ものとして定義される。化合物の構造と機能の関係についての研究は、化合物とその特定の生物学的標的との間の最適な相互作用に必要とされる特定の立体的および電子的特徴に対して重要な洞察を提供できる。

ファルマコフォアの同定は、同様の生物学的活性を有する多様な構造の分子の設計に有用であり得る。ファルマコフォアの理解は、レセプターとリガンドとの相互作用および未知のレセプター活性部位の他の化学的および構造的特性に関する詳細をもたらすことができる。ファルマコフォアの正確な同定はまた、増強された治療選択性またはより望ましい薬学的特性を有する類似体の創出による化合物の潜在的最適化を可能にする。

疾患治療における大きな障害は、健康な組織を温存しながらも、病変組織を選択的に標的とすることができる薬剤が相対的に不足していることである。病変組織を選択的に標的とし、全身療法に伴う副作用を低減するための新たな治療戦略が必要とされている。また、病変組織を選択的に同定する診断用薬も必要とされている。疾患選択性および内在化特性を有する分子クラスを包含するファルマコフォアの同定は、重要な治療および診断の可能性を有する化合物の開発を可能にするであろう。本発明は、病変組織に対する選択性を有するファルマコフォアを同定することによりこのニーズを満たすものである。本発明はまた、このファルマコフォアに適合し、治療目的や診断目的に有用であり得る分子を同定する。これらの化合物はまた、独立型治療剤として適しており、治療剤に結合したホーミング部分として、あるいは病変組織に同時投与した薬剤の効果を選択的に高めるためにも適している。

敗血症は、感染症に対する強い免疫応答により引き起こされ、生命を脅かす病状である。感染症に抵抗するために血流に放出される天然化学物質は、全身の炎症を引き起こし、多臓器不全および死に至る可能性があり得る（National Institute of General Medical Sciences, 2014）。敗血症の非特異的症状が他の多くの症状と重なり、敗血症の診断を困難にさせるため、敗血症の発症率は著しく過少報告されていると推定される。それにもかかわらず、敗血症は全入院の約2％で起こっており、米国のみで年間約75万人が罹患していると推定されている（Martin 2012; Lever et al., 2007）。敗血症の発症率も上昇しており、1年あたりの症例数は、1979年の164,072件から2000年の659,935件に増加し、それぞれの死亡件数は43,579件から120,491件に増加している（Lever et al., 2007）。さらに、典型的に敗血症の死亡率は高く、最も軽度のタイプでの10％から、敗血症性ショックを有する患者での80％近くと様々である（Lever et al., 2007）。

現在、敗血症治療に使用される薬物療法の1つに、好中球エラスターゼ阻害薬であるシベレスタットがある。しかし、敗血症の治療薬としてのシベレスタットの有効性は、これまで説得力をもって証明されていない。1つの系統的レビューおよびメタ分析でシベルスタットを使用した8回の個別の試験を調べたところ、シベルスタットは、無作為化後28〜30日以内の死亡率に差はなく、人工呼吸を行った日数にも差がなく、180日での死亡率を増加させる可能性があることが見出された（Iwata et al., 2010）。本研究においてシベルスタットは、酸素供給を短期間改善することに関連している可能性があり、効果がある場合のシベルスタットの効果は、中程度であると結論付けている（Iwata et al., 2010）。

アンチトロンビンIIIは、敗血症の治療薬としても使用されている。最近のデータでは、抗凝固作用に加えて、抗トロンビンも強力な抗炎症剤であることを示唆しており、抗トロンビンIIIは、致死量の大腸菌を用いた動物実験において、多臓器不全や死亡率を大幅に減少させることがわかった（Dept. Haematology, Royal Free University College London Medical School, 2001）。これらの結果を念頭に置いて、抗トロンビン療法を用いて敗血症患者の臨床試験をいくつか実施した。一部の小規模研究では、抗トロンビン療法が30日間での死亡率減少を示したが、差は統計学的に有意ではないとわかった（Dept. Haematology, Royal Free University College London Medical School, 2001）。大規模な臨床試験では、抗トロンビン療法群とプラセボ群での生存期間の差は認められなかったが、サブグループ分析を用いたところ、抗トロンビン療法は、敗血症で最も重篤な敗血症ショックの患者において有意な延命効果を示した（Dept. Haematology, Royal Free University College London Medical School, 2001）。もう一つのランダム化対照試験では、2000名を超える重篤な敗血症サンプルの患者に抗トロンビンIIIが高用量使用され、抗トロンビンIII群での死亡率が38.9％、プラセボ群では38.7％であり、その副次的なエンドポイントでは2つのグループ間で差異を示さなかった（Warren et al., 2001）。

敗血症治療に頻繁に使用されている最終的な治療の1つがステロイド療法である。しかし、研究では、ステロイド療法が敗血症に役立つという明確な結果は見出されず、いくつかの症例では、ステロイド療法が実際に二次感染を引き起こし、生存率に効果がないことが判明した。敗血症ショックの患者に低用量ヒドロコルチゾン療法を試験したある研究における結果では、ヒドロコルチゾンは敗血症ショック患者の生存率を改善しなかったことを示し、ヒドロコルチゾン治療群においてより多くの重複感染の発現があった（Spring et al., 2008）。ヒドロコルチゾンまたは他のコルチコステロイドを試験した他の研究においても、延命効果はなく、実際にはヒドロコルチゾンまたはコルチコステロイド群はプラセボ群よりもより多くの合併症を経験した（Rakela et al., 1991; Hotchkiss et al., 2003）。

血行力学的補助、輸液蘇生、昇圧剤治療、酸素供給の増強、経験的抗菌療法、およびコルチコステロイド療法などの医療資源の集約的利用にもかかわらず（Claessens et al., 2007; Kilal et al., 2014）、敗血症による死亡リスクは30〜80％となっている（Jawad et al., 2012）。敗血症の生存率を改善でき得る革新的なアプローチに対して、緊急だが未だ対処されていないニーズがある。

CARは、創傷治癒を含む、多種多様な損傷障害、炎症障害および線維性障害（Jarvinen et al., 2007）、肺高血圧症（Urakami et al., 2011; Toba et al., 2014）、急性肺障害、肺線維症、慢性腎臓病およびトリプルネガティブ乳がん誘発悪液質（Mann et al., 2015）にホーミングし、前臨床有効性を示す。これら外見上異なる疾患は、変化したグリコカリックスという共通の特徴を共有する。敗血症はまた、変化したグリコカリックスによって特徴付けられるため（Chelazzi et al., 2015）、CARが、治療剤にコンジュゲートしたホーミング部分として、または治療剤としてCARのみを投与することによって、既存の薬剤との同時投与を通じて敗血症に関連する死亡率を効果的に減少させるための強力な候補となり得る。

疾患ホーミングおよび内在化特性に必須のCARファルマコフォアの特徴が本明細書で開示され、さらにCARファルマコフォアの範囲内に入る分子の実体も開示される。

本明細書では、同定されたCARファルマコフォアを含む化合物が開示される。腫瘍血管構造、再生組織、創傷組織、炎症組織、線維化組織、再構築組織、ヘパラナーゼレベルの上昇を特徴とする組織を選択的に標的とし、そのような異常細胞に内在化する機能を有するペプチドが開示される。開示された化合物は、他の共役化合物、関連化合物、または同時投薬化合物の選択的標的化、内在化、および組織透過も媒介でき得る。

環状、直鎖状、またはトランケート型CARファルマコフォアを含む化合物が開示される。

また、配列番号1〜8、12、および16〜33の配列を有するアミノ酸セグメント、関連するアミノ酸配列、またはCARファルマコフォアを含むあらゆるペプチドまたはタンパク質も開示される。ペプチドまたはタンパク質は、配列番号1〜8、12および16〜33のアミノ酸配列、または複数の保存的アミノ酸置換を有する配列番号1〜8、12および16〜33のアミノ酸配列を含むアミノ酸セグメントからなり得る。

また、配列番号1〜8、12、および16〜33の配列を有するアミノ酸セグメント、関連するアミノ酸配列、またはCARファルマコフォアを含むペプチドまたはタンパク質であって、アミノ酸配列が置換、挿入または欠失の改変を受けているあらゆるペプチドまたはタンパク質が開示される。配列番号2〜8、12、および16〜33の配列を有するアミノ酸セグメント、関連するアミノ酸配列、またはCARファルマコフォアを含むあらゆる保存的変異体が開示される。また、CARファルマコフォアを有する共役化合物、ならびに化学誘導化したCARファルマコフォアを含有する化合物も開示される。

開示された組成物は、配列番号1〜33のいずれかの構造の同定またはCARファルマコフォアを含む任意の他の化合物の同定のために、分子モデリング、計算化学、またはコンピューター援用薬品設計（CADD）技術と共に使用でき得る。ペプチド模倣薬の使用により発見または開発されたCARファルマコフォアを含む化合物が開示される。

経済的な産生、より優れた化学的安定性、毒性または副作用の低減、強化された薬理作用（例えば、半減期、吸収、分布、代謝、排泄、効能、有効性、標的結合または親和性など）、変化した特異性（例えば、広域な生物学的活性など）、抗原性の低下など、強化された特性または望ましい特性を有する分子が開示される。また、経済的な産生、より優れた化学的安定性、毒性または副作用の低減、強化された薬理作用（例えば、半減期、吸収、分布、代謝、排泄、効能、有効性、標的結合または親和性など）、変化した特異性（例えば、広域な生物学的活性など）、抗原性の低下など、強化された特性または望ましい特性を有する分子も開示される。

独立した機能を有する第2のペプチドに融合された、ホーミングペプチドを含む二機能性ペプチドが開示される。また、組み合わせ技術またはスクリーニング技術により同定された組成物であって、配列番号2〜33に開示される組成物またはその一部分が組み合わせプロトコルまたはスクリーニングプロトコルにおける標的として使用される組成物も開示される。

さらに、環状CARファルマコフォアを同定する方法であって、
a）密接に関連する少なくとも7つの追加ペプチド（配列番号2〜8）を合成するために、環状CARペプチド（配列番号1）に置換（permutation）を実施すること；
b）配列番号1〜8の細胞結合および内在化アッセイを実施すること；
c）生物学的活性を保持するためにCARについて保存を必要とする工程b）からの残基および配列パターンを同定すること；
d）小化合物ライブラリを作製し、CARファルマコフォアの保存された分子の特徴をさらに同定するために、配列番号1〜8のインシリコモデリングを実施すること；
e）類似体モデルを配列番号１と重ね合せること；および
f）保存された構造パターンについて重ね合せた類似体を分析すること
を含む方法が開示される。

また、少なくとも一つの治療的に活性な分子のファルマコフォアを同定する方法であって、
a）少なくとも１つの治療的に活性な分子に、その分子の類似体を合成するために、順列置換を実施すること；
b）治療的に活性な分子および合成された類似体について細胞結合および内在化アッセイを実施すること；
c）治療活性を保持するためにその分子について保存を必要とする工程b）からのあらゆる残基および配列パターンを同定すること、
d）小化合物ライブラリを作製し、保存されたファルマコフォアの分子特徴をさらに同定するために、治療的に活性な分子および類似体のインシリコモデリングを実施すること；
e）類似体モデルを治療的に活性な分子モデルと重ね合せること；および
f）保存された構造パターンについて重ね合せた類似体を分析すること
を含む方法を開示する。

一実施態様において、疾患に対して測定可能な治療効果をもたらす少なくとも一つの治療分子は、腫瘍血管構造、再生組織、創傷組織、炎症組織、繊維化組織、再構築組織、損傷内皮、ヘパラナーゼレベルの上昇を特徴とする組織を選択的に標的とし、そしてそのような異常細胞に内在化する能力を有するペプチドからなる群から選択され得る。

別の実施態様において、疾患は肺疾患、肺高血圧症、間質性肺疾患、急性肺傷害、急性呼吸促迫症候群、喘息、敗血症、敗血症性ショック、感染症、肺サルコイドーシス、結合組織病（全身性エリテマトーデス、リューマチ性関節炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎など）における肺の症状、気管支拡張症、石綿症、ベリリウム症、珪肺症、ヒスチオサイトーシスX、肺炎、間質性肺炎、喫煙者肺、閉塞性細気管支炎、肺線維症、その他心筋梗塞、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症、塵肺症、腎性全身性線維症、瘢痕形成、ケロイド、関節線維症、癒着性関節包炎、放射線維症、乳腺線維嚢胞症、肝硬変、肝炎、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝疾患、急性肝不全、非アルコール性脂肪性肝炎、リンパ節または他の器官のサルコイドーシスなどの線維性疾患、炎症性腸疾患、クローン病、悪液質、慢性腎臓病、急性腎傷害、急性腎不全、多発性嚢胞腎、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性硬変、膵炎、間質性膀胱炎、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化症、虚血性心疾患、血管炎、新生物性/転移性/腫瘍性疾患（がんを含む）、塵肺症、自己免疫疾患、血管新生性疾患、創傷治癒、感染症、外傷性損傷および全身エリテマトーデスを含む全身結合組織疾患、リウマチ性関節炎強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、嚢胞性線維症、勃起不全、α1-アンチトリプシン欠乏症、糖尿病、高ヘパラナーゼルレベルを特徴とする疾患、神経炎症状態、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病（PD）、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症などの中枢神経変性疾患、外傷性脳損傷、低酸素症、加齢脳、滲出型黄斑変性症、新生血管加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、神経膠芽腫、および老化関連疾患からなる群から選択される場合がある。

好ましい実施態様において、疾患は、肺動脈性肺高血圧症、敗血症、腎臓病、がんおよび悪液質からなる群より選択され得る。

また、疾患に罹患している個体を治療する方法であって、
a）実質的にCARファルマコフォアと同一の配列であって、配列番号16〜配列番号33からなる群より選択される配列を含む標的ペプチド、またはその変異体を提供すること；
b）肺疾患、肺高血圧症、間質性肺疾患、急性肺傷害、急性呼吸促迫症候群、喘息、敗血症、敗血症性ショック、感染症、肺サルコイドーシス、結合組織病（全身性エリテマトーデス、リューマチ性関節炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎など）における肺の症状、、気管支拡張症、石綿症、ベリリウム症、珪肺症、ヒスチオサイトーシスX、肺炎、間質性肺炎、喫煙者肺、閉塞性細気管支炎、肺線維症、その他心筋梗塞、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症、塵肺症、腎性全身性線維症、瘢痕形成、ケロイド、関節線維症、癒着性関節包炎、放射線維症、乳腺線維嚢胞症、肝硬変、肝炎、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝疾患、急性肝不全、非アルコール性脂肪性肝炎、リンパ節または他の器官のサルコイドーシスなどの線維性疾患、炎症性腸疾患、クローン病、悪液質、慢性腎臓病、急性腎傷害、急性腎不全、多発性嚢胞腎、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性硬変、膵炎、間質性膀胱炎、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化症、虚血性心疾患、血管炎、新生物性/転移性/腫瘍性疾患（がんを含む）、塵肺症、自己免疫疾患、血管新生性疾患、創傷治癒、感染症、外傷性損傷および全身エリテマトーデスを含む全身結合組織疾患、リウマチ性関節炎強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、嚢胞性線維症、勃起不全、α1-アンチトリプシン欠乏症、糖尿病、高ヘパラナーゼルレベルを特徴とする疾患、神経炎症状態、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病（PD）、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症などの中枢神経変性疾患、外傷性脳損傷、低酸素症、加齢脳、滲出型黄斑変性症、新生血管加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、神経膠芽腫、および老化関連疾患からなる群より選択される疾患に測定可能な治療効果をもたらす少なくとも一つの治療分子を提供すること；
c）a）およびb）を含む組成物をそれを必要とする個体に同時投与すること；ならびに
d）個体に対する治療効果を測定すること
を含む方法を開示する1。

さらに、疾患に罹患している個体を治療する方法であって、
a）実質的にCARファルマコフォアと同一の配列であって、配列番号16〜配列番号33からなる群より選択される配列を含む標的ペプチド、またはその変異体を提供すること；
b）肺動脈性肺高血圧症（PAH）、敗血症および悪液質からなる群より選択される疾患に対して測定可能な治療効果をもたらす少なくとも一つの治療分子を提供すること；
c）a）およびb）を含む組成物をそれを必要とする個体に同時投与すること；および
d）個体に対する治療効果を測定すること
を含む方法を開示する。

一つの実施形態では、少なくとも一つの治療分子は、イマチニブ、シベレスタット、パクリタキセル、アンチトロンビンIII、ヒドロコルチゾンからなる群より選択され得る。

また、疾患に罹患している個体を治療する方法であって、
a）実質的にCARファルマコフォアと同一の配列であって、配列番号16〜配列番号33からなる群より選択される配列を含む標的ペプチド、またはその変異体を提供すること；
b）a）における標的ペプチドであって、肺疾患、肺高血圧症、間質性肺疾患、急性肺傷害、急性呼吸促迫症候群、喘息、敗血症、敗血症性ショック、感染症、肺サルコイドーシス、結合組織病（全身性エリテマトーデス、リューマチ性関節炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎など）における肺の症状、気管支拡張症、石綿症、ベリリウム症、珪肺症、ヒスチオサイトーシスX、肺炎、間質性肺炎、喫煙者肺、閉塞性細気管支炎、肺線維症、その他心筋梗塞、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症、塵肺症、腎性全身性線維症、瘢痕形成、ケロイド、関節線維症、癒着性関節包炎、放射線維症、乳腺線維嚢胞症、肝硬変、肝炎、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝疾患、急性肝不全、非アルコール性脂肪性肝炎、リンパ節または他の器官のサルコイドーシスなどの線維性疾患、炎症性腸疾患、クローン病、悪液質、慢性腎臓病、急性腎傷害、急性腎不全、多発性嚢胞腎、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性硬変、膵炎、間質性膀胱炎、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化症、虚血性心疾患、血管炎、新生物性/転移性/腫瘍性疾患（がんを含む）、塵肺症、自己免疫疾患、血管新生性疾患、創傷治癒、感染症、外傷性損傷および全身エリテマトーデスを含む全身結合組織疾患、リウマチ性関節炎強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、嚢胞性線維症、勃起不全、α1-アンチトリプシン欠乏症、糖尿病、高ヘパラナーゼルレベルを特徴とする疾患、神経炎症状態、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病（PD）、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症などの中枢神経変性疾患、外傷性脳損傷、低酸素症、加齢脳、滲出型黄斑変性症、新生血管加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、神経膠芽腫、および老化関連疾患からなる群から選択された疾患に測定可能な治療効果をもたらすペプチドを投与すること、そして
c）個体に対する治療効果を測定すること
を含む方法を開示する。

好ましい実施態様において、疾患はPAH、敗血症、がんおよび悪液質からなる群より選択され得る。

また、本明細書に開示されるペプチドに連結される部分を含むコンジュゲートも本明細書に開示される。当該部分は、抗血管新生剤、血管新生促進剤、がん化学療法剤、細胞毒性剤、抗炎症剤、抗関節炎薬、ポリペプチド、核酸分子、小分子、蛍光体、フルオレセイン、ローダミン、放射性核種、ガドリニウム、酸化鉄、ヨウ素含有造影剤、硫酸バリウム、ガリウム、18Ｆ-フルオロデオキシグルコース、カプリミナ（Cuprymina）、3'-デオキシ-3'-［18F］フルオロチミジン、インジウム111、テクネチウム99、炭素11、炭素13、またはその組み合わせとなり得る。当該部分は、治療薬、検出可能な薬剤、ウイルス、またはファージとなり得る。例えば、配列番号1から配列番号33のアミノ酸配列を含むアミノ酸セグメントを有するペプチドに連結された部分を含むコンジュゲートが開示される。

本明細書に開示されるペプチドなどの部分およびホーミング分子を含むコンジュゲートが開示される。例えば、再生組織、創傷組織または腫瘍に選択的にホーミングするホーミング分子に連結された治療薬を含有するコンジュゲートが開示される。開示されたコンジュゲートは、例えば、配列番号1から配列番号33のアミノ酸配列を含むアミノ酸セグメントを有するペプチドに連結された部分を含み得る。

本明細書中に開示されるあらゆる形態または種類のホーミング分子を、開示されたコンジュゲートにおいて使用することができる。当該部分は、任意の分子であり得る。好ましくは、当該部分はホーミング分子の標的に対して有用に標的化された分子である。例えば、治療効果を有する部分など、標的に影響を及ぼす部分、または蛍光分子、造影剤、または放射性核種など、標的の検出、視覚化またはイメージングを容易にする部分。再生組織、創傷組織、または腫瘍にホーミングする開示されるペプチドは、例えば創傷1治癒を促進し、炎症または痛みを治療し、またはがんを治療することができ得る部分と有用に組み合わせることができ得る。様々な治療剤は、限定するものではないが、抗血管新生剤、血管新生促進剤、がん化学療法剤、細胞毒性剤、抗炎症剤、抗関節炎薬、ポリペプチド、核酸分子、小分子、蛍光体、フルオレセイン、ローダミン、放射性核種、ガドリニウム、酸化鉄、ヨウ素含有造影剤、硫酸バリウム、ガリウム、フッ素18-フルオロデオキシグルコース、Cuprymina、3'-デオキシ-3'-（18F）フルオロチミジン、インジウム111、テクネチウム99、炭素11、炭素13、またはその組み合わせである部分を含むコンジュゲートで有用である。

コンジュゲートは、例えば、少なくとも２つのホーミング分子に連結されたリポソームまたは他の高分子マトリックスを含むことができる。必要に応じて、リポソームまたは他の高分子マトリックスを少なくとも10個、少なくとも100個または少なくとも1000個のホーミング分子に連結することができる。リポソームは、当該コンジュゲートにおいて有用であり得る。リポソームはリン脂質または他の脂質から構成され、製造および投与が比較的容易な非毒性で、生理学的に許容される代謝可能なキャリアである（Gregoriadis, Liposome Technology, Vol. 1 (CRC Press, Boca Raton, Fla. (1984)）。リポソームまたは他の高分子マトリックスは、任意には、治療薬、がん化学療法剤、細胞傷害性薬、診断用薬、抗血管新生薬、ポリペプチドまたは核酸分子などの別の成分を特に制限なく含めることができる。

ある実施形態において、コンジュゲートはがん化学療法剤を含むことができる。本明細書で使用する「がん化学療法剤」とは、がん細胞の増殖、成長、寿命または転移活性を阻害する化学薬品である。このようながん化学療法剤は、限定されるものではないが、ドセタキセルなどのタキサン、ドキソルビシンなどのアントラサイクリン、アルキル化剤、ビンカアルカロイド、代謝拮抗剤、シスプラチンやカルボプラチンなどのプラチナ製剤、メトトレキサートなどのステロイド、アドリアマイシンなどの抗生物質、イホスファミド、または選択的エストロゲン受容体調節因子、トラスツズマブなどの抗体であり得る。

コンジュゲートは、本明細書に開示されている疾患、症状、または障害、例えば、肺動脈性肺高血圧症、敗血症、がんおよび悪液質を診断または治療するために使用され得る。

組成物は、局所鼻腔内投与または吸入による投与を含め、経口（例えば、舌下）、非経口（例えば静脈内）、筋肉内注射、腹腔内注射、経皮、体外、局所的に投与され得る。本明細書で使用する「局所鼻腔内投与」とは、鼻腔の一方または両方を通じて鼻および鼻腔への組成物の送達を意味しており、噴霧機構または液滴機構による送達、または核酸またはベクターのエアロゾル化による送達を含む場合がある。吸入による組成物の投与は、噴霧または液滴機構による送達を介して鼻または口から行うことができる。送達はまた、吸入または挿管を介して呼吸器系の領域（例えば、肺）に直接行うことができる。必要な組成物の正確な量は、対象の種、年齢、体重および全身状態、治療されるアレルギー性疾患の重篤度、使用される特定の核酸またはベクター、投与様式などによって、対象ごとに異なる。従って、すべての組成物に対して正確な量を特定することはできない。しかしながら、適量については本明細書の教示に記述された慣例的な実験のみを用いて当業者が決定でき得る。

また、本明細書に開示されているように、対象にコンジュゲートを投与することを含み、部分を再生組織に向かわせる方法も本明細書に開示される。治療効果が炎症の減少、創傷治癒速度の向上、瘢痕組織の減少、疼痛の減少、腫脹の減少、感染の減少、または壊死の減少を含む方法が開示される

また、本明細書に開示されているように、対象にコンジュゲートを投与することを含み、部分を腫瘍に向かわせる方法も開示される。コンジュゲートは治療効果を有し得き、対象は一つまたは複数の標的化部位を有し得、その部分が一つまたは複数の標的化部位に向けられる。対象はがんを有している場合があり、そこで部分は対象の腫瘍血管新生に向けられる。コンジュゲートは、腫瘍のサイズまたは成長を低下させるなど、がんに対する治療効果を有し得る。部分はまた、がんを検出するため、一つまたは複数の腫瘍を視覚化するため、またその両方のために使用できる。

一つの実施態様において、変異体は、式CxRxRxRとなり得、式中、Rは、KまたはＲからなる群より選択され、さらにXはT、S、N、Q、A、I、LまたはVからなる群から選択される。

さらに別の実施態様において、本発明は、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7および配列番号8からなる群より選択された少なくとも1つの構成に対して少なくとも約90％同一であるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを提供する。

添付の図面は、開示された方法および組成物についてのいくつかの実施態様を説明すると同時に、説明と共にそれぞれの方法および／または組成物に適用される原理を説明する役割を果たすものとする。

環状CARファルマコフォアを決定するために試験した環状ペプチドを示す図である。 CARペプチド変異体のCHO-K細胞への結合および内在化を示す図である。表示されているFAM結合ペプチドを濃度5μMでCHO-K細胞と2時間培養した。細胞を洗浄、固定、核染色DAPIで染色した。元の倍率は×400。ヒト肺線維芽細胞（CCL-210）へのＣＡＲ変異体の取り込みを示す図である。細胞を無血清DMEMで5μMペプチドと37℃で24時間培養した。培養後、細胞を100μg/mlのヘパリンを含有する氷冷緩衛薬で3〜4回洗浄し、非内在化ペプチドを除去した。トリプシンEDTAを使用して細胞を剥がし、細胞懸濁液を7AAD色素で染色して細胞生存率を確認した。その後直ちに、FACSを使用して細胞を分析し、ペプチドの内在化レベルを測定した。元のcCARを含む、試験した8つの変異体（配列番号1〜8）すべての重ね合せを示す図である。この図は、配列番号1〜8を重ね合わせ、CARファルマコフォアの保存された特徴を説明する。 CARリファブチン、CARラパマイシン、およびCARボクロスポリン類似体（配列番号：9〜11）と共に、環状CAR（配列番号：1）を示す図である。これらの化合物は、既存の大環状分子から構造的に改変され、CARファルマコフォアを含む化合物を生成し、配列番号1と同様のホーミング性と内在化の特性を有するであろう。直鎖状CARリファブチン、直鎖状CARラパマイシン、および直鎖状CARボクロスポリン類似体（配列番号：13〜15）と共に、直鎖状9個のアミノ酸CAR（配列番号：12）を示す図である。ここに示す構造改変は、CARファルマコフォアを含有する化合物を生成するために既存分子に対してなされ得る一定の改変を再度説明する。 cCARおよび異常なcCAR類似体（配列番号：1および16〜19）の重ね合せの図である。様々な位置での置換には、1）D-アミノ酸；2）D-アリルグリシン；3）ジアミノ酸（Arg位置でのAsn置換は見えにくい）；4）N-メチルアミノ酸を含む。再度、CARとほぼ同じ特性を有する「新しい」化合物を生成するためにCARペプチドに対して行う改変を説明するため、これらの化合物が構造的に改変された図である。 9個のアミノ酸直鎖状CAR類似体（非天然置換：配列番号：20〜23）と共に、9個のアミノ酸直鎖状CAR（配列番号：12）の重ね合せを示す図である。様々な位置での置換には、1）D-アミノ酸；2）D-アリルグリシン；3）D-アミノ酸（Arg位置でのAsn置換）；4）N-メチルアミノ酸が含まれる。非天然の直鎖状7個のアミノ酸CAR類似体（配列番号：25〜28）と共に、7個のアミノ酸直鎖状CAR（配列番号：24）の重ね合せの図である。様々な位置での置換には、1）D-アミノ酸；2）D-アリルグリシン；3）ジアミノ酸（Arg位置でのAsn置換）；4）N-メチルアミノ酸を含む。元の直鎖状7個のアミノ酸CARは、より大きな「スティック状」レンダリングで表示され、すべての変異体は「直鎖状」レンダリングで表示される。半月体形成性糸球体腎炎におけるCAR標的化を示す図である。マッソントリクローム染色（A）。フィブロネクチン免疫染色（B）。CAR集積（C）。対照集積（D）。敗血症におけるCARファルマコフォア作用についての仮説的機序を示す図である。 LPS誘発敗血症マウスにおけるシベレスタットに対するCARファルマコフォアの追加効果を示す図である。 LPS誘発敗血症マウスにおけるATIIIに対するCARファルマコフォアの追加効果を示す図である。 LPS誘発敗血症マウスにおけるヒドロコルチゾンに対するCARファルマコフォアの追加効果を示す図である。 A）LPS誘発敗血症マウスの生存率；B）LPS誘発敗血症マウス由来の肺、肝臓および腎臓組織の組織学を示す図である。 LPS誘発敗血症マウス由来の腎組織におけるCARファルマコフォアの局在化を示す図である。対照、シベレスタットおよびCARファルマコフォア＋シベレスタット処置マウス由来の肺組織の走査電子顕微鏡写真を示す図である。対照、シベレスタットおよびCARファルマコフォア＋シベレスタット処置マウス由来の肝組織の走査電子顕微鏡写真を示す図である。対照、シベレスタットおよびCAR＋シベレスタット処置マウス由来の腎臓組織の走査電子顕微鏡写真を示す図である。急性腎傷害マーカー（KIM-1）に対するＣＡＲファルマコフォアの効果を示す図である。トリプルネガティブ乳がんのマウスにおけるがん関連の悪液質に対するCARファルマコフォアの効果を示す図である。右心肥大に対するCARファルマコフォアアジュバントの効果を示す図である。 PAHモデルラットの体重に対するCARファルマコフォアアジュバントの効果を示す図である。右心肥大に対する経口CARファルマコフォアの効果を示す図である。 PAHモデルラットの肺動脈（PA）の筋性動脈化（muscularization）に対するCARファルマコフォアの効果を示す図である。

発明の詳細な説明

定義
本明細書で使用する「CARファルマコフォア」という用語は、環状（配列番号：1）、直鎖状（配列番号：12）、およびトランケート型（配列番号：24）CARペプチドの保存された分子的特徴として定義され、CARの疾患ホーミング、標的結合、内在化、および生物学的活性に必要である。本明細書では、トランケート型、直鎖状または環状CARファルマコフォアを総称して「CARファルマコフォア」と呼ぶ。

用語「ペプチド」が本明細書中で使用される場合、ペプチド、タンパク質、タンパク質の断片などの意味に幅広く使用される。本明細書で使用する「ペプチド模倣薬」という用語は、構造的に基づいているペプチドの活性を有するペプチド様分子を意味する。

I. 全般
最近の研究（Jarvinen 2007; Urakami 2011; Jaervinen 2010; Toba 2014; 米国特許出願公開第2009/0036349A1）において、配列「CARSKNKDC」（CAR、配列番号：1）を有する疾患ホーミングおよび細胞透過性ペプチドを同定した。更なる実験研究では、直鎖状CAR（配列番号：12）およびトランケート型CAR（tCAR、配列番号：24）も同様の生物学的活性を有することが判明している（米国特許出願公開第2012/0034164 Al）。CARの生物学的活性に関する我々の知見にも関わらず、その正確な受容体は未知のままである。CARファルマコフォアの同定は、CAR受容体の調査、その作用メカニズム（MOA）の解明、および潜在的により有用な他の化合物の設計において非常に貴重である。

環状CARファルマコフォアを同定する試みにおいて、環状CARペプチド（配列番号：1）および密接に関連する7つのペプチド（配列番号：2〜8）に対する細胞結合および内在化アッセイを実施した。環状CAR（配列番号：1）に加えて、LysまたはArg残基のいずれかに置換を含む7つの環状ペプチドを合成し（配列番号：2〜8）、フルオレスカミン（FAM）基をその分子に結合することで標識した（図1）。置換された化合物と元のCARペプチドを比較する最初の試験として細胞結合および内在化アッセイを使用した。これまでCAR結合の研究に使用されてきた共焦点顕微鏡およびチャイニーズハムスター卵巣（CHO-K）細胞を用いてペプチドの細胞結合および内在化を研究した。。蛍光活性細胞選別（FACS）を用いて、配列番号：1〜8の細胞内在化を判定した。細胞結合および内在化アッセイは、化合物がその生物学的活性を保持するために保存される必要がある保存残基および配列パターンに関して、CARファルマコフォアのある種の特徴を同定した。

CARファルマコフォアの保存された分子特徴をさらに同定するために、計算モデル技術を用いて配列番号：1〜8をインシリコで生成した。配列番号1〜8の様々な分子的特徴を比較・対比するために様々なレンダリングを表示した。重ね合せたCAR類似体（図４）の分析は、環状CARファルマコフォアとして同定された保存された環状CAR構造パターンを明らかにした。これは、配列番号1〜8の構造的、電子的、立体的および配列の著しい類似性に起因する。

インシリコモデリングは、以前同定されたCARファルマコフォアをさらに定義するのに役立ち、これは正確な配列および残基パターンに関して定義することができ得るだけではなく、直鎖状、トランケート型、および環状CARペプチドと同様の3次元、空間、および電子パターンを有するより一般化された構造に関しても定義し得る。これらの結果では、配列番号2〜8が配列番号1と同様の生物学的活性を示す細胞結合および内在化アッセイで生成されたデータを確認する。その結果、配列番号2〜8は元のCAR配列（配列番号1）と同様の治療活性を有し、すべての配列はCARファルマコフォア内に入ると結論付けた。

実験的研究および計算論的モデルの結果に基づいて、CARファルマコフォアが決定されている。これらの分子分析において、それぞれの生物学的活性に必要な保存された特徴が同定されている。さらに、tCARはcCARと同様の性質を有するので、（環状CARファルマコフォアに加え）直鎖状およびトランケート型CARファルマコフォアの同定が推定できる。これは、直鎖状化されているが、CARファルマコフォアの保存された特徴が直鎖状およびトランケート型変異体に依然として存在し、元の環状CARペプチドの特性をなお保存できるという更なる証拠を提供する。

環状、直鎖状、およびトランケート型CARファルマコフォア（集合的に「CARファルマコフォア」と呼ぶ）の同定後、これらの必須の分子的特徴を保持する追加構造が作成された。分子モデリング/計算化学、ペプチド模倣薬、配列多様性技術、およびコンピューター支援医薬品設計を活用して、CARファルマコフォアを含むように特異的に設計された化合物ライブラリ（配列番号9〜33）を生成し、これは疾患ホーミングおよび選択的内在化に必要とされる。これらの構造は、CARファルマコフォアおよびCARペプチドの疾患ホーミングおよび内在化特性を有する、生成でき得る多種多様な新規化合物を説明するために生成された。

II.材料

A. ペプチドおよびタンパク質

配列番号1〜8、12、および16〜33の配列を有するアミノ酸セグメント、関連するアミノ酸配列、またはCARファルマコフォアを含んでいるペプチドまたはタンパク質が開示される。ペプチドまたはタンパク質は、配列番号1〜8、12および16〜33のアミノ酸配列、または一つ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号1〜8、12および16〜33のアミノ酸配列を含むアミノ酸セグメントから構成され得る。アミノ酸セグメントは、配列番号1〜8、12および16〜33のアミノ酸配列と60％、70％、80％、90％または100％同一であるアミノ酸配列、または追加、欠失もしくは置換を含む一つ以上のアミノ酸残基の変化を表す間の任意の割合から構成され得る。アミノ酸セグメントは、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個または9個の保存的アミノ酸置換を有する配列番号1〜8、12および16〜33のアミノ酸配列を含むことができる。アミノ酸セグメントは、アミノ酸配列、配列番号1〜8、12および16〜33のキメラを含むことができる。当該キメラは、1つの配列の配列が別の配列に付加される付加型、1つの配列の配列が別の配列の配列で置換される置換型、またはその組み合わせであり得る。

また、CARファルマコフォアを含むアミノ酸セグメントも開示され、セグメントは、直鎖状（トランケート型直鎖状ペプチドを含む）、環状（circular）または環化（cyclic）であり得る。アミノ酸セグメントは、適切な結合、例えばジスルフィド結合またはペプチド結合などを介して環状または環化であり得る。ペプチドは任意の長さを有することができる。

また、再生組織、創傷組織、または腫瘍に選択的にホーミングできるCARファルマコフォアを含むペプチドまたはタンパク質も開示される。開示されたペプチドは、再生組織、創傷組織、または腫瘍と選択的に相互作用することができる。

また、100残基未満の長さを有し、配列番号1〜8、12、および16〜33のアミノ酸配列またはCARファルマコフォアを含む単離ペプチドまたはタンパク質も開示される。開示されたペプチドに関連して本明細書で使用される場合、「単離した」という用語は、ポリペプチド、脂質、核酸および細胞内のペプチドと通常関連している他の細胞物質、またはライブラリまたは粗製剤のペプチドと関連している他の細胞物質を相対的に含まない形態のペプチドを意味する。

配列番号1〜8、12および16〜33の配列を有するアミノ酸セグメント、関連するアミノ酸配列、またはCARファルマコフォアを含む開示されたペプチドまたはタンパク質は、適切な長さを有し得る。

B. 計算論的モデル

開示された組成物は、配列番号1〜33の構造の同定またはCARファルマコフォアを含む他の化合物の同定のために、分子モデリング、計算化学、またはコンピューター援用薬品設計（CADD）技術と共に使用でき得る。開示された組成物（配列番号1〜33）をモデリング技術で使用する場合、疾患部位への選択的ホーミングおよび疾患部位における細胞内在化などの特定の望ましい特性を有する化合物が同定されることが理解される。

また、合理的な設計の使用により発見されたCARファルマコフォアを含む化合物も開示される。これは、構造的情報および／またはコンピュータモデリングを使用して達成することができる。コンピュータモデリング技術は、選択した分子の三次元原子構造の可視化を可能にし、この三次元原子構造の知見は、新しい化合物の合理的設計における化学官能基の判定および最適配置を可能にできる。三次元構築物はCARファルマコフォアを含む分子のX線結晶解析またはNMRイメージングから取得でき得る。分子動力学および力場データの使用は、CARファルマコフォアを含む化合物の発見にも使用できる。コンピューターグラフィックスシステムは、化合物がそれぞれのレセプターとどのように結合するかの予測を可能にし、化合物構造/配列の実験的操作を行い、結合特異性を最適化することができる。合成化学物質、ペプチド、タンパク質、および他の生物学的に活性な物質を含む、化合物ライブラリの仮想スクリーニングを実施し、CARファルマコフォアを含む新規化合物を発見することもできる。

C. ペプチド模倣薬

また、ペプチド模倣薬の使用により発見または開発されたCARファルマコフォアを含む化合物も開示される。ペプチド模倣薬は、化学修飾ペプチド、非天然アミノ酸を含むペプチド様分子ならびにタンパク質が含まれる。ペプチド模倣化合物は、配列番号1などの選択的疾患ホーミング活性および/または標的細胞内在化能力を有し得る。

また、ホーミング分子（例えば、配列番号2〜33のアミノ酸配列、またはその保存的変異体またはペプチド模倣薬）をそれぞれ独立的に含む少なくとも２個の部分配列を含む分離された多価ペプチドも開示される。多価ペプチドは、例えば、ホーミング分子（例えば、配列番号2〜33のアミノ酸配列、またはその保存的変異体またはペプチド模倣薬）をそれぞれ独立的に含む、少なくとも３個、少なくとも５個または少なくとも10個のそのような部分配列を有することができる。特定の実施形態では、多価ペプチドは2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個または20個の同一または非同一の部分配列を有することができる。別の実施形態では、多価ペプチドはホーミング分子（例えば、配列番号2〜33のアミノ酸配列、またはその保存的変異体またはペプチド模倣薬）からなる同一の部分配列を含むことができる。別の実施形態では、多価ペプチドは介在するアミノ酸によって分離しない連続した同一または非同一の部分配列を含む。また別の実施形態では、多価ペプチドは、環状となることもでき、あるいは立体構造的に制約される場合がある。一例では、ペプチドは、ジスルフィド結合を介して環状または環化され得る。

制約されたアミノ酸、ペプチド二次構造を模倣する非ペプチド成分、またはアミド結合同配体を含む、ペプチド様分子など、様々なペプチド模倣薬が知られている。制約された、非天然アミノ酸を含むペプチド模倣薬は、例えば、α-メチル化アミノ酸；α,α-ジアルキルグリシンまたはα-アミノシクロアルカンカルボン酸；N^α---C^α環状アミノ酸；N^α ---メチル化アミノ酸；β-またはγ-アミノシクロアルカンカルボン酸；α,β-不飽和アミノ酸；β,β-ジメチルまたはβ-メチルアミノ酸；β-置換-2,3-メタノアミノ酸；N---C^εまたはC^α---C^Δ環化アミノ酸；置換プロリンまたは別のアミノ酸模倣物であり得る。ペプチド二次構造を模倣するペプチド模倣薬は、例えば、非ペプチドβ-ターン模倣；γ-ターン模倣；β-シート構造の模倣；またはヘリックス構造の模倣であり、それぞれ当技術分野において周知されている。ペプチド模倣薬はまた、例えばレトロインベルソ型修飾などのアミド結合同配体；還元アミド結合；メチレンチオエーテルまたはメチレン-スルホキシド結合；メチレンエーテル結合；エチレン結合；チオアミド結合；トランス-オレフィンまたはフルオロオレフィン結合；1,5-二置換テトラゾール環；ケトメチレンまたはフルオロケトメチレン結合または他のアミド同配体でもあり得る。

また、CARファルマコフォアを含むペプチド模倣薬を同定するための方法も開示され、例えば、潜在的なCARファルマコフォアペプチド模倣薬のライブラリを含むデータベースのスクリーニングなどを含むこともできる。例として、ケンブリッジ結晶構造データベース（Cambridge Structural Database）は、既知の結晶構造を有する300,000を超える化合物のコレクションを有している（Allen et al., Acta Crystalloqr. SectionB, 35:2331 (1979)）。この構造の保管所では、新しい結晶構造が決定されると絶えず更新され、適切な形状、例えば開示されたペプチドと同じ形状、および標的分子に対する潜在的な幾何学的および化学的相補性を有する化合物についてスクリーニングされ得る。ペプチド結合するペプチドまたは標的分子の結晶構造が利用できない場合は、例えばCONCORDプログラム（Rusinko et al., J. Chern. Inf. Comput. Sci. 29:251 (1989)）を使用して構造が生成される場合がある。別のデータベースである、Available Chemicals Directory（Molecular Design Limited, Information Systems; San Leandro Calif.）では、市販されている約100,000種類の化合物があり、例えば、腫瘍の間質、創傷、および血漿クロットに選択的にホーミング活性を有する、ペプチドの潜在的なペプチド模倣薬を同定するために検索することができる。

D. 置換変異体

また、配列番号：1〜8、12、および16〜33の配列を有するアミノ酸セグメント、関連するアミノ酸配列、またはCARファルマコフォアを含んでいるペプチドまたはタンパク質も開示され、ここでのアミノ酸配列は置換、挿入または欠失の改変を受けている。挿入には、アミノおよび/またはカルボキシル末端融合ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。挿入は通常、アミノまたはカルボキシル末端融合のものよりも小さく、例えば1〜4個の残基程度の挿入である。欠失は、タンパク質またはペプチド配列からの１個以上のアミノ酸残基の除去によって特徴付けられる。一般的には、タンパク質またはペプチド分子内の任意の部位で約2〜6個以下の残基が欠失される。これらの変異体は、タンパク質またはペプチドをコードするDNA内のヌクレオチドの部位特異的変異により変異体をコードするDNAを生成し、その後組み換え細胞培養においてDNAを発現させることにより製造することができる。置換、挿入または欠失改変には、非天然アミノ酸、D-アミノ酸、またはCARファルマコフォアを依然として有する変更または改善された化合物の生成をもたらし得る他の残基が含まれ得るが、これらに限定されない。

既知の配列を有するDNAの所定の部位で置換変異を起こす技術は周知されている。アミノ酸置換は、典型的に単一残基であるが、同時に多数の異なる場所で生じる場合があり、挿入は通常1〜10個程度のアミノ酸残基であり、欠失は約1〜10残基の範囲である。欠失または挿入は、好ましくは隣接する対、すなわち、2つの残基の欠失または2つの残基の挿入が行われる。置換、欠失、挿入またはそれらの組み合わせは、CARファルマコフォアを含む最終的な構築物に到達させるために組み合わせることができる。置換変異体は、少なくとも1つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入された変異体である。

E. 保存された変異体

また、配列番号1〜8、12、および16〜33の配列を有するアミノ酸セグメント、関連するアミノ酸配列、またはCARファルマコフォアを含んでいる保存的変異体も開示される。保存的変異体は、第1のアミノ酸が第１のアミノ酸のものと類似している少なくとも1つの生化学的特性を有する別のアミノ酸またはアミノ酸類似体によって置換されている配列であり、類似の特性には、例えば類似のサイズ、電荷、疎水性または水素結合能力が含まれる。保存的変異体は、第1の非荷電性アミノ酸がシステイン、セリン、トレオニン、チロシン、グリシン、グルタミンまたはアスパラギンまたはそれらの類似体などの第2の（非同一）の非荷電性アミノ酸で保存的に置換されている配列であり得る。保存的変異体はまた、第1の塩基性アミノ酸がアルギニン、リシン、ヒスチジン、5-ヒドロキシリシン、N-メチルリシンまたはそれらの類似体などの第2の塩基性アミノ酸で保存的に置換されている配列であり得る。同様に、保存的変異体はまた、第1の疎水性アミノ酸がアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはそれらの類似体などの第2の疎水性アミノ酸で保存的に置換されている配列であり得る。同様に、保存的変異体は、第1の酸性アミノ酸がアスパラギン酸、グルタミン酸、またはそれらの類似体などの第2の酸性アミノ酸で保存的に置換されている配列；フェニルアラニンなどの芳香族アミノ酸が、例えば、チロシンなどの第2の芳香族アミノ酸またはアミノ酸類似体で保存的に置換されている配列；あるいは、アラニンなどの第1の比較的小さいアミノ酸が、グリシンもしくはバリン、またはそれらの類似体などの第2の比較的小さいアミノ酸またはアミノ酸類似体で置換されている配列であり得る。例えば、１個のアミノ酸残基を生物学的および/または化学的に類似している別のアミノ酸残基で置き換えることは、保存的置換として当業者に知られている。例えば、保存的置換は、ある疎水性残基を別のものに置換すること、または1つの極性残基を別のものに置換することである。置換は、例えば、Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、GIn；Ser、Thr；Lys、Arg；およびPhe、Tyrなどの組み合わせを含む。明示的に開示された各配列の当該保存的置換変異体は、本明細書で提供されるモザイク状ポリペプチド内に含まれる。配列番号1〜8、12、および16〜33の保存的変異体は、配列番号1〜8、12および16〜33に対して1個、2個、3個、4個あるいはそれ以上のアミノ酸置換を含む配列を包含し、当該変異体は、天然および非天然アミノ酸類似体を含むことができ得ると理解される。

また、保存的でない（less conservative）アミノ酸置換が行われているCARファルマコフォアを含む化合物も開示される。これには、（a）例えばシート構造またはヘリックス構造などの置換領域のポリペプチド骨格の構造、（b）標的部位での分子の電荷または疎水性、または（c）側鎖のかさを維持する効果がより大きく異なる残基を選択することが含まれ得る。一般的に、タンパク質特性において最大の変化が生じると予想される置換は、
（a）例えば、セリルまたはスレオニルなどの親水性残基が、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルなどの疎水性残基で（またはそれにより）置換されているもの；（b）システインまたはプロリンが他の任意の残基で（またはそれにより）置換されているもの；リジル、アルギニル、ヒスチジルなどの陽性側鎖を有する残基が、グルタミルまたはアスパルチルなどの陰性残基で（またはそれにより）置換されているもの；または（d）フェニルアラニンなどの大きな側鎖を有する残基が、グリシンなどの側鎖を持たない残基で（またはそれにより）置換され、この場合（e）硫酸化および/またはグリコシル化の部位数を増加させることによるものである。

置換または欠失変異誘発を用いてN-グリコシル化（Asn-X-Thr/Ser）またはO-グリコシル化（SerまたはThr）のための部位を挿入することができる。システインまたは他の不安定な残基の欠失もまた望ましい場合がある。潜在的タンパク質分解部位、例えばArgなどの欠失または置換は、塩基性残基の1つを欠失させるか、グルタミニルまたはヒスチジル残基で1つを置換することで達成される。

F. 誘導体化

誘導体化は、ある化合物を類似の化学構造の生成物に改変するプロセスである。特定の翻訳後誘導化は、発現されたポリペプチドに対する組み換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、しばしば翻訳後に対応するグルタミニルおよびアスパルチル残基に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は穏やかな酸性条件下で脱アミド化される。他の翻訳後修飾には、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のo-アミノ基のメチル化（T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco pp 79-86; 1983）、N末端アミンのアセチル化、場合によってはC末端カルボキシルのアミド化が含まれる。

本明細書において開示されたタンパク質の変異体および誘導体を定義する1つの方法は、特定の既知の配列との相同性/同一性に関して変異体および誘導体を定義することによるものと理解される。記述された配列に対して少なくとも70％、75％、80％、85％、90％または95％の相同性を有するか、置換、付加、または欠失を含むアミノ酸の変化を表すそれらの間の任意の％を有する、本明細書に開示されるこれらおよび他のタンパク質の変異体が具体的に開示される。当業者は、2つのタンパク質の相同性の判定方法を容易に理解する。例えば、相同性が最高レベルになるように2つの配列を整列させた後に計算することができる。

保存的突然変異および相同性の記載は、変異体が保存的変異である特定の配列に対して少なくとも70％の相同性を有する実施態様などのような任意の組み合わせで一緒に組み合わせることができると理解される。

本明細書では、様々なタンパク質およびタンパク質配列について論じる場合、タンパク質配列をコードできる核酸もまた開示されていることが理解される。これは、特定のタンパク質配列に関連するすべての縮重配列、すなわち、特定のタンパク質配列の1つをコードする配列を有するすべての核酸、ならびにタンパク質配列の開示された変異体および誘導体をコードする縮重核酸を含むすべての核酸を含む。従って、各特定の核酸配列は本明細書に記載されていない場合があるが、本明細書において開示されたタンパク質配列によって実際に開示および説明されることが理解できる。

開示された組成物に組み込むことができる多くのアミノ酸およびペプチド類似体が存在することが理解される。例えば、多くのD-アミノ酸または上記で述べたものとは異なる機能的置換基を有するアミノ酸が存在する。天然ペプチドと反対の立体異性体、ならびにペプチド類似体の立体異性体が開示される。これらのアミノ酸は、例えば、アンバーコドンを使用して部位特異的方法でペプチド鎖に類似体アミノ酸を挿入するために選択したアミノ酸でtRNA分子を充填し、遺伝子構築体を設計することによりポリペプチド鎖に容易に組み込むことができ得る（Thorson et al., Methods in Molec. BioI. 77:43-73 (1991), Zoller, Current Opinion in Biotechnology, 3:348-354 (1992); Ibba, Biotechnology & Genetic Engineering Reviews 13:197-216 (1995), Cahill et al., TIBS, 14(10): 400-403 (1989); Benner, TIB Tech, 12:158-163 (1994); Ibba and Hennecke, Bio/technology, 12:678-682 (1994)に記載されており、それらすべては、少なくともアミノ酸類似体に関連する題材については参照により本明細書に組み込まれている）。

また、ペプチドに類似しているが、天然ペプチド結合を介して結合しない分子も開示される。例えば、アミノ酸またはアミノ酸類似体の結合には以下のものが含まれる：CH₂NH---、---CH₂S---、---CH₂---CH₂---、---CH==CH---(シスおよびトランス)、---COCH₂---、---CH(OH) CH₂--- 、および ---CHH₂SO---（これらおよびその他は、Spatola, A. F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p.267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications (general review); Morley, Trends Pharm Sci (1980) pp. 463-468; Hudson, D. et al., Int J Pept Prot Res 14:177-185 (1979) (---CH₂NH--- , CH₂CH₂---); Spatola et al. Life Sci 38:1243-1249 (1986) (---CH H₂---S); Harm J. Chem. Soc Perkin Trans. I 307-314 (1982) (---CH---CH---, cis and trans); Almquist et al. J. Med. Chem. 23:1392-1398 (1980) (---COCH₂---); Jennings-White et al. Tetrahedron Lett 23:2533 (1982) (---COCH₂---); Szelke et al. EuropeanAppln, EP 45665 CA (1982): 97:39405 (1982) (---CH(OH)CH₂---); Holladay et al. Tetrahedron. Lett 24:4401-4404 (1983) (---C(OH)CH₂---); and Hruby Life Sci 31:189-199 (1982) (---CH₂---S---)に記載されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれている）。特に好ましい非ペプチド結合は、---CH₂NH---である。ペプチド類似体は、b-アラニン、g-アミノ酪酸などの結合原子間に2つ以上の原子を有することができ得ることが理解される。

G. コンジュゲート

また、CARファルマコフォアを有するコンジュゲート化合物も開示される。コンジュゲートは、CARファルマコフォアの直鎖状または環状変異体である場合があり、ジスルフィド結合、ペプチド結合、または他の種類の共有結合的もしくは非共有結合的な化学修飾を用いて別の化合物に連結され、結果としてCARファルマコフォア変異体を1つ以上の他の化合物に連結させるか、またはCARファルマコフォアの直鎖状または環状変異体を、治療上または診断上のペイロードを含むリポソーム、ナノエリスロソームまたはミセルに連結させる。一実施態様では、トランケート型CAR（tCAR、配列番号24）はジスルフィド結合を介してヒト血清アルブミン（HSB）のCys34残基の遊離スルフヒリドル基に共役されている（Sugio 1999）。このHSA-tCARコンジュゲートは、tCARの半減期を延長することができ（Dennis 2002）、CARファルマコフォア変異体の半減期などの特性を高めることに使用でき得るかなり広範なアプローチの実例である。

別の実施態様では、CARファルマコフォアはデコリンなどの抗線維化化合物に結合して、瘢痕縮小などの標的化線維化阻害を生成し得る。

CARファルマコフォアを含む分子を別の分子にコンジュゲートするこのアイディアは、半減期の延長、疾患組織への親和性の改善、毒性または薬物動態特性の改善、選択性の改善、結合および/または内在化の改善、またはいずれかのコンジュゲート化合物の治療効果の改善への効果をもたらすことができ得る。別の実施態様では、環状CAR（配列番号1）は、モノクローナル抗がん抗体B1のFvフラグメントに（ペプチド結合を介して）共有結合している。この抗体は、ヒトがん腫細胞に対して親和性を有する。これは、ヒトがん細胞に対する高度の特異性を有する薬物コンジュゲートをもたらすことができ、改善された疾患ホーミング特性を有するCARファルマコフォアを含むより広範なクラスの化合物の実例である。

H. 最適化された化合物

また、経済的な産生、より優れた化学的安定性、毒性または副作用の低減、強化された薬理学的特性（例えば、半減期、吸収、分布、代謝、排泄、効能、有効性、標的結合または親和性など）、変化した特異性（例えば、広範囲の生物学的活性など）、抗原性の低下など、強化された特性または望ましい特性を有するアミノ酸およびペプチド類似体も開示される。ある実施態様では、D-アミノ酸はペプチターゼによって認識されないので、より安定的なペプチドを生成するために使用することができる。同じタイプのD-アミノ酸（例えば、L-リジンの代わりにD-リジン）でコンセンサス配列の１つ以上アミノ酸の系統的な置換を用いてより安定的なペプチド（配列番号16、20、および25）を生成でき得る（Molhoek 2011）。別の実施態様では、メチレン架橋、アミド（ペプチド）結合、またはシステイン残基（ジスルフィド結合）を用いて2つ以上のペプチドを一緒に環化または結合し得る（配列番号29）。これは、ペプチドをより安定的な立体配座に制限するのに有益であり得る（Clark 2005）。これはまた、リガンドおよびレセプターとの間の分子相互作用を強化するためにアミノ酸残基の最適配置など、改善された標的特異性または結合を有するペプチドまたはタンパク質を含む。別の実施態様では、塩基性残基（Lys、Arg、またはHis）は、レセプターとリガンドとの間の相互作用が最適なものとなるように配置されている（配列番号30）。また、改善された（減少した）全身毒性を有するタンパク質およびペプチドも開示される。システイン残基は、他の残基と比較して毒性であると判明したペプチドにおいてしばしば支配的である（Gupta 2013）。当該一実施態様では、配列番号1の隣接システイン残基が隣接するロイシン残基で置換され、隣接するロイシン残基間のメチレン架橋によって環化が達成されている（配列番号29）。

また、良好な生物医薬品特性をもたらすアミノ酸配列修飾または改変を有するペプチドおよびタンパク質も開示される。例えば、酸性または塩基性側鎖の組込みは、強化された製剤または薬物動態的特性を有するペプチドおよびタンパク質の水性または非水性の溶解性を改善し得る（Rand 2012）。一実施態様では、アスパラギン酸などの低分配係数（log D）を有する残基は、ロイシンなどのより大きなlog D値を有する残基で置換することができ得る（配列番号31）。

改善された細胞透過性を有するペプチドおよびタンパク質も開示される。ペプチドまたはタンパク質へのポリアルギニン配列の付加は、細胞内取込および透過性を大幅に可能にし（Fuchs 2007）、アルギニン残基による非塩基性残基の置換も含まれる。当該実施態様では、配列番号1に含まれる9つの既存残基のうち4つがアルギニン残基で置換され、効力を保持しながら透過性を高めることができる（配列番号32）。

異種タンパク質に融合した開示ペプチドを含むキメラタンパク質も開示される。一実施態様では、異種タンパク質は、サイトカイン活性、細胞毒性活性またはアポトーシス促進性活性などの治療活性を有し得る。別の実施態様では、異種タンパク質は抗体またはその抗原結合断片であり得る。他の実施態様では、キメラタンパク質は、異種タンパク質に融合された、配列番号2〜34のアミノ酸配列を含むペプチド、またはその保存的変異体またはペプチド模倣薬を含む。開示されたペプチドに融合されるタンパク質に関して本明細書で使用される「異種」という用語は、ペプチドをコードする遺伝子以外の供給源に由来するか、あるいはペプチド模倣薬が由来するタンパク質を意味する。開示されるキメラタンパク質は、100残基未満、200残基未満、300残基未満、400残基未満、500残基未満、800残基未満または1000残基未満の長さを含む多様な長さを有し得るが、これらに限定されない。

本明細書で使用されている場合、「キメラ」および「キメラの」は、2つ以上の供給源に由来する配列のあらゆる組み合わせを言う。これは、例えば、サブユニットの単一部分（例えばヌクレオチド、アミノ酸）から他の配列に付加、挿入およびまたは置換された完全な供給源配列までを含む。キメラは、例えば、1つの配列の１つ以上の部分が１つ以上の他の配列の1つ以上の部分に付加されている付加的なもの；1つの配列の1つ以上の部分が1つ以上の他の配列の1つ以上の部分で置換されている置換のもの；または組み合わせであり得る。「保存的置換キメラ」は、キメラの供給源配列がいくつかの構造的および/または機能的関係性を有し、同様のまたは類似の構造および/または機能を有する配列の部分がお互いに置換されている置換キメラに言及するために使用することができる。典型的なキメラ抗体およびヒト化抗体は、保護的置換キメラの例である。

I. 二機能性化合物

また、別の機能を有する第2のペプチドに融合されたホーミングペプチドを含む二機能性ペプチドも開示される。当該二機能性ペプチドは、全長分子の異なる部分によって付与される、少なくとも2つの機能を有し、例えば、選択的ホーミング活性に加えて抗血管新生活性またはアポトーシス促進性活性を表示することができる。

必要に応じて、単離されたペプチド、または本明細書の他の個所で論じているホーミング分子は、環状または立体配座的に制限され得る。本明細書中で使用される場合、ペプチドなどの「立体配座的に制限された」分子とは、3次元構造が実質的に1つの空間的配置に長時間維持されるものである。立体配座的に制限された分子では、親和性増加、代謝安定性、細胞膜透過性または溶解性などの特性が改善され得る。立体配座的制限の方法は、当該分野で周知されており、本明細書の他の個所でさらに論じている環化を含む。

ペプチドに関して本明細書で使用する「環状」という用語は、2つの隣接しないアミノ酸またはアミノ酸類似体間の分子内結合を含む構造を意味する。環化は、共有結合または非共有結合によって影響される場合がある。分子内結合には、骨格と骨格、側鎖と骨格および側鎖と側鎖の結合が含まれるが、これらに限定されない。環化の好適方法は、非隣接アミノ酸またはアミノ酸類似体の側鎖間のジスルフィド結合の形成によるものである。ジスルフィド結合を形成し得る残基は、例えば、システイン（Cys）、ペニシラミン（Pen）、β,β-ペンタメチレンシステイン（Pmc）、β,β-ペンタメチレン-β-メルカプトプロピオン酸（Pmp）およびそれらの機能的等価物を含む。

ペプチドはまた、例えば、1つのアミノ酸またはその類似体の側鎖基を利用してアミノ末端残基のN末端アミンに共有結合を形成することができるラクタム結合を介して環化することができ得る。ラクタム結合を形成し得る残基には、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、リシン（Lys）、オルニチン（om）、α,β-ジアミノプロピオン酸、γ-アミノアジピン酸（Adp）およびM-（アミノメチル）安息香酸（Mamb）がある。さらに環化には、例えばリシン（Lys）およびロイシン（Leu）残基間のリシノノルロイシン（Iysinonorleucine）結合または2つのチロシン（Tyr）残基間のジチロシン結合の形成によって影響を受ける場合がある。当業者は、これらおよび他の結合が環状ペプチドに含まれ得ることを理解する。

J. コンビナトリアル技術

開示された組成物は、望ましい方法で開示された組成物と相互作用する分子または巨大分子を同定するためのコンビナトリアル技術の標的として使用でき得る。また、配列番号2〜33に開示される組成物またはその一部分がコンビナトリアルプロトコルまたはスクリーニングプロトコルにおける標的として使用されるコンビナトリアル技術またはスクリーニング技術により同定された組成物も開示される。

コンビナトリアル技術またはスクリーニング法において開示された組成物を使用する場合、巨大分子などの分子が、阻害や刺激、または標的分子の機能などの特定の望ましい特性を有することが同定されることが理解される。CARなどの開示された組成物を使用する場合に同定および単離された分子もまた開示される。従って、配列番号2〜33など、開示された組成物を含むコンビナトリアルまたはスクリーニングアプローチを使用して生成された生成物もまた本明細書において開示されたとみなされる。

K. 疾患

CARファルマコフォアを含む、開示された化合物は、肺疾患、肺高血圧症、間質性肺疾患、急性肺傷害、急性呼吸促迫症候群、喘息、敗血症、敗血症性ショック、感染症、肺サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、リューマチ性関節炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎などの結合組織病における肺の症状、気管支拡張症、石綿症、ベリリウム症、珪肺症、ヒスチオサイトーシスX、肺炎、間質性肺炎、喫煙者肺、閉塞性細気管支炎、肺線維症、その他心筋梗塞、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症、塵肺症、腎性全身性線維症、瘢痕形成、ケロイド、関節線維症、癒着性関節包炎、放射線維症、乳腺線維嚢胞症、肝硬変、肝炎、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝疾患、急性肝不全、非アルコール性脂肪性肝炎、リンパ節または他の器官のサルコイドーシスなどの線維性疾患、炎症性腸疾患、クローン病、悪液質、慢性腎臓病、急性腎傷害、急性腎不全、多発性嚢胞腎、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性硬変、膵炎、間質性膀胱炎、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化症、虚血性心疾患、血管炎、新生物性/転移性/腫瘍性疾患（がんを含む）、塵肺症、自己免疫疾患、血管新生性疾患、創傷治癒、感染症、外傷性損傷、および全身エリテマトーデスを含む全身結合組織疾患、リウマチ性関節炎強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、嚢胞性線維症、勃起不全、α1-アンチトリプシン欠乏症、糖尿病、高ヘパラナーゼルレベルを特徴とする疾患、神経炎症状態、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病（PD）、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症などの中枢神経変性疾患、外傷性脳損傷、低酸素症、加齢脳、滲出型黄斑変性症、新生血管加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、神経膠芽腫、老化関連疾患などの疾患の治療および/または診断に有用であり得、また遺伝子治療アジュバントとして有用であり得る。

次の実施例は、本明細書で請求される化合物、組成物、および/または方法の一部についての作製方法および評価方法の開示および説明を当業者に提供することを意味する。これらの実施例は、より広範に使用できるアプローチを例示することを意図としたものであり、決して本開示を限定することを意図するものではない。

環状CARファルマコフォアの同定

環状CARファルマコフォアを同定する試みにおいて、CARペプチド（配列番号1）および密接に関連する7つのペプチド（配列番号2〜8）に対する細胞結合および内在化アッセイを実施した。

1A.共焦点顕微法

リシンまたはアルギニン残基のいずれかの順列置換を有する8つのCAR変異体（配列番号1〜8）を合成した（図1）。ペプチドには、フルオレスカミン（FAM）基をその分子に結合させることによって標識した。

変異体と元のCARペプチドを比較する最初の試験として細胞結合および内在化アッセイを使用した。これまでにCAR結合を調べるために使用されているチャイニーズハムスター卵巣（CHO-K）細胞を用い、共焦点顕微鏡でCARペプチド変異体による細胞結合/内在化を調べた。

表示されているFAM共役ペプチドを濃度5μMでCHO-K細胞と2時間インキュベートした。細胞を洗浄し、固定し、核染色DAPIで染色した。CHO細胞結合および内在化の結果（図2）は、最初のアルギニンをリシン残基に変更させることがCHO細胞への結合を改善すること、およびペプチドが少なくとも1つのアルギニンを有すべきであることを示唆した。

1B.蛍光活性化細胞選別（FACS）

配列番号1〜8の細胞内在化を判定するために、蛍光活性化細胞選別（FACS）を使用した。ヒト肺線維芽細胞（CCL-210）が選択されたのは、CARに対してCHO細胞よりもより優れた標的であると思われたためである。共焦点顕微鏡実験（実施例1A）とは異なり、FACS分析は、ペプチド結合ではなく、ペプチド内在化について全面的に焦点を当てている。

細胞を無血清DMEM中、5μMペプチドと37℃で24時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を100μg/mlのヘパリンを含有する氷冷緩衝液で3〜4回洗浄し、非内在化ペプチドを除去した。トリプシンEDTAを使用して細胞を剥がし、細胞懸濁液を7AAD色素で染色して細胞生存率を確認した。その後直ちに、FACSを使用して細胞を分析し、ペプチド内在化のレベルを測定した。

FACSの結果は、各配列中に存在するアミノ酸置換に基づいた配列番号1〜8のペプチド内在化プロファイルの変動を同定した（図3）。変動は、ペプチド結合の強度だけでなく、ペプチド結合の局在化でも起こった。興味深いことに、保存されたアミノ酸置換を有するCARファルマコフォアペプチド変異体は、CHO細胞およびヒト肺線維芽細胞との間に示差的な結合特性および内在化特性を示し（図2および3にそれぞれ示すように）、それは元のCARペプチドに対する保存的アミノ酸置換が結合および内在化において予期しない差異を生成することを示している。これらの結果は意外なことに、保存的アミノ酸置換がペプチド内在化にほとんどまたは全く影響しないことが示された、米国特許第8，188,220号のRuoslahtiの開示から遠ざかるものである。

FACSの結果（実施例1B）は、2つのアルギニン、1つのリシンのペプチドが最も有効なものである点で、共焦点分析（実施例1A）とは異なっていた（図2）。しかし、このアッセイのバックグラウンドは高く、その差は50％未満であり、統計的に有意ではなかった。共焦点研究（実施例1A）におけるものよりもより大きなアルギニン残基に対する要求は、FACS実験（実施例1B）において、内在化のみを測定し、結合および内在化を測定しなかったという事実に関連し得る。複数のアルギニン残基は、細胞への内在化を促進することが周知されている。

1C.環状CARファルマコフォアの同定のための計算論的モデル研究

実施例1Aおよび1Bの実験研究では、配列番号2〜8が配列番号1と類似の生物学的活性を示すことを明らかにした。配列番号2〜8の構造の配列番号1の構造に対する類似性に基づいて、生物学的活性を与える配列番号1の本質的な特性（ファルマコフォア）に対して初期の手がかりがいくつか得られた。

CAR変異体間の結合および内在化に差異がある一方、すべての変異体が結合および内在化され、変異体間の差異は統計学的に有意ではなかった。従って、8つすべての変異体は、元のCAR配列と同様の生物学的活性を有する。次に、CARファルマコフォアの本質的な特性をインシリコ（in silico）モデリングにより決定した。

CAR類似体（配列番号1〜8）の8つすべてがPyMOL Molecular Graphics System、バージョン1.2r2（PyMOL 2014）を用いてインシリコで生成された。立体的性質、分子量、水素結合ドナーおよびアクセプター、溶媒露出表面積、配列関係、ペプチド骨格構造、および空間におけるアミノ酸側鎖位置など、創製された変異体の様々な特性がすべて研究された。配列番号1〜8間の電子的類似点は、分子の高分子静電気を計算するプログラムである、APBS（Adaptive Poisson-Boltzmann Solver）バージョン1.2.1（Baker 2001）を用いて研究された。計算結果は、静電ポテンシャル分子表面としてレンダリングされ、8つのすべての変異体の静電荷分布の類似性を示すのに有用であった。

配列番号1〜8の様々な分子特性を比較するために様々なレンダリングを表示した。特に重要なのは配列番号1〜8の重ね合わせで、CARペプチド（配列番号1）とCARペプチド類似体（配列番号2〜8）との間に些細だが鋭い類似性を明らかにした。

重ね合わ載されたCAR類似体の分析（図4）において、保存された環状CAR構造パターンが見られ、環状CARファルマコフォアとして同定された。これは、配列番号1〜8の構造的、電子的、立体的および連続的な著しい類似性に起因する。これらの結果は、配列番号2〜8が配列番号1、つまり元のCAR配列（配列番号1）に類似の生物学的活性を示し、すべての配列がCARファルマコフォア内に収まる、実施例１で生成されたデータを裏付ける支持。

ペプチド模倣薬を用いた環状または直鎖状CARファルマコフォアを有する新しい非ペプチド化合物の創製

2A.配列番号9〜11および13〜15のインシリコ生成および仮想レンダリング

CARファルマコフォアを有する新しい化合物の創製のためにとり得るペプチド模倣薬アプローチを説明するために、PyMOL Molecular Graphics System, バージョン 1.2r2 (PyMOL 2014)を用いてインシリコで小化合物ライブラリを生成した。疾患ホーミングおよび選択的内在化に必要なCARファルマコフォアを含有させるために6つの構造が設計されている。CAR分子特性を模倣するための合理的なアプローチを活用して、既存の、幅広く利用できる３つの治療薬、つまりボクロスポリン、ラパマイシン、およびリファブチンから6つすべての類似体を産生した。環状CARファルマコフォア（配列番号9〜11）を含む3つの環状変異体が産生され、直鎖状CARファルマコフォア（配列番号13〜15）を含む3つの直鎖状変異体が産生された。

ボクロスポリン、ラパマイシン、およびリファブチンのある面は、CARのものとは異なる場合がある（例えば、ラパマイシン、およびリファブチンは非ペプチド化合物である）が、これらの分子はCAR類似体を産生するためのペプチド模倣薬アプローチの出発点となり得る。これらの化合物は、環状性質、分子量（約1kDa）、および経口バイオアベイラビリティに基づいて選択され、そのすべてがCARペプチドの特徴でもある。

立体的特性、分子量、水素結合ドナーおよびアクセプター、溶媒露出表面積、配列関係、環状リング骨格構造、および空間におけるアミノ酸側鎖/官能基の位置などの配列番号9〜11および配列番号13〜15の様々な特徴を研究した。これらの類似体がCARファルマコフォアおよびCARペプチドの疾患ホーミングおよび選択的内在化特性を依然として有しているかどうかを判定するために、観察された配列番号9〜11および13〜15の特徴を環状CARおよび直鎖状CARとそれぞれ比較した。類似体への修飾は、これらの化合物がCARファルマコフォアと類似の結合、内在化、および疾患選択制を有することを可能にするだろう。

2B.結果の分析

環状CAR（配列番号1）を環状CAR-ラパマイシン（配列番号9）、環状CAR-リファブチン（配列番号10）、および環状CAR-ボクロスポリン（配列番号11）と比較した場合、4つのすべての化合物間に類似点および相違点の両方が存在することが分かる。明らかに、配列番号9および10の非ペプチド／小分子の性質は、観察可能な配列番号1との間の差異の大部分を占める。しかし、配列番号1および9-11の詳細な検査の際、立体的特性の保存されたパターンが存在することが分かる。より具体的には、すべて正電荷末端を有する3つの特定の官能基が、環状ペプチド模倣薬のそれぞれに存在することが明らかである。各類似体のそれらの官能基はすべて、配列番号1と同様の方式で、コア骨格構造（環状リング）から空間に突出する。配列番号1および配列番号9〜11との間の静電的類似性も存在し、伸長官能基の正電荷成分に特に重点を置いている。配列番号1および配列番号9〜11との間には別の類似点も存在しており、分子量、コア骨格構造を含む保持された環状、リング状構造などである。

直鎖状CAR（配列番号12）の直鎖状CAR-ラパマイシン（配列番号13）、直鎖状CAR-リファブチン（配列番号14）、および直鎖状CAR-ボクロスポリン（配列番号15）との分析では、4つのすべての化合物間に類似点および相違点の両方が存在することを示した。先に観察された環状構造（配列番号9〜11）と同様に、直鎖状CAR（配列番号12）および直鎖状類似体（配列番号13〜15）との間に立体的特性の保存パターンが存在することが分かる。3つのユニークな官能基は、すべて正電荷末端を有しており、各直鎖状ペプチド模倣薬に存在する。各類似体のこれらの官能基はすべて、配列番号12と同様の方式で、直鎖状骨格構造から空間に突出する。配列番号12および配列番号13〜15との間の静電的類似性も存在し、4つすべての化合物が伸長した3つの官能基の末端に正電荷領域を有する。

直鎖状および環状CARペプチド模倣薬ライブラリからの結果は、ペプチド模倣薬を利用して小分子を含む化合物を生成する場合に採用できる非限定的で実例的なアプローチとして役立ち、そのような化合物はCARペプチドのCARファルマコフォアおよび疾患ホーミングおよび選択的内在化特性を有する。その分子はまた、CARファルマコフォアのホーミングおよび疾患選択制特性と組み合わされたそれらの元の治療特性も有し得る。加えて実施例3は、先に同定されたCARファルマコフォアをさらに定義するのに役立ち、これは正確な配列および残基パターンに関して定義するだけではなく、直鎖状、トランケート型、および環状CARペプチドとしての同様の3次元空間、立体的、および電子パターンを有するより一般化された構造に関しても定義し得る。

環状、直鎖状、およびトランケート型CARファルマコフォアを含む、新しいペプチド置換変異体の創製

3A.配列番号16〜19、20〜23および25〜28のインシリコ生成および仮想レンダリング

CARファルマコフォアを有する新しいペプチドの創製のためにとり得る置換アプローチを説明するために、PyMOL Molecular Graphics System, バージョン 1.2r2 (PyMOL 2014)を用いてインシリコでの集中した化合物ライブラリを生成した。この実施例では、産生された環状、直鎖状、およびトランケート型類似体は、非天然アミノ酸置換を含む。CARファルマコフォアを依然として保持する新規類似体を生成するために、使用された特定の非天然アミノ酸残基ならびにCARペプチド配列内でのそれらの位置が故意的に選択された。配列番号16〜19は、環状CARファルマコフォアに適合するように設計され、配列番号20〜23は直鎖状CARファルマコフォアに適合するよう設計され、そして配列番号25〜28はトランケート型CARファルマコフォアに適合するように設計された。

環状4つ、直鎖状4つ、およびトランケート型4つ、合計で12の置換変異体が生成された。実施された置換のタイプは、環状、直鎖状、およびトランケート型変異体で同じである。より具体的には、各カテゴリー（環状、直鎖状、およびトランケート型）において、CARアミノ酸配列中の最初のLys残基の立体化学を変化させることによって1つの類似体が生成され、この位置でD-アミノ酸置換が生じた。通常のAla残基の代わりにD-アリルグリシン残基（グリシン誘導体の一種）を含む別の類似体を各カテゴリーについて生成した。各カテゴリー内では、ジアミノ酸置換も生成され、CAR配列のArg残基がAsn残基で置換された。最後に、（通常荷電またはアセチル化N末端を含む）CAR配列のCys残基をN-メチル化Cys残基に置換した置換変異体を生成した。

立体的特性、分子量、水素結合ドナーおよびアクセプター、溶媒露出表面積、配列関係、骨格構造、および空間におけるアミノ酸側鎖/官能基の位置などの配列番号16〜19、20〜23、および25〜28の分子的特性を研究した。類似体がCARファルマコフォアを依然として有し、その結果としてCARペプチドの疾患ホーミングおよび選択的内在化特性を有するかどうかを判定するために、観察された配列番号16〜19、20〜23、および25〜28の特徴をそれぞれ環状、直鎖状、またはトランケート型CAR対応物と比較した。

環状、直鎖状、およびトランケート型CARペプチドの様々な分子類似性をそれらのそれぞれの置換類似体で伝達するために、いくつかの仮想レンダリングが創成された。

3B.結果の分析

環状置換類似体（配列番号16〜19）と環状CAR（配列番号1）との重ね合わせにより、5つの化合物すべての類似性を表示させることができる（図7）。配列番号16〜19のアミノ酸置換は、環状リング構造の喪失または正電荷塩基性残基の空間的配置の喪失をもたらさなかった。これら3つすべての塩基性残基（Arg、Lys1、およびLys2）が配列番号1とほぼ同じ側鎖空間的配置を有するという事実は、配列番号16〜19が環状CARファルマコフォアを有していることを実証している。さらに、配列番号1および配列番号16〜19との間の静電的類似性も見られ、伸長側鎖の正電荷成分に特に重点を置いている。配列番号1および配列番号9〜19との間には別のより些細な類似点も存在しており、コア骨格構造を含む、分子量および保持された環状、リング状構造を含んでいる。

直鎖状CAR（配列番号12）および直鎖状置換変異体（配列番号20-23）を分析すると、5つすべての化合物の間に非常に多くの類似性を見ることができる（図８）。配列番号20〜23のアミノ酸置換は、直鎖状骨格構造の損失をもたらさず、正荷電塩基性残基（Arg、Lys1、およびLys2）の3次元空間配置は配列番号12のものとほぼ同一である。配列番号12および配列番号20〜23の間の静電気的類似性も明らかであり、伸長したArgおよびLys側鎖の正電荷成分を含んでいる。分析の結果は、配列番号20〜23が直鎖状CARファルマコフォアを有することを示している。

トランケート型置換類似体（配列番号25〜28）とトランケート型CAR（配列番号24）との重ね合わせにより、5つの化合物すべての類似性を表示させることができる（図9）。生成された直鎖状類似体と同様に、配列番号25〜28での残基置換は、直鎖状骨格構造の喪失をもたらさず、正荷電塩基性残基（Arg、Lys1、およびLys2）の3次元空間配置は配列番号24のものとほぼ同一である。配列番号24および配列番号25〜28の間の静電気的類似性も見られ、伸長したArgおよびLys側鎖の正電荷成分を含んでいる。配列番号25〜28および配列番号24との間でこれら本質的類似性が与えられた場合、配列番号25〜28がトランケート型CARファルマコフォアを有することが推定されている。

環状およびトランケート型CARファルマコフォアを有する共役系化合物の開発

4A.コンジュゲート化合物（配列番号29および30）のインシリコ生成および仮想レンダリング

PyMOL Molecular Graphics System, バージョン 1.2r2 (PyMOL 2014)を用いて、CARファルマコフォアを含む2つの新しい化合物をインシリコ生成した（配列番号29および30）。配列番号29は、トランケート型CARペプチド（tCAR、配列番号24）に連結された（コンジュゲートされた）ヒト血清アルブミン（HSB）タンパク質から構成される。配列番号29は、環状CAR（配列番号1）にコンジュゲートされたモノクローナル抗がん抗体B1のFvフラグメントから構成される。その結果として、配列番号29および30いずれも配列内にそれぞれトランケート型および環状CARファルマコフォアを有する。

配列番号29は、ジスルフィド結合を介してヒト血清アルブミン（HSB）のCys34残基の遊離スルフヒリドル基にtCARをコンジュゲートすることによって生成された。このHSA-tCARコンジュゲートは、tCARの半減期を延長することが以前に示されており（Dennis 2002）、CARファルマコフォア変異体の半減期などの特性を高めることに使用できるかなり広範なアプローチの実例である。配列番号30は、モノクローナル抗がん抗体B1のFv断片に環状CARペプチドを（ペプチド結合を介して）共有結合的に連結させて生成した。この抗体は、ヒトがん腫細胞に対して親和性を有する。二機能性化合物は、ヒトがん細胞に対する高度の特異性を有する薬物コンジュゲートをもたらし、疾患ホーミングおよび治療特性の両方を有するCARファルマコフォアを含むより広範なクラスの化合物の実例である。

環状CARファルマコフォアを含む最適化された特性を有するペプチドの生成

5A.配列番号31〜33のインシリコ生成および仮想レンダリング

環状CARファルマコフォアを有する新しいペプチドの開発のためにとり得るコンピューターを利用した最適化アプローチを説明するために、PyMOL Molecular Graphics System, バージョン 1.2r2 (PyMOL 2014)を用いてインシリコ化合物ライブラリを作製した。CARファルマコフォアを有することに加えて、生成された3つのすべての類似体（配列番号31〜33）は、改善された、または強化された特性を有する構造の創製をもたらす1つ以上の化学修飾を含む。生成された構造は、単一タイプの配列修飾の結果として、改善された複数の特徴を有し得る。配列番号31〜33を生成するプロセスにおいて、先に開示された技術がしばしば用いられ、置換修飾が含まれる。

配列番号31は、配列番号1の隣接するC末端およびN末端Cys残基をLeu残基で置換して生成され、アミノ酸配列「LARSKNKDL」を生成した。この場合、配列番号1の正常なジスルフィド結合とは対照的に、２つの隣接するLeu残基を連結するメチレン架橋を介して環化が達成されている。配列番号1のジスルフィド結合と同様に、修飾はペプチドをより安定したコンホメーションに制約するはたらきをする。しかし、配列番号1のジスルフィド結合とは異なり、Leu残基は、一般的にCys残基より全身毒性がより低いレベルであるため（Gupta 2013）、2つのLeu残基は、配列番号1に関連する全身毒性を潜在的に低下させることができる。

配列番号32は、配列番号1の元のアミノ酸配列を再整列、再配置して生成され、「CAKSRNHDC」の配列を生成した。より具体的には、配列番号1のArg1は、Lys残基で置換されており、配列番号1のLys1はArg残基で置換され、配列番号1のLys2はHis残基で置換されている。CARペプチドレセプターの確認されていない性質および内在化のメカニズムが与えられると、この再整列/再配置は、リガンドとレセプターとの間の分子相互作用を強化するアミノ酸残基の最適配置を生み出すことができる。これは最終的に、環状CARファルマコフォアを含むこの化合物の標的特異性、結合、または内在化の改善をもたらし得る。

配列番号1の負電荷のAsp残基を疎水性Leu残基で置換し、アミノ酸配列「CARSKNKLC」を得ることにより配列番号33を生成した。アスパラギン酸などの低分配係数（log D）を有する残基をロイシンなどのより大きなlog D値を有する残基で置換すると、ペプチドの非水溶性が改善され、製剤の強化または薬物動態的特性の改善を可能にする類似体生成を潜在的にもたらし得る（Rand 2012）。

5B.結果の分析

環状CAR（配列番号1）と最適化されたペプチド類似体（配列番号31〜33）との重ね合わせにより、5つすべての化合物間の類似性を視覚化することが可能になる（図示せず）。配列番号31〜33のアミノ酸置換は、環状リング構造の喪失または正電荷塩基性残基の空間的配置の喪失をもたらさなかった。これら3つすべての塩基性残基（Arg、Lys1、およびLys2）が配列番号1とほぼ同じ側鎖空間的配置を有する事実は、配列番号31〜33が環状CARファルマコフォアを有していることを実証している。

さらに、配列番号1および配列番号31〜33との間の静電的類似性も見られ、伸長側鎖の正電荷成分に特に重点を置いている。配列番号1および配列番号31〜33との間には別のより些細な類似点も存在しており、分子量、コア骨格構造を含む保持された環状、リング状構造を含んでいる。

潜在的CAR変異体の開発

CARには、「Basic-X-Basic-X-Basic-X」の配置で3つの塩基性残基を含む。このモチーフは、多くのタンパク質におけるヘパリン結合モチーフに類似している。CARに対するヘパラン硫酸結合の必要条件を前提として（Jarvinen and Ruoslahti, 2008）、塩基性アミノ酸（アルギニンまたはリシンのいずれか）を元の位置に保存するように順列置換がなされた。残りのポジションは、ランダムに変化した。ファージにおける突然変異分析は、当該分析を行う最も簡単な方法であるため実施された。CHO細胞への結合についてファージクローンを試験し（JarvinenおよびRuoslahti、2010）、活性の場合、インビボホーミングについて試験した。並行して、トランケート型CAR配列も試験した。以前の実験では、C末端で（CARSKNKDCから）CARSKNKにトランケートされた直鎖状ペプチドが細胞結合および組織ホーミングにおいて高活性であることを発見した。対照的に、N末端を切断すると活性が低下した。これらの結果は、ファルマコフォアをXXBXBXBと定義し、ここではBが塩基性アミノ酸である。最も短くおよび/または最も活性のあるペプチドに到達させるため、X残基をランダムに突然変異させてファージを試験した。

結果は、「CxRxRxR」のモチーフにおいて、「R」は「K」または「R」、すなわち陽性側鎖を有する残基であり得ることを示した。「R」がD、E、H、T、S、N、I、V、G、Q、LおよびPである場合、細胞結合および細胞ホーミングは改善されなかった。「X」については、どの残基が改善された細胞結合および細胞ホーミングをもたらすかを解釈することがより困難であった。結果は、「X」をPとすることはできないことを示した。実際の結合距離ではなく、しばしば静電的な差異が、「X」がK、H、R、D、E、C、F、WまたはYであるという否定的結論を導いた。最終的に結果は、「X」がT、S、N、Q、A、I、LまたはV、すなわち疎水性側基を有する残基と同様、極性の非荷電側基を有する残基であってもよいことを示した。

慢性腎臓病のCARファルマコフォアの標的化
半月体形成性糸球体腎炎（抗糸球体基底膜抗体による糸球体傷害）のラットモデルを使用して、慢性腎臓病を標的にするCARファルマコフォアの有用性について観察した。ラットの腎臓において、抗糸球体基底膜抗体の静脈内注射で糸球体腎炎を誘発した。誘発から14日後、CARファルマコフォアペプチドまたは対照（CGGGGGGGC）ペプチドが3.3mg/kg（体重）で静脈内注射された。CARファルマコフォアまたは対照注射の3時間後に腎臓を摘出し、マッソントリクローム（コラーゲン）染色およびフィブロネクチン免疫染色を用いて腎臓病および線維形成の進行を判定した。

図10に示す結果は、慢性腎臓疾患を標的とするCARファルマコフォアの有用性を示唆している。CARファルマコフォアは、罹患腎臓において、糸球体毛細血管、ボーマン隙の半月体、尿細管上皮、および間質に広範囲に蓄積した（紫色）（C）。CARファルマコフォアは、半月体ならびに腎管に蓄積した。腎管への蓄積は、再吸収に関連する可能性がある。対照的に、対照ペプチドは、3時間の投与で腎臓から大部分除去された（D）。

モノクロタリン誘導（MCT）PAHのラットモデルにおけるイマチニブとのCARファルマコフォア同時投与を用いてPAHを標的化するためのCARの治療的有用性を観察した。MCT誘導の4週間後から14日間、CARファルマコフォアペプチドを10mg/kgまたは50mg/kgのイマチニブと静脈内に同時投与した。

この結果は、MCT誘発性PAHの重篤度は、CARファルマコフォアおよびイマチニブの同時投与後の誘発後4週間でこれまでに報告された研究ほど大きくなかったことを示唆している（データ示さず）。CARファルマコフォアの同時投与は、イマチニブの効果を高め、右心肥大を減少させた。

同様に、この実験で肺動脈の筋性動脈化の程度を測定すると、CARファルマコフォアの同時投与は、イマチニブの効果を高めた（データは示さず）。

驚くべき結果は、体重に対するCARファルマコフォアの有益効果の発見であった。右心肥大および肺動脈の筋性動脈化の減少は、高血圧症ラットの体重回復の改善と一致した。悪液質、または消耗性症候群は、積極的に体重を減らそうとしていない個体の体重、筋肉の萎縮、疲労、衰弱、および食欲の喪失である。悪液質は、がん、AIDS、慢性閉塞性肺疾患、多発性硬化症、うっ血性心不全、結核、家族性アミロイドポリニューロパチー、水銀中毒症（肢端疼痛症）およびホルモン不足の患者ｎ人に見られる。体重へのCARファルマコフォアの薬効の発見は、MCT注入および恐らく一般的な悪液質によって誘発される体重減少を改善でき得るCARファルマコフォアの能力に関する最初の証拠を提供する。

敗血症のリポ多糖エンドキシン（LPS）マウスモデルにおける敗血症生存率を改善するCARファルマコフォアの能力

敗血症におけるCAR作用の仮説的機序（図11）。(A)健康な内皮のグリコカリックスは、CARペプチドに結合しない。一部の薬物分子は、原形質膜を通じて受動的に拡散するが、薬物の大半は、血流に留まる。(B)敗血症の後、ヘパラナーゼ発現は、ヘパラン硫酸（HS）鎖の選択的な酵素切断およびグリコカリックスの修飾を引き起こす。切断に耐性のあるHS変異体は損傷を受けず、CARがそのHSレセプターと結合することを可能にする。(C)CARの結合は、膜ラフリングおよび脂質ラフト形成を引き起こし、原形質膜の内側へのフォールディングを引き起こし、CARおよび薬物分子などの細胞外成分の取り込みを引き起こす。(D)CARおよび薬物分子を含むマクロピノサイトーシス小胞が細胞内に内在化される。(E)減少した細胞内のpHは、マクロピノソーム（macropinosome）を解離させ、CARおよび薬物を細胞内に放出する。これはまだ単なる仮説であるが、CARが血管透過性を増加させることなく、敗血症組織における薬剤の局所的活性を選択的に高める方法を説明でき得る。

LPSによって誘発された敗血症を有し、未処置のままのマウス全体の内の50％が、48時間以内に死亡する。これらのLPSマウスを臨床的に関連する容量の一般的および実験的敗血症薬である、ヒドロコルチゾン、アンチトロンビンIII、またはシベレスタットで治療すると、生存率は40〜56％となり、現在の臨床転帰と類似していた。対照的に、LPSマウスにヒドロコルチゾン、アンチトロンビンIIIまたはシベレスタットと同時にCARを同時投与した場合、実験的敗血症の生存率は83〜89％へと改善した。

CARファルマコフォアは、シベレスタットで処置した敗血症マウスにおける生存率を劇的に改善した。細菌タンパク質である、リポ多糖（LPS）の注入を用いてマウスで敗血症を誘発した。シベレスタットの臨床使用と一致するように3時間、6時間、9時間、および12時間で投与した。LPS注入後48時間まで生存率を測定した。48時間後、対照およびシベレスタットのみの両方の群での50％と比較すると、CARファルマコフォア+シベレスタットで治療した動物の生存率は89％であり、CARファルマコフォアで治療した動物の生存率は78％の増加を示した（図12）。

CARファルマコフォアは、アンチトロンビン（ATIII）で処置した敗血症マウスにおける生存率を劇的に改善した。敗血症が発症し、ATIIIの臨床使用と一致するように3時間および24時間投与した状態で生存率を測定した。48時間後、対照での50％およびATIIIのみでの40％と比較すると、CARファルマコフォア+ATIIIで治療した動物の生存率は83%であり、ATIIIのみの群よりもCARファルマコフォアで治療した動物の生存率が66%の増加を示した（図13）。ATIIIのみの動物における生存率の低下は、ATIIIの抗凝血性活性によって引き起こされる出血によるものであり得た。CARファルマコフォアは、この作用を完全に逆転させるように見えた。

CARファルマコフォアは、ヒドロコルチゾンステロイドで処置した敗血症マウスにおける生存率を劇的に改善した。敗血症が発症し、ヒドロコルチゾンの臨床使用と一致するように3時間および24時間投与した状態で生存率を測定した。48時間後、対照での50％およびヒドロコルチゾンのみの群での56%と比較すると、CARファルマコフォアで治療した動物の生存率は83%であり、ヒドロコルチゾンのみの群よりもCARファルマコフォアで治療した動物の生存率が57%の増加を示した（図14）。

この結果を励みに、我々はその後LPS敗血症マウスにおけるCARファルマコフォア自体を試験したところ、生存率が80％に改善した。敗血症における独立型治療薬として、LPSマウスに20mg/kg（または500ug/マウス）の腹腔内注射によって単独で投与されたCARファルマコフォアは、48時間で生存率を50％（治療なし）からCARファルマコフォア投与で80％と改善した。これは、既存の敗血症治療法を強化するためのCARファルマコフォアの有用性ならびに敗血症の生存率改善のための独立型薬剤としての可能性を実証している。投与されたCARファルマコフォアの投与量、すなわち500ug／20〜25gマウスは、体重当たり20〜25mg／kgのCARファルマコフォアに相当し、改変したグリコカリックスによって特徴付けられる炎症組織における局在化したマイクロピノサイトーシスを誘発した強力な抗炎症剤としてそれ自体が作用するCARファルマコフォアの可能性を支持し、炎症組織が正常組織に近い速度で組織外分子を取り込むことを可能にし、それにより組織が炎症から治癒することを可能にする。

敗血症におけるCARファルマコフォアの標的化および損傷した肺、肝臓および腎臓内皮の再生
LPS注入を使用して、10週齢のオスのC57BL6ラットに敗血症を誘発させた（20mg/kg、腹腔内注射）。PBS100％（n=10）、LPS21.4％（n=28）の注入後、動物の生存率を48時間評価した、p < 0.05（図15A）。CARファルマコフォアが内皮細胞にホーミングするかどうかを確認するために、PBSまたはLPS投与後12時間に蛍光CARファルマコフォア-FAM（8mg/kg 腹腔内注射）で動物を処置した。1時間後、研究目的として動物を犠牲にし、肺、肝臓、および腎臓組織を組織学のために処理した。CAR陽性染色は、敗血症動物の肺血管および肝臓のグリソン鞘でのみ観察された（図15B、矢印）。腎臓では、CARファルマコフォアのレベルが高い場所が敗血症動物の糸球体に集中していた（矢印）。図16に示す通り、CARファルマコフォアは腎臓の内皮特異的マーカーレクチンと共存する。敗血症動物では、CARファルマコフォアは損傷した内皮細胞にホーミングし、レクチンと共存する（矢印）。

対照、シベレスタットおよびCARファルマコフォア+シベレスタット処置したマウスからの肺組織の走査電子顕微鏡写真は、シベレスタット単独では連続する肺動脈内皮の分解を妨げないことを示した（図17）。CARファルマコフォアをシベレスタットと同時投与した場合、内皮の分解が妨げられ、その連続した外観は対照と類似していた。

対照、シベレスタットおよびCARファルマコフォア+シベレスタット処置したマウスからの肝臓組織の走査電子顕微鏡写真は、対照において示されるように、シベレスタット単独では敗血症動物の師板放出を防止できないことを示した（図18）。CARファルマコフォアとシベレスタットを敗血症動物に同時投与した場合、師版クラスターのサイズおよび数は対照レベルにほぼ回復する。

対照、シベルスタットおよびCARファルマコフォア+シベルスタットで治療したマウスの腎臓組織の走査電子顕微鏡写真は、恐らく重篤な細胞外基質タンパク質のタンパク質分解を引き起こす好中球エラスターゼの活性化のために、シベルスタット単独では対照（図19）で示すように肉眼的に組織損傷（矢印）を防止しないことを示した。CARファルマコフォアをシベルスタットと同時投与した場合、シベルスタットの抗エラスターゼは、腎臓の損傷した内皮グリコカリックスにCARファルマコフォアが選択的にホーミングすることにより効率的に増強されたと思われる。

急性腎傷害マーカー（KIM-1）発現は、CARファルマコフォアを処置した動物において減少した（図20）。腎障害の近位尿細管において上方調節されるKIM-1の組織学的染色は、CARファルマコフォアを処置した動物において著しく低下する。

トリプルネガティブ乳がんモデルにおけるCARファルマコフォアの効果

雌の胸腺欠損ヌードマウス（CRL: NU(NCr)-Foxn1nu、11週齢、Charles River）において、右脇腹に5×106 MDA-MB-231細胞の皮下注射を介してトリプルネガティブ乳がん腫瘍を引き起こした。平均腫瘍サイズが100〜150mm3に近づくまで腫瘍増殖をモニターした。腫瘍移植21日後（研究の1日目、体重範囲20.6〜27.3グラム）、動物はパクリタキセルおよびCARファルマコフォアの組み合わせ（各3mg/kg）、パクリタキセル（3mg/kg）、または生理食塩水ビヒクルの3つの群（n=3）に分類された。動物には1日おきに静脈内に投与し、合計15回投与した。カリパスを用いて週2回腫瘍体積を測定し、1日目〜5日目は毎日動物の体重を計り、その後週2回のスケジュールで体重を計った。

CARファルマコフォアとパクリタキセルの同時投与は、パクリタキセル単独と比較して15日間にわたり平均腫瘍体積を減少させ（図21）、がん誘発性体重減少の改善という更なる効用を提供した。CARファルマコフォアで治療した動物は、平均開始体重に対して11％増加したが、パクリタキセル単独群は5％の増加、生理食塩水ビヒクル対照群は32日後に6％増加した（データ示さず）。

肺動脈性肺高血圧症における選択的薬物有効性。

オスのSDラット（Sprague-Dawley rats）（300〜330g、10週齢、Harlan）にモノクロタリン（60mg/kg）を単回腹腔内投与し、PAHを誘発した。治療は、PAH誘発の４週間後に、イマチニブ（50mg/kgまたは10mg/kg）またはイマチニブ（50mg/kgまたは10mg/kg）+CARファルマコフォアの組み合わせ（3mg/kg）を２週間、毎日の静脈内投与（図22および23）または毎日の舌下投与のいずれかで開始された。

右心肥大（図22および24）および肺動脈の筋性動脈化（図25）の改善によって測定されるように、CARファルマコフォアの同時投与はイマチニブの治療効果を増強した。驚くべきことに、イマチニブの80％低減用量（10mg/kg）であっても、CARファルマコフォアジュバントをこの治療に付加すると、全用量50ｍｇ/kgのイマチニブ単独治療の有効性と同等またはそれ以上の有効性がもたらされた（図22および25）。イマチニブの長期間の静脈内投与は、体重に重大な悪影響を及ぼすと思われる。CARファルマコフォアペプチドの同時投与は、この副作用を緩和すると思われる。イマチニブ療法のアジュバントとしてのCARファルマコフォアの追加では、MCTラットの体重が増加し、動物の全体的な健康状態の著しい改善を示した。

用語集
1. DMEM - ダルベッコ改変イーグル培地 - アミノ酸、塩、グルコース、およびビタミンを含む細胞培地。
2. FAM - トレーサー剤として使用されるカルボキシフルオレセイン蛍光色素。
3. DAPI - 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール - DNA内のATリッチ領域に強く結合する蛍光染色剤であり、蛍光顕微鏡で幅広く使用されている。
4. NIH - アメリカ国立衛生研究所
5. STTR - スモールビジネス・テクノロジー・トランスファー - 連邦政府の研究開発への小規模企業の参加を増加させ、連邦政府の研究開発を通じて開発されたテクノロジーを民間セクターでの商業化を促進するためにNIHが主催するプログラム。
6. CAR - 配列CARSKNKDCの9アミノ酸ペプチド。環状または直鎖状の場合がある。
7. cCAR - 配列CARSKNKDCの環状9アミノ酸ペプチド。
8. tCAR - 配列CARSKNKのトランケート型直鎖状7アミノ酸ペプチド。
9. 配列番号 - 「配列識別番号(Sequence Identification Number）」の略語であり、開示された特定の配列を同定するために使用される。
10. CADD - コンピューター援用薬品設計。
11. CHO-K1 - 親のチャイニーズハムスター卵巣細胞胞株由来のサブクローン誘導。1957年にT. T. Puck氏によって成体のチャイニーズハムスターの卵巣生検から開始された。
12. FACS - 蛍光活性化細胞ソーティング。
13. HS - へパラン硫酸
14. HSA - ヒト血清アルブミン
15. HSA-tCAR - ジスルフィド結合を介してトランケート型CAR（tCAR; 配列番号24）をヒト血清アルブミン（HSA）のCys34残基で遊離スルフヒドリル基に共有結合的に連結することで産生されたコンジュゲート化合物。
16. ATIII - アンチトロンビンIII
17. AB1 - モノクローナル抗がん抗体B1。
18. CAR-AB1 - 環状CAR（配列番号1）をモノクローナル抗がん抗体B1のFvフラグメントに共有結合的に連結することで産生されたコンジュゲート化合物。
19. CNS - 中枢神経系
20. Cyclic CAR Rifa - 環状CARリファブチンペプチド模倣薬。
21. Cyclic CAR-Rapa - 環状CAR-ラパマイシンペプチド模倣薬。
22. Cyclic CAR-Voclo - 環状CAR-ボクロスポリンペプチド模倣薬。
23. Linear CAR-Rifa - 直鎖状CAR-リファブチンペプチド模倣薬。
24. Linear CAR-Rapa - 直鎖状CAR-ラパマイシンペプチド模倣薬。
25. Linear CAR-Voclo - 直鎖状CAR-ボクロスポリンペプチド模倣薬。
26. PAH - 肺動脈性肺高血圧症
27. DNA - デオキシリボ核酸。
28. LPS - リポ多糖内毒素
29. MCT - モノクロタリン
30. NMR - 核磁気共鳴。
31. PBS - リン酸緩衝生理食塩水
32. Arg - アルギニン。
33. His - ヒスチジン。
34. Lys - リシン。
35. Asp - アスパラギン酸。
36. Glu - グルタミン酸。
37. Ser - セリン。
38. Thr - トレオニン。
39. Gln - グルタミン。
40. Cys - システイン。
41. Gly - グリシン。
42. Pro - プロリン。
43. Ala - アラニン。
44. Val - バリン。
45. Ile - イソロイシン。
46. Leu - ロイシン。
47. Met - メチオニン。
48. Phe - フェニルアラニン。
49. Tyr - チロシン。
50. Trp - トリプトファン。
51. Log D - 分配係数（P）の対数であり、これは脂溶性有機相と極性水相との間に分配される化合物の傾向の評価尺度である。

Claims

少なくとも１つの治療的に活性なペプチド分子のファルマコフォアを同定する方法であって、
a）少なくとも１つの治療的に活性なペプチド分子に、該分子の類似体を合成するために、順列置換を行うこと；
b）該治療的に活性なペプチド分子および合成された類似体に対して細胞結合および内在化アッセイを行うこと；
c）工程b）の結果に基づき、該治療的に活性なペプチド分子が治療活性を維持するために、保存されることが必要であるファルマコフォアの分子的特徴であって、構造的、電子的、立体的及び配列的特徴を含む、分子的特徴を同定すること；
d）化合物モデルのライブラリを作製し、さらに保存されたファルマコフォアの該分子的特徴を同定するために、該治療的に活性なペプチド分子およびその類似体のモデルをインシリコで生成すること；
e）該類似体のモデルを該治療的に活性なペプチド分子モデルに重ね合わせること；および
f)保存された該分子的特徴について、構造的、電子的、立体的及び配列的特性からなる群より選ばれる少なくとも１の特性における重ね合せたモデル間の類似性を分析することを含む方法。
前記少なくとも1つの治療的に活性なペプチド分子が、腫瘍血管系、再生組織、創傷組織、炎症組織、線維化組織、再構築組織、損傷内皮、ヘパラナーゼレベルの上昇を特徴とする組織を選択的に標的化することにより測定可能な疾患治療効果をもたらし、かつ当該病的細胞に内在化する能力を有する請求項１記載の方法。
疾患が、肺疾患、肺高血圧症、間質性肺疾患、急性肺傷害、急性呼吸促迫症候群、喘息、敗血症、敗血症性ショック、感染症、肺サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、リューマチ性関節炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎などの結合組織病における肺の症状、を含み、気管支拡張症、石綿症、ベリリウム症、珪肺症、ヒスチオサイトーシスX、肺炎、間質性肺炎、喫煙者肺、閉塞性細気管支炎、肺線維症、その他心筋梗塞、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症、塵肺症、腎性全身性線維症、瘢痕形成、ケロイド、関節線維症、癒着性関節包炎、放射線維症、乳腺線維嚢胞症、肝硬変、肝炎、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝疾患、急性肝不全、非アルコール性脂肪性肝炎、リンパ節または他の器官のサルコイドーシスなどの線維性疾患炎症性腸疾患、クローン病、悪液質、慢性腎臓病、急性腎傷害、急性腎不全、多発性嚢胞腎、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性硬変、膵炎、間質性膀胱炎、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化症、虚血性心疾患、血管炎、新生物性/転移性/腫瘍性疾患（がんを含む）、塵肺症、自己免疫疾患、血管新生性疾患、創傷治癒、感染症、外傷性損傷および全身エリテマトーデスを含む全身結合組織疾患、リウマチ性関節炎強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、嚢胞性線維症、勃起不全、α1-アンチトリプシン欠乏症、糖尿病、高ヘパラナーゼルレベルを特徴とする疾患、神経炎症状態、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病（PD）、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症などの中枢神経変性疾患、外傷性脳損傷、低酸素症、加齢脳、滲出型黄斑変性症、新生血管加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、神経膠芽腫、および老化関連疾患からなる群から選択される請求項２記載の方法。
疾患が、肺動脈性肺高血圧症、敗血症、腎臓病、がんおよび悪液質から構成される群から選択される請求項３記載の方法。
前記少なくとも1つの治療的に活性なペプチド分子が、環状、直鎖状、又はトランケート型CARペプチド分子である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。