JP6893037B2 - Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染のための４，６−ジ−（Ｏ−チオホスフェート）−イノシトール−１，２，３，５−テトラ−Ｏ−スルフェート - Google Patents

Description

本発明は、４，６−ジ−（Ｏ−チオホスフェート）−イノシトール−１，２，３，５−テトラ−Ｏ−スルフェート（硫酸塩）、ならびにＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染と関連する中毒症状の予防および治療におけるクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の腸溶性活性化剤としてのその使用に関する。

発明の背景
クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）による感染は、重篤で、生命を脅かす下痢を引き起こし得る。この症状は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢによって合成された２つの毒素によって引き起こされる。毒素は、結腸内層の細胞に侵入し得、細胞質イノシトール六リン酸エステル（ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｈｅｘａｋｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＩＰ６）によって活性化され、その毒性の機能を発揮する。
１つの示唆される治療的介入は、結腸内腔の細胞外空間において毒素を活性化することである。活性化された毒素は、もはや結腸細胞に入ることができず、結腸管腔内では、それらの毒性機能を発揮することができない。したがって、結腸内腔内の毒素の活性化は、影響を受けた患者にとって毒素を無害にさせる。

ＩＰ６は、結腸管腔内のカルシウム濃度が高いせいで沈殿するので、治療的介入には使用できない。

特許文献１は、ＰＥＧ修飾イノシトールリン酸化合物および混合イノシトールリン酸−硫酸化合物、ならびにＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素活性化の活性化におけるそれらの使用を示す。そこに示された化合物の活性は有望である。

国際公開第２０１３０４５１０７号パンフレット

しかし、特許文献１に関連する結果の改善は有利であろう。したがって、本発明の根底にある問題は、高カルシウム濃度でより強い活性を示すＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素の活性化剤を提供することである。この問題は、独立した請求項の主題によって解決される。

発明の詳細な説明
ＷＯ２０１３０４５１０７Ａ１（特許文献１）に最初に示された化合物クラスの研究の間、驚くべきことに、混合イノシトールテトラキススルフェートビオチオホスフェート化合物の小さなサブセットが、以前に研究された混合硫酸塩−リン酸塩化合物と効果を比較してはるかに優れていることが見出された（図１を参照のこと）。

本発明の第１の態様によれば、一般式（Ｉ）によって特徴付けられる化合物、

であって、式中、６つのＸのうち２つが、ＯＰＳＯ_２ ^２−であり、かつ残りのＸがＯＳＯ_３ ⁻である、化合物が提供される。

式Ｉの直線は、個々の環の炭素原子の立体化学が規定されていないことを示すことを意味する。式は、任意の立体異性体を包含することを意味する。

特定の実施形態では、この化合物は、一般式（ＩＩａ）または（ＩＩｂ）

によって特徴付けられる。

本発明の第２の態様によれば、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）または（ＩＩｂ）によって特定される化合物は、疾患の治療または予防における医薬としての使用のために提供される。

本発明の第３の態様によれば、式（Ｉ）、（ＩＩａ）または（ＩＩｂ）で特定される化合物は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の治療もしくは予防における、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染に関連する症状の治療もしくは予防における使用のために提供される。

本発明による化合物は、哺乳動物または細菌の膜を貫通して活性である必要はない。さらに、本発明による化合物は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌に選択的な圧力をかけることはなく、したがって耐性に関連する問題は回避される。

本発明の第４の態様によれば、式（Ｉ）、（ＩＩａ）または（ＩＩｂ）で特定される化合物を含む剤形が、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の治療もしくは予防に、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染に関連する症状の治療もしくは予防における使用のために特に提供される。

特定の実施形態では、剤形は、経口製剤、特に錠剤、カプセル、トローチ剤、粉末、溶液またはシロップである。

本発明の別の態様によれば、本発明の上記態様において特定された化合物は、医薬品として、特にＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染に関連する症状の予防または治療に使用するために製剤化された医薬品として提供される。

特定の実施形態では、医薬品は、単独で、または１つ以上の薬学的に許容される賦形剤もしくは担体と一緒に、本発明の上記の態様で特定された化合物を含む。

この医薬品は、単独で、または１つ以上の治療剤と組み合わせて、特に抗菌薬物と組み合わせて、より好ましくは、（限定するものではないが）メトロニダゾール、バンコマイシンまたはフィダキソマイシンを含む群から選択される抗菌薬物と組み合わせて投与されてもよい。

本発明のさらに別の態様によれば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染に関連する症状の処置または予防方法であって、それを必要とする被験体に対する、式（Ｉ）、（ＩＩａ）または（ＩＩｂ）で特定される化合物の被験体への投与を包含する方法が提供される。投与は、前述の手段のいずれかによって達成され得る。

この化合物は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染と既に診断された患者、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染に罹患している疑いがある患者に投与されてもよい。あるいは、化合物は、病院環境で抗菌薬を用いた治療を受けている患者のような、感染に罹患する危険がある患者の予防薬として使用してもよい。

本発明のさらに別の態様によれば、抗菌薬、特にメトロニダゾール、バンコマイシンまたはフィダキソマイシンを、式（Ｉ）、（ＩＩａ）または（ＩＩｂ）によって特定されるような化合物と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを包含する、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の処置方法が提供される。

ＩＰ６、ＩＰ２Ｓ４および活性化化合物ＩＴ２Ｓ４（ＩＩａ）のＣａ^２＋（１０ｍＭ）の有無におけるＴｃｄＢの切断の程度を示す。 化合物（ＩＩａ）の^１Ｈ−ＮＭＲおよび^３１Ｐ−ＮＭＲを示す。 イノシトール六リン酸（ＩＰ６）、イノシトール六硫酸（ＩＳ６）、および２つの混合のリン酸塩−硫酸塩化合物についての１０ｍＭのＣａＣｌ_２の存在下でのＴｃｄＢの切断の程度を示す。

[実施例]

実施例１：化合物（ＩＩａ）の合成
合成は、以下のスキームに描かれている順序に従った：

ＰＴＳＡ：ｐ−トルエンスルホン酸；ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド；ＴＢＤＭＳＣｌ：ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロライド；ＤＣＭ：ジクロロメタン；Ｓ８：元素状硫黄；ｐｙｒ．：ピリジン；ＴＭＳＢｒ：臭化トリメチルシリル、ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸。

リン酸化反応
既知の２−ｔｅｒｔブチルジメチルシリルイノシトールオルトホルメートを、トルエンと同時エバポレートさせ（３×）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解した。１Ｈ−テトラゾール（４当量）、続いてホスホラミダイト（８当量）を、反応物に添加し、一晩撹拌した。ピリジン、続いて粉砕した硫黄フレーク（２０当量）を、この反応物に添加し、一晩撹拌した。得られた粗混合物を、ＤＣＭで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。生成物をトルエン中のＤＣＭを用いたフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。

^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ_３）：δ７．３５−７．２９（ｍ，４Ｈ）、７．１５（ｄｄ、Ｊ＝６．６，２．１Ｈｚ，２Ｈ）、７．０７−７．０４（ｍ，２Ｈ）、５．５４（ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ，１Ｈ）、５．４５−５．４１（ｍ，２Ｈ）、５．３０−４．９７（ｍ，８Ｈ）、４．５１−４．４９（ｍ，１Ｈ）、４．３３−４．３２（ｍ，２Ｈ）、４．２７（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ、１Ｈ）、０．９３（ｓ，９Ｈ）、０．１３（ｓ，６Ｈ）；^３１Ｐ−ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ；ＣＤＣｌ_３）：δ７０．１。

脱保護
以下の脱保護条件は、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ［ＪＡＣＳ ２００５，１２７，５２８８］に発表された合成と同様である。
出発物質（５０ｍｇ）を、チオフェノール（３００μｌ）、ｍ−クレゾール（３００μｌ）、トリフルオロ酢酸（１．８ｍｌ）で処理した。次いで、ＴＭＳＢｒＯＨをゆっくりと添加した（３６０μｌ）。室温で２時間撹拌した。トルエンから２回エバポレートした。ＤＣＭおよび約５ｍｌの水で希釈した。１ＮのＮａＯＨで中和した。ＳｏｌＥｘ Ｃ１８カートリッジ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、１ｇ、６ｍｌ）上に水層（わずかに濁った）を直接注いだ。水で溶出した。ある場合には、芳香族不純物がいくつか見出されたが、水中で時間と共に沈殿し、濾別可能であった。
^１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；Ｄ_２Ｏ）：δ４．３６（ｑ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、２Ｈ）、４．０２（ｔ、Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ）、３．６４（ｄｄ、Ｊ＝９．７，２．８Ｈｚ、２Ｈ）、３．５０（ｔ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ）。
^３１Ｐ−ＮＭＲ（２０３ＭＨｚ；Ｄ_２Ｏ）：δ４５．７。

硫酸化
チオリン酸エステル（チオホスフェート）は、反応条件下で最終的にリン酸塩に変換されるので、チオリン酸エステルの硫酸化反応は、注意深く実施しなければならない。従って、我々は慎重に硫酸化をモニターし、約３０分後に反応が完了したこと、およびこの時点で分解は観察されなかったことを見た。従って、ＤＭＦ中のイノシトールリン酸の懸濁液に、スルホトリオキシドジメチルホルムアミド（ＳＯ_３−ＤＭＦ）複合体（１２当量）を加えて、その反応物を３５分間撹拌した。約ｐＨ８に続いて約３ｍｌのメタノール（ＭｅＯＨ）で塩を沈殿させるまで、約１ＮのＮａＯＨを加えて、反応をクエンチングさせた。固体をＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムにより、水で溶離して精製した。
^１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；Ｄ_２Ｏ）：δ５．０６（ｓ，１Ｈ）、５．０４−４．９８（ｍ，４Ｈ）、４．７９−４．７６（ｍ，１Ｈ）。^３１Ｐ−ＮＭＲ（２０３ＭＨｚ；Ｄ_２Ｏ）：δ４４．５
^１Ｈ−ＮＭＲおよび^３１Ｐ−ＮＭＲの結果を図２に示す。

実施例２：切断効率の比較
ＩＰ６、活性化化合物（ＩＩａ）およびＩＰ２Ｓ４を、ＴｃｄＢの切断の程度に関して比較した（図１）。試験される化合物は、１００ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．４中の１０ｍＭのＣａ^２＋の有無において１ｍＭ〜１５０ｎｇの毒素Ｂで添加され、３７℃で３時間インキュベートされた。切断されたタンパク質断片を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、銀染色により可視化した。切断の程度は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアパッケージを用いてタンパク質バンド強度から定量した。
シグナルは、陽性対照および陰性対照の切断に対して標準化された。その結果によって、ジチオリン酸塩−四硫酸塩イノシトールが、二リン酸塩−四硫酸塩イノシトールと比較して驚くべきことにさらに優れており、これが以前に発表されたイノシトール六硫酸およびイノシトール六リン酸に対して驚くほど優れていることが示されている（図３および比較例３）。

実施例３（比較）：Ｐ２Ｓ４イノシトール、ＩＰ６およびＩＳ６切断効率
試料を調製し、実施例２に記載したように処理した。エラーバーは、ｓ．ｄ．を示し；アスタリスクは、ＩＰ２Ｓ４と比較して統計的差を示す（Ｐ＜０．０５）；ｎ＝３。

方法：
ＩＣＰ−ＭＳによる類似体溶解度測定。１０ｍＭのＣａＣｌ_２を含むかまたは含まないイノシトール六リン酸（ＩＰ６）類似体の１００ｍＭ溶液を、１０ｍＭのトリスｐＨ７．４中で調製し、３７℃で２時間撹拌しながらインキュベートした。その溶液を直ちに、３７℃に平衡化された０．２ｍｍのナイロンフィルターで濾過した。各ろ液中のリン含量は、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）によって測定した。得られた値を、各ＩＰ６類似体中のリン酸塩の数で割って、溶液中の化合物の濃度を決定した。

遊離カルシウムイオン定量。ムレキシド（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の新鮮な１ｍＭの溶液を、１０ｍＭトリスｐＨ７．４中で調製した。各ＩＰ６類似体について、５０ｍＬの１０ｍＭトリス中の０．５ｍＭの類似体、ムレキシドおよびＣａＣｌ_２を含む試料を、三重に調製した。室温で５分間インキュベートした後、試料を２０，０００ｇで２分間遠心分離し、上清の上部４０ｍＬを、３８４ウェルプレートに移した。１ｍＭ〜２０ｍＭ、および２０ｍＭの範囲のＣａＣｌ_２を含有するＩＰ６類似体を含まない試料も調製し、各実験の較正に使用した。吸光度を、４７４ｎｍおよび５４４ｎｍで測定し、そのデータをＯｈｎｉｓｈｉによって報告されたように分析した［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８５，１６５（１９７８）］この実験を３回繰り返した。

ホロトキシンによる切断アッセイ。１ｍＭのＩＰ６類似体を、１００ｍＭのトリスｐＨ７．４中の１０ｍＭのＣａＣｌ_２で、３７℃で、１５分間平衡化した後、１５０ｎｇのＴｃｄＢ（ＴｇｃＢｉｏｍｉｃｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を総量２０ｍＬで添加した。陰性対照（ＩＰ６なし、１０ｍＭのＣａＣｌ_２）および陽性対照（１ｍＭのＩＰ６）もすべてのゲルに含まれた。反応混合物を３７℃で３時間インキュベートし、次いで氷上に置いた。Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（５×）を添加して反応を停止させ、ＣａＣｌ_２を含む試料に１０ｍＭ ＥＤＴＡを添加した後、９５℃で３分間加熱した。
分裂生成物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５ウェル８％アクリルアミドＰｒｅｃｉｓｅ^ＴＭＴｒｉｓ−グリシンゲル、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡを使用）で可視化し、続いて１０分延長したチオ硫酸塩増感ステップを伴う改変Ｖｏｒｕｍプロトコール［Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １，１３５９（２００１）］に従って銀染色した。染色プロトコールの直線性は、１６０ｎｇ／レーンから開始して２０ｎｇ／レーンまで下がるＴｃｄＢの連続希釈で検証した。組換え毒素を用いた切断アッセイについて記載したように、バンド強度を定量した。実験は三重に行った。

Claims (4)

1. 式（ＩＩａ）または（ＩＩｂ）
   

   

   で記述されるアニオンを含有することを特徴とする化合物。
2. 疾患の治療用または予防用の請求項１に記載の化合物。
3. Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の治療用もしくは予防用の、または、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染に関連する症状の予防用もしくは治療用の請求項１に記載の化合物。
4. 請求項３に記載の化合物を含む、剤形が錠剤、カプセル、トローチ剤、粉末、溶液またはシロップとしてのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の治療用もしくは予防用の、または、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染に関連する症状の予防用もしくは治療用の薬剤。

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