JP6878163B2

JP6878163B2 - 培養装置および培養方法

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Publication number: JP6878163B2
Application number: JP2017117882A
Authority: JP
Inventors: 樋口　朗; 朗樋口; 浩幸内藤; 逸郎茂木
Original assignee: Kyoto Seisakusho Co Ltd
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Priority date: 2017-06-15
Filing date: 2017-06-15
Publication date: 2021-05-26
Anticipated expiration: 2037-06-15
Also published as: JP2019000043A; WO2018229740A1; US20200131460A1; US11898128B2

Description

本発明は、培養液を用いて細胞などの培養を行う培養装置および培養方法に関する。

従来より、培養液を用いて細胞などの培養対象を培養する際に、培養に必要な酸素や二酸化炭素などのガス（またはそれらの混合ガス）を培養液に溶存させるために該培養液を撹拌する培養装置が知られている。

例えば、特許文献１に記載された培養装置は、円筒状の培養槽内に細胞が懸濁した培養液を収容し、その培養液を撹拌翼によって撹拌するように構成されている。

また例えば、特許文献２に記載された培養装置は、細胞が懸濁した培養液を収容した培養バッグ（バイオリアクターバッグ）を支持体上に載置し、その支持体を水平方向に延在する揺動軸を中心としてシーソーのように揺動させることによって培養液を一方向に往復動させるように構成されている。

特開２０１４−１２４１３９号公報特表２０１４−５０７９５９号公報

しかしながら、特許文献１に記載する培養装置の場合、酸素は液面を介して培養液内に取り込まれて溶存する。そのため、液面から遠い培養容器の底面付近では、培養液内の溶存酸素量が不足する可能性がある。その対処として、培養容器の底面にスパージャーを配置し、そのスパージャーから酸素を培養液内に供給することが考えられる。しかしながら、スパージャーから発生した酸素の気泡の破裂によって生じる衝撃により、細胞がダメージを受ける。

特許文献２に記載する培養装置の場合、培養バッグの揺動によって生じた波面を介して、酸素が培養液内に取り込まれて溶存する。この培養装置では、培養液内の溶存酸素量をさらに増加させる場合、培養バッグをさらに大きく揺動させる必要がある。しかしながら、培養バッグを大きく揺動させると、揺動によって傾いて下側に位置する培養バッグの内壁面に培養液が強く衝突する。それにより、せん断応力が大きい局所的な流れが発生し、そのせん断応力によって細胞がダメージを受ける。

そこで、本発明は、細胞などの培養対象が懸濁された培養液を撹拌することによって培養を行う際に、培養対象へのダメージを抑制しつつ、酸素などの培養に必要なガスを培養液に十分に且つ全体にわたって溶存させることを課題とする。

上記技術的課題を解決するために、本発明の一態様によれば、
培養対象が懸濁した培養液を収容する内部空間を備える培養容器と、
培養容器の内部空間に単一ガスまたは混合ガスを供給するガス供給装置と、
培養容器の位置姿勢を変更して培養液を撹拌する撹拌装置と、を有し、
撹拌装置が、培養容器の内部空間で培養液を周回させて、培養容器の内部空間の底面が部分的に露呈して且つ露呈部分が周回方向に遷移していくように、培養容器の位置姿勢を変更する、培養装置が提供される。

また、本発明の別態様によれば、
培養液を収容する培養容器の内部空間に単一ガスまたは混合ガスを供給し、
培養容器内で培養液を周回させて、培養容器の内部空間の底面が部分的に露呈して且つ露呈部分が周回方向に遷移していくように、培養容器の位置姿勢を変更して培養液を撹拌する、培養方法が提供される。

本発明によれば、細胞などの培養対象が懸濁された培養液を撹拌することによって培養を行う際に、培養液内の培養対象へのダメージを抑制しつつ、酸素などの培養に必要なガスを培養液に十分に且つ全体にわたって溶存させることができる。

本発明の実施の形態に１係る培養装置の概略的斜視図培養容器の概略的斜視図培養容器の上面図トレイに取り付けられた状態の培養容器の上面図図４に示すＹｂ軸に沿った断面図培養装置の制御系を示すブロック図培養液を撹拌するための制御を示す図培養液の撹拌の様子を示す培養空間の上面図および断面図二重境膜説を説明するための図培養液への酸素の溶存を説明するための図本発明の実施の形態２に係る培養装置の概略的部分断面図図１１に示す培養装置の一部を異なる方向から見た概略的部分断面図培養容器が傾いた状態の図１１に示す培養装置の概略的部分断面図

本発明の一態様の培養装置は、培養対象が懸濁した培養液を収容する内部空間を備える培養容器と、培養容器の内部空間に単一ガスまたは混合ガスを供給するガス供給装置と、培養容器の位置姿勢を変更して培養液を撹拌する撹拌装置と、を有し、撹拌装置が、培養容器の内部空間で培養液を周回させて、培養容器の内部空間の底面が部分的に露呈して且つ露呈部分が周回方向に遷移していくように、培養容器の位置姿勢を変更する。

この態様によれば、培養液内の培養対象へのダメージを抑制しつつ、酸素などの培養に必要なガスを培養液に十分に且つ全体にわたって溶存させることができる。

例えば、撹拌装置が、培養容器を水平方向に対して傾けることによって内部空間の底面を部分的に露呈させ、その露呈部分が周回方向に遷移していくように培養容器の傾き方向を変更するように構成されている。これにより、培養容器の内部空間で培養液を周回させて、培養容器の内部空間の底面が部分的に露呈して且つ露呈部分が周回方向に遷移させることができる。

例えば、撹拌装置が、培養容器を保持するステージと、水平方向に延在する第１の揺動軸を中心にして培養容器を第１の周波数で揺動させる第１のモータと、水平方向に延在して且つ第１の揺動軸に直交する第２の揺動軸を中心にして培養容器を第２の周波数で振動させる第２のモータとを備え、第１の周波数と第２の周波数は、波長および振幅が同一であって、位相が四分の一波長異なる。これにより、培養容器の内部空間で培養液を周回させて、培養容器の内部空間の底面が部分的に露呈して且つ露呈部分が周回方向に遷移させることができる。

例えば、撹拌装置が、培養容器を保持するステージと、鉛直方向に延在する回転中心軸を中心にして回転する回転テーブルを備えるロータリーアクチュエータと、ステージを支持し、水平方向に延在する第１の揺動軸と水平方向に延在して且つ第１の揺動軸に直交する第２の揺動軸とを中心にして揺動可能であって、且つ連結シャフトを備える揺動ヘッドと、揺動ヘッドの連結シャフトに摺動可能に外挿されて揺動ヘッドに連結する揺動ヘッド連結部、ロータリーアクチュエータの回転テーブルに取り付けられるベース部、および揺動ヘッド連結部に回動可能に固定された一端とベース部に回動可能に固定された他端とを備えるリンクアームを含む傾動機構と、ロータリーアクチュエータを鉛直方向に昇降させるロータリーアクチュエータ昇降機構と、を備える。これにより、培養容器の内部空間で培養液を周回させて、培養容器の内部空間の底面が部分的に露呈して且つ露呈部分が周回方向に遷移させることができる。

培養装置が、培養液内の溶存酸素濃度を測定する溶存酸素測定器を有し、測定された溶存酸素濃度に基づいて、培養容器の内部空間の底面における露呈部分の面積および該露呈部分の遷移速度の少なくとも一方を制御してもよい。これにより、培養液内のガス溶存量を適切に調節することができる。

培養装置が、培養液のｐＨ値を測定するｐＨ測定器を有し、測定されたｐＨ値に基づいて、培養容器の内部空間の底面における露呈部分の面積および該露呈部分の遷移速度の少なくとも一方を制御してもよい。これにより、培養液のｐＨ値を適切に制御することができる。

例えば、培養容器の内部空間が環状であってもよい。これにより、培養液が培養容器の内部空間で周回しやすくなる。

例えば、培養容器が可撓性の培養バッグであってもよい。これにより、培養容器の位置姿勢を、例えばガラス製の重い培養容器に比べて、変更しやすくなる。すなわち、その内部空間内の培養液を撹拌しやすくなる。

培養対象が、浮遊細胞または浮遊馴化された接着細胞であってもよい。

本発明の別態様の培養方法は、培養液を収容する培養容器の内部空間に単一ガスまたは混合ガスを供給し、培養容器内で培養液を周回させて、培養容器の内部空間の底面が部分的に露呈して且つ露呈部分が周回方向に遷移していくように、培養容器の位置姿勢を変更して培養液を撹拌する。

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。

図１は、本発明の一実施の形態に係る培養装置を概略的に示している。なお、図面においてＸ−Ｙ−Ｚ直交座標系が示されているが、これは発明の実施の形態の理解を容易にするためのものであって発明を限定するものではない。また、Ｘ軸方向およびＹ軸方向は水平方向であって、Ｚ軸方向は鉛直方向である。

図１に示すように、培養装置１０は、培養対象が懸濁した培養液を収容する培養容器１００と、培養容器１００内の培養液を撹拌するための撹拌装置２０とを有する。まず、培養容器１００について説明する。

図２は、培養容器１００の概略的な斜視図である。図３は、培養容器１００の上面図である。

図２に示すように、培養容器１００は、本実施の形態の場合、細胞などの培養対象の培養が行われる袋体である。以下、培養バッグと称する。本実施の形態の場合、培養バッグ１００は、シングルユースを考慮して、廃棄時に圧縮することができるように、ポリエチレンやエラストマー材料などの可撓性材料から作製されている。また、ガラス製の培養容器に比べて軽量であるために、後述するように、位置姿勢を変更しやすい、すなわち培養バッグ１００内の培養液を撹拌しやすい。

培養バッグ１００は、細胞などの培養対象が一定の濃度（数）で懸濁された培養液（細胞懸濁液）を収容して培養を行うための培養部１０２と、培養部１０２を保持するシート状のブラケット部１０４とを有する。なお、本実施の形態の場合、培養対象として、撹拌が必要な浮遊細胞が培養液に懸濁している。

培養バッグ１００の培養部１０２は、図３に示すように、培養液を収容して培養を行う内部空間１０６を備えている。本実施の形態の場合、内部空間１０６は、培養液が周回可能な無端状の周回空間であって、環状、さらに言えば円形の縦断面を備える円環状（ドーナツ状）の空間である（図５参照）。

なお、ここで、環状の内部空間１０６について、いくつかの用語を定義する。まず、周回空間である環状の内部空間１０６の周回方向をＲと定義する。この周回方向Ｒを含む平面と直交する軸を、第３のバッグ軸Ｚｂと定義する。そして、周回方向Ｒを含む平面に含まれ、第３のバッグ軸Ｚｂと直交し、且つ、互いに直交し合う軸を、第１および第２のバッグ軸Ｘｂ、Ｙｂと定義する。

さらに、本実施の形態の場合、内部空間１０６は円環状であるため、第３のバッグ軸Ｚｂを、その円環形状の中心を通過する中心軸とする。また、第１および第２のバッグ軸Ｘｂ、Ｙｂ軸に沿ってシート状のブラケット部１０４は展開している。

培養バッグ１００の培養部１０２を保持するブラケット部１０４は、培養バッグ１００を撹拌装置２０に取り付けるためのブラケットとして機能する。そのために、本実施の形態の場合、培養バッグ１００のブラケット部１０４は、撹拌装置２０にねじ留めされるときに使用される通し穴１０４ａが複数形成されている。

なお、本実施の形態の場合、図２に示すように、培養部１０２は、ブラケット部１０４を貫通するように該ブラケット部１０４に設けられている。すなわち、培養部１０２は、ブラケット部１０４によって上半分１０２ａ（培養装置１０に取り付けられた状態のときに上側に位置する部分）と下半分１０２ｂとに分かれている。ただし、培養部１０２の内部空間１０６は、ブラケット部１０４を貫通している。

また、本実施の形態の場合、培養バッグ１００の培養部１０２には、複数のポート（ホース）１０８、１１０、１１２、１１４、および１１６が設けられている。

複数のポート１０８、１１０、１１２、１１４、および１１６それぞれは、培養部１０２の内部空間１０６内に連通している。

培養液ポート１０８は、培養液を培養部１０２の内部空間１０６に対して供給するおよび培養液を内部空間１０６から回収するときに使用されるポートである。培養液ポート１０８は、培養部１０２の上半分１０２ａに設けられている。

サンプリングポート１１０は、培養部１０２の内部空間１０６内で培養されている細胞のサンプルを取得するために使用される。このポート１１０を介して、培養バッグ１００から培養液（細胞懸濁液）を指定量採取することができる。この採取した懸濁液を顕微鏡等で観察することにより、培養の進行具合を知ることができる。例えば、顕微鏡を介して細胞の数をカウントすることにより、細胞の成長度合いを測定することができる。なお、サンプリングポート１１０は、例えばバルブ付きルアーロックコネクタなどを含むポートである。サンプリングポート１１０は、培養部１０２の下半分１０２ｂから延在してブラケット部１０４で開口している。

第１のガス供給ポート１１２は、培養部１０２の内部空間１０６内に培養に必要な酸素、二酸化炭素、またはこれらを含む混合ガスを供給するために使用されるポートである。例えば、空気に二酸化炭素を混合した混合ガス、窒素、酸素、二酸化炭素を所定の混合比で混合した混合ガスなどが、第１のガス供給ポート１１２を介して内部空間１０６に供給される。第１のガス供給ポート１１２は、培養部１０２の下半分１０２ｂから延在している。

排気ポート１１４は、培養部１０２の内部空間１０６内を排気するまたはその排気によって内部空間１０６内の圧力を調節するために使用されるポートである。排気ポート１１４は、培養部１０２の上半分１０２ａから延在している。

そして、第２のガス供給ポート１１６は、第１のガス供給ポート１１２と同様に、培養部１０２の内部空間１０６内に培養に必要な酸素、二酸化炭素、またはこれらを含む混合ガスを供給するために使用されるポートである。第２のガス供給ポート１１６は、培養部１０２の上半分１０２ａから延在している。例えば、第２のガス供給ポート１１６がメインに使用され、第１のガス供給ポート１１２が補助的に使用される。

なお、これらの複数のポート１０８、１１０、１１２、１１４、および１１６が設けられている培養部１０２上の位置は、培養バッグ１００の用途（培養の種類）によって変更されてもよい。また、第１および第２のガス供給ポート１１２、１１６および排気ポート１１４には、培養バッグ１００の内部空間１０６内への異物進入を抑制するためのフィルタが設けられている。

本実施の形態の場合、培養バッグ１００は、図４に示すように、トレイ２２に固定された状態で、撹拌装置２０に取り付けられる。培養バッグ１００は、そのブラケット部１０４に形成された複数の通し穴１０４ａを通過する複数のローレットねじ２４を介して、トレイ２２に固定される。

図４に示すＹｂ軸に沿った断面を示す図５に示すように、トレイ２２には、培養バッグ１００の培養部１０２の内部空間１０６内の温度を調節するためのヒータ２６が設けられている。

図１に示すように、撹拌装置２０は、トレイ２２が固定状態で載置されるステージ２８を備える。ステージ２８は、第１のバッグ軸Ｘｂが一方の水平軸であるＸ軸に対して平行に、且つ、第２のバッグ軸Ｙｂが他方の水平軸であるＹ軸に対して平行になるようにトレイ２２を保持する。

また、撹拌装置２０は、ステージ２８の姿勢を変更する、すなわちステージ２８に載置されたトレイ２２上の培養バッグ１００の姿勢を変更するために、複数のモータ３０、３２、３４を有する。

モータ３０は、トレイ２２を介してステージ２８に固定された培養バッグ１００を、その培養バッグ１００の第１のバッグ軸Ｘｂ（揺動軸）を中心として揺動させる揺動源である。

モータ３２は、トレイ２２を介してステージ２８に固定された培養バッグ１００を、その培養バッグ１００の第２のバッグ軸Ｙｂ（揺動軸）を中心として揺動させる揺動源である。

モータ３４は、トレイ２２を介してステージ２８に固定された培養バッグ１００を、その培養バッグ１００の第３のバッグ軸Ｚｂを中心として揺動させる揺動源である。

なお、ステージ２８は、第１〜第３のバッグ軸Ｘｂ、Ｙｂ、Ｚｂを中心として、ステージ２８上にトレイ２２を介して載置されている培養バッグ１００が揺動できるように、撹拌装置２０に搭載されている。

これらのモータ３０、３２、および３４により、トレイ２２を介してステージ２８に固定された培養バッグ１００は、その姿勢が変更される。それにより、培養バッグ１００の培養部１０２の内部空間１０６内の培養液が、その内部空間１０６内で撹拌される。

図６は、培養装置１０の制御系を示すブロック図である。

図６に示すように、培養装置１０は、第１および第２のガス供給ポート１１２、１１６を介して培養バッグ１００の内部空間１０６に酸素を含む混合ガスを供給する混合ガス供給装置５０を有する。また、撹拌装置２０は、モータ３０、３２、および３４を制御するモータ制御装置５２を有する。

混合ガス供給装置５０は、例えば、酸素を含む混合ガスを貯蔵するタンク（図示せず）と、タンクと第１および第２のガス供給ポート１１２、１１６との間に配置された流量調整弁（図示せず）とを含んでいる。なお、供給量を制御して培養バッグ１００の内部空間１０６に混合ガスを供給できるのであれば、混合ガス供給装置５０の形態は問わない。

撹拌装置２０のモータ制御装置５２は、例えば、モータ３０、３２、および３４に電力を供給することができ、メモリやＣＰＵが搭載された制御基板から構成される。また、モータ制御装置５２は、図１に示すように、モータ３０、３２、および３４それぞれの回転角度θｘ、θｙ、およびθｚを制御することにより、ステージ２８の姿勢を変更するように構成されている。すなわち、モータ制御装置５２はステージ２８の傾きを制御する。具体的には、培養バッグ１００の内部空間１０６内の培養液が撹拌するように、モータ３０、３２、および３４それぞれの回転角度θｘ、θｙ、およびθｚが制御される。

図７は、培養バッグ１００の内部空間１０６内の培養液を撹拌するための撹拌装置２０のモータ３０、３２、および３４の制御を示している。

図７に示すように、第１のバッグ軸Ｘｂを中心とするモータ３０の回転角度θｘは、所定の周波数（第１の周波数）で制御される。また、第２のバッグ軸Ｙｂを中心とするモータ３２の回転角度θｙは、所定の周波数（第２の周波数）で制御される。なお、図７に示すモータ制御において、モータ３４は停止している。すなわち、第３のバッグ軸Ｚｂを中心とするモータ３４の回転角度θｚはゼロで維持される。また、θｘがゼロのときには第２のバッグ軸Ｙｂは水平であって、θｙがゼロのときには第１のバッグ軸Ｘｂが水平である。

また、図７に示すように、回転角度θｘの周波数と回転角度θｙの周波数は、波長および振幅が同一である。所定の最大値（上限回転角度）θｍａｘと所定の最小値（下限回転角度）θｍｉｎとの間で、回転角度θｘ、θｙは変化する。なお、本実施の形態の場合、θｍａｘとθｍｉｎは同一の大きさである（絶対値が同一である）。

さらに、図７に示すように、回転角度θｘの周波数と回転角度θｙの周波数は、その位相が四分の一波長異なる。

図８は、図７に示す制御によって生じる培養液の撹拌の様子を示す培養バッグ１００の内部空間１０６の上面図および断面図を示している。断面図は、Ｚ−Ｘ平面に沿った断面を示している。

図８に示すように、図７に示すモータ制御によって培養バッグ１００の傾き方向が周期的に変化する。すなわち、培養バッグ１００の内部空間１０６において最も低い部分が周回方向Ｒに遷移していく。その結果として、培養液ＣＳは、培養バッグ１００の環状の内部空間１０６内を周回する（周回方向Ｒに流れる）。

培養液ＣＳが周回することにより、すなわち培養液ＣＳが培養バッグ１００の内部空間１０６の内壁面に沿って流れ続けることにより、培養液ＣＳに懸濁する細胞へのダメージが抑制される（培養液ＣＳが一方向に往復動する場合に比べて）。

具体的には、培養液ＣＳが往復動ではなく周回するために、その培養液ＣＳが内壁面に強く衝突することが抑制される。それにより、その衝突を原因とするせん断応力が大きい局所的な流れの発生が抑制され、その大きなせん断力による細胞へのダメージが抑制される。また、培養液ＣＳが内壁面に強く衝突することによる気泡の発生が抑制され、その結果、その気泡の破裂によって生じる衝撃を受けて細胞がダメージを受けることが抑制される。

また、図７に示すモータ制御により、図８に示すように、培養液ＣＳの周回とともに、培養バッグ１００の内部空間１０６の底面１０６ａが部分的に露呈し、その露呈部分が周回方向Ｒ１に遷移していく。すなわち、培養液ＣＳが、周回方向Ｒに連続することなく、一塊になって内部空間１０６を周回方向Ｒに移動する。

なお、本明細書で言う「底面の露呈」とは、その底面上の少なくとも一部に培養液の液膜が形成される程度に、底面が培養液から現出することを言う。例えば、底面が傾いても培養液が流れ落ちない程度に、培養液が底面に付着していることを言う。また、本明細書では、「底面の露呈」は、底面上に培養液が全く存在しない「底面の露出」と異なるものとして使用されている。なお、言い換えると、本実施の形態の場合、培養液の水平状態の液面に比べて高い位置に存在する底面の部分が露呈部分に該当する。

培養液ＣＳの周回によって培養バッグ１００の内部空間１０６の底面１０６ａの一部が露呈するように、モータ３０、３２の回転角度θｘ、θｙの最大値θｍａｘと最小値θｍｉｎが設定されている。すなわち、底面１０６ａの一部が露呈するまで培養バッグ１００が傾くように、θｍａｘとθｍｉｎが設定されている。

このように、培養バッグ１００の内部空間１０６の底面１０６ａの一部を露呈させる、すなわち培養液ＣＳの液膜を形成する理由は、酸素を培養液ＣＳに十分に且つ全体にわたって溶存させるためである。具体的には、培養バッグ１００内において、好ましくは培養液バッグ１００内の気相の酸素（溶存していない培養液ＣＳ外部の酸素）の分圧で平衡状態を維持しつつ、培養液ＣＳ内の溶存酸素量（単位時間あたり）が培養液ＣＳ内の培養細胞の酸素消費量（単位時間あたり）に比べて多い状態を該培養液ＣＳの全体にわたって維持するためである。

具体的に説明すると、培養液ＣＳへの酸素の溶存は、培養液ＣＳの液面で行われる。このとき、単位時間当たりの培養液ＣＳへの酸素の溶存量（酸素移動速度ＯＴＲ：ＯｘｙｇｅｎＴｒａｎｓｆｅｒＲａｔｅ）は、培養液ＣＳの深さが浅いほど多い。これは、二重境膜説に基づいている。その二重境膜説について、図９を参照しながら説明する。

二重境膜説によれば、気相から液相への単位時間当たりの酸素の移動量である酸素移動速度ｖは、数式１のように定義される。

ここで、ｋ_Ｌは酸素移動係数（ｍ・ｓ^−１）であり、ａは単位容積当たりの気液接触面積（ｍ^−１）である。ｋ_Ｌａは、酸素移動容量係数と呼称されている。また、Ｃ^*は液体中の飽和酸素濃度（ｍｏｌ・ｍ^−３）であり、Ｃは液体中の溶存酸素濃度（ｍｏｌ・ｍ^−３）である。また、酸素移動容量係数ｋ_Ｌａは、数式２のように定義される。

ここで、Ａは気液接触面積（ｍ^２）であり、Ｖは液体の容積（ｍ^３）であり、ｈは液体の深さ（ｍ）である。

数式１および数式２を参照すると、気相から液相への酸素移動速度は、酸素が溶け込める余地が大きいほど高く、液体の深さが小さいほど高い。

本実施の形態に当てはめると、培養液ＣＳの深さが浅いほど、酸素が培養液ＣＳにより早く溶け込める。すなわち、図１０（ａ）に示すように、培養バッグ１００の内部空間１０６の底面１０６ａにおける露呈部分上の培養液ＣＳの液膜部分ＬＦでは、液膜ではない残りの培養液の深み部分ＬＤ（液膜の厚さに比べて大きい深さを備える部分）に比べて（単位時間当たり且つ単位液面面積当たり）、より早く酸素が溶け込むこむことができる。

培養バッグ１００の内部空間１０６の底面１０６ａが水平になるにしたがって、培養液ＣＳがその底面１０６ａにおける露呈部分を掃引していく。すなわち、露呈部分における培養液ＣＳの液膜部分ＬＦが、培養液ＣＳの深み部分ＬＤに吸収されていく。そして、図１０（ｂ）に示すように、底面１０６ａが水平になると、培養液ＣＳの深さは一様になり、液膜部分ＬＦに溶け込んだ溶存酸素は培養液ＣＳの深部（底面１０６ａ近傍の部分）に分配される。それにより、培養液ＣＬの液面ＬＳから深部にわたって溶存酸素がいきわたる。その結果、培養液ＣＳを撹拌しつつ、培養液ＣＬに懸濁する細胞それぞれに対して十分量の酸素を供給することができる。

このような培養装置１０によれば、細胞にとって必要な培養液ＣＳの撹拌を行いつつ、細胞に必要な酸素を培養液ＣＳ内に十分に且つ全体にわたって溶存させることができる。したがって、酸素を培養液ＣＳに溶け込ませるためにスパージャーを使用する必要がなくなる。また、酸素を培養液に溶け込ませるために、必要以上に培養液ＣＳを撹拌する、すなわち培養バッグ１００を撹拌に必要な傾き以上に傾ける必要がなくなる。

なお、培養に必要な培養液ＣＳのｐＨ調整のために二酸化炭素が培養バッグ１００内に供給されている場合、酸素と同様に、二酸化炭素も培養液ＣＳに溶け込む。

また、本実施の形態１の場合、細胞の酸素消費量の変化に対応して培養液ＣＳ内の溶存酸素量を調節することが可能である。すなわち、培養液ＣＳ全体のみかけの酸素移動速度を調節することができる。

例えば、細胞の酸素消費量が増加して培養液ＣＳ内の溶存酸素量が減少した場合、培養バッグ１００の水平方向に対する傾き角度を大きくすることにより、すなわち培養バッグ１００の内部空間１０６の底面１０６ａにおける露呈部分の面積を大きく拡大することにより、培養液外部から培養液（露呈部分における液膜部分ＬＦ）内に移動する酸素量を増加させることができる。それにより、培養液ＣＳ内の溶存酸素量が増加する。ただし、これにより、無制限に溶存酸素量を増加させることができるわけではない。ヘンリーの法則により、培養液ＣＳ内の溶存酸素量は、培養バッグ１００内の気相の酸素（溶存していない培養液ＣＳ外部の酸素）の分圧に比例する。そのため、その酸素の分圧が一定である場合、一義的に溶存酸素量の最大値が決まる。したがって、培養液ＣＳ内の溶存酸素量が減少して平衡状態でなくなると、平衡状態に戻るまで、すなわち気相の酸素の分圧に対応する最大値になるまで、溶存酸素量を増加させることができる。

本実施の形態１の場合、モータ３０、３２の回転角度θｘ、θｙの振幅を調節することによって培養バッグ１００の内部空間１０６の底面１０６ａにおける露呈部分の面積を調節することができ、それにより溶存酸素量を調節することができる。

また、溶存酸素を培養液ＣＳ全体に分配する速度を調節することが可能である。

例えば、細胞の酸素消費量が急激に増加して培養液ＣＳ内の溶存酸素量が急激に減少した場合、上述したように溶存酸素量を増加させた後、その溶存酸素を速やかに培養液全体にいきわたらせる必要がある。この場合、培養バッグ１００の内部空間１０６の底面１０６ａにおける露呈部分の遷移速度を上げる、すなわち、露呈部分を掃引する培養液の掃引速度を上げる。これにより、露呈部分における培養液ＣＳの液膜部分ＬＦに溶存した溶存酸素が速やかに培養液全体にいきわたる。

本実施の形態１の場合、モータ３０、３２の回転角度θｘ、θｙの周波数を調節することにより、露呈部分の遷移速度、すなわち露呈部分を掃引する培養液の掃引速度を調節することができる。

培養バッグ１００の内部空間１０６の底面１０６ａにおける露呈部分の面積を調節するために、また露呈部分を掃引する培養液ＣＳの掃引速度を調節するために、すなわち培養液ＣＳ内の溶存酸素量の変化を検出するために、培養液ＣＳの溶存酸素量（濃度）を測定してもよい。培養液ＣＳ内の溶存酸素量は、例えば溶存酸素測定器によって測定することができる。培養期間が長い場合、使用する溶存酸素測定器は、定期的な隔膜の交換が必要な隔膜式の測定器よりは、長期の測定に適した蛍光式の測定器が好ましい。

蛍光式の溶存酸素測定器は、分子の蛍光発光現象を利用して溶存酸素量（濃度）を測定するように構成されている。具体的には、溶存酸素測定器のプローブが培養液内に設置される。プローブからは紫外線などが照射され、その照射を受けた（光エネルギーを吸収した）分子は基底状態から励起状態にされる。励起状態の分子は基底状態に戻るときに蛍光を発光する。このとき、酸素分子が近くに存在すると、光エネルギーを吸収して励起状態の分子は酸素分子にエネルギーを奪われ、それにより発光強度が低下する。酸素分子濃度が高いほど、発光強度はより低下する。このように酸素分子濃度に反比例に対応する発光強度を測定することにより、蛍光式の溶存酸素測定器は溶存酸素量を測定する。

このような溶存酸素測定器によって測定された溶存酸素濃度に基づいて、培養装置１０（そのモータ制御装置５２）は、培養バッグ１００の内部空間１０６の底面１０６ａにおける露呈部分の面積および該露呈部分の遷移速度の少なくとも一方を制御することができる。

同様に、培養液ＣＳのｐＨ値をｐＨ測定器を用いて測定し、その測定結果に基づいて、培養バッグ１００の内部空間１０６の底面１０６ａにおける露呈部分の面積および該露呈部分の遷移速度の少なくとも一方を制御してもよい。

例えば、細胞の酸素消費量が増加すると、それにともない細胞から排出される二酸化炭素量が増加する。それにより、培養液のｐＨが下がり、培養系に影響を与えることがある。この場合、露呈部分の面積を大きくして且つその遷移速度を高めるあるいは何れか一方の制御を実行することにより、培養液ＣＳ内の二酸化炭素濃度を、培養バッグ１００内の気相の二酸化炭素（溶存していない培養液ＣＳ外部の二酸化炭素）の分圧で平衡する濃度まで早急に低下させることができる。

以上、本実施の形態１によれば、細胞が懸濁された培養液を撹拌することによって培養を行う際に、培養対象へのダメージを抑制しつつ、酸素を培養液に十分に且つ全体にわたって溶存させることができる。

（実施の形態２）
本実施の形態２は、酸素などを培養液に溶存させる原理については上述の実施の形態１と同一であるが、培養容器および撹拌装置の構造について異なる。したがって、本実施の形態２を、異なる点を中心に説明する。

本実施の形態２の場合、図１１および図１２に示すように、培養装置２１０における培養容器３００は、環状凹部状の内部空間３０２ａを備える本体部３０２と、内部空間３０２ａを覆うカバー部３０４とを備える。本体部３０２は、剛体であって、例えば金属材料やアクリル樹脂材料などから作製されている。カバー部材３０４は、本体部３０２の内部空間３０２ａを覆う環状のプレートであって、ガス供給ポートなどのポート（図示せず）を備える。本体部３０２の内部空間３０２ａ内に培養液ＣＳが収容され、内部空間３０２ａ内で培養が行われる。

本実施の形態２の培養装置２１０における撹拌装置２２０は、培養容器３００を保持するステージ２２２と、鉛直方向（Ｚ軸方向）に延在する回転中心軸Ｃ０を中心にして回転する回転テーブル２２４ａを備えるロータリーアクチュエータ２２４とを備える。

ステージ２２２とロータリーアクチュエータ２２４は、揺動ヘッド２２６と傾動機構２２８とを介して駆動連結されている。

揺動ヘッド２２６は、ステージ２２２を支持し、水平方向（Ｘ軸方向）に延在する揺動軸Ｃ１と水平方向（Ｙ軸方向）に延在して該揺動軸Ｃ１に直交する揺動軸Ｃ２を中心にして揺動可能に、撹拌装置２２０に設けられている。また、揺動ヘッド２２６は、その下部に、傾動機構２２８を介してロータリーアクチュエータ２２４と駆動連結するための連結シャフト２２６ａを備えている。ステージ２２２が水平姿勢をとるとき、揺動ヘッド２２６の連結シャフト２２６ａは鉛直方向（Ｚ軸方向）に延在している。

傾動機構２２８は、揺動ヘッド２２６を介してステージ２２２を傾ける、すなわちステージ２２２上の培養容器３００を水平方向に対して傾けるためのリンク機構である。そのために、傾動機構２２８は、ベース部２３０と、揺動ヘッド２２６に連結する揺動ヘッド連結部２３２と、ベース部２３０と揺動ヘッド連結部２３２とを連結するリンクアーム２３４とを含んでいる。

傾動機構２２８のベース部２３０は、ロータリーアクチュエータ２２４の回転テーブル２２４ａに取り付けられている。そのため、ロータリーアクチュエータ２２４が駆動すると、ベース部２３０は、回転テーブル２２４ａとともに、回転中心軸Ｃ０を中心にして回転する。

傾動機構２２８の揺動ヘッド連結部２３２は、揺動ヘッド２２６の連結シャフト２２６ａに、例えば軸受を介することなどにより、摺動可能に外挿されている。

傾動機構２２８のリンクアーム２３４は、ベース部２３０と揺動ヘッド連結部２３２とを連結するように構成されている。具体的には、リンクアーム２３４は、揺動ヘッド連結部２３２に回動可能に固定された一端と、ベース部２３０に回動可能に固定された他端とを備える。リンクアーム２３４の一端の回動軸Ｃ３と他端の回転軸Ｃ４それぞれは、水平方向に延在し、互いに平行である。

傾動機構２２８のベース部２３０が取り付けられているロータリーアクチュエータ２２４は、ボールねじ機構２３８によって鉛直方向（Ｚ軸方向）に昇降される。

ボールねじ機構２３８は、鉛直方向（Ｚ軸方向）に延在するねじシャフト２４０と、ねじシャフト２４０に係合するナット２４２と、ネジシャフト２４０を回転させるモータ（図示せず）とを含んでいる。ナット２４２は、昇降ブラケット２４４に取り付けられている。その昇降ブラケット２４４にロータリーアクチュエータ２２４が取り付けられている。

ボールねじ機構２３８が駆動すると、ナット２４２を介して、昇降ブラケット２４４とともにロータリーアクチュエータ２２４が昇降する。例えば、図１３に示すように、ボールねじ機構２３８によってロータリーアクチュエータ２２４が上昇すると、傾動機構２２８を介してステージ２２２が傾く。具体的には、ロータリーアクチュエータ２２４に取り付けられた傾動機構２２８のベース部２３０が上昇し、それによりリンクアーム２３４が揺動ヘッド連結部２３２を押す。それにより、揺動ヘッド連結部２３２とともに揺動ヘッド２２６が、揺動軸Ｃ１、Ｃ２の少なくとも一方（図１３では揺動軸Ｃ２）を中心として回転する。それにより、ステージ２２２が傾き、そのステージ２２２に保持された培養容器３００の内部空間３０２ａの底面３０２ｂが部分的に露呈する。

図１３に示すように、底面３０２ｂが部分的に露呈するようにステージ２２２が傾いた状態でロータリーアクチュエータ２２４が駆動して回転テーブル２２４ａが回転すると、傾動機構２２８が回転軸Ｃ０を中心にして回転し、それによりステージ２２２の傾き方向が変化する。その結果として、培養液ＣＳが周回して、培養容器３００の内部空間３０２ａの底面３０２ｂにおける露呈部分が遷移する。

本実施の形態２の場合、１つのロータリーアクチュエータ２２４の回転によって培養容器３００の内部空間３０２ａの底面３０２ｂにおける露呈部分が遷移（周回）する。これに対して、上述の実施の形態１の場合、２つのモータ３０、３２の同期回転によって培養バッグ１００の内部空間１０６の底面１０６ａにおける露呈部分が周回する。本実施の形態２の場合、１つのロータリーアクチュエータ２２４を制御するだけでよいため、２つのモータ３０、３２を同期制御する上述の実施の形態１に比べて、制御系の構成や制御内容をシンプル化することができる。

本実施の形態２の場合も、上述の実施の形態１と同様に、培養液ＣＳ内の溶存酸素量や培養液ＣＳのｐＨ値を調節するために、溶存酸素測定器やｐＨ測定器が設けられてもよい。その溶存酸素測定器やｐＨ測定器の測定結果に基づいて、培養装置２１０は、培養バッグ容器３００の内部空間３０２ａの底面３０２ｂにおける露呈部分の面積および該露呈部分の遷移速度の少なくとも一方を制御することができる。

本実施の形態２の場合、ボールねじ機構２３８によってロータリーアクチュエータ２２４の高さ位置（Ｚ軸方向位置）を調節することにより、培養容器３００の傾き、すなわちその内部空間３０２ａの底面３０２ｂにおける露呈部分の面積を調節することができる。また、本実施の形態２の場合、ロータリ―アクチュエータ２２４の回転速度を調節することにより、露呈部分の遷移速度を調節することができる。

以上、本実施の形態２によれば、上述の実施の形態１と同様に、細胞が懸濁された培養液を撹拌することによって培養を行う際に、培養対象へのダメージを抑制しつつ、酸素を培養液に十分に且つ全体にわたって溶存させることができる。

以上、上述の実施の形態１および２を挙げて本発明を説明したが、本発明の実施の形態はこれらに限らない。

例えば、上述の実施の形態１の場合、培養対象は浮遊細胞であったが、接着細胞でも可能である。接着細胞の場合、マイクロキャリアに接着細胞を接着させ、接着細胞を浮遊馴化させる。

さらに、上述の実施の形態１および２の場合、培養が行われる培養容器１００、３００の内部空間は環状であったが、本発明の実施の形態はこれに限らない。少なくとも、培養液が周回できるのであれば、培養容器の内部空間は環状に限定されない。ただ、培養液が衝突することなくスムーズに周回するように、培養容器の内部空間の内周面は、角がない、すなわち連続した曲面が好ましい。

さらにまた、上述の実施の形態１の場合、撹拌装置２０は、図１に示すように、水平方向に延在して直交し合う第１のバッグ軸Ｘｂと第２のバッグ軸Ｙｂ軸とを中心とする揺動によって培養バッグ１００の姿勢を変更している。また、上述の実施の形態２の場合、図１１に示すように、揺動ヘッド２２６の揺動軸Ｃ１、Ｃ２を中心とする揺動によって培養容器３００の姿勢を変更している。すなわち、上述の実施の形態１および２の場合、培養容器を水平方向に対して傾けることによって内部空間の底面を部分的に露呈させ、その露呈部分が周回方向に遷移していくように培養容器の傾き方向を変更している。しかしながら、本発明に係る実施の形態はこれに限らない。少なくとも、培養容器の内部空間で培養液が周回して、培養容器の内部空間の底面が部分的に露呈して且つ露呈部分が周回方向に遷移していくのであれば、培養容器の姿勢のみならず位置も変更してもよい。

そして、上述の実施の形態１および２では、培養液への酸素の溶存について説明したが、本発明の実施の形態によって培養液に溶け込ませるガスは酸素に限定されない。例えば、二酸化炭素ガスのみ、酸素と二酸化炭素の混合ガスなどの培養に必要な単一ガスまたは混合ガスを培養液に溶け込ませてもよい。

すなわち、本発明の実施の形態に係る培養装置は、広義には、培養対象が懸濁した培養液を収容する内部空間を備える培養容器と、培養容器の内部空間に単一ガスまたは混合ガスを供給するガス供給装置と、培養容器の位置姿勢を変更して培養液を撹拌する撹拌装置と、を有し、撹拌装置が、培養容器の内部空間で培養液を周回させて、培養容器の内部空間の底面が部分的に露呈して且つ露呈部分が周回方向に遷移していくように、培養容器の位置姿勢を変更する、装置である。

また、本発明の実施の形態に係る培養方法は、広義には、培養液を収容する培養容器の内部空間に単一ガスまたは混合ガスを供給し、培養容器内で培養液を周回させて、培養容器の内部空間の底面が部分的に露呈して且つ露呈部分が周回方向に遷移していくように、培養容器の位置姿勢を変更して培養液を撹拌する、培養方法である。

本発明は、培養液を撹拌しながら行われる培養に適用可能である。

１０培養装置
２０撹拌装置
５０ガス供給装置（混合ガス供給装置）
１００培養容器（培養バッグ）
１０６内部空間
１０６ａ底面
ＣＳ培養液
Ｒ周回方向

Claims

培養対象が懸濁した培養液を収容する内部空間を備える培養容器と、
培養容器の内部空間に単一ガスまたは混合ガスを供給するガス供給装置と、
培養容器の位置姿勢を変更して培養液を撹拌する撹拌装置と、を有し、
撹拌装置が、培養容器を水平方向に対して傾けることによって培養容器の内部空間の底面を部分的に露呈させ、培養容器の内部空間で培養液を周回させて、露呈部分が周回方向に遷移していくように、培養容器の傾き方向を変更するように構成され、
撹拌装置が、
培養容器を保持するステージと、
鉛直方向に延在する回転中心軸を中心にして回転する回転テーブルを備えるロータリーアクチュエータと、
ステージを支持し、水平方向に延在する第１の揺動軸と水平方向に延在して且つ第１の揺動軸に直交する第２の揺動軸とを中心にして揺動可能であって、且つ連結シャフトを備える揺動ヘッドと、
揺動ヘッドの連結シャフトに摺動可能に外挿されて揺動ヘッドに連結する揺動ヘッド連結部、ロータリーアクチュエータの回転テーブルに取り付けられるベース部、および揺動ヘッド連結部に回動可能に固定された一端とベース部に回動可能に固定された他端とを備えるリンクアームを含む傾動機構と、
ロータリーアクチュエータを鉛直方向に昇降させるロータリーアクチュエータ昇降機構と、を備える、培養装置。
培養液内の溶存酸素濃度を測定する溶存酸素測定器を有し、
測定された溶存酸素濃度に基づいて、培養容器の内部空間の底面における露呈部分の面積および該露呈部分の遷移速度の少なくとも一方を制御する、請求項１に記載の培養装置。
培養液のｐＨ値を測定するｐＨ測定器を有し、
測定されたｐＨ値に基づいて、培養容器の内部空間の底面における露呈部分の面積および該露呈部分の遷移速度の少なくとも一方を制御する、請求項１または２に記載の培養装置。
培養容器の内部空間が環状である、請求項１から３のいずれか一項に記載の培養装置。
培養容器が可撓性の培養バッグである、請求項１から４のいずれか一項に記載の培養装置。
培養対象が、浮遊細胞または浮遊馴化された接着細胞である、請求項１から５のいずれか一項に記載の培養装置。