JP6875998B2 - 生物学的組織試料の分子プロファイルの空間マッピング - Google Patents

Description

高分解能で組織試料の核酸の空間マッピングを可能にする方法が提示される。当該方法は、組織情報を考慮に入れた、試料内の核酸に結合するバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドプローブのパターンの適用に基づく。

現在、病理学者は、様々な形の組織及び細胞の顕微鏡検査を行っている。顕微鏡画像は、診断に対する基礎である形態学（例えば細胞型、分化等）に関する情報を明らかにする。病理学者が組織／細胞をより詳細に検査することを望む場合、乳癌の場合にはＥＲ、ＰＲ及びＨＥＲ２等、バイオマーカー特異的染色プロトコルが使用される。特定の分子試験が、ＤＮＡ及びＲＮＡに対していわゆるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによってｉｎ ｓｉｔｕで実行される。しかし、標的の数は、そのようなアプローチでは限られている。改善された層別化のために、配列決定（例えばＳａｎｇｅｒ又は次世代シーケンシング）及び発現プロファイリング（例えば、マイクロアレイ、ＲＮＡｓｅｑ、ＲＴ−ＰＣＲ）の助けを借りて、遺伝子発現（例えばＯｎｃｏＴｙｐｅＤＸ、Ｍａｍｍａｐｒｉｎｔ）を試験するか、又は、ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ等のような実行可能な突然変異を探すよう分子診断試験が実行される。

腫瘍組織は組成が不均一であり、間質細胞及び浸潤免疫細胞によって囲まれている。この空間的不均一性は、腫瘍細胞のＤＮＡ及びＲＮＡが、分析によって標的にされていない細胞からのＤＮＡ及びＲＮＡによって希釈されるため、分子分析に影響を及ぼし得る。この問題を克服するために、組織／細胞の関心領域（ＲＯＩ）がスライド上で選択され、さらに、例えば、かき取り又は（レーザーキャプチャ）顕微解剖技術によってスライドから取り出されて、分子アッセイ及び／又はプロテオミクスアッセイ（タンパク質組成物等）において処理及び分析される。ＲＯＩを収集している間、限られた位置情報のみが記憶され、さらに、収集される材料は異なるＲＯＩから生じるか、又は、ＲＯＩは、プールされ、その後、共に分析されることが多くある。レーザーキャプチャ顕微解剖の場合、小さな領域を別々に収集することができるが、これは時間がかかり、さらに、組織／細胞の系統的分析を可能にしない。分子分析は、時間がかかり且つ高価である。分子プロファイルのより高い分解能のマッピングのために、これは、臨床診療には高すぎる費用を伴う多数の分子試験をもたらす。腫瘍の不均一性及び組織構造は、さらに、腫瘍のクローン進化及びその攻撃性についての手がかりを提供することができるため、有望な診断パラメータであり得る。従って、さらなる分子分析を行うためにスライドからＲＯＩを取り除くことにより、この情報は失われる。

不均一性マップが、分子バイオマーカー及びタンパク質バイオマーカーに対するｉｎ ｓｉｔｕ染色に基づき作製されてきた。例えば、非特許文献１を参照されたい。異なるアプローチが、非特許文献２及び非特許文献３によって記載されており、ここでは、組織片がウェルプレートに圧入され、各ウェルにおいて、単一のｑＰＣＲ又はＲＴ−ｑＰＣＲ反応が行われた。その後、増幅された標的の２Ｄマップが生成された。

特許文献１は、組織試料が配置される基板上のプローブアレイを記載している。プローブは標的核酸に結合し、さらに、結合したプローブ及び標的核酸は抽出され、分子診断に使用される。

ＵＳ２０１４００６６３１８ Ａ１

Ａｌｍｅｎｄｒｏ，ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，６：５１４−５２７ Ａｒｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ Ｃｈｉｐ，２００９，９（２４）：３５２６−３５３４ Ａｒｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２０１１，４００：３３８３−３３９３ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ５４（１２）：１４１３−２３ Ｐ．Ｇｉｌｌ ａｎｄ Ａ．Ｇｈａｅｍｉ，２００８，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２７（３）：２２４−２４３ Ｔｕｌｌｉｓ ａｎｄ Ｒｕｂｉｎ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８０，１０７（１）：２６０−２６４）

本願において本発明者等は、１つの試料あたりの多重化ＲＯＩを効率的に使用することによって次世代シーケンシングから利用可能な多重化度を犠牲にすることなく、核酸の高空間分解能マッピングを可能にするアプローチを記載している。本発明の方法は、組織情報を考慮に入れた、バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドプローブのパターンの適用に基づいており、オリゴヌクレオチドプローブは試料内の核酸に結合する。様々な適用技術を使用することができ、さらに、特定のピッチを有する通常のアレイ、又或いは、形状の拘束なしに関心のある画定された領域を用いたオブジェクトベースのパターニングのような、異なるパターニングの方法を利用することができる。

本発明の鍵となる態様は、ＲＯＩの同定であり、組織情報及び回答すべき質問に基づき個々にパターンの空間分解能を明らかにすることである。関心領域だけでなく、パターンの空間分解能も、試薬の適用前の組織の画像に基づく分析に応答して選ぶことができる。少なくとも１つのＲＯＩを同定し、さらに、ＲＯＩに対してオリゴヌクレオチドプローブを提供することのみによって、より少ない種のオリゴヌクレオチドプローブが、空間マップを提供するために要求される。さらに、アレイのフォーマットに制限されることなく個々に空間分解能パターンを設計することは、使用されることになるオリゴヌクレオチドプローブの数が個々に決定されるのを可能にする。従って、本発明の方法は、一般的な従来技術の方法よりもはるかに安価であり、さらに、選択的プロファイリングに適合性がある。

本発明の方法の別の利点は、現在のデジタルパソロジーワークフローに円滑に適合するということである。一般的なデジタルパソロジーワークフローは：
１．ヘマトキシリン及びエオシン染色の染色スライドの調製、
２．デジタル画像を得るためのヘマトキシリン及びエオシン染色スライドの走査、
３．病理学的診断（良性又は悪性）に到達するための画像解析の実行、及び、
４．より正確な診断結果を提供するための、さらなる分子診断のためのＲＯＩの同時の同定、
である。

本発明は、組織試料内の核酸を空間的に検出する方法に関し、当該方法は：
試料内の少なくとも１つの関心領域（ＲＯＩ）を同定するステップ；
少なくとも１つの種のオリゴヌクレオチドプローブを、ＲＯＩ内の既定の位置の上に加え、さらに、オリゴヌクレオチドプローブが試料の核酸に結合するのを可能にするステップであり、オリゴヌクレオチドプローブはバーコード配列を含む、ステップ；
核酸−オリゴヌクレオチドプローブの複合体を抽出するステップ；
抽出された核酸の分子を配列決定するステップ；
配列決定された核酸の分子を、ＲＯＩ内の対応する標的核酸分子の最初の位置に関連づけて、標的核酸分子の空間分布を生成するステップであり、各位置が、ステップ（ｂ）において結合する１つ又は複数の種のオリゴヌクレオチドプローブによって同定される、ステップ；
を含む。

一実施形態において、ステップ（ｄ）に先立ち、ＤＮＡ分子が、ＤＮＡ増幅を介して核酸−オリゴヌクレオチドプローブの複合体から生成される。

別の実施形態において、ＤＮＡ分子の生成は、逆転写反応の後で生じる。

一実施形態において、ステップ（ｂ）における試料の核酸に対するオリゴヌクレオチドプローブの結合は、ハイブリダイゼーションを介して生じ、オリゴヌクレオチドプローブは、プライマーとして使用される。

代替的な実施形態において、ステップ（ｂ）における試料の核酸に対するオリゴヌクレオチドプローブの結合は、ライゲーションを介して生じる。

一実施形態において、ステップ（ｅ）は、標的核酸分子の空間分布を、ステップ（ｂ）の前又は後で得られたＲＯＩの画像又はＲＯＩが同定された組織試料の画像と関連づけるステップをさらに含む。

一実施形態において、当該方法は、二次元の空間マップを提供して標的核酸分子の空間分布を可視化するステップをさらに含む。

一実施形態において、当該方法は、二次元の空間マップを、ステップ（ｂ）の前又は後で得られたＲＯＩの画像又はＲＯＩが同定された組織試料の画像でオーバーレイするステップをさらに含む。

一実施形態において、ステップ（ｂ）において、少なくとも２つの異なる種のオリゴヌクレオチドプローブが１つの標的核酸分子に結合され、少なくとも２つの異なる種のオリゴヌクレオチドプローブの独特な組み合わせが、ＲＯＩ内の標的核酸分子の位置を同定するために使用される。

一実施形態において、１つの核酸分子に結合するオリゴヌクレオチドプローブの種のうち少なくとも１つが一般配列（ｇｅｎｅｒｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含み、任意選択で、一般配列は標的核酸に相補的である。

一実施形態において、１つの核酸分子に結合するオリゴヌクレオチドプローブの種のうち少なくとも１つが追加的配列を含み、追加的配列は、精製配列（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）又はプライマーアライメント配列である。

一実施形態において、既定の位置は、セパレーションマスク（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍａｓｋ）によって画定される。

一実施形態において、セパレーションマスクは、任意選択で試料の上に印刷されるトップセパレーションマスクであるか、又は、フルセパレーションマスクであり、セパレーションマスクは、格子のセパレーションマスク、自由形状のセパレーションマスク又はその組み合わせである。

一実施形態において、加えられるオリゴヌクレオチドプローブが異なる既定の位置間で混合しないように、オリゴヌクレオチドプローブは、液体移送技術によって、好ましくは、コンタクトプリント技術又はノンコンタクトプリント技術によって、既定の位置の上にステップ（ｂ）において加えられる。

一実施形態において、試料は、病理組織学的検体、好ましくは、脱パラフィンされたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料、新鮮凍結（ＦＦ）試料若しくは新鮮試料、又は、細胞学的試料である。

一実施形態において、標的核酸分子はＲＮＡである。

一実施形態において、標的核酸分子はＤＮＡである。

本発明の概要を示した図である。（Ａ）支持材料１及び組織試料２が上面図において示されており、さらに、小さなパネルで側面図において示されている。（Ｂ）組織試料の上にセパレーションマスクが適用されて、既定の位置７をもたらしている。描かれているセパレーションマスクは、格子のセパレーションマスク３及び自由形状のセパレーションマスク４を組み合わせている。しかし、格子のセパレーションマスク及び自由形状のセパレーションマスク４は、個々に適用することもできる。異なる断面構造を有する２つのタイプのセパレーションマスクが、側面図を提供するパネルにおいて示されており：（ａ）トップセパレーションマスク５、（ｂ）フルセパレーションマスク６が示されている。（Ｃ）オリゴヌクレオチドプローブが、組織試料の既定の位置の上に液相で加えられた。パネルは側面図を提供しており：（ａ）トップセパレーションマスク５、（ｂ）フルセパレーションマスク６を提供している。 ライゲーションを介して結合するオリゴヌクレオチドプローブの例証的な組成物を示した図である。核酸１２に結合した、一般配列９、バーコード配列１０ａ及び１０ｂをそれぞれ含み、さらに、追加的配列１１を含む２つ種のオリゴヌクレオチドプローブ８ａ及び８ｂが示されている。 （ｈｔｔｐ：／／ｒｎａｓｅｑ．ｕｏｒｅｇｏｎ．ｅｄｕ／＃ｌｉｂｒａｒｙ−ｐｒｅｐ−ａｄｄｉｔｉｏｎ−ｏｆ−ａｄａｐｔｅｒｓ−ｖｉａ−ｌｉｇａｔｉｏｎから適応した）標準的なオリゴヌクレオチドプローブのライゲーション反応スキームを示した図である。核酸は、断片化されたＲＮＡである。第１のステップにおいて、１つの種のオリゴヌクレオチドプローブがＲＮＡの３´末端に連結される。第２のステップにおいて、別の種のオリゴヌクレオチドプローブがＲＮＡの５´末端に連結される。第３のステップにおいて、逆転写反応を介してｃＤＮＡが生成され、次世代シーケンシングに対する配列（ＮＧＳ−アダプター）を含むプライマーが、オリゴヌクレオチドプローブのプライマーアライメント配列にハイブリダイズする。第４のステップにおいて、ｃＤＮＡがＰＣＲによって増幅される。 増幅曲線を示す図である。

本明細書及び付随の特許請求の範囲において使用されている場合、不定冠詞を伴う単数形は、何か他に明確に述べられていない限りその複数形も含む。

本発明と関連して、「約」及び「ほぼ」という用語は、くだんの特徴の技術的効果を依然として保証すると当業者が理解するであろう正確さの差を示している。この用語は、典型的には、±２０％、好ましくは±１５％、より好ましくは±１０％、及び、さらにより好ましくは±５％の示された数値からの偏差を示している。

「含む」という用語は限定的ではないということが理解されたい。本発明の解釈上、「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｏｆ）」という用語の好ましい具体化であると考慮される。以後、群が少なくとも特定数の具体化を含むよう規定される場合、これは、好ましくはこれらの具体化から成る群のみを包含するとも意味する。

さらに、本明細書及び特許請求の範囲において「第１」、「第２」、「第３」、又は、「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」等の用語は、類似の要素を区別するために使用され、必ずしも順番又は時系列順を記述するために使用されているのではない。そのように使用されている用語は、適切な状況下で交換可能であり、本明細書において記述されている本発明の実施形態は、本明細書に記述又は例示された順序以外の順序で操作できることが理解されたい。

「第１」、「第２」、「第３」、又は、「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」、「ｉ」、「ｉｉ」等の用語が方法又は使用又はアッセイのステップに関する場合、ステップ間の時間又は時間間隔の一貫性はなく、すなわち、ステップは、同時に実行することができるか、又は、本明細書において上記又は下記に定められたように本願において示されていない限り、そのようなステップ間には秒、分、時、日、週、月、若しくは年さえの時間間隔があってもよい。

本発明は、本明細書において記載される特定の方法論、プロトコル、試薬等は変わり得るためこれらに限定されないということが理解されたい。本明細書において使用される用語法は特定の実施形態を記載する目的のみにあり、付随の特許請求の範囲によってのみ限定されることになる本発明の範囲を限定すると意図されないことも理解されたい。定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

本発明は、試料内の核酸の空間マッピングに関する。

本明細書において使用される場合「空間マッピング」という用語は、標的核酸の、試料内のその空間的位置への割当に関する。空間マップは、組織試料内の多数の細胞からの転写情報又はゲノム情報を提供することができ、その情報は二次元空間分解能によって特徴付けられる。空間マップは、アレイに基づき作製されてもよく、又は、ＲＯＩの個々の特徴に基づき、並びに、試薬の適用前の組織の画像ベースの分析に応答してパターンを選ぶことができるため、独特な空間分解能を有してもよい。標的核酸の空間分布は、空間マップの可視化を提供するために、ＲＯＩの画像と、又は、ＲＯＩが同定された組織試料の画像と相関させてもよい。従って、本発明による方法は、組織情報を考慮に入れて答えられるべき質問に基づき設計され得る個別化された空間マップを提供する。

本明細書において使用される場合「核酸」という用語は、本明細書における方法を使用することによって検出され得るいかなる核酸分子も意味する。核酸分子は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）等の自然発生の核酸、並びに、例えば、化学的に合成されたか又は組換え遺伝子技術によって生成された核酸類似体等の人工的に設計された核酸（例えば、非特許文献４を参照）を含む。人工的に設計された核酸の特定の例には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又はロックド核酸（ＬＮＡ）が含まれる。自然発生の核酸の特定の例には、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ分子等のＤＮＡ配列、並びに、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ又はｒＲＮＡ分子等のＲＮＡ配列、又は、その逆の補体核酸配列が含まれる。核酸は、いかなる長さのものであってもよく、さらに、一本鎖又は二本鎖の分子であってもよい。本明細書において使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドもデオキシリボヌクレオチドも（すなわちＲＮＡ分子もＤＮＡ分子も）指すものとして理解されることになる。一実施形態では、核酸はＤＮＡである。別の実施形態では、核酸はＲＮＡである。

本明細書において使用される場合「標的にされた核酸」又は「標的核酸」という用語は、マップされることになる１つ又は複数の核酸を意味する。一実施形態では、標的核酸は、試料内の全ての核酸、好ましくは試料の全てのＤＮＡ又は全てのＲＮＡに関する。別の実施形態では、標的核酸は、例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ又はｒＲＮＡ等、試料内の特定のタイプの全ての核酸に関する。別の実施形態では、標的核酸は、１つ又は複数の特定の関心のある核酸である。関心のある核酸は、ゲノムのいかなる遺伝子、好ましくはヒトゲノムのいかなる遺伝子であってもよい。例えば、標的核酸は疾患に関連づけられてもよく、例えば、癌、炎症、細菌感染又はウイルス感染等の悪性疾患に関連づけられてもよい。そのような核酸の例として、病原体又は患部の細胞若しくは組織に特異的な又はそれらによって産生される核酸、並びに、サイトカイン又は抗原をコードする核酸等、疾患に応答して産生される核酸が挙げられる。標的にされた核酸は、あらゆるサイズを有し得る。一実施形態では、標的にされた核酸はＤＮＡである。別の実施形態では、標的にされた核酸はＲＮＡである。好ましい実施形態では、標的にされた核酸はＲＮＡであり、好ましくは試料の全てのｍＲＮＡである。

標的核酸は断片化されていてもよく、又は、無処置であってもよい。一実施形態では、標的核酸は断片化される。断片化された核酸は、例えば超音波処理又は超音波処置等の物理的方法、例えば制限酵素等のエンドヌクレアーゼを用いた化学的方法又は酵素的方法等、当技術分野において既知のあらゆる手段によって生成することができる。断片化は、組織試料内のＲＯＩを同定する前、その間又はその後に行われてもよい。一実施形態では、断片化は、組織を固定するステップにおいて達成される。例えば、試料の凍結又はホルマリンを用いた試料の固定化は、少なくとも部分的な核酸の断片化をもたらし得る。他の固定液でも類似の結果が得られ得る。断片化された核酸は、約２００００ヌクレオチドまでの長さであり得る。典型的には、断片化された核酸は、１０から１００００ヌクレオチドの長さであり、例えば、２０から２０００ヌクレオチド、３０から１０００ヌクレオチド又は５０から５００ヌクレオチドである。核酸の断片化により、全ての核酸が断片化されるわけではない。従って、断片化の後で、核酸は部分的に断片化され得る。好ましい実施形態では、核酸は少なくとも部分的に断片化される。別の実施形態では、核酸は無処置である。一実施形態では、標的にされた核酸は、断片化されたＤＮＡ又は断片化されたＲＮＡである。別の実施形態では、標的にされた核酸は無処置のＤＮＡ又は無処置のＲＮＡである。好ましい実施形態では、標的にされた核酸は、少なくとも部分的に断片化されたＲＮＡ、好ましくは試料の全てのｍＲＮＡである。

本明細書において使用される場合「核酸分子」という用語は、ＲＯＩ内の既定の位置に存在する１つの特定の核酸分子を指す。例えば、ＲＯＩ内の全てのｍＲＮＡが標的にされることになる実施形態では、核酸分子は１つのｍＲＮＡ分子を表す。

本明細書において使用される場合「試料」という用語は、例えば植物、動物、真菌、ヒト等のいかなる生物に由来し得るいかなる生物学的試料も、いかなるも人工の試料も意味する。好ましい実施形態では、試料は組織試料である。「組織試料」は、収穫された、培養された又は生検された組織試料又はその一部であってもよい。組織試料は、癌組織、炎症組織若しくは感染組織等の患部の組織、患部の組織に隣接する組織又は健康な組織に由来し得る。好ましい実施形態では、組織試料は、患部の組織又はそれに隣接する組織に由来する。

組織試料は、生物学的組織試料又は人工的組織試料であってもよい。「生物学的組織試料」は、自然発生の細胞のアンサンブルを指し、生検又は手術に由来する臨床的試料、細胞学的試料又は組織を形成する培養された細胞を含む。生物学的組織試料は、あらゆる従来の組織試料調製の方法によって調製することができる。一実施形態では、生物学的組織試料は病理組織学的検体である。別の実施形態では、生物学的組織試料は細胞学的試料である。「人工的組織試料」は、固体組織を自然に形成しない細胞、例えば血液細胞又は浮遊細胞の培養から調製される。人工的組織試料は、全血、リンパ又はＣＳＦ等の臨床的試料から得られた細胞浮遊液から、又は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法によって得られた細胞浮遊液から調製されてもよい。細胞は、ゲルマトリックス等のマトリックスにおいて捕捉され、さらに、例えば、非特許文献５によって記載されているような従来の方法によって切片化されてもよい。人工的組織試料は、単一の細胞層であってもよく、又は、多数の細胞層を含んでもよい。一実施形態では、人工的組織試料は、臨床的試料から得られた細胞浮遊液から調製される。別の実施形態では、人工的組織試料は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法によって得られた細胞浮遊液から調製される。好ましい実施形態では、組織試料は生物学的組織試料、好ましくは臨床的試料、さらにより好ましくは病理組織学的検体又は細胞学的試料である。

組織試料は、ほぼ１つの細胞又はそれ以下の厚さを有する細胞の層を有してもよい。一実施形態では、組織試料の厚さは、１つの細胞の断面の０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２又は０．１未満である。別の実施形態では、組織試料は、１つの細胞を超える厚さを有してもよい。一実施形態では、組織試料切片の厚さは、少なくとも約０．１μｍ、好ましくは少なくとも約０．２、０．３、０．４、０．５、０．７、１．０、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０μｍである。他の実施形態では、組織試料切片の厚さは、少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０又は５０μｍである。必要に応じて又は都合がよければ、より厚い試料を使用することもでき、例えば、組織試料は約７０又は１００μｍ以上の厚さを有してもよい。典型的には、組織試料切片の厚さは、約１〜１００μｍ、１〜５０μｍ、１〜３０μｍ、１〜２５μｍ、１〜２０μｍ、１〜１５μｍ、１〜１０μｍ、３〜１０μｍ、２〜８μｍ、３〜７μｍ又は４〜６μｍである。好ましい実施形態では、組織試料は３〜１０μｍの範囲の厚さを有する。組織試料の厚さは、本発明の方法に対して重要ではなく、その値は単なる代表的な値である。

組織試料は、約２ｃｍ^２のサイズを有してもよい。一実施形態では、組織試料は、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．５、１．７、２．０、２．５、３．０、３．５又は４．０ｃｍ、又は、その間のいかなる数の長さも有し、さらに、約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．５、１．７又は２．０ｃｍ又はその間のいかなる数の高さも有する。試料の高さ及び長さは交換可能である。特定の実施形態では、組織試料は２．０×４．０ｃｍの最大サイズを有する。別の実施形態では、組織試料は、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．５、１．７、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５又は８．０ｃｍ^２又はその間のいかなる数の面積も有する。好ましい実施形態では、組織試料は約２．０×４．０ｃｍの最大サイズを有し、好ましくは、組織試料は約１．０から５．０ｃｍ^２の範囲の面積を有し、より好ましくは、面積は約２．０ｃｍ^２である。

組織試料は、新鮮なもの、凍結したもの、固定されたもの又は固定されていないものであってもよい。一実施形態では、組織試料は新鮮試料である。別の実施形態では、組織試料は新鮮凍結試料である。さらに別の実施形態では、組織試料は固定組織試料である。当技術分野において既知のいかなる手順も、組織試料を凍結、固定又は包埋するために使用することができる。特に、いかなる既知の固定液又は包埋材料も使用することができる。一実施形態では、組織試料は、脱パラフィンされたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料である。好ましい実施形態では、組織試料は、病理組織学的検体のＦＦＰＥ試料、新鮮凍結試料又は新鮮試料、又は、細胞学的試料であり、好ましくは、病理組織学的検体のＦＦＰＥ試料である。

一態様では、本発明は、組織試料内の核酸を空間的に検出する方法に関し、当該方法は：
試料内の少なくとも１つの関心領域（ＲＯＩ）を同定するステップ；
少なくとも１つの種のオリゴヌクレオチドプローブを、ＲＯＩ内の既定の位置の上に加え、さらに、オリゴヌクレオチドプローブが試料の核酸に結合するのを可能にするステップであり、オリゴヌクレオチドプローブはバーコード配列を含む、ステップ；
核酸−オリゴヌクレオチドプローブの複合体を抽出するステップ；
抽出された核酸の分子を配列決定するステップ；
配列決定された核酸の分子を、ＲＯＩ内の対応する標的核酸分子の最初の位置に関連づけて、標的核酸分子の空間分布を生成するステップであり、各位置が、ステップ（ｂ）において結合する１つ又は複数の種のオリゴヌクレオチドプローブによって同定される、ステップ；
を含む。

本明細書において使用される場合「空間的に検出する方法」という用語は、標的核酸を検出し、さらに、試料内の上記の核酸の最初の位置を同定する方法に関する。

「標的核酸分子」は、ステップｂ）においてオリゴヌクレオチドプローブによって結合される試料の核酸分子に相当する。

関心領域（ＲＯＩ）は、当技術分野において既知のいかなる手順に従って得ることができる組織情報を考慮に入れて、組織試料において同定することができる。例えば、組織試料は、適したマーカーによって画像処理、染色又は標識されてもよい。一実施形態では、ＲＯＩは染色によって同定される。別の実施形態において、ＲＯＩは、適したマーカーを用いて標識することによって同定される。さらに別の実施形態では、ＲＯＩは、画像処理によって同定される。好ましい実施形態では、ＲＯＩは、画像解析に基づき同定される。画像解析は、自動又は手動で行うことができる。自動のＲＯＩ選択の場合、画像解析が必要とされる。画像解析を行う一般的な方法は全て使用することができる。

本明細書において言及される場合ＲＯＩは、同定されたＲＯＩの周囲の領域、すなわち、関心のあるものとして同定された領域に直接隣接する領域も含んでよい。ＲＯＩは、組織試料と同じサイズ（最大サイズ）と、格子のセルサイズ（最小サイズ）との間のいかなるサイズも有してよい。ＲＯＩのサイズは、組織試料よりも小さいということが好ましい。

組織試料において、少なくとも１つのＲＯＩを同定することができる。組織試料において、２つ以上のＲＯＩも同定することができる。例えば、組織試料は、２、３、４、５、１０又はそれ以上のＲＯＩを含んでもよい。異なるＲＯＩは、異なる手段によって同定することができ、例えば、ＲＯＩの一部は、自動的に画像解析ソフトウェアによって同定され、さらに、病理学者は手動でＲＯＩを示すこともできる。好ましい実施形態では、少なくとも１つのＲＯＩが組織試料において同定され、好ましくは、２つのＲＯＩが組織試料において同定され、より好ましくは、３つ以上のＲＯＩが組織試料において同定される。

特定の実施形態では、組織試料は、２つの層に切断することができる。１つの層の上に、画像処理ステップのためのラベルが加えられる。この参照層の画像に基づき、ＲＯＩが選択され、さらに、第２の層（核酸抽出スライド）に加えられる。第２の層の上では、バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドプローブの結合が実行される。当該方法は、例えば、オリゴヌクレオチドプローブの結合、核酸分子抽出又は配列決定等、以下のプロトコルのステップと適合性のないイメージングラベルを、参照スライド上で使用することができ、従って、組織試料の第２の層（核酸抽出スライド）上で実行される反応を妨げないという利点を有する。

本明細書において使用される場合「オリゴヌクレオチドプローブ」という用語は、バーコード配列を含む核酸分子を意味する。オリゴヌクレオチドプローブは、例えば、ＲＮＡプローブ又はＤＮＡプローブであってもよい。同一のバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドプローブは、「オリゴヌクレオチドプローブの種」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドプローブの各種は、独特なバーコード配列を含有する。バーコード配列は、ランダム配列の生成を使用して設計又は生成することができる。設計された又はランダムに生成された配列は、バーコード配列が核酸の捕捉を妨げないということを確実にするために分析されてもよい。バーコード配列は、試料内の核酸に連結することができる。バーコード配列はプライマーとして作用しない。バーコード配列は、約１〜８ヌクレオチドの範囲のサイズを有してもよい。

オリゴヌクレオチドプローブは、「一般配列」をさらに含んでもよい。一般配列は、標的にされる核酸にハイブリダイズさせることによって、試料内の核酸を捕捉するために使用することができる。一実施形態では、一般配列は、試料内の核酸の選択的増幅のために使用される。そのような実施形態では、一般配列は「プライマー配列」と呼ばれる。プライマー配列は、標的にされることになる試料内の核酸に相補的である。例えば、プライマー配列は、試料の全ｍＲＮＡが標的にされる場合にはポリＴ配列を含んでもよく、又は、プライマー配列は、特定の遺伝子の配列ストレッチに相補的なヌクレオチドを、上記の遺伝子によって発現される核酸のみが標的にされる場合には含んでもよい。代替的な実施形態では、一般配列は、試料内の核酸へのバーコード配列の安定したライゲーションを確実にするために使用される。すなわち、標的にされることになる配列内の核酸に一般配列が連結され得る。そのような実施形態では、一般配列は「ライゲーション配列」と呼ばれる。一実施形態では、バーコード配列が、試料内の核酸に直接連結され、一般配列は必要とされない。一実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも１つの一般配列を含む。一般配列は、約０〜１００ヌクレオチド、好ましくは０〜５０ヌクレオチド、より好ましくは０〜３０ヌクレオチド、さらにより好ましくは約５〜３０ヌクレオチドの範囲のサイズを有してもよい。

オリゴヌクレオチドプローブは、１つ又は複数の「追加的配列」をさらに含んでもよい。一実施形態では、追加的配列を使用して、核酸を濃縮する（「濃縮配列」）か、又は、核酸を精製する（「精製配列」）ことができる。別の実施形態では、追加的配列を使用して、核酸を濃縮且つ精製することができる。追加的配列は、次世代シーケンシングに使用されるアダプター等の配列決定プロセスのための配列、又は、選択若しくは同定のための配列であってもよい。一実施形態では、追加的配列は、プライマーが整列する配列（「プライマーアライメント配列」）であってもよい。オリゴヌクレオチドプローブがライゲーション配列を含む実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、プライマーアライメント配列をさらに含んでもよい。プライマー配列は、プライマーアライメント配列に相補的であってもよい。

オリゴヌクレオチドプローブは、スペーサーとも呼ばれる１つ又は複数のスペーサー配列をさらに含んでもよい。スペーサーは、オリゴヌクレオチドプローブの異なる配列要素間に配置することができる。スペーサーは、約０から２０ヌクレオチドの範囲のサイズを有してもよい。オリゴヌクレオチドプローブは、長さが約１５から１５０ヌクレオチドの間であってもよい。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、長さが約１５から１００ヌクレオチド、好ましくは約２０から５０ヌクレオチドである。

オリゴヌクレオチドプローブは、乾燥した形又は液体の形であってもよい。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、液相、好ましくは緩衝液又はインクにある。インクは、印刷に適したいかなる溶液も指す。オリゴヌクレオチドプローブが乾燥した形である実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは適用前に溶解される。

一実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、試料内の全てのＤＮＡ分子に結合する。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、トランスクリプトームの空間マップを提供するために、試料内の全てのＲＮＡ分子に結合する。別の好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ又は他の非翻訳領域のＲＮＡ等の特定のＲＮＡ分子のみに結合し、好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブはｍＲＮＡに特異的に結合する。

「オリゴヌクレオチドプローブが試料の核酸に結合するのを可能にする」という用語は、核酸−オリゴヌクレオチドプローブの複合体の作製を指す。試料の核酸へのオリゴヌクレオチドプローブの結合は、異なる方法によって達成することができる。

一実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、試料内の標的にされた核酸に連結される。このライゲーションは、バーコード配列又は一般配列（ライゲーション配列）を介して生じてもよい。従って、１つの好ましい一実施形態において、試料の核酸へのオリゴヌクレオチドプローブの結合は、ライゲーションを介して生じる。オリゴヌクレオチドプローブは、当技術分野において既知のいかなる方法によって標的核酸に連結されてもよい。例えば、ｍＲＮＡへのライゲーションはポリ−Ａテールを介して生じてもよく、ＤＮＡへのライゲーションは、オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする付着末端を生成する消化ステップの後に行われてもよい。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、（ｉ）ライゲーション配列、（ｉｉ）バーコード配列、及び任意選択で（ｉｉｉ）１つ又は複数の追加的配列を含む。異なる配列が、スペーサーによって分離されてもよい。さらに、追加的配列はまた、ライゲーション配列とバーコード配列との間に位置づけられてもよい。標的にされた核酸が増幅されることになる場合、プライマーアライメント配列が存在する。従って、別の特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、（ｉ）ライゲーション配列、（ｉｉ）バーコード配列、及び（ｉｉｉ）プライマーアライメント配列を含む。オリゴヌクレオチドプローブは、スペーサー及び／又はさらなる追加的配列を含んでもよい。配列は、増幅又は逆転写反応において、増幅されたＤＮＡ又はｃＤＮＡにバーコードがそれぞれ組み込まれるように、オリゴヌクレオチドプローブ内に配置される。別の好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、核酸に連結されるバーコード配列を含み、これに、１つ又は複数の一般配列及び／又は追加的配列が続いてもよい。

代替的な実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブはプライマー配列を含む。このシナリオでは、核酸の増幅及び／又は逆転写が要求される。従って、１つの好ましい実施形態では、試料の核酸へのオリゴヌクレオチドプローブの結合は、ハイブリダイゼーションを介して生じ、オリゴヌクレオチドプローブは、増幅又は逆転写のためのプライマーとして使用される。オリゴヌクレオチドプローブがプライマーとして作用する実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、（ｉ）プライマー配列、（ｉｉ）バーコード配列、及び、任意選択で（ｉｉｉ）１つ又は複数の追加的配列を含み、プライマー配列は増幅又は逆転写反応のためのプライマーとして作用する。オリゴヌクレオチドプローブは、スペーサー及び／又はさらなる追加的配列を含んでもよい。増幅又は逆転写反応において、増幅されたＤＮＡ又はｃＤＮＡ内にそれぞれバーコードが組み込まれるように、配列はオリゴヌクレオチドプローブ内に配置される。

試料内の核酸へのオリゴヌクレオチドプローブの結合は、上記の実施形態に限定されず、多数の他の方法を介して生じてもよいということが理解されたい。例えば、一般的なプライマーアライメント配列を標的にされた核酸に連結することができ、さらに、オリゴヌクレオチドプローブを増幅又は逆転写反応においてプライマーとして使用することができる。別の例は、消化後のＤＮＡの付着末端等、核酸へのライゲーションであってもよく、その上に、第２のライゲーション反応においてオリゴヌクレオチドプローブが連結される。当業者は、標的にされることになる核酸を捕捉するための異なる分子技術、及び、バーコード配列を組み込むための異なる選択肢を認識している。

試料内の核酸へのオリゴヌクレオチドプローブの結合は、ＲＯＩ内の既定の位置における核酸分子への１つ又は複数の種のオリゴヌクレオチドプローブの結合を包含する。一実施形態では、１つの種のオリゴヌクレオチドプローブが、ＲＯＩ内の各既定の位置の上に加えられる。従って、特定の実施形態では、１つの種のオリゴヌクレオチドプローブが、１つの既定の位置において１つの標的にされた核酸分子に結合する。このアプローチは、少数の既定の位置又は低い分解能のアプローチに好ましい。

別の実施形態において、少なくとも２つの異なる種のオリゴヌクレオチドプローブが、ＲＯＩ内の１つの既定の位置の上に加えられる。従って、特定の実施形態では、少なくとも２つの異なる種のオリゴヌクレオチドプローブが、１つの既定の位置において１つの標的にされた核酸分子に結合する。このアプローチは、１つの試料当たり多重ＲＯＩを効率的に使用する複雑な分子プロファイルの高空間分解能マッピングを可能にする。１つの特定の実施形態では、１つの核酸分子に結合するオリゴヌクレオチドプローブの種のうち少なくとも１つが、そのバーコード配列を介したライゲーションを介して結合する。別の特定の実施形態では、１つの核酸分子に結合するオリゴヌクレオチドプローブの種のうち少なくとも１つは一般配列を含み、任意選択で、一般配列は、標的にされた核酸に相補的である。例えば、１つの種のオリゴヌクレオチドプローブがライゲーション配列を含んでもよく、さらに、第２の種のオリゴヌクレオチドプローブが、核酸の増幅又は逆転写のためのプライマー配列を含んでもよい。別の例では、１つの種のオリゴヌクレオチドプローブは一般配列を含まなくてもよく、さらに、第２の種のオリゴヌクレオチドプローブは一般配列を含んでもよい。従って、一般配列を有さないオリゴヌクレオチドプローブは、そのバーコード配列を介したライゲーションを介して核酸分子に結合することができ、さらに、一般配列を有するオリゴヌクレオチドプローブは、そのプライマー又はライゲーション配列を介したハイブリダイゼーションを介して結合することができる。別の実施形態では、１つの核酸分子に結合するオリゴヌクレオチドプローブの種のうち少なくとも１つは、追加的配列を含み、追加的配列は、精製配列又はプライマーアライメント配列である。例えば、１つの種のオリゴヌクレオチドプローブは、ライゲーション配列及び精製配列を含んでもよく、さらに、第２の種のオリゴヌクレオチドプローブは、プライマー配列を含んでもよい。別の例では、１つの種のオリゴヌクレオチドプローブは、一般配列を含まなくてもよいが追加的配列を含んでもよく、さらに、第２の種のオリゴヌクレオチドプローブは、一般配列のみを含んでもよい。従って、一般配列を有さないオリゴヌクレオチドプローブは、そのバーコード配列を介したライゲーションを介して核酸分子に結合し、さらに、フォワードプライマーがハイブリダイズするプライマーアライメント配列を含んでもよく、さらに、一般配列を有するオリゴヌクレオチドプローブは、ハイブリダイゼーションを介して結合してもよく、ここで、一般配列はリバースプライマーとして作用する。１つの種のオリゴヌクレオチドプローブ内の配列の組み合わせは、上記の実施形態に限定されないということが理解されたい。当業者は、標的にされることになる核酸を捕捉し、さらに、それらに対応するバーコードを用いてマーキングするための多数の他の組み合わせが可能であるということを認識しているであろう。従って、標的にされた核酸を効果的にマークするのに適した少なくとも１つのさらなる種のオリゴヌクレオチドプローブと組み合わせた場合、１つの種のオリゴヌクレオチドプローブ内の配列のさらなる組み合わせが明示的に包含される。

オリゴヌクレオチドプローブが上に加えられる「既定の位置」は、ＲＯＩ内の１つ又は複数の位置を表す。研究者の質問に応じて、ＲＯＩ全体を別々の既定の位置に分割することができ、すなわち、１つの既定の位置が、境界を共有するように、別の既定の位置のすぐ隣にあるか、又は、ＲＯＩの一部を選択することができ、すなわち、ＲＯＩ内の既定の位置が、上にはプローブは加えられないＲＯＩ内の領域によって分離された島を表してもよい。好ましくは、既定の位置は、ＲＯＩ内の２つ以上の位置を指す。

一実施形態では、ＲＯＩ内の既定の位置は、例えば行及び列において系統的に配置される。一実施形態では、ＲＯＩは、少なくとも１、２、５、１０、５０、１００、５００、７５０、１０００、１５００、３０００、５０００、１００００、２００００、４００００、５００００、７５０００、１０００００、１５００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、７５００００、８０００００、１００００００又はそれ以上の既定の位置を含む。好ましい実施形態では、ＲＯＩは、少なくとも１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０又は１００の既定の位置を含み、好ましくは、ＲＯＩは少なくとも１０の既定の位置を含む。別の実施形態では、各既定の位置の面積は、約１μｍ^２、２μｍ^２、３μｍ^２、４μｍ^２、５μｍ^２、１０μｍ^２、１２μｍ^２、１５μｍ^２、２０μｍ^２、５０μｍ^２、７５μｍ^２、１００μｍ^２、１５０μｍ^２、２００μｍ^２、２５０μｍ^２、３００μｍ^２、４００μｍ^２又は５００μｍ^２であってもよい。各既定の位置に、独特な種のオリゴヌクレオチドプローブ又は独特な組み合わせの２つ以上の異なる種のオリゴヌクレオチドプローブが加えられる。２つ以上の種のオリゴヌクレオチドプローブが加えられる場合、異なる種のオリゴヌクレオチドプローブが各行に加えられ、さらに、異なる種のオリゴヌクレオチドプローブが各列に加えられるということが好ましい。例えば、行１は、行２におけるオリゴヌクレオチドプローブの種とは異なる１つの種のオリゴヌクレオチドプローブを含み、行２におけるオリゴヌクレオチドプローブの種は、次に、行３におけるオリゴヌクレオチドプローブとは異なる。列Ａは、行において加えられるオリゴヌクレオチドプローブの種のいずれとも異なるオリゴヌクレオチドプローブの種を含み、列Ｂは、さらなる異なる種のオリゴヌクレオチドプローブをここでも含む。列Ａ、行１（Ａ１）における既定の位置は、従って、Ａ２、Ｂ１又はＢ２等の組み合わせとは異なる独特な組み合わせのオリゴヌクレオチドプローブを有する。このアプローチを使用して、より少ない種のオリゴヌクレオチドプローブが利用され、アッセイのコストを削減する必要がある。例えば、サブＲＯＩ等の対角の位置又は自由に画定された既定の位置における異なる種のオリゴヌクレオチドプローブの添加等、さらなる種のオリゴヌクレオチドプローブが添加されてもよい。好ましい実施形態では、独特な組み合わせの少なくとも２つの種のオリゴヌクレオチドプローブ、好ましくは、独特な組み合わせの２つの種のオリゴヌクレオチドプローブが各既定の位置に加えられる。

代替的な実施形態では、ＲＯＩ内の既定の位置は自由に画定される。既定の位置の自由な配置は、ＲＯＩ内のさらなる関心のあるサブ領域（サブＲＯＩ）をいかなる制限もなく画定することができるという利点を有する。従って、等しいサイズの規則的な特徴を有する列及び行におけるアレイの従来の配置と比較して、自由な配置は、いかなる形状及びサイズの既定の位置、並びに、異なる形状及びサイズを有する異なる既定の位置を可能にする。例えば、組織試料において、ＲＯＩは、特定の細胞型の存在に基づき同定することができる。上記のＲＯＩ内では、さらなるサブＲＯＩを、形態学的特徴に基づき同定することができる。これらのサブＲＯＩは、異なる形状及びサイズを有するＲＯＩ内の別々の島を形成してもよい。ＲＯＩ内の既定の位置は、各サブＲＯＩが別の既定の位置を表すように画定されてもよい。そのようなシナリオでは、サブＲＯＩによってカバーされた領域を差し引いた残りのＲＯＩは関心のないものであり得、さらに、オリゴヌクレオチドプローブはこの領域には加えられないか、又は、この領域はさらなる既定の位置を表すことができる、又は、行及び列の系統的な配置によって既定の位置にさらに分割することができる。各既定の位置に、独特な種のオリゴヌクレオチドプローブ、又は、独特な組み合わせの２つ以上の種のオリゴヌクレオチドプローブを加えることができる。別の既定の位置を表すサブＲＯＩは、互いと異なっていてもよく、又は、部分的に重複してもよい。サブＲＯＩが部分的に重複する場合、重複の領域は、第１のサブＲＯＩに特異的な少なくとも１つの種のオリゴヌクレオチドプローブと、第２のサブＲＯＩに特異的な少なくとも１つの種のオリゴヌクレオチドプローブとの独特な組み合わせによって同定可能であるだろう。一実施形態では、少なくとも２つのサブＲＯＩが部分的に重複する。別の実施形態では、３つ以上のサブＲＯＩが部分的に重複する。さらに別の実施形態では、サブＲＯＩは重複しない。あらゆる情報を、サブＲＯＩを同定するために使用することができ、さらに、サブＲＯＩの同定は、ＲＯＩの同定によって得られる情報に限定されない。サブＲＯＩを同定するために使用することができる特徴は、細胞型、形態、色、透明度、例えば抗体、サイトカイン又は薬物等の特定の分子の有無、又は、患者から採取される前の組織試料の特定の領域への放射線の印加を含むが、それらに限定されない。

さらなる実施形態では、既定の位置は、マスクの適用によって画定される。マスクは「セパレーションマスク」であってもよい。セパレーションマスクは、ＲＯＩをマークするいかなるパターンも有し得る。一実施形態では、セパレーションマスクは、ＲＯＩの系統的な位置の特徴づけのために行及び列を提供する「格子のセパレーションマスク」である（図１）。別の実施形態では、セパレーションマスクは、ＲＯＩ及びサブＲＯＩの形状に基づく「自由形状のセパレーションマスク」であってもよい（図１）。別の実施形態では、セパレーションマスクは、図１において例証的に示されているように、格子のセパレーションマスクと自由形状のセパレーションマスクとの組み合わせであってもよい。

セパレーションマスクは、異なる方法で適用することができる。一実施形態では、セパレーションマスクは、好ましくは引っ掻き、レーザアブレーション、又は、金属グリッド等の物理的バリアを作製することによって、組織試料の全厚を通して適用される完全な溝（「フルセパレーションマスク」）を提供することによって、既定の領域を画定する。別の実施形態では、セパレーションマスクは、上部バリア（「トップセパレーションマスク」）を提供することによって既定の領域を画定する。トップセパレーションマスクは、物理的バリアによって既定の位置を画定することができる。トップセパレーションマスクは、所望の領域に試薬を閉じ込める構造化プロセス（「位置マスク」）によって、好ましくは位相幾何学的制約によって、又は、局所的に組織の水和性をパターン化することによって、既定の領域を画定することもできる。そのような層を構成するために、リソグラフィ技術を利用することができる。好ましい実施形態では、ＲＯＩの表面は、ＲＯＩの表面上で蒸発する薄い金層上の自己組織化膜（ＳＡＭ）で構造化される。ＳＡＭ層は、金層のエッチングにおいてエッチレジストとして使用される有機チオールのマイクロコンタクトプリンティングによって適用されてもよい。ＳＡＭは疎水性であり、さらに、インクジェット印刷中のオリゴヌクレオチドプローブの広がりを防ぐ。トップセパレーションマスクは、ＲＯＩの上部に印刷することもでき、インクは、物理的バリアとして作用する。図１は、側面図において、トップセパレーションマスク５及びフルセパレーションマスク６を例証的に示している。一実施形態では、既定の位置は、セパレーションマスクによって画定される。好ましい実施形態では、セパレーションマスクは、任意選択で試料の上に印刷されるトップセパレーションマスク又はフルセパレーションマスクであり、セパレーションマスクは、格子のセパレーションマスク、自由形状のセパレーションマスク又はその組み合わせである。より好ましい実施形態では、セパレーションマスクは、印刷によって適用されるトップセパレーションマスクである。加熱されたインクジェットプリントヘッドを用いるワックスのインクジェット印刷を使用することができるか、又は、ＵＶ硬化可能インクを用いるインクジェット印刷を使用することができる。どちらもグラフィック業界ではよく知られた技術である。

トップマスクは、オープンベースのマイクロタイタープレートのような、予め製造された一体部分として適用することもできる。マイクロタイタープレートは、この目的のために製造された場合に、３８４ウェルプレート又は１５３６ウェルプレート、又は、いかなる他の数であり得る。ウェルプレートは、ウェルプレートのプラスチック壁と組織試料との良好な物理的接触を確実にするために、組織試料の上に固定することができる。次に、所定のＲＯＩと重複する各ウェルの緩衝液にオリゴヌクレオチドプローブを添加して溶解することができる。各ウェルは、異なるインク、すなわち異なるオリゴヌクレオチドプローブを受けることができる。全ての試薬を提供するために多数の堆積が可能である。ウェルに試薬を提供するために、インクジェット印刷又はマイクロドージングを使用することができる。そのようなトップマスクの壁の高さは、０．５〜５ｍｍ程度である。これは、各ウェル内の分配された容積が１００ｎＬ〜１０μ、より好ましくは０．５〜２μＬ程度であり得るということを意味する。

別の実施形態では、セパレーションマスクは（それが物理的、化学的又は機械的マスクであろうが）使用されず、さらに、既定の位置は、試料上の異なる既定の位置間で混合しないようなオリゴヌクレオチドプローブの局所的適用によって画定される。一実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、容易に広がらないか又は体積が所望の空間分解能を維持するのに十分小さく保たれた印刷インクを使用して加えられ、印刷パターンは既定の位置を画定する。この実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブの適用及び既定の位置の画定は同時に生じる。オリゴヌクレオチドプローブは、依然として、組織試料のＲＯＩ内に拡散することができるけれども、インクは所望の位置での固定を確実にするために適用後にゲル化されてもよい。最先端の液体移送技術を使用して、ＲＯＩの上に特定のパターンでオリゴヌクレオチドプローブを加えることができる。一実施形態では、加えられたオリゴヌクレオチドプローブが異なる既定の位置間で混合しないように、液体移送技術によって、好ましくはコンタクトプリンティング技術又はノンコンタクトプリンティング技術によって、オリゴヌクレオチドプローブは既定の位置の上に加えられる。好ましい実施形態では、液体移送技術はコンタクトプリンティング技術、好ましくはディップペンプロッティング又はマイクロコンタクトプリンティングである。別の好ましい実施形態では、液体移送技術はノンコンタクトプリンティング技術、好ましくはインクジェットである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、横線又は横線に置かれるドット（行を表す）に印刷される。次に、垂直移動が使用されて、オリゴヌクレオチドプローブを垂直線に印刷するか、又は、既に存在するドット（列を表す）の上部に置く。異なる印刷インクを同時に印刷することができるマルチノズルプリンタも使用することができる。サーマルインクジェット又はピエゾ駆動インクジェットヘッドを使用することができる。ピエゾ駆動プリンタは、印刷インク内のタンパク質のあり得る分解を回避するために好ましい。一般に好まれる液体移送技術は、所望の分解能に基づき適応することができる。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、同定されたサブＲＯＩの形状に従って印刷される。

印刷インクは、任意選択で界面活性剤及び安定剤と共に、水又は生理食塩水の緩衝液のような溶媒に溶解したオリゴヌクレオチドプローブを含有する。インク内のオリゴヌクレオチドプローブの濃度は、１ｎＭから１ｍＭ、好ましくは１００ｎＭから１０μＭの範囲であり得る。異なるオリゴヌクレオチドを同じインクに溶解することができる。好ましくは、酵素も同じインクに溶解される。酵素の安定性のために、ＢＳＡ又は他の血清を、例えば０．５から５％ｗ／ｗ等、安定した保存に対しては典型的な濃度で添加することができる。

印刷量は、使用される堆積技術に対しては典型的であり、且つ、所望の空間分解能に応じて選ばれる。インクジェット印刷に対しては、印刷量は、５０ｐＬから５μＬ、より好ましくは１００ｐＬから１μＬの範囲であり得る。ディップペンプロッティングに対しては、移送される量は、ペンのサイズ及び滞留時間次第である。移送される典型的な量は、１ｐＬから１μＬ、好ましくは１０ｐＬから１００ｎＬの範囲である。

セパレーションマスクが使用されない実施形態に対して記載したようなオリゴヌクレオチドプローブの適用は、既定の位置がセパレーションマスクによって画定される実施形態に使用することもできる。例えば、第１のステップにおいて、セパレーションマスクを印刷して既定の位置を画定することができ、さらに、第２のステップにおいて、オリゴヌクレオチドプローブを、既定の位置の上に印刷することによって加えることができる。従って、一実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは印刷によって加えられる。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、ピペット操作等、印刷とは異なる方法によって加えられる。

オリゴヌクレオチドプローブは、ゲル様層又はゲル層で調製することもでき、この層は、ＲＯＩ内の既定の位置の上に加えられる。ゲル層は、ＲＯＩの上の単一ステップで加えられてもよく、さらに、オリゴヌクレオチドプローブは、拡散によってＲＯＩに移送される。 本明細書において使用される場合「ゲル様」又は「ゲル」という用語は、軟質且つ弱質から硬質且つ強靭に及ぶ特性を有することができる固体のゼリー様材料を意味し、オリゴヌクレオチドプローブはゲルからＲＯＩに拡散することができる。従って、一実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、試料の上に加えられるゲル層又はゲル様層の形である。

オリゴヌクレオチドプローブは、後にＲＯＩの上に接続されることになる（例えば、ウェルプレートのような小さなウェルを用いて）別の使い捨て容器で加えることもできる。このアプローチは、全ての液体が堆積されたかどうかを確認するための関連する品質管理手段を含め、オフラインで製造することができるという利点を有する。オフラインでの別の使い捨て容器でのオリゴヌクレオチドプローブの堆積は、病理研究室における液体移送装置の使用を時代遅れにする。一実施形態では、ＲＯＩは、非特許文献２及び非特許文献３に記載されているようにウェルプレートに圧入することができる。オリゴヌクレオチドプローブ又は独特な組み合わせのオリゴヌクレオチドプローブは、スポット操作によってウェルのそれぞれの底部に添加されてもよい。オリゴヌクレオチドプローブは、使用に先立ち乾燥させることができる。

オリゴヌクレオチドプローブは、上記の手段の組み合わせ及び／又はセパレーションマスクを使用しないこととセパレーションマスクを使用することの組み合わせによって加えることもできる。例えば、第１のステップでは、オリゴヌクレオチドプローブを異なるサブＲＯＩの上に印刷し、その結果セパレーションマスクを使用せずに既定の位置を画定することができ、さらに、第２ステップでは、オリゴヌクレオチドプローブを、トップセパレーションマスクによって画定された既定の位置の上にピペットすることによって加えることができる。従って、オリゴヌクレオチドプローブは、順次又は同時に加えることができる。多数のさらなる組み合わせが可能であり、さらに、オリゴヌクレオチドプローブの適用は上記の実施形態に限定されないということが理解されたい。

３種以上のオリゴヌクレオチドプローブがＲＯＩ内の既定の位置の上に加えられる実施形態では、この適用は順次であってもよい。例えば、核酸分子に連結されることになるオリゴヌクレオチドプローブを第１のステップにおいて加えて、プローブが核酸分子に連結される条件を提供することができ、さらに、第２のステップでは、核酸分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ及び／又は核酸分子に連結されたオリゴヌクレオチドプローブを加えることができる。従って、一実施形態では、異なる種のオリゴヌクレオチドプローブが、ＲＯＩ内の既定の位置の上に順次加えられる。別の実施形態では、異なる種のオリゴヌクレオチドプローブが、ＲＯＩ内の既定の位置の上に同時に加えられる。

好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、ＲＯＩ内の既定の位置の上に液相で加えられる。さらに好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、ＲＯＩ内の既定の位置の上に液相で加えられ、ここで、既定の位置は、組織情報を考慮に入れて同定されている。さらなる好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、標的分子へのハイブリダイゼーションを可能にするために、高いイオン強度を有する液相で加えられる。別の好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、適用される温度ステップ又は照射によって、試料への適用の直後にゲル化する液相で加えられる。これは、溶液における熱可逆的ゲル化を受けるポリアクリルアミドのようなポリマーの添加、及び／又は、照射下で重合してこの方法でゲル化をもたらすことができるモノマーの添加によって達成することができる。ゲル化は、異なる既定の位置でのプローブのあり得る混合を回避するべきである。

ＲＯＩ内の核酸分子は、前処理されてもよい。一実施形態では、正しいタイプの核酸分子を標的にするために、及び／又は、オリゴヌクレオチドプローブの効率的なライゲーションのために、試料の核酸は前処理される。標的にされることになる核酸がＤＮＡ分子である実施形態では、前処理は、当技術分野においてよく知られた方法に従った、より小さなサイズのＤＮＡ断片を提供するためのＤＮＡの消化を包含し得る。

ＲＯＩ内の既定の位置の上にオリゴヌクレオチドプローブを加えた後で、オリゴヌクレオチドプローブはＲＯＩ内に拡散する。オリゴヌクレオチドプローブのサイズは、短時間での組織試料の深い浸透を可能にする。次に、ＲＯＩのその既定の位置内のオリゴヌクレオチドプローブは、試料の核酸に結合し、その結果、核酸−オリゴヌクレオチドプローブの複合体を作製する。本明細書において使用される場合「核酸−オリゴヌクレオチドプローブの複合体」という用語は、検出されることになる核酸と少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブとの複合体を意味する。検出されることになる核酸は、２種以上のオリゴヌクレオチドプローブとの複合体、例えば、２つの種のオリゴヌクレオチドプローブとの複合体内にあってもよい。拡散及び結合のプロセスの間に、溶媒の蒸発を回避するために、湿った大気が表面に提供される。その期間の間に温度ステップが、良好な反応の変換を達成するために適用されてもよい。そのステップの間、セパレーションマスクはその位置にとどまっていてもよく、又は、任意選択で、プローブの適用後に除去されてもよい。上昇した温度によって、拡散及び結合反応が加速される。ハイブリダイゼーションが結合のために使用される場合には、温度はプローブの融解温度よりも下に保たれるべきである。或いは、温度は、リガーゼが良好に働くように選ばれるべきである。好ましい実施形態では、温度は、約２０から４５℃、好ましくは約３０から４０℃の範囲にある。

試料の核酸へのオリゴヌクレオチドプローブの結合の後で、核酸−オリゴヌクレオチドプローブの複合体はＲＯＩから抽出される。一実施形態において、抽出は、上昇した温度にて抽出緩衝液内にＲＯＩを浸漬することによって行われる。分子アッセイに対する試料調製において一般的であり且つ当技術分野において既知の抽出緩衝液を使用することができる。抽出された核酸は、さらなる分析のために単一のチューブにおいて収集することができる。抽出された核酸−オリゴヌクレオチドプローブの複合体の溶液は、空間分子プロフィール（ＳＭＰ）抽出物と呼ばれる。

一実施形態では、抽出された核酸は、当技術分野において既知の方法によって精製される。別の実施形態では、抽出された核酸は、当技術分野において既知の方法によって濃縮される。さらなる実施形態では、抽出された核酸は精製及び濃縮される。

別のさらなる実施形態では、抽出された核酸−オリゴヌクレオチドプローブの複合体からＤＮＡ増幅を介してＤＮＡ分子は生成され、任意選択で、ＤＮＡ分子の生成が、逆転写反応の後に生じる。好ましい実施形態では、抽出された核酸は、逆転写され且つ増幅されるＲＮＡ分子である。

核酸増幅は、サイクリック増幅によって達成することができる。サイクリック増幅は、２つ以上のいかなる数の増幅サイクルも含んでもよい。通常、サイクリック増幅反応は、少なくとも１０又は少なくとも２０のサイクルを含む。例証的なサイクリック増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。ＰＣＲは、分子生物学における確立された標準的な方法であり、例えば上記の非特許文献４に詳細に記載されている。典型的には、ＰＣＲは、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼを利用することによって二本鎖ＤＮＡ分子を増幅するために使用される。好ましい実施形態では、核酸増幅は、サイクリック増幅であり、好ましくはＰＣＲである。

代替的な実施形態では、核酸増幅は、等温増幅法によって達成される。等温条件で核酸を増幅することによって、サーモサイクル装置の使用を回避することが可能になる。ニッキング酵素増幅反応、転写増幅法、核酸配列ベースの増幅、ＲＮＡ技術のシグナル媒介増幅、鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、ＬＡＭＰ法、等温多置換増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、単一プライマー等温増幅及び環状ヘリカーゼ依存性増幅等を含む等温核酸増幅法のタイプがいくつか当業者には既知である。等温核酸増幅技術は、例えば非特許文献６において概説されている。

核酸がＲＮＡである場合、ＤＮＡ分子の生成は、核酸に増幅を受けされるのに先立ち、逆転写を受けさせるステップをさらに含む。逆転写は、分子生物学における別の標準的な方法であり、例えば、上記の非特許文献４においても記載されている。

核酸−オリゴヌクレオチドプローブの複合体が抽出され、さらに、任意選択で上記の方法のいずれかを受けさせた後で、ＳＭＰ抽出物が配列決定される。本明細書において使用される場合「抽出された核酸分子を配列決定する」という用語は、広い意味で理解されることになり、すなわち、配列情報を提供するいかなる方法も指す。例えば、配列情報は、特定のプローブとのハイブリダイゼーション又はマイクロアレイによって得ることができる。一実施形態では、抽出された核酸分子を配列決定することは、任意選択で逆転写によってＲＮＡから得られるＤＮＡ分子の配列決定を指す。ＤＮＡ分子を配列決定するのに適した方法は、当技術分野において既知であり、さらに、サンガーシーケンシング、パイロシーケンシング又は次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を含むが、それらに限定されない。別の実施形態において、抽出された核酸分子を配列決定することは、ナノポアシーケンシング、マイクロＲＮＡシーケンシング又はホールトランスクリプトームショットガンシーケンシングによるＲＮＡ分子の配列決定を指す。好ましい実施形態では、配列決定はＤＮＡシーケンシング、好ましくはＮＧＳである。

配列情報がＮＧＳによって得られる場合、オリゴヌクレオチドプローブがＮＧＳにおいてプライマーとして作用する実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは追加的配列としてＮＧＳアダプターを含む。

配列決定された核酸分子の配列情報が得られた後で、配列決定された核酸分子は、標的核酸分子の空間分布を生成するために、ＲＯＩ内の対応する標的核酸分子の最初の位置に関連づけられる。このように、核酸が起源をもつ例えばセパレーションマスクによって画定された既定の位置に従って配列決定された核酸が示されている空間的な２次元マップが作製される。従って、一実施形態では、配列決定された核酸分子は、標的核酸分子の空間分布を生成するために、ＲＯＩ内の既定の位置内の対応する標的核酸分子の最初の位置に関連付けられ、各位置は、ＲＯＩ内の既定の位置における試料の核酸に結合した１つ又は複数の種のオリゴヌクレオチドプローブによって同定される。別の実施形態では、ＲＯＩ内の標的にされた核酸分子の位置を同定するために、オリゴヌクレオチドプローブの少なくとも２つの異なる種の独特な組み合わせが使用される。抽出され且つ配列決定された核酸分子は、ＲＯＩ内の既定の位置において試料の標的核酸に結合するオリゴヌクレオチドプローブのバーコード配列を含む。ＲＯＩ内の各既定の位置には、試料の標的核酸に結合する独特な種のオリゴヌクレオチドプローブ又は独特な組み合わせのオリゴヌクレオチドプローブが加えられたため、抽出され且つ配列決定された核酸分子はオリゴヌクレオチドプローブのバーコード配列を包含する。各核酸分子は、各核酸分子含むバーコード配列に基づき、上記のバーコード配列を含む種のオリゴヌクレオチドプローブが上に加えられた既定の位置に関連づけられてもよい。結果として生じる相関は、ＲＯＩ内の標的にされた核酸の最初の位置を示す空間マップを提供する。そのような空間マップは、例えば、核酸の発現状態、突然変異状態、分解状態、メチル化状態、エピジェネティック状態又はその組み合わせに関する情報を提供することができる。

一実施形態では、標的にされた核酸分子の空間分布は、ＲＯＩの画像又はＲＯＩが同定された組織試料の画像に関連づけられてもよい。標的にされた核酸分子の空間分布は、可視化して二次元の空間マップを提供することができる。一実施形態では、標的にされた核酸分子の空間分布は、ＲＯＩから得られた画像の空間パターンに関連づけられる。従って、一実施形態では、当該方法は、標的にされた核酸分子の空間分布を可視化するために二次元の空間マップを提供する。さらなる実施形態では、当該方法は、二次元の空間マップを、ＲＯＩの画像又はＲＯＩが同定された組織試料の画像でオーバーレイするステップをさらに含む。ＲＯＩの画像は、ＲＯＩの同定の前又は後に得ることができる。従って、一実施形態では、画像は、少なくとも１つのＲＯＩを同定する前に組織試料から得られる。別の実施形態では、組織の画像は、少なくとも１つのＲＯＩを同定した後に得られる。さらに別の実施形態では、画像は、ＲＯＩ内の既定の位置の上にオリゴヌクレオチドプローブを加える前又は後にＲＯＩから得られる。画像は、デジタルパソロジー又はカメラを有する顕微鏡等、当技術分野において既知のいかなる方法によっても得ることができる。一実施形態では、標的にされた核酸分子の空間分布は、ＲＯＩ内に位置し且つセパレーションマスクによって画定された既定の位置に関連づけられ、画像は、セパレーションマスクを適用した後、且つ、ＲＯＩ内の既定の位置の上にオリゴヌクレオチドプローブを加える前又は後、好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの適用前に得られる。好ましい実施形態において、標的にされた核酸分子の空間分布は、ＲＯＩ内の既定の位置の上にオリゴヌクレオチドプローブを加える前又は後、好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの適用前に得られるＲＯＩの画像に関連づけられる。別の好ましい実施形態では、標的にされた核酸分子の空間分布は、セパレーションマスクを適用した後、且つ、セパレーションマスクによって画定された既定の位置の上にオリゴヌクレオチドプローブを加える前に得られるＲＯＩの画像に関連づけられる。

空間マップは、例えば、偽色を表示することによって可視化することができ、グリッドによって画定された各既定の位置は同じ色の領域を表す。空間マップは、ＲＯＩの画像又は組織試料の画像でオーバーレイすることができる。例えば、空間マップは、半透明画像として構成され、さらに、ＲＯＩの画像の上に又は組織試料の画像でオーバーレイされる。或いは、逆もまた同様に、ＲＯＩの画像又は組織試料の画像が半透明画像として構成され、空間マップ上にオーバーレイされる。好ましい実施形態では、同じ種のオリゴヌクレオチドプローブを用いたアッセイにおいて決定される同じ標的核酸分子の数又は量は、対応する既定の位置におけるマップの色に関連させられる。別の実施形態では、例えば既知の発癌性突然変異を保有する核酸分子のサブセットのような特定の組み合わせの標的核酸分子が色に関連づけられる。さらに別の実施形態では、特定の遺伝子に関連する特定のセットの標的核酸分子の過剰発現を、マップ上の色に関連づけることができる。取り組まれる生物学的及び／又は臨床的質問に応じて、多くの異なるプロファイルを明らかにし且つ視覚的表示の方法に関連させることができるということが理解されたい。色の代わりに、又は色と組み合わせて、他のアノテーションを空間マップにおいて表示することができる。

初期画像の空間パターンに対する標的にされた核酸分子の空間分布の相関性、すなわち空間マップを使用して、臨床的質問に答える、及び、臨床的判断のためのガイダンスを提供することができる。本発明の方法により作製された空間マップによって得られた結果は、患者における臨床的診断又は臨床的反応のモニタリングに使用することができる。初期画像の空間パターンに対する標的にされた核酸分子の空間的分布の相関性は、研究の分野において使用することもできる。

好ましい実施形態では、組織試料及び／又はＲＯＩが画像処理される。組織試料から撮られた画像は、関心領域だけでなく、試薬の適用前の組織の画像ベースの解析に基づくパターンの空間分解能を同定するために使用されてもよい。

本発明の別の態様は、５´−オリゴヌクレオチドプローブ及び３´−オリゴヌクレオチドプローブをＲＮＡ分子の５´末端及び３´末端に連結させ、さらに、オリゴヌクレオチドプローブ二量体のライゲーション部位に制限部位を導入するＤＮＡ分子、及び、制限部位を切断するのに適した制限酵素を同時に加える反応に関し、ＤＮＡ分子の５´末端及び３´末端がライゲーション反応に関与しないように修飾される。その結果、オリゴヌクレオチドプローブが互いに反応する場合にその間に生じる二量体（すなわちオリゴヌクレオチドプローブ二量体）が、完全に活性な個々の５´−オリゴヌクレオチドプローブ及び３´−オリゴヌクレオチドプローブに切断される。切断されたオリゴヌクレオチドプローブは、ＲＮＡ分子の５´末端及び３´末端に連結されるようにライゲーション反応において再利用することができる。

特定の実施形態が、ＦＦＰＥ組織試料上のライゲーション反応に関し、５´−オリゴヌクレオチドプローブ及び３´−オリゴヌクレオチドプローブをＲＮＡ分子の５´末端及び３´末端に連結させ、オリゴヌクレオチドプローブ二量体のライゲーション部位に制限部位を導入するＤＮＡ分子と、制限部位を切断するのに適した制限酵素とを同時に加え、ＤＮＡ分子の５´末端及び３´末端は、ライゲーション反応に関与しないように修飾される。

図２Ｂにおいて提示されている標準的なオリゴヌクレオチドプローブのライゲーション反応スキームにおいて、ライゲーション反応は、逆転写反応によってクエンチされ、その結果、オリゴヌクレオチドプローブ二量体の形成を回避している。逆転写反応は、ＦＦＰＥ組織試料においてはむしろ非効率的である。本発明のオリゴヌクレオチドプローブのライゲーションプロトコルでは、オリゴヌクレオチドプローブ二量体は、制限酵素によって切断され、従って、逆転写反応ステップは、ＦＦＰＥ組織試料において回避することができる。さらに、本発明のプロトコルを使用することによって、実施例及び図３において記載されているように、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼＩ及びＩＩの反応を１つのステップにおいて組み合わせることができる。従って、本発明のオリゴヌクレオチドプローブのライゲーション反応方法は先行技術よりも有利である。

特定の実施形態では、本発明は、５´−オリゴヌクレオチドプローブ及び３´−オリゴヌクレオチドプローブをＲＮＡ分子の５´末端及び３´末端に連結させ、さらに、オリゴヌクレオチドプローブ二量体のライゲーション部位にＨａｅＩＩＩ制限部位を導入するＤＮＡ分子、及び、制限部位にて切断するＨａｅＩＩＩ制限酵素を同時に加えるライゲーション反応に関する。

上記のライゲーション反応は、本明細書において記載される組織試料内のＲＮＡ分子を空間的に検出する方法のステップｂ）において使用することができる。

特に、上記のライゲーション反応は、本明細書において記載されるＦＦＰＥ組織試料内のＲＮＡ分子を空間的に検出する方法のステップｂ）において使用することができる。その結果、逆転写反応がＦＦＰＥ組織試料上で実行されなければならないということを回避することができる。この方法は、ＦＦＰＥ試料に対してむしろ非効率的な逆転写反応を回避するため、有利である。さらに、このプロトコルを使用して、Ｔ４ＲＮＡリガーゼＩ及びＩＩの反応を１つのステップにおいて組み合わせることができる。

特定の実施形態では、組織試料内の核酸を空間的に検出する方法は：
ａ１）組織試料の画像を取得するステップ；
ａ２）試料内の少なくとも１つのＲＯＩを同定するステップ；
ａ３）異なる既定の位置を含むＲＯＩにマスクを適用するステップ；
ｂ）ＲＯＩ内の既定の位置の上に少なくとも１つの種のオリゴヌクレオチドプローブを加え、さらに、オリゴヌクレオチドプローブが試料の核酸に結合するのを可能にするステップであり、オリゴヌクレオチドプローブはバーコード配列を含む、ステップ；
ｃ）核酸−オリゴヌクレオチドプローブの複合体を抽出するステップ；
ｄ）抽出された核酸分子を配列決定するステップ；
ｅ）配列決定された核酸分子をＲＯＩ内の対応する標的核酸分子の最初の位置に関連づけて、標的核酸分子の空間分布を生成するステップ；
を含み、各位置は、ステップｂ）において結合する１つ又は複数の種のオリゴヌクレオチドプローブによって同定される。

別の特定の実施形態では、ＦＦＰＥ組織試料内の核酸を空間的に検出する方法は：
ａ１）ＦＦＰＥ組織試料を脱パラフィンするステップ；
ａ２）組織試料の画像を取得するステップ；
ａ３）試料内の少なくとも１つのＲＯＩを同定するステップ；
ａ４）異なる既定の位置を含むＲＯＩにマスクを適用するステップ；
ｂ）ＲＯＩ内の既定の位置の上に少なくとも１つの種のオリゴヌクレオチドプローブを加え、さらに、オリゴヌクレオチドプローブが試料の核酸に結合するのを可能にするステップであり、オリゴヌクレオチドプローブはバーコード配列を含む、ステップ；
ｃ）核酸−オリゴヌクレオチドプローブの複合体を抽出するステップ；
ｄ）抽出された核酸分子を配列決定するステップ；
ｅ）配列決定された核酸分子をＲＯＩ内の対応する標的核酸分子の最初の位置に関連づけて、標的核酸分子の空間分布を生成するステップ；
を含み、各位置は、ステップｂ）において結合する１つ又は複数の種のオリゴヌクレオチドプローブによって同定される。

特定の実施形態では、組織試料内のＲＮＡを空間的に検出する方法は：
ａ１）組織試料の画像を取得するステップ；
ａ２）試料内の少なくとも１つのＲＯＩを同定するステップ；
ａ３）異なる既定の位置を含むＲＯＩにマスクを適用するステップ；
ｂ）ＲＯＩ内の既定の位置の上に少なくとも１つの種のオリゴヌクレオチドプローブを加え、さらに、オリゴヌクレオチドプローブが試料のＲＮＡ分子に結合するのを可能にするステップであり、オリゴヌクレオチドプローブはバーコード配列を含む、ステップ；
ｃ）ＲＮＡ−オリゴヌクレオチドプローブの複合体を抽出するステップ；
ｄ）抽出されたＲＮＡ分子を配列決定するステップ；
ｅ）配列決定されたＲＮＡ分子をＲＯＩ内の対応する標的ＲＮＡ分子の最初の位置に関連づけて、標的ＲＮＡ分子の空間分布を生成するステップ；
を含み、各位置は、ステップｂ）において結合する１つ又は複数の種のオリゴヌクレオチドプローブによって同定される。

特定の実施形態では、ＦＦＰＥ組織試料内のＲＮＡ分子を空間的に検出する方法は：
ａ１）ＦＦＰＥ組織試料を脱パラフィンするステップ；
ａ２）組織試料の画像を取得するステップ；
ａ３）試料内の少なくとも１つのＲＯＩを同定するステップ；
ａ４）異なる既定の位置を含むＲＯＩにマスクを適用するステップ；
ｂ）ＲＯＩ内の既定の位置の上に少なくとも１つの種のオリゴヌクレオチドプローブを加え、さらに、オリゴヌクレオチドプローブが試料のＲＮＡ分子に結合するのを可能にするステップであり、オリゴヌクレオチドプローブはバーコード配列を含む、ステップ；
ｃ）ＲＮＡ−オリゴヌクレオチドプローブの複合体を抽出するステップ；
ｄ）抽出されたＲＮＡ分子を配列決定するステップ；
ｅ）配列決定されたＲＮＡ分子をＲＯＩ内の対応する標的ＲＮＡ分子の最初の位置に関連づけて、標的ＲＮＡ分子の空間分布を生成するステップ；
を含み、各位置は、ステップｂ）において結合する１つ又は複数の種のオリゴヌクレオチドプローブによって同定される。

特定の実施形態では、ＦＦＰＥ組織試料内のＲＮＡを空間的に検出する方法は：
ａ１）ＦＦＰＥ組織試料を脱パラフィンするステップ；
ａ２）組織試料の画像を取得するステップ；
ａ３）試料内の少なくとも１つのＲＯＩを同定するステップ；
ａ４）異なる既定の位置を含むＲＯＩにマスクを適用するステップ；
ｂ）ＲＯＩ内の既定の位置の上に、５´−ＲＮＡプローブ及び３´−ＲＮＡプローブを加え、さらに、ＲＮＡプローブが試料のＲＮＡ分子の５´末端及び３´末端に連結するのを可能にするステップであり、ＲＮＡプローブはバーコード配列を含む、ステップ；
ｃ）ＲＮＡ−ＲＮＡプローブの複合体を抽出するステップ；
ｄ）抽出されたＲＮＡ分子を配列決定するステップ；
ｅ）配列決定されたＲＮＡ分子をＲＯＩ内の対応する標的ＲＮＡ分子の最初の位置に関連づけて、標的ＲＮＡ分子の空間分布を生成するステップ；
を含み、各位置は、ステップｂ）において結合する１つ又は複数の種のＲＮＡプローブによって同定される。

特定の実施形態では、ＦＦＰＥ組織試料内のＲＮＡを空間的に検出する方法は：
ａ１）ＦＦＰＥ組織試料を脱パラフィンするステップ；
ａ２）組織試料の画像を取得するステップ；
ａ３）試料内の少なくとも１つのＲＯＩを同定するステップ；
ａ４）異なる既定の位置を含むＲＯＩにマスクを適用するステップ；
ｂ）ＲＯＩ内の既定の位置の上に、５´−ＲＮＡプローブ及び３´−ＲＮＡプローブを加え、さらに、ＲＮＡプローブが試料のＲＮＡ分子の５´末端及び３´末端に連結するのを可能にし、ＲＮＡプローブはバーコード配列を含み、さらに、ＲＮＡプローブ二量体のライゲーション部位に制限部位を導入するＤＮＡ分子、及び、制限部位を切断するのに適した制限酵素を同時に加えるステップ；
ｃ）ＲＮＡ−ＲＮＡプローブの複合体を抽出するステップ；
ｄ）抽出されたＲＮＡ分子を配列決定するステップ；
ｅ）配列決定されたＲＮＡ分子をＲＯＩ内の対応する標的ＲＮＡ分子の最初の位置に関連づけて、標的ＲＮＡ分子の空間分布を生成するステップ；
を含み、各位置は、ステップｂ）において結合する１つ又は複数の種のＲＮＡプローブによって同定される。

特定の実施形態では、ＦＦＰＥ組織試料内のＲＮＡを空間的に検出する方法は：
ａ１）ＦＦＰＥ組織試料を脱パラフィンするステップ；
ａ２）組織試料の画像を取得するステップ；
ａ３）試料内の少なくとも１つのＲＯＩを同定するステップ；
ａ４）異なる既定の位置を含むＲＯＩにマスクを適用するステップ；
ｂ）ＲＯＩ内の既定の位置の上に、５´−ＲＮＡプローブ及び３´−ＲＮＡプローブを加え、さらに、ＲＮＡプローブが試料のＲＮＡ分子の５´末端及び３´末端に連結するのを可能にし、ＲＮＡプローブはバーコード配列を含み、さらに、ＲＮＡプローブ二量体のライゲーション部位にＨａｅＩＩＩ制限部位を導入するＤＮＡ分子、及び、ＨａｅＩＩＩ制限酵素を同時に加えるステップ；
ｃ）ＲＮＡ−ＲＮＡプローブの複合体を抽出するステップ；
ｄ）抽出されたＲＮＡ分子を配列決定するステップ；
ｅ）配列決定されたＲＮＡ分子をＲＯＩ内の対応する標的ＲＮＡ分子の最初の位置に関連づけて、標的ＲＮＡ分子の空間分布を生成するステップ；
を含み、各位置は、ステップｂ）において結合する１つ又は複数の種のＲＮＡプローブによって同定される。

特定の実施形態では、組織試料内のＤＮＡを空間的に検出する方法は：
ａ１）組織試料の画像を取得するステップ；
ａ２）試料内の少なくとも１つのＲＯＩを同定するステップ；
ａ３）異なる既定の位置を含むＲＯＩにマスクを適用するステップ；
ｂ）ＲＯＩ内の既定の位置の上に少なくとも１つの種のオリゴヌクレオチドプローブを加え、さらに、オリゴヌクレオチドプローブが試料のＤＮＡ分子に結合するのを可能にするステップであり、オリゴヌクレオチドプローブはバーコード配列を含む、ステップ；
ｃ）ＤＮＡ−オリゴヌクレオチドプローブの複合体を抽出するステップ；
ｄ）抽出されたＤＮＡ分子を配列決定するステップ；
ｅ）配列決定されたＤＮＡ分子をＲＯＩ内の対応する標的ＤＮＡ分子の最初の位置に関連づけて、標的ＤＮＡ分子の空間分布を生成するステップ；
を含み、各位置は、ステップｂ）において結合する１つ又は複数の種のオリゴヌクレオチドプローブによって同定される。

核酸分子へのオリゴヌクレオチドプローブ結合に対するプロトコルタイプ

ＦＦＰＥ組織試料内のＲＮＡを空間的に検出する方法
（プロトコルタイプ［Ｃ］による実施例）
材料：スライド上のＦＦＰＥ組織試料
組織試料は、例えば、非特許文献７によって記載されているように、３７℃にてプロテイナーゼＫ（ＰｒｏｔＫ）で、又は、Ｅｎｇｙｏｄｏｎｔｉｕｍ ａｌｂｕｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）からのプロテイナーゼＫを、製造業者の指示に従って使用して処理され、８０℃にて１５分間のＰｒｏｔＫの熱非活性化が続く。

組織試料は、製造業者の指示に従って、例えば、脱パラフィン溶液（例えばＱｉａｇｅｎ等）を使用して脱パラフィンされる。

完全なスライドの画像が取得され（Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｓｃａｎｎｅｒ ＵＦＳ）、さらに、画像内でＲＯＩが同定される。

ＲＯＩ内で異なる位置が選択され、さらに、紫外線硬化インク（Ｓｕｎｊｅｔ ｉｎｋ Ｃｒｙｓｔａｌ ＵＦＥ７５７３（ブラック））をインクジェット印刷する（プリントヘッドＸＡＡＲ）ことによってトップセレクションマスクが適用され、異なる反応ウェルを分ける格子が作製される。マスクの紫外線硬化は、３０から６０秒間、ＵＶ−ＬＥＤを用いて３６０から３８０ｎｍにて実行される。

バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドプローブの２つの種の独特な組み合わせ（５´−ＲＮＡプローブ及び３´−ＲＮＡプローブ）が、（ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｄｉｍａｔｉｘプリントヘッドを使用した）インクジェット印刷によって各既定の位置の上に加えられる。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）（ＮＥＢ）に対するＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｓｍａｌｌ ＲＮＡライブラリー調製セットの修正されたプロトコルを使用して、５´−ＲＮＡプローブ及び３´−ＲＮＡプローブが、単一のステップにおいてｍＲＮＡ分子に連結される。図２Ｂにおいて描写された標準的なプロトコルでは、ＲＮＡプローブは、単一のステップにおいてＲＮＡ分子に連結される。この反応の間、５´−ＲＮＡプローブは３´−ＲＮＡプローブと反応し、さらに、二量体を形成する。修正されたプロトコルでは、反応をクエンチするためにＲＴ−プライマーを使用する代わりに、異なるアプローチがとられ：これらの二量体を切断するために、５´−ＲＡプローブの３´末端及び３´−ＲＡプローブの５´末端のライゲーション部位に相補的な、ＲＮＡプローブ二量体のライゲーション部位にＨａｅＩＩＩ制限部位を導入するＤＮＡ分子が使用される。ＤＮＡ分子は、ライゲーション反応に関与しないように両端が修飾されている。ＨａｅＩＩＩ制限酵素の添加によって、相補的なＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二本鎖を有するＲＮＡプローブ二量体は、ＲＮＡ鎖上のみで２つのＲＮＡプローブのライゲーション部位で切断されることになる一方、ＤＮＡ分子は無処置のまま残る。切断されたＲＮＡプローブは、ライゲーション反応に再び関与することができる。

ライゲーションミックスの適用後、スライドは、蓋（Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ ＨｙｂｒｉＷｅｌｌ（商標）密封システム、ＳｅｃｕｒｅＳｅａｌ（商標）接着チャンバ）で覆われる。

オリゴヌクレオチドプローブのライゲーション後、抽出緩衝液が試料に加えられ、全てのウェルを浸し、さらに、ＲＮＡ抽出が、製造業者の指示に従って、例えば、ＲＮｅａｓｙ ＦＦＰＥ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して等、ＲＮＡ膜精製を使用して行われる。試料は抽出中に加熱され、さらに、試料の脱水を回避するために密封されたままである。或いは、オリゴヌクレオチドプローブの配列は、例えば磁気ビーズを使用して等、精製プロセス中に使用することができる。ＤＮａｓｅを用いたインキュベーションが、ライゲーションＲＮＡ精製の間又は後で（例えば３７℃にて１５分間）実行され、続いて、８０℃にて１５分間、ＤＮａｓｅ不活性化が実行される。或いは、上記のプロテイナーゼＫ処理のステップと並行して、ＤＮａｓｅ処理が遂行されてもよい。

ＲＮＡ配列決定ライブラリーの調製は、製造業者の指示に従って、例えば、ＳｃｒｉｐｔＳｅｑ ｖ２ ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して行われる。ＲＮＡ配列決定が行われ、さらに、バーコードの転写物が配列から同定される。この情報は、次に、空間転写マップを構築するために、ＲＯＩから得られた元の画像と組み合わされる。

ＦＦＰＥ組織試料内のＤＮＡを空間的に検出する方法
（プロトコルタイプ［Ｂ］による実施例）
材料：スライド上のＦＦＰＥ組織試料
組織試料は、製造業者の指示に従って、例えば脱パラフィン溶液（例えばＱｉａｇｅｎ）を使用して脱パラフィンされ、さらに、乾燥される。

組織試料は、例えば、非特許文献７によって記載されているように、３７℃にてプロテイナーゼＫ（ＰｒｏｔＫ）で、又は、Ｅｎｇｙｏｄｏｎｔｉｕｍ ａｌｂｕｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）からのプロテイナーゼＫを、製造業者の指示に従って使用して処理され、８０℃にて１５分間のＰｒｏｔＫの熱非活性化が続く。

組織試料はＥｔＯＨで洗浄され、さらに、４０℃で３０分間乾燥される。完全なスライドの画像が取得され（Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｓｃａｎｎｅｒ ＵＦＳ）、さらに、画像内でＲＯＩが同定される。

ＤＮＡ分子が、変性溶液（２ＸＳＳＣ，ｐＨ７．０−８．０中の７０％ホルムアミド）の添加及び５分間の７５℃でのインキュベーション、続く、７０％ＥｔＯＨ中で１分間、８５％ＥｔＯＨ中で１分間、さらに、１００％ＥｔＯＨ中で１分間のインキュベーションによって変性される。次に、スライドが乾燥され、さらに、４５〜５０℃にて置かれ、残りのＥｔＯＨを蒸発させる。ＲＯＩ内で異なる位置が選択され、さらに、紫外線硬化インク（Ｓｕｎｊｅｔ ｉｎｋ Ｃｒｙｓｔａｌ ＵＦＥ７５７３（ブラック））をインクジェット印刷する（プリントヘッドＸＡＡＲ）ことによってトップセレクションマスクが適用され、異なる反応ウェルを分ける格子が作製される。マスクの紫外線硬化は、３０から６０秒間、ＵＶ−ＬＥＤを用いて３６０から３８０ｎｍにて実行される。

バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドプローブが、（ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｄｉｍａｔｉｘプリントヘッドを使用した）インクジェット印刷によって各既定の位置の上に加えられる。

組織試料は、４０°で２時間（湿潤条件）インキュベートされる。

インキュベーション後、オリゴヌクレオチドプローブのプライマー配列を用いてハイブリダイズした標的配列を増幅するために伸長反応が行われる。

伸長反応後、スライドは、蓋（Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ ＨｙｂｒｉＷｅｌｌ（商標）密封システム、ＳｅｃｕｒｅＳｅａｌ（商標）接着チャンバ）で覆われる。

抽出緩衝液が導入され、さらに、試料が６０℃で３０分間インキュベートされる。

ＤＮＡ配列決定ライブラリー調製及びＤＮＡ配列決定が行われ、さらに、バーコードの転写物が配列から同定される。この情報は、次に、空間転写マップを構築するために、ＲＯＩから得られた元の画像と組み合わされる。上記のステップの反応に対して、良く知られた標準的なキットが、製造業者のプロトコルに従って適用される。

ＦＦＰＥスライド上での２つの異なるバーコードを用いたワンステップでの３´及び５´ＲＮＡライゲーションの方法
この実験の目的は、単一の反応において、ＦＦＰＥＴスライド上で、ＲＮＡの３´側にｍｉＲＮＡクローニングリンカーを連結する、及び、ＲＮＡの５´側にＲＮＡ５´アダプターを連結することであった。これを、下記のプロトコルに従って行った。ライゲーション反応が成功したかどうかを決定するために、抽出したＲＮＡに対してＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを行った。

試料として、乳癌ＦＦＰＥブロックから切り取った５μＭのカット（ｃｏｕｐｅｓ）を使用し、さらに、５５〜６０℃で３０分間焼いた。次に、スライドをオーブンに移して、試料は完全に乾燥しているということを確実にした（５５℃で一晩）。ライゲーション反応が成功するためには、ＲＮＡは、スライド上で利用可能にならなければ／露出されなければならない。これを、まず、キシレン中でスライドを洗浄し（２ｘ１０分 １ｘ８分）、１００％ＥｔＯＨですすぐ（１ｘ５分、１ｘ１分）ことによって行った。次に、スライドを５分間空気乾燥させ、さらに、流体が残るであろう組織の周りに円を作製するために、疎水性バリアペンを使用した（スライドをさらに１５〜３０分間空気乾燥させた）。スライドホルダーを、１ｘ前処理溶液（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ（登録商標）Ｖｉｅｗ ＲＮＡ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ；Ｐ／Ｎ：１７４２８）で満たした。スライドホルダーを、湯浴内（９５℃）に置き、さらに、加熱した１ｘ前処理溶液を有したこのスライドホルダー内にスライドを注意深く２０分間置いた。スライドを、ＭｉｌｉＱ水（２ｘ１分）及びＰＢＳ（１ｘ５秒）においてすすいだ。プロテアーゼＱＳ溶液（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ（登録商標）Ｖｉｅｗ ＲＮＡ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ；Ｐ／Ｎ：１６７４２）の２００〜４００アリコートを組織の上に添加し、さらに、４０℃にて湿度ボックス内で２０分間インキュベートした。スライドを、ＰＢＳにおいて洗浄して（２ｘ５秒）プロテアーゼＱＳ溶液を除去した。次に、スライドを、室温にて５分間４％緩衝ホルムアルデヒド中で固定させ、さらに、スライドをＰＢＳにおいて洗浄する（２ｘ５秒）ことによって過剰な溶液を再び除去した。２つの市販のライゲーションキット：ｉ）Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２、切断型（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ−Ｍ０２４２Ｓ）及びｉｉ）Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１、ｓｓＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ−Ｍ０２０４Ｓ）を使用した。加えて、市販のｍｉＲＮＡクローニングリンカー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ−Ｓ１３１５Ｓ、ＳＥＱ ＩＤ＝１）を３´ライゲーションに使用し、さらに、ＩＤＴによって生成されたＲＮＡオリゴ（ＳＥＱ ＩＤ＝２）を５´ライゲーションに使用した。反応混合物を、以下の表に記載されたように調製した：

ライゲーション溶液の６０μＬアリコートをスライド上の組織に添加し、さらに、湿度ボックス内で（２５℃にて１時間、及び、３７℃にて１時間）インキュベートした。スライドをＰＢＳにおいて洗浄する（２ｘ５秒）ことによってライゲーション溶液を停止させた。２００μＬの市販の溶解緩衝液（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｖｅｒｓａｎｔ ＲＮＡ単離キット）を組織の上に４回添加する、及び、それをＰＣＲクリーン１．５ｍＬ遠心チューブに移すことによってＲＮＡを収集した。製造業者のプロトコル（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｖｅｒｓａｎｔ ＲＮＡ単離キット）に従ってＲＮＡをさらに単離した。

次に、連結された生成物の検出を、連結された生成物に対して特別に設計したＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを用いて決定した。図３における増幅曲線及び以下の表における使用したオリゴヌクレオチドを参照されたい。ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイは、Ｂ−アクチンｍＲＮＡ上の連結された生成物を検出する。上記と同じようにスライドを処理したが、実際にはライゲーション配列（クローニングリンカー及びＲＮＡオリゴ）を添加しないネガティブコントロールを使用し、赤色で示した。ＰＣＲコントロールに対してノーテンプレートコントロール（ＮＴＣ）を使用し、黒色で示した。３´ライゲーション生成物を決定するために１つのＲＴ−ｑＰＣＲアッセイ、５´ライゲーション生成物の存在を決定するために１つのＲＴ−ｑＰＣＲアッセイ、及び、全Ｂ−アクチンｍＲＮＡレベルを決定するための対照として最後のＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを使用した。

Claims (17)

1. 組織試料内の核酸を空間的に検出する方法であって、
   （ａ）前記試料を少なくとも第１の層及び第２の層に分けるステップと、
   （ｂ）前記第１の層に少なくとも１つのイメージングラベルを加えるステップと、
   （ｃ）前記第１の層を画像化するステップと、
   （ｄ）前記第１の層の画像から、前記試料内の少なくとも１つの関心領域（ＲＯＩ）を同定し、前記ＲＯＩを前記第２の層に適用するステップと、
   （ｅ）少なくとも１つの種のオリゴヌクレオチドプローブを、前記ＲＯＩ内のフルセパレーションマスクによって画定される既定の位置の上に加え、さらに、前記オリゴヌクレオチドプローブが前記試料の前記核酸に結合するのを可能にするステップであり、それぞれの種の前記オリゴヌクレオチドプローブは独特なバーコード配列を含む、ステップと、
   （ｆ）核酸−オリゴヌクレオチドプローブの複合体を抽出するステップと、
   （ｇ）抽出された前記核酸の分子を配列決定するステップと、
   （ｈ）前記オリゴヌクレオチドプローブの１つ又は複数の前記バーコード配列を包含する配列決定された前記核酸の分子を、前記１つ又は複数のバーコード配列に基づき、前記ＲＯＩ内の対応する標的核酸分子の最初の位置に関連づけて、前記標的核酸分子の空間分布を生成するステップであり、各位置が、ステップ（ｅ）において結合する１つ又は複数の種のオリゴヌクレオチドプローブによって同定される、ステップと、
   を含む方法。
2. ステップ（ｇ）に先立ち、ＤＮＡ分子が、ＤＮＡ増幅を介して前記核酸−オリゴヌクレオチドプローブの複合体から生成される、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＤＮＡ分子の生成は、逆転写反応の後で生じる、請求項２に記載の方法。
4. ステップ（ｅ）において、前記試料の核酸に対する前記オリゴヌクレオチドプローブの結合は、ハイブリダイゼーションを介して生じ、さらに、前記オリゴヌクレオチドプローブは、プライマーとして使用される、請求項２又は３に記載の方法。
5. ステップ（ｅ）において、前記試料の核酸に対する前記オリゴヌクレオチドプローブの結合は、ライゲーションを介して生じる、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
6. ステップ（ｈ）は、前記標的核酸分子の空間分布を、ステップ（ｅ）の前に得られた前記ＲＯＩの画像又は前記ＲＯＩが同定された前記組織試料の画像に関連づけるステップをさらに含む、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
7. 二次元の空間マップを提供して前記標的核酸分子の空間分布を可視化するステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記二次元の空間マップを、ステップ（ｅ）の前に得られた前記ＲＯＩの画像又は前記ＲＯＩが同定された前記組織試料の画像でオーバーレイするステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
9. ステップ（ｅ）において、少なくとも２つの異なる種のオリゴヌクレオチドプローブが１つの標的核酸分子に結合され、さらに、前記少なくとも２つの異なる種のオリゴヌクレオチドプローブの独特な組み合わせが、前記ＲＯＩ内の前記標的核酸分子の位置を同定するために使用される、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
10. １つの核酸分子に結合する前記オリゴヌクレオチドプローブの種のうち少なくとも１つが一般配列を含む、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法。
11. １つの核酸分子に結合する前記オリゴヌクレオチドプローブの種のうち少なくとも１つが追加的配列を含み、前記追加的配列は、精製配列又はプライマーアライメント配列である、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記フルセパレーションマスクは、格子のセパレーションマスク、自由形状のセパレーションマスク又はその組み合わせである、請求項１に記載の方法。
13. ステップ（ｅ）において、加えられる前記オリゴヌクレオチドプローブが異なる既定の位置間で混合しないように、前記オリゴヌクレオチドプローブは、液体移送技術によって、前記既定の位置の上に加えられる、請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記試料は、病理組織学的検体、又は、細胞学的試料である、請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記一般配列は前記標的核酸に相補的である、請求項１０に記載の方法。
16. 前記液体移送技術は、コンタクトプリント技術又はノンコンタクトプリント技術である、請求項１３に記載の方法。
17. 前記病理組織学的検体は、脱パラフィンされたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料、新鮮凍結（ＦＦ）試料、又は新鮮試料である、請求項１４に記載の方法。

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