JP6860165B2 - 抗癌剤投与効果予測方法 - Google Patents

Description

本発明は、抗癌剤の投与効果を予測する方法に関する。特に本発明は、癌原発組織および癌転移組織以外の試料（例えば血液試料）由来の腫瘍細胞を用いた、抗癌剤の投与効果を予測する方法に関する。

近年、癌患者への抗癌剤の投与判断に、患者検体由来の腫瘍細胞が有する遺伝子変異に基づくコンパニオン診断が用いられている。コンパニオン診断に基づき、医師が抗癌剤の投与を判断することにより、癌患者に対し不必要な治療（不必要な抗癌剤の投与）を行なうリスクが低減する。そのため、医療費の低減に寄与し、かつ最適な治療による患者の予後改善にも寄与する。

患者検体由来の腫瘍細胞が有する遺伝子変異に基づくコンパニオン診断においては、通常、生検や組織切除により得られた、癌原発組織または癌転移組織由来の腫瘍細胞を遺伝子解析する。例えば、メラノーマに対する抗癌剤であるベムラフェニブの投与を検討する際、メラノーマ患者の癌原発組織または癌転移組織由来の腫瘍細胞が有する遺伝子変異を解析し、その結果、ＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００の位置に遺伝子変異があれば、ベムラフェニブが高い奏効性を示すと判断する。

その一方で、癌原発組織または癌転移組織では、Ｘ腺照射や薬剤投与などによる外部環境の変化や細胞のコピーエラーなどにより、異なる遺伝子変異を持つ腫瘍細胞が経時的に生じることも知られている。しかしながら、このような異なる遺伝子変異を持つ腫瘍細胞は、当該癌組織に占める割合が少ない場合や当該癌組織において偏在している場合が多く、当該癌組織から採取した腫瘍細胞を試料として、当該遺伝子変異を持つ腫瘍細胞を検出することは、一般に、困難であった。また、手術などにより癌原発組織などを完全に切除した場合、当該組織における遺伝子変異の経時的変化を追うこと自体が不可能となってしまう。これらの理由から、癌原発組織または癌転移組織から採取した腫瘍細胞における遺伝子変異の経時的変化を、癌患者への抗癌剤の投薬判断に反映させることは、これまで的確に行うことができなかった。

また近年、体内で細胞が死ぬ際に細胞の内容物とともに放出された微量のＤＮＡが血液中に存在することが知られており（このようなＤＮＡを「循環遊離ＤＮＡ（血中遊離ＤＮＡ、セルフリーＤＮＡ）」と称する）、当該ＤＮＡ中の標的遺伝子を遺伝子診断に活用する試みがなされている。例えば、癌原発組織または癌転移組織由来の腫瘍細胞が死ぬ際、当該細胞由来のゲノムＤＮＡが放出される。放出されたゲノムＤＮＡは、マクロファージなどの食細胞により消化されるが、未消化のゲノムＤＮＡは、正常細胞由来の未消化のゲノムＤＮＡと共に循環遊離ＤＮＡとして血管を流れる。前記腫瘍細胞由来の循環遊離ＤＮＡを用いることで、癌組織の採取と比較して低侵襲的な遺伝子変異解析が可能となる。

しかしながら、上記の通り、異なる遺伝子変異を持つ腫瘍細胞は、当該癌組織に占める割合が少ない場合や当該癌組織において偏在している場合が多く、当該癌組織から放出される循環遊離ＤＮＡ全体に占める当該異なる遺伝子変異を持つＤＮＡの割合が極めて少ないことから、循環遊離ＤＮＡを用いて当該異なる遺伝子変異を検出することは、いまだ困難である。

他方、前述した異なる遺伝子変異を持つ腫瘍細胞が検出されない場合であっても、血中循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ、以下、「ＣＴＣ」と称する）の数をモニタリングすることにより、患者の予後や治療効果などを含め複合的な患者の病態を評価することが行われている。また、近年、癌原発組織または癌転移組織に代わる遺伝子解析のための対象細胞としても、ＣＴＣが用いられている。例えば、非特許文献１では、癌患者由来の血液から回収したＣＴＣの遺伝子解析を開示している。この文献では、単一細胞でのＣＴＣの遺伝子解析も行っている。また、特許文献１では、前立腺癌患者より回収したＣＴＣにおけるＡＲ−Ｖ７（Ａｎｄｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｐｌｉｃｅ Ｖａｒｉａｎｔ−７）のＲＮＡ発現量を解析することで、前立腺癌に対する薬剤であるエンザルタミドおよびアビラテロンの投与判断が行なえることを開示している。

さらに特許文献２では、無細胞体液試料から疾患もしくは症状の１つまたは複数のマーカーについての第１プロファイルを決定し、ＤＮＡ量が２ｎである貪食細胞（２ｎ貪食細胞）集団または非貪食細胞集団から、前記１つまたは複数のマーカーのうちの少なくとも１つについての第２プロファイルを決定し、前記マーカーのうちの少なくとも１つについて、第１プロファイルと第２プロファイルとの差異を同定し、前記差異に基づき、前記試料提供患者における前記疾患もしくは症状の存在、発症するリスクもしくはその評価、予後予測もしくはその補助、または診断もしくはその補助を行なうことを開示している。

しかしながら、ＣＴＣにおいて、癌原発組織、癌転移組織または循環遊離ＤＮＡでは検出されない遺伝子変異の有無やその経時的変化を検出し、それらを指標として複合的な癌患者の病態を評価することは、これまで報告されていない。

ＷＯ２０１６／０３３１１４号 特開２０１７−６０４７９号公報

Ｋ．Ｓａｋａｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，１０６，９３９−９４６（２０１２）

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、腫瘍細胞における遺伝子変異の経時的な変化を鋭敏に検出して、癌患者における抗癌剤投与効果を高い精度で予測しうる方法を提供することにある。

上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、癌原発組織および癌転移組織以外の試料由来の腫瘍細胞、特にＣＴＣを用いることにより、腫瘍細胞における遺伝子変異の経時的な変化を鋭敏に検出することができ、引いては、抗癌剤投与効果を高い精度で予測しうることを見出し、本発明に到達した。

すなわち本発明の第一の態様は、抗癌剤投与効果の予測方法であって、
（１）癌患者より癌原発組織および癌転移組織以外の試料を採取する工程、
（２）（１）で採取した試料から腫瘍細胞を回収する工程、および
（３）（２）で回収した腫瘍細胞における遺伝子変異を解析して、癌原発組織もしくは癌転移組織由来の腫瘍細胞もしくは循環遊離ＤＮＡでは検出されないか、または主要ではない変異を同定する工程、
を含み、（３）で同定された変異を抗癌剤投与効果の指標とする方法である。

さらに、本発明の第二の態様は、抗癌剤投与効果の予測方法であって、
（１）癌患者より癌原発組織および癌転移組織以外の試料を採取する工程、
（２）（１）で採取した試料から腫瘍細胞を回収する工程、および
（３）（２）で回収した腫瘍細胞の細胞数を計測し、かつ、（２）で回収した腫瘍細胞における遺伝子変異を解析して、癌原発組織もしくは癌転移組織由来の腫瘍細胞もしくは循環遊離ＤＮＡでは検出されないか、または主要ではない変異を同定する工程、
を含み、（３）で計測した腫瘍細胞の細胞数、および（３）で同定された変異を抗癌剤投与効果の指標とする方法である。

また、本発明の第三の態様は、（２）の工程を、試料中に含まれる腫瘍細胞を保持可能な保持部を複数設けた細胞保持手段と誘電泳動力を発生させる手段とを備えた細胞回収装置を用いて行なう、前記第一または第二の態様のいずれかに記載の方法である。

また、本発明の第四の態様は、癌原発組織および癌転移組織以外の試料が血液試料であり、腫瘍細胞が血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）である、前記第一から第三の態様のいずれかに記載の方法である。

また本発明の第五の態様は、抗癌剤がＢ−Ｒａｆ酵素阻害薬であり、遺伝子変異がＢＲＡＦ遺伝子の変異である、前記第一から第四の態様のいずれかに記載の方法である。

また、本発明の第六の態様は、癌が間葉系癌である、前記第一から第五の態様のいずれかに記載の方法である。

本発明では、経時的な遺伝子変異を生じやすい腫瘍細胞の遺伝子情報解析を、癌原発組織および癌転移組織以外の試料から採取した腫瘍細胞に対して行ない、癌原発組織もしくは癌転移組織由来の腫瘍細胞もしくは循環遊離ＤＮＡでは検出されないか、または主要ではない変異を抗癌剤投与効果の指標とすることで、抗癌剤投与効果の予測のための精度の高い情報を提供できる。

本発明の好ましい態様では、癌原発組織および癌転移組織以外の試料中に含まれる腫瘍細胞数を計測する工程も実施しており、当該計測された腫瘍細胞数をも抗癌剤投与効果の指標に追加することで、抗癌剤投与効果の予測において、より精度の高い情報を提供することもできる。

また、本発明により、癌患者が抱える病状に最適な投薬指標や、病状における危険性や生存の確率に関する情報を医師に提供できるため、医師は最適な治療方法を選択できる。その結果、不必要な治療（不必要な抗癌剤の投与）を患者に行なうリスクを低減させることができ、不必要な治療に対する費用の節約だけでなく、最適な治療選択による患者の予後改善に寄与できる。

さらに、本発明は、癌患者に対する抗癌剤の投与効果の予測のみならず、予後の予測や癌転移の予測にも応用することが可能である。癌診断において、癌の早期発見に応用することも可能である。

本発明において腫瘍細胞を回収する工程で使用可能な、腫瘍細胞を保持可能な細胞回収装置の一例を示した図（分解図）である。 図１に示す装置の正面図である。 図１に示す装置を用いた、腫瘍細胞を回収する工程の一例を示した図である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明において、癌の限定は特になく、例えば、白血病、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫などの造血細胞悪性腫瘍、脳腫瘍、乳癌、子宮体癌、子宮頚癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、虫垂癌、大腸癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、膵臓癌、副腎癌、消化管間質腫瘍、中皮腫、口腔底癌、歯肉癌、舌癌、頬粘膜癌などの喉頭癌口腔癌、頭頚部癌、唾液腺癌、副鼻腔癌、甲状腺癌、腎臓癌、肺癌、骨肉腫、骨癌、前立腺癌、精巣腫瘍、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、肛門癌、メラノーマが挙げられる。また原発癌でもよいし転移癌であってもよい。

本発明を適用する癌患者は、効果予測対象の抗癌剤の投与をすでに受けた患者であってもよいし、当該抗癌剤の投与を現在受けている患者であってもよいし、当該抗癌剤の投与を受ける前の患者であってもよいが、投薬方針を判断する観点から、抗癌剤の投与前または投与中の患者が好ましい。

本発明における癌原発組織および癌転移組織以外の試料は、腫瘍細胞を含む試料であれば特に限定はなく、例えば、尿、全血、血漿、血清、唾液、精液、糞便、痰、髄液、羊水、リンパ液、腹水、胸水や、前記癌原発組織および癌転移組織以外の組織や器官（肝臓、肺、脾臓、腎臓、皮膚、リンパ節、動脈など）といった生体試料、ならびに前記生体試料中に含まれる細胞／組織の培養物や培養液（培養試料）が挙げられる。なお、癌原発組織および癌転移組織以外の試料は、その性状に応じて、予め希釈、混合、分散、懸濁などの処理を行なってもよい。

前記生体試料のうち、血液試料（例えば、全血、血漿、血清などの血液検体や、当該血液検体を生理食塩水などで希釈した試料）は、癌患者からの試料採取や試料中に含まれる腫瘍細胞の回収が容易に行なえる点で、本発明における癌原発組織および癌転移組織以外の試料として好ましい。

本発明では、まず前述した癌原発組織および癌転移組織以外の試料を採取した後、当該採取した試料から腫瘍細胞を回収する。癌原発組織および癌転移組織以外の試料が全血、血漿、血清といった血液試料であり、腫瘍細胞が血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）である場合、例えば、当該血液試料から密度勾配遠心法（特開２０１５−００６１６９号公報）やフィルタ−法（特開２０１４−２３３２６７号公報）などによりＣＴＣを含む（ＣＴＣが濃縮された）画分を取得し、当該画分からＣＴＣを回収することができる。

密度勾配遠心法により腫瘍細胞を含む画分を取得する場合には、密度勾配溶液に試料を重層した後、遠心分離を行う。当該遠心分離により試料中に含まれる夾雑細胞（血液試料の場合、赤血球、白血球など）は下層（密度勾配溶液側）に移動する一方、腫瘍細胞は上層（試料側）に残るため、当該上層を回収することで腫瘍細胞を含む（腫瘍細胞が濃縮された）画分を取得することができる。なお、前述した腫瘍細胞を含む画分の取得を、前記上層と前記下層とが分離可能な容器（特開２０１５−００６１６９号公報）を用いて行なうと、腫瘍細胞を含む画分の取得が容易となるため好ましい。さらに、試料が血液試料の場合には、当該試料を密度勾配溶液に重層する前に、当該試料を溶血させる工程（溶血操作）を行なうと、夾雑細胞である赤血球の細胞数を減少させることができ、前記上層への赤血球の混入数も減少するため好ましい。なお、前記溶血操作は密度勾配遠心分離後に実施してもよく、その場合は、再度遠心分離などによる夾雑細胞の除去操作を行なってもよい。

前述した方法で得られた腫瘍細胞を含む画分は、凍結保存や化学固定による保存処理を行なってもよい。例えば、凍結保存する場合は、細胞保存溶液に溶液置換をした後、０℃以下の温度、好ましくは−２０℃以下、さらに好ましくは−８０℃以下の温度で保存すればよく、化学固定する場合は、細胞懸濁液に安定化剤を添加し、タンパク質を不溶化および／または不活性化する細胞固定処理を施すことで、前記細胞の劣化を長時間抑制すればよい。化学固定に用いる安定化剤としては、例えば、アルデヒド類、酸類、脱水剤・有機溶媒類、金属塩類などの細胞固定剤を含む溶液が挙げられる。

前述した方法で得られた腫瘍細胞を含む画分には、腫瘍細胞以外の夾雑細胞（血液試料の場合、特に白血球）がまだ多く含まれる。従って、前記画分中に存在する腫瘍細胞を特異的に検出してから、腫瘍細胞を回収すると好ましい。腫瘍細胞を検出するには、例えば、まず、腫瘍細胞を含む画分をスライドに塗布するか、または腫瘍細胞を保持可能な装置に腫瘍細胞を含む画分を導入して腫瘍細胞を前記装置に保持させる。その後、顕微鏡や光学検出器などを利用して、前記腫瘍細胞が有する特徴に基づいて、腫瘍細胞を検出すればよい。また、腫瘍細胞を含む画分をフローサイトメーターに導入することで腫瘍細胞を検出してもよい。

腫瘍細胞を回収可能な細胞回収装置の一例を図１に示し、その正面図を図２に示す。

図１および図２に示す細胞回収装置１００は、
貫通孔１１ａを有する平板状の遮光部材１１と、
貫通孔１２ａを有する平板状の絶縁体１２と、
導入口２１、排出口２２および貫通部２３を有する平板状のスペーサ２０と、
遮光部材１１の下部およびスペーサー２０の上部と密着するよう設けた電極基板３１、３２と、
電極基板３１、３２同士を接続する導線４０と、
電極基板３１、３２に信号を印加する信号発生器５０と、
を備えている。

遮光部材１１が有する貫通孔１１ａと絶縁体１２が有する貫通孔１２ａとは互いに同一の寸法および形状であり、かつそれぞれの貫通孔の位置が一致するよう遮光部材１１および絶縁体１２を設けている。貫通孔１１ａ、貫通孔１２ａおよび遮光部材１１の下部に密着して設けた電極基板３１により、細胞回収手段１０内に保持部６０が構成され、導入口２１から細胞を含む液体を導入すると、貫通部２３を通じて保持部６０へ細胞が導入される。電極基板３２はスペーサ２０上部に密着して設けており、導入口２１から導入した、細胞を含む液体の飛散や蒸発を防止している。なお、保持部６０に保持した細胞の回収を容易にするため、電極基板３２はスペーサ２０から取り外し可能な構造となっている。また電極基板３１・３２をＩＴＯ（酸化インジウムスズ）などの透明電極にすると、保持部６０に保持された細胞を、顕微鏡や光学検出器を用いて検出可能となるため好ましい。

図１および図２に示す細胞回収装置１００に腫瘍細胞を保持させる際は、腫瘍細胞を含む画分をスペーサ２０に設けた導入口２１から導入後、信号発生器５０から導線４０を介して電極基板３１・３２へ交流電圧を印加することで誘電泳動力を発生させ、腫瘍細胞を保持させるとよい。腫瘍細胞を含む画分を細胞回収装置１００に導入する際は、予め当該画分を遠心分離することで腫瘍細胞を含むペレットを得た後、マンニトール、グルコ−ス、スクロ−スなどの糖を含む溶液に当該ペレットを懸濁させてから細胞回収装置１００に導入すると、腫瘍細胞へのダメ−ジが少なくなるため好ましい。なお、前記ペレットの懸濁液として前述した糖の他に、ＢＳＡやカゼイン等のタンパク質、親水性高分子を結合したタンパク質をさらに含んでもよい。前記ペレットの懸濁液中に含まれる糖の濃度は腫瘍細胞と等張になる濃度とすればよく、糖としてマンニトールを用いる場合は終濃度で２５０ｍＭから３５０ｍＭの間とすればよい。電極基板３１・３２へ印加する交流電圧としては、ピ−ク電圧が１Ｖから２０Ｖ程度で、周波数１０ｋＨｚから１０ＭＨｚ程度である、正弦波、矩形波、三角波、台形波が例示できる。具体例として、生きた腫瘍細胞を保持部に１つずつ保持させたい場合は、周波数１００ｋＨｚから３ＭＨｚの矩形波を使用すると好ましい。

前述した通り腫瘍細胞の検出は、当該腫瘍細胞が有する特徴に基づき検出すればよい。例えば、血液試料中に含まれる腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出する場合は、細胞核を有し、かつ白血球マーカー（ＣＤ４５など）を実質的に発現していない、および／または癌細胞由来マーカーもしくは上皮系マーカー（サイトケラチン（ＣＫ）やＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）など）を発現している細胞をＣＴＣとして検出する態様が挙げられる（Ｓ．Ｌ．Ｗｅｒｎｅｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｉｒｃ．Ｂｉｏｍａｒｋ．，４：３，ｄｏｉ：１０．５７７２／６０７２５（２０１５）参照）。ここで「白血球マーカーを実質的に発現していない」とは、白血球マーカーの発現がほとんど確認できないことをいい、具体的には、対象細胞におけるマーカーの発現量が、白血球マーカーを発現する細胞（白血球など）の発現量の半分未満、好ましくは１／３未満、より好ましくは１／５未満、さらにより好ましくは１／１０未満である場合に「白血球マーカーを実質的に発現しない」と評価しうる。また、対象細胞におけるマーカーの発現量が、白血球マーカーを発現しないことが知られている陰性対照細胞（例えば、血管内皮細胞、間葉系幹細胞）と同等の発現量である場合も「白血球マーカーを実質的に発現しない」と評価しうる。癌細胞由来マーカーとしては、癌種によって様々なタンパク質が挙げられるが、間葉系癌の一つであるメラノーマの場合は、ｇｐ１００やＭＡＲＴ−１が例示できる。なお、ＣＫにはＣＫ１からＣＫ２０まで２０種類のタンパク質が知られているが、そのいずれもが前記上皮系マーカーとして使用可能である。

腫瘍細胞の検出を当該腫瘍細胞が有する光学的特徴に基づき検出する場合、細胞核の検出は、４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）やＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（商品名）などの細胞核染色試薬で染色して検出すればよい。また、マーカーの検出は、当該マーカーを直接呈色試薬や蛍光試薬で染色して検出してもよく、当該マーカーに対する標識化抗体又は当該タンパク質に対する一次抗体と当該一次抗体に対する標識二次抗体を用いて検出してもよく、当該マーカーの遺伝子を特異的に増幅して検出してもよい。中でもマーカーの検出を当該マーカーに対する標識化抗体を用いて検出する方法は、当該マーカーを簡便、高感度、かつ特異的に検出できる方法であり好ましく、さらに標識二次抗体を用いた検出がより高感度、かつ特異的に検出できるため特に好ましい。なお、抗体を標識する物質も特に限定はなく、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商品名）などの蛍光物質が挙げられる。

腫瘍細胞検出の別の態様として、細胞の大きさに基づき検出する態様が挙げられる。腫瘍細胞の多くは赤血球（直径７μｍから８μｍ、厚さが２μｍ程度の円盤形）や白血球（マクロファージを除けばおよそ直径６μｍから１５μｍの球状）と比較して径が大きい（ＣＴＣの場合、直径１０μｍから３０μｍ）ことが知られており（Ｒｏｓｔａｇｎｏ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１７（４Ａ），２４８１−２４８５（１９９７））、赤血球や白血球と比較して径が大きな細胞を指標とすることにより、腫瘍細胞（例えば、メラノーマなど上皮間葉転移を起こした腫瘍組織由来の間葉系細胞）を精度よく検出できる。

腫瘍細胞検出のさらに別の態様として、細胞核の大きさに基づき検出する態様が挙げられる。腫瘍細胞の多くは正常細胞と比較して細胞核が大きいことが知られており、正常細胞と比較して細胞核が大きな細胞を抽出することにより、正常細胞とほぼ同じ径の腫瘍細胞であっても精度よく検出することが可能となる（特願第２０１２−５３５３４５号、特許第５１３８８０１号参照）。細胞核の大きさの測定は、具体的には、細胞核領域を染色可能な試薬で染色して測定すればよい。

検出器による腫瘍細胞の検出は、例えば、カメラなどの撮像手段で撮像することで得られた画像（明視野像、蛍光画像、発光画像など）をパソコン等に取り込んだ後、ソフトウェアを用いて腫瘍細胞か否かを判別すればよい。ソフトウェアを用いずに、目視により腫瘍細胞か否かを判別することもできる。

前述した方法で検出した腫瘍細胞は、細胞を採取可能な採取手段を用いて回収すればよい。採取手段としては、例えば、ポンプや電気浸透流などを用いた吸引による採取手段が挙げられる。腫瘍細胞がポリ−Ｌ−リジンなどの接着物質により比較的強く基板に接着されており、かつ採取手段としてシリンジポンプを用いる場合は、高流速で吸引する必要があるため、流量を０．０１から５．０μＬ／ｓの間とすると好ましい。細胞の吸引で用いる細管の材質としては、ガラス、金属、樹脂等が挙げられるが、耐衝撃性および光透過性が高いガラスが好ましい。また、細管の内径は、吸引後の細管内での詰まりを防ぐため、吸引する細胞の直径よりも大きくすることが好ましい。例えば、直径３０μｍの保持部（保持部間の距離は５０μｍ）に導入された細胞を吸引する場合は、細管の内径を２５μｍから３５μｍの間とすることができる。

癌原発組織および癌転移組織以外の試料から回収した腫瘍細胞は、遺伝子変異解析に供される。前記腫瘍細胞は、前述した検出および採取手段により回収した腫瘍細胞を用いてもよいが、癌原発組織および癌転移組織以外の生体試料の懸濁液や培養試料といった試料中に含まれる腫瘍細胞が多い場合および／または夾雑細胞が少ない場合は、前述した密度勾配遠心法やフィルター法などにより得られた腫瘍細胞を含む画分（腫瘍細胞が濃縮された画分）をそのまま遺伝子変異解析に供してもよい。遺伝子変異解析手法に関しては特に限定はなく、例えば、回収した腫瘍細胞から、遺伝子を抽出した後、遺伝子解析をすればよい。その際に抽出した遺伝子の増幅反応を行なってもよく、遺伝子の増幅法としては、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法や、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などを用いることができる。遺伝子変異解析においては、例えば、サンガー法、サイクルシークエンス法、次世代シークエンシングなどの手法により、抽出した遺伝子（またはその増幅産物）の塩基配列を決定してもよく、また、例えば、抽出した遺伝子を特定の変異を検出可能なプライマーセットを用いた核酸増幅反応（前述したＰＣＲ法、ＴＲＣ法、ＬＡＭＰ法など）を行うことで定性的に解析してもよく、抽出した遺伝子の絶対数を定量するためにデジタルＰＣＲ法を行なってもよい。

前述した方法で解析された、癌原発組織および癌転移組織以外の試料由来の腫瘍細胞の遺伝子変異情報に基づき、対象患者（前記試料を採取した患者）に対する抗癌剤の投与効果を予測することができる。

遺伝子の中には、その変異が抗癌剤の奏効性に影響を与える遺伝子が存在する。このような遺伝子においては、例えば、その変異が、コードするタンパク質の構造や活性に影響を及ぼし、それにより患者に対する抗癌剤の奏効性や副作用が変化する。従って、当該遺伝子の変異は、抗癌剤投与を行なう際の指標となる。例えば、ゲフィチニブやエルロチニブといった上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬（ＥＧＦＲ−ＴＫＩ）については、ＥＧＦＲ遺伝子の変異がそれらの奏効性に関与することが知られており、また、ベムラフェニブ、ダブラフェニブやエンコラフェニブといったＢ−Ｒａｆ酵素阻害薬については、ＢＲＡＦ遺伝子の変異がそれらの奏効性に関与することが知られている。

本発明においては、具体的には、癌原発組織および癌転移組織以外の試料由来の腫瘍細胞で検出される遺伝子変異のうち、癌原発組織もしくは癌転移組織由来の腫瘍細胞もしくは循環遊離ＤＮＡでは検出されないか、または主要ではない変異（以下、「本発明の対象変異」と称する。）を指標として、抗癌剤投与効果の予測を行う。なお、本発明において、「循環遊離ＤＮＡ」とは、体内で細胞が死ぬ際に細胞の内容物とともに放出され血中に流れ込むＤＮＡを意味する。また、「主要ではない変異」とは、癌原発組織もしくは癌転移組織由来の腫瘍細胞または循環遊離ＤＮＡで検出される遺伝子変異のうち、頻度が１０％以下、例えば、５％以下、３％以下、１％以下の変異を意味する。変異の検出および頻度の決定は、本願実施例に記載の方法で行うことができる。

本発明の対象変異は、癌原発組織および癌転移組織以外の試料由来の腫瘍細胞で検出される遺伝子変異と、前記癌原発組織もしくは癌転移組織由来の腫瘍細胞または循環遊離ＤＮＡで検出される遺伝子変異とを比較することにより同定することができる。遺伝子変異の比較のために用いられる、癌原発組織および癌転移組織以外の試料由来の腫瘍細胞、並びに癌原発組織もしくは癌転移組織由来の腫瘍細胞または循環遊離ＤＮＡは、同一人に由来することが好ましい。

遺伝子変異の比較においては、癌原発組織および癌転移組織以外の試料由来の腫瘍細胞（以下、腫瘍細胞Ａとも表記）で検出される遺伝子変異と、前記癌原発組織もしくは癌転移組織由来の腫瘍細胞（以下、腫瘍細胞Ｂとも表記）または循環遊離ＤＮＡで検出される遺伝子変異とを、（ｉ）遺伝子変異位置、（ｉｉ）遺伝子変異数、（ｉｉｉ）遺伝子変異の種類などの相違に基づき比較すればよい。抗癌剤の投与効果の予測においては、腫瘍細胞Ａにおける本発明の対象変異の有無のみならず、その頻度を考慮に入れることができる。また、特定の時点での本発明の対象変異の状況のみならず、その経時的な変化を考慮に入れることができる。

例えば、前記比較の結果、本発明の対象変異が腫瘍細胞Ａに存在する場合、一定のしきい値（数または割合）以上存在する場合、または本発明の対象変異が検出される腫瘍細胞Ａの数または割合が増加する場合に、当該遺伝子に対応する抗癌剤の投与が有効または無効と予測できる。抗癌剤の投与が有効であると予測できる場合においては、有効性の程度（極めて有効、中程度に有効、わずかに有効など）を評価に含めてもよい。

前記予測の第一の態様として、腫瘍細胞Ｂもしくは循環遊離ＤＮＡで検出される遺伝子変異とは異なる位置にある変異を有する腫瘍細胞Ａの存在／不存在に基づく予測が挙げられる。また前記予測の第二の態様として、腫瘍細胞Ｂもしくは循環遊離ＤＮＡで検出される遺伝子変異とは異なる位置にある変異を有する腫瘍細胞Ａが一定のしきい値（数または割合）以上存在するか否かに基づく予測が挙げられる。また前記予測の第三の態様として、腫瘍細胞Ｂもしくは循環遊離ＤＮＡで検出される遺伝子変異とは異なる位置にある変異を有する腫瘍細胞Ａの数または割合の増加／減少に基づく予測が挙げられる。中でも前記第三の態様に基づく予測は、抗癌剤の投与効果予測を病態の変化よりも早期に予測できる点で、より好ましい。

本発明の方法による抗癌剤投与効果の予測は、医師が行なわずに、医療補助者などが行なうことができるし、装置及びソフトウェア上で自動で関連付けすることができる。したがって、本発明の方法は、医師による抗癌剤投与判断のための予備的方法、または医師による抗癌剤投与効果の予測のための情報を得る方法ということもできる。

腫瘍細胞の遺伝子変異と、それに対応する抗癌剤の投与効果予測との関係については、追跡試験を行なうことで決定することもできる。そのような関係は、患者が患っている癌疾患の種類及びステージに応じて決定することもできる。治療前の患者血液に含まれる腫瘍細胞の遺伝子情報に応じて、奏効性の高いまたは副作用の少ない抗癌剤との関連を予め決定することで、患者への抗癌剤投与方針を決定することができる。また、治療中の患者由来の試料に含まれる腫瘍細胞の遺伝子情報に応じて、奏効性の高いまたは副作用の少ない抗癌剤との関連を予め決定することで、遺伝子変異が生じやすい癌を患った患者に対しての抗癌剤投与方針を決定することもできる。さらに、治療後の患者由来の試料に含まれる腫瘍細胞の遺伝子変異情報に応じて、奏効性の高い薬剤または副作用の少ない抗癌剤との関連を予め決定することで、抗癌剤投与方針を決定することもできる。

本発明の好ましい態様の一つとして、本発明の対象変異を指標とすることに加えて、癌原発組織および癌転移組織以外の試料由来の腫瘍細胞数を指標とすることで、抗癌剤投与効果を予測する方法が挙げられる。癌原発組織および癌転移組織以外の試料由来の腫瘍細胞数と予後とは関連性があり、当該腫瘍細胞数が多いほど予後が悪い（血液試料中に含まれる腫瘍細胞の場合は特許第５４７９３５５号参照）。このことから、癌原発組織および癌転移組織以外の試料由来の腫瘍細胞数を計測することで、患者の予後を予測することができ、当該患者が抗癌剤を投与されている場合、当該抗癌剤投与による効果を予測することができる。従って、癌原発組織および癌転移組織以外の試料由来の腫瘍細胞における遺伝子変異を解析して、本発明の対象変異を同定する工程に加えて、癌原発組織および癌転移組織以外の試料由来の腫瘍細胞数を計測することで、抗癌剤投与による効果予測をより精度高く行なうことができる。なお、腫瘍細胞数を指標とする場合においては、単に採取した試料中に一定のしきい値以上の腫瘍細胞が存在するかを評価してもよく、試料を複数回採取し、当該採取した各試料中に含まれる腫瘍細胞数の経時変化を評価してもよい。

以下、本発明の予測方法の一例として、図１および図２に示す細胞回収装置１００を用いた、血液試料中に含まれる腫瘍細胞（ＣＴＣ）で検出される本発明の対象変異に基づく予測方法を説明するが、本発明は本説明の内容に限定されるものではない。

（１）癌の疑いのある患者または癌患者から血液を採取する。なお、血液を採取する際、クエン酸、ヘパリン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの抗凝固剤を添加してもよい。また必要に応じ、採取した血液を生理食塩水などで希釈してもよい。

（２）採取した血液（または希釈した血液）を密度勾配遠心法に供し、当該血液中に含まれる夾雑細胞（赤血球、白血球など）を除去する。密度勾配遠心法は、物質をその比重に基づき分離する方法であり、密度勾配を形成した媒体（密度勾配溶液）上に採取した血液（または希釈した血液）を重層した後、遠心分離を行なうことにより、夾雑細胞やごみを除去し、ＣＴＣを含む画分（上層）を回収することができる。なお、前記遠心分離を行なう前に、採取した血液（または希釈した血液）に、夾雑細胞（赤血球、白血球など）と結合可能な結合剤（例えば、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））を添加することもできる。前記結合剤は、赤血球、白血球および／またはこれら細胞の表面抗原と結合することで細胞凝集体を形成し、これら細胞の密度を大きくすることができるため、密度勾配遠心法によるＣＴＣの分離を容易にする。密度勾配遠心法により夾雑細胞やごみが除去されたＣＴＣを含む画分は、速やかに後続の操作を行なうことが好ましいが、後続の操作を速やかに行なえない場合は、凍結保存による保存処理を行なってもよい。凍結保存する際は、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ２（日本全薬工業社製）などの細胞保存溶液にＣＴＣを含む画分を懸濁させた後、−８０℃で凍結保存すればよい。

（３）（２）で得られたＣＴＣを含む画分に塩化アンモニウムを含む溶液を添加して撹拌することで、当該画分に混入した赤血球を溶血させる。本操作により、分離回収したＣＴＣの観察が良好になる。

（４）（３）で得られた溶血処理後のＣＴＣを含む溶液を遠心分離することで血液成分を除去することでＣＴＣをペレット状にした後、適切な溶液を用いてＣＴＣを懸濁させる。

（５）（４）で調製したＣＴＣを含む懸濁液を再度遠心分離し、ＣＴＣを含むペレットを回収する。なお、必要に応じ、前記回収したペレットを溶液に再度懸濁させ、遠心分離する工程を追加してもよい。

（６）（５）で得られたＣＴＣを、図１に示す細胞回収装置１００に設けた細胞保持手段１０上に展開後、誘電泳動力８０により細胞７０を保持部６０へ保持させる（図３（１））。

（７）接着物質９０を細胞回収装置１００に導入し、ＣＴＣを保持部６０に接着する（図３（２））。接着物質９０としては、例えばポリ−Ｌ−リジンを用いることができ、その濃度は０．０１（ｗ／ｖ）％以下とするとよい。

（８）保存処理剤および細胞膜透過処理剤を細胞回収装置１００に導入し、ＣＴＣの保存および膜透過処理を施す。保存処理剤としては、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒドドナー化合物（加水分解を受けることでホルムアルデヒドを放出可能な化合物）、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド類、メタノール、エタノールなどのアルコール類、および重金属を含む溶液が例示できる。細胞膜透過処理剤としては、メタノール、エタノールなどのアルコール類や、サポニンなどの界面活性剤が例示できる。

（９）抗体による非特異的な反応を防ぐため、保存および膜透過処理後の標的細胞を保持した保持部に対してタンパク質によるブロッキング処理を施す。

（１０）ブロッキング処理した後、白血球が発現するタンパク質（白血球マーカー）、上皮系細胞が発現するタンパク質（上皮系マーカー）、もしくは腫瘍細胞が発現するタンパク質（癌細胞由来マーカー）に対する蛍光標識抗体や、細胞核を蛍光染色させる試薬を用いて細胞を標識し（図３（３））、洗浄後、蛍光顕微鏡２００などで細胞の蛍光像および明視野像を観察する（図３（４））。白血球が発現するタンパク質に対する抗体としては、抗ＣＤ４５抗体を用いることができる。また、上皮系細胞が発現するタンパク質に対する抗体としては、抗ＣＫ抗体や抗ＥｐＣＡＭ抗体などを用いることができる。腫瘍細胞が発現するタンパク質に対する抗体としては。腫瘍細胞がメラノーマの場合、抗ｇｐ１００抗体や抗ＭＡＲＴ−１抗体などを用いることができる。細胞核を蛍光染色させる試薬としては、４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）やＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（商品名）などを用いることができる。

（１１）観察した蛍光像および明視野像を基にＣＴＣ７１を検出する（図３（４））。ＣＴＣの検出においては、例えば、細胞核が染色されており、抗ＣＤ４５抗体では標識されず、かつ上皮系細胞が発現するタンパク質に対する抗体（抗ＣＫ抗体や抗ＥｐＣＡＭ抗体など）または癌細胞が発現するタンパク質に対する抗体（メラノーマの場合、抗ｇｐ１００抗体や抗ＭＡＲＴ−１抗体）で標識された細胞をＣＴＣとして検出すればよい。また細胞核が染色されており、抗ＣＤ４５抗体では標識されず、かつ赤血球や白血球と比較して明視野像での細胞の形状が大きい細胞をＣＴＣとして検出してもよい。

（１２）蛍光顕微鏡２００で検出したＣＴＣ７１を回収するために、電極基板３２をスペーサ２０から取り外した後、回収装置３００で吸引することでＣＴＣ７１を回収する（図３（５））。電極基板３２を取り外す際は、スペーサ２０を剥がさないよう取り外す必要がある。もしスペーサ２０が絶縁体１２から剥がれると、装置内に保持されている溶液が系外に流れてしまい、ＣＴＣ７１が破壊されるからである。回収装置３００によるＣＴＣ７１の吸引は、前記（１１）で検出したＣＴＣ７１が保持されている保持部６０に回収装置３００を移動させ、回収装置３００により液を吸引することでＣＴＣ７１を回収する。なお、回収装置３００によるＣＴＣ７１の吸引位置を、ＣＴＣ７１を標本化した保持部６０の中心から水平方向に一定距離ずらした位置とすると、ＣＴＣ７１の吸引を容易に行なえるため好ましい。具体的にはＣＴＣ７１の吸引位置を、保持部６０の中心から水平方向に保持部６０の直径の０．１倍から２倍の長さ分（ただし隣接する保持部６０間の距離の２分の１以下）ずらし、かつ保持部６０の高さから垂直方向に保持部６０の高さの０．０１倍から２倍の高さ分高い位置とすると好ましい。また、回収装置３００によるＣＴＣ７１の吸引操作の前に、ＣＴＣ７１と保持部６０との接着性を弱める酵素を含む溶液を添加する操作を行なってもよい。

（１３）回収装置３００による吸引で回収したＣＴＣ７１を回収チュ−ブ４００へ吐出する（図３（６））。回収チュ−ブ４００へＣＴＣ７１が吐出されたかどうかを光学検出器２００で検出してもよい。

（１４）回収チュ−ブ４００に回収されたＣＴＣ７１中の遺伝子を抽出し、ＰＣＲ法により当該遺伝子を増幅した後、サンガー法により当該遺伝子の配列決定することで、遺伝子変異を解析する。

（１５）（１４）の解析結果と、癌原発組織もしくは癌転移組織由来の腫瘍細胞または循環遊離ＤＮＡにおける遺伝子変異の解析結果とを比較し、これら遺伝子変異位置の違いの有無に基づき、抗癌剤投与効果を予測する。なお、より精度の高い効果予測を行なう場合は、例えば、前記（１１）で検出されたＣＴＣを計数し、その経時変化を観察する工程を追加するとよい。

以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は当該例に限定されるものではない。

［実施例１］血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）における遺伝子変異と抗癌剤投与による病態との相関
（１）インフォームドコンセントを得たステージＩＶのメラノーマ患者から、治療経過に合わせて血液を計４回採取した。採血時期を以下に示す。
（１回目）Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害薬投与前
（２回目）Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害薬を投与し、病態の変化が認められない（病態が安定した）段階（１回目の採血から７ヶ月後）
（３回目）Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害薬を投与したものの、リンパ節転移や皮膚転移新生が認められた（病態が悪化した）段階であって、かつニボルマブの投与前（２回目の採血から８ヶ月後）
（４回目）ニボルマブ投与（５サイクル）により、ＣＴ画像診断による皮膚転移の縮小変化が認められた（病態が好転した）段階（３回目の採血から４ヶ月後）
（２）（１）で採取した血液１０ｍＬを２０×ｇで１０分間、室温にて遠心し、上清を除去後、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）２０ｍＬで懸濁することで、希釈血液試料を調製した。
（３）希釈血液試料を、密度１．０７７ｇ／ｍＬの密度勾配溶液に重層し、８００×ｇで２０分間、室温にて遠心後、上清部にあるＣＴＣを含む画分を回収した。
（４）（３）で回収したＣＴＣを含む画分にＰＢＳ３０ｍＬを加え、６００×ｇで１０分間、室温にて遠心分離することで上清を除去し、ＣＴＣを含むペレットを得た。
（５）ＣＴＣを含むペレットを、ＰＢＳ２０ｍＬで再懸濁し、３００×ｇで８分間、室温にて遠心分離することで上清を除去し、ＣＴＣを含むペレットを得た。
（６）再度ＣＴＣを含むペレットをＰＢＳ２０ｍＬで再懸濁した後、３００×ｇで８分間、室温にて遠心分離し、上清を除去した。（４）、（５）および本操作は、血液成分を除去し、所望とする細胞を濃縮するための操作である。
（７）ＣＴＣの長期保存を目的に、ＣＴＣを含むペレットを、細胞凍結保存液（ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ２、日本全薬工業社製）２ｍＬで再懸濁し、−８０℃にて凍結保存した。
（８）（７）で凍結保存したＣＴＣを含む懸濁液を解凍し、その一部を、３００ｍＭマンニトールを含む溶液１０ｍＬに懸濁後、３００×ｇで５分間、室温にて遠心分離することで上清を除去した。
（９）再度３００ｍＭマントールを含む溶液１０ｍＬで懸濁後、３００×ｇで５分間、室温にて遠心分離し、上清を除去した。（８）および本操作は、細胞凍結保存液を除去し、ＣＴＣを濃縮するための操作である。
（１０）（９）で上清を除去したＣＴＣを含む懸濁液を図１に示す細胞回収装置１００に設けた細胞保持手段１０に導入し、信号発生器５０から電極基板３１・３２へ交流電圧（周波数１ＭＨｚ）を３分間印加することで前記手段が有する保持部６０にＣＴＣを含めた細胞を保持させた。本実施例で用いた細胞回収装置１００は、直径３０μｍ、深さ４０μｍの微細孔を複数有する絶縁体１２と、絶縁体１２と電極基板３１の間に設置した遮光性のクロム膜（遮光部材１１）と、電極基板３１とからなる細胞保持手段１０に設けた保持部６０の上面に、厚さ１ｍｍのスペーサ２０および電極基板３２を密着させた構造である。
（１１）（１０）の条件で交流電圧を印加しながら、０．０１（ｗ／ｖ）％のポリ−Ｌ−リジンを含む３００ｍＭマンニトール水溶液を導入し、３分間静置後、前記交流電圧の印加を停止し、前記水溶液を吸引除去した。
（１２）５０％（ｖ／ｖ）エタノールと２％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドを含む水溶液（以下、「細胞膜透過試薬」と称する）を導入し、１０分間静置することで、細胞膜を透過させ、保持部にＣＴＣを含めた細胞を標本化した。
（１３）細胞膜透過試薬を吸引除去し、ＰＢＳを導入することで、残留した細胞膜透過試薬を洗浄した。
（１４）細胞膜内外のタンパク質と特異的に結合可能な蛍光標識抗体と、細胞核を標識する蛍光試薬（ＤＡＰＩ：４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）を含む水溶液（以下、標識試薬Ａ）を導入し、３０分間静置した。なお、前記標識された抗体として、白血球表面に発現しているＣＤ４５に対する抗体、ならびにメラノーマ細胞の細胞質内で発現しているｇｐ１００およびＭＡＲＴ−１に対する抗体を用いている。
（１５）標識試薬Ａを吸引除去し、ＰＢＳを導入することで、残留した標識試薬Ａを除去した。
（１６）（１５）で標識したＣＴＣを含む細胞保持手段を蛍光顕微鏡のステージ上に載置した後、複数の保持孔に捕捉した全ての細胞を観察するために保持部全体の撮像を行った。これにはコンピューター制御式電動ステージ、ＣＭＯＳカメラ（ＯＲＣＡ−Ｆｌａｓｈ４．０；浜松ホトニクス社製）を装備した蛍光顕微鏡（ＩＸ８３；オリンパス社製）を用いた。画像取得及び解析ソフトウェアにはＬａｂＶＩＥＷ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いた。
（１７）（１６）で撮像した細胞の中から、細胞核を有していることを示すＤＡＰＩで染色されており（ＤＡＰＩ陽性）、白血球で発現しているＣＤ４５に対する抗体では染色されず（ＣＤ４５陰性）、メラノーマの性質を有していることを示すｇｐ１００およびＭＡＲＴ−１に対する抗体で染色されている（ｇｐ１００／ＭＡＲＴ−１陽性）細胞を、目的とする腫瘍細胞（メラノーマ由来ＣＴＣ）として検出した。
（１８）スペーサ２０から電極基板３２を取り外した後、蛍光顕微鏡下で、円筒状の細管を用いて任意の保持部から（１７）で検出したメラノーマ由来ＣＴＣを一つずつ吸引した。吸引した前記細胞を、容器に吐出することで前記細胞を回収した。
（１９）（１８）で回収した細胞から遺伝子を抽出し、ＢＲＡＦ遺伝子領域をＰＣＲ法で増幅した。
（２０）（１９）で増幅させたＢＲＡＦ遺伝子からサンガー法による配列解析で当該遺伝子情報を取得し、変異の有無を解析した。

［実施例２］癌原発組織および癌転移組織における遺伝子変異
（１）実施例１（１）において採血した癌患者から、１回目の採血前に癌原発組織および癌転移組織であるリンパ節を、３回目の採血時に癌転移組織である新生皮膚転移組織を、それぞれ採取した。
（２）採取した各組織に対して、コバス ＢＲＡＦ Ｖ６００変異検出キット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて、遺伝子変異の有無を解析した。

実施例１で遺伝子情報が得られたメラノーマ由来ＣＴＣ数と、その遺伝子変異解析結果を表１に示す。また実施例２で遺伝子解析を行なった組織における遺伝子変異解析結果を表２に示す。

１回目の採血（Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害薬投与前）では、遺伝子情報が得られたメラノーマ由来ＣＴＣ１３個のうち、Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害薬による奏功性が高い、ＢＲＡＦ Ｖ６００部位の変異を有するＣＴＣが２個検出（当該変異を有するＣＴＣの割合１５．４％）され、かつその変異は、癌原発組織およびリンパ節（癌転移組織）で検出されるＢＲＡＦ Ｖ６００部位の変異（Ｖ６００Ｅ）とは異なる変異（Ｖ６００Ｋ）であった。ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｋの変異を有するＣＴＣが検出されたことから、この時点ではＢ−Ｒａｆ酵素阻害薬の投与が有効であることが予測される。

２回目の採血（Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害薬投与により病態安定）でも、遺伝子情報が得られたメラノーマ由来ＣＴＣ１０個のうち、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｋの変異を有するＣＴＣが１個検出（当該変異を有するＣＴＣの割合１０．０％）されており、遺伝子変異解析の結果からもＢ−Ｒａｆ酵素阻害薬投与が有効であることが示されている。事実、Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害薬の投与により病態は安定している。但し、２回目の採血では病態の変化が認められないにも関わらず、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｋの変異を有するＣＴＣの検出数および割合が１回目の採血時（ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｋの変異を有するＣＴＣが２個検出され、当該変異を有するＣＴＣの割合は１８．２％）と比較して減少していることから、２回目採血以降Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害薬が効きづらくなることが予測される。

３回目の採血時には、Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害薬投与を継続しているにも関わらず病態が悪化しており、Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害薬の奏効性が低下したことを示す。このことは上記２回目の採血結果からの予測（即ち２回目の採血以降にＢ−Ｒａｆ酵素阻害薬の奏効性が低下するとの予測）と合致している。３回目の採血では、遺伝子情報が得られたメラノーマ由来ＣＴＣ９個のうち、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｋの変異を有するＣＴＣは検出されない一方、皮膚転移組織が有するＢＲＡＦ Ｖ６００部位の変異と同じ変異（Ｖ６００Ｅ）を有するＣＴＣが１個検出（当該変異を有するＣＴＣの割合１１．１％）された。このことから皮膚転移組織由来の腫瘍細胞で検出されるＢＲＡＦ Ｖ６００部位の変異（Ｖ６００Ｅ）とは異なる変異（Ｖ６００Ｋ）を有するＣＴＣが検出されなくなると、Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害薬による奏功性が低下する（すなわち病状が悪化する）ことがわかる。一方、皮膚転移組織由来の腫瘍細胞にはＢＲＡＦ Ｖ６００部位の変異（Ｖ６００Ｅ）が残存していることから、癌原発組織または癌転移組織由来の腫瘍細胞で検出される変異を解析するのみでは、抗癌剤投与効果の予測が困難であることがわかる。

以上の結果から癌原発組織および癌転移組織由来の腫瘍細胞で検出される遺伝子変異とは異なる変異（ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｋ）を有するＣＴＣの数および割合の経時変化を観察することで、病態の変化を観察するよりも早期に、抗癌剤投与効果が予測できることがわかる。

なお、４回目の採血（ニボルマブ投与で病状好転）では、遺伝子情報が得られたメラノーマ由来ＣＴＣ１４個のうち、ＢＲＡＦ Ｖ６００変異を有するＣＴＣは検出されなかった。

また、実施例１（１７）で検出した、各採血時のメラノーマ由来ＣＴＣ数を計数した結果を表３に示す。

病態が悪化した３回目の採血時にメラノーマ由来ＣＴＣ数が大幅に上昇した一方（２回目の採血時１０４．２個／ｍＬ→３回目の採血時１０４４個／ｍＬ）、病状が好転した４回目の採血時ではメラノーマ由来ＣＴＣ数が減少している（３回目の採血時１０４４個／ｍＬ→４回目の採血時７６５．８個／ｍＬ）ことから、メラノーマ患者由来血液試料中に含まれるメラノーマ由来ＣＴＣ数と当該患者の病態とは相関していることがわかる。従って、メラノーマ患者由来血液試料中に含まれるメラノーマ由来ＣＴＣ数を観察することで、当該患者の予後予測、すなわち抗癌剤投与効果の予測が可能といえる。

［比較例１］ メラノーマ患者由来血液試料中の５−Ｓ−ＳＤ（５−Ｓ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌｄｏｐａ）量測定
実施例１（１）で採取した血液を用いて、メラノーマ診断時のマーカーとして従来から用いられている５−Ｓ−ＣＤの値を測定した。結果を表４に示す。

５−Ｓ−ＣＤに関しては、各採血時において正常であることを示す基準値（２．５から６．１ｎｍｏｌ／Ｌ）を超える値となった。しかしながら、病状が悪化した３回目の採血時において、２回目の採血時よりも５−Ｓ−ＳＤ量は低下していた（２回目の採血時３３．５ｎｍｏｌ／Ｌ→３回目の採血時２７．４ｎｍｏｌ／Ｌ）。このことから、メラノーマ患者由来血液試料中に含まれる５−Ｓ−ＳＤ量の経時変化を観察しても、当該患者の予後予測は困難といえる。

［実施例３］標識二次抗体を用いたＣＴＣ数の経時的推移と病態との相関
（１）インフォームドコンセントを得た、実施例１とは異なるステージＩＶのメラノーマ患者から、治療経過に合わせて血液を計３回採取した。採血時期を以下に示す。
（１回目）リンパ節転移箇所郭清後
（２回目）肺転移出現後（１回目の採血から５ヶ月後）
（３回目）肺転移増大、肝転移出現、皮膚転移増大が認められた（病態が悪化した）段階（２回目の採血から３ヶ月後）
（２）（１）で採取した血液を用いた他は、実施例１（２）から（１３）と同様な方法でＣＴＣを含む細胞を細胞膜透過試薬に曝した後、残存した細胞膜透過試薬を洗浄した。
（３）細胞膜内外のタンパク質と特異的に結合可能な一次抗体を含む水溶液を導入し、３０分間静置した。なお、前記一次抗体として、メラノーマ細胞の細胞質内で発現しているｇｐ１００およびＭＡＲＴ−１に対する抗体を用いている。
（４）一次抗体を含む水溶液を吸引除去し、ＰＢＳを導入することで、残存した一次抗体を含む水溶液を除去した。
（５）細胞膜内外のタンパク質と特異的に結合可能な蛍光標識抗体と、前記一次抗体に対して特異的に結合可能な蛍光標識二次抗体と、細胞核を標識する蛍光試薬（ＤＡＰＩ：４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）を含む水溶液（以下、標識試薬Ｂ）を導入し、２０分間静置した。なお、前記蛍光標識抗体として、白血球表面に発現しているＣＤ４５に対する抗体を、前記蛍光標識二次抗体として、前記一次抗体の産生動物種およびサブクラスに対して特異的に結合可能な抗体を、それぞれ用いている。
（６）標識試薬Ｂを吸引除去し、ＰＢＳを導入することで、残留した標識試薬Ｂを除去した。
（７）（６）で標識したＣＴＣを含む細胞保持手段を用いて、実施例１（１６）および（１７）と同様な方法でＣＴＣを検出した。

各採血時のメラノーマ由来ＣＴＣ数を計数した結果を表５に示す。

病態が悪化した３回目の採血時にメラノーマ由来ＣＴＣ数が大幅に上昇（２回目の採血時１１０．６個／ｍＬ→３回目の採血時５６５．８個／ｍＬ）し、病態との相関が見られた。実施例１では、標識一次抗体を用いてＣＴＣ数と病態との相関を検出したが、本実施例では、標識二次抗体を用いた場合でも、ＣＴＣ数と病態との相関を得ることができることが判明した。

［実施例４］ＣＴＣにおける遺伝子変異
（１）インフォームドコンセントを得た、実施例１から３とは異なるステージＩＶのメラノーマ患者から、血液を１回採取した。
（２）（１）で採血した血液を用いた他は、実施例３（１）から（６）と同様な方法でＣＴＣを検出した。
（３）（２）で検出したメラノーマ由来ＣＴＣの中から無作為に抽出した３３個を、実施例（１８）から（２０）と同様な方法で一つずつ回収し、ＢＲＡＦ遺伝子領域の変異の有無を解析した。

［実施例５］癌原発組織、癌転移組織および循環遊離ＤＮＡにおける遺伝子変異
（１）実施例４（１）において採血した癌患者から、癌原発組織および癌転移組織を採取した。また、末梢血を採取し、細胞を除去して末梢血中に含まれるＤＮＡ（循環遊離ＤＮＡ）を抽出した。
（２）ＢＲＡＦ遺伝子領域の変異の有無の解析を、（１）で採取した組織に対しては、コバス ＢＲＡＦ Ｖ６００変異検出キット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）およびサンガー法を用いて行なった。ＢＲＡＦ遺伝子領域のＶ６００ＥおよびＶ６００Ｋ、Ｋ６０１Ｅの変異の有無の解析を、抽出した循環遊離ＤＮＡに対しては、デジタルドロップレットＰＣＲ法を用いて行なった。

実施例４で遺伝子情報が得られたメラノーマ由来ＣＴＣの遺伝子変異解析結果を表６に示す。また実施例５で遺伝子解析を行なった癌原発組織、癌転移組織および循環遊離ＤＮＡにおける遺伝子変異解析結果を表７に示す。

実施例４で遺伝子情報が得られたメラノーマ由来ＣＴＣ３３個のうち、ＢＲＡＦ Ｖ６００近傍の変異を有するＣＴＣが６個検出され、かつそれら変異の中に、癌転移組織および循環遊離ＤＮＡで検出されたＢＲＡＦ Ｖ６００近傍の変異（Ｋ６０１Ｅ ヘテロ変異体）とは異なる変異（Ｖ６００Ｅ ヘテロ変異体、Ｖ６００Ａ ヘテロ変異体、Ｋ６０１Ｅ ホモ変異体）も検出された。癌原発組織では変異は検出されず、癌転移組織および循環遊離ＤＮＡは同一の変異が検出されたことから、癌転移組織で検出できる変異のみが循環遊離ＤＮＡからも検出されることがわかる。一方、ＣＴＣからは癌原発組織、癌転移組織および循環遊離ＤＮＡで検出されない遺伝子変異が検出されたことから、癌原発組織、癌転移組織および循環遊離ＤＮＡでは検出できない遺伝子変異の多様性の情報をＣＴＣから取得できることがわかる。

１００：細胞回収装置
１０：細胞保持手段
１１：遮光部材
１２：絶縁体
１１ａ、１２ａ：貫通孔
２０：スペーサ
２１：導入口
２２：排出口
２３：貫通部
３１・３２：電極基板
４０：導線
５０：信号発生器
６０：保持部
７０：細胞
７１：目的細胞（ＣＴＣ）
８０：誘電泳動力
９０：接着物質
２００：蛍光顕微鏡
３００：回収装置
４００：回収チューブ

Claims (3)

1. Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害薬の投与効果の予測のための指標を得る方法であって、
   （１）メラノーマ患者より採取した血液試料から血中循環腫瘍細胞を回収する工程、および
   （２）（１）で回収した血中循環腫瘍細胞におけるＢＲＡＦ遺伝子変異を解析して、Ｖ６００Ｋ変異を同定する工程、
   を含み、（２）で同定されたＶ６００Ｋ変異をＢ−Ｒａｆ酵素阻害薬の投与効果の指標とする方法。
2. Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害薬の投与効果の予測のための指標を得る方法であって、
   （１）メラノーマ患者より採取した血液試料から血中循環腫瘍細胞を回収する工程、および
   （２）（１）で回収した血中循環腫瘍細胞の細胞数を計測し、かつ、（１）で回収した血中循環腫瘍細胞におけるＢＲＡＦ遺伝子変異を解析して、Ｖ６００Ｋ変異を同定する工程、
   を含み、（２）で計測した血中循環腫瘍細胞の細胞数、および（２）で同定されたＶ６００Ｋ変異をＢ−Ｒａｆ酵素阻害薬の投与効果の指標とする方法。
3. （１）の工程を、血液試料中に含まれる血中循環腫瘍細胞を保持可能な保持部を複数設けた細胞保持手段と誘電泳動力を発生させる手段とを備えた細胞回収装置を用いて行なう、請求項１または２に記載の方法。

Images