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JP6855513B2 - 哺乳類由来細胞のリプログラミング方法 - Google Patents

哺乳類由来細胞のリプログラミング方法 Download PDF

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Description

本発明は、細胞のリプログラミングを誘導することのできるエキソソームであるリプロソーム（ＲＥＰＲＯＳＯＭＥ）及びその製造方法に関し、さらに詳しくは、クロマチンリモデリング因子（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）を多量含んでいるリプロソーム、そしてリプロソームを高い歩留まりで製造することができる方法、及び前記方法で製造されたリプロソームの用途に関する。
エキソソームは、自然に分泌される３０〜２００ｎｍの直径のナノ小胞であり、由来細胞から遺伝物質を運ぶ重要なナノ媒介として作用できることが知られている。エキソソームがｍＲＮＡの伝達を介して標的細胞の表現型を変化させ得ることを発見して以来、多くの研究によってエキソソームが細胞分化などに関与することが明らかになった。このような従来の研究では、エキソソームを得るための細胞またはエキソソームを用いて分化や表現型の変化を誘導する対象として幹細胞及び前駆細胞を用いているが、これらの細胞は、分離及び増幅に細心のプロセスが求められることから、効率と経済性の側面において問題がある。従って、簡単に取得することができる患者の体細胞から、所望の方向に細胞を変化させ得る因子を入れたエキソソームの分泌を誘導し、また、これらのエキソソームを用いて、同様に簡単に取得することができる体細胞を所望の機能を有する他の細胞に変えることができれば、これは細胞補充療法の臨床適用における大きな飛躍になるはずである。
さらに、近年では、エキソソームそのものを治療目的で人体に直接使用できる可能性について、色んな角度から検討されている。エキソソームは、生物医薬品（ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）の分野において、小さな分子、ペプチド、成長因子、抗体、核酸などの生物薬剤（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）と、各種の細胞や血小板のような大きな医薬品との中間者的位置にある。つまり、生物薬剤に比べて、エキソソームは、様々なタンパク質と核酸を含有しており、より複雑で長持ちする効果を奏することができる。また、細胞と比較しても、他の利点を有する。つまり、細胞を生体に注入する場合、例えば、注入された細胞が癌細胞に転移する恐れがあるなど、安全性における懸念がある。また、細胞治療のために血管に注入された細胞は、肺、肝臓、脾臓、または腎臓などのろ過機能を有する器官によってろ過され、閉じ込められることが一般的であり、前記のようにろ過された細胞は、最終的には小さな小胞体の形態に分解され、人体に影響を及ぼすことが知られている。従って、前記細胞から分泌可能な有効成分を含んでいる上で、サイズの小さいエキソソームを投与する場合、完全な細胞とは異なる時空間的治療効果をより安全に確保することができる。
しかしながら、前述したように、エキソソームは、細胞治療のためのツールや治療剤そのものとして高い可能性を有するものの、未だに大量に生産することが困難であるのが現状である。例えば、１リットルの培地で培養した６千万個の間葉系幹細胞から取得することのできるエキソソームは、含まれているタンパク質の含有量基準で１〜２ｍｇ程度しか取得することができない。これは、マウス数匹分の治療実験に使用できる量であり、人間の場合には、例えば、移植片対宿主病（Ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ；ＧＶＨＤ）の治療のために使用されるエキソソームは、タンパク質の含有量基準で１回、患者体重の１ｋｇ当たり０．０５〜０．６ｍｇが必要である。従って、エキソソームを臨床的に使用するためには、歩留まりを向上する技術が要求されている。
本発明は、現在の細胞治療及びエキソソーム治療剤において存在する、前述の要求を含む様々なニーズに応えるためのものである。つまり、細胞治療に一般的に用いられる幹細胞は、分離、増幅、及び維持が困難であり、その分化の方向性を予測することが難しく、また癌への発展の可能性があるという問題がある。さらに、所望の機能を有する細胞を得るプロセスもまた、幾つものステップの分化を経るので時間がかかり、転換効率が低く、化学的処理により行われているので安全性を担保することが困難である。従って、簡単に取得することができる細胞を細胞治療に使用できるようにする技術と、所望の機能を有する細胞を安全かつ高効率で短時間に取得することができる技術とに対する開発が求められている。エキソソーム治療剤の場合には、治療に十分な量を得ることのできる技術が不足しているのが現状である。
本発明は、前述の課題を解決するために見出されたものであり、本発明の一実施例は、クロマチンリモデリング（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）に関与する遺伝子のＲＮＡを含むことを特徴とし、前記遺伝子は、ＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）のシグナル伝達システム上のリン酸化酵素の遺伝子と、ヒストン修飾活性を有する遺伝子とを含み、所望の方向に細胞のリプログラミングを誘導することのできるリプロソームを提供する。
また、本発明の一実施例は、細胞に超音波刺激を与え、細胞のない培養培地に超音波刺激を与え、前記細胞と前記培養培地とを混合して一定時間培養することにより、前述したリプロソームを短時間で多量生産できる製造方法を提供する。
さらに、本発明の一実施例は、前記リプロソームを細胞に処理し、細胞を所望の方向に効率的にリプログラミングする方法を提供する。
また、本発明の細胞のリプログラミングを誘導する前記リプロソームを含んでいる組成物を提供する。
本発明が解決しようとする技術的課題は、前述の技術的課題に限定されるものではなく、言及していない他の技術的課題は、以下の記載から本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に明確に理解されるであろう。
前述の技術的課題を解決するための技術的手段として、本発明の一側面に係る、細胞のリプログラミングを誘導することのできるリプロソームは、クロマチンリモデリング（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）に関与する遺伝子のＲＮＡを含み、前記遺伝子は、ＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）のシグナル伝達システム上のリン酸化酵素の遺伝子と、ヒストン修飾活性を有する遺伝子とを含むことを特徴とする。
ここで、前記ＭＡＰＫのシグナル伝達システム上のリン酸化酵素の遺伝子は、ＢＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ３、ＭＡＰ３Ｋ１０、ＭＡＰ３Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ５、ＭＡＰ３Ｋ７、ＭＡＰＫ１２、ＲＰＳ６ＫＡ４（ＭＳＫ２）、ＴＡＯＫ１、及びＴＡＯＫ２で構成された群から少なくとも１つ以上選択されてもよい。
前記ヒストン修飾活性を有する遺伝子は、ＡＳＨ１Ｌ、ＣＲＥＢＢＰ、ＤＯＴ１Ｌ、ＥＰ３００、ＧＴＦ３Ｃ１、ＫＡＴ２Ａ、ＫＡＴ６Ｂ、ＫＤＭ１Ａ、ＫＤＭ３Ｂ、ＫＤＭ６Ａ、ＫＭＴ２Ａ、ＫＭＴ２Ｅ、ＮＣＯＡ３、ＮＳＤ１、ＳＥＴＤ１Ａ、及びＳＥＴＤ２で構成された群から少なくとも１つ以上選択されてもよい。
前記リプロソーム中の全ＲＮＡに対して、小型ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ＲＮＡ）の割合が４０％以上であり、前記小型ＲＮＡにおいて、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の割合が４０％以上であることを特徴としてもよい。
本発明の他の一側面は、細胞に超音波刺激を与え、細胞のない培養培地に超音波刺激を与えるステップと、前記細胞と前記培養培地とを混合して一定時間培養するステップと、前記混合物からリプロソームを分離するステップと、を備える、細胞のリプログラミングを誘導するリプロソームの製造方法を提供する。
ここで、前記細胞は、哺乳類由来の繊維芽細胞または器官内の組織細胞のいずれか一つであってもよい。
前記培養培地は、胚性幹細胞培地、神経幹細胞培地、心臓幹細胞培地、毛乳頭細胞培地、間葉系幹細胞培地、骨形成培地、筋形成培地、造血幹細胞培地、ニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）培地、星状細胞培地、乏突起膠細胞培地、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）培地、脂肪細胞培地、筋肉細胞培地、血管内皮細胞培地、膵臓β細胞培地、または心筋細胞培地のいずれか一つであってもよい。
前記培養培地は、神経幹細胞培地、毛乳頭細胞培地、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）培地、脂肪細胞培地のいずれか一つであってもよい。
前記細胞に与えられる超音波刺激は、１０〜３０ＫＨｚ、０．５〜３Ｗ／ｃｍ２において１〜１０秒に掛けて行われてもよい。
前記培養培地に与えられる超音波刺激は、１０〜３０ＫＨｚ、１〜２０Ｗ／ｃｍ２において１〜２０分に掛けて行われてもよい。
前記混合物の培養は、１〜１０日に掛けて行われることを特徴としてもよい。
前記リプロソームを分離するステップは、前記培養後の混合物を遠心分離して上澄み液を取得するステップと、前記上澄み液をフィルターでろ過し、ろ液を取得するステップと、前記ろ液を濃縮するステップと、を備えてもよい。ここで、前記上澄み液をフィルターでろ過する前に、４℃以下で７日〜１ヶ月に掛けて保管するステップをさらに備えてもよい。前記分離されたリプロソームは、直径が５０〜２００ｎｍであることを特徴としてもよい。
本発明のもう一つの一側面は、リプロソームを第１の培養培地に混入するステップと、前記混合物から第１の細胞を培養するステップと、前記培養後、第２の細胞を収得するステップと、を備える、細胞をリプログラミングする方法を提供する。
ここで、前記第１の細胞は、哺乳類由来の繊維芽細胞または器官内の組織細胞のいずれか一つであってもよい。
前記第２の細胞は、万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）以下の分化能を有する細胞であることを特徴としてもよい。
前記第２の細胞は、胚性幹細胞、神経幹細胞、心臓幹細胞、毛乳頭細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞のいずれか一つであってもよい。
前記第２の細胞は、神経幹細胞、ニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）、星状細胞、乏突起膠細胞、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）、脂肪細胞、毛包細胞、筋肉細胞、血管内皮細胞、角質細胞、膵臓β細胞または心筋細胞のいずれか一つであってもよい。
前記第２の細胞は、第１の細胞とは異なる種類であることを特徴としてもよい。
前記リプロソームは、１０７〜１０１５個／ｍｌの濃度で第１の培養培地に混入されていることを特徴としてもよい。
前記第１の培養培地は、前記リプロソームを製造する際に用いた培養培地と同じであることを特徴としてもよい。
前記第２の細胞は、幹細胞、始原細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）のいずれか一つであり、前記第１の細胞の培養は、１〜６日に掛けて行われることを特徴としてもよい。
前記第２の細胞は、ニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）、星状細胞、乏突起膠細胞、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）、脂肪細胞、毛包細胞、筋肉細胞、血管内皮細胞、角質細胞、膵臓β細胞または心筋細胞のいずれか一つであり、第１の細胞の培養は、１０日〜６０日に掛けて行われることを特徴としてもよい。
本発明のもう一つの一側面は、前述した細胞のリプログラミングを誘導するリプロソームを含む組成物を提供する。
本発明の一実施例に係るリプロソームは、細胞のリプログラミングを誘導することのできる様々な因子、特にクロマチンリモデリング因子を含有し、リン脂質ベースの膜構造を有して細胞膜浸透が容易であり、物質の伝達効率が高いので、所望の機能を有する細胞へのリプログラミングを高い効率で誘導することができる。例えば、従来のヒト体細胞を用いた神経細胞の直接分化効率は０．１％未満であるが、リプロソームを用いた方法は、約７０％に達する。
本発明の一実施例に係るリプロソームの製造方法は、分離と増幅のプロセスが厳しい幹細胞及び前駆細胞は無論のこと、容易に取得することができる体細胞からも、超音波処理といった簡単なプロセスを介してリプロソームの分泌を多く誘導することができる。このように誘導されたエキソソームは、従来の方法に比べてその歩留まりが高く、前記エキソソーム中に含まれている各種因子の量及び数もまた多い。
本発明の一実施例に係る細胞のリプログラミング方法は、化学物質や外来転写因子を遺伝体内へ導入することなく、所望の機能を有する細胞へのリプログラミングを安全に誘導することができる。また、前記リプログラミング方法は、リプロソームを培養培地に追加して細胞を培養するといった単純なプロセスを介して、幾つもの発生ステップを経ることなく、比較的短時間で効率的に一種類の細胞を他の細胞にリプログラミングすることができる。
本発明の一実施例に係るリプロソームを含んでいる組成物は、身体の部位に処理して前記処理部位に存在する細胞のリプログラミングを促すことにより、前記処理部位の組織再生を促すことができる。
本発明の効果は、前記効果に限定されるものではなく、本発明の詳細な説明または特許請求の範囲に記載されている発明の構成から推論可能なあらゆる効果が含まれる。
本発明の実施例１に基づいて誘導された神経前駆細胞（ＮＰＣ）の誘導能を有するリプロソームの生成データであり、（ａ）は、超音波処理を施した細胞（ＵＨＤＦ）と処理していない細胞（ＮＨＤＦ）とから分泌されたエキソソーム（それぞれｉＥｘｏ（リプロソーム）及びｎＥｘｏ）の形態を確認した電子顕微鏡の画像、（ｂ）は、ＣＤ６３の誘導を示した免疫蛍光染色の画像、（ｃ−ｄ）は、エキソソームのサイズ分布及び数、及び（ｅ）は、培養開始後において、時間に伴うエキソソーム分泌量の変化である。 本発明の実施例１に基づいて誘導された神経前駆細胞（ＮＰＣ）の誘導能を有するリプロソームの成分データであり、（ａ）は、エキソソームにおけるＲＮＡ濃度、（ｂ）は、前記ＲＮＡで発現された遺伝子の数、（ｃ）は、前記ＲＮＡにおける小型ＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの量、（ｄ）は、エキソソームにおけるタンパク質の濃度、（ｅ−ｆ）は、エキソソームにおおけるＮＰＣのマーカーｍＲＮＡ（Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｐａｘ６、及びＮｅｓｔｉｎ）と、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ９、ｍｉＲ１２４ａ、ｍｉＲ１２５ｂ、及びｍｉＲ１２８−１）との相対的な発現量、（ｇ）は、神経関連のｍＲＮＡ（左）及びｍｉＲＮＡの発現を示すヒートマップ、及び（ｈ）は、ＮＰＣのマーカー（Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｐａｘ６、及びＮｅｓｔｉｎ）とエキソソームのマーカー（ＣＤ６３）との細胞内の共同分布を示した免疫蛍光染色の画像である。 本発明の実施例１に基づいて分離した神経前駆細胞（ＮＰＣ）の誘導能を有するリプロソームのＮＰＣ誘導能の分析データであり、（ａ）は、前記細胞を誘導するプロトコルの模式図、（ｂ）は、リプロソーム（ｉＥｘｏ）処理後において、時間に伴うリプロソームの細胞内流入を示した共焦点顕微鏡画像、（ｃ）は、ＨＤＦの形態変化、（ｄ）は、ＮＰＣのマーカー（Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｐａｘ６、及びＮｅｓｔｉｎ）ＲＮＡに対するｑＲＴ−ＰＣＲデータ、（ｅ−ｆ）は、前記マーカータンパク質に対する免疫蛍光染色の画像及び流動細胞の分析データ、（ｇ）は、ＮＳＣ関連遺伝子に対するクラスターの分析データ、（ｈ）は、細胞分裂マーカー（Ｋｉ−６７）に対する免疫蛍光染色の画像、（ｉ−ｊ）は、エキソソームの処理濃度に応じて形成されたスフェロイドの数及びＮＰＣのマーカー（Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｐａｘ６、及びＮｅｓｔｉｎ）の発現量、及び（ｋ）は、継代培養６次細胞の成長曲線である。 本発明の実施例１による神経前駆細胞（ｒＮＰＣ）の誘導メカニズムの分析データであり、（ａ）は、ｎＥｘｏとリプロソーム（ｉＥｘｏ）処理細胞群に示されたクロマチンリモデリング関連の遺伝子発現ヒートマップ、（ｂ−ｃ）は、リプロソーム処理後において、時間に伴うＭＡＰＫのシグナル伝達システムのタンパク質（Ｅｒｋ１／２、ｐ３８、及びＭｓｋ１）のリン酸化の程度を示したウェスタンブロッティングの結果及び細胞内免疫の蛍光染色の画像、（ｄ）は、ＮＰＣのマーカー（Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｐａｘ６、及びＮｅｓｔｉｎ）ＲＮＡに対するｑＲＴ−ＰＣＲデータ、（ｅ）は、クロマチンリモデリングの指標（ＨＰ１α、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）に対する免疫蛍光染色のデータと対照染色ＤＡＰＩとに対する相対的な前記指標の分布、及び（ｆ）は、各細胞群における神経関連遺伝子発現のヒットマップである。 本発明の実施例１によるｒＮＰＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ分化能の分析データであり、（ａ）は、神経分化培地で４週間培養して分化させたｒＮＰＣの神経マーカー（ニューロンのマーカーであるＭａｐ２とＴｕｊ１、星状細胞のマーカーであるＧｆａｐ、乏突起膠細胞のマーカーであるＯ４）に対する免疫蛍光染色のデータ、（ｂ−ｃ）は、前記分化されたｒＮＰＣに対する電圧クランプデータ及び活動電位データ、（ｄ）は、（ｂ−ｃ）で示したｉｎ ｖｉｔｒｏ分化能のデータ、及びラット脳に移植してから４週後のＧＦＰ−ｒＮＰＣの分布、（ｅ）は、ヒトミトコンドリア抗体とＧＦＰを用いた免疫蛍光染色の結果、及び（ｆ）は、前記神経マーカーに対する免疫蛍光染色の結果である。 本発明の実施例２に係る脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）の誘導能を有するリプロソームの生成データであり、（ａ）は、ｉＥｘｏ（リプロソーム）の形を確認したＮａｎｏｓｉｇｈｔ及び電子顕微鏡の画像、（ｂ−ｃ）は、エキソソームのマーカーであるＣＤ６３の誘導及びＣＤ６３と褐色脂肪細胞のマーカーであるＵＣＰ１の共存を示した免疫蛍光染色の画像、及び（ｄ）は、分離されたリプロソーム内の褐色脂肪細胞に関連するｍＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ及び脂質合成に関連するｍＲＮＡの特性を分析したＲＮＡ−ｓｅｑデータである。 本発明の実施例２に係る褐色脂肪細胞（ｒＢＡ）の免疫蛍光染色のデータであり、脂質染色試薬であるＡｄｉｐｏＲｅｄ、ヒトミトコンドリア抗体（ＨｕＭｉｔｏ）、及び褐色脂肪細胞のマーカーであるＵＣＰ１に対する抗体を用いた免疫蛍光染色の画像である。 本発明の実施例３に係る肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）の誘導能を有するリプロソームの生成データであり、（ａ）は、ｉＥｘｏ（リプロソーム）の形を確認したＮａｎｏｓｉｇｈｔ及び電子顕微鏡の画像、（ｂ−ｃ）は、エキソソームのマーカーであるＣＤ６３の誘導及びＣＤ６３と肝細胞のマーカーであるＨＮＦ１αの共存を示した免疫蛍光染色の画像、及び（ｄ）は、分離されたリプロソーム内の肝細胞に関連するｍＲＮＡ／ｍｉＲＮＡの特性を解析したＲＮＡ−ｓｅｑデータである。 本発明の実施例３に係る肝細胞（ｒＨ）の免疫蛍光染色のデータであり、肝細胞のマーカーであるＡＦＰ、ＨＮＦ４α、ＣＫ１８、及びＡＬＢに対する免疫蛍光染色の画像である。 本発明の実施例４に係る毛髪組織の分化誘導能を有するリプロソームの生成データであり、（ａ）は、ｉＥｘｏ（リプロソーム）の形を確認したＮａｎｏｓｉｇｈｔ及び電子顕微鏡の画像、（ｂ−ｃ）は、エキソソームのマーカーであるＣＤ６３の誘導及びＣＤ６３と毛髪再生に重要なタンパク質であるＳｈｈの共存を示した免疫蛍光染色の画像、及び（ｄ）は、分離されたリプロソーム内の毛髪再生に関連するｍＲＮＡの特性を分析したＲＮＡ−ｓｅｑデータである。 本発明の実施例４に係る毛髪再生能を有するリプロソームによるＣ５７及びヌードマウスの皮膚におけるｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子発現の変化データであり、（ａ−ｂ）は、親油性マーカーであるＤｉｄで標識したリプロソームの皮膚塗布後の分布を示した蛍光染色の画像、（ｃ−ｄ）は、前記リプロソーム処理による毛包の再生遺伝子の発現変化に関するタンパク質（β−Ｃａｔｅｎｉｎ、Ｓｈｈ、Ｋｉ−６７）の免疫蛍光染色の画像、及び（ｅ−ｆ）は、ｍＲＮＡ（Ｓｈｈ、β−Ｃａｔｅｎｉｎ、ＫＲＴ−２５、ＶＣＡＮ、Ｇｌｉ１、Ｌｅｆ１、Ｐｃｔ１、Ｔｙｒｐ１、Ｔｙｒ、Ｍｉｔｆ、Ｄｃｔ、Ｓｆｒｒｐ４、ＤＫＫ）のｑＲＴ−ＰＣＲデータである。 本発明の実施例４に係る毛髪再生能を有するリプロソームによるＣ５７及びヌードマウスの皮膚における組織変化データであり、（ａ−ｂ）は、皮膚組織のＨ＆Ｅ染色の画像、及び（ｃ−ｄ）は、皮下及び全体の皮膚における毛包数のデータである。 本発明の実施例４に係る毛髪再生能を有するリプロソームによるＣ５７及びヌードマウスの皮膚における毛髪再生データであり、（ａ−ｂ）は、前記エキソソームの処理濃度と処理後の時間に伴う毛髪の生成画像である。 本発明の実施例５に係る創傷治癒能を有するリプロソームの生成データであり、（ａ）は、エキソソームのマーカーであるＣＤ６３の誘導を示した免疫蛍光染色の画像、（ｂ）は、誘導されたリプロソームにおける創傷治癒に関する遺伝子のＲＮＡを分析したｑＲＴ−ＰＣＲデータ、及び（ｃ）は、ＲＮＡ−ｓｅｑデータである。 本発明の実施例５に係る創傷治癒能を有するリプロソームによるｉｎ ｖｉｔｒｏ効果のデータであり、（ａ）は、前記リプロソームを色んな濃度で処理したＨＤＦにおける細胞増殖マーカーＫｉ６７の発現を示した免疫蛍光染色の画像、（ｂ）は、ＭＴＴ ａｓｓａｙで測定したＨＤＦの各リプロソームの処理濃度・時間ごとの増殖率、（ｃ−ｄ）は、ｓｃｒａｔｃｈ ａｓｓａｙで測定したＨＤＦの各リプロソームの処理濃度・時間ごとの移動能、（ｅ−ｇ）は、リプロソームの処理濃度ごとのＨＵＶＥＣのｔｕｂｅ形成を示した光学顕微鏡の画像、形成されたｔｕｂｅの長さ、及び交差点の数、及び（ｈ）は、リプロソームを処理した細胞における創傷治癒に関する遺伝子のＲＮＡを分析したｑＲＴ−ＰＣＲデータである。
以下、本発明をさらに詳しく説明する。しかしながら、本発明は、様々な異なる形態で実現され得るので、以下に説明する実施例によって限定されるものではなく、専ら添付の特許請求の範囲によって定義される。
なお、本発明に用いられる用語は、単に特定の実施形態について説明するために用いられるものであり、本発明を限定しようとする意図はない。単数の表現には、文脈からみて明らかに他の意味を有さない限り、複数の言い回しを含む。本発明の記載全体において、ある構成要素を「含む」とは、特に反対の記載がない限り、他の構成要素を除外するのではなく、他の構成要素をさらに含んでもよいことを意味する。
本発明の一側面に係る、細胞のリプログラミングを誘導することのできるリプロソームは、クロマチンリモデリング（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）に関与する遺伝子のＲＮＡを含み、前記遺伝子は、ＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）のシグナル伝達システム上のリン酸化酵素の遺伝子と、ヒストン修飾活性を有する遺伝子とを含むことを特徴とする。
ここで、前記ＭＡＰＫのシグナル伝達システム上のリン酸化酵素の遺伝子は、ＢＲＡＦ（Ｂ−Ｒａｆ ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、ＭＡＰ２Ｋ３（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３）、ＭＡＰ３Ｋ１０（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ １０）、ＭＡＰ３Ｋ４（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ４）、ＭＡＰ３Ｋ５（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ５）、ＭＡＰ３Ｋ７（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ７）、ＭＡＰＫ１２（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ １２）、ＲＰＳ６ＫＡ４（Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ６ ｋｉｎａｓｅ Ａ４、ａｌｓｏ ｋｎｏｗｎ ａｓ Ｍｓｋ２）、ＴＡＯＫ１（ＴＡＯ ｋｉｎａｓｅ １）、及びＴＡＯＫ２（ＴＡＯ ｋｉｎａｓｅ ２）で構成された群から少なくとも１つ以上選択されてもよい。前記リン酸化酵素の遺伝子は、前記１０個の遺伝子のうち、少なくともＭＡＰ３Ｋ１０、ＲＰＳ６ＫＡ４、及びＴＡＯＫ１を含むことが好ましく、少なくともＭＡＰ２Ｋ３、ＭＡＰ３Ｋ１０、ＭＡＰ３Ｋ７、ＭＡＰＫ１２、ＲＰＳ６ＫＡ４、ＴＡＯＫ１、及びＴＡＯＫ２を含むことがより好ましい。
前記ヒストン修飾活性を有する遺伝子は、ＡＳＨ１Ｌ（ＡＳＨ１ ｌｉｋｅ ｈｉｓｔｏｎｅ ｌｙｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＣＲＥＢＢＰ（ＣＲＥＢ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＤＯＴ１Ｌ（ＤＯＴ１ ｌｉｋｅ ｈｉｓｔｏｎｅ ｌｙｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＥＰ３００（Ｅ１Ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ３００）、ＧＴＦ３Ｃ１（Ｇｅｎｅｒａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＩＩＩＣ ｓｕｂｕｎｉｔ １）、ＫＡＴ２Ａ（Ｌｙｓｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２Ａ）、ＫＡＴ６Ｂ（Ｌｙｓｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ６Ｂ）、ＫＤＭ１Ａ（Ｌｙｓｉｎｅ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ １Ａ）、ＫＤＭ３Ｂ（Ｌｙｓｉｎｅ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ ３Ｂ）、ＫＤＭ６Ａ（Ｌｙｓｉｎｅ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ ６Ａ）、ＫＭＴ２Ａ（Ｌｙｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２Ａ）、ＫＭＴ２Ｅ（Ｌｙｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２Ｅ）、ＮＣＯＡ３（Ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ ３）、ＮＳＤ１（Ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ＳＥＴ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ＳＥＴＤ１Ａ（ＳＥＴ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １Ａ）、及びＳＥＴＤ２（ＳＥＴ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２）で構成された群から少なくとも１つ以上選択されてもよい。前記ヒストン修飾活性を有する遺伝子は、前記の１６個の遺伝子のうち、少なくともＡＳＨ１Ｌ、ＣＲＥＢＢＰ、ＤＯＴ１Ｌ、ＥＰ３００、ＧＴＦ３Ｃ１、ＫＡＴ６Ｂ、ＫＤＭ１Ａ、ＫＤＭ３Ｂ、ＫＭＴ２Ａ、ＫＭＴ２Ｅ、及びＮＳＤ１を含むことが好ましく、少なくともＡＳＨ１Ｌ、ＣＲＥＢＢＰ、ＤＯＴ１Ｌ、ＥＰ３００、ＧＴＦ３Ｃ１、ＫＡＴ６Ｂ、ＫＤＭ１Ａ、ＫＤＭ３Ｂ、ＫＭＴ２Ａ、ＫＭＴ２Ｅ、ＮＣＯＡ３、ＮＳＤ１、及びＳＥＴＤ２を含むことがより好ましい。
小型ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ＲＮＡ）は、２００ｎｔ（ヌクレオチド）未満のサイズを有するＲＮＡであり、主に非翻訳ＲＮＡ（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）である。小型ＲＮＡには、マイクロＲＮＡ、短干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、短核小体ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ＲＮＡ）、ｐｉｗｉ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）などが含まれる。そのうち、ｍｉＲＮＡは、２２ｎｔ程度の長さを有し、ＲＮＡサイレンシング（ＲＮＡ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）と転写後の遺伝子発現調節（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）に関与することが知られている。前記リプロソーム中の全ＲＮＡに対して、小型ＲＮＡの割合が４０％以上であり、前記小型ＲＮＡにおいて、ｍｉＲＮＡの割合が４０％以上であることを特徴としてもよい。より好ましくは、前記リプロソーム中の全ＲＮＡに対して、小型ＲＮＡの割合が５０％以上であり、前記小型ＲＮＡにおいて、ｍｉＲＮＡの割合が５０％以上であり、最も好ましくは、前記リプロソーム中の全ＲＮＡに対して、小型ＲＮＡの割合が６０％以上であり、前記小型ＲＮＡにおいて、ｍｉＲＮＡの割合が６０％以上であることを特徴としてもよい。
前述した細胞のリプログラミングを誘導することのできるリプロソームは、後述する製造方法によって製造されることを特徴としてもよい。
本発明の他の一側面は、細胞に超音波刺激を与え、細胞のない培養培地に超音波刺激を与えるステップと、前記細胞と前記培養培地とを混合して一定時間培養するステップと、前記混合物からリプロソームを分離するステップと、を備える、細胞のリプログラミングを誘導するリプロソームの製造方法を提供する。
ここで、前記細胞は、生殖細胞を除いた細胞の中から選択されることが好ましく、哺乳類由来の繊維芽細胞または器官内の組織細胞のいずれか一つであるのがより好ましい。これは、本発明の一側面による細胞のリプログラミングを誘導するリプロソームの製造方法によると、前記リプロソームは、どのような細胞を使用しても取得可能であるので、取得し難く増幅が困難である幹細胞や前駆細胞よりも、繊維芽細胞や器官内の組織細胞などの収得、維持、増幅が容易な細胞から得る方がより簡単かつ効率的であるためである。前記細胞は、前記リプロソームの後述する他の細胞または生体に対する後ほどの用途に応じて自己由来（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）、同種由来（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）または異種由来（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）のいずれかであってもよく、異種由来である場合、哺乳類から取得したものであってもよい。免疫拒否反応の可能性が存在するので、好ましくは同種由来、最も好ましくは自己由来のものを使用してもよい。
前記細胞に超音波刺激を加えるステップは、細胞に直接超音波処理を施すか、あるいは初期培養培地をかろうじて覆うほどの最低限の細胞量のみが含まれている状態で行われてもよい。このときの初期培養培地は、前記細胞を健康な状態に保つために用いる一般的な培地であり、前記細胞の通常の培養に適した培地、例えば、前記細胞が繊維芽細胞であり、抗生剤及び血清が含まれているＤＭＥＭ培地であってもよい。
前記培養培地（前記超音波処理される培地）は、胚性幹細胞培地、神経幹細胞培地、心臓幹細胞培地、毛乳頭細胞培地、間葉系幹細胞培地、骨形成培地、筋形成培地、造血幹細胞培地、ニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）培地、星状細胞培地、乏突起膠細胞培地、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）培地、脂肪細胞培地、筋肉細胞培地、血管内皮細胞培地、膵臓β細胞培地、または心筋細胞培地のいずれか一つであってもよい。前記培養培地は、分化誘導用、あるいは維持用と増幅用の培地のいずれか一つであってもよい。後述する本発明の他の一側面に基づき、リプロソームを処理して第１の細胞を第２の細胞に再プログラムする場合は、好ましくは、取得しようとする第２の細胞が健康的に維持かつ増幅することができる培地を選択してもよい。後述する本発明の別の一側面に基づき、リプロソームを含む組成物を身体の部位に処理して前記部位の細胞が標的細胞にリプログラミングされるように促そうとする場合には、好ましくは、前記標的細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養するときに、健康的に維持かつ増幅することができる培地を選択してもよい。
前記培養培地は、神経幹細胞培地、毛乳頭細胞培地、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）培地、脂肪細胞培地のいずれか一つであってもよい。
前記細胞に与えられる超音波刺激は、１０〜３０ＫＨｚ、０．５〜３Ｗ／ｃｍ２において１〜１０秒に掛けて行われてもよく、好ましくは、１５〜２５ＫＨｚ、０．５〜１．５Ｗ／ｃｍ２において３〜７秒に掛けて行われてもよい。
前記培養培地に与えられる超音波刺激は、１０〜３０ＫＨｚ、１〜２０Ｗ／ｃｍ２において１〜２０分に掛けて行われてもよく、好ましくは、１５〜２５ＫＨｚ、０．５〜１．５Ｗ／ｃｍ２において７〜１３分に掛けて行われてもよい。
前記混合物の培養は、１〜１０日に掛けて行われることを特徴としてもよく、好ましくは１〜６日に掛けて、最も好ましくは１〜２日に掛けて行われることを特徴としてもよい。これは、リプロソームが、超音波処理を施してから１日目に最も多く分泌され、時間の経過とともにその分泌量が減少するが、これらの分泌量の減少からすると、成分にも変化がある可能性があるためである。
前記リプロソームを分離するステップは、前記培養後の混合物を遠心分離して上澄み液を取得するステップと、前記上澄み液をフィルターでろ過し、ろ液を取得するステップと、前記ろ液を濃縮するステップと、を備えてもよい。前記遠心分離は、細胞デブリ及び死細胞を除去するために行い、１０００〜５０００ｇで１０分〜６０分に掛けて行うことが好ましい。前記上澄み液をフィルターでろ過するステップは、細胞デブリをさらに除去し、特定のサイズ以下の粒子のみを残すために行われるものであり、ここで用いられるフィルターは、シリンジフィルター（ｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｅｒ）であることが好ましい。前記ろ液を濃縮するステップは、遠心分離フィルター（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ）を用いて行うことが好ましい。遠心分離フィルターを用いると、前記ろ液を濃縮すると同時に、特定のサイズ以下の粒子を除去することができる。前記リプロソームを分離するステップは、前記上澄み液をフィルターでろ過する前に、４℃以下で７日〜３ヶ月に掛けて保管するステップをさらに備えてもよい。前記保管は、４℃以下で７日以内が好ましく、−２０℃以下で１ヶ月以内がより好ましく、−８０℃以下で３ヶ月以内が最も好ましい。リプロソームの有効成分は、ｍＲＮＡ及びタンパク質などであり、これらの成分は、温度が高かったり、酵素活性が高い温度に近くにつれ、簡単に変性されたり分解される恐れがある。ここで、前記分離されたリプロソームは、直径が５０〜２００ｎｍであることを特徴としてもよく、好ましくは、直径が１００〜１５０ｎｍであることを特徴としてもよい。
本発明のもう一つの一側面は、リプロソームを第１の培養培地に混入するステップと、前記混合物から第１の細胞を培養するステップと、前記培養後、第２の細胞を収得するステップと、を備える、細胞をリプログラミングする方法を提供する。
ここで、前記第１の細胞は、哺乳類由来の繊維芽細胞または器官内の組織細胞のいずれか一つであってもよい。これは、本発明の一側面に係る細胞をリプログラミングする方法は、どのような体細胞を使用しても第２の細胞の収得が可能なので、取得し難く増幅が困難である幹細胞や前駆細胞よりも、繊維芽細胞や器官内の組織細胞などの収得、維持、増幅が容易である細胞から得る方がより簡単かつ効率的であるためである。前記第２の細胞を後ほど人体に移植する場合には、第１の細胞は、ヒト由来の細胞を用いることが好ましく、移植する対象から由来した、自己由来（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）細胞を用いることが最も好ましい。移植対象と遺伝的に近い生体由来の細胞を第１の細胞として用いる場合、細胞移植の際に拒絶反応などの副作用が出る可能性を低減することができる。
前記第２の細胞は、万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）以下の分化能を有する細胞であることを特徴としてもよい。
前記第２の細胞は、胚性幹細胞、神経幹細胞、心臓幹細胞、毛乳頭細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞のいずれか一つであってもよい。
前記第２の細胞は、神経幹細胞、ニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）、星状細胞、乏突起膠細胞、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）、脂肪細胞、毛包細胞、筋肉細胞、血管内皮細胞、角質細胞、膵臓β細胞または心筋細胞のいずれか一つであってもよい。最終分化（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）されていない細胞の分化能は、そのレベルが高いものから低い順で、全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）、万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）、多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）、少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｃｙ）、及び単能性（ｕｎｉｐｏｔｅｎｃｙ）に分けて称する。全能性は、一つの生物（ｏｒｇａｎｉｓｍ）のすべての細胞に分化することができ、一細胞から一つの生物を形成できることをいい、万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）は、内胚葉（ｅｎｄｏｄｅｒｍ）、中胚葉（ｍｅｓｏｄｅｒｍ）、及び外胚葉（ｅｃｔｏｄｅｒｍ）の三胚葉の全細胞に分化することができることを意味する。多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）は、一系統（ｌｉｎｅａｇｅ）あるいは少数系統のいくつかの細胞に分化することができることをいい、少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｃｙ）は、それよりもより狭い範囲のいくつかの細胞に分化することができることをいい、また単能性（ｕｎｉｐｏｔｅｎｃｙ）は、単一の細胞の種類に分化することができることを意味する。従って、前記万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）以下の分化能を有する細胞は、万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）、多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）、少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｃｙ）、及び単能性（ｕｎｉｐｏｔｅｎｃｙ）の細胞と最終分化細胞（ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ）とを含む。前記第２の細胞を後ほど人体に移植する場合、前記第２の細胞は、多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）、少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｃｙ）または単能性（ｕｎｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有する幹細胞、始原細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）であることが好ましい。万能性細胞の場合、癌細胞への変異の可能性があるといった問題性が引き続き報告されたており、最終分化細胞の場合、寿命が短いか、あるいは細胞治療の効果が低下する恐れがある。
前記第２の細胞は、第１の細胞とは異なる種類であることを特徴としてもよい。例えば、第１の細胞は、収得かつ維持が容易である繊維芽細胞や他の組織から取得した細胞であってもよく、本発明の細胞をリプログラミングする方法によると、それから簡単に所望の第２の細胞を取得することができる。
前記リプロソームは、１０７〜１０１５個／ｍｌの濃度で第１の培養培地に混入されていることを特徴としてもよく、好ましくは、１０１０〜１０１２個／ｍｌの濃度で第１の培養培地に混入されていることを特徴としてもよい。本発明の発明者らは、混入されたリプロソームの濃度が低すぎるかまたは高すぎると、リプログラミング効率が低下することを確認した（図３（ｉ））。
前記第１の培養培地は、前記リプロソームを製造する際に用いた培養培地と同じであることを特徴としてもよいが、これに限定されるものではない。これは、前記第１の培養培地が、前記リプロソームを製造する際に用いた培養培地と同じである場合は、所望の第２の細胞へのリプログラミングがより迅速に起こる効果があるが、異なる培養培地を使用している場合でも、リプロソームが混入されると、第２の細胞へのリプログラミングが起こるためである。
前記第２の細胞は、幹細胞、始原細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）または前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）のいずれか一つであり、前記第１の細胞の培養は、１〜６日に掛けて行われることを特徴としてもよい。前記第２の細胞は、ニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）、星状細胞、乏突起膠細胞、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）、脂肪細胞、毛包細胞、筋肉細胞、血管内皮細胞、角質細胞、膵臓β細胞または心筋細胞のいずれか一つであり、第１の細胞の培養は、１０日〜６０日に掛けて行われることを特徴としてもよい。これは、分化能の高い細胞へのリプログラミングと、より分化能の低い細胞へのリプログラミングとではかかる時間に差があり、後者がより長い時間を要する傾向があるためであって、後者は、１５日〜２５日に掛けて培養することが好ましい。
本発明のもう一つの一側面に係る組成物は、細胞のリプログラミングを誘導する前述のリプロソームを含む。ここで、前記組成物は、例えば、身体の部位に処理して前記処理部位に存在する組織が再生されるように促すことを目的としてもよい。前記身体の部位は、表皮、真皮、及び頭皮が含まれてもよく、このような場合、前記組成物は、前記部位に塗布または注入されることで、創傷治癒または毛髪の再生などの組織再生効果を奏する。
前記組成物には、前記リプロソームの他にも薬剤学的に許容される担体及び／または前記処理部位への浸透率などを高めて組織再生効果をさらに向上できるその他の添加剤などが色々添加されてもよいことは言うまでもないので、これに対する具体的な説明は省略する。
前述のとおり、本発明の一実施例に係るリプロソームは、様々なリプログラミング因子、特にクロマチンリモデリング因子を含有し、リン脂質ベースの膜構造を有するので、所望の機能を有する細胞へのリプログラミングを高い効率で誘導することができる。
本発明の一実施例に係るリプロソームの製造方法は、分離と増幅のプロセスが厳しい幹細胞及び前駆細胞は無論のこと、容易に取得することができる体細胞からも、超音波処理といった簡単なプロセスを介して様々な細胞のリプログラミング因子を入れたリプロソームの分泌を誘導することができる。
本発明の一実施例に係る細胞のリプログラミング方法は、化学物質や外来転写因子を遺伝体内へ導入することなく、所望の機能を有する細胞を安全に誘導することができる。また、前記リプログラミング方法は、幾つもの発生ステップを経る必要がないので、リプロソームを培養培地に加えて培養するといった単純なプロセスにより、比較的短時間で効率的に一種類の細胞を他の細胞にリプログラミングすることができる。
本発明の一実施例に係るリプロソームを含んでいる組成物は、身体の部位に処理して前記処理部位に存在する組織再生を促すことができる。
以下、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように、本発明の実施例について詳しく説明する。しかしながら、本発明は、複数の異なる形態で具現されてもよく、ここで説明する実施例に限定されるものではない。
本発明のすべての実施例及び実験例上のすべての細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で行われた。
［実施例１］神経前駆細胞の誘導能を有するリプロソームの製造及びこれを用いた繊維芽細胞の神経前駆細胞へのリプログラミングの誘導
神経前駆細胞の誘導能を有するリプロソームを得るために、１×１０６個のＨＤＦにＵｌｔｒａＲｅｐｒｏ １００１（ＳＴＥＭＯＮ Ｉｎｃ．、Ｓｅｏｕｌ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）を用い、２０ＫＨｚ、１．０Ｗ／ｃｍ２の超音波刺激を５秒間、直接加えた（以下、このように刺激を受けたＨＤＦをＵＨＤＦと称する）。２×１０５個のＵＨＤＦを３５−ｍｍペトリ皿に超音波処理の施された（２０ＫＨｚ、５．０Ｗ／ｃｍ２、１０分）ｈＮＳＣ培地とともに１日培養した。前記ＵＨＤＦを培養した培養培地から、次のようにリプロソームを分離した：培養培地を３，０００×ｇで２０分間遠心分離することで細胞デブリ及び死細胞を除去した後、上澄み液を０．２２−ｍｍのフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ（登録商標）Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｆｉｌｔｅｒ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に通過させた。通過して出てきた培地を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５ １００，０００ ｋＤａ ｄｅｖｉｃｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）に入れて１４，０００×ｇで２０分間遠心分離することで、リプロソーム（ｉＥｘｏ）を濃縮した。
ｒＮＰＣ（リプロソームでリプログラミングすることで取得した神経前駆細胞）を製造するために、１×１０５個のＨＤＦを３５−ｍｍペトリ皿にシードし、１日培養した後、培地を分離したリプロソームを含むｈＮＳＣ培地に変えてから５日間培養した。培養培地は、２日ごとに交換した。
［実施例２］脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）の誘導能を有するリプロソームの製造及びこれを用いた繊維芽細胞の褐色脂肪細胞へのリプログラミングの誘導
脂肪細胞の誘導能を有するリプロソームを得るために、１×１０６個のＨＤＦにＵｌｔｒａＲｅｐｒｏ １００１（ＳＴＥＭＯＮ Ｉｎｃ．、Ｓｅｏｕｌ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）を用い、２０ＫＨｚ、１．０Ｗ／ｃｍ２の超音波刺激を５秒間、直接加えた。２×１０５個のＵＨＤＦを３５−ｍｍペトリ皿に超音波処理の施された（２０ＫＨｚ、５．０Ｗ／ｃｍ２、１０分）幹細胞用の脂肪細胞の分化誘導培地（ＭｅｓｅｎＣｕｌｔＴＭ ａｄｉｐｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｅｓ）とともに１日培養した。このようにＵＨＤＦを培養した培養培地から、実施例１と同様なリプロソームの分離プロセスを経てリプロソームを分離した。
ｒＢＡ（リプロソームでリプログラミングすることで取得した褐色脂肪細胞）を製造するために、１×１０５個のＨＤＦを３５−ｍｍペトリ皿にシードし、１日培養した後、培地を分離したエキソソームを含む脂肪細胞の分化誘導培地に変えてから２０日間培養した。培養培地は、２日ごとに交換した。
［実施例３］肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）の誘導能を有するリプロソームの製造及びこれを用いた繊維芽細胞の肝細胞へのリプログラミングの誘導
肝細胞の誘導能を有するリプロソームを得るために、１×１０６個のＨＤＦにＵｌｔｒａＲｅｐｒｏ １００１（ＳＴＥＭＯＮ Ｉｎｃ．、Ｓｅｏｕｌ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）を用い、２０ＫＨｚ、１．０Ｗ／ｃｍ２の超音波刺激を５秒間、直接加えた。２×１０５個のＵＨＤＦを３５−ｍｍペトリ皿に超音波処理の施された（２０ＫＨｚ、５．０Ｗ／ｃｍ２、１０分）肝細胞の培養培地（ＨＣＭＴＭ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ、Ｌｏｎｚａ）とともに１日培養した。このようにＵＨＤＦを培養した培養培地から、実施例１と同様なリプロソームの分離プロセスを経てリプロソームを分離した。
ｒＨ（リプロソームでリプログラミングすることで取得した肝細胞）を製造するために、１×１０５個のＨＤＦを３５−ｍｍペトリ皿にシードし、１日培養した後、培地を分離したエキソソームを含む肝細胞の培養培地に変えてから２４日間培養した。培養培地は、２日ごとに交換した。
［実施例４］毛髪再生能を有するリプロソームの製造及びこれを用いた毛髪再生の誘導
毛髪再生能を有するリプロソームを得るために、１×１０６個のＨＤＦにＵｌｔｒａＲｅｐｒｏ １００１（ＳＴＥＭＯＮ Ｉｎｃ．、Ｓｅｏｕｌ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）を用い、２０ＫＨｚ、１．０Ｗ／ｃｍ２の超音波刺激を５秒間、直接加えた。２×１０５個のＵＨＤＦを３５−ｍｍペトリ皿に超音波処理の施された（２０ＫＨｚ、５．０Ｗ／ｃｍ２、１０分）毛乳頭細胞の培養培地（Ｄｅｒｍａｌ Ｐａｐｉｌｌａ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉｕｍ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）とともに１日培養した。このようにＵＨＤＦを培養した培養培地から、実施例１と同様なリプロソームの分離プロセスを経てリプロソームを分離した。
［実施例５］創傷治癒能を有するリプロソームの製造
創傷治癒能を有するリプロソームを得るために、１×１０６個のＨＤＦにＵｌｔｒａＲｅｐｒｏ １００１（ＳＴＥＭＯＮ Ｉｎｃ．、Ｓｅｏｕｌ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）を用い、２０ＫＨｚ、１．０Ｗ／ｃｍ２の超音波刺激を５秒間、直接加えた。２×１０５個のＵＨＤＦを３５−ｍｍペトリ皿に超音波処理の施された（２０ＫＨｚ、５．０Ｗ／ｃｍ２、１０分）胚性幹細胞の培養培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１５％ＦＢＳ、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ、０．１％ＮＥＡＡ、０．１％ペニシリン／ストレプトマイシン、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール、１０００ ｕｎｉｔ／ｍｌの白血病抑制因子（ＬＩＦ））とともに１日培養した。このようにＵＨＤＦを培養した培養培地から、実施例１と同様なリプロソームの分離プロセスを経てリプロソームを分離した。
［実験例１］神経前駆細胞の誘導能を有するリプロソームの生成実験
神経前駆細胞の誘導能を有するリプロソームの分泌を誘導するために、実施例１に基づいてＨＤＦを超音波刺激に露出した後（ＵＮＤＦ）、超音波処理を施したヒト神経幹細胞培地（ｈＮＳＣ培地）で１日培養した。１日に掛けて培養した後、エキソソーム特異的マーカーであるＣＤ６３を用い、ＮＨＤＦに比べてＵＨＤＦに多量の小胞体が誘導されたことを確認した（図１ｂ）。ＵＨＤＦを培養した培地内の誘導されたエキソソーム（ｉＥｘｏ）とＮＨＤＦから分泌されたエキソソーム（ｎＥｘｏ）とを実験例１のリプロソームの分離方法で分離した結果、透過電子顕微鏡の画像に示すように、いずれも一般的なエキソソームの小胞性構造を有していることが観察された（図１ａ）。ナノ粒子の追跡分析の結果、ｉＥｘｏの粒子のサイズは、約５０〜２００ｎｍの範囲に分布しており、平均で１５５．６±４．２ｎｍであった（図１ｃ）。５０〜２００ｎｍのサイズのｉＥｘｏは９×１０８個であり、ｎＥｘｏよりも３．２倍高い数値であった（図１ｄ）。このような結果は、ＨＤＦに超音波を加えることでエキソソームを効率的に誘導することができることを示す。このようなｉＥｘｏの分泌量は、超音波処理を施した後、培養時点を基準に１日目に最も量が多く、時間の経過とともに減少する傾向を示したが、それでも分析した１、３、５日目の分泌量のいずれにおいてもｎＥｘｏより高いことが確認された（図１ｅ）。
ｉＥｘｏの成分を分析するために、１日目の培養培地から分離されたエキソソームから、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用い、全体のＲＮＡとマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の濃度及び質的な部分を、エキソソームのＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）を介してタンパク質コーディング遺伝子の数を測定した。ｉＥｘｏ中の全体のＲＮＡ濃度は、ｎＥｘｏに比べて５．３倍高く（図２ａ）、前記ＲＮＡで発現された遺伝子の数は８４００であり、１７６２個を記録したｎＥｘｏに比べて４．７倍高い値を示した（図２ｂ）。公開されたデータベースの検索及び遺伝子オントロジー分析により、ｉＥｘｏ中のｍＲＮＡの一部は、神経発生と関連していることが明らかになった（図２ｇ）。ｑＲＴ−ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；図２ｅ）により、ｉＥｘｏ中のＳｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｐａｘ６、及びＮｅｓｔｉｎなどのＮＰＣ特異的マーカーの遺伝子発現レベルが増加したことが確認された。エキソソーム中の非コーディング小型ＲＮＡのうち、ｉＥｘｏのｍｉＲＮＡの割合（６０．５７％）は、ｎＥｘｏ（８．５２％）に比べてはるかに高かった（図２ｃ）。また、ｉＥｘｏ中の全７２個のうちの５３個が、Ｐａｒｓｏｎｓ ｅｔ ａｌ．による神経系統特異的ｍｉＲＮＡに属することが分かった（図２ｇ）。ｉＥｘｏの総タンパク質濃度もまた、ｎＥｘｏに比べて２０倍ほど増加していた（図１ｄ）。免疫蛍光染色及び流動細胞分析の結果から、ｉＥｘｏにはＮＰＣ特異的マーカータンパク質であるＳｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｐａｘ６、及びＮｅｓｔｉｎが含まれていることを確認し、前記遺伝子のタンパク質発現がｍＲＮＡ発現のように増加したことが確認された（図１ｈ）。前記結果は、ＵＨＤＦが神経発達に関するｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びタンパク質の豊富なリプロソームを分泌するように誘導することができたことを証明する。ＵＨＤＦで誘導されたリプロソーム内の転写物及びタンパク質の数が劇的に増加しており、そのうちの多くの遺伝子が幹細胞で分化能を維持する役割を果たすため、このような増加は、細胞リプログラミングにおける大きな要因となれることを意味する。
［実験例２］実施例１に係るリプロソームの神経前駆細胞の誘導能の分析実験
リプロソームによる神経表現型の方向への細胞リプログラミングの誘導可不可を確認するために、本発明の発明者らは、ｉＥｘｏがＨＤＦ内へ伝達されるかを確認した。ｉＥｘｏを親油性のトレーサーであるＤｉＤ（ＤｉＤ−ｌａｂｅｌｅｄ ｉＥｘｏ）で標識した後、ＨＤＦに処理してから１日培養した。ＤｉＤで標識されたｉＥｘｏを、ｉＥｘｏ処理済みのＨＤＦの細胞から確認することができた（図３ｃ、左側のパネル）。さらに、ｉＥｘｏ内部のリプログラミング因子が伝達されているか否かを確認するために、完全なＨＤＦをＣｙ５．５標識済みのｐｏｌｙ（Ａ）２７で標識した後、ＵＨＤＦを製造するプロセスを経て、ｐｏｌｙ（Ａ）２７−Ｃｙ５．５を含むエキソソーム（Ｃｙ５．５−ｅｘｏ）が誘導されるようにした。ＨＤＦをＣｙ５．５−ｅｘｏを含むｉＥｘｏで処理し、１日培養した後、Ｃｙ５．５−ｅｘｏがＨＤＦの細胞質から観察された（図３ｃの右側のパネル）。興味深いことに、Ｐａｘ６の発現の増加は、ｉＥｘｏを処理したＨＤＦから処理後の２４時間後に誘導されており、これは、リプロソームがＨＤＦ内へ高効率で伝達され、入ることを意味する。
次に、ｉＥｘｏが細胞リプログラミングを誘導できるか否かを確認した。ＨＤＦ（１×１０５個、７次継代培養）を、ｈＮＳＣ、ＮＨＤＦ、及びＵＨＤＦが１日培養された培養培地から分離されたエキソソーム（以下、それぞれｈＮＳＣ−Ｅｘｏ、ｎＥｘｏ、及びｉＥｘｏ）に露出させた。興味深いことに、５日に掛けて前記３種のエキソソームとＨＤＦを共同培養したとき、ｉＥｘｏを処理した細胞（ｉＥｘｏ−ＨＤＦ）のみで密集したコロニーが形成され（＞１００μｍ ｉｎ ｄｉａｍｅｔｅｒ）（図３ｂ）、培養初日からＮＰＣ特異的なマーカーの増加を示した（図３ｄ−ｆ）。細胞を２０×１０１１ ｉＥｘｏｓ／ｍｌで処理したとき、ｉＥｘｏ−ＨＤＦは、スフェロイドの形成及びＮＰＣ特異的なマーカーの発現を最大レベルまで示し（図３ｉ）、以下、この濃度を用い、ｉＥｘｏの効果を確認した。エキソソームの処理から５日後、ｉＥｘｏ−ＨＤＦコロニーは１５００個に達し、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｐａｘ６、及びＮｅｓｔｉｎのようなＮＰＣ特異的遺伝子及びタンパク質の発現が、ｈＮＳＣと比肩できる程度まで増加するなど、ＮＰＣと同様の性質を示した（図３ｄ−ｅ）。最後に、二重陽性流動細胞の分析の結果、５日目のｉＥｘｏ−ＨＤＦでは、Ｐａｘ６／Ｎｅｓｔｉｎ、Ｓｏｘ１／Ｎｅｓｔｉｎ、及びＳｏｘ２／Ｎｅｓｔｉｎである細胞がそれぞれ７４．７％、６８．５％、及び７５．８％に達していた（図３ｆ）。ＲＮＡ−ｓｅｑ分析の結果、ｉＥｘｏ−ＨＤＦの神経特異的な遺伝子発現のプロファイルは、ｈＮＳＣと類似しており、ＨＤＦとはかけ離れた様相を示し（図３ｇ）、遺伝子のオントロジー分析により、ｉＥｘｏ−ＨＤＦで過発現された多くの遺伝子が、神経発生と関連していることが分かった。このような結果は、ｉＥｘｏが細胞リプログラミングを迅速に誘導し、ＨＤＦから高い歩留まりでＮＰＣと同様の細胞をたったの５日で生成できることを示している。５日目にＮＰＣと同様の特性を有するようになったｉＥｘｏ−ＨＤＦをｒＮＰＣとし、ｉＥｘｏ−ＨＤＦの密集したコロニーをｒＮＰＣの１次継代培養群（ｐ１）と命名した。
ｒＮＰＣ ｐ１のスフェロイドを集め、数回の継代培養を経てから均一な細胞群を得た。ＮＰＣ特異的なマーカー遺伝子及びタンパク質を分析した結果、ｐ２、ｐ４、ｐ６、及びｐ１０のｒＮＰＣのすべてにおいて、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｐａｘ６、及びＮｅｓｔｉｎが高いレベルで発現した。Ｋｉ−６７の免疫蛍光染色の結果、ｒＮＰＣは活発に増殖していることが分かった（図３ｈ）。Ｐ６ ｒＮＰＣの増殖能は、数週間も維持されることが分かった（図３ｋ）。前記結果を総合すると、前記細胞が、複数回の継代培養を経ているにもかかわらず、Ｋｉ６７及びＮＰＣのマーカーの発現を維持する均一かつ増幅可能な群の細胞であることが証明されており、これは、ｒＮＰＣが、ＮＰＣの有する増幅と自己再生能を有していることを意味する。
［実験例３］ｒＮＰＣ誘導メカニズムの分析実験
リプロソームによる迅速な細胞リプログラミングが行われるメカニズムを解明するために、本発明の発明者らは、細胞のストレスによる遺伝子発現の後成的調節に注目した。興味深いことに、ｉＥｘｏには、ヒストン修飾とＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）経路関連遺伝子に関連するｍＲＮＡ及びタンパク質が含まれていた（図４ａ）。次に、ｉＥｘｏが標的細胞のＭＡＰＫのシグナル伝達経路を刺激することで、クロマチンリモデリングを誘導することができるか否かを確認した。ウェスタンブロッティング及び流動細胞分析の結果、ｉＥｘｏを処理した１日後から、ＨＤＦではｐ３８、Ｅｒｋ、及びＭｓｋ１の発現が急激に増加した（図４ｂ、ｃ）。また、ＭＡＰＫのシグナル伝達経路のｐ３８及びＥｒｋの阻害剤であるＳＢ２０３５８０及び／またはＵ０１２６をｉＥｘｏ−ＨＤＦに処理した場合には、各標的タンパク質及び前記シグナル伝達経路の下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）タンパク質であるＭｓｋ１と、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｐａｘ６、及びＮｅｓｔｉｎとなどのＮＰＣ特異的遺伝子及びタンパク質の発現が有意に減少することが確認された（図４ｄ）。このような結果は、リプロソームがクロマチンリモデリングを介して急速にｒＮＰＣを誘導するために、ＭＡＰＫのシグナル伝達システムが重要なメカニズムとして働くことを示す。さらに、ｉＥｘｏの処理後、３日目のＨＤＦの核において、局部クロマチン密度及びヒストン修飾に示された変化を追跡した。局部クロマチン密度は、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）で標識されたＨ２Ｂタンパク質（Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ）をトランスフェクションさせることで確認した。ｉＥｘｏの処理後、時間の経過に伴ってＨ２Ｂ−ＧＦＰ分布が広がる様相が示された（図４ｅ）。また、ＨＰ１α（ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ １ α）の核内の発現及び阻害性ヒストン修飾であるＨ３Ｋ２７ｍｅ３が減少し、ｉＥｘｏ処理後、時間経過に伴って活性化ヒストン修飾であるＨ３Ｋ４ｍｅ３２４がＨＤＦにおいて増加した（図４ｆ）。特に、神経発生関連遺伝子のＤＮＡメチル化プロファイルを確認したところ、メチル化が減少していることが分かった（図４ｇ）。前記のような結果は、リプロソームが、ＭＡＰＫのシグナル伝達システムの活性化及びクロマチンリモデリングのみならず、いくつかの後成的調節子を介してＮＰＣと類似の細胞への迅速なリプログラミングを誘導することを示す。
［実験例４］ｒＮＰＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ分化能の分析実験
ｒＮＰＣが有する神経細胞への分化能を評価するために、ｒＮＰＣがニューロン、星状細胞、及び乏突起膠細胞のような神経系に分化することができるか否かを確認した。５日目のｒＮＰＣスフェロイドを、近年発表された神経分化プロトコルに基づいてゼラチンコートされた培養プレートに培養した。神経分化から４週間後、分化した細胞において、Ｍａｐ２とＴｕｊ１（ニューロンのマーカー）、Ｇｆａｐ（星状細胞のマーカー）、及びＯ４（乏突起膠細胞のマーカー）の発現が確認された（図５ａ）。Ｍａｐ２、Ｔｕｊ１、Ｇｆａｐ、及びＳ１００ｂ（星状細胞のマーカー）、Ｍｂｐ（乏突起膠細胞のマーカー）、ａｎｄ Ｏｌｉｇｏ１（乏突起膠細胞のマーカー）のｑＲＴ−ＰＣＲ分析の結果からもまた、ｒＮＰＣが成功的に神経細胞へと分化したことが示された。次に、ｒＮＰＣから派生したニューロンの機能的特性を、全細胞パッチクランプ記録を介して確認した。まず、カリウムイオンチャンネル（ＥＡＧ１、Ｋｖ４．３、及びＫｖ７．２）及びナトリウムイオンチャンネル（Ｎａｖ１．３、Ｎａｖ１．６、及びＮａｖ１．７）に関する遺伝子発現が、ｒＮＰＣからニューロンに分化した後、大きく増加したことが確認された。電流クランプの際に、ＮＰＣから派生したニューロンでは、内向きナトリウム電流及び外向きカリウム電流を確認することができた（図５ｂ）。また、ナトリウムイオンチャンネルの遮断剤であるＴＴＸ（ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ）により、ｒＮＰＣから派生したニューロンにおいてナトリウム電流が阻害されることが観察された。ｒＮＰＣから派生したニューロンは、電流クランプに反応して活動電位を誘発した（図５ｃ）。前記のような結果は、ｒＮＰＣが多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有しており、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてニューロン、星状細胞、及び乏突起膠細胞に効果的に分化したことを示す。
ｒＮＰＣがｉｎ ｖｉｖｏで多能性分化できるか否かを確認するために、ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーターによって発現されるＧＦＰレポーターをトランスフェクションさせたＨＤＦを使用し、Ｇ４１８抗生剤でレポーターが安定して発現される細胞（ＧＦＰ−ＨＤＦ）を確立した。確立された５日目のＧＦＰ−ｒＮＰＣスフェロイド（約１，５００個のクラスタ）を、正常のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（ｎ＝５）の脳（ｓｔｒｉａｔａ；線条体）に移植し、これらの細胞の分化状態を４週間後に確認した。その結果、脳の複数個所において、ＧＦＰ陽性である細胞が確認され、そのうちの多くのものに長い神経突起が形成されており（図５ｄ）、これは、これらの細胞が効率的に生存、移動、及び宿主統合（ｈｏｓｔ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）されたことを示す。ＧＦＰ−陽性である細胞は、ヒトミトコンドリア抗体で染色されることを確認し、これらの細胞がＧＦＰ−ｒＮＰＣであることが確認された（図５ｅ）。Ｇｆａｐ陽性である星状細胞、Ｍａｐ２、及びＴｕｊ１陽性であるニューロン、Ｏ４陽性である乏突起膠細胞の一部は、ＧＦＰ−陽性を示した（図５ｆ）。前記のような結果は、移植されたＨＤＦから誘導されたｒＮＰＣが、たったの５日目にｉｎ ｖｉｖｏで神経系の３つの異なる細胞型に分化することのできる多能性を有することを示す。
［実験例５］脂肪細胞の誘導能を有するリプロソームの分析実験
実施例２の脂肪細胞の誘導能を有するリプロソーム誘導方法により培養したＵＨＤＦを、ＣＤ６３エキソソームのマーカーに対する免疫蛍光染色によって分析した結果（このとき、対照染色は、核染色剤であるＤＡＰＩとする）、多量のエキソソームが生成されており（図６ａ）、前記マーカーと褐色脂肪細胞のマーカーであるＵＣＰ１の免疫蛍光染色の結果、分泌されるエキソソームでＵＣＰ１が発現していることが分かった（図６ｂ）。実施例２の脂肪細胞の誘導能を有するリプロソームの製造方法によって取得したリプロソームの形を、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ及びＴＥＭ（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いて分析した結果、正常な形態のエキソソームの形が観察され（図６ｃ）、前記リプロソームに対するＲＮＡ−Ｓｅｑ分析の結果、褐色脂肪細胞に関連するｍＲＮＡ及びｍｉｃｒｏＲＮＡと脂質合成に関連するｍＲＮＡとが対照群に比べて大きく増加したことが分かった（図６ｄ）。総合すると、実施例２のリプロソームの製造方法により、ＨＤＦから脂肪細胞の誘導能を有するリプロソームが成功的に誘導、取得されたことを確認できる。
［実験例６］ｒＢＡの分析実験
実施例２のｒＢＡの製造方法によって製造されたｒＢＡを、脂肪細胞から多量発見される脂肪滴を確認できるＡｄｉｐｏＲｅｄで染色した結果（このとき、対照染色は、核染色剤であるＤＡＰＩとする）、ＡｄｉｐｏＲｅｄが陰性である対照群に比べて明らかな陽性を示した（図７の上段パネル）。前記ｒＢＡを褐色脂肪細胞のマーカーであるＵＣＰ１で免疫蛍光染色した結果（このとき、対照染色は、核染色剤であるＤＡＰＩとヒトミトコンドリア抗体であるＨｕＭｉｔｏとする）、同様に、陰性である対照群に比べて明らかな陽性を示した（図７の下段パネル）。前記のような結果は、実施例２の製造方法により製造されたリプロソーム及びこれを用いたｒＢＡの製造方法により、ＨＤＦをｒＢＡにリプログラミングすることができることを示している。
［実験例７］肝細胞の誘導能を有するリプロソームの分析実験
実施例３の肝細胞の誘導能を有するリプロソーム誘導方法により培養したＵＨＤＦを、ＣＤ６３エキソソームのマーカーに対する免疫蛍光染色によって分析した結果（このとき、対照染色は、核染色剤であるＤＡＰＩとする）、多量のエキソソームが生成されており（図８ａ）、前記マーカーと肝細胞のマーカーであるＨＮＦ１ａの免疫蛍光染色の結果、分泌されるエキソソームでＨＮＦ１ａが発現していることが分かった（図８ｂ）。実施例３の肝細胞の誘導能を有するリプロソームの製造方法によって取得したリプロソームの形を、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ及びＴＥＭ（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いて分析した結果、正常な形態のエキソソームの形が観察され（図８ｃ）、前記リプロソームに対するＲＮＡ−Ｓｅｑ分析の結果、肝細胞に関連するｍＲＮＡ及びｍｉｃｒｏＲＮＡが対照群に比べて大きく増加したことが分かった（図８ｄ）。総合すると、実施例２のリプロソームの製造方法により、ＨＤＦから脂肪細胞の誘導能を有するリプロソームが生成、分泌されたことを確認できる。
［実験例８］ｒＨの分析実験
実施例３のｒＨの製造方法によって製造されたｒＨを、肝細胞のマーカーであるＡＦＰ、ＨＮＦ４ａ、ＣＫ１８、及びＡＬＢで免疫蛍光染色した結果（このとき、対照染色は、核染色剤であるＤＡＰＩとする）、明らかな陽性を示した（図９）。前記のような結果は、実施例３の製造方法により製造されたリプロソーム及びこれを用いたｒＨの製造方法により、ＨＤＦをｒＨにリプログラミングすることができることを示している。
［実験例９］毛髪再生能を有するリプロソームの分析実験
実施例４の毛髪再生能を有するリプロソーム誘導方法により培養したＵＨＤＦを、ＣＤ６３エキソソームのマーカーに対する免疫蛍光染色によって分析した結果（このとき、対照染色は、核染色剤であるＤＡＰＩとする）、多量のエキソソームが生成されており（図１０ｂ）、前記マーカーと毛髪再生に重要なマーカーであるＳｈｈ（Ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ）の免疫蛍光染色の結果、分泌されるエキソソームでＳｈｈが発現していることが分かった（図１０ｃ）。実施例４の毛髪再生能を有するリプロソームの製造方法によって取得したリプロソームの形を、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ及びＴＥＭ（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いて分析した結果、正常な形態のエキソソームの形が観察され（図１０ａ）、前記リプロソームに対するＲＮＡ−Ｓｅｑ分析の結果、毛髪の再生に関連する毛髪組織の発生、発毛の促進、Ｊａｋ−Ｓｔａｔのシグナル伝達システム及びＷｎｔのシグナル伝達システムのｍＲＮＡ及びｍｉｃｒｏＲＮＡが対照群に比べて大きく増加したことが分かった（図１０ｄ）。総合すると、実施例４のリプロソームの製造方法により、ＨＤＦから毛髪再生能を有するリプロソームが成功的に誘導されたことを確認できる。
［実験例１０］毛髪再生能を有するリプロソームによる毛髪再生の実験
実施例４の毛髪再生能を有するリプロソームの製造方法に基づいて取得したリプロソームを脂質マーカーであるＤｉＤで染色した後、ヌードマウス及び対照群であるＣ５７マウスの表皮に塗布した結果、リプロソームが毛穴内に浸透したことが分かった（図１１ａ−ｂ、対照染色は、核染色剤であるＤＡＰＩとする）。背側（ｄｏｒｓａｌ ｓｉｄｅ）の毛髪を除去したＣ５７マウス及びヌードマウスの皮膚に、Ｄ−ＰＢＳ培養液に希釈したリプロソームを１×１０９、１×１０１０、及び１×１０１１個／ｍｌの濃度でそれぞれ塗布し、１週間及び２週間後に、それぞれその効果を確認したところ、ヌードマウスの場合は、リプロソームを処理していない群では、目視で毛髪が観察されないのに対し、リプロソームを処理した群の場合、1週目から複数の毛髪が伸びていることが確認され、Ｃ５７マウスは、対照群に比べて、複数の毛髪が長く伸びていることが確認された（図１３ａ−ｂ）。リプロソームを２週間処理した群は、対照群に比べて毛髪が３倍以上長く伸び、Ｈ＆Ｅ染色の結果、リプロソームを処理した皮膚から毛包を示す濃い紫の染色部分が複数観察され（図１２ａ−ｂ）、皮膚層の全体、特に皮下組織（ｓｕｂｃｕｔｉｓ）において、対照群に比べてはるかに多い数の毛包が確認されており（図１２ｃ−ｄ）、毛髪生成が促進されたことを組織レベルでも確認することができた。また、リプロソーム処理群は、対照群に比べて毛包細胞の再生に関連するタンパク質であるβ−Ｃａｔｅｎｉｎ、Ｓｈｈ、及びＫｉ６７の発現が増加したことを組織の免疫蛍光染色によって確認し（図１０ｃ−ｄ）、発毛促進因子であるＳｈｈ、β−Ｃａｔｅｎｉｎ、ＫＲＴ−２５、ＶＣＡＮ、Ｇｌｉ１、Ｌｅｆ１、Ｐｃｔ１、Ｔｙｒｐ１、Ｔｙｒ、Ｍｉｔｆ、及びＤＣＴのｍＲＮＡ発現が増加し、発毛抑制因子であるＳｆｒｐ４及びＤＫＫのｍＲＮＡ発現が減少したことをｑＲＴ−ＰＣＲにより確認した（図１１ｅ−ｆ）。総合すると、毛髪再生能を有するリプロソームは、実験例９に基づくｉｎ ｖｉｔｒｏの実験で予測されたように、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても、毛髪の再生に優れた効果を示すことを意味する。
［実験例１１］組織再生能を有するリプロソームの分析実験
実施例５の組織再生能を有するリプロソームの製造方法により培養したＵＨＤＦを、ＣＤ６３エキソソームのマーカーに対する免疫蛍光染色によって分析した結果（このとき、対照染色は、核染色剤であるＤＡＰＩとする）、多量のエキソソームが生成されていることが分かった（図１４ａ）。前記細胞の培養液から分離したエキソソーム（リプロソーム）をｑＲＴ−ＰＣＲを用いて分析した結果、創傷治癒に関連する細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）に関する遺伝子であるＣｏｌｌａｇｅｎ １α（Ｃｏｌ１α）、Ｃｏｌｌａｇｅｎ ３α（Ｃｏｌ３α）、及びＥｌａｓｔｉｎ（ＥＬＮ）と、細胞増殖に関する遺伝子であるＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、及びＣｙｃｌｉｎ−Ｄ１となどの発現が、対照群から分離したエキソソームに比べて高くなっていることが分かった（図１４ｂ）。また、ＲＮＡ−ｓｅｑの結果、リプロソームでは、ｎＥｘｏに比べて創傷治癒に関する遺伝子が多く発現していることが分かった（図１４ｃ）。
［実験例１２］組織再生能を有するリプロソームによる組織再生効果の分析実験
実施例５の組織再生能を有するリプロソームの製造方法により製造したリプロソームをＨＤＦで処理し、これに対してリプロソームの濃度による効果を確認した。まず、細胞増殖効果を関連マーカーであるＫｉ６７に対する免疫蛍光染色によって分析した結果、実験群は、対照群に比べて前記マーカーの発現がより高く、特に５×１０１１／ｍｌ及び１０×１０１１／ｍｌの濃度のリプロソームで処理したとき、より優れた効果が示されることが分かり、細胞数がより多く増加することが確認された（図１５ａ−ｂ）。次に、前記ＨＤＦをプレートに満杯に培養した後、２０μｌ ｙｅｌｌｏｗ ｔｉｐで線を引いて細胞間の距離を離隔してからリプロソームを処理して培養するｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ａｓｓａｙを行い、この結果、リプロソーム処理群において、空き領域が相対的に迅速に埋まることが示されており（図１５ｃ−ｄ）、対照群の細胞移動率が高いことを確認できた。
次に、実施例５に基づいて製造されたリプロソームの濃度に応じた組織の再生プロセスにおける血管形成の効率を分析するために、内皮細胞であるＨＵＶＥＣに異なる濃度のリプロソームを処理し、１０時間後に管（ｔｕｂｅ）の形成を確認した。その結果、リプロソーム処理群は、対照群に比べて管を良好に形成することが目視でも確認され（図１５ｅ）、管の長さ及び分岐点の数も高く示されており（図１５ｆ−ｇ）、特に、５×１０１１／ｍｌ及び１０×１０１１／ｍｌの濃度で処理した群では、高い数値が示された。
最後に、リプロソームを処理した細胞内の創傷治癒に関する遺伝子の発現をｑＲＴ−ＰＣＲで分析した。その結果、実験群の場合、対照群に比べて創傷治癒に関する遺伝子の発現が高いことが分かった（図１５ｈ）。
総合してみると、実施例５に基づいて製造されたリプロソームは、細胞の増殖及び移動、並びに血管の発達などを促すことにより、組織の創傷治癒及び再生能力を向上できる。
［比較例１］リプロソームに対する対照群
超音波で刺激していないＨＤＦ（ＮＨＤＦ）を、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ−Ｉ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）、６Ｕ／ｍｌ ｈｅｐａｒｉｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び２００μＭ ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で含むｈＮＳＣ培地（ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ＮＳＣ ＳＦＭ、Ｇｉｂｃｏ）、もしくは繊維芽細胞培地（１０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）及び１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ））に培養した。前記ＮＨＤＦを培養した培養培地からエキソソーム（ｎＥｘｏ）を分離する際には、実施例１のリプロソームの分離方法と同様のプロセスを経た。
［比較例２］リプロソームによって誘導された細胞の対照群
１×１０５のＨＤＦを３５−ｍｍペトリ皿にシードし、１日培養した後、培地を比較例１に基づいて取得したエキソソームを含む培地に変えて、５日間培養した。このとき、エキソソームを含む培地は、各実験群と一致させ、ｒＮＰＣ、ｒＢＡ、及びｒＨの対照群に対して、それぞれｈＮＳＣ培地、幹細胞の脂肪細胞の分化誘導培地、及び肝細胞の培養培地を使用しており、培養培地は、２日ごとに交換した。
前述した本発明の説明は例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形できることを理解するであろう。よって、前述の実施形態はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。例えば、単一型で説明された各構成要素を分散して実施してもよく、同様に分散したものと説明された構成要素を結合された形態に実施してもよい。
本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲の意味及び範囲、並びにその均等概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態も本発明に含まれるものと解釈すべきである。

Claims (18)

  1. 哺乳類由来細胞のリプログラミングを誘導するリプロソームを含む組成物を第１の培養培地に混入するステップと、
    前記混入された培地から哺乳類由来第１の細胞を培養するステップと、
    前記培養後、第２の細胞を収得するステップと、を備える
    哺乳類由来細胞をリプログラミングする方法であって、
    前記リプロソームは哺乳類由来細胞に超音波刺激を与え、細胞のない培養培地に超音波刺激を与えるステップと、
    前記超音波刺激された細胞と前記超音波刺激された培養培地とを混合した混合物を一定時間培養するステップと、
    前記培養後の混合物を遠心分離して上澄み液を取得するステップと、
    前記上澄み液をフィルターでろ過し、ろ液を取得するステップと、
    前記ろ液を濃縮するステップと、を備える製造方法で製造され、
    前記リプロソームは、直径が５０〜２００ｎｍであり、前記組成物中に１０ ７ 〜１０ １５ 個／ｍｌの濃度で含まれ、
    前記リプロソーム中の全ＲＮＡに対して、小型ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ＲＮＡ）の割合が４０％以上であり、前記小型ＲＮＡにおいて、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の割合が４０％以上であり、
    前記混入された培地は第２の細胞が維持かつ増幅することができる培養培地であり、
    前記リプロソームは、クロマチンリモデリング（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）に関与する遺伝子のＲＮＡを含み、前記遺伝子は、ＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）のシグナル伝達システム上のリン酸化酵素の遺伝子と、ヒストン修飾活性を有する遺伝子とを含む
    ことを特徴とする方法。
  2. 前記ＭＡＰＫのシグナル伝達システム上のリン酸化酵素の遺伝子は、ＢＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ３、ＭＡＰ３Ｋ１０、ＭＡＰ３Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ５、ＭＡＰ３Ｋ７、ＭＡＰＫ１２、ＲＰＳ６ＫＡ４（ＭＳＫ２）、ＴＡＯＫ１、及びＴＡＯＫ２で構成された群から少なくとも１つ以上選択される
    請求項１に記載の方法。
  3. 前記ヒストン修飾活性を有する遺伝子は、ＡＳＨ１Ｌ、ＣＲＥＢＢＰ、ＤＯＴ１Ｌ、ＥＰ３００、ＧＴＦ３Ｃ１、ＫＡＴ２Ａ、ＫＡＴ６Ｂ、ＫＤＭ１Ａ、ＫＤＭ３Ｂ、ＫＤＭ６Ａ、ＫＭＴ２Ａ、ＫＭＴ２Ｅ、ＮＣＯＡ３、ＮＳＤ１、ＳＥＴＤ１Ａ、及びＳＥＴＤ２で構成された群から少なくとも１つ以上選択される
    請求項１に記載の方法。
  4. 前記哺乳類由来細胞は、哺乳類由来の繊維芽細胞または哺乳類由来器官内の組織細胞である
    請求項１に記載の方法。
  5. 前記細胞のない培養培地は、胚性幹細胞培地、神経幹細胞培地、心臓幹細胞培地、毛乳頭細胞培地、間葉系幹細胞培地、骨形成培地、筋形成培地、造血幹細胞培地、ニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）培地、星状細胞培地、乏突起膠細胞培地、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）培地、脂肪細胞培地、筋肉細胞培地、血管内皮細胞培地、膵臓β細胞培地、または心筋細胞培地である
    請求項１に記載の方法。
  6. 前記細胞のない培養培地は、神経幹細胞培地、毛乳頭細胞培地、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）培地、または、脂肪細胞培地である
    請求項１に記載の方法。
  7. 前記細胞に与えられる超音波刺激は、１０〜３０ＫＨｚ、０．５〜３Ｗ／ｃｍ２において１〜１０秒に掛けて行われる
    請求項１に記載の方法。
  8. 前記培養培地に与えられる超音波刺激は、１０〜３０ＫＨｚ、１〜２０Ｗ／ｃｍ２において１〜２０分に掛けて行われる
    請求項１に記載の方法。
  9. 前記超音波刺激された細胞と前記超音波刺激された培養培地とを混合した混合物を一定時間培養するステップは、１〜１０日に掛けて行われる
    請求項１に記載の方法。
  10. 前記上澄み液をフィルターでろ過し、ろ液を取得するステップは、前記上澄み液をフィルターでろ過する前に、４℃以下で７日〜１ヶ月に掛けて保管するステップをさらに備える
    請求項１に記載の方法。
  11. 前記哺乳類由来第１の細胞は、哺乳類由来の繊維芽細胞または哺乳類由来器官内の組織細胞である
    請求項１に記載の方法。
  12. 前記第２の細胞は、万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）以下の分化能を有する細胞である
    請求項１に記載の方法。
  13. 前記第２の細胞は、胚性幹細胞、神経幹細胞、心臓幹細胞、毛乳頭細胞、間葉系幹細胞、または、造血幹細胞である
    請求項１に記載の方法。
  14. 前記第２の細胞は、神経幹細胞、ニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）、星状細胞、乏突起膠細胞、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）、脂肪細胞、毛包細胞、筋肉細胞、血管内皮細胞、角質細胞、膵臓β細胞、または、心筋細胞である
    請求項１に記載の方法。
  15. 前記第２の細胞は、前記哺乳類由来第１の細胞とは異なる種類である
    請求項１に記載の方法。
  16. 前記哺乳類由来第１の培養培地は、前記細胞のない培養培地と同じである
    請求項１に記載の方法。
  17. 前記第２の細胞は、幹細胞、始原細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）、または、前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）であり、前記哺乳類由来第１の細胞を培養するステップは、１〜６日に掛けて行われる
    請求項１に記載の方法。
  18. 前記第２の細胞は、ニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）、星状細胞、乏突起膠細胞、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）、脂肪細胞、毛包細胞、筋肉細胞、血管内皮細胞、角質細胞、膵臓β細胞、または、心筋細胞であり、前記哺乳類由来第１の細胞を培養するステップは、１０日〜６０日に掛けて行われる
    請求項１に記載の方法。
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