JP6726291B2 - 心筋線維化の処置のための医薬組成物 - Google Patents

Description

本特許出願は、２０１５年１１月１３日に韓国特許庁に出願された、韓国特許出願第10-2015-0159888号の優先権の利益を主張し、この内容は参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、心筋線維化を処置する医薬品組成物、より具体的には、心筋線維化または心筋線維化を伴う心疾患を処置する医薬品組成物に関する。

線維化の処置において形成される希少疾患は、心臓組織、血管内皮細胞および骨髄性細胞に存在する線維芽細胞の分化に由来する。筋線維芽細胞の供給源となる細胞は様々であり得るが、分化した筋線維芽細胞は細胞外マトリックス（線維性コラーゲンなど）の過剰産生およびその分泌に関与している。細胞内α平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）の発現による収縮性細胞の退縮は、線維化の程度が生じた時点と比較して減少した状態と定義され、反転または可逆性は、正常な組織構造への完全回復状態を指す。

西洋社会で起こる死の約４５％を占める線維性疾患は深刻な問題であり、疾患がかなり進行した後でのみ臨床的に診断され得る(G. Garrison, S.K. Huang, et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 48:550558(2013);およびRosenbloom J., et al. Biochim. Biophys. Acta., 1832(7):1088-1103(2013))。予防処置の制限と共に、線維性疾患は、現在まで進行性線維化または既存の線維化を直接処置する有効な処置手段がない、深刻な臨床分野に属している(Rosenbloom J, Mendoza FA, et al., Biochim. Biophys. Acta, 1832(7):1088-1103(2013))。線維化を誘導する線維性疾患の原因および発生する疾患の形態は様々であり得るが、線維化形成機構の途中において筋線維芽細胞（ＭｙｏＦＢ）（すなわち活性化線維芽細胞）が、病態活性化細胞(pathologically activated cell)として働き、これによって全ての線維性疾患の進行を制御していることが見出された(Dufferield J.S., et al., Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis., 8:241-276(2013))。

特に、心臓は人体において代表的な臓器であり、線維化による心筋組織の構造リモデリングは心臓の運動機能に直接影響を与える。心臓は、様々な細胞（運動機能において中心的な役割を果たす心筋細胞、線維芽細胞、および血管に関連する内皮細胞など）で構成される筋組織である。心筋の体積のほとんどは心筋細胞で構成されるが、線維芽細胞は心筋組織の細胞の５０％以上を占める。線維芽細胞の機能は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を産生および分泌することであり、ＥＣＭは、心筋細胞の効率的な収縮および弛緩を支持し、かつ心筋組織内部の微小環境における適切な力の伝達、電気信号の伝達、細胞内情報伝達、および代謝産物の交換などを促進する、正確な構造体を構成する(F.G. Spinale, Physiol. Rev. 87:12851342(2007))。しかしながら、心臓壁に加えられる圧力の増加、心臓壁の損傷および疾患などによって線維化が発生すると、線維性細胞外マトリックスの過剰蓄積によって起こる心臓組織の硬直により、心臓の機能に変化が生じる(Schroer A.K., et al., J. Cell. Sci. 128(10):1865-1875(2015))。心筋線維化において、線維化の原因となる細胞である筋線維芽細胞は、病態に共通する環境（心臓障害など）を示す(Kendall R.T., Feghali-Bostwick C.A., Front Pharmacol., 5: 123(2014))。損傷した心筋細胞および炎症性免疫細胞から分泌される、線維化を誘導する増殖因子およびサイトカイン（ＴＧＦ−β、アンジオテンシンＩＩ（ＡＮＧ−ＩＩ）、エンドセリンＩ（ＥＴ−１）、ＩＬ−６、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、フィブロネクチンのエクストラドメインＡ（ＥＤＡ）など）は、筋線維芽細胞の分化および活性化に関与する(Frangogiannis N.G., Nat. Rev. Cardiol. 11(5):255-65(2014))。慢性的な病状において、筋線維芽細胞は、継続的な増殖およびその活性化によって、線維化プロセスの悪循環を自律的に促進する。これらの要素は、ＴＧＦ−β１およびＡＮＧ−ＩＩの自己分泌、細胞外マトリックスの過剰産生による組織の硬化を介した機械的な刺激による線維芽細胞におけるＡＮＧ−ＩＩのＩ型受容体の発現、およびアポトーシスを防ぐ遺伝子の活性化による、新規な分泌細胞の機能の提供を含む(Wynn T.A., Ramalingam T.R. Nat. Med. 18: 1028-1040 (2012))。アポトーシスの機能を失った筋線維芽細胞の継続的な増殖および活性化は、組織のリモデリングを引き起こす細胞外マトリックスの産生および蓄積、ならびに炎症細胞の機能を導く。酸素フリーラジカル、シグナル伝達を行う脂質物質、およびＴＮＦ−αなどのサイトカインの分泌は、損傷した組織における炎症およびＭＣＰ−１などのケモカインの分泌を介して、炎症性免疫細胞の流入を促進し、これによって反応性線維化プロセスを進行させる(Van Linthout S., et al. , Cardiovasc. Res. 102(2):258-269(2014))。線維芽細胞の活性化の延長が誘導された心臓では線維性組織が生じ、それによって様々な病的に有害な作用が起こる。１）線維性コラーゲンに包まれた周囲の心筋細胞は萎縮し、これによって様々なサイズで存在し、筋細胞の運動負荷を減少させる(Drakos S.G., et al. J. Am. Coll. Cardiol. 27;56(5):382-391(2010))。２）受動的な組織の硬直性の増加は、分泌されたＩ型コラーゲンの架橋および筋線維芽細胞のギャップ結合によって、収縮性の線維組織を産生し、心臓の拡張機能障害をもたらす(Lo B. et al. Hypertension 60:677683(2012))。３）冠動脈血管の収縮および弛緩における異常は心筋の酸素供給を減少させるため、血管周囲線維化は、正常なエネルギー代謝の減少によって、心筋細胞のアポトーシスをもたらす(Coen, M., Gabbiani, G. & Bochaton-Piallat, ML Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol, 31:23912396(2011))。したがって、そのような線維性リモデリングが長引くと、拡張期心不全から収縮期心不全への弛緩のプロセスが、心筋細胞の収縮およびアポトーシスの発生によって示される(Kamalov G., Zhao W., et al. J Cardiovasc. Pharmacol. 62(6):497-506(2013))。

心臓組織の線維化の形態は、大量の心筋細胞の壊死が発生し（心筋梗塞など）、広範囲の筋細胞の壊死が生じた（心筋梗塞など）場合に、瘢痕組織を形成し、急速な心臓の破裂を防ぐ置換性線維化に分類され、かつ様々な病状によって徐々に拡散する反応性線維化である間質性および血管周囲線維化に分類される(Bharath Ambale-Venkatesh and Joao A. C. Lima, Nat. Rev. Cardiol. 12: 18-29 (2015))。心筋線維化を伴う心疾患は、１）遺伝子異常に関連する心筋肥大、２）慢性代謝疾患（高血圧、慢性腎疾患、糖尿病、肥満など）に関連する心疾患、３）心臓弁膜症、４）炎症性疾患に関連する心疾患（サルコイドーシス、自己免疫性心筋炎および心臓移植関連拒絶反応など）、５）構造的心疾患（冠動脈機能障害、大動脈弁狭窄症、非虚血性拡張型心筋症など）、６）感染症（シャーガス病、ウイルス性心筋炎など）、７）先天性心疾患（チアノーゼ性心疾患、ファロー四徴症、大血管転位症、単心室症など）、８）遺伝性疾患（デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、ファブリー病など）に関連する心疾患、および９）有毒化学物質の曝露（喫煙、アルコール摂取、抗がん剤など）によって、および自然な老化現象において生じる心疾患、を含む（Schelbert E.B., Fonarow G.C., J. Am. Coll. Cardiol. 63(21):2188-2198(2014); Collier P., et al., QJM. 105(8):721-724(2012); Maron B.J, Maron M.S., Lancet. 381(9862):242-255(2013); Kong P., Christia P., et al. Cell. Mol. Life Sci. 71(4):549-574(2014);およびMavrogeni S., Markousis-Mavrogenis G., et al. World J. Cardiol. (7):410-414(2015)）。さらに、線維化が疾患の原因となる要素の種類に関係なく進行する場合、心臓は、心室の硬直とそれによる心不全（収縮期および拡張期心機能障害など）との間の因果関係を示す(Weber K.T., Sun Y., et al. Nat. Rev. Cardiol. 10 (1): 15-26 (2013))。最近、心不全は心機能の異常に依存する２つのカテゴリーに臨床的に分類され、これらは、直接的な原因が駆出率が保存された左心室心不全（ＨＦｐＥＦ）の線維性硬直であり、拡張機能の異常を示す正常な駆出率と、心筋細胞の損失、収縮機能の異常、および心臓の膨張が原因である駆出率の減少を示す、駆出率が減少した心不全（ＨＦｒＥＦ）である(Burchfield J.S., Xie M., Hill J.A., et al. Circulation 128 (4): 388-400 (2013);およびButler J., Fonarow G.C., et al. JACC Heart Fail. 2(2): 97-112(2014))。ＨＦｐＥＦの危険因子は、老化、糖尿病および代謝疾患、心肥大、冠動脈疾患ならびに高血圧を含み、これらの因子は心筋線維化を引き起こし、拡張期心不全を進行させる。さらにＨＦｒＥＦの場合、アポトーシス（心筋梗塞など）が主な原因であるが、別の線維化に加えて、間質性線維化の拡散における増加が疾患重症度の増加に比例し、疾患を悪化させる因子として働くことが報告された(Borlaug B.A., Nat. Rev. Cardiol. 11(9):507-515(2014))。

心筋線維化の予防研究は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を過剰発現させたトランスジェニックマウス、またはＴＧＦ−βの補助因子であるエンドグリン遺伝子を欠損させたトランスジェニックマウスからの圧負荷によって誘導した心不全モデルにおいて報告された。各トランスジェニックモデルマウスでは、血管内皮細胞の筋線維芽細胞への内皮間葉転換（ＥｎｄｏＭＴ）が阻害され、これは心筋線維化および心不全を進行させる心機能の悪化を予防する効果を示したが、既に発生している線維化に対する治療効果は検証されなかった(Okayama K., Azuma J., et al. Hypertension 59(5):958-965(2012);およびKapur N.K., et al. Circulation 125(22):2728-2738(2012))。

線維化の処置は、疾患の可逆的な回復（過剰蓄積した線維性組織の除去、損傷組織の機能回復など）を促進する処置手段を必要とする。線維性疾患の処置における老化の制御および筋線維芽細胞の死は、有効な治療標的の可能性を含む多くの研究結果を用いて提示されている(Darby I.A., et al. Clin. Cosmet. Investig. Dermatol. 7:301-311(2014))。インビボ(in vivo)での組織損傷の治癒方法における正常な組織構造および機能の回復は、老化およびアポトーシスによる活性化線維芽細胞の消滅によって開始される。蓄積した細胞外線維性マトリックスの分解および排除は、マクロファージおよび線維芽細胞におけるコラゲナーゼの分泌および除去作用によるものであり、損傷後には回復が起こる(Wynn T.A, Ramalingam TR. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat Med. 18: 1028-40 (2012))。しかしながら、線維化の可逆的な処置および回復の可能性は、抗レトロウイルス処置を受けた患者間での肝硬変の症状の可逆的な回復に関連することが報告されており、筋肉構造のリモデリングは、心不全を患う患者に左心補助循環装置を用いる方法において、心筋線維化によってまれに元に戻り、心臓の機能が改善することが報告されている(Sun M., Kisseleva T., Clin. Res. Hepatol. Gastroenterol. 39 Suppl. 1: S60-63(2015);およびJeff M. Berry, et al. Circ. Res. 109:407417(2011))。この事実は、線維化は現在も可逆的に処置できないという従来の知識に対する新たな挑戦であり、線維化に対する新たな処置戦略を提示する。したがって、進行性線維化および既に形成されている線維化の処置は、線維化の発生および進行に関与する病原性細胞である筋線維芽細胞の増殖を阻害し、アポトーシスを誘導する機構に基づく。この処置方法を介して、線維性細胞外マトリックスの形成および消化を制御でき、正常な組織に戻す治療手段を開発する必要がある。

本発明に使用されるＣＣＮ５は、ＣＣＮファミリーに属する基質細胞タンパク質であり、６種類のタンパク質がＣＣＮファミリーにおいて公知であり、細胞機能（血管疾患、血管形成、発がん、線維性疾患の誘導、細胞分化、および生存など）を制御する様々な役割を担っていることが報告されている(Perbal B. Lancet, 363:62-4(2004))。ＣＣＮ５は、ＣＣＮファミリーの他のタンパク質とは異なり、Ｃ末端ドメインを持たず、ＣＣＮ５は他の名称（ＷＩＳＰ−２、ＨＩＣＰ、Ｃｏｐ１、ＣＴＧＦ−Ｌなど）を有する。さらに、ＣＣＮ５は２５０個のアミノ酸配列の単一ポリペプチド鎖からなる。ＣＣＮ５はＮ末端に２２アミノ酸の分泌誘導配列を有し、細胞外に分泌され、シグナル伝達タンパク質として機能する(Russo J.W., et al. J. Cell. Commun. Signal. 4(3):119-130(2010))。

本発明で使用される遺伝子治療は、遺伝子レベルでの心血管疾患の機構の理解、治療用遺伝子の発見、遺伝子導入ベクターおよび実装技術の設計、ならびに前臨床実験および患者での臨床治験における大型動物用の送達技術のために、様々な分野で使用される(Mason D., et al. J. Control Release 215:101-111(2015))。遺伝子ベクター用の非ウイルスベクターの場合には、第２相の臨床結果において、ＳＤＦ−１遺伝子ベクターを心臓の創傷周囲の領域に直接注入する送達方法によって、心筋梗塞を患う患者の心臓機能を改善したことが報告されている。さらに、ウイルスベクターの場合には、アデノウイルス（Ａｄ）およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を、遺伝子送達治療によって心筋内に直接注入する方法、ならびにＡｄおよびＡＡＶを冠動脈および冠静脈に局所的に感染させることによる送達技術が使用された(Chung E.S., Miller L., et al. Eur. Heart J. 36(33):2228-2238(2015))。ＡＡＶ１−ＳＥＲＣＡ２ａの遺伝子治療の臨床ＩＩｂが完了し、これは患者の心筋における収縮力および機能の回復を改善し、ＡＡＶ９−Ｓ１００Ａ１およびＡｄ５−アデニリルシクラーゼ６は臨床段階にあり、ウイルスベクターによる重篤な副作用はなかった(Rincon M.Y., et al. Cardiovasc. Res. 108(1):4-20(2015))。したがって、ＣＣＮ５タンパク質は、遺伝子送達方法によって、線維化の病原性細胞である筋線維芽細胞の選択的なアポトーシス機構を介して、様々な原因によって発生する既存の心筋線維化を処置するのに有効であることが、本発明によって明らかになった。

多数の論文および特許文書が、本明細書のあらゆる箇所で引用され、引用が示される。引用された論文および特許文書の開示は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれ、本発明の属する技術分野のレベルおよび本発明の内容をより明確に説明する。

本発明の発明者は、心筋線維化または心筋線維化を伴う心疾患を可逆的に処置する方法を開発するために集中的な取り組みを行った。結果として、ＣＣＮ５遺伝子またはＣＣＮ５タンパク質が筋線維芽細胞を選択的に死滅させ、心筋線維化を著しく減少させ、進行性または既存の心筋線維化を処置できることを見出した。本発明は、心筋線維化を伴う、駆出率が減少した心不全（ＨＦｒＥＦ）または駆出率が保存された心不全（ＨＦｐＥＦ）に対して治療効果を有することを確認したことによって完成した。

したがって、本発明の対象は、心筋線維化または心筋線維化を伴う心疾患を処置する医薬組成物を提供することであって、この医薬組成物はＣＣＮ５タンパク質、またはＣＣＮ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子担体を含む。

本発明の別の対象は、心筋線維化または心筋線維化を伴う心疾患を処置する方法を提供することであって、この方法は本発明の医薬組成物を対象に投与する工程を含む。

本発明の他の対象および利点は、本発明の詳細な説明、添付の特許請求の範囲および図面からより明白になる。

本発明のある態様において、本発明は、心筋線維化または心筋線維化を伴う心疾患を処置する医薬組成物を提供し、この医薬組成物は（ａ）ＣＣＮ５タンパク質；（ｂ）ＣＣＮ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子担体を有効成分として含む。

心筋線維化または心筋線維化を伴う心疾患を可逆的に処置する方法を開発するための徹底した研究の努力の結果として、本発明者は、ＣＣＮ５遺伝子またはＣＣＮ５タンパク質が線維芽細胞を選択的に死滅させ、心筋線維化を著しく減少させ、進行性または既存の心筋線維化を処置でき、駆出率の減少を伴う心不全（ＨＦｒＥＦ）または保存された駆出率を伴う拡張期心不全（ＨＦｐＥＦ）に対して治療効果を有することを見出した。

本発明のある実施態様において、本発明の心筋線維化は進行性心筋線維化または既存の心筋線維化である。上述のように、最近、線維化を可逆的に処置できる可能性があり、下記の実施例で示すように、筋線維芽細胞は本発明の医薬組成物によって選択的に死滅し、これによって既存の線維化は回復し、したがって進行性心筋線維化または既存の心筋線維化に対する治療効果が確認された。したがって、本発明の重要な特徴は、本発明の医薬組成物が筋線維芽細胞特異的なアポトーシスを誘導することである。

本発明のある実施態様において、本発明のＣＣＮ５タンパク質は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。

本発明のある実施態様において、本発明のＣＣＮ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなる。

本発明の有効成分である、ＣＣＮ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子担体は、ＣＣＮ５遺伝子を心臓に導入する遺伝子送達システムにおいて使用される。本明細書における用語「遺伝子導入」は、遺伝子を細胞内に輸送することを意味し、遺伝子の細胞内形質導入と同じ意味を持つ。組織レベルにおいて、用語「遺伝子送達」は、「遺伝子の伝播」と同じ意味を持つ。したがって、本発明の遺伝子送達システムは、遺伝子の形質導入システムおよび遺伝子伝播システムとして記述され得る。

本発明の遺伝子送達システムを調製するため、ＣＣＮ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＣＣＮ５タンパク質遺伝子）は、適切な発現コンストラクト中に存在し得る。上記の発現コンストラクトにおいて、ＣＣＮ５タンパク質遺伝子は、プロモーターと動作可能に連結してい得る。本明細書において、用語「動作可能に連結している」は、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列または転写制御因子の結合部位のアレイ）と別の核酸配列との間の機能的な結合を指し、これによって調節配列は他の核酸配列の転写および／または翻訳を制御する。本発明において、ＣＣＮ５タンパク質遺伝子配列と連結しているプロモーターは、本発明のある実施態様において動物細胞中で機能し、別の実施態様において哺乳類細胞中で機能し、ＣＣＮ５タンパク質遺伝子の転写を制御する。このプロモーターは、哺乳類ウイルス由来のプロモーターおよび哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーターを含み、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ベータ−アクチンプロモーター、ヒトＩＬ−２遺伝子のプロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子のプロモーター、ヒトＩＬ−４遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーター、およびヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のプロモーターを含み得るが、これらに限定されない。本発明の特別な実施態様において、プロモーターはＣＭＶプロモーターである。

本発明の遺伝子担体は様々な形式で調製され得るが、ウイルス担体または非ウイルス担体（より具体的には、（ｉ）組換えネイキッドＤＮＡ(naked recombinant DNA)分子、（ｉｉ）プラスミド、（ｉｉｉ）ウイルスベクター、および（ｉｖ）組換えネイキッドＤＮＡ分子またはプラスミドを封入するリポソームまたはニオソーム(niosome)）の形式で調製してもよい。

本発明のＣＣＮ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、従来の遺伝子治療に利用されているあらゆる遺伝子送達システム、好ましくは、プラスミド、アデノウイルス(Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Re. 3:2075-2080(1997))、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ、Lashford L.S., et al., Gene Therapy Technologies, Application and Regulations Ed. A. Meager, 1999）、レトロウイルス(Gunzburg W.H., et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Application and Regulations Ed. A. Meager, 1999)、レンチウイルス(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11): R55-62(1999))、単純ヘルペスウイルス(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1411-1415(1995))、ワクシニアウイルス(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999))、リポソーム(Methods in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds), Humana Press 2002)またはニオソームに適用できる。

アデノウイルス
アデノウイルスは、中程度のゲノムサイズ、操作の利便性、高い力価、広範な標的細胞および優れた感染力により、遺伝子導入ベクターとして広く使用されている。ゲノムの両末端は、１００〜２００ｂｐの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含み、これはＤＮＡ複製およびＤＮＡパッケージングに必須のシスエレメントである。ゲノムのＥ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）はウイルスＤＮＡ複製に関与するタンパク質をコードしている。

現在開発されているアデノウイルスのうち、Ｅ１領域を持たない複製能力のないアデノウイルスが広く使用されている。一方、Ｅ３領域は、従来のアデノウイルスベクターから欠失しており、外来遺伝子を挿入する部位を提供する(Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982);およびRiordan, J.R. et al., Science, 245:1066-1073(1989))。したがって、本発明のＣＣＮ５タンパク質遺伝子は、欠失したＥ１領域（Ｅ１Ａ領域および／またはＥ１Ｂ領域、好ましくはＥ１Ｂ領域）またはＥ３領域に挿入されることが好ましく、欠失したＥ３領域に挿入されることがより好ましい。一方、細胞内に送達される標的ヌクレオチド配列は、欠失したＥ１領域（Ｅ１Ａ領域および／またはＥ１Ｂ領域、好ましくはＥ１Ｂ領域）またはＥ３領域、好ましくはＥ３領域に挿入される。さらに、「プロモーター−標的ヌクレオチド配列−ポリＡ配列−ＩＲＥＳ−ＣＣＮ５タンパク質遺伝子」を、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）で連結している、バイシストロニックな発現システムによって発現してもよい。

さらに、アデノウイルスは野生型ゲノムの約１０５％までパッケージングできるため、約２ｋｂをさらにパッケージングできる(Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6:1733-1739(1987))。したがって、アデノウイルスに挿入される上述の外来配列を、アデノウイルスゲノムにさらに連結できる。

アデノウイルスは、４２種類の血清型およびＡ〜Ｆのサブグループを有する。それらのうち、サブグループＣに属するアデノウイルス５型が、本発明のアデノウイルスベクターを得るのに最も好ましい出発物質である。アデノウイルス５型の生化学的情報および遺伝情報は当分野で周知である。

アデノウイルスによって送達された外来遺伝子は、エピソームと同様の方法で複製され、宿主細胞に対する遺伝毒性は極めて低い。したがって、本発明のアデノウイルス遺伝子送達システムを用いた遺伝子治療は非常に安全であると判断される。

レトロウイルス
レトロウイルスは、自身の遺伝子を宿主のゲノムに挿入でき、大量の外来性遺伝物質を運搬でき、感染可能な広範囲の細胞を有し得るため、遺伝子導入ベクターとして使用される。

レトロウイルスベクターを構築するため、ＣＣＮ５タンパク質遺伝子および導入する標的ヌクレオチド配列を、レトロウイルス配列の代わりにレトロウイルスゲノムに挿入し、複製能力のないウイルスを作成する。ウイルス粒子を作成するため、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含み、長い末端反復配列（ＬＴＲ）およびψ配列を含まない、パッケージングした細胞株を構築する(Mann et al., Cell, 33: 153-159 (1983))。ＣＣＮ５タンパク質遺伝子、送達される標的ヌクレオチド配列、ＬＴＲおよびψ配列を含む組換えプラスミドを細胞株に導入すると、ψ配列は、組換えプラスミドのＲＮＡトランスクリプトームの産生を可能にし、トランスクリプトームはウイルス中にパッケージングされ、ウイルスは培地中に放出される(NicholasおよびRubinstein "Retroviral vectors", In: Vector: A survey of molecular cloning vectors and their uses, RodriguezおよびDenhardt (eds.), Stoneham L Butterworth, 494-513 (1988))。組換えレトロウイルスを含む培地を回収し、濃縮し、遺伝子送達システムとして用いる。

第二世代のレトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入が報告された。Kasaharaら(Science, 266: 1373-1376 (1994))は、Mohrlunyマウス白血病ウイルスのバリアントを作成し、これはエリスロポエチン（ＥＰＯ）配列がエンベロープ部位に挿入され、キメラタンパク質を生成した。本発明の遺伝子送達システムもまた、そのような第二世代のレトロウイルスベクター作成戦略に基づいて作成され得る。

ＡＡＶベクター
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、非分裂細胞に感染でき、様々な種類の細胞に感染する能力を持つため、本発明の遺伝子送達システムに適している。ＡＡＶベクターの調製および使用の詳細な説明は、米国特許第5,139,941号および第4,797,368号に詳細に開示されている。

遺伝子送達システムとしてのＡＡＶの研究は、LaFace, et al., Viology, 162: 483-486 (1988), Zhou, et al., Exp. Hematol. (NY), 21: 928-933 (1993), Walsh, et al., J. Clin. Invest., 94: 1440-1448 (1994)およびFlotte, et al., Gene Therapy, 2:29-37(1995)に記述されている。最近、心不全の処置としてのＡＡＶベクターについて、第２相臨床試験が行われている。

典型的に、ＡＡＶウイルスは、標的遺伝子配列（ＣＣＮ５タンパク質遺伝子および送達される標的ヌクレオチド配列）を含むプラスミドであり、ここで２つのＡＡＶ末端反復配列は隣り合わせで配置され(McLaughlin, et al., J. Virol. And Samulski, et al., J. Virol., 63: 3822-3828 (1989))、末端反復配列を含まない野生型ＡＡＶコード配列を含む発現プラスミドである(McCarty, et al. J. Virol., 65:2936-2945(1991))。

ＡＡＶウイルスは、９種類の血清型（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９）を有する。これらのうち、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９は、本発明のアデノ随伴ウイルスベクターを得るのに最も好ましい出発物資である。

他のウイルスベクター
他のウイルスベクターもまた、本発明の遺伝子送達システムとして使用され得る。ワクシニアウイルス(Puhlmann M, et al., Human gene therapy 10: 649-657 (1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. RodriguezおよびDenhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492 (1988); BaichwalおよびSugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148 (1986)およびCoupar, et al., Gene, 68: 1-10(1988))、レンチウイルス由来のベクター(Wang G., et al., J. Clin. Invest. 104 (11): R55-62(1999))または単純ヘルペスウイルス(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995))もまた、ＣＣＮ５タンパク質遺伝子および細胞内に送達される対象のヌクレオチド配列を運搬できる送達システムとして使用できる。

リポソーム
リポソームは、水中に分散するリン脂質によって自動的に生成する。外来ＤＮＡ分子をリポソームに送達するのに成功した例は、NicolauおよびSene, Biochim. Biophys. Acta, 721: 185-190 (1982)ならびにNicolau, et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)に記述されている。一方、リポフェクタミン(Gibco BRL)は、リポソームを用いた動物細胞の形質転換に最も広く使用されている試薬である。ＣＣＮ５タンパク質遺伝子および送達される標的ヌクレオチド配列を封入したリポソームは、エンドサイトーシス、細胞表面への吸着、形質細胞の膜との融合などの機構を介して細胞と相互作用し、ＣＣＮ５タンパク質遺伝子および送達される標的ヌクレオチド配列を細胞中に送達する。

本発明において、遺伝子担体をウイルスベクターに基づいて調製する場合、本発明の医薬組成物を注入する方法は、当分野で公知のウイルス感染方法に従って実行される。ウイルスベクターを用いた宿主細胞の感染は、上記で言及した引用文献に記載されている。

本発明において、遺伝子送達システムが組換えネイキッドＤＮＡ分子またはプラスミドである場合、マイクロインジェクション法(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980);ならびにHarlandおよびWeintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099(1985))、リン酸カルシウム沈殿法(Graham, F.L., et al., Virology, 52:456(1973);ならびにChenおよびOkayama, Mol. Cell. Biolo. 7:2745-2752(1987))、エレクトロポレーション法(Neumann, E., et al., EMBO J., 1:841(1982);およびTur-Kaspa, et al., Mol. Cell. Biol., 6:716-718(1986))、リポソームを介した遺伝子導入法(Wong, T.K., et al., Gene, 10:87(1980); NicolauおよびSene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982);ならびにNicolau, et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987))、ＤＥＡＥ−デキストラン処理法(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985))、および遺伝子銃(gene bombardment)(Yang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990))が、遺伝子を細胞に挿入するのに使用され得る。

本発明で使用され得る遺伝子担体の詳細な説明は、米国特許出願公開第2013/0287739号に詳細に開示され、本発明の明細書において参考として挿入される。

本発明のある実施態様において、本発明の遺伝子担体は、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、リポソームおよびニオソームからなる群から選択される。本発明の別の実施態様において、本発明の遺伝子担体はアデノ随伴ウイルスであり、本発明のさらに別の実施態様において、本発明のアデノ随伴ウイルスは、アデノ随伴ウイルス血清型１、６、８、および９からなる群から選択される。本発明の特別な実施態様において、本発明の遺伝子担体はアデノ随伴ウイルス血清型９である。

本発明において、本発明の医薬組成物は、筋線維芽細胞特異的なアポトーシスを誘導し、線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化を阻害し、これによって心筋線維化を伴う駆出率が減少した心不全、または心筋線維化を伴う駆出率が保存された心不全の処置に有効である。

下記の実施例で示されるように、本発明の医薬組成物は、圧負荷モデル（収縮期心不全のモデル、筋肉退行性の拡張期心不全のモデル、および拡張期の大動脈バンディング虚血再灌流デバンディング（ＡＩＤ；Aortic banding-Ischemia-reperfusion-Debanding）モデル）におけるＡＡＶ９−ＣＣＮ５の遺伝子治療を介して、疾患のある心臓においてＣＣＮを発現し、心筋線維化を可逆的に処置し、収縮期および拡張期の心臓機能の低下を防ぎ、処置する。さらに、本発明の医薬組成物はまた、心臓の収縮力を増加させることによって血液循環のポンプ機能を担うＳＥＲＣＡ２ａタンパク質を増加させるため、ＨＦｒＥＦに対する直接的な治療効果も予測され得、したがって、これによりＨＦｒＥＦおよびＨＦｐＥＦの症状が共存している場合にも、治療効果が予測され得る。

本発明のある実施態様において、心筋線維化を伴う心疾患は、肥大型心筋症、慢性代謝疾患による心疾患、心臓弁膜症、炎症性心疾患、構造的心疾患、伝染性病原性感染症による心疾患、先天性心疾患、遺伝性異常による心疾患、喫煙、アルコール摂取または有毒薬物（例えば抗がん剤）への曝露による心疾患、および老化による心疾患を含む。

本発明の別の実施態様において、本発明の心筋線維化疾患は、肥大型心筋症；慢性代謝疾患（高血圧、慢性腎疾患、糖尿病、肥満など）による心疾患；心臓弁膜症；炎症性心疾患（サルコイドーシス、自己免疫性心筋炎および心臓移植における拒絶など）；炎症性心疾患（冠動脈機能障害、大動脈弁狭窄症、非虚血性拡張型心筋症など）；伝染性病原性感染症（シャーガス病、ウイルス性心筋炎など）による心疾患；先天性心疾患（チアノーゼ性心疾患、ファロー四徴症、大血管転位症、単心室症など）；遺伝性異常（デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、ファブリー病など）による心疾患；喫煙、アルコール摂取または有毒薬物への曝露による心疾患；および老化による心疾患からなる群から選択される心疾患である。

本発明の医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体を含み得る。本発明の医薬組成物に含まれる薬学的に許容され得る担体は、製剤に通常使用される担体であり、その例は、ラクトース、ブドウ糖、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸、プロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱油などを含むが、本発明はこれらに限定されない。本発明の医薬組成物はさらに、上記成分に加えて、潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香味料、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを含み得る。適切な薬学的に許容され得る担体および製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)に詳述されている。本発明の医薬組成物の注入量は、患者の年齢、性別および症状、体内での有効成分の吸収の程度、不活化速度、ならびに患者が現在服用している薬物と組み合わせて使用される薬剤を考慮して決定されることが望ましく、ＣＣＮ５タンパク質遺伝子をコードするヌクレオチドに基づいて０．０００１ｍｇ／ｋｇ（体重）〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量で注入され得る。

本発明の医薬組成物は、経口的または非経口的のいずれかで投与され得、非経口投与は、静脈注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、経皮注射、組織への直接注射などを含む。

医薬組成物の投与形式は使用方法に依存して様々であり得るが、こう薬、顆粒、粉末、シロップ、溶液、流エキス剤Ｉ、乳濁液、懸濁液、輸液、錠剤、注射液、カプセル剤、および丸薬などとして調製され得る。

本発明の医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体および／または賦形剤を用いて、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者によって容易に実行できる方法に従って処方され得る。本発明の医薬組成物は、単位体積の形式または複数回の体積の容器に注入されることによって調製され得、さらに分散剤または安定剤を含み得る。

本発明の医薬組成物に使用される有効成分は、上記のＣＣＮ５タンパク質またはＣＣＮ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子担体自身、および薬学的に許容され得る塩、水和物または溶媒和物である。

本明細書において、用語「薬学的に許容され得る塩」は、所望の薬理効果を有する（すなわち、線維芽細胞の分化を阻害し、線維芽細胞を選択的に死滅させる能力を有する）本発明の有効成分の塩を指す。これらの塩は、無機酸（塩酸塩、臭化水素酸塩およびヨウ化水素酸塩など）および有機酸（酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、重硫酸塩、スルファミン酸塩、硫酸塩、ナフチル酸塩(naphthylate)、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳(campolate)、樟脳スルホン酸塩(camposulfonate)、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩(glucoheptanoate)、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩(hemisulfate)、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、トシル酸塩、およびウンデカン酸塩など）を用いることによって形成される。本明細書において、用語「薬学的に許容され得る水和物」は、所望の薬理効果を有するＣＣＮ５の水和物を指す。本明細書において、用語「薬学的に許容され得る溶媒和物」は、所望の薬理効果を有する本発明の有効成分の溶媒和物を指す。上記水和物および溶媒和物はまた、上記の酸を用いて調製され得る。

本発明の別の態様において、本発明は、心筋線維化または心筋線維化を伴う心疾患を処置する医薬組成物をスクリーニングする方法を提供し、この方法は：（ａ）テスト物質を、ＣＣＮ５タンパク質またはＣＣＮ５遺伝子を含む細胞に処理する工程；（ｂ）ＣＣＮ５タンパク質またはＣＣＮ５遺伝子の発現を分析する工程を含む。

本発明の方法において、第一に、分析する試料をＣＣＮ５タンパク質またはＣＣＮ５遺伝子を含む細胞と接触させる。本発明のある実施態様において、ＣＣＮ５タンパク質またはＣＣＮ５遺伝子を含む細胞は心臓由来の細胞である。本発明のスクリーニング方法に言及する際に使用される用語「テスト物質」は、それがＣＣＮ５タンパク質遺伝子の発現レベルまたはＣＣＮ５タンパク質の量に影響を与えるか否かを調べるスクリーニングにおいて使用される未知の物質を指す。テスト物質は、限定されないが、化学物質、ヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）および天然物抽出成分を含む。

次いで、ＣＣＮ５遺伝子の発現レベルまたはＣＣＮ５タンパク質の量を、テスト物質で処理した細胞において測定する。測定の結果として、ＣＣＮ５遺伝子の発現レベルまたはＣＣＮ５タンパク質の量を上方制御することが特定された場合、テスト物質を心筋線維化の治療薬；または心筋線維化を伴う心疾患の治療薬と表し得る。

ＣＣＮ５遺伝子の発現レベルにおける変化の測定は、当分野で公知の様々な方法で実行できる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ(Sambrook, et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001))、ノーザンブロット法(Peter B. Kaufman, et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC Press)、ｃＤＮＡマイクロアレイを用いたハイブリダイゼーション反応(Sambrook, et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3^rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001))またはインサイチュ(in situ)のハイブリダイゼーション反応(Sambrook, et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3^rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001))など。

ＲＴ−ＰＣＲプロトコルに基づいて実行する場合、第一に、テスト物質で処理した細胞由来の全ＲＮＡを分離し、次いで第一鎖ｃＤＮＡをオリゴｄＴプライマーおよび逆転写酵素を用いて調製する。その後、ＰＣＲ反応を、第一鎖ｃＤＮＡを鋳型として用いたＣＣＮ５タンパク質遺伝子特異的プライマーセットを用いて実行する。したがって、ＰＣＲ増幅産物を電気泳動し、形成したバンドを分析し、ＣＣＮ５タンパク質遺伝子の発現レベルにおける変化を測定する。

本発明の別の態様において、本発明は、対象に医薬組成物を投与することによって、心筋線維化または心筋線維化を伴う心疾患を処置する方法を提供し、この医薬組成物は（ａ）ＣＣＮ５タンパク質；または（ｂ）ＣＣＮ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子担体を有効成分として含む。

本発明の処置方法は上述の本発明の医薬組成物を使用する方法であり、上述の本発明の医薬組成物に関して共通する内容について、その記述は過剰な複雑さを回避するために省略されている。

本発明の特徴および利点を以下に要約する：
（Ａ）本発明は、心筋線維化または心筋線維化を伴う心疾患を処置する医薬組成物を提供する。
（Ｂ）本発明の医薬組成物は、心筋線維化における筋線維芽細胞を選択的に死滅させることによって線維性基質を溶解する効果、および線維性基質を正常な組織へ回復させる効果を有するため、不可逆的な疾患進行とみなされ、現在まで治療薬が開発されていない心筋線維化および心筋線維化を伴う心疾患を処置する医薬組成物として効果的に使用され得る。

図１は、抗ＣＣＮ５および抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いて、（Ａ）ヒトおよび（Ｂ）マウス由来の心不全の心臓組織におけるＣＣＮ５タンパク質の発現レベルの変化を決定した結果である（＊＊Ｐ＜０．０１）。

図２は、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を実験用ラットの尾静脈に注射した４週間後の心臓組織におけるＣＣＮ５タンパク質の発現量を示す（ｎ＝６、＊Ｐ＜０．０５）。

図３Ａは、圧負荷モデルの実験用ラットにおける既存の心筋線維化に対する、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５の可逆的な治療効果および心臓機能保護効果を示す。図３Ａは、可逆的な治療効果を決定するための圧負荷モデルの誘導およびＡＡＶ−ＣＣＮ５遺伝子治療の注射における実験計画を示す。 図３Ｂは、圧負荷モデルの実験用ラットにおける既存の心筋線維化に対する、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５の可逆的な治療効果および心臓機能保護効果を示す。図３Ｂの上部は、マッソン−トリクローム染色法を用いた心臓組織の線維化の程度を示す。その上部は間質性線維化であり、下部は血管周囲組織の線維化であり、各組織における線維化の割合を点で示す。 図３Ｃは、圧負荷モデルの実験用ラットにおける既存の心筋線維化に対する、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５の可逆的な治療効果および心臓機能保護効果を示す。図３Ｃは、蛍光染色法を用いて、抗α−ＳＭＡ（筋線維芽細胞標的タンパク質）抗体で心臓組織の断面を染色した結果である。左に表示されている画像は間質組織を示し、右に表示されている画像は血管周囲組織を示す。下部は、α−ＳＭＡ発現細胞の程度を示すグラフである。 図３Ｄは、圧負荷モデルの実験用ラットにおける既存の心筋線維化に対する、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５の可逆的な治療効果および心臓機能保護効果を示す。図３Ｄは、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による測定の結果である（ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。 図３Ｅは、圧負荷モデルの実験用ラットにおける既存の心筋線維化に対する、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５の可逆的な治療効果および心臓機能保護効果を示す。図３Ｅは、心臓の短縮率（ＦＳ）および収縮期の左室内径（ＬＶＩＤｓ）ならびに拡張期の左室内径（ＬＶＩＤｄ）を測定した（ｎ＝１６、＊Ｐ＜０．０５）。

図４Ａは、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５およびＣＣＮ５タンパク質がインビボ(in vivo)において、細胞レベルで筋線維芽細胞のアポトーシスを誘導することを示す。図４Ａは圧負荷ラットモデルの実験計画を示す。 図４Ｂは、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５およびＣＣＮ５タンパク質がインビボ(in vivo)において、細胞レベルで筋線維芽細胞のアポトーシスを誘導することを示す。図４Ｂは、心臓組織切片を、ＴＵＮＥＬ染色（赤）および筋線維芽細胞に特異的なタンパク質である抗α−ＳＭＡ抗体（緑）で同時染色した結果を示す。 図４Ｃは、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５およびＣＣＮ５タンパク質がインビボ(in vivo)において、細胞レベルで筋線維芽細胞のアポトーシスを誘導することを示す。図４Ｃは、図４Ｂの各実験群における筋線維芽細胞（ｎ＝３、＊＊Ｐ＜０．０１）のアポトーシスの程度を定量的に示す。

図４Ｄは、心筋細胞（Ｍｙｏ）、線維芽細胞（ＦＢ）および筋線維芽細胞（ＭｙｏＦＢ）を対照の細胞培地およびＣＣＮ５タンパク質を含む細胞培地中で４８時間培養した後の実験結果を示す。図４ＤはＤＡＰＩで染色した結果であり、ここで矢印は濃縮した核を示し、右図は濃縮した核の数をグラフに示す。 図４Ｅは、心筋細胞（Ｍｙｏ）、線維芽細胞（ＦＢ）および筋線維芽細胞（ＭｙｏＦＢ）を対照の細胞培地およびＣＣＮ５タンパク質を含む細胞培地中で４８時間培養した後の実験結果を示す。図４Ｅは、同一の条件下で培養した細胞をＴＵＮＥＬ染色で染色した結果であり、矢印はＴＵＮＥＬを示す核を示し、右図はＴＵＮＥＬ蛍光を示す核の数をグラフに示したものである（ｎ＝３、＊＊Ｐ＜０．０１）。 図４Ｆは、心筋細胞（Ｍｙｏ）、線維芽細胞（ＦＢ）および筋線維芽細胞（ＭｙｏＦＢ）を対照の細胞培地およびＣＣＮ５タンパク質を含む細胞培地中で４８時間培養した後の実験結果を示す。図４Ｆは、線維芽細胞および筋線維芽細胞を、対照培地（ＣＭ−Ｃｏｎ）およびＣＣＮ５タンパク質を含む培地（ＣＭ−ＣＣＮ５）中で４８時間培養した後の蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）による分析の結果を示す（ｎ＝３、＊＊Ｐ＜０．０１）。

図５Ａは、ＣＣＮ５タンパク質による筋線維芽細胞の選択的なアポトーシスの機構を示す（ｎ＝３、＊＊Ｐ＜０．０１）。図５Ａは、線維芽細胞および筋線維芽細胞を対照培地（ＣＭ−Ｃｏｎ）またはＣＣＮ５タンパク質を含む培地中に配置し、１日または２日間培養し、次いでタンパク質を細胞から分離し、ウエスタンブロット法を行った結果である。 図５Ｂは、ＣＣＮ５タンパク質による筋線維芽細胞の選択的なアポトーシスの機構を示す（ｎ＝３、＊＊Ｐ＜０．０１）。図５Ｂは、上記細胞において、抗シトクロムＣ抗体を用いて免疫化学的方法を行った結果である。 図５Ｃは、ＣＣＮ５タンパク質による筋線維芽細胞の選択的なアポトーシスの機構を示す（ｎ＝３、＊＊Ｐ＜０．０１）。図５Ｃは、上記細胞における、ＮＦ−κＢ、ビメンチンおよび抗α−ＳＭＡ抗体を用いたウエスタンブロット法の結果である。 図５Ｄは、ＣＣＮ５タンパク質による筋線維芽細胞の選択的なアポトーシスの機構を示す（ｎ＝３、＊＊Ｐ＜０．０１）。図５Ｄは、線維芽細胞および筋線維芽細胞における、抗ＮＦ−κＢ抗体を用いたＮＦ−κＢレポーター分析の結果である。 図５Ｅは、ＣＣＮ５タンパク質による筋線維芽細胞の選択的なアポトーシスの機構を示す（ｎ＝３、＊＊Ｐ＜０．０１）。図５Ｅは、線維芽細胞および筋線維芽細胞における、抗ＮＦ−κＢ抗体を用いた蛍光染色法の結果である。

図６は、（Ａ）ＣＣＮ５タンパク質を過剰発現する細胞の調製および（Ｂ）条件液体培地への分泌およびその活性を示す。

図７は、ラットの心臓組織由来の心筋細胞および筋線維芽細胞をＴＧＦ−βで処理した後の、筋線維芽細胞の分化誘導およびＣＣＮ５タンパク質の分化に対する効果を示す。

図８Ａは、対照群および圧負荷モデルラットにおける、ＴＧＦ−βシグナル伝達に対するＡＡＶ９−ＣＣＮ５の効果を示す（ｎ＝３、＊＊Ｐ＜０．０１）。 図８Ｂは、対照群および圧負荷モデルラットにおける、ＴＧＦ−βシグナル伝達に対するＡＡＶ９−ＣＣＮ５の効果を示す（ｎ＝３、＊＊Ｐ＜０．０１）。

図９Ａは、インビボにおいて細胞レベルで、血管内皮細胞をＴＧＦ−βの活性によって線維芽細胞に分化形質転換（内皮間葉転換、ＥｎｄｏＭＴ）させ、筋線維芽細胞に進行させた結果に対するＡＡＶ９−ＣＣＮ５およびＣＣＮ５タンパク質の効果を示す。図９Ａは、Ｓｃｌ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ；Ｒ２６ＲｓｔｏｐＹＦＰダブルトランスジェニックマウスモデルのＡＡＶ−ＣＣＮ５遺伝子注入および消化管手術／大動脈交差狭窄(cross-stenosis)手術の実験計画を示す。 図９Ｂは、インビボにおいて細胞レベルで、血管内皮細胞をＴＧＦ−βの活性によって線維芽細胞に分化形質転換（内皮間葉転換、ＥｎｄｏＭＴ）させ、筋線維芽細胞に進行させた結果に対するＡＡＶ９−ＣＣＮ５およびＣＣＮ５タンパク質の効果を示す。図９Ｂは、手術の８週間後に試料採取したマウスモデルの心臓組織の免疫化学的方法の結果である（ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。 図９Ｃは、インビボにおいて細胞レベルで、血管内皮細胞をＴＧＦ−βの活性によって線維芽細胞に分化形質転換（内皮間葉転換、ＥｎｄｏＭＴ）させ、筋線維芽細胞に進行させた結果に対するＡＡＶ９−ＣＣＮ５およびＣＣＮ５タンパク質の効果を示す。図９Ｃは、手術の８週間後に試料採取したマウスモデルの心臓組織の免疫化学的方法の結果である（ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。 図９Ｄは、ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）においてＴＧＦ−βで処置し、対照培地およびＣＣＮ５タンパク質を含む培地で４８時間培養し、次いで免疫化学を行い、抗ＶＥ−カドヘリンおよび抗ビメンチン抗体で染色した結果である。 図９Ｅは、培養したヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）の同一の面積を引っ掻き、それらを図９Ｄと同じ培地条件で培養し、細胞を固定し、ＤＡＰＩで染色し、細胞の移動度を測定した結果を示す（ｎ＝４、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。 図９Ｆは、ｑＲＴ−ＰＣＲによる、α−ＳＭＡ、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、Ｔｉｅ２およびＣＤ３１のｍＲＮＡ発現レベルの測定結果である（ｎ＝６、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。

図１０Ａは、インビボにおける細胞レベルでの、ＴＧＦ−βの活性による線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化転換に対するＡＡＶ９−ＣＣＮ５およびＣＣＮ５タンパク質の効果を示す。図１０Ａは、８週齢のマウスモデルのＡＡＶ−ＣＣＮ５遺伝子注入および消化管手術／大動脈交差狭窄手術の実験計画を示す。 図１０Ｂは、インビボにおける細胞レベルでの、ＴＧＦ−βの活性による線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化転換に対するＡＡＶ９−ＣＣＮ５およびＣＣＮ５タンパク質の効果を示す。図１０Ｂは、手術の８週間後にマウスモデルの心臓組織を試料採取し、免疫化学を行った結果である。 図１０Ｃは、インビボにおける細胞レベルでの、ＴＧＦ−βの活性による線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化転換に対するＡＡＶ９−ＣＣＮ５およびＣＣＮ５タンパク質の効果を示す。図１０Ｃは、ビメンチン発現細胞において同時にα−ＳＭＡを発現する細胞を示すグラフである（ｎ＝３、Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。 図１０Ｄは、インビボにおける細胞レベルでの、ＴＧＦ−βの活性による線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化転換に対するＡＡＶ９−ＣＣＮ５およびＣＣＮ５タンパク質の効果を示す。図１０Ｄは、線維芽細胞をＴＧＦ−βで処理し、ＣＣＮ５タンパク質を含む培地中で４８時間培養し、ＤＡＰＩおよび免疫化学的方法を行うことによって抗α−ＳＭＡ抗体で染色した結果である。 図１０Ｅは、インビボにおける細胞レベルでの、ＴＧＦ−βの活性による線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化転換に対するＡＡＶ９−ＣＣＮ５およびＣＣＮ５タンパク質の効果を示す。図１０Ｅは、コラーゲンゲル収縮法を用いて、ＣＣＮ５がＴＧＦ−βによる線維芽細胞の分化を阻害することを確認した結果である（ｎ＝３、Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。 図１０Ｆは、インビボにおける細胞レベルでの、ＴＧＦ−βの活性による線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化転換に対するＡＡＶ９−ＣＣＮ５およびＣＣＮ５タンパク質の効果を示す。図１０Ｆは、定量ｑＲＴ−ＰＣＲによって、α−ＳＭＡおよびＩ型コラーゲンのｍＲＮＡ発現レベルの程度を測定した結果である（ｎ＝６、Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。

図１１Ａは、退行性筋ジストロフィー(muscle regression dystrophy)（デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ＤＭＤ）モデルマウスにおける、心筋線維化に対するＡＡＶ９−ＣＣＮ５の可逆的な治療効果および心臓機能の保護を示す。図１１Ａは、可逆的な治療効果を確認するための、老化退行性筋ジストロフィーモデルマウスの誘導およびＡＡＶ９−ＣＣＮ５遺伝子治療の注射の実験計画を示す。 図１１Ｂは、退行性筋ジストロフィー（デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ＤＭＤ）モデルマウスにおける、心筋線維化に対するＡＡＶ９−ＣＣＮ５の可逆的な治療効果および心臓機能の保護を示す。図１１Ｂおよび図１１Cは、マッソン−トリクローム染色法を用いて確認した、心臓組織の線維化の程度を示す。各実験群における線維化の範囲は、棒グラフの割合として表現された（ｎ＝３〜４、ｐ＜０．００１）。

図１２は、退行性筋ジストロフィー（ＤＭＤ）モデルマウスにおいて、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５が心臓機能を改善する測定結果を示す。図１２Ａは、室内径短縮率（ｎ＝３〜７、Ｐ＜０．００５）の測定結果を示す。図１２Ｂは、収縮末期圧−容積関係（ＥＳＰＶＲ）の平均値を用いた、心臓の血行動態機能の測定結果を示す（Ｎ＝６〜７、Ｐ＜０．０５）。

図１３は、退行性筋ジストロフィー（ＤＭＤ）モデルマウスにおいて、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５による線維化関連タンパク質の発現量の変化を、ウエスタンブロット法で確認した結果である。

図１４は、退行性筋ジストロフィー（ＤＭＤ）モデルマウスにおいて、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５による線維化関連遺伝子の発現量の変化を、ｑＲＴ−ＰＣＲ法で確認した結果である。

図１５Ａは、大動脈バンディング虚血再灌流デバンディング（ＡＩＤ）心不全ラットモデルにおける既存の心筋線維化および心収縮性の可逆的な処置に対するＡＡＶ９−ＣＣＮ５の効果を示す。図１５Ａは、可逆的な治療効果を確認するための、ＡＩＤラットモデルの誘導およびＡＡＶ−ＣＣＮ５遺伝子治療の注射の実験計画を示す。 図１５Ｂは、大動脈バンディング虚血再灌流デバンディング（ＡＩＤ）心不全ラットモデルにおける既存の心筋線維化および心収縮性の可逆的な処置に対するＡＡＶ９−ＣＣＮ５の効果を示す。図１５Ｂの上部は、マッソン−トリクローム染色法を用いた、間質細胞の心筋線維化の程度を示す。下部は、血管の末梢領域における心筋線維化の程度を示す（ｎ＝５〜８、ｐ＜０．０５）。 図１５Ｃは、大動脈バンディング虚血再灌流デバンディング（ＡＩＤ）心不全ラットモデルにおける既存の心筋線維化および心収縮性の可逆的な処置に対するＡＡＶ９−ＣＣＮ５の効果を示す。図１５Ｃは、心臓の切片において心筋線維化が生じている相対的な面積を示す（ｎ＝５〜８、ｐ＜０．０５）。

図１６は、ＡＩＤラットモデルにおいてＡＡＶ９−ＣＣＮ５の心臓機能を改善する測定結果を示す。図１６Ａは、心臓の超音波分析を介して得られた心室の短縮率を示す（ｎ＝５〜８、＊＊Ｐ＜０．０１）。図１６Ｂは、圧−容積ループ解析結果を用いた、ＡＩＤラットモデルの心臓機能に対するＡＡＶ９−ＣＣＮ５の効果を示す。図１６Ｃは、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５の血行動態解析の代表的な結果である、収縮末期圧−容積関係（ＥＳＰＶＲ）および拡張末期圧−容積関係（ＥＤＰＶＲ）の値を示す（Ｎ＝６、ｐ＜０．０５、ＢおよびＣ）。これは、血行動態、圧−容積ループ解析の結果による、ＡＩＤラットモデルの心臓機能に対するＡＡＶ９−ＣＣＮ５の効果を示す。ＥＳＰＶＲの値は心臓の収縮機能を示し、拡張末期圧−容積関係（ＥＤＰＶＲ）の値は心臓の拡張機能を示す。

以下に、本発明を実施例によって詳細に説明する。以下の実施例は、本発明をさらに説明することが意図され、本発明の範囲を限定せず、本発明の範囲が実施例に限定されないことは当業者には明らかである。

全ての動物実験は、光州科学技術院(ＧＩＳＴ；Gwangju Institute of Science and Technology)およびマウントサイナイ医科大学(School of Medicine at Mount Sinai)の動物実験委員会(Animal Protection and Use Committee)の認可および規則に基づいて行った。実験の解析は、動物の保護および使用におけるＮＩＨの指針に従った。

実験方法
大動脈縮窄術（ＴＡＣ）による圧負荷の動物モデル（心不全モデル）の作成
ジャクソン研究所からの８週齢〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６雄性マウス（体重２５〜３０ｇ）を本研究に用いた。マウスを、９５ｍｇ／ｋｇケタミンおよび５ｍｇ／ｋｇキシラジンで構成された溶液を用いて腹腔内注射によって麻酔した。マウスを、酸素呼吸器を用いて０．２の１日の呼吸率および毎分１１呼吸の呼吸速度で呼吸させた。大動脈弓を観察するため、近位胸骨周囲の領域を縦方向に２〜３ｍｍ切開した。２７ゲージ針を無名動脈と左総頸動脈との間に配置し、大動脈弓を横方向に接続した。針をすぐに除去し、切開部位を覆った。

遺伝子的にＤＭＤの動物における心不全モデル
Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ（Ｄｍｄ^ｍｄｘ／Ｕｔｒｎ^{ｔｍ１Ｊｒｓ}）をジャクソン研究所(Bar Harbor, ME)から購入した。９月齢以上の雄性ＭＤＸ／ＵＴＲＮ（＋／−）マウスを実験に用い、退行性筋ジストロフィーの心疾患を確実に誘導した。この雄性マウスは、ヒトＸ染色体に関連する先天性遺伝障害であるデュシェンヌ型筋ジストロフィーとの臨床的関連性が示されているモデルである。

圧負荷および虚血再灌流の複合心不全モデル（ＡＩＤモデル）の作成
ラットにおいて圧負荷および虚血再灌流を同時に行った、複合心不全モデルを使用した。体重１８０〜２００グラムのSprague-Dawleyラットを用いた。第二肋間を開胸術で開き、上行大動脈を外径が０．９６５ｍｍであるＰＥ−５０チューブなどの４−０積層部分(4-0 laminated portion)で包み、ＰＥ−５０チューブを引き抜いた。この手法を用いて、心臓に圧負荷を加えた。２月後、左冠動脈前下行枝を３０分間結び、再灌流した。詳細には、血管を左心の末端より４ｍｍ下の点まで６−０縫合で完全に結び、３０分後に解放した。さらに１月後、上行大動脈を結んだ縫合を完全に解放した。この複合心不全モデルは、大動脈バンディング虚血再灌流デバンディング（ＡＩＤ）と呼ばれ、４月かけて作成される。

心臓機能の分析−経胸壁心エコー法とインビボでの血液動態
実験動物であるモデルマウスを、１００μｇ／ｇの濃度のケタミンの腹腔内注射を介して麻酔した。二次元画像およびＭモードの記録のために、１５．０ＭＨｚのコンバーター(GE Vivid 7 Vision)を用いて、心室内径収縮率および程度を決定し、左心室乳頭筋の収縮を報告した。ラットを、気管切開術でチューブを挿入した後、イソフルランで麻酔した。心臓を、７つのソノマイクロメーター結晶(Sonometrics, London, Ontario, Canada)を用いて、胸部切開によって左室心外膜における結び目に連結した。Ｍｉｌｌａｒ ＳＰ−６７１圧力コンバーターを、左心室の前壁を介して挿入した。データを市販のソフトウェアＳｏｎｏＬａｂを用いて収集し、血行動態測定を、下大動脈および大動脈の一時的な閉鎖の後の前負荷の圧力および後負荷の圧力の範囲で行った。心臓機能のデータを、ＭＡＴＬＡＢ(v 7.0, The MathWorks, Natick, MA)で作成した一連のアルゴリズムを用いて分析した。心エコー実験を実験期間全体を通して同一の実験者で進行させ、実験の正確性を向上させた。５５０ｂｐｍの最小心拍数が実験の正確性を改善するために必要であったが、最小化された心臓機能の徐脈に関連する過小評価を伴う構造的および機能的評価を含むように実験を行った。各マウスについて測定を３回行い、平均値を計算し、数値として表現した。インビボでの血行動態分析を、１．２Ｆｒ圧−容積（ＰＶ）コンダクタンスカテーテル(Scisense, Ontario, Canada)を用いて行った。マウスを、ウレタン（１ｍｇ／ｇ）、エトミデート（１０μｇ／ｇ）およびモルヒネ（１μｇ／ｇ）の複合溶液を用いて腹腔内注射によって麻酔し、気管支切開を介してチューブを挿入することによって、人工呼吸器を用いて毎分１２５の呼吸および７μｌ／ｇの呼吸率に設定した。ＰＶカテーテルを頭頂の手法(vertex approach)で左心室内部に配置し、ＰＶデータをＩＯＸ２ソフトウェア(EMKA technologies)を用いて分析した。心臓負荷を、生理食塩水中のドブタミンを１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌの増加させた濃度で注射することによって（具体的には、血行動態のパラメータを正規化するために、右頸静脈に挿入された中心静脈カテーテルを介して１０分の時間間隔で）測定した。

アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）の作成および注射
自己相補的なＡＡＶ（血清型９）を作成するために、ヒトＣＣＮ５遺伝子をｐｄｓ−ＡＡＶ２−ＥＧＦＰベクター中にクローン化した。ウイルスパッケージングの阻害を防ぐため、ｅＧＦＰ配列をＡＡＶベクター作成のために調製した。組換えＡＡＶを２９３Ｔ細胞を用いて作成した。細胞培養溶液中のＡＡＶ粒子を回収し、硫酸アンモニウムで沈殿させ、その後、イオジキサノール勾配を用いて超遠心分離法を介して精製した。ＡＡＶ粒子を、多数の希釈を介して濃縮し、イオジキサノールを乳酸リンゲル液で置換した。ＡＡＶの濃度を、定量ＲＴ−ＰＣＲおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて定量化した。ＡＡＶ−ＶＬＰおよびＡＡＶ−ＣＣＮ５を、５×１０^１０〜１×１０^１１個のウイルスゲノムでモデルマウスおよびモデルラットの尾静脈に注射した。

組換え活性ＣＣＮ５の発現
ＣＣＮ５タンパク質を生成するために、ｐｃＤＮＡ３．１−ＣＣＮ５ＨＡプラスミドを用いた。ＨＥＫ２９３細胞を６０ｍｍペトリ皿に５×１０^５個播種し、細胞を１日間安定化させた。その後、ｐｃＤＮＡ３．１−ＣＣＮ５ＨＡをリポフェクチンを用いて感染させた。４時間後、リポフェクチンを除去するため、血漿を除去した条件培地（ＣＭ）で置換した。次いで、２４時間の培養後に得られた、分泌されたＣＣＮ５をＣＭ−ＣＣＮ５と名付け、これを実験に用いた。ＣＣＮ５タンパク質の発現をウエスタンブロット法で確認し、ＣＣＮ５で標識された抗ＨＡ抗体を用いて確認した。

常在性線維芽細胞の分離
８週齢の雄性マウス(Damul Science)に、イソフルランを用いた吸入麻酔(respiratory anesthesia)を行い、心臓を取り出した。大動脈カニューレを大動脈に挿入した後、ラットをすぐにランゲルドルフ装置に取り付け、心臓に付着した不要な組織を除去した。一定速度の灌流、生理液（Ｔｙｒｏｉｄ緩衝液；組成：１２５ｍＭ／Ｌ ＮａＣｌ、５ｍＭ／Ｌ ＫＣｌ、１２．５ｍＭ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、１１ｍＭ／Ｌグルコース、１０ｍＭ／Ｌ ＢＤＭ、５タウリン、２．４ ＭｇＣｌ_２）を用いた。生理液を用いて、血液を十分に除去した後、３７℃で１００％に飽和した酵素溶液（３００μｇ／ｍＬ ＩＩ型コラーゲン分解酵素、８０μｇ／ｍＬヒアルロン酸）を、５０分間灌流し、心臓組織を分解した。この過程を通して心臓組織が分解した後、ピペッティングを数回行い、次いで完全に分解していない組織および単細胞を７０μｍの細胞フィルターを介して分離した。心筋細胞と、心臓を構成する他の細胞（線維芽細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞）との最大の違いは細胞のサイズである。この特徴を利用して、濾過した細胞溶液を２５ｇで３分間遠心し、心筋細胞を分離した。上清を取り出し、２５０ｇで１０分間遠心し、線維芽細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞を分離した。したがって、得られた細胞をＤＭＥＭを含む培養培地（低グルコース／１０％ＦＢＳ／１％抗生物質）中に混合し、培養皿に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター中で、４時間インキュベートした。線維芽細胞は、短時間で培養皿に接着するという安定化の特徴を有し、この特徴は他の細胞とは異なる。したがって、培地を４時間後に置換し、培養皿に接着することによって安定化した細胞である線維芽細胞以外の他の細胞を除去した。翌日に培地を交換した後、線維芽細胞を、２日置きに培地を交換しながら培養した(Skrzypiec-Spring, et al. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 55: 113-126 (2007))。

線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化誘導
ラットの心臓から単離した常在性線維芽細胞を、１０ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ−β(Peprotech)で処理し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター中で、２日間培養した。筋線維芽細胞への分化を確認するため、マーカータンパク質であるα−ＳＭＡを免疫化学を用いて確認した(Kovacic J.C., et al. Circulation, Apr 10; 125(14):1795-1808 (2012))。

ＣＣＮ５の線維芽細胞、内皮細胞の筋線維芽細胞の間葉細胞への分化転換の免疫蛍光染色
線維芽細胞および内皮細胞（ヒト冠動脈内皮細胞、ＨＣＡＥＣ）を１６ｍｍカバーガラス上に播種し、安定化のために一晩培養し、次いで１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βおよびＣＣＮ５で処理し、４８時間培養した。４％パラホルムアルデヒド溶液での固定化後、細胞膜の透過処理を０．５％トリトンＸ−１００溶液を用いて行い、次いで５％ＢＳＡ溶液でブロックした。抗ＶＥ−カドヘリン(Cell Signaling Technology)、抗ビメンチン(Santa Cruz)、または抗α−ＳＭＡ(Sigma)抗体を反応のために使用し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４(Invitrogen)を二次抗体として用いた。核をＤＡＰＩを用いて染色した。免疫化学を行った細胞を、蛍光顕微鏡(Olympus)を用いて分析した(Okayama K., et al. Hypertension 59:958-965 (2012))。

コラーゲンゲル格子の分析
コラーゲンゲル収縮アッセイにおいて、１×１０^６細胞／ｍＬの線維芽細胞および１．２ｍｇ／ｍＬコラーゲン溶液(Invitrogen)を混合し、１Ｎ ＮａＯＨ（約２０μＬ）を添加してコラーゲン溶液のｐＨを中和した。ピペッティングによって単純に混合した後、５００ｍＬの各コラーゲンゲル懸濁液を、２４ウェルプレートに配置し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター中で、３０分間重合した。コラーゲンゲルを形成した後、対照群およびＴＧＦ−β単独での処理群またはＣＣＮ５を伴うＴＧＦ−βでの処理群を、それぞれＤＭＥＭ培地で培養した。４８時間後、コラーゲンゲル収縮の程度を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて観察および分析した(Dobaczewski M., et al. Circ. Res. 107: 418-428 (2010))。

血管内皮細胞の間葉細胞への分化誘導（内皮間葉転換；ＥｎｄＭＴ）
ＥｎｄＭＴを、ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）を用いて誘導した。ＨＣＡＥＣをLonzaを介して購入し、ＥＧＭ−２(Lonza)培養溶液を用いて、５％ＣＯ_２インキュベーター中で培養した。ヒト由来細胞であるＨＣＡＥＣは、購入時に継代培養数３の細胞であり、継代培養数５〜７の細胞を実験に用いた。ＨＣＡＥＣを用いてＥｎｄＭＴを誘導するために、培養中、培養溶液の交換中などの細胞密度を介して、細胞の状態をよく維持することが重要である。培養皿上にＨＣＡＥＣを播種した後、約１２時間安定化し、１０ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ−βで処理し、３日間培養した。ＥｎｄＭＴを誘導している間、培養溶液は交換せず、３日後に免疫細胞化学および定量ＰＣＲを行い、ＨＣＡＥＣの間葉細胞への分化転換が起こったか否かを確認した。Ｔｉｅ２およびＶＥ−カドヘリン（ＣＤ３１）をＨＣＡＥＣのマーカー遺伝子として用い、ビメンチン、α−ＳＭＡ、Ｉ型Ｃコラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲンおよびＦＳＰ−１を間葉細胞のマーカー遺伝子として用いた(Medici D., et al. Biochem. J 437:515-520 (2012))および(Zeisberg E.M., et al. Nat Med. 13: 952-961 (2007))。

試験管の細胞遊走分析
スクラッチ分析を行い、細胞遊走能を測定した。ＨＣＡＥＣを１２ウェルプレートに配置し、細胞を一晩安定化させた。翌日、培養培地を交換し、２００μＬのチップを用いて、細胞上にスクラッチを作った。スクラッチされた細胞を生理食塩水で洗浄し、次いで１０ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ−βで処理されたＣＭ−ＣｏｎまたはＣＭ−ＣＣＮ５と共に培養した。４８時間後、細胞をＤＡＰＩで染色し、蛍光顕微鏡で分析した。細胞の移動距離を、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア(Widyantoro B, et al. Circulation 121:2407-2418(2010))を用いて解析した。

ＮＦ−Ｂレポーター遺伝子分析
ラットの線維芽細胞および筋線維芽細胞を、６ウェルプレート中に３×１０^５細胞／ウェルで配置し、リポフェクタミン２０００(Invitrogen)を用いて、ＮＦ−Ｂレポータープラスミド（ｐＢＩＩｘ）、ｐＲｅｎｉｌｌａおよび他のプラスミド（空のｐｃＤＮＡ３ベクターおよびｐｃＤＮＡ−ｈＣＣＮ５）を遺伝子導入した。４８時間後、細胞を受動溶解緩衝液(passive lysis buffer)で溶解し、１４，０００ｒｐｍ、４℃で遠心し、細胞片を除去した。ルシフェラーゼ活性を、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム(Promega)を用いて測定した。

アポトーシスのＴＵＮＥＬ分析
培養した心筋細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞をカバーガラス上に広げ、DeadEnd Fluorometric TUNELキット(Promega)を用いて染色した。末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を用いて、ＤＮＡの分節化がアポトーシスによって生じたことが確認された。ＴＵＮＥＬ蛍光を確認するため、Fluoview FV 1000球状集束顕微鏡(spherical focus microscope)を用いた(Oberhaus S.M. Methods Mol Biol.218:85-96(2003))。

免疫組織化学
マウスの心臓組織を、ＯＣＴコンパウンド(Tissue-Tek)を用いて凍結保存し、厚さ６μｍの切片を作成した。組織の固定化後、アセトン−メタノールを用いて−２０℃で２０分間反応させ、透過性膜とすることを可能にした。組織を、ＰＢＳを用いて再水和し、５％ＢＳＡ溶液で１時間ブロックした。その後、反応を、抗α−ＳＭＡ、抗ＧＦＰ、および抗ビメンチン抗体を用いて、４℃で１２時間行った。一次抗体と反応させた組織を生理食塩水で洗浄し、蛍光性Ａｌｅｘａ５４６またはＡｌｅｘａ４８８を連結した二次抗体と、室温で１時間反応させた。蛍光免疫化学で調べた心臓組織について、結果をFluoview FV 1000共焦点顕微鏡を用いて確認した。

病理組織学的染色（マッソン−トリクローム染色）
モデル動物から心筋を得た後、適切な切削温度で包埋溶液（Fisher Healthcare (Pittsburgh, PA)から購入）に即座に浸し、次いで新鮮なまま冷凍し、厚さ８μｍの切片を作成した。線維化の程度を決定するため、薄片となった試料を、マッソン−トリクローム(Abcam)染色後、光学顕微鏡を用いて観察した。

フローサイトメトリー
別々の線維芽細胞の層を、０．２％ウシ胎児血漿（ＦＢＳ）を含む生理食塩水で洗浄し、２．５％ホルムアルデヒド溶液で固定した。細胞膜を０．５％トリトンＸ−１００溶液で透過処理した後、反応を、ＦＩＴＣを連結した抗α−ＳＭＡ抗体(Abcam)を用いて行った。培養した線維芽細胞および筋線維芽細胞を、０．２％ＦＢＳ溶液で洗浄し、ＰＥを連結した抗アネキシン抗体(eBioscience)を用いて反応させた。染色した細胞を、Guava easyCye HT (Millipore)を用いて分析した(Saada J.I., et al. J. Immunol. 177:5968-79(2006))。

ウエスタンブロット分析
細胞および組織の均一溶液について、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いてサイズによって分離し、ＰＶＤＦ膜(Millipore)に移行した。タンパク質発現の確認を、基本的な実験プロトコル(Kawaki, et al., 2011)に従って行った。調製した膜を、抗ＣＣＮ２、抗ＣＣＮ５(Lifespan Biosciences)、抗ＳＥＲＣＡ２ａ(21st Century Biochemicals)、抗Ｓｍａｄ４、抗ｐ−Ｓｍａｄ２、抗Ｓｍａｄ２／３(Cell signaling)、抗Ｓｍａｄ７(Lifespan Biosciences)、抗ＬＯＸ(Abcam)、抗α−アクチニン、抗α−ＳＭＡ(Sigma)、抗ビメンチン、抗Ｂｃｌ−２(Santa Cruz)、および抗カスパーゼ抗体キット(Cell signaling)と共にインキュベートした。

定量ＲＴ−ＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲを、QuantiTect SYRB GreenリアルタイムＰＣＲキット(Qiagen Ltd.)を用いて行い、転写レベルをこのキットで分析した。トリゾール(gibco BRL)を用いて、心臓組織からＲＮＡを分離し、ｃＤＮＡ中に合成した。種々の定量リアルタイムＰＣＲ条件は、３７サイクル：９４℃で１０分間、５７℃で１５分間および７２℃で５分間であった。本実験で用いたプライマーの情報を、以下の表１に示す。

統計処理
データを、平均値±ＳＤの値で表す。群の平均値を、スチューデントのt検定またはボンフェローニの事後検定と共に、ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ(Statview, V5.0, SAS)を用いて比較した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。

実験結果
Ａ．大動脈縮窄術（ＴＡＣ）による圧負荷動物モデル
心不全の心臓組織におけるＣＣＮ５タンパク質発現の減少
心臓移植手術中に提供された心不全患者の心臓組織から得たタンパク質を、正常な人間の心臓組織（表１）とウエスタンブロット法によって比較した結果、心不全患者のＣＣＮ５タンパク質の発現レベルは、約２４％減少していた（図１Ａ）。圧負荷によって誘導した心不全のマウスモデルにおけるＣＣＮ５の発現量は、約９０％減少していた（図１Ｂ）。本実験の結果、心不全状態の心臓組織におけるＣＣＮ５の発現量の減少はヒトおよびマウスにおいて同様に示され、これはヒトとマウスとの間の臨床相関を示す。１５μｇのＣＣＮ５タンパク質抽出物を電気泳動に用い、抗ＣＣＮ５および抗ＧＡＰＤＨ抗体で確認した。（＊＊Ｐ＜０．０１）

ＣＣＮ５遺伝子導入による心筋線維化の可逆的回復
作成したＡＡＶ９−ＣＣＮ５および対照のウイルスベクターＡＡＶ９−ＶＬＰをマウスの尾静脈に２種類の濃度のＡＡＶ−ＣＣＮ５で注射し、４週間後に、有効な濃度をウエスタンブロット法で決定した。注射したＡＡＶ−ＣＣＮが心臓に特異的に発現したことを確認することによって、心筋線維化の病理活性と筋線維芽細胞との関係を調べた（ｎ＝６、エラーバー＝Ｓ．Ｄ．、＊Ｐ＜０．０５、図２）。ＴＡＣで誘導された圧負荷心疾患モデルにおいて、心筋線維化がＴＡＣ手術の８週間後に生じたことを確認した。ＡＡＶ−ＣＣＮ５および対照群であるＡＡＶ−ＶＬＰを、心筋線維化を誘導した実験ラットの尾静脈を介して、ウイルスゲノムの濃度を５×１０^１０として、それぞれ注射した（ｎ＝１６、図３Ａ）。ＣＣＮ５遺伝子導入の８週間後よりも後に、心臓組織を試料採取し、組織線維化の程度をマッソン−トリクローム染色を介して定量化し、心筋線維化の治療効果を確認した。さらに、各実験群の心臓を分離し、線維芽細胞をランゲンドルフ等速灌流システムを用いて分離し、α−ＳＭＡを発現している細胞の程度をフローサイトメトリーで測定した。

結果として、間質組織および血管周囲組織で既に進行していた線維化の程度は、プラシーボ手術群（シャム）と同様に、ＣＣＮ５を注射した群における線維化の程度と同程度であり、これは正常な組織へ回復する程度と同様の可逆的治療効果を示した（図３Ｂ〜３Ｃ）。さらに、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５注射群の心臓の線維化状態において増加した筋線維芽細胞の量は、プラシーボ手術群と同様の数に減少した（図３Ｄ）。これらの結果は、ＣＣＮ５が、線維性障害の分解および進行性線維化を患う心臓組織から正常な組織構造への可逆的な回復を示す治療効果を有することを示す。さらに、ＣＣＮ５の心筋線維化の可逆的な処置が、ＣＣＮ５による線維芽細胞の増殖の減少に関連することを確認し、ここで線維芽細胞は、全ての線維性疾患の発生および進行の病態遂行細胞(pathologic execution cell)である。

心筋線維化の処置と心臓機能の保護効果との間の関係を、心エコー検査を介して調べた。心臓の短縮率（ＦＳ）における減少の防止ならびに末端収縮（収縮期における左室内径、ＬＶＩＤｓ）および拡張期左室内径（ＬＶＩＤｄ）における増加の抑制は、対照ウイルス注射群（ＡＡＶ−ＶＬＰ）と比較して、ＣＣＮ５注射群（ＡＡＶ−ＣＣＮ５）において著しく抑制された。したがって、ＣＣＮ５タンパク質は、既存の心筋線維化の処置を介して心不全状態の心臓機能の悪化を防ぐことによって、収縮期心不全に対する治療効果を示した（ｎ＝１６、エラーバー＝Ｓ．Ｄ．＊Ｐ＜０．０５、図３Ｅ）。

ＣＣＮ５遺伝子導入による線維芽細胞の選択的なアポトーシス
相関分析を行い、心筋線維化の回復が筋線維芽細胞のアポトーシスによって起こるのか否かを決定した。圧負荷モデルマウスの誘導と共に、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５およびＡＡＶ９−ＶＬＰを注射し、２週間後、心臓組織切片をＴＵＮＥＬ染色（赤）および線維芽細胞特異的なタンパク質である抗α−ＳＭＡ抗体（緑）で同時に染色し、線維芽細胞のアポトーシスが生じているか否かを確認した（図４Ｂ）。結果として、プラシーボ手術群において、２つの染色法に応答する細胞（アポトーシスを起こした筋線維芽細胞）はほとんど存在せず、ＡＡＶ９−ＶＬＰを注射した対照群において疾患群の約９％であり、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５群において約７２％であった（ｎ＝３）。非常に多くの細胞が、ＡＡＶ−ＣＣＮ５を注射した疾患モデル群において存在していた（図４Ｂおよび４Ｃ）。したがって、心筋線維化の悪化および筋線維芽細胞の増殖は比例しており、心筋線維化が進行している動物モデルにおいて注射されたＡＡＶ９−ＣＣＮ５の可逆的な治療効果は、筋線維芽細胞のアポトーシスに起因し、ＣＣＮ５遺伝子注射による線維化の治療効果およびアポトーシスによる筋線維芽細胞の減少が直接的に関連していることが確認された。

さらに、ＣＣＮ５が筋線維芽細胞を選択的に死滅させるか否かを確認した（図４Ｄ〜４Ｆ）。本実験に用いる心筋細胞および線維芽細胞をラットの心臓から得、筋線維芽細胞を、線維芽細胞をＴＧＦ−βで処理することによって誘導した。ラットの心筋細胞、線維芽細胞および筋線維芽細胞をＣＭ−ＣｏｎまたはＣＭ−ＣＣＮ５培地で培養し、４８時間後に、ＤＡＰＩを用いた濃縮した核の染色法、アポトーシス測定のためのＴＵＮＥＬ染色法、および抗アネキシンＶ（アポトーシスのマーカー）抗体での染色法を用いて、染色を行い、フローサイトメトリーを行った（ｎ＝３、エラーバー＝Ｓ．Ｄ．、＊＊Ｐ＜０．０１）。結果として、ＣＭ−ＣＣＮ５培地で培養した筋線維芽細胞の場合にのみ、核濃縮が増加し、ＴＵＮＥＬ蛍光を示す核の数が増加し、アネキシンＶ陽性の筋線維芽細胞の数が著しく増加したことを確認した。これらの結果は、ＣＣＮ５が、心筋線維化の病態遂行細胞である筋線維芽細胞のみにおいてアポトーシスを選択的に引き起こすという動物実験の結果と同様の結果を示す。

２つの結果を共に考慮することにより、ＣＣＮ５は、心筋線維化疾患モデルにおける筋線維芽細胞のアポトーシスを誘導し得、心筋細胞または線維芽細胞に影響を与えない選択的な機構を示し得ることがわかった。

ＣＣＮ５タンパク質の選択的アポトーシス（内因性アポトーシス経路）の機構の調査
ＣＭ−ＣｏｎまたはＣＭ−ＣＣＮ５を、ＴＧＦ−βの条件下で線維芽細胞から分化した筋線維芽細胞に添加し、１日または２日間培養し、次いでタンパク質を細胞から分離し、ウエスタンブロット法を行った（図５Ａ）。使用した抗体は、抗Ｂｃｌ２、抗ＢＡＸ、抗プロカスパーゼ３、抗切断型カスパーゼ３、抗プロカスパーゼ７、抗切断型カスパーゼ７、抗プロカスパーゼ８、抗切断型カスパーゼ８、抗プロカスパーゼ９、抗切断型カスパーゼ９および抗ＧＡＰＤＨ抗体であり、これらはアポトーシスに関連するタンパク質である。ＣＣＮ５タンパク質で処理した群において、アポトーシスを防ぐタンパク質であるＢＣＬ−２の発現量は著しく減少したが、アポトーシスを促進するタンパク質であるＢＡＸならびにカスパーゼ３、７および９の発現量は時間と共に増加した。

さらに、筋線維芽細胞を、ウエスタンブロットの細胞培養と同様の条件下で２日間、ＣＭ−ＣｏｎまたはＣＭ−ＣＣＮ５で処理し、次いで免疫化学を抗シトクロムＣ抗体を用いて行った（図５Ｂ）。図５Ｂにおける矢印は、アポトーシスが起こり、シトクロムＣがミトコンドリアから細胞質中に存在していることを意味し、ＣＣＮ５タンパク質の処理による筋線維芽細胞のアポトーシスが蛍光免疫化学を介して確認された。

さらに、線維芽細胞および誘導された筋線維芽細胞における抗ＮＦ−κＢ、抗ビメンチンおよび抗α−ＳＭＡ抗体を用いたウエスタンブロット法を、上述のウエスタンブロット法および免疫化学と同様の条件下で行った。結果として、アポトーシス抵抗性を与える核内のＮＦ−κＢの発現量は、筋線維芽細胞に特異的に高かった（図５Ｃ）。ＮＦ−κＢレポーター分析および抗ＮＦ−κＢ抗体での免疫染色法の結果として、ＮＦ−κＢの核内への移動が、ＣＣＮ５タンパク質処理群において完全に抑制されていたことが確認された（図５Ｄおよび５Ｅ）。これらの結果は、ＣＣＮ５タンパク質による筋線維芽細胞の選択的なアポトーシスの誘導が、核内へのＮＦ−κＢの移動阻害機構によるものであることを証明する（ｎ＝３、エラーバー＝Ｓ．Ｄ．、＊＊Ｐ＜０．０１）。

ＣＭ−ＣＣＮ５の発現および活性の確認
細胞から分泌されるタンパク質としてＣＣＮ５を過剰発現させるために、ＨＡ標識されたＡｄ−ＣＣＮ５プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に注入し、２４時間培養し、次いで分泌されたタンパク質を無血清細胞培養溶液から得た（図６Ａ）。培養培地および細胞を分離し、抗ＨＡ抗体を用いて、ＣＣＮ５の発現量および分泌量を決定し、細胞質標的タンパク質である抗ＧＡＰＤＨ抗体によって、培養培地に分泌されたＣＣＮ５が細胞質に混入していなかったことを確認した。

以下の実験を行い、本実験で使用した組換えＣＣＮ５が機能的に作動したか否かを確認した。新生児ラットの心筋細胞を単離し、血漿を除去した培地で１２時間培養し、次いで１００μＭのフェニレフリンで２４時間処理した。フェニレフリンは心筋細胞肥大を誘導する。同時処理群において、フェニレフリンと同時にＣＭ−ＣＣＮ５を２００ｎｇ／ｍＬの濃度で処理することによって、抗αアクチン抗体を用いた蛍光免疫化学により、心筋細胞肥大が抑制されるか否かを観察した。細胞表面をＭｅｔａＭｏｒｐｈプログラムを用いて測定した（ｎ＝５０、エラーバー＝Ｓ．Ｄ．、＊＊Ｐ＜０．０１）。結果として、組換えＣＣＮ５は、フェニレフリンで誘導した心筋細胞の肥大を完全に阻害し、したがって本実験で使用した組換えＣＣＮ５は機能的に作動したことが確認された（図６Ｂ）。

筋線維芽細胞（ＭｙｏＦＢ）への分化の確認
ウエスタンブロットを行い、ラットの心筋細胞（Ｍｙｏ）、線維芽細胞（ＦＢ）およびＴＧＦ−βのそれぞれの存在下において、分化した筋線維芽細胞（ＭｙｏＦＢ）がよく分離および分化したことを確認し、これは抗α−アクチニン、抗ビメンチン、抗α−ＳＭＡ、および抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いて確認された。線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化転換後でさえ、線維芽細胞のマーカータンパク質であるビメンチンは消失しなかった。したがって、ビメンチンおよびα−ＳＭＡの両方が筋線維芽細胞から発現されたことを確認することで、筋線維芽細胞が分離および分化したことを確認し、これにより本実験の信頼性は向上した（図７）。

心臓に発現させたＣＣＮ５による線維化のシグナル伝達の阻害
プラシーボ手術または大動脈交差狭窄手術（ＴＡＣ）の８週間後に、ＡＡＶ９−ＶＬＰまたはＡＡＶ９−ＣＣＮ５（マウス毎に５×１０^１０ウイルス遺伝子担体）をマウスモデルに注射し、さらに８週間後に、線維化のシグナル伝達に関連するタンパク質の発現量を、屠殺したモデルの心臓においてウエスタンブロットを用いて確認した（ｎ＝３、図８Ａおよび８Ｂ）。心臓組織から得たタンパク質を５０μｇの濃度で用い、抗ＳＥＲＣＡ２ａ、抗ＣＣＮ５、抗Ｓｍａｄ４、抗ｐ−Ｓｍａｄ２、抗Ｓｍａｄ７、抗ＣＣＮ２、抗ＬＯＸ、および抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いて確認した。結果として、対照群では、ＴＧＦ−βのシグナル伝達の活性化に関与するＳｍａｄ２はリン酸化されていたが、ＣＣＮ５注射群では、ｐ−Ｓｍａｄ２の発現が阻害されていた。さらに、ＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害に関与するＳｍａｄ７は、ＣＣＮ５群でのみ発現していた。線維化の進行を阻害する重要な薬物標的であるリジルオキシダーゼ（ＬＯＸ）は、線維化の過程において分泌されるコラーゲンを架橋および重合する酵素であり、組織の外部環境を治癒するのに重要な役割を担っている。ＬＯＸは対照群において増加したが、ＣＣＮ５注射群において大幅に減少したことが確認された。さらに、心臓の収縮力の増加による血液循環のポンプ機能を担うＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の増加の結果によって、心臓の収縮力による収縮期の心臓機能改善効果が予測され得る。

ＲＮＡを同じ心臓組織を用いて抽出し、ｃＤＮＡを合成し、線維化のシグナル伝達に関与するｍＲＮＡの発現レベルを定量ＲＴ−ＰＣＲで決定した（図８Ｂ）。ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＣＣＮ２、ガレクチン３、コラーゲン１Ａ、コラーゲン３Ａ１およびフィブロネクチンのｍＲＮＡを測定した。心筋線維化の標的遺伝子を定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて分析した結果、ＴＧＦ−β型、ＣＣＮ２、ガレクチン３などの線維化のシグナル伝達を導く遺伝子、およびその転写機構を介して増加した線維性タンパク質の遺伝子は、対照群において増加し、ＣＣＮ５注射群において減少していた（ｎ＝３、＊＊Ｐ＜０．０１）。

ＣＣＮ５による内皮細胞の筋線維芽細胞への分化転換の阻害
最近の研究の結果、心筋細胞の過程で増殖する線維芽細胞は、内皮細胞からの分化転換（ＥｎｄｏＭＴ）によって一部が形成され、筋線維芽細胞の形成を促進していることがわかった。ＣＣＮ５がそのような分化転換を阻害するか否かを、Ｓｃｌ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ；Ｒ２６ＲｓｔｏｐＹＦＰ二重トランスジェニックマウスモデルを用いて確認した。

Ｓｃｌ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ；Ｒ２６ＲｓｔｏｐＹＦＰ二重トランスジェニックマウスモデルにおいて、タモキシフェンを５日間処理し、４週間後に、ＡＡＶ９−ＶＬＰまたはＡＡＶ９−ＣＣＮ５（マウス毎に５×１０^１０ウイルス遺伝子担体）を注射し、同時にプラシーボ手術または大動脈縮窄（ＴＡＣ）手術を行った（図９Ａ）。ＴＡＣ手術の８週間後、心臓組織を試料採取し、免疫化学を行った（図９Ｂおよび９Ｃ）心臓組織の断面を、抗ＹＦＰ（緑）および抗ビメンチン（赤）抗体で染色し、タモキシフェンで誘導されたＹＦＰおよび線維芽細胞の標的遺伝子であるビメンチンを同時に発現している細胞を測定した。ＹＦＰおよびビメンチンを同時に発現している細胞は、内皮細胞が中胚葉細胞に転換している細胞であり得る。結果として、ＡＡＶ−ＶＬＰ注射群において、約８．５％の細胞がＹＦＰおよびビメンチンを同時に発現したが、ＡＡＶ−ＣＣＮ５注射群においては、約１％の細胞のみがＹＦＰおよびビメンチンを同時に発現した。上記の結果は、ＣＣＮ５が、線維化の原因細胞である筋線維芽細胞の、様々な前駆細胞からの分化転換および増殖を阻害できることを示す。

さらに、組織および臓器の損傷部位に依存して、線維芽細胞および周皮細胞と共に、内皮細胞が線維芽細胞に分化転換し、線維化誘導因子（ＴＧＦ−βなど）によって最終的に筋線維芽細胞に分化する。ＣＣＮ５が、内皮細胞のＴＧＦ−βによる中胚葉細胞への分化転換を阻害したか否かを確認した（図９Ｄ）。内皮細胞を分化転換を介して中胚葉細胞に誘導するため、ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）を１０ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ−β２で７２時間処理した。この細胞を、対照培地（ＣＭ−Ｃｏｎ）および２００ｎｇ／ｍＬ ＣＣＮ５（ＣＭ−ＣＣＮ５）を含む培地で培養し、結果を観察した。免疫化学を行い、抗ＶＥ−カドヘリンおよび抗ビメンチン抗体で染色し、核をＤＡＰＩで染色した。結果として、ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）をＴＧＦ−βで処理した場合、筋線維芽細胞のマーカーであるα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）およびビメンチンを共に発現し、ＣＣＮ５で同時に処理した群では、発現は抑制された。

さらに、内皮細胞が分化転換を起こす場合、筋線維芽細胞に類似の特徴が生じ、創傷部位へ遊走する能力を有する。ＣＣＮ５がこの特徴を抑制するか否かを、フローサイトメトリーを用いて確認した（図９Ｅ）。ＨＣＡＥＣを培養皿に播種および安定化した後、スクラッチを２００μＬピペットチップを用いて作成し、次いで細胞を図９Ｄに示される免疫化学の条件下で培養した。４８時間後、細胞を固定し、ＤＡＰＩで染色し、細胞が遊走した程度を測定した。結果として、ＴＧＦ−βで処理した群では、細胞の遊走能は対照群と比較して増加し、ＴＧＦ−βとＣＣＮ５を同時に処理した群では、細胞遊走は起こらなかった。さらに、内皮細胞を図９Ｄの免疫化学と同じ条件下で培養することによってＲＮＡを抽出した後、ｃＤＮＡを合成し、定量ＲＴ−ＰＣＲを行い、α−ＳＭＡ、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、Ｔｉｅ２およびＣＤ３１のｍＲＮＡ発現の程度を測定し、遺伝子発現を分析した（図９Ｆ）。結果として、ＣＣＮ５で同時に処理した群において、ＴＧＦ−βで誘導した線維芽細胞に関連する遺伝子であるα−ＳＭＡ、Ｉ型コラーゲンおよびＩＩＩ型コラーゲンの発現量、および内皮細胞に固有であるＴｉｅ２およびＣＤ３１遺伝子の発現量は、ＴＧＦ−β未処理の対照群と類似していたことが示された（ｎ＝６、エラーバー＝Ｓ．Ｄ．、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。したがって、ＣＣＮ５は内皮細胞から中胚葉細胞への分化転換を阻害し、線維化を抑制したことが示された。

ＣＣＮ５による、線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化の阻害
以下の実験を行い、ＣＣＮ５が線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化を阻害するか否かを確認した。８週齢のマウスモデルにＡＡＶ９−ＶＬＰまたはＡＡＶ９−ＣＣＮ５（マウス毎に５×１０^１０ウイルス遺伝子担体）を注射し、同時にプラシーボ手術または大動脈縮窄（ＴＡＶ）手術を行い、８週間後に、心臓組織を用いて免疫化学を行った（図１０Ａ）。心臓組織の断面を抗ビメンチン（赤）および抗α−ＳＭＡ（緑）抗体で染色した。ビメンチンおよびα−ＳＭＡを同時に発現する細胞は、線維芽細胞への転換を起こした細胞であり得る（図１０Ｂ）。ビメンチンを発現する細胞のうち、同時にα−ＳＭＡを発現する細胞を分析し、グラフに示した（ｎ＝３、エラーバー＝Ｓ．Ｄ．、＊＊Ｐ＜０．０１）。結果として、ＡＡＶ９−ＶＬＰ注射群では、約１７％の細胞がα−ＳＭＡおよびビメンチンを同時に発現したが、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５注射群では、約４％の細胞がα−ＳＭＡおよびビメンチンを同時に発現した。この結果は、心臓におけるＣＣＮ５の発現量の増加が、線維化を引き起こす線維芽細胞を筋線維芽細胞に分化させ、増殖させる病理学的機構を効果的に抑制することを示す（ｎ＝３、エラーバー＝Ｓ．Ｄ．、＊＊Ｐ＜０．０１、図１０Ｃ）。

以下の実験を行い、組換えＣＣＮ５タンパク質もまたＴＧＦ−βによる筋線維芽細胞の分化を抑制することを確認した。線維芽細胞が筋線維芽細胞に分化するのを誘導するため、１０ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ−βで４８時間処理した。細胞を、対照群の培地および２００ｎｇ／ｍＬ ＣＣＮ５の培地でそれぞれ培養し、結果を観察した。抗α−ＳＭＡ抗体で染色し、核をＤＡＰＩで染色し、免疫化学を行った。ＣＣＮ５で同時に処理した群において、筋線維芽細胞の収縮力を与えるα−平滑筋アクチンのタンパク質発現レベルの増加が抑制されたことを確認した（図１０Ｄ）。

ＴＧＦ−βはコラーゲンゲルの収縮力を増加させるため、コラーゲンゲル収縮アッセイを用いて、ＣＣＮ５がＴＧＦ−βによる筋線維芽細胞の分化を阻害することを確認した（図１０Ｄ）。コラーゲン格子ゲルを、線維芽細胞およびコラーゲンを用いて作成し、図１０Ｄに関連する実験と同じ条件下で培養し、次いで４８時間後にコラーゲンゲルのサイズを測定した。結果として、ＴＧＦ−βによるコラーゲンゲルの収縮力は、ＣＣＮ５で処置した群において著しく減少したことが確認された。

定量ＲＴ−ＰＣＲを行い、α−ＳＭＡおよびＩ型コラーゲンのｍＲＮＡ発現レベルを測定した（図１０Ｆ）。線維芽細胞をまた、図１０に関連する実験と同じ条件下で培養し、ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成し、定量ＲＴ−ＰＣＲを行い、α−ＳＭＡおよびＩ型コラーゲンのｍＲＮＡ発現の程度を測定した。結果として、ＴＧＦ−βで誘導された筋線維芽細胞の特異的な転写機構であるα−平滑筋アクチンおよびＩ型コラーゲン遺伝子の発現量は、ＣＣＮ５で同時に処理した群における線維芽細胞と同じレベルまで抑制された（ｎ＝６、エラーバー＝Ｓ．Ｄ．、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。したがって、ＣＣＮ５はＴＧＦ−βによる筋線維芽細胞への分化および筋線維芽細胞の産生を効果的に阻害することが示された。

Ｂ．遺伝的デュシェンヌ型筋ジストロフィー心不全モデル（ＤＭＤモデル）
ＤＭＤモデルにおける心筋線維化に対するＡＡＶ−ＣＣＮ５の治療効果
デュシェンヌ型筋ジストロフィーモデルマウスである老齢ＭＤＸ／ＵＴＲＮ（＋／−）マウスにおけるＡＡＶ−ＣＣＮ５の治療効果を、図１１Ａにおける計画に従って検査した。線維化の程度を、マッソン−トリクローム染色を用いて、心筋の低温切断法を介して確認した（図１１Ｂ）。心筋線維化の範囲を測定した結果、線維化の範囲は、ＡＡＶ−ＶＬＰ注射群（１０．１４％＋／−５．１１）と比較して、ＡＡＶ−ＣＣＮ５注射群（３．３９％＋／−０．５８）において、平均で２．６倍減少した（図１１Ｂ）。ＡＡＶ−ＣＣＮ５を注射した心臓における間質性線維化の蓄積の抑制は、構造リモデリングの効果の改善および心筋組織の性質を正規化する治療効果を示した（ｎ＝３〜４、ｐ＜０．００１）。

ＤＭＤモデルにおけるＡＡＶ−ＣＣＮ５による心臓組織の処置の改善
心エコー法を、ＡＡＶ−ＶＬＰおよびＡＡＶ−ＣＣＮ５の注射の８週間後に行った。心室短縮率を測定した結果、ＣＣＮ５による心室短縮の治療効果が、正常なシャム手術をしたＷＴ（＋／−）群、ＡＡＶ−ＶＬＰ群、およびＡＡＶ−ＣＣＮ５群において、それぞれ５８．７０％±１．０５（ｎ＝３）、４５．７５％±１．２９（ｎ＝７）および５３．８８±１．２１（ｎ＝６）として示された（Ｐ＜０．００５、図１２Ａ）。さらに、心臓の血行動態機能を測定した結果、ＡＡＶ−ＣＣＮ５注射群の平均の収縮末期圧−容積関係（ＥＳＰＶＲ）は３．５４±２．４９（ｎ＝７）であり、ＡＡＶ−ＣＣＮ５注射群の平均のＥＳＰＶＲは６．１０±２．２５（ｎ＝６）であった。この結果は、心臓の収縮末期の弾力性(terminal systolic elasticity)および収縮力を改善する、過剰発現したＣＣＮ５タンパク質の治療効果を示す（ｐ＜０．０５、図１２Ｂ）。

心筋線維化に関連する遺伝子の発現に対する、ＡＡＶ−ＣＣＮ５の阻害効果
ＤＭＤモデル動物において、ＡＡＶ−ＶＬＰおよびＡＡＶ−ＣＣＮ５、心筋の収縮に関連するＳＥＲＣＡ２ａ；線維化に関連する遺伝子である、Ｃｏｌ１Ａ２、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ｐ−ＳＭＡＤおよびα−ＳＭＡ；ならびにＣＣＮ５タンパク質を注射した、正常なマウスおよび老齢ＭＤＸ／ＵＴＲＮ（＋／−）マウスに対して、ウエスタンブロットを行った。ＡＡＶ−ＣＣＮ５注射群において、心収縮に重要なＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の発現量は増加し、線維化マーカータンパク質であるＣｏｌ１Ａ２、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ｐ−ＳＭＡＤおよびα−ＳＭＡの発現量は減少した（図１３）。遺伝子レベルでの発現量をｑＲＴ−ＰＣＲを用いて決定した結果、ＡＡＶ−ＣＣＮ５注射群において、Ｃｏｌ１Ａ２およびＴＧＦ−β１の発現量が減少し、抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０の発現量は増加した（図１４）。したがって、ＡＡＶ−ＣＣＮ５注射群において、過剰発現したＣＣＮ５タンパク質が心筋線維化の処置に有効であることが、タンパク質および遺伝子発現実験を介して見出された。

Ｃ．大動脈バンディング虚血再灌流デバンディング（ＡＩＤ）心不全モデル
ＣＣＮ５遺伝子導入による、心筋線維化に対する治療効果
本発明で用いられる拡張期心不全モデルは、大動脈バンディング虚血再灌流デバンディング（ＡＩＤ）外科方法を介して、ラットに対して作成したモデルである。このモデルは、心不全の研究に通常用いられる圧負荷モデルよりも、心不全患者の状況をよく反映する。すなわち、多くの心不全患者は大抵、高血圧などによる圧負荷、および狭心症、心筋梗塞などによる虚血を同時に経験する。しかしながら、圧負荷を外科的な方法および薬物処置によって取り除き、冠動脈の灌流を達成しても、心臓の症状は改善せず、心不全に進行する（図１５Ａ）。本発明者は、心筋線維化が、ＡＩＤモデルの心臓から重篤に進行し、それによって心臓の拡張機能が著しく減少したことを発見した。一方、心臓の収縮機能における減少は、統計的有意性を有するほど大きくなかった。したがって、ＡＩＤモデルは心不全患者の状況をよりよく表し、特に駆出率が保存された心不全の特徴を有する。ＡＩＤ心不全ラットモデルを対照群と処置群に分けた後、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５（マウス毎に１×１０^１１ウイルスゲノム）を尾静脈に注射し、２月後に分析した。心臓の切片をマッソン−トリクローム染色し、顕微鏡下で観察した。心筋線維化において分泌されたコラーゲンは、マッソン−トリクローム染色によって青色染色された。

結果として、心筋線維化が、ＡＩＤラットの間質領域および血管周囲領域において著しく進行したことが確認された。しかしながら、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を注射したラットにおいて、心筋線維化は、手術を行っていないラットに類似する程度まで処置された（ｎ＝５〜８、Ｐ＜０．０５、図１５Ｂおよび１５Ｃ）。

血行動態分析を用いた、心臓の収縮機能および拡張機能の確認
ＣＣＮ５を、ＡＡＶ−ＣＣＮ５を用いて心筋細胞に過剰発現させた場合、ＡＩＤモデルにおける心エコー分析で得られた短縮率は、実験群の間で有意差を示さなかったが、正常に近い機能を示した（図１６Ａ）。ＣＣＮ５の効果を、ＡＩＤ心不全モデルにおいて血行動態分析を介して確認した。この分析において、拡張末期圧−容積関係（ＥＳＰＶＲ）の値は心臓の収縮機能（収縮力）に比例し、（ＥＤＰＶＲ）の値は心臓の拡張機能（伸展性）に反比例する。実験結果は、ＡＩＤラットのＡＡＶ−ＣＣＮ５注射群において、ＥＳＰＶＲのわずかな減少およびＥＤＰＶＲの著しい増加を示した（ｎ＝６、Ｐ＜０．０５、図１６Ｂおよび１６Ｃ）。これは、ＡＩＤラットが、正常なマウスと比較して、著しく減少した収縮力を有するのではなく、著しく減少した拡張機能を有することを意味する。この拡張機能の減少は、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５を注射したラットにおいて観察されなかった。これらの結果は、心臓の拡張機能の減少が、ＣＣＮ５タンパク質を過剰発現させたＡＩＤモデルにおいて回復し得ることを意味する。

結果の分析とさらなる考察
不可逆的な疾患である線維性疾患には、疾患発生後に診断されるという問題がある。現在まで、いかなる治療に成功した治療薬も開発されていない。線維性疾患の特徴として、病態遂行細胞である線維芽細胞は、組織および臓器の種類にかかわらず、疾患の発生および進行に中心的な役割を果たしている。筋線維芽細胞は、通常の創傷を治癒する過程において一時的に誘導され、消失する特徴を有する細胞であるが、線維性疾患状態において、筋線維芽細胞はアポトーシスを防ぐ機構を獲得することにより、持続的に増殖する機能および活性を有する。線維芽細胞のそのような持続的活性は、線維化が進行する疾患に一般的な疾患の経路において示される。病原性筋線維芽細胞は、線維性細胞外マトリックスを過剰生産し、蓄積させる分泌性細胞の機能、炎症性免疫細胞の流入および炎症性物質の自己分泌における炎症性細胞の機能、ならびに周囲の細胞および周囲の分泌物質との異常な接続によって構造組成細胞の機能を破壊する、シグナル伝達の細胞機能を有する。結果的に、筋線維芽細胞の持続的な増殖および活性化は、組織のリモデリングを生じる線維化の原因であるだけでなく、炎症性細胞の機能によって反応性線維化の過程を促進する役割を果たしている。

本発明の研究を介して、まず、ＣＣＮ５タンパク質が、心筋線維化の過程における中心的な細胞である筋線維芽細胞の選択的な死滅を引き起こすことを、病状の細胞レベルおよび生物学的レベルで明らかにした。ＣＣＮ５タンパク質は、筋線維芽細胞の持続的な病的活性を制御し、選択的なアポトーシスを促進し、既存の心筋線維化を人体内の物質で可逆的に処置する方法を提供し得る。特に、治療の目的のための、線維芽細胞のアポトーシスを調節する薬剤の開発は成功してこなかったが、ＣＣＮ５タンパク質による線維芽細胞の選択的なアポトーシスは、通常の創傷治癒の過程の回復期間(resolution period)に起こる人体模倣機構の特徴を有する。これらの事実は、病原性筋線維芽細胞のみを死滅させ、前駆細胞である線維芽細胞に影響を与えず、心筋細胞が副作用を最小化し得る機構が新規の生体模倣治療であることを示唆する。したがって、本発明において、既存の線維化の処置のために、ＣＣＮ５タンパク質活性によって、線維性マトリックスを分解し、正常な構造組成を回復し、それによって心筋線維化を含む不治の病である線維性疾患の新規処置方法を提供し得る。

ＣＣＮ５は細胞外に分泌されるマトリックス細胞タンパク質であり、治療活性を示すため、ＣＣＮ５は、様々な病状および広範な部位を薬物送達法（タンパク質製剤、遺伝子治療薬、遺伝子を増幅する細胞治療薬など）で処置できる可能性がある。これらの特徴に基づいて、心筋線維化がかなり進行した様々な動物モデルの心臓に、ＡＡＶ９−ＣＣＮ５遺伝子導入を介してＣＣＮ５を発現させた結果、既存の線維性組織は可逆的に処置される。ＣＣＮ５の可逆的な処置機構は、細胞レベルでの実験と同様に筋線維芽細胞のアポトーシスを選択的に誘導することを介して、インビボの処置効果を再現した。特に、心筋線維化の治療効果は、心筋組織の間質性線維化および血管周囲線維化の処置を介して確認された。さらに、タンパク質分析および遺伝子分析を介したＣＣＮ５の治療効果の結果として、コラーゲンの架橋を引き起こすことで硬直性を増加させるＬＯＸ酵素(Rosin N.L., et al., Am. J Pathol. 185(3):631-642(2015)の減少、ＴＧＦ−βのシグナル伝達の阻害剤であるＳｍａｄ７タンパク質(Wei L.H., Huang X.R., et al. Cardiovasc. Res. 1;99(4): 665-73(2013))の発現量の増加、炎症性免疫細胞の流入および筋線維芽細胞の増殖を促進するガレクチン３(Ho J.E., Liu C., et al. J Am. Coll. Cardiol. 60(14):1249-1256(2012))の減少、ならびにＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２の発現量の減少はそれぞれ、線維化処置の薬物標的であり、これはＣＣＮ５の処置機構が強力であることを示した。したがって、ＣＣＮ５タンパク質は、様々な心筋線維性疾患の処置のための有効な処置手段を提供し得る。

心筋線維化を伴う心機能不全は、駆出率が保存された心不全（ＨＦｐＥＦ）の最大の疾患原因である。心室の硬直化は、心筋の弛緩機能の異常および細胞外間質組織の増加によって、心筋細胞の萎縮、心血管収縮および心血管弛緩の問題を引き起こす。結果として、低酸素の誘導、細胞エネルギー代謝障害、および炎症性細胞の継続的な流入が心筋細胞の壊死を進行させ、駆出率が保存された心不全（ＨＦｐＥＦ）が駆出率が減少した心不全（ＨＦｒＥＦ）に進行する。さらに、心筋梗塞と同様に心筋細胞の大量死が起こる、駆出率が減少した心不全（ＨＦｒＥＦ））の場合、置換性線維化は損傷部位に発生するが、間質性線維化は境界組織および遠位の組織で進行する。結果的に、心筋線維化は、収縮期心不全の症状を悪化させるリスク因子として働き得る。本発明において、ＣＣＮ５タンパク質は、圧負荷（ＴＡＣ）モデル、およびインビボモデルを介した希少疾患であるデュシェンヌ型筋ジストロフィーモデル（ＤＭＤ）において、心筋線維化の可逆的な処置ならびに収縮期心不全における回復および保護効果に効果的であることがわかった。さらに、ＣＣＮ５タンパク質は、心筋線維化を可逆的に処置でき、拡張期心不全を起こしているラットＡＩＤモデル実験を介して、拡張期の心機能の減少を回復できた。この結果は、ＣＣＮ５タンパク質が、本発明を介して、心筋線維化または心筋線維化を伴う収縮期心不全（ＨＦｒＥＦ）および拡張期心不全（ＨＦｐＥＦ）の可逆的な処置のための治療薬として開発され得ることを示す。

本発明の特定の部分を詳述したが、当業者はこれらの具体的な技術が単なる好ましい実施態様にすぎないことを認識し、本発明の範囲が限定されないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付された特許請求の範囲およびそれに相当するものによって規定され得る。

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Claims (6)

1. デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するための医薬組成物であって、ＣＣＮ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むアデノ随伴ウイルスを有効成分として含む医薬組成物。
2. 筋線維芽細胞特異的なアポトーシスを誘導する、請求項１に記載の医薬組成物。
3. ＣＣＮ５タンパク質が配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の医薬組成物。
4. ＣＣＮ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなる、請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
5. アデノ随伴ウイルスが、アデノ随伴ウイルス血清型１、アデノ随伴ウイルス血清型６、アデノ随伴ウイルス血清型８、およびアデノ随伴ウイルス血清型９からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
6. 筋線維芽細胞特異的なアポトーシスを誘導し、または線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化を抑制する、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。

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