JP6704990B2 - インターフェロンλ産生促進用組成物及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、インターフェロンλ産生促進用組成物及びその製造方法に関する。

インターフェロンλはＩＩＩ型インターフェロンに属する生理活性物質（サイトカイン）の１種であり、これまでに樹状細胞、肝細胞、腸管上皮細胞、肺上皮細胞などによる産生が認められている。インターフェロンλは抗ウイルス作用といった自然免疫賦活化作用を有し、抗ウイルス活性、免疫賦活活性、抗感染症活性、抗Ｂ型肝炎活性、抗Ｃ型肝炎活性、抗増殖活性、抗腫瘍活性、抗癌活性などを示し得ることから、これらの活性を有する飲食品、治療剤、予防剤、改善剤、緩和剤などに利用することが期待されている。

具体的には、インターフェロンλはＣ型肝炎治療において治験が行われ、実際に抗ウイルス作用を示すことが確認されている。また、インターフェロンλは、ロタウイルス、ＲＳウイルス、インフルエンザウイルスなどに対しても抗ウイルス作用を示すことが確認されており、肝臓、腸管、呼吸器などの組織の免疫において重要な役割を果たしている。

さらに、インターフェロンλは、加齢に伴って生じる免疫力の低下を補うことができるものである。インターフェロンλに対する受容体は上記した細胞に限定的に局在していることから、インターフェロンλは、あらゆる細胞に受容体が発現しているインターフェロンαとは異なり、摂取者に対して、副作用を抑えて選択的な生理活性作用を付与することができる。

そこで、インターフェロンλを直接投与することのみならず、インターフェロンλの生体内での発現量を増やすこと、すなわち、インターフェロンλの産生を促進する物質を投与することにより、インターフェロンλによって期待される生理活性を生体内で引き起こすことが可能となる。

インターフェロンλを産生する細胞のうち、樹状細胞は、プラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）及びミエロイド樹状細胞（ｍＤＣ）に大別でき、ｍＤＣはさらにＣＤ１９が陰性であるｍＤＣ１及びＢＤＣＡ３が陽性であるＢＤＣＡ３ＤＣに分けることができる。

これらの樹状細胞サブセットは、それぞれ発現する細胞表面分子マーカーの種類及び程度、産生するサイトカインの種類などが相違することが知られている（例えば、非特許文献１及び２を参照）。

インターフェロンλ産生促進物質としては、例えば、ｐＤＣを活性化して、インターフェロンλの産生を促進する可能性があるものとして、特許文献１にラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株が記載されている。

また、インターフェロンλとは異なるサイトカインとして、インターフェロンγ及びインターフェロンβの産生を促進し得る乳酸菌として、テトラジェノコッカス属乳酸菌が知られている（例えば、特許文献２及び３を参照）。

国際公開第２０１２／０９１０８１号 日本国特開２００６−０２８０４７号公報 日本国特許第５３１２３２２号公報

Jens Geginat et al., Frontiers in Immunology, October 2015, Vol.6, Article 527 Bing Liu et al., Gastroenterology Research and Practice, Vol. 2015, Article ID 796461

特許文献１によれば、ＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株のインターフェロンλの産生量は、他のインターフェロンの産生量と比べて１桁少ない。そこで、本発明者らは、ＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株のインターフェロンλの産生促進作用について、改めて調べることにした。その際、樹状細胞の中でも、インターフェロンλの産生量が比較的多い、ＢＤＣＡ３ＤＣを用いることにした。

そうしたところ、驚くべきことに、特許文献１に記載のＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株は、ＢＤＣＡ３ＤＣに対してインターフェロンλ産生促進作用をほとんど示さなかった。また、特許文献２及び３並びに非特許文献１及び２には、ＢＤＣＡ３ＤＣに対してインターフェロンλ産生促進作用を示す物質についての記載はない。

そこで、本発明が解決しようとする課題は、ＢＤＣＡ３ＤＣに対してインターフェロンλの産生促進作用を示す有効成分を含有する、インターフェロンλ産生促進用組成物及びその製造方法を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を積み重ねた結果、ストレス条件下で培養が可能である乳酸菌の菌体、菌体成分又は培養物は、ＢＤＣＡ３ＤＣに対してインターフェロンλ産生促進作用を示すことを見出した。

特に驚くべきことに、特許文献１に記載のＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株は二本鎖ＲＮＡを含有するものでありながらもＢＤＣＡ３ＤＣに対してインターフェロンλ産生促進作用を示さないことに対して、テトラジェノコッカス・ハロフィラス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）ＫＫ２２１株は、ＢＤＣＡ３ＤＣに対して格別に優れたインターフェロンλ産生促進作用を示すことを本発明者らは見出した。

これらの知見を基に、本発明者らは、ＫＫ２２１株などのストレス条件下で培養が可能である乳酸菌の菌体、菌体成分又は培養物を有効成分として含有する、インターフェロンλ産生促進用組成物及びその製造方法を創作することに成功した。本発明はこれらの知見及び成功例に基づいて完成するに至った発明である。

すなわち、本発明は以下に関する。
１．ストレス条件下で培養が可能である乳酸菌の菌体、菌体成分又は培養物を有効成分として含有する、インターフェロンλ産生促進用組成物。
２．前記インターフェロンλ産生促進用組成物は、ＢＤＣＡ３ＤＣに対するインターフェロンλ産生促進用組成物である、前記１に記載のインターフェロンλ産生促進用組成物。
３．前記インターフェロンλは、インターフェロンλ３である、前記１又は２に記載のインターフェロンλ産生促進用組成物。
４．前記菌体、前記菌体成分及び前記培養物は、それぞれ核酸を含有する菌体、菌体成分及び培養物である、前記１〜３のいずれか１に記載のインターフェロンλ産生促進用組成物。
５．前記ストレス条件下で培養が可能である乳酸菌は、菌体１×１０^１０ｃｆｕあたり１５，０００ｎｇ／ｍｌ以上の二本鎖ＲＮＡを含有する乳酸菌及び菌体１×１０^１０ｃｆｕあたり総核酸中の二本鎖ＲＮＡの割合が３．５％以上である乳酸菌の少なくとも一方である、前記４に記載のインターフェロンλ産生促進用組成物。
６．前記インターフェロンλ産生促進用組成物が、インターフェロンλ産生促進用腸溶組成物である、前記１〜５のいずれか１に記載のインターフェロンλ産生促進用組成物。
７．前記１〜６のいずれか１に記載のインターフェロンλ産生促進用組成物を含有する飲食品。
８．ストレス条件下で培養が可能である乳酸菌を培養して、該乳酸菌の菌体、菌体成分又は培養物を得ることを含む、インターフェロンλ産生促進用組成物の製造方法。
９．ストレス条件下で培養が可能である乳酸菌の菌体、菌体成分又は培養物を使用してインターフェロンλの産生を促進する方法。
１０．インターフェロンλ産生促進用組成物の製造のためのストレス条件下で培養が可能である乳酸菌の菌体、菌体成分又は培養物の使用。
１１．インターフェロンλの産生を促進するためのストレス条件下で培養が可能である乳酸菌の菌体、菌体成分又は培養物の使用。

本発明の組成物及び本発明の製造方法によって得られる組成物は、インターフェロンλ産生促進作用、特にＢＤＣＡ３ＤＣに対するインターフェロンλ産生促進作用を有し、さらにこれらの作用に関連して、抗ウイルス効果、免疫賦活効果、抗感染症効果、抗Ｂ型肝炎効果、抗Ｃ型肝炎効果、抗増殖活効果、抗腫瘍効果、抗癌効果などを奏することが期待できる。

本発明の組成物で用いられる有効成分は飲食品の添加物などの使用実績のあるものである。したがって、本発明の組成物は、安全性が高いものであり、抗ウイルス剤、免疫賦活剤、抗感染症剤、抗Ｂ型肝炎剤、抗Ｃ型肝炎剤、腸管免疫賦活剤、気道免疫賦活剤、抗腫瘍剤、抗癌剤などとして有用であり、経口的又は非経口的な形態で提供することが期待できるものである。

図１は、実施例に記載されている、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＫＫ２２１株によるＢＤＣＡ３ＤＣのインターフェロンλ３産生促進試験の結果を示す図である。 図２は、実施例に記載されている、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＫＫ２２１株によるＢＤＣＡ３ＤＣ、ｐＤＣ及びｍＤＣ１のインターフェロンλ３産生促進試験の結果を示す図である。 図３は、実施例に記載されている、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＫＫ２２１株及び該菌株をＲＮａｓｅＡ処理した菌体による、ＢＤＣＡ３ＤＣのインターフェロンλ３産生促進試験の結果を示す図である。 図４は、実施例に記載されている、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＫＫ２２１株及びＰｏｌｙ ＩＣによる、クロロキン添加有無別のＢＤＣＡ３ＤＣのインターフェロンλ３産生促進試験の結果を示す図である。 図５は、実施例に記載されている、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＫＫ２２１株による、ＴＲＩＦ阻害剤の添加有無別のＢＤＣＡ３ＤＣのインターフェロンλ３産生促進試験の結果を示す図である。 図６は、実施例に記載されている、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＫＫ２２１株、ラクトコッカス・ラクティスＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株による、ＢＤＣＡ３ＤＣのインターフェロンλ３産生促進試験の結果を示す図である。 図７は、実施例に記載されている、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＫＫ２２１株、ラクトコッカス・ラクティスＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株による、ｐＤＣのインターフェロンα産生促進試験の結果を示す図である。 図８Ａおよび図８Ｂは、それぞれ、実施例に記載されている、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＫＫ２２１株及びＰｏｌｙ ＩＣによる、ＢＤＣＡ３ＤＣの各サイトカイン産生促進試験の結果を示す図である。 図９は、実施例に記載されている、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＫＫ２２１株、ラクトコッカス・ラクティスＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株による、生菌数あたりの二本鎖ＲＮＡの量を測定した結果を示す図である。 図１０は、実施例に記載されている、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＫＫ２２１株、ラクトコッカス・ラクティスＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株による、生菌数あたりの総核酸量を測定した結果を示す図である。 図１１は、実施例に記載されている、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＫＫ２２１株、ラクトコッカス・ラクティスＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株による、生菌数あたりの総核酸中の二本鎖ＲＮＡの割合を算出した結果を示す図である。 図１２は、実施例に記載されている、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＫＫ２２１株、ラクトコッカス・ラクティスＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株による、乾燥菌体あたりの二本鎖ＲＮＡの量を測定した結果を示す図である。 図１３は、実施例に記載されている、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＫＫ２２１株、ラクトコッカス・ラクティスＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株による、乾燥菌体あたりの総核酸量を測定した結果を示す図である。 図１４は、実施例に記載されている、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＫＫ２２１株、ラクトコッカス・ラクティスＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株による、乾燥菌体あたりの総核酸中の二本鎖ＲＮＡの割合を算出した結果を示す図である。 図１５は、実施例に記載されている、各種乳酸菌による、生菌数あたりの二本鎖ＲＮＡの量を測定した結果を示す図である。 図１６Ａおよび図１６Ｂは、実施例に記載されている、ラクトバチルス・サケイＫ１株を２０℃、３４℃又は３８℃にて培養して得られた培養殺菌処理液の１×１０^１０ｃｆｕ相当液量について、生菌数あたりの二本鎖ＲＮＡ量を測定した結果を示す図である。 図１７Ａおよび図１７Ｂは、実施例に記載されている、ラクトバチルス・サケイＫ４１株を２３℃、２９℃又は３６℃にて培養して得られた培養殺菌処理液の１×１０^１０ｃｆｕ相当液量について、生菌数あたりの二本鎖ＲＮＡ量を測定した結果を示す図である。

以下、本発明の詳細について説明する。本発明のインターフェロンλ産生促進用組成物（以下、単に本発明の組成物とよぶ。）は、インターフェロンλ産生促進作用を有し、かつ、有効成分としてストレス条件下で培養が可能である乳酸菌の菌体、菌体成分又は培養物を少なくとも含有する。

本明細書における「インターフェロンλ産生促進作用」とは、例えば、インターフェロンλ遺伝子の発現量を促進すること、インターフェロンλタンパク質の翻訳量を増大すること及びインターフェロンλ産生細胞を活性化することのうち少なくともいずれか１つの作用をいう。

本発明の組成物が有するインターフェロンλ産生促進作用は、本発明の組成物を供することにより惹起されるインターフェロンλ産生促進作用であれば特に限定されないが、例えば、樹状細胞に対するインターフェロンλ産生促進作用であり、好ましくは末梢血系樹状細胞に対するインターフェロンλ産生促進作用であり、より好ましくはＢＤＣＡ３ＤＣに対するインターフェロンλ産生促進作用である。

本発明の組成物によって産生促進されるインターフェロンλは特に限定されず、インターフェロンλ１、インターフェロンλ２及びインターフェロンλ３のいずれでもよいが、好ましくはインターフェロンλ３であり、より好ましくはＢＤＣＡ３ＤＣにおいて産生されるインターフェロンλ３である。

本発明の組成物は、インターフェロンλ産生促進作用を有することにより、抗ウイルス効果、免疫賦活効果、抗感染症効果、抗Ｂ型肝炎効果、抗Ｃ型肝炎効果、抗増殖活効果、抗腫瘍効果及び抗癌効果などを奏することが期待されるものであることから、抗ウイルス剤、免疫賦活剤、抗感染症剤、抗Ｂ型肝炎剤、抗Ｃ型肝炎剤、腸管免疫賦活剤、気道免疫賦活剤、抗腫瘍剤及び抗癌剤という態様を採り得る。

本発明の組成物が奏する抗疾患効果とは、例えば、抗ウイルス効果の場合は、摂食者における現在又は将来のウイルス性疾患若しくはウイルス性疾患に罹患しているとされる状態になることを抑制、遅滞又はその状態を改善することをいう。

本発明の組成物が奏する免疫賦活効果とは、例えば、摂食者における現在又は将来の免疫系を活性化して、種々の疾患や異常を正常な状態になるように維持又は促進することをいう。

乳酸菌は通常知られているとおりの乳酸を生成する微生物のことを意味する。乳酸菌としては、例えば、テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ロイコノストック属などに属する微生物が挙げられ、増殖性及びホモ発酵型でガス発生がないという観点からテトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属が特に好ましい。

乳酸菌としては、具体的には例えば、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＫＫ２２１株、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＮＢＲＣ１２１７２株、ペディオコッカス・ペントサセウスＯＳ株（ＮＩＴＥ Ｐ−３５４）、ペディオコッカス・ペントサセウスＮＲＩＣ１９１５株、ペディオコッカス・ペントサセウスＮＲＩＣ００９９株、ペディオコッカス・ペントサセウスＮＲＩＣ０１２２株、ラクトバチルス・プランタラムＮＲＩＣ１９３０株、ラクトバチルス・プランタラムＮＲＩＣ１０６７株、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスＮＲＩＣ１６８８株、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＮＲＩＣ１６８３株、ラクトバチルス・ブレビスＮＲＩＣ１７１３株、ラクトバチルス・ペントーサスＮＲＩＣ０３９１株、ラクトバチルス・ペントーサスＮＲＩＣ０３９６株、ラクトバチルス・ペントーサスＮＲＩＣ１８３６株、ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・カゼイＮＲＩＣ０６４４株、ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイＮＲＩＣ１９３６株、ストレプトコッカス・サーモフィラスＮＲＩＣ０２５６株、ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・メセンテロイデスＮＲＩＣ１９８２株、ロイコノストック・シュードメセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１株、ロイコノストック・ラクティスＮＲＩＣ１５８２株などが挙げられるが、これらに限定されない。

ストレス条件下で培養が可能である乳酸菌は、上記した乳酸菌などのうち、二本鎖ＲＮＡの含有量が大きい乳酸菌であることが好ましく、菌体１×１０^１０ｃｆｕあたり１５，０００ｎｇ／ｍｌ以上の二本鎖ＲＮＡを含有する乳酸菌及び菌体１×１０^１０ｃｆｕあたり総核酸中の二本鎖ＲＮＡの割合が３．５％以上である乳酸菌の少なくとも一方であることがより好ましい。

乳酸菌が生菌である場合、菌体１×１０^１０ｃｆｕあたり１５，０００ｎｇ／ｍｌ以上の二本鎖ＲＮＡを含有する乳酸菌及び菌体１×１０^１０ｃｆｕあたり総核酸中の二本鎖ＲＮＡの割合が３．５％以上であることが特に好ましい。また、乳酸菌が生菌である場合、菌体１×１０^１０ｃｆｕあたり総核酸中の二本鎖ＲＮＡの割合が３．５％以上であることが特に好ましい。

乳酸菌の菌体１×１０^１０ｃｆｕあたりの二本鎖ＲＮＡの含有量の上限は特に制限されないが、通常５０，０００ｎｇ／ｍｌ以下である。また、乳酸菌の菌体１×１０^１０ｃｆｕあたり総核酸中の二本鎖ＲＮＡの割合の上限は特に制限されないが、通常２０％以下である。

ストレス条件下で培養が可能である乳酸菌の具体的態様としては、例えば、テトラジェノコッカス属の乳酸菌、ペディオコッカス属の乳酸菌、ラクトバチルス属の乳酸菌などが挙げられ、好ましくはテトラジェノコッカス・ハロフィラス、ペディオコッカス・ペントサセウス、ラクトバチルス・サケイなどが挙げられるが、これらに限定されない。

ストレス条件下で培養が可能である乳酸菌としては、増殖性及びホモ発酵型でガス発生がないという観点から、ラクトバチルス・プランタラムＮＲＩＣ１０６７株、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＮＲＩＣ１６８３株、ラクトバチルス・ペントーサスＮＲＩＣ１８３６株、ストレプトコッカス・サーモフィラスＮＲＩＣ０２５６株が好ましく、ペディオコッカス・ペントサセウスＮＲＩＣ００９９株、ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイＮＲＩＣ１９３６株、ラクトバチルス・ブレビスＮＲＩＣ１７１３株がより好ましく、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＫＫ２２１株、ペディオコッカス・ペントサセウスＯＳ株（ＮＩＴＥ Ｐ−３５４）がさらに好ましい。

乳酸菌を入手する方法は特に限定されないが、例えば、市販や寄託されている乳酸菌を利用する方法、醤油諸味、漬物、市販の乳酸菌飲料などの乳酸菌含有物から分離して利用する方法などが挙げられる。

本発明の組成物において有効成分として含有される乳酸菌は、上記した乳酸菌のうち、ストレス条件下で培養が可能である乳酸菌であれば特に限定されない。ここでストレス条件とは、高塩濃度、高温又は低温、貧栄養、富栄養、低ｐＨ、高ｐＨなどの乳酸菌を通常培養する条件から外れている条件であり、好ましくは乳酸菌の倍加時間が好適な条件で培養した場合の時間よりも長くなるような条件である。

具体的には、高塩濃度によるストレス条件下での培養とは、例えば、塩分濃度が好ましくは０．５〜３０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは５〜１５％（ｗ／ｖ）を含む培地を使用して培養することが挙げられる。塩分濃度が０．５％（ｗ／ｖ）未満又は３０％（ｗ／ｖ）超の培地では、乳酸菌の増殖が極端に遅くなる場合がある。

また、高温又は低温によるストレス条件下での培養とは、例えば、乳酸菌の増殖に適した至適温度±５〜２０℃、好ましくは至適温度±１０℃にて培養することが挙げられる。具体的には、例えば、使用する乳酸菌の至適温度が３０℃であれば３５〜４５℃又は１５〜２５℃にて培養すること、使用する乳酸菌の至適温度が３５℃であれば４０〜５０℃又は２０〜３０℃にて培養することなどが挙げられる。

乳酸菌は、ストレス条件下で培養することにより、ストレスがない条件下で培養する場合と比べて、例えば、二本鎖ＲＮＡなどの菌体成分をより多く産生し得る。

ストレス条件下で培養が可能である乳酸菌は、いずれか１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。本発明の組成物において有効成分として含有される乳酸菌は、ストレス条件下で培養した乳酸菌であっても、通常の条件下で培養した乳酸菌であっても、いずれでもよい。例えば、ストレス条件下で培養した乳酸菌の１種又は２種以上と、通常の条件下で培養した乳酸菌の１種又は２種以上とを組み合わせて本発明の組成物に含有させ得る。

本発明の組成物における有効成分は、ストレス条件下で培養が可能である乳酸菌それ自体、すなわち、該乳酸菌の菌体に加えて、該乳酸菌の菌体成分及び該乳酸菌の培養物であり得る。乳酸菌の菌体は、例えば、乳酸菌の培養物を遠心分離などの通常知られている固液分離手段を用いて培地を除去することにより得られる菌体が挙げられる。

乳酸菌の菌体成分は、例えば、乳酸菌の菌体内に存在する、又は菌体外に分泌する精製又は非精製の成分が挙げられ、具体的には一本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ並びに一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡが挙げられる。

乳酸菌の培養物は、例えば、乳酸菌を培養して得た培養液そのものが挙げられる。本発明の組成物における有効成分としては、ストレス条件下で培養が可能である乳酸菌の菌体、菌体成分及び培養物であれば特に限定されないが、例えば、核酸を含有する菌体、菌体成分及び培養物が好ましい。核酸としては、ＲＮＡが好ましく、二本鎖ＲＮＡがより好ましい。

ストレス条件下で培養が可能である乳酸菌の菌体、菌体成分及び培養物は、それらのいずれか１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用することができる。具体的には、例えば、該乳酸菌の菌体、菌体成分及び培養物からＲＮＡ、好ましくは二本鎖ＲＮＡを単離して使用してもよい。

すなわち、本発明は、ストレス条件下で培養が可能である乳酸菌の菌体、菌体成分及び培養物から単離した二本鎖ＲＮＡを有効成分として含有する、インターフェロンλ産生促進用組成物にも関する。また、本発明は、ストレス条件下で培養が可能である乳酸菌の菌体、菌体成分及び培養物を得ること、および該乳酸菌の菌体、菌体成分及び培養物から二本鎖ＲＮＡを単離することを含む、インターフェロンλ産生促進用組成物の製造方法にも関する。

乳酸菌の菌体、菌体成分及び培養物からＲＮＡを単離する方法は特に限定されないが、例えば、乳酸菌の菌体から二本鎖ＲＮＡを単離する方法としては、特許文献３に記載の方法が挙げられる。

二本鎖ＲＮＡを含有する乳酸菌の菌体、菌体成分又は培養物を入手する方法は特に限定されない。具体的には、例えば、テトラジェノコッカス属に属する乳酸菌を食塩５〜１０％（ｗ／ｖ）を含有するＭＲＳ培地（ＢＤ社）に接種し、又はペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属及びロイコノストック属に属する乳酸菌を通常のＭＲＳ培地に植菌し、２０〜３５℃にて２４〜７２時間培養することにより、二本鎖ＲＮＡを含有する乳酸菌の菌体、菌体成分及び培養物を入手する方法が挙げられる。

乳酸菌の菌体、菌体成分及び培養物から二本鎖ＲＮＡを単離する方法の具体例としては、例えば、以下の方法が挙げられる。

すなわち、二本鎖ＲＮＡを含有する乳酸菌の菌体、菌体成分及び培養物を９０〜１００℃にて５〜２０分間の加熱殺菌処理に供して加熱殺菌処理液を得る。次いで加熱殺菌処理液を遠心分離等の固液分離手段に供して固形分を回収する。次いで固形分を洗浄して緩衝液に懸濁して懸濁液を得る。次いで懸濁液にリゾチームを添加して３５〜４０℃にて加温してリゾチーム処理液を得る。

次いでリゾチーム処理液にＳＤＳ及びＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを添加して３５〜４０℃にて加温してプロテナーゼ処理液を得る。次いでプロテナーゼ処理液をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール処理に供し、遠心分離等の固液分離手段により上清として粗核酸抽出液を得る。粗核酸抽出液には、ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡなどを含有する核酸混合物である。

次いで、粗核酸抽出液を、セルロースカラムクロマトグラフィーに供することによって、精製された二本鎖ＲＮＡを得ることができる。セルロースカラムクロマトグラフィー及びその後の高度な精製手段は、特許文献３の記載に準じて実施することができる。

乳酸菌の菌体、菌体成分及び培養物は、長期にわたりヒトに摂取されてきた実績のある天然物やその由来物であって安全性が高いことから、本発明の組成物は、実用性が高く、そのままで、又は加工することにより、経口的又は非経口的な形態で種々の用途に適用可能である。

本発明の組成物は、用途に応じて、例えば、他の成分と混合して使用することができる。このように、本発明の組成物は、ストレス条件下で培養が可能である乳酸菌の菌体、菌体成分又は培養物の他に、本発明の目的を達成し得る限り、種々のものを配合できる。

本発明の組成物には、例えば、糖質甘味料、安定化剤、乳化剤、澱粉、澱粉加工物、澱粉分解物、食塩、着香料、着色料、酸味料、風味原料、栄養素、果汁、卵などの動植物性食材、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、香油などの通常の食品加工に使用される添加物をさらに含有することができる。添加物の使用量は、本発明の課題の解決を妨げない限り特に限定されず、適宜設定され得る。

本発明の組成物は、通常用いられる形態であれば特に限定されず、例えば、固形状、液状、ゲル状、懸濁液状、クリーム状、シート状、スティック状、粉状、粒状、顆粒状、錠状、棒状、板状、ブロック状、ペースト状、カプセル状、カプレット状などの各形態を採り得る。

本発明の組成物は、例えば、経口用組成物である場合に、乳酸菌の菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらから単離した二本鎖ＲＮＡを、食道及び胃を経由して小腸へ送達し得るものとして、腸溶性組成物とすることが好ましい。腸溶性組成物は、胃酸では溶けずに小腸において溶解する形態の組成物であれば特に限定されず、例えば、耐酸性マイクロカプセルやリポソームの形態の組成物などが挙げられる。

本発明の組成物に含有されるストレス条件下で培養が可能である乳酸菌の菌体、菌体成分又は培養物の含有量は、インターフェロンλ産生促進作用が認められる量であれば特に限定されないが、経口用組成物としては、例えば、組成物全体に対して、好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上であり、上限は特に制限されないが通常５０質量％以下である。非経口用組成物としては、例えば、組成物全体に対して、好ましくは０．００００１質量％以上、より好ましくは０．０００１質量％以上であり、上限は特に制限されないが、通常１０質量％以下である。

本発明の組成物の摂取量は特に限定されず、摂取者の症状や体格に合わせて適宜設定すればよいが、例えば、ストレス条件下で培養が可能である乳酸菌を有効成分とする組成物の摂取量は通常１〜１０００ｍｇ／体重６０ｋｇ／日である。

本発明の組成物は、それ自体単独で、又は飲食品、医薬品などに添加して使用することができる。すなわち、本発明の別の態様は、本発明のインターフェロンλ産生促進用組成物を含有する飲食品であり、例えば、機能性飲食品、特定保健用飲食品、栄養機能飲食品、保健機能飲食品、特別用途飲食品、栄養補助飲食品、健康補助飲食品、サプリメント、美容飲食品、化粧品、医薬品、医薬部外品、動物飼料などやこれらの製品を製造するための原料が挙げられる。

本発明の製造方法は、ストレス条件下で培養が可能である乳酸菌を培養して、該乳酸菌の菌体、菌体成分又は培養物を得ることを少なくとも含む。有効成分であるインターフェロンλ産生促進作用を示す成分が得られる限り、乳酸菌の培養条件、有効成分である菌体、菌体成分又は培養物の採取方法は特に限定されない。

本発明の製造方法の一態様として、例えば、高塩濃度又は通常の塩濃度のＭＲＳ培地に乳酸菌を植菌し、該乳酸菌の至適温度±５〜２０℃にて１２〜７２時間培養することにより培養物を得る。次いで得られた培養物から培地を限外ろ過膜や遠心濃縮機などの通常知られている固液分離手段によって培地を除去して菌体を回収する。次いで得られた菌体を水や食塩水などで洗浄することにより、乳酸菌の菌体を得ることを含む方法が挙げられる。

このようにして得られた菌体、該菌体を水や食塩水などに懸濁した菌体懸濁液、該菌体を乾燥処理に供して得られる乾燥粉末などは、本発明の組成物の有効成分として使用可能である。乾燥処理の方法は特に限定されず、例えば、自然乾燥、風乾、噴霧乾燥、凍結乾燥などが挙げられる。

本発明の製造方法では、本発明の目的を達成し得る限り、上記した工程の前段若しくは後段又は工程中に、種々の工程や操作を加入することができる。

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。

［例１．テトラジェノコッカス属乳酸菌のインターフェロンλ産生促進試験］
テトラジェノコッカス属に属する乳酸菌を使用し、インターフェロンλ産生促進試験を実施した。

１．乳酸菌懸濁液の調製
乳酸菌としてテトラジェノコッカス・ハロフィラスＫＫ２２１株（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ Ｔｈ２２１、以下、ＫＫ２２１株とよぶ。）を使用した。本出願人は、ＫＫ２２１株を下記の条件で寄託した。
（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター
（２）連絡先：〒３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６
（現：千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２０号室）
電話番号０４３８−２０−５５８０
（３）受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９８７
（４）識別のための表示：Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ Ｔｈ２２１
（５）原寄託日：２００７年６月２５日
（６）ブダペスト条約に基づく寄託への移管日：２００８年７月１６日

まず、食塩１０％（ｗ／ｖ）を含有したＭＲＳ培地に、ＫＫ２２１株を１×１０^７個／ｍｌとなるように接種して乳酸菌原液を調製した。この乳酸菌原液を、３０℃にて４８〜７２時間静置培養した後、９５℃にて１０分間の煮沸殺菌処理を行うことにより、培養殺菌処理液を調製した。培養殺菌処理液を遠心分離して得た菌体を、生理食塩水にて洗浄した後、生理食塩水に１×１０^９個／ｍｌとなるように懸濁し、乳酸菌懸濁液を調製した。

２．インターフェロンλ産生促進試験
調製した乳酸菌懸濁液のインターフェロンλの産生促進活性を、非ウイルス感染健常者の末梢血より採取及び調製した樹状細胞を用いて以下のとおりに評価した。

（１）末梢血由来樹状細胞の採取及び調製
非ウイルス感染健常者の末梢血２００ｍｌから低密度勾配遠心法により単核球として、磁気細胞分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）、セルソーター（ＢＤ社）を用いて樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ；ＤＣ）を単離した。なお、樹状細胞は、ＢＤＣＡ４陽性であるｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ＤＣ（ｐＤＣ）；ＢＤＣＡ１が陽性であり、かつ、ＣＤ１９が陰性であるｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅ１（ｍＤＣ１）；及び、ＢＤＣＡ３が陽性であるｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅ２（ＢＤＣＡ３ＤＣ）の３種の表現型サブセットで単離した。

単離した各ＤＣの細胞数を測定し、５×１０^４個／ｍｌとなるように２５ｍＭ Ｄ−グルコース、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び１μＭ ピルビン酸ナトリウム含有ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ社）を用いて細胞原液を調製した。２４ウェル組織培養プレートに１ウェルあたり２００μｌの細胞原液を播種した。さらに、各ウェルに上記成分を含有するＩＭＤＭ培地又は乳酸菌懸濁液を、それぞれ１ウェルあたり０μｌ、０．１μｌ、１μｌ、１０μｌ及び１００μｌを加え（乳酸菌数／ＤＣ数＝０、１０、１００、１，０００及び１０，０００）、３７℃にて５％炭酸ガス培養器内で培養し、共培養開始後２４時間の培養上清を回収した。

（２）インターフェロンλ産生促進活性の測定
回収した培養上清を用いて、インターフェロンλ３を化学発光酵素免疫測定法により、スギヤマらの文献［Ｓｕｇｉｙａｍａ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ Ｒｅｓ．４２（１１）：１０８９−１０９９、２０１２］に記載の方法に準じて測定した。

ＤＣとしてＢＤＣＡ３ＤＣを用いた場合のインターフェロンλ３の測定結果を図１に示す。図１に示すように、共培養開始後２４時間目において、ＫＫ２２１株がＢＤＣＡ３ＤＣによるインターフェロンλ３産生を濃度依存的に促進したことが確認された。

乳酸菌数／ＤＣ数を１００に設定し、かつ、ＤＣとしてＢＤＣＡ３ＤＣ、ｐＤＣ及びｍＤＣ１を用いた場合のインターフェロンλ３の測定結果を図２に示す。図２に示すように、共培養の開始後２４時間目において、ＫＫ２２１株がＢＤＣＡ３ＤＣ（ＢＤＣＡ３陽性樹状細胞）及びｐＤＣ（ＢＤＣＡ４陽性樹状細胞）のインターフェロンλ３産生を促進したことが確認された。

図１及び図２の結果より、ＫＫ２２１株が、ヒト樹状細胞におけるインターフェロンλ３産生促進作用を有することが確認できた。

［例２．テトラジェノコッカス属乳酸菌から単離したＲＮＡのインターフェロンλ産生促進試験］
１．ＲＮａｓｅＡ処理
ＫＫ２２１株を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて５×１０^９個／ｍｌとなるように懸濁し、１０μｇ／ｍｌとなるように牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ社）をさらに添加して、ＲＮａｓｅＡ含有菌懸濁液を調製した。

このＲＮａｓｅＡ含有菌懸濁液を、３７℃にて２時間インキュベートすることによる酵素処理に供して、酵素処理液を得た。本酵素処理において、ＮａＣｌ非存在下では１本鎖ＲＮＡ及び２本鎖ＲＮＡの両方が分解される。

得られた酵素処理液を遠心分離することにより回収した菌体を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で２回洗浄した後に、生理食塩水に１×１０^９個／ｍｌとなるように懸濁し、ＲＮＡ分解乳酸菌懸濁液を調製した。

２．インターフェロンλ産生促進活性の測定
ＲＮＡ分解乳酸菌懸濁液又は例１で調製した未処理乳酸菌混濁液と、例１で調製したＢＤＣＡ３ＤＣとを一定の割合で混合し（ＢＤＣＡ３ＤＣ数：乳酸菌数＝１：１００）、これらの共培養を行った。共培養後の上清を培養開始２４時間後に回収し、例１と同様にして化学発光酵素免疫測定法により、上清中のインターフェロンλ濃度を測定した。結果を図３に示す。

図３に示すように、ＲＮＡ分解乳酸菌懸濁液及び未処理乳酸菌混濁液のいずれを用いてもＢＤＣＡ３ＤＣのインターフェロンλ産生を促進することが確認された。しかし、ＲＮＡ分解乳酸菌懸濁液において、インターフェロンλ産生促進活性が低下することが確認された。この結果から、ストレス条件下で培養が可能である乳酸菌内のＲＮＡが樹状細胞を活性化してインターフェロンλの産生を促進していることがわかった。ＢＤＣＡ３ＤＣはトル様受容体（ＴＬＲ）３の発現が非常に高いという特徴がある。この受容体は二本鎖ＲＮＡを認識することが知られており、菌体内の二本鎖ＲＮＡの含量、もしくは総核酸中の二本鎖ＲＮＡの割合が高いほどインターフェロンλの産生促進が強いことが考えられる。

［例３．ＴＬＲ３経路阻害剤を使用したインターフェロンλ産生促進試験］
乳酸菌の構成成分を認識すると想定されるＢＤＣＡ３ＤＣにおけるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）に着目し、エンドソームへの取り込みを阻害し、細胞質内に存在するＴＬＲ３への会合を阻害するクロロキン、もしくは２本鎖ＲＮＡを認識するＴＬＲ３を介するシグナル伝達のアダプター分子であるＴＲＩＦの阻害剤（製品名「ＴＲＩＦ／ＴＩＣＡＭ１ Ｐｅｐｔｉｄｅ」；ＮＯＶＵＳ社）を用いて、インターフェロンλ産生促進活性を評価した。

ＴＬＲ３リガンドとして化合物Ｐｏｌｙ ＩＣ（製品名「Ｐｏｌｙ ＩＣ」；Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）を用いた。樹状細胞の調製、乳酸菌懸濁液の調製及びインターフェロンλ産生促進活性の測定は例１及び例２と同様の方法で行った。なお、乳酸菌懸濁液については、例１で調製した未処理乳酸菌懸濁液を用いた。共培養開始後２４時間目の上清中のインターフェロンλ濃度を測定した。

乳酸菌懸濁液及びＰｏｌｙ ＩＣの添加別に、クロロキンの添加の有無によるインターフェロンλ産生促進活性を測定した結果を図４に示す。図４に示すように、乳酸菌懸濁液及びＰｏｌｙＩＣのいずれを添加した場合でも、クロロキン１０μＭを添加することによりインターフェロンλ産生促進活性が低下することが確認された。

乳酸菌懸濁液を添加し、さらにＴＲＩＦ阻害剤を０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌ添加したことによるインターフェロンλ産生促進活性を測定した結果を図５に示す。ＴＲＩＦ阻害剤添加により、ＴＲＩＦ阻害剤の濃度依存的にインターフェロンλ産生促進活性が低下したことが確認された。

図４及び図５の結果より、ストレス条件下で培養が可能である乳酸菌によるＢＤＣＡ３陽性樹状細胞におけるインターフェロンλ産生促進活性は、ＴＲＩＦが関与するシグナル、つまりＴＬＲ３からのシグナルに関係がある可能性が示唆された。

［例４．種々の乳酸菌を使用したインターフェロン産生促進試験］
ＫＫ２２１株に加えて、インターフェロンλ産生を誘導することが知られるラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）に属するＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株（特許文献１）を使用し、インターフェロンλ産生促進試験を実施した。

ＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株は、食塩を含有しないＭＲＳ培地に１×１０^７個／ｍｌとなるように接種して乳酸菌原液を調製した。この乳酸菌原液を、３０℃にて２４時間静置培養した後、９５℃にて１０分間の煮沸殺菌処理を行うことにより、培養殺菌処理液を調製した。培養殺菌処理液を遠心分離して得た菌体を、生理食塩水にて洗浄した後、生理食塩水に１×１０^９個／ｍｌとなるように懸濁し、乳酸菌懸濁液を調製した。

ＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株を用いて調製した乳酸菌懸濁液と、例１でＫＫ２２１株を用いて調製した乳酸菌懸濁液とについて、例１と同様に樹状細胞を調製して、乳酸菌数／ＤＣ数＝１００になるような条件下で、各乳酸菌によるインターフェロンλ産生促進活性の測定を実施した。結果を図６に示す。

図６に示すように、驚くべきことに、特許文献１ではＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株がインターフェロンλの産生を促進するという記載があったものの、これらの菌株を用いた乳酸菌懸濁液ではＢＤＣＡ３ＤＣに対してインターフェロンλ産生誘導作用が見られなかった。

インターフェロンλの発現はインターフェロンαによって誘導されることが報告されていることから（例えば、Ｊ．Ｖｉｒａｌ、２００６、Ｖｏｌ．８０、Ｎｏ．1９、ｐｐ．４５０１−４５０９を参照）、特許文献１に記載されているＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株のインターフェロンλの産生誘導は、ＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株によるインターフェロンα産生誘導の結果として生じたものと推察される。

なお、同様にして、ＫＫ２２１株、ＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株を用いて調製した乳酸菌懸濁液とｐＤＣとを、乳酸菌数／ＤＣ数＝１００になるように調製して共培養することにより、各乳酸菌によるインターフェロンα産生促進活性の測定を実施した。インターフェロンαは、回収した培養上清を用いて、インターフェロンαのＣＢＡ（ｃｙｔｏｍｅｔｏｒｉｃ ｂｅａｄｓ ａｓｓａｙ；ＢＤ社）を用いて、測定した。結果を図７に示す。

図７に示すように、特許文献１が示すとおりに、ＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株は、ｐＤＣに対してインターフェロンα産生促進活性があることが示された。また、図２に示す結果より、ｐＤＣについてもインターフェロンλ産生促進活性がみられることから、特許文献１に記載されているＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株によるインターフェロンλ産生促進作用は、ｐＤＣに対する作用であることが示唆される。

［例５．ＫＫ２２１株によるサイトカイン産生促進試験］
例１に準じて、ＫＫ２２１株を用いて調製した乳酸菌懸濁液又はＰｏｌｙ ＩＣとＢＤＣＡ３ＤＣとを、乳酸菌数／ＤＣ数＝１００になるように調製して共培養することにより、各種サイトカイン産生促進活性の測定を実施した。

なお、ＴＮＦα、ＩＬ−１０、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ７０は、それぞれＣＢＡ（ｃｙｔｏｍｅｔｏｒｉｃ ｂｅａｄｓ ａｓｓａｙ；ＢＤ社）を用いて測定した。結果を図８Ａおよび図８Ｂに示す。

図８Ａおよび図８Ｂに示すように、Ｐｏｌｙ ＩＣはインターフェロンλ（ＩＬ２８Ｂ）に加えて、ＴＮＦα、インターフェロンα及びＩＬ−６などを非特異的に産生促進していることに対して、ＫＫ２２１株はインターフェロンλに対して特異的に産生促進していることが確認できた。

Ｐｏｌｙ ＩＣによって産生誘導されるＴＮＦαは典型的な炎症性サイトカインであり、ＴＮＦαにより生体内では炎症反応が起こる。それに対して、ＫＫ２２１株は、炎症反応を起こすことなく、インターフェロンλを特異的に産生促進できることから、インターフェロンλによって期待される生理作用を誘起するものとして非常に有用であることが確認された。

［例６．各種乳酸菌の生菌数あたりの二本鎖ＲＮＡの量及び割合の評価］
ＫＫ２２１株、ＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株の生菌数あたりの二本鎖ＲＮＡ（以下ｄｓＲＮＡとも略す）量、総核酸量及び総核酸中の二本鎖ＲＮＡの割合（ｄｓＲＮＡ量／総核酸量×１００）を以下のとおりに測定した。

食塩１０％（ｗ／ｖ）を含有したＭＲＳ培地に、ＫＫ２２１株を１×１０^７個／ｍｌとなるように接種して乳酸菌原液を調製した。この乳酸菌原液を、３０℃にて４８時間静置培養して、ＫＫ２２１株培養液を得た。

また、食塩を含有しないＭＲＳ培地に、ＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株をそれぞれ１×１０^７個／ｍｌとなるように接種して乳酸菌原液を調製した。この乳酸菌原液を、３０℃にて２４時間静置培養して、ＪＣＭ２０１０１株培養液及びＪＣＭ５８０５株培養液を得た。

ＫＫ２２１株培養液の一部を採取し段階希釈して、食塩５％（ｗ／ｖ）を含有したＭＲＳ寒天培地を用いて培養することによりコロニー数をカウントした。また、ＪＣＭ２０１０１株培養液及びＪＣＭ５８０５株培養液の一部を採取し段階希釈して、食塩を含有しないＭＲＳ寒天培地を用いて培養することによりコロニー数をカウントした。

ＫＫ２２１株培養液、ＪＣＭ２０１０１株培養液及びＪＣＭ５８０５株培養液のその余の部分について、９５℃にて１５分間の煮沸殺菌処理を行うことにより、各培養殺菌処理液を調製した。カウントしたコロニー数に基づいて、各培養殺菌処理液の１×１０^１０ｃｆｕ相当液量を採取した。

採取した各液量を８５００×ｇで１５分間遠心分離し固形分を回収した。次いで固形分をＳＴＥ緩衝液で洗浄してＳＴＥ緩衝液に懸濁して懸濁液を得た。次いで懸濁液にＳＴＥ緩衝液に懸濁したリゾチーム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）溶液（終濃度５ｍｇ／ｍＬ）を添加して３７℃にて３０分間加温してリゾチーム処理液を得た。次いでリゾチーム処理液に１０％ＳＤＳ（和光純薬工業）及びＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（タカラバイオ社）を添加して３７℃にて１時間加温してプロテナーゼ処理液を得た。

次いでプロテナーゼ処理液をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（和光純薬工業）で処理し、８５００×ｇで１５分間遠心分離し上清として粗核酸抽出液を得た。粗核酸抽出液に含まれる総核酸量を超微量分光光度計（製品名「ナノドロップ」、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて測定した。粗核酸抽出液から、ＥＬＩＳＡ法で二本鎖ＲＮＡを定量した。

採取した各液量からＲＮＡを抽出し、総核酸量を超微量分光光度計（製品名「ナノドロップ」、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて測定した。抽出したＲＮＡから、さらに二本鎖ＲＮＡを抽出し、ＥＬＩＳＡ法で定量した。

測定して得られた二本鎖ＲＮＡ量、総核酸量及び総核酸中の二本鎖ＲＮＡの割合をそれぞれ図９〜１１に示す。検定は、ＫＫ２２１株とＪＣＭ２０１０１株又はＪＣＭ５８０５株との間における２群間比較（対応のないｔ検定）により行った。有意水準は、危険率５％（図中の「＊」）又は１％（「＊＊」）とした。

図９〜１１に示すように、ＫＫ２２１株の二本鎖ＲＮＡ量はＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株の二本鎖ＲＮＡ量に対して大きかった。特に、ＫＫ２２１株の総核酸中の二本鎖ＲＮＡの割合は、ＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株のその割合に対して、統計的有意に大きかった。この結果から、ストレス条件下で培養が可能である乳酸菌内の二本鎖ＲＮＡが樹状細胞を活性化してインターフェロンλの産生を促進しており、二本鎖ＲＮＡ量が多いほど、又は総核酸中の二本鎖ＲＮＡの割合が高いほどインターフェロンλ産生促進作用が向上すると考えられる。

また、図９および図１１それぞれに示すように、生菌数あたりの二本鎖ＲＮＡ量が１２１８４〜１３８１９ｎｇ／ｍＬより多い量である、又は生菌数あたりの総核酸中の二本鎖ＲＮＡの割合が２．６４５４〜３．１５３０％より多い量である乳酸菌は、ＢＤＣＡ３ＤＣに対してインターフェロンλ産生促進作用を有する乳酸菌であることがわかった。

［例７．各種乳酸菌の乾燥菌体量あたりの二本鎖ＲＮＡの量及び割合の評価］
ＫＫ２２１株、ＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株の乾燥菌体量あたりのｄｓＲＮＡ量、総核酸量及び総核酸中の二本鎖ＲＮＡの割合を以下のとおりに測定した。

食塩１０％（ｗ／ｖ）を含有したＭＲＳ培地に、ＫＫ２２１株を１×１０^７個／ｍｌとなるように接種して乳酸菌原液を調製した。この乳酸菌原液を、３０℃にて４８時間静置培養して、ＫＫ２２１株培養液を得た。

また、食塩を含有しないＭＲＳ培地に、ＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株をそれぞれ１×１０^７個／ｍｌとなるように接種して乳酸菌原液を調製した。この乳酸菌原液を、３０℃にて２４時間静置培養して、ＪＣＭ２０１０１株培養液及びＪＣＭ５８０５株培養液を得た。

ＫＫ２２１株培養液、ＪＣＭ２０１０１株培養液及びＪＣＭ５８０５株培養液を、９５℃にて１５分間の煮沸殺菌処理に供することにより、各培養殺菌処理液を調製した。各培養殺菌処理液を遠心分離して得た菌体を、生理食塩水にて洗浄した後、再度遠心分離して得た３菌体を凍結乾燥させた。

採取した凍結乾燥粉末５ｍｇを用いて、例６と同様にして、ＲＮＡ抽出、総核酸量測定、二本鎖ＲＮＡ抽出及び二本鎖ＲＮＡ量測定を実施した。各凍結乾燥粉末５ｍｇ中の二本鎖ＲＮＡ量、総核酸量及び総核酸中の二本鎖ＲＮＡの割合をそれぞれ図１２〜１４に示す。

図１２〜１４に示すように、ＫＫ２２１株の総核酸中の二本鎖ＲＮＡの割合は、ＪＣＭ２０１０１株及びＪＣＭ５８０５株のその割合に対して、統計的有意に大きかった。この結果から、ストレス条件下で培養が可能である乳酸菌内の二本鎖ＲＮＡが樹状細胞を活性化してインターフェロンλの産生を促進しており、総核酸中の二本鎖ＲＮＡの割合が高いほどインターフェロンλ産生促進作用が向上すると考えられる。

また、図１４に示すように、乾燥菌体量あたりの総核酸中の二本鎖ＲＮＡの割合が３．１６７３〜３．５８９８％より多い量である乳酸菌は、ＢＤＣＡ３ＤＣに対してインターフェロンλ産生促進作用を有する乳酸菌であることがわかった。

［例８．各種乳酸菌の生菌数あたりの二本鎖ＲＮＡ量の評価］
培養殺菌処理液の５×１０^９ｃｆｕ相当液量を用いた以外は、例６と同様にして、各種乳酸菌の生菌数あたりの二本鎖ＲＮＡ量を測定した。

使用した乳酸菌は、テトラジェノコッカス・ハロフィラス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）ＫＫ２２１株、Ｋ１１２１株及びＫ１１４２株；ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ）Ｋ１株、Ｋ４１株及びＫ１１８５株；ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）Ｋ５９８株、Ｋ１１８２株及びＫ１１８３株；並びに、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）Ｋ４３６株、Ｋ５５０株及びＫ１１１８株を用いた。

これらの乳酸菌のうち、Ｋ１１８５株及びＫ１１１８株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）に寄託されており、受託番号はそれぞれＮＢＲＣ１５８９３及びＮＢＲＣ１００９３３である。

また、Ｋ１１８２株及びＫ１１８３株は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より分譲を受けたものであり、ＡＴＣＣ番号はそれぞれ１３４１９及び２５９７５である。

Ｋ１１２１株、Ｋ１１４２株、Ｋ１株、Ｋ４１株、Ｋ５９８株、Ｋ４３６株、Ｋ５５０株はキッコーマン株式会社において発酵食品等から分離した乳酸菌である。

その余の乳酸菌は、本願出願人により分離及び単離された菌株である。また、ポジティブ・コントロールとして、ＳｏｙＬａｃｔｉｃ（登録商標；キッコーマン社）を使用した。ポジティブ・コントロールの二本鎖ＲＮＡ測定値を１００とした場合の、各乳酸菌の二本鎖ＲＮＡ測定値の測定結果を図１５に示す。

図１５に示すように、テトラジェノコッカス・ハロフィラスの３株及びラクトバチルス・サケイの３株の二本鎖ＲＮＡ量は多かったのに対し、ラクトバチルス・サリバリウスの３株及びラクトコッカス・ラクティスの２株は二本鎖ＲＮＡ量が少なかった。

上述したように、ストレス条件下で培養が可能である乳酸菌体内の二本鎖ＲＮＡがＴＬＲ３を介して樹状細胞を活性化してインターフェロンλの産生を促進しており、二本鎖ＲＮＡ量が多いほどインターフェロンλ産生促進作用が向上すると考えられる。したがって、これらの結果より、テトラジェノコッカス・ハロフィラスの３株及びラクトバチルス・サケイの３株は、ＢＤＣＡ３ＤＣに対するインターフェロンλ産生促進作用を有する可能性が示唆された。

また、ラクトバチルス・サケイＫ１株及びＫ４１株について、各温度で培養して得られた培養殺菌処理液の１×１０^１０ｃｆｕ相当液量を用いて、生菌数あたりの二本鎖ＲＮＡ量を測定した結果を図１６Ａ及び図１６Ｂ並びに図１７Ａ及び図１７Ｂにそれぞれ示す。

図１６Ａ及び図１６Ｂ並びに図１７Ａ及び図１７Ｂに示すように、ラクトバチルス・サケイの２株の二本鎖ＲＮＡ量は、至適温度よりも高温（３８℃若しくは３６℃）下又は低温（２０℃若しくは２３℃）下で培養した場合に、二本鎖ＲＮＡ量が多くなることを確認した。

これらの結果より、ストレス条件下で培養した乳酸菌は、二本鎖ＲＮＡ量が多くなることから、ＢＤＣＡ３ＤＣに対するインターフェロンλ産生促進作用を有する可能性が示唆された。

本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１６年４月４日付けで出願された日本特許出願（特願２０１６−０７５３２３号）に基づいており、その全体が引用により援用される。

本発明の組成物及び本発明の製造方法によって得られる組成物は、経口的及び非経口的のいずれの態様においても適用可能な有効成分を含むものであり、インターフェロンλ産生促進作用を通じて、抗ウイルス活性、免疫賦活活性、抗感染症活性、抗Ｂ型肝炎活性、抗Ｃ型肝炎活性、抗増殖活性、抗腫瘍活性、抗癌活性を期待する摂取者にとって有用なものであり、このような摂取者の健康及び福祉に資する飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品、サプリメントなどとして利用可能なものである。

Claims (11)

1. ストレス条件下で培養が可能である乳酸菌の菌体、菌体成分又は培養物を有効成分として含有する、インターフェロンλ産生促進用組成物であって、
   前記乳酸菌は、テトラジェノコッカス・ハロフィラス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）ＫＫ２２１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９８７）である、前記インターフェロンλ産生促進用組成物。
2. 前記インターフェロンλ産生促進用組成物は、ＢＤＣＡ３ＤＣに対するインターフェロンλ産生促進用組成物である、請求項１に記載のインターフェロンλ産生促進用組成物。
3. 前記インターフェロンλは、インターフェロンλ３である、請求項１又は２に記載のインターフェロンλ産生促進用組成物。
4. 前記菌体、前記菌体成分及び前記培養物は、それぞれ核酸を含有する菌体、菌体成分及び培養物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のインターフェロンλ産生促進用組成物。
5. 前記ストレス条件下で培養が可能である乳酸菌は、菌体１×１０^１０ｃｆｕあたり１５，０００ｎｇ／ｍｌ以上の二本鎖ＲＮＡを含有する乳酸菌及び菌体１×１０^１０ｃｆｕあたり総核酸中の二本鎖ＲＮＡの割合が３．５％以上である乳酸菌の少なくとも一方である、請求項４に記載のインターフェロンλ産生促進用組成物。
6. 前記インターフェロンλ産生促進用組成物が、インターフェロンλ産生促進用腸溶組成物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のインターフェロンλ産生促進用組成物。
7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のインターフェロンλ産生促進用組成物を含有するインターフェロンλ産生促進用飲食品。
8. ストレス条件下で培養が可能である乳酸菌を培養して、該乳酸菌の菌体、菌体成分又は培養物を得ることを含む、インターフェロンλ産生促進用組成物の製造方法であって、
   前記乳酸菌は、テトラジェノコッカス・ハロフィラス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）ＫＫ２２１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９８７）である、前記製造方法。
9. ストレス条件下で培養が可能である乳酸菌の菌体、菌体成分又は培養物を使用してインターフェロンλの産生を促進する方法（ただし、ヒトへの投与を除く）であって、
   前記乳酸菌は、テトラジェノコッカス・ハロフィラス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）ＫＫ２２１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９８７）である、前記方法。
10. インターフェロンλ産生促進用組成物の製造のためのストレス条件下で培養が可能である乳酸菌の菌体、菌体成分又は培養物の使用であって、
    前記乳酸菌は、テトラジェノコッカス・ハロフィラス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）ＫＫ２２１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９８７）である、前記使用。
11. インターフェロンλの産生を促進するためのストレス条件下で培養が可能である乳酸菌の菌体、菌体成分又は培養物の使用（ただし、ヒトへの投与を除く）であって、
    前記乳酸菌は、テトラジェノコッカス・ハロフィラス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）ＫＫ２２１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９８７）である、前記使用。

Images