JP6750021B2 - 線虫の嗅覚に基づく匂い物質に対する走性行動の評価方法、並びに該評価方法に用いるシャーレおよび行動評価系 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照

本出願は、日本国において２０１６年９月１２日に出願された特許出願（特願２０１６−１７７６６４号）、および、２０１７年３月３１日に出願された特許出願（特願２０１７−６９７６２号）の優先権の利益を享受する出願であり、これら出願の全体は、引用されることにより本願に取り込まれるものである。

本発明は、線虫の嗅覚に基づく匂い物質に対する走性行動の評価方法、並びに該評価方法に用いるシャーレおよび行動評価系に関する。

線虫は、生物研究においてモデル生物として世界中で広く飼育され、研究されているポピュラーな生物であり、飼育が容易であるという特徴を有する。線虫は神経が細胞レベルですべて明らかになっており、行動解析の研究が盛んにおこなわれている。

線虫の行動評価では、９ｃｍの丸形シャーレを用いる。これは、線虫の移動距離を長く確保することが、線虫の行動評価の精度を維持するために不可欠であるためである。本発明者らは、線虫の嗅覚を利用すると、高感度かつ高精度にがんを検出できることを実証してきた（非特許文献１および特許文献１）。

上述の通り、従来、線虫の嗅覚を介した走性行動を評価するために、シャーレ上に被検物質と線虫とを一定以上隔離させて配置し、走性行動をシャーレ上の線虫の配置を観察していた。線虫の走性行動は、揺らぎを有し、必ずしも被験物質に対して最短距離で移動するわけではなく、迂回しながらの走性を示すこともあるため、走性行動の評価結果を精度を向上させるためには、一般的な行動評価と同様に、一定以上の長距離を移動した線虫のみを評価するといった手法が必要であると考えられていたためである。加えて、匂いは、遠隔的に伝達できるため、被検試料と線虫との距離を大きく離して配置して試験することが可能であり、被検試料と線虫との距離が大きく離れている方が正確に走性行動を評価できると考えられており、このことから匂いは被検試料と線虫との距離を大きく離す評価系に適していると信じられていた。したがって、嗅覚を介した走性行動の評価においても、一般的な行動評価の系が用いられることが前提となっていた。

ところで、線虫に一定以上の長距離を移動させるためには、一定以上の長時間にわたって線虫が動くことを許す必要がある。一方で、一定以上の長時間にわたって嗅覚を刺激すると、線虫の嗅覚は感作を起こしてランダムに動き始めるため嗅覚による走性行動の評価が不能となる。したがって、線虫の嗅覚を介した走性行動を評価する際には、殺線虫剤（例えばアジ化ナトリウムなどの劇薬）を用い、走性行動を示した線虫の動きを止める工夫がなされていた（非特許文献１および特許文献１）。

ＷＯ２０１５／８８０３９

Hirotsu T. et al., PLOS ONE, 10(3): e0118699, 2015

本発明は、線虫の嗅覚に基づく匂い物質に対する走性行動の評価方法、並びに該評価方法に用いるシャーレおよび行動評価系を提供する。

本発明者らは、一般的な行動評価とは異なり、嗅覚を介した走性評価の場合には、近距離に被検試料と線虫とを配置すると、意外にも従来よりも精度高く走性行動を評価できることを見出した。本発明者らはまた、この知見に基づいて、線虫の嗅覚を介した走性行動を評価することに適したシャーレを発明した。本発明は、これらの知見および発明に基づくものである。

本発明では、以下の発明が提供される。
（１）略角型形状（例えば、長手方向が３〜６ｃｍ、横手方向が１〜３ｃｍまたは３ｃｍ〜６ｃｍである略角型形状）の底面を有するシャーレであって、底面は、長手方向に片側の末端から別の末端に向かって第一の領域、第二の領域および第三の領域の少なくとも３つの領域に区分けされ、第二の領域が、第一の領域と第三の領域との境界に配置されている、シャーレ。
（２）区分けが、底面の上面に対する凹凸形状若しくは印刷、または下面に対する凹凸形状若しくは印刷による区分けである、上記（１）に記載のシャーレ。
（３）第一の領域と第三の領域とを区別する表示を有する、上記（１）または（２）に記載のシャーレ。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のシャーレが複数連結した、マルチプレート。
（５）被検試料の匂いに対する線虫の走性行動を評価する方法であって、
ａ）被検試料が配置されたシャーレであって、被検試料から１ｃｍ〜３ｃｍ離れた底面の領域または部位に線虫が配置されたシャーレを提供することと、
ｂ）被検試料と線虫がシャーレに配置されてから３〜１５分後に線虫の底面上での配置を観察することと、
ｃ）被検試料に対して誘引行動を示したか忌避行動を示したかを、観察された線虫の配置から評価することと
を含む、方法。
（６）被検試料が、がん患者であると疑われる対象から得られた試料である、上記（５）に記載の方法。
（７）被検試料が、がん患者であると疑われる対象から得られた尿である、上記（６）に記載の方法。
（８） ｃ）において線虫が被検試料に対して誘引行動を示した場合には、被検試料にがんに由来する誘引物質が含まれると判定すること、または、線虫が被検試料に対して忌避行動を示した場合には、被検試料にがんに由来する誘引物質が含まれていないと判定することをさらに含む、上記（６）または（７）に記載の方法。
（９）殺線虫剤を用いない、上記（５）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０） ａ）において、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のシャーレまたは上記（４）に記載のマルチプレートに含まれるいずれか１つのシャーレを用いる、上記（５）〜（９）のいずれかに記載の方法。

本発明はまた、上記発明によるシャーレの小型化に伴って、シャーレ内壁と固形培地の隙間に潜り込む線虫数が増大し、観察可能な線虫数が時間経過と共に減少するという新しい課題に対して解決手段を提供する。

この点に関して、本発明者らは、固形培地に線虫の厚み以上の面状のくぼみを形成させ、くぼみを完全に覆う蓋をして、そのくぼみ内で嗅覚に基づく走性行動評価を行うと、線虫が行動観察面から逃げ出すことができず、行動評価時に観察可能な線虫数が飛躍的に増大することを見出した。本発明は、これらの知見にも基づくものである。

（１Ａ）略角型形状（例えば、長手方向が３〜６ｃｍ、横手方向が１〜３ｃｍまたは３ｃｍ〜６ｃｍである略角型形状）の底面と底面の周囲を囲む側壁とを有する線虫の走性行動評価系であって、底面は、目印によって長手方向に片側の末端から別の末端に向かって第一の領域、第二の領域および第三の領域の少なくとも３つの領域に区分けされ、第二の領域が、第一の領域と第三の領域との境界に配置されている、走性行動評価系。
（２Ａ）目印が、底面の上面に対する凹凸形状若しくは印刷、または下面に対する凹凸形状若しくは印刷による目印である、上記（１Ａ）に記載の走性行動評価系。
（３Ａ）第一の領域と第三の領域とを区別する表示を有する、上記（１Ａ）または（２Ａ）に記載の走性行動評価系。
（４Ａ）上記（１Ａ）〜（３Ａ）のいずれかに記載の走性行動評価系が複数連結した、マルチプレート。
（５Ａ）略角型形状（例えば、長手方向が３〜６ｃｍ、横手方向が１〜３ｃｍまたは３ｃｍ〜６ｃｍ）、深さが線虫の厚み以上であり２ｍｍ以下である略角型面形状のくぼみを表面に有する固形培地が導入されたシャーレと、前記くぼみを上部から覆う板を備えた線虫の走性行動評価系。
（６Ａ）シャーレの底面の前記くぼみに対応する部位が、目印によって長手方向に片側の末端から別の末端に向かって第一の領域、第二の領域および第三の領域の少なくとも３つの領域に区分けされ、第二の領域が、第一の領域と第三の領域との境界に配置されている、上記（５Ａ）に記載の走性行動評価系。
（７Ａ）前記くぼみを上部から覆う板の前記くぼみに対応する部位が、目印によって長手方向に片側の末端から別の末端に向かって第一の領域、第二の領域および第三の領域の少なくとも３つの領域に区分けされ、第二の領域が、第一の領域と第三の領域との境界に配置されている、上記（５Ａ）に記載の走性行動評価系。
（８Ａ）目印が、底面の上面に対する凹凸形状若しくは印刷、または下面に対する凹凸形状若しくは印刷による目印である、上記（６Ａ）または（７Ａ）に記載の走性行動評価系。
（９Ａ）第一の領域と第三の領域とが接しており、第二の領域が閉じた形状である、上記（１Ａ）〜（８Ａ）のいずれかに記載の線虫の走性行動評価系。
（１０Ａ）蓋を閉じたときに前記底面に対向する面上に被検試料配置部位を備える蓋を備えた、上記（１Ａ）〜（４Ａ）のいずれかに記載の線虫の走性行動評価系。
（１１Ａ）第二の領域上に線虫が配置された、上記（１Ａ）〜（１０Ａ）のいずれかに記載の線虫の走性行動評価系。
（１２Ａ）第一の領域または第三の領域に被検試料が配置された、上記（１Ａ）〜（１１Ａ）のいずれかに記載の線虫の走性行動評価系。
（１３Ａ）被検試料の匂いに対する線虫の走性行動を評価する方法であって、
ａ）被検試料が配置されたシャーレであって、被検試料から１ｃｍ〜３ｃｍ離れた底面の領域または部位に線虫が配置されたシャーレを提供することと、
ｂ）被検試料と線虫がシャーレに配置されてから３〜１５分後に線虫の底面上での配置を観察することと、
ｃ）被検試料に対して誘引行動を示したか忌避行動を示したかを、観察された線虫の配置から評価することと
を含む、方法。
（１４Ａ）被検試料が、がん患者であると疑われる対象から得られた試料である、上記（１３Ａ）に記載の方法。
（１５Ａ）被検試料が、がん患者であると疑われる対象から得られた尿である、上記（１４Ａ）に記載の方法。
（１６Ａ）ｃ）において線虫が被検試料に対して誘引行動を示した場合には、被検試料にがんに由来する誘引物質が含まれると判定すること、または、線虫が被検試料に対して忌避行動を示した場合には、被検試料にがんに由来する誘引物質が含まれていないと判定することをさらに含む、上記（１４Ａ）または（１５Ａ）に記載の方法。
（１７Ａ）殺線虫剤を用いない、上記（１３Ａ）〜（１６Ａ）のいずれかに記載の方法。
（１８Ａ）ａ）において、上記（１Ａ）〜（３Ａ）のいずれかに記載の走性行動評価系若しくは上記（４Ａ）に記載のマルチプレート、または上記（５Ａ）〜（１２Ａ）のいずれかに記載の走性行動評価系のいずれか１つを用いる、上記（１３Ａ）〜（１７Ａ）のいずれかに記載の方法。
（１９Ａ）ａ）において、以下のシャーレ：
（ｉ）略角型形状（例えば、長手方向が３〜６ｃｍ、横手方向が１〜３ｃｍまたは３ｃｍ〜６ｃｍである略角型形状）の底面を有するシャーレであって、底面は、長手方向に片側の末端から別の末端に向かって第一の領域、第二の領域および第三の領域の少なくとも３つの領域に区分けされ、第二の領域が、第一の領域と第三の領域との境界に配置されている、シャーレ；若しくは、
（ｉｉ）略角型形状（例えば、長手方向が３〜６ｃｍ、横手方向が１〜３ｃｍまたは３ｃｍ〜６ｃｍ）、深さが線虫の厚み以上であり２ｍｍ以下である略角型面形状のくぼみを表面に有する固形培地が導入されたシャーレと、前記くぼみを上部から覆う板を備えた線虫の走性行動評価系；または
（ｉｉｉ）上記（ｉ）のシャーレまたは上記（ｉｉ）の走性行動評価系が複数連結したマルチプレートに含まれるいずれか１つを用いる、上記（１３Ａ）〜（１８Ａ）のいずれかに記載の方法。

本発明によれば、線虫の嗅覚に基づく走性行動の評価の精度が向上する上に、測定時間が大幅に短縮されるという利点およびアジ化ナトリウムなどの劇物の使用が不要とできるという利点がある。

図１Ａは、本発明の第一の実施形態のシャーレ１００の平面図を示す。図中の二点鎖線は、底面の区分けパターンの境界線を示す。 図１Ｂは、本発明の第一の実施形態のシャーレ１００の正面図を示す。 図１Ｃは、本発明の第一の実施形態の変形例１００Ａの平面図を示す。図中の二点鎖線は、底面の区分けパターンの境界線を示す。 図１Ｄは、蓋１５０をかぶせた本発明の第一の実施形態のシャーレ１００の正面図を示す。 図１Ｅは、蓋１５０の平面図を示す。 図１Ｆは、蓋１５０の変形例１５０Ａの平面図を示す。 図１Ｇは、変形例１５０Ａの一態様における、１５１を通る直線での断面図を示す。 図１Ｈは、変形例１５０Ａの一態様における、１５１を通る直線での断面図を示す。 図１Ｉは、本発明の第一の実施形態のシャーレ１００のＡ−Ａ断面図（図１Ａ参照）を示す。 図２Ａは、本発明の第二の実施形態のシャーレ２００の平面図を示す。図中の二点鎖線は、底面の区分けパターンの境界線を示す。 図２Ｂは、本発明の第二の実施形態の変形例２００Ａの平面図を示す。図中の二点鎖線は、底面の区分けパターンの境界線を示す。 図３Ａは、本発明のマルチプレートの一例５００の平面図を示す。 図３Ｂは、本発明のマルチプレートの一例５００Ａの平面図を示す。 図３Ｃは、本発明の蓋６００付のマルチプレートの一例５００の正面図を示す。 図４は、本実施例において作成された５ｃｍ×２ｃｍの角形シャーレの写真を示す。写真中、白い細かい点で示されるのが線虫である。 図５は、本発明のシャーレを用いると、誘引物質（イソアミルアルコール）への誘引行動および忌避物質（ノナノン）への忌避行動が高感度で測定できることを示す図である。 図６は、本発明のシャーレを用いて、５分および１０分でがん患者の尿への誘引行動および健常者の尿への忌避行動が明確に評価できることを示す図である。 図７は、従来法に基づく尿サンプルへの走性行動評価の結果を示す図である。 図８は、様々ながん患者および健常者から得た尿（１／２００希釈）を用いた走性行動評価の結果を示す図である。 図９は、３ｃｍ×１ｃｍの角形シャーレを用いて走性行動評価をした結果を示す図である。 図１０は、従来の線虫の走性行動評価系と本発明の第三の実施形態の評価系とを比較した模式図である。記号「＋」の位置に被検試料を配置し、記号「Ｃ」の領域に線虫を配置し、線虫が「Ａ」に移動した場合には誘引行動を示したことが分かり、「Ｂ」に移動した場合には忌避行動を示したことが分かるという評価系である。 図１１Ａは、本発明の第三の実施形態による評価系の固形培地表面を表す平面図である。 図１１Ｂは、本発明の第三の実施形態による評価系の固形培地表面を表すＡ−Ａ断面図である。 図１１Ｃは、くぼみを作成するための型の断面図である。 図１２Ａは、本発明の第三の実施形態による評価系の平面図である。 図１２Ｂは、本発明の第三の実施形態による評価系のＢ−Ｂ断面図である。 図１３は、実施例Ｂ４において構築した本発明の第三の実施形態による評価系の写真である。 図１４は、実施例Ｂ４において構築した本発明の第三の実施形態による評価系を用いた線虫の走性行動の評価結果（左）および観察面に残存する線虫の割合の経時変化（右）を示す。

発明の具体的な説明

本明細書では、「線虫」とは、セノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）を意味する。線虫は、生物研究においてモデル生物として世界中で広く飼育され、研究されているポピュラーな生物であり、飼育が容易で、嗅覚が優れているという特徴を有する。

本明細書では、「がん」とは、胃がん、直腸結腸がん、食道がん、すい臓がん、前立腺がん、胆管がん、肺がん、血液がん、白血病、リンパ腫等のがん腫を意味する。

本明細書では、「対象」とは、哺乳動物、例えば、ヒトを意味する。

本明細書では、「走性行動」とは、誘引行動または忌避行動を意味する。誘引行動とは、ある物質からの物理的距離を縮める行動を意味し、忌避行動とは、ある物質からの物理的距離を広げる行動を意味する。誘引行動を誘発する物質を誘引物質といい、忌避行動を誘発する物質を忌避物質という。

線虫（C. elegans）は嗅覚により誘引物質に対して誘引し、忌避物質から忌避するという性質を有している。誘引物質に対して誘引する行動を誘引行動といい、忌避物質から忌避する行動を忌避行動という。また、誘引行動と忌避行動とを合わせて走性行動という。

本発明によれば、線虫の嗅覚を介した走性行動を評価することに適した行動評価系（例えば、下記実施形態に示されるシャーレおよび必要に応じてその蓋）が提供される。シャーレおよび蓋は、プラスチックなどの樹脂製とすることができ、透明な樹脂製とすることができる。以下、実施形態ごとに本発明を説明する。なお、以下、区切り線との表現は、領域を物理的に区切るものではなく、目印として領域間を区分けするという意味で用いられている。線虫は行動評価時には、区切り線を越えて他の領域に移動できる。

第一の実施形態
本発明の第一の実施形態を図１Ａおよび１Ｂを参照しながら説明する。

本実施形態におけるシャーレ１００は、図１Ａに示されるように、略角型形状の底面を有するシャーレである。シャーレ１００の底面は、少なくとも２つの区切り線２５および３５を有し、長手方向に片側の末端から別の末端に向かって、底面の領域を少なくとも３つの領域に区分けしている。これにより、底面は、第一の領域２０、第二の領域３０および第三の領域４０の少なくとも３つの領域に区分けされており、特に第二の領域３０が第一の領域２０と第三の領域４０との境界に配置されている。なお、シャーレ１００は、底面の周囲を囲むように側壁が上方に延びている。また、図１Ｉに示されるように、シャーレ１００の底面内面１００ａは、側壁に対して略垂直である。また、シャーレ１００の底面の内面１００ａは、底面の外面１００ｂに対して略平行である。

第一の実施形態のシャーレ１００は、底面が略角形の形状を有するシャーレで有り得、底面の長手方向の長さが３ｃｍ〜６ｃｍ、横手方向の長さが１ｃｍ〜３ｃｍまたは３ｃｍ〜６ｃｍの範囲の長さであり得る。長手方向の長さは、好ましくは、４ｃｍ〜６ｃｍ、好ましくは、４．５ｃｍ〜５．５ｃｍ、好ましくは５ｃｍであり得る。横手方向の長さは、好ましくは、１．５ｃｍ〜２．５ｃｍ、好ましくは、２ｃｍであり得る。あるいは、横手方向の長さは、好ましくは、３．５ｃｍ〜５．５ｃｍ、好ましくは、４ｃｍ〜５ｃｍであり得る。そして、第一の実施形態のシャーレ１００は、底面が略角形の形状を有し、底面の長手方向の長さが４ｃｍ〜６ｃｍであり、好ましくは、４．５ｃｍ〜５．５ｃｍであり、かつ、底面の横手方向の長さが１．５ｃｍ〜２．５ｃｍまたは３．５ｃｍ〜５．５ｃｍであり得る。第一の実施形態のシャーレ１００は、底面が略角形の形状を有し、長手方向の長さが４．５ｃｍ〜５．５ｃｍであり、横手方向の長さが４．５ｃｍ〜５．５ｃｍであってもよい。また、第一の実施形態のシャーレ１００は、高さが１ｃｍ〜３ｃｍであり得る。

第二の領域３０は、第一の領域２０と第三の領域４０とを分離するように配置されていてもよい。第二の領域３０は、図１Ａに示されるように、好ましくは、第一の領域２０と第三の領域４０とが第二の領域３０を挟んで対向するように配置され得る。

第二の領域３０は、底面の総面積の３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または、５％以下であり得る。

区分けは、ヒトや機械が、上記少なくとも３つの領域をそれぞれ判別できるようになされていれば、どのように区分けされていてもよい。特に、区分けは、視覚的に各領域の境界が視認できるようになされていればよく、線虫の領域間の移動を完全に妨げるものではない。区分けは、線虫が領域間を移動できるようになされ得る。区分けは、特に限定されないが例えば、底面への印刷または底面の凹凸形状によりなされ得る。底面への印刷または底面の凹凸形状は、底面の上面に対してされていてもよいし、下面に対してなされていてもよい。区分けは、例えば、図１Ａに示されるように、区切り線２５および区切り線３５などの境界線となる区切り線によりなされ得る。区切り線は、必ずしも直線でなくてもよいが、好ましくは直線とすることができる。区切り線は、必ずしも凹凸形状を有さなくてよい。

第一の領域２０と第三の領域４０とは、それぞれどちらが第一の領域でどちらが第三の領域であるかを区別できるように表示を有していてもよい。表示は、○や×などの記号であってもよいし、文字であってもよく、何らかの印であってもよい。第一の領域と第三の領域を区別するために、シャーレ１００は、タグ９０を有していてもよい。第一の領域と第三の領域とは面積が異なっていてもよく、面積が異なることを利用してそれぞれを区別できるようになっていてもよい。

タグ９０は、例えば、複数のシャーレ１００をそれぞれ区別するために用いることができる。タグ９０には、特に限定されないが例えば、バーコードや二次元バーコードなどの表示が付され得、前記表示にはそれぞれのシャーレ１００の管理情報が含まれ得る。

シャーレ１００は、図１Ｂに示されるように底面の縁部に側壁を有し、容器の形状を備える。

第一の実施形態のシャーレの使用方法
第一の実施形態のシャーレ１００は、線虫の嗅覚を介した走性行動を評価することに適している。以下では、第一の実施形態のシャーレ１００を用いて、線虫の嗅覚を介した走性行動を評価する方法について説明する。

第一の実施形態のシャーレ１００は、内部に線虫のための固体培地を加えることができる。固体培地は、例えば、寒天培地であり、当業者であれば線虫の生存に適した培地などの培地を作成し、シャーレに添加することができる。
線虫６０は、第二の領域３０に播種することができる。線虫は、第二の領域３０の全面に播種されてもよいし、第二の領域３０の一部だけに播種されてもよい。被検試料は、第一の領域２０または第三の領域４０であって、例えば、線虫が播種される領域から１ｃｍ〜３ｃｍほど離れた位置に配置することができる。

被検試料が配置された第一の実施形態のシャーレ１００に、線虫を播種すると、線虫は被検試料が誘引物質である場合には、被検試料に誘引行動を示し、被検試料に近い場所に移動するが、被検試料が忌避物質である場合には、被検試料に忌避行動を示し、被検試料から離れた場所に移動する。したがって、線虫が移動した場所を観察することにより（観察された線虫の配置から）、被検試料が誘引物質であるのか忌避物質であるのかを判別することができる。観察は、例えば、目視または顕微鏡で行うことができる。観察は、線虫の配置情報を画像化して、画像を用いて行ってもよい。

第一の実施形態の変形例
第一の実施形態の変形例１００Ａについて、図１Ｃを参照しながら以下説明する。第一の実施形態の変形例１００Ａは、底面における第一、第二および第三の領域の区分けパターン（区分け形状）が異なる以外は、ほかの構成要素およびその使用法は図１Ａおよび１Ｂに示される第一の実施形態のシャーレ１００と同一である。したがって、以下では、区分けパターンについてのみ説明し、第一の実施形態のシャーレ１００と同じ部分には同一符号を付して説明は省略する。

第一の実施形態の変形例１００Ａでは、第二の領域３０Ａが、第一の領域２０Ａと第三の領域４０Ａの境界に配置されている点は、第一の実施形態のシャーレ１００と同じである。しかし、第一の実施形態の変形例１００Ａでは、第一の領域２０Ａと第三の領域４０Ａとが接している点で、第一の実施形態のシャーレ１００と異なる。

第二の領域３０Ａは、閉じた形状であれば様々な形状をも有し得る。図１Ｃでは、略円形状に区分けされているが、円形状に限られず、略多角形形状（例えば、略４角形、略６角形、または略８角形等）であってもよい。

第一の実施形態のシャーレ１００およびその変形例１００Ａに対する蓋１５０
第一の実施形態のシャーレ１００およびその変形例１００Ａは、蓋１５０を備えていてもよい。以下、蓋１５０について図１Ｄおよび１Ｅを参照しながら説明する。

図１Ｄおよび１Ｅに示されるように、蓋１５０は、シャーレ１００の上面を覆う蓋であれる。蓋１５０の形状は、シャーレ１００の上面を覆う蓋である限り、その形状は問わない。蓋１５０は、シャーレ１００の上面を覆い、かつ、シャーレ１００内部と外部との空気の流れを遮断できる蓋であることが、嗅覚に基づく行動評価の精度を高める観点で好ましい。

タグ９０は、蓋１５０に備えられていてもよい。

蓋１５０の使用法
蓋１５０は、被検試料と線虫を配置したら、シャーレにかぶせることができる。これにより、外気の影響を防ぎ、また、匂いをシャーレ内部に有効に閉じ込めることが可能となり得る。

蓋１５０の変形例１５０Ａ
蓋１５０の変形例１５０Ａについて、図１Ｄおよび１Ｆを参照しながら以下説明する。蓋１５０Ａは、図１Ｆに示されるように、被検試料配置部位１５１を備える以外は、ほかの構成要素およびその使用法は蓋１５０と同様である。したがって、以下では、被検試料配置部位１５１についてのみ説明し、蓋１５０と同じ部分には同一符号を付して説明は省略する。

図１Ｆに示されるように、蓋１５０Ａは、蓋を閉じたときにシャーレ底面に対向する面上に被検試料配置部位１５１を備える。被検試料配置部位１５１は、蓋１５０Ａの長手方向中心部から１〜３ｃｍ離れた領域に形成される。図１Ｆでは、被検試料配置部位１５１は、円形状で図示されているが、これに限られず、被検試料配置部位１５１は、略円形状、略線形状または略四角形状であり得る。

ある態様では、被検試料配置部位１５１は、被検試料配置部位１５１とそれ以外の領域１５２との境界１５３を有する。境界１５３は、印刷または凹凸形状により形成され得る。

ある態様では、被検試料配置部位１５１とそれ以外の領域１５２とは境界１５３において段差を有する。ある態様では、図１Ｇに示されるように、被検試料配置部位１５１は、それ以外の領域１５２よりも、蓋を閉じたときにシャーレ底面に向けて突出していてもよく、ある態様では、図１Ｈに示されるように、被検試料配置部位１５１は、領域１５２よりも蓋を閉じたときにシャーレ底面に対して窪んでいてもよい。図１Ｇに示されるように、被検試料配置部位１５１は、それ以外の領域１５２よりも、蓋を閉じたときにシャーレ底面に向けて突出している場合には、被検試料配置部位１５１の素材は、領域１５２や蓋１５０Ａの素材と同じでもよいし、異なっていてもよい。

ある態様では、蓋１５０Ａでは、蓋を閉じたときにシャーレ底面に対向する面において、被検試料配置部位１５１は、それ以外の領域１５２と異なる親水性度を有する。
ある態様では、被検試料配置部位１５１は、親水性表面を有し、それ以外の領域１５２は疎水性表面を有する。これにより、水性の被検試料は、被検試料配置部位１５１上に正確に配置され得る。ある態様では、被検試料配置部位１５１は、疎水性表面を有し、それ以外の領域１５２は親水性表面を有する。これにより、油性の被検試料は、被検試料配置部位１５１上に正確に配置され得る。

蓋の変形例１５０Ａの使用方法
蓋１５０Ａは、被検試料と線虫を配置したら、シャーレにかぶせることができる。これにより、外気の影響を防ぎ、また、匂いをシャーレ内部に有効に閉じ込めることが可能となり得る。

蓋１５０Ａを用いる場合、蓋１５０Ａの被検試料配置部位１５１に被検試料を配置し、シャーレに線虫を配置することができる。嗅覚を介した走性行動の評価においては、被検試料と線虫とは空間を隔てて配置されていてもよく、この場合であっても、匂いは空中を拡散し、線虫に届き得る。また、蓋１５０Ａの被検試料配置部位１５１に被検試料を配置し、線虫に到達するのは匂い成分であることから、走性行動のうち、嗅覚を介した部分の評価に向いている。特に被検試料が強力な化学走性を有する場合に、被検試料に含まれるにおい成分の嗅覚を介した走性行動を評価することに適している。

蓋１５０Ａへの被検試料の配置に関しては、蓋１５０Ａの蓋を閉じたときにシャーレ底面に対向する面を下に向けた状態で、被検試料を蓋の下から導入することにより行うことができる。蓋１５０Ａへの被検試料の配置は、蓋１５０Ａの蓋を閉じたときにシャーレ底面に対向する面を上に向けた状態で、被検試料を蓋の下から導入し、その後、天地反転することにより行うことができる。

第二の実施形態
第二の実施形態のシャーレ２００について、図２Ａを用いて説明する。第二の実施形態のシャーレ２００は、底面の区分けパターンが異なる以外は、図１Ａおよび１Ｂに示される第一の実施形態のシャーレ１００と同じである。したがって、第一の実施形態のシャーレ１００と同じ部分には同一符号を付して説明は省略する。

図２Ａに示されるように、第二の実施形態のシャーレ２００では、底面が長手方向に片側の末端から別の末端に向かって第一の領域２１０、第二の領域２２０、第三の領域３０、および第四の領域４０の少なくとも４つの領域に区分けされている。第一の実施形態のシャーレ１００との違いは、第一の領域１０が、第二の実施形態のシャーレ２００では、第一の領域２１０と第二の領域２２０との２つにさらに区分けされている点である。図２Ａに示されるように、第二の実施形態のシャーレ２００では、ライン２１５により第一の領域２１０と第二の領域２２０とが区分けされている。

第二の実施形態のシャーレ２００では、被検試料は、例えば、第一の領域２１０もしくはライン２１５上またはその両方に配置することができる。被検試料の配置領域が区分けにより示されていることにより、被検試料と、線虫６０（第三の領域３０の一部または全部に塗布される）との距離を異なる試験間で一定に保つことが容易になる。第一の領域２１０と第三の領域３０とは、例えば、１ｃｍ〜３ｃｍ程度、１ｃｍ〜２ｃｍ程度、または１．５ｃｍ〜２．５ｃｍ程度、１．５ｃｍ〜２ｃｍ程度の距離を有し得る。

第二の実施形態の変形例２００Ａ
第二の実施形態の変形例２００Ａについて、図２Ｂを参照しながら以下説明する。第二の実施形態の変形例２００Ａは、底面における区分けパターン（区分け形状）が異なる以外は、ほかの構成要素は図２Ａおよび１Ｂに示される第二の実施形態のシャーレ２００と同一である。したがって、以下では、区分けパターンについてのみ説明し、第二の実施形態のシャーレ２００と同じ部分には同一符号を付して説明は省略する。

第二の実施形態の変形例２００Ａでは、第三の領域３０Ａが、第二の領域２２０と第四の領域４０Ａの境界に配置されている点は、第一の実施形態のシャーレ１００と同じである。しかし、第二の実施形態の変形例２００Ａでは、第二の領域２２０と第四の領域４０Ａとが接している点で、第二の実施形態のシャーレ２００と異なる。

第三の領域３０Ａは、閉じた形状であれば様々な形状をも有し得る。図２Ｂでは、略円形状に区分けされているが、円形状に限られず、略多角形形状（例えば、略４角形、略６角形、または略８角形等）であってもよい。

上記において、実施形態ごとに本発明のシャーレを説明したが、これらのシャーレにおいて、底面はさらに細かく区分けされていてもよい。区分けは、上記と同様に区分けは、ヒトや機械が、上記少なくとも３つの領域をそれぞれ判別できるようになされていれば、どのように区分けされていてもよい。

本発明のマルチパネル
以下、本発明のマルチパネルについて図３を参照しながら説明する。

図３Ａに示すように本発明のマルチパネル５００は、本発明の第一の実施形態のシャーレ１００が縦または横に配置されてなる集合体であり得る。また、図３Ｂに示されるように本発明のマルチパネル５００Ａは、本発明の第一の実施形態のシャーレ１００が縦横に配置されてなる集合体であり得る。本発明のマルチパネル５００または５００Ａでは、特に限定されないが例えば、本発明の第一の実施形態のシャーレ１００が２個〜１０００個、４個〜７００個、６個〜６００個、８個〜５００個、または１０個〜３００個配置されていてもよい。

また、マルチパネルでは、隣り合う第一の実施形態のシャーレ１００同士は直接連結していてもよいし、スペーサーを介して連結していてもよい。

図３ＡおよびＢでは、シャーレとして、第一の実施形態のシャーレ１００を用いる例を示したが、シャーレは、第二の実施形態のシャーレ２００としてもよいし、第一の実施形態の変形例１００Ａまたは第二の実施形態の変形例２００Ａとしてもよい。

本発明のマルチパネル５００または５００Ａは、蓋６００をさらに備えていてもよい。蓋６００と各シャーレとの側壁により、各シャーレ内の被検試料が隣のシャーレに漏れることをより効果的に防ぐことが期待できる。蓋６００は、蓋１５０Ａと同様に被検試料配置部位１５１を備えていてもよい。蓋６００の使用法は、蓋１５０および蓋１５０Ａにおいて説明した通りであるので説明を省略する。

第三の実施形態
第三の実施形態は、シャーレの小型化に伴って、シャーレ内壁と固形培地の隙間に潜り込む線虫数が増大し、観察可能な線虫数が時間経過と共に減少するという新しい課題に対して、その解決手段を提供するものである。第三の実施形態は、シャーレ自体の形状ではなく、シャーレに固形培地を導入した後に形成される固形培地表面（上面）の形状に特徴がある。以下、第三の実施形態を図１０〜１２により説明する。

図１０では、従来の特許文献１に記載された評価系と、本発明の第三の実施形態の評価系とを対比した模式図である。従来の評価系は、線虫を播種する面は、シャーレの側壁によりその外周を囲われていた。本発明の第三の実施形態の評価系は、評価系の固形培地面に面形状のくぼみを有し、そのくぼみ内で走性行動を評価するものである。なお、線虫の走性行動を観察する際には、このくぼみに蓋をして線虫をくぼみ内に閉じ込めて観察を行うため、このくぼみを本明細書では、「行動観察面」とよぶことがある。

図１１に示されるように、第三の実施形態では、固形培地面６１０は、略角型形状の面状のくぼみ６００を有する。略角型形状の面状のくぼみ６００は、くぼみの底面６００ａとくぼみの側面６００ｂとを有する。くぼみの底面６００ａは、長手方向の長さが３ｃｍ〜６ｃｍ、横手方向の長さが１ｃｍ〜３ｃｍまたは３ｃｍ〜６ｃｍの範囲の長さであり得る。前記くぼみの底面６００ａの長手方向の長さは、好ましくは、４ｃｍ〜６ｃｍ、好ましくは、４．５ｃｍ〜５．５ｃｍ、好ましくは５ｃｍであり得る。前記くぼみの底面６００ａの横手方向の長さは、好ましくは、１．５ｃｍ〜２．５ｃｍ、好ましくは、２ｃｍであり得る。あるいは、横手方向の長さは、好ましくは、３．５ｃｍ〜５．５ｃｍ、好ましくは、４ｃｍ〜５ｃｍであり得る。前記凹みはまた、長手方向の長さが４．５ｃｍ〜５．５ｃｍであり、横手方向の長さが４．５ｃｍ〜５．５ｃｍであってもよい。前記くぼみ６００の深さ（厚み）またはくぼみの側面６００ｂの高さは、線虫の厚み以上であり、５ｍｍ以下、４ｍｍ以下、３ｍｍ以下、２ｍｍ以下、好ましくは１ｍｍ以下、より好ましくは０．５ｍｍ以下、さらに好ましくは０．３ｍｍ以下、さらにより好ましくは０．２ｍｍ以下、例えば、０．１ｍｍ程度であり得る。行動観察に用いる線虫の厚み＋１０〜５０％程度の深さ、線虫の厚み＋１０〜４０％程度の深さ、線虫の厚み＋１０〜３０％程度の深さ、線虫の厚み＋１０〜２０％程度の深さとすると、線虫を行動観察面に閉じ込める目的と、線虫を行動観察面内で行動させる目的とを両立でき、好ましい。

顕微鏡観察を容易にする観点では、くぼみの底面６００ａは略平面であることが望ましい。このようにすることで顕微鏡のフォーカスを一定にしたまま、行動観察面全体を観察することが容易となる。

また、行動観察時には、くぼみ６００を蓋６５０で完全に覆って線虫がくぼみ６００の外部に逃げないようにすることができる。また、本発明では、くぼみ６００の深さを線虫の厚み（例えば、約０．１ｍｍ程度）に近づけることができる。このようにすることで、くぼみ６００を覆う板６５０で覆ったときに、線虫がくぼみ６００の外に逃れることが困難になると同時に、板６５０の内壁６５０ａに付着した線虫も、くぼみ６００の底面６００ａに付着した線虫と同様に観察することができる。

従来、線虫は、評価系の側壁に達すると側壁と固形培地との間に潜り込んでしまい、行動評価に潜り込んだ線虫を用いることはできなかった。本発明では、くぼみ６００の内面は、その表面がスムースに整形されている。スムースに整形されているとは、線虫が潜り込める隙間や穴を有しないことを意味する。このような表面がスムースに整形されたくぼみは、熱して溶解した、冷えると固化する培地をシャーレに導入し、固まる前に溶解した培地の上方からくぼみ６００の形状の型をあてながら冷却することで作成することができる。くぼみ６００の形状の型は、例えば、図１１Ｃに示されるように、くぼみ６００の形状と相補的な形状を有する型６６０とすることができる。

ここで、シャーレは、くぼみの底面６００ａを上方から観察したときに、中央部の領域を示す二本の線６２０（目印）が設けられていてもよい。線６２０で示された領域には線虫を配置し、二本の線６２０の外側の領域のどちらかに被検試料を配置することができる（被検試料は蓋に配置してもよい）。すなわち、くぼみ６００の底面６００ａ（行動観察面）は、第一の実施形態や第二の実施形態と同じように、少なくとも２つの区切り線２５および３５を目印として有し、長手方向に片側の末端から別の末端に向かって、底面の領域を少なくとも３つの領域に区分けしている。これにより、底面は、第一の領域２０、第二の領域３０および第三の領域４０の少なくとも３つの領域に区分けされており、特に第二の領域３０が第一の領域２０と第三の領域４０との境界に配置されている。区切り線は、領域を物理的に分断するものではなく、目印として異なる領域間の境目を区別する目的を果たせばそれで十分である。

図１２に示されるように、くぼみ６００は、測定時にはくぼみ全体を覆う板６５０によって覆われる。板６５０は平面上である。板６５０は、シャーレが光透過性の場合には光透過性でなくてもよいが、光透過性とすることができる。板６５０が光透過性であると、上部から顕微鏡を用いて、板６５０でくぼみ６００を覆った状態で線虫を観察可能であり、有利である。板６５０が光透過性でない場合には、シャーレが光透過性であることが好ましく、この場合、シャーレの下部から倒立顕微鏡を用いて線虫を観察することができる。板もシャーレも光透過性でない場合には、観察時に、板を外してくぼみ、および／または板に付着した線虫を観察することができる。
区切り線６２０は、シャーレの底面に設けられてもよいし、板６５０の上面または下面６５０ａに設けられていてもよい。

本発明では、第三の実施形態の行動評価系を作成するための、シャーレ、くぼみ６００を覆う板６５０、およびくぼみ６００を作成するための型６６０の組合せが提供される。前記組合せにおいては、シャーレは、くぼみ６００が形成される部位の直下のくぼみ６００の形状に対応する位置に、第一の実施形態のシャーレ１００、変型例１００Ａ、第二の実施形態のシャーレ２００、または変形例２００Ａの底面における区分けパターンと同様の区分けパターンを有していてもよい。また、くぼみ６００を覆う板６５０には、くぼみ６００を覆ったときにくぼみ６００に対応する位置に、第一の実施形態のシャーレ１００、変型例１００Ａ、第二の実施形態のシャーレ２００、または変形例２００Ａの底面における区分けパターンと同様の区分けパターンを有していてもよい。このようにすることで、線虫を配置する場所を安定させることができ、また、誘引行動と忌避行動とを見分けることが容易になる。

本発明における線虫の嗅覚を介した走性行動の評価方法
以下、線虫の嗅覚を介した走性行動の評価方法を説明する。

本発明によれば、
被検試料の匂いに対する線虫の走性行動を評価する方法であって、
ａ）被検試料が配置されたシャーレであって、被検試料から１ｃｍ〜３ｃｍ離れた底面の領域または部位に線虫が配置されたシャーレを提供することと、
ｂ）播種から３〜１５分後に線虫の配置を観察することと、
ｃ）被検試料に対して誘引行動を示したか忌避行動を示したかを、観察された線虫の配置から評価することと
を含む、方法が提供される。

以下、ａ）〜ｃ）を工程ごとに説明する。

ａ）被検試料が配置されたシャーレであって、被検試料から１ｃｍ〜３ｃｍ離れた底面の領域または部位に線虫が配置されたシャーレを提供すること

ａ）では、被検試料が配置されたシャーレを用いる。シャーレは、蓋を有していなくてもよいが、好ましくは蓋を有するものを用い得る。シャーレには、線虫のための固体培地が添加され得る。線虫のための固体培地としては、線虫を培養または増殖させるための固体培地を用いることができる。固体培地としては、周知の培地、例えば、寒天培地を用いることができる。被検試料は、特に限定されないが好ましくは、シャーレ底面に配置され得、特にシャーレ底面の周辺部付近に配置され得る。あるいは、被検試料は、特に限定されないが好ましくはシャーレの蓋上の、シャーレ底面に対向する面（または下面）に配置され得、特に蓋の下面の周辺部付近に配置され得る。シャーレ底面または蓋の周辺部（すなわち、側壁付近）に被検試料を配置することにより、線虫をシャーレの底面中央に配置したときに、被検試料との距離を一定以上確保することが容易となる。

被検試料が配置された部位から、線虫が播種される部位までの距離は、１ｃｍ〜３ｃｍ程度、１〜２．５ｃｍ程度、１．５〜２ｃｍ程度、１．５ｃｍ〜２．５ｃｍ程度、または２ｃｍ程度とすることができる。

播種する線虫の個体数は、例えば、１０〜５００程度、例えば１００〜５００程度とすることができる。

被検試料は、あらゆる試料を用いることができる。被検試料としては、例えば、がんに罹患していることが疑われる対象（例えば、ヒト）の試料が挙げられる。被検試料は、例えば、がん細胞であると疑われる細胞、がん組織であると疑われる組織、またはこれらの抽出物もしくは溶解物とすることができるし、あるいは、がんに罹患していることが疑われる対象の体液試料、例えば、血液（例えば、血漿）または尿とすることができる。

線虫の嗅覚を介した走性評価については、例えば、ＷＯ２０１５／０８８０３９に記載されるように実施することができる。

従来の方法では、ａ）で提供するシャーレには、殺線虫剤（例えば、アジ化ナトリウム）を被検試料付近および線虫を配置する位置から見て被検試料とは逆側の領域に配置しておく必要があったが、本発明の方法では、殺線虫剤を用いなくてよい。

ａ）で提供される、被検試料が配置されたシャーレであって、被検試料から１ｃｍ〜３ｃｍ離れた領域または部位に線虫が配置されたシャーレは、被検試料を配置した後で線虫を配置して得てもよいし、線虫を配置してから被検試料を配置して得てもよい。線虫を配置してから被検試料を配置する場合には、配置されるべき箇所に線虫を配置して培養して増やしてから、被検試料を配置してもよい。
線虫を配置してから時間が経過すると線虫が底面上で広く拡散してしまう可能性が高まることから、線虫を配置した後は速やかに観察を開始することが望ましい。したがって、好ましくは、被検試料をシャーレの所定位置に配置し、その後、線虫を所定位置に配置して、すぐに後述するｂ）における３〜１５分の時間のカウントを開始することが好ましい。線虫を配置してから被検試料を配置する場合には、線虫を配置して、好ましくは３分以内、より好ましくは１分以内に被検試料を配置することが望ましい。
ａ）で提供されるシャーレにおいて、線虫が配置される場所は、好ましくは、シャーレまたはその蓋のいずれの側壁からも、０．５ｃｍ以上離れている領域に線虫が配置されている（ただし、側壁から０．５ｃｍ以内の領域に配置することを妨げない）。

ｂ）被検試料と線虫がシャーレに配置されてから３〜１５分後に線虫の底面上での配置を観察すること
ｂ）では、線虫は、シャーレに被検試料を配置すると（または線虫は、被検試料が配置されたシャーレに配置すると）すぐに走性行動を示す。３〜１５分程度、好ましくは、３〜１２分、より好ましくは５〜１０分、例えば、５分、７．５分または１０分待つと、線虫は走性行動を評価するに十分な距離だけ移動できる。そのため、被検試料または線虫のいずれか遅い方が配置されてから、３〜１５分程度、好ましくは、３〜１２分、より好ましくは５〜１０分、例えば、５分、７．５分または１０分後に線虫の底面上での配置を観察することができ、これにより線虫の走性行動を評価することができる。この時間を、３分以上とすることにより、線虫の走性行動が十分に可視化できる程度に大きくなるので、走性行動の評価精度が向上する。また、この時間が１５分以下だと、線虫の嗅覚が感作を受けて、線虫がシャーレ上をランダムに移動し始める可能性が低下し、走性行動の精度が向上する。シャーレの底面に線虫が配置され、蓋に被検試料が配置される場合には、「被検試料と線虫がシャーレに配置されたとき」とは、前記シャーレに前記蓋がかぶせられたときである。

ｃ）被検試料に対して誘引行動を示したか忌避行動を示したかを、観察された線虫の配置から評価すること
ｃ）では、観察された線虫の配置から線虫が被検試料に対して誘引行動を示したか、忌避行動を示したが、どちらも示さなかったかを評価することができる。ｃ）では、被検試料に近づいた線虫の割合が、被検試料から遠ざかった線虫の割合よりも高い場合には、線虫が被検試料に対して誘引行動を示したと評価することができる。ｃ）ではまた、被検試料に近づいた線虫の割合が、被検試料から遠ざかった線虫の割合よりも低い場合には、線虫が被検試料に対して忌避行動を示したと評価することができる。ｃ）では、被検試料に近づいた線虫の割合が、被検試料から遠ざかった線虫の割合と同等の場合には、線虫が誘引行動も忌避行動もしなかったと評価してもよい。

また、ｃ）では、例えば、下記式により走性インデックスを求めて、線虫が誘引行動を示したか、忌避行動を示したかを評価してもよい。

走性インデックス
（走性インデックス）＝
｛（○で示す領域の線虫個体数）−（×で示す領域の線虫個体数）｝／全線虫個体数

走性インデックスは、−１〜＋１の間の数値をとり、誘引行動を示した場合には正の値を、忌避行動を示した場合には負の値を取る。そして、数値の絶対値が大きいほど、走性行動が強く表れたと解釈できる。

ｃ）は、線虫が被検試料に対して示した走性行動に基づいて、被検試料を誘引物質であるか忌避物質であるか、またはそのいずれでもないかを評価することをさらに含んでもよい。

本発明者らは、ＷＯ２０１５／０８８０３９において、線虫ががん患者の体液（例えば、尿）に対して誘引行動を示すこと、および健常者の体液（例えば、尿）に対しては忌避行動を示すことを明らかにしている。これは、がん患者のがん細胞やがん組織からがん特有の因子ががん患者の体液中に放出されるが、これが線虫の誘引行動を惹起することに基づくと理解される。

したがって、本発明で、被検試料として、がん細胞であると疑われる細胞、がん組織であると疑われる組織、またはこれらの抽出物もしくは溶解物とすることができるし、あるいは、がんに罹患していることが疑われる対象（例えば、ヒト）の体液試料、例えば、血液（例えば、血漿）または尿を用いた場合には、線虫の走性行動に基づいて、試料ががんに由来する誘引物質を含むか否かを判定することができる。そしてこの判定の結果は、医師ががんの診断をするときの基礎情報の一つとして有益であり、医師によるがん診断の補助となる。

したがって、本発明の別の側面では、被検試料にがんに由来する誘引物質が含まれているか否かを判定する方法であって、上記ａ）〜ｃ）を含み、かつ、線虫の走性行動に基づいて、被検試料ががんに由来する誘引物質を含むか否かを判定することをさらに含む、方法が提供される。

また、本発明の別の側面では、対象ががんに罹患しているか否かを診断する方法であって、対象から被検試料を得ることと、上記ａ）〜ｃ）を含み、かつ、ｄ）線虫が被検試料に対して誘引行動を示した場合には対象ががんに罹患していると評価すること、または線虫が被検試料に対して忌避行動を示した場合には対象ががんに罹患していないと評価することを含む、方法が提供される。

本発明の被検試料の匂いに対する線虫の走性行動を評価する方法、被検試料にがんに由来する誘引物質が含まれているか否かを判定する方法、および、対象ががんに罹患しているか否かを診断する方法においては、線虫の嗅覚を介した走性行動が評価されるが、線虫の移動を停止させるための殺線虫剤（例えば、アジ化ナトリウムなどの劇薬）を用いる必要がない。アジ化ナトリウムなどの劇薬は、保管や使用に対して厳格な管理を行うことが求められる（そのような制約がある）から、これらを用いない本発明の方法は、実施上の制約が一つ除去できる点で有益である。

本発明の被検試料の匂いに対する線虫の走性行動を評価する方法、被検試料にがんに由来する誘引物質が含まれているか否かを判定する方法、および、対象ががんに罹患しているか否かを診断する方法においては、上記で説明した本発明のシャーレまたは行動評価系を用いることができるし、マルチプレートを用いることもできる。本発明の方法における本発明のシャーレ、行動評価系、およびマルチプレートの使用方法は、上述した通りである。

実施例１：線虫の嗅覚を利用した走性行動の評価系の構築
本実施例では、新しい線虫の走性行動の評価系の構築を試みた。

まず、一例として底面が５ｃｍ×２ｃｍである角形シャーレを作製した（図１ＡおよびＢ参照）。実際に作製したシャーレの写真は図４の通りであった。この角形シャーレの長手方向中央部において２本の線で仕切られた領域に線虫を播種し、左末端の領域に誘引物質または忌避物質を塗布して、線虫の誘引物質に対する誘引行動または忌避物質に対する忌避行動をそれぞれ観察した。本実施例では、誘引物質としてイソアミルアルコールを用い、忌避物質としてノナノンを用いた。具体的には、イソアミルアルコールは、水で１０００倍希釈し、１μＬを左末端の領域に塗布した。また、ノナノンは、原液１μＬを左末端の領域に塗布した。線虫としては、野生型C. elegans（１０〜５０匹／実験）を用いた。

線虫の誘引行動および忌避行動について下記で説明される走性インデックスを求め、構築した評価系の感度を確認した。具体的には、誘引物質または忌避物質を塗布した左末端の領域と、長手方向中央部の線虫を播種する領域との間の領域（図４において○で示される領域；第一の実施形態の領域１に対応する）に移動した線虫の個体数と、その反対側の領域（図４において×で示される領域；第一の実施形態の領域２に対応する）に移動した線虫の個体数の差を求め、全線虫個体数で除して走性インデックスを求めた。

走性インデックス
（走性インデックス）＝
｛（記号"○"で示す領域の線虫個体数）−（記号"×"で示す領域の線虫個体数）｝／全線虫個体数

実験は、５回繰り返し、走性インデックスの平均値とＳＥＭを求めた。

結果は、図５に示される通りであった。図５は、線虫播種して、わずか１０分後に測定した走性インデックスと標準誤差（ＳＥＭ）を示す。図５に示されるように、わずか１０分の測定で、誘引物質であるイソアミルアルコールに対して走性インデックスが０．８を超える値を示した。この結果は、９割以上の線虫がこの短期間の間に誘引物質に対して誘引行動を示したものとして測定できたことを示す。
また、忌避物質であるノナノンに対して走性インデックスが−０．８を下回る値を示した。この結果は、９割以上の線虫がこの短期間の間に忌避物質に対して忌避行動を示したものとして測定できたことを示す。

嗅覚を用いた走性行動の評価では、試験物質が誘引物質か忌避物質か、またはどちらでもないかを判別することを目的として評価が実施される場合がある。本発明の評価系を用いると、短い測定時間で驚くべき感度で、試験物質が誘引物質であるか、忌避物質であるかを判別することが可能であることが分かった。

従来は、嗅覚に基づく走性行動の評価を９ｃｍの丸形シャーレを用いて行っており、この場合は、線虫の可動領域が広く、また移動中に嗅覚が感作を受けてすぐに走性行動を示さなくなり、ランダムに動き回ることが知られている。いったん移動した線虫がさらにランダムに動きまわることを防ぐために、アジ化ナトリウムなどの毒物を移動先の領域に塗布するという対策が取られている。

一方で、本発明の評価系では、毒物を一切使用せずに、線虫の嗅覚に基づく走性行動を超高感度で測定することができた。本発明では、従来、嗅覚に基づく走性行動の観察に必須であった、アジ化ナトリウムの使用は必要なかった。

また、従来の評価系では、線虫の走性行動を評価するために、３０分以上の期間にわたって線虫を行動させる必要があった。これに対して、本発明の評価系では、従来の数分の１以下の時間にわたって線虫に行動させるだけで評価が可能であるだけでなく、従来よりも高感度に走性を評価することができた。

本実施例は、被検試料と線虫とを従来よりも近くに配置すると、高精度の評価が可能となったというものである。本発明の評価方法で走性評価が高精度となった理由としては、嗅覚に基づく走性行動評価の際に、線虫の行動能力（例えば、栄養状態、環境温度、培養条件、および成長段階により影響を受ける）の影響が無視できないほど大きなノイズとして影響していたところ（本発明以前はこの影響自体知られていなかったが）、本発明の評価方法では、この影響が最小化できたためであると考えられる。

実施例２：がん患者の尿を用いた線虫の嗅覚を介した走性行動の評価
野生型線虫は、がん患者の尿には誘引行動を示し、健常者の尿には忌避行動を示すことが明らかとなっている。本実施例では、実施例１で構築した新しい評価系を用いて、がん患者由来の尿に対する走性行動を評価した。

誘引物質または忌避物質をがん患者の尿（１／２０希釈）または健常者の尿（１／２０希釈）とする以外は実施例１と同様に走性行動を評価した。測定時間は、実施例１の結果から線虫の播種から５分後または１０分後とした。結果は、図６に示される通りであった。

図６に示されるように、高希釈倍率にも関わらず、５分後でもがん患者の尿への誘引行動と健常者の尿への忌避行動を明確に観察することができた。結果は、１０分後でも同様であった。また、走性インデックスは、がん患者の尿サンプルに対して、５分後で０．５、１０分後で０．６であり、それぞれ７５％および８０％の線虫が誘引行動を示したことを意味する良好な数値である。

これに対して、９ｃｍディッシュを用いてWO2015/088039の実施例１と同様の実験を行うと、１／１０希釈の尿を用い、測定時間３０分、アジ化ナトリウム使用の条件下で、走性インデックスはわずか０．３と低い値に留まった（図７参照）。すなわち、９ｃｍディッシュの系では、尿濃度が２倍濃いにもかかわらず走性インデックスは低い値しか認められなかった。

次に、本実施例の上記評価法において、尿の濃度を１／２００希釈とし、測定時間を１０分とする以外は、上記図６の結果を得た実験と同じ条件で、線虫の走性行動を観察した。尿は、異なる複数のがん患者から得た尿を用いた。結果は図８に示される通りであった。

図８に示されるように、いずれのがん患者からの尿に対しても線虫は誘引行動を示し、いずれの健常者の尿に対しても線虫は忌避行動を示した。走性インデックスは、尿を高倍率で希釈したにも関わらず０．１〜０．２であり、本評価方法の感度の高さを実証できた。一方で、健常者の尿に対しても、走性インデックス−０．１５〜−０．２であり、本評価方法の感度の高さを再検証できた。

実施例３：３ｃｍ×１ｃｍの角型シャーレを用いた線虫の走性行動の評価
本実施例では、実施例１よりもさらに小さな角型シャーレを用いて線虫の走性行動を評価した。

３ｃｍ×１ｃｍの角型シャーレを用いる以外は、上記図６の結果を得た実験と同じ条件で、線虫の走性行動を観察した。評価は、線虫播種５分後および１０分後に行った。結果は、図９に示される通りであった。

図９に示されるように、５分後では、がん患者の尿に対して誘引行動を示し、健常者の尿に対して忌避行動を示した。一方で、１０分後では、がん患者の尿に対しては誘引行動を示したものの、健常者の尿に対しては忌避行動を示さなかった。

この結果は、小型の角型シャーレでも線虫の走性行動を評価することは可能であることを示すものであるが、しかし、一方で、その感度が低下する可能性を示唆するものと言える。

感度が低下した原因を調べたところ、１０分後は、線虫がシャーレの側壁を上っていたり、または、線虫が側壁部から培地内に潜ることにより、計数可能な線虫個体数が低下していることが一因となっていることが明らかとなった。すなわち、線虫が配置される場所は、シャーレの側壁から０．５ｃｍ以上離れていた方がよいことが明らかとなった。

実施例Ｂ４：第三の実施形態による走性行動評価系
本実施例では、シャーレ自体の形状ではなく、固形培地に走性行動を評価するためのフィールド（くぼみ６００）を設け、その内部で線虫の走性行動を評価するものである。

線虫株であるＮ２ Ｂｒｉｓｔｏｌ株を用いて嗅覚に基づく走性行動を評価した。線虫の飼育は、以下表１に記載のＮＧＭプレートを用いて行った。

また、線虫の走性行動評価は、以下表２に記載のアッセイプレート（径５ｃｍまたは９ｃｍシャーレ）を用いて行った。

上記アッセイプレートの培地組成で試薬を混合し、オートクレーブ後に９ｃｍシャーレに適量を流し込み、５ｃｍ×２ｃｍ×１ｍｍのプラスチック板を表面に型押ししながら冷却して固形培地を固めた。固形培地が固まった後に、プラスチック板を除去して、長さ５ｃｍ、幅２ｃｍ、深さ１ｍｍのくぼみを固形培地表面に形成した。このようにして、図１１ＡおよびＢに示されるようなくぼみを表面に有する固形培地を有するシャーレを得た。

次に、図１３右の「＋」で示される位置に、１０^-5倍希釈したイソアミルアルコール（ＩＡＡ）または１０^-3倍希釈したノナノン（Ｎｏｎａ）を配置し、２０℃で４日間培養した線虫を中央部（図１３の領域Ｂに相当する）に配置した。その後、２３℃で線虫の走性行動を観察した。

また、実施例１および２で用いた行動評価系を用いた観察結果と比較した。

経過時間が０分、５分、１０分、２０分後に、図１３のＡ、ＢおよびＣの領域に対応する領域にいる線虫の数を計測した。線虫の残存数としては０分の時の線虫数に対する、各時間における線虫数の割合として算出した。また、走性インデックスは［Ｎ（Ａ）−Ｎ（Ｂ）］／［Ｎ（Ａ）＋Ｎ（Ｂ）］の式をもとに算出した。ここで、Ｎ（Ａ）：領域Ａに移動した線虫個体数であり、Ｎ（Ｂ）は、領域Ｂに移動した線虫個体数である。

結果は、図１４に示される通りであった。図１４右に示されるように、実施例１および２で用いた行動評価系（５ｃｍ ｐｌａｔｅ（Ｎｏｎａ））では、時間経過（横軸、単位：分）とともに線虫が、固形培地とプレート側壁との間に潜り込んでしまい、観察面から減少してしまった。これに対して、第三の実施形態の評価系（Ｎｅｗ ｐｌａｔｅ（Ｎｏｎａ）およびＮｅｗ ｐｌａｔｅ（ＩＡＡ））では、時間経過に伴う観察面からの線虫の減少はほとんど見られなかった。また、図１４左に示されるように、第三の実施形態の評価系では、５分でノナノン（Ｎｏｎａ）に対する忌避行動が明確に観察できた。第三の実施形態の評価系ではまた、５分、特に２０分でイソアミルアルコール（ＩＡＡ）に対する遊走行動を明確に観察できた。図１４右と合わせると、結果が明瞭になる２０分後においても、第三の実施形態の評価系を用いると線虫の減少は少なく、観察結果が明瞭になるメリットが大きいと考えられた。

Claims (14)

1. 略角型面形状のくぼみを表面に有する固形培地が導入されたシャーレと、前記くぼみを上部から覆う板を備えた線虫の走性行動評価系であって、シャーレの底面の前記くぼみに対応する部位が、目印によって長手方向に片側の末端から別の末端に向かって第一の領域、第二の領域および第三の領域の少なくとも３つの領域に区分けされ、第二の領域が、第一の領域と第三の領域との境界に配置され、目印は、領域間を物理的に区切るものではなく、線虫は領域間を移動できる、走性行動評価系。
2. 深さが線虫の厚み以上であり２ｍｍ以下である略角型面形状のくぼみを表面に有する固形培地が導入されたシャーレと、前記くぼみを上部から覆う板を備えた線虫の走性行動評価系であって、
   シャーレの底面の前記くぼみに対応する部位が、目印によって長手方向に片側の末端から別の末端に向かって第一の領域、第二の領域および第三の領域の少なくとも３つの領域に区分けされ、第二の領域が、第一の領域と第三の領域との境界に配置されている、走性行動評価系。
3. 前記くぼみを上部から覆う板の前記くぼみに対応する部位が、目印によって長手方向に片側の末端から別の末端に向かって第一の領域、第二の領域および第三の領域の少なくとも３つの領域に区分けされ、第二の領域が、第一の領域と第三の領域との境界に配置され、目印は、領域間を物理的に区切るものではなく、線虫は領域間を移動できる、請求項２に記載の走性行動評価系。
4. 目印が、底面の上面に対する凹凸形状若しくは印刷、または下面に対する凹凸形状若しくは印刷による目印である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の走性行動評価系。
5. 第一の領域と第三の領域とが接しており、第二の領域が閉じた形状である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の線虫の走性行動評価系。
6. 蓋を閉じたときに前記底面に対向する面上に被検試料配置部位を備える蓋を備えた、請求項１〜５のいずれか一項に記載の線虫の走性行動評価系。
7. 第二の領域上に線虫が配置された、請求項１〜６のいずれか一項に記載の線虫の走性行動評価系。
8. 第一の領域または第三の領域に被検試料が配置された、請求項１〜７のいずれか一項に記載の線虫の走性行動評価系。
9. 被検試料の匂いに対する線虫の走性行動を評価する方法であって、
   ａ）被検試料が配置されたシャーレであって、被検試料から１ｃｍ〜３ｃｍ離れた底面の領域または部位に線虫が配置されたシャーレを提供することと、
   ｂ）被検試料と線虫がシャーレに配置されてから３〜１５分後に線虫の底面上での配置を観察することと、
   ｃ）被検試料に対して誘引行動を示したか忌避行動を示したかを、観察された線虫の配置から評価することと
   を含み、
   ａ）において、以下のシャーレ：
   （ｉ）略角型形状の底面を有するシャーレであって、底面は、長手方向に片側の末端から別の末端に向かって第一の領域、第二の領域および第三の領域の少なくとも３つの領域に区分けされ、第二の領域が、第一の領域と第三の領域との境界に配置され、目印は、領域間を物理的に区切るものではなく、線虫は領域間を移動できる、シャーレ；若しくは、
   （ｉｉ）略角型面形状のくぼみを表面に有する固形培地が導入されたシャーレと、前記くぼみを上部から覆う板を備えた線虫の走性行動評価系であって、シャーレの底面の前記くぼみに対応する部位が、目印によって長手方向に片側の末端から別の末端に向かって第一の領域、第二の領域および第三の領域の少なくとも３つの領域に区分けされ、第二の領域が、第一の領域と第三の領域との境界に配置され、目印は、領域間を物理的に区切るものではなく、線虫は領域間を移動できる、走性行動評価系；または
   （ｉｉｉ）上記（ｉ）のシャーレまたは上記（ｉｉ）の走性行動評価系が複数連結したマルチプレート
   のいずれか１つを用いる、
   方法。
10. 被検試料が、がん患者であると疑われる対象から得られた試料である、請求項９に記載の方法。
11. 被検試料が、がん患者であると疑われる対象から得られた尿である、請求項１０に記載の方法。
12. ｃ）において線虫が被検試料に対して誘引行動を示した場合には、被検試料にがんに由来する誘引物質が含まれると判定すること、または、線虫が被検試料に対して忌避行動を示した場合には、被検試料にがんに由来する誘引物質が含まれていないと判定することをさらに含む、請求項１０または１１に記載の方法。
13. 殺線虫剤を用いない、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記略角型面形状のくぼみの深さが線虫の厚み以上であり２ｍｍ以下である、請求項９〜１３に記載の方法。

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