JP6747843B2 - 蛍光観察方法、蛍光観察装置、及び遮光部材 - Google Patents

Description

本発明は、蛍光観察方法、蛍光観察装置、及び遮光部材に関する。

近年、蛍光色素などの蛍光試薬を生体組織などの観察対象に対して付与し、当該観察対象から発せられる蛍光を観察して情報を取得する技術の開発が進められている。例えば非特許文献１に記載の技術では、がん細胞により活性が上昇する特定のたんぱく質分解酵素が蛍光性を示す蛍光試薬を観察対象にスプレーし、がん細胞を選択的に光らせた蛍光像を観察することで、正常な組織とがん細胞との識別を行っている。

浦野 泰照、他３４名、「Rapid intraoperative visualization of breast lesions with γ-glutamyl hydroxymethyl rhodamine green」、Scientificreports、2015年7月13日発行、p.1−6

上述のような蛍光観察方法においては、観察対象からの蛍光が微弱な場合がある。このため、蛍光像の観察により観察対象の識別を精度良く行うためには、観察すべき蛍光のＳ／Ｎ比を高める上で、背景光等の外乱光の影響を排除することが重要となっている。

また、蛍光像の定量的な評価のためには、蛍光を撮像する撮像部と観察対象との距離を一定にすることが好ましい。しかしながら、蛍光の観察を行う現場で観察の度に観察対象と撮像部との位置関係を手動で調整していては、蛍光の観察を開始するまでに多くの時間を要することとなる。したがって、観察対象と撮像部との位置関係を簡便に調整できる技術が望まれている。

本発明は、上記課題の解決のためになされたものであり、蛍光像の定量的な評価を簡便に実施でき、かつ観察対象を精度良く識別できる蛍光観察方法、蛍光観察装置、及び遮光部材を提供することを目的とする。

本発明の一側面に係る蛍光観察方法は、観察対象からの蛍光を撮像部によって撮像する蛍光撮像ステップを備え、蛍光撮像ステップは、撮像部の観察窓を囲うように筒状の本体部を有する遮光部材の基端部を撮像部に取り付けた状態で、観察対象又は観察対象の載置面に遮光部材の先端部を突き当てることにより、観察対象と観察窓との間の空間を暗室にする暗室化ステップと、撮像部のフォーカス位置を調整するフォーカス調整ステップと、を含む。

この蛍光観察方法では、暗室化ステップにおいて、観察窓を囲うように取り付けた遮光部材の先端部を観察対象又は観察対象の載置面に突き当てることにより、観察対象と観察窓との間に暗室を形成している。これにより、背景光などの外乱光を撮像空間から排除することが可能となり、十分なＳ／Ｎ比を有する蛍光像を撮像部で取得できる。したがって、観察対象の識別を精度良く実施できる。また、この蛍光観察方法では、遮光部材の先端部を観察対象又は観察対象の載置面に突き当てることで、暗室の形成と同時に、観察窓から観察対象の位置までの距離を遮光部材の本体部の軸方向に沿う長さにすることができる。したがって、光像の定量的な評価を簡便に実施できる。

また、フォーカス調整ステップは、暗室化ステップよりも前に行われ、撮像部のフォーカス位置が遮光部材の先端部を含む面の位置となるように撮像部のフォーカス位置を調整してもよい。この場合、観察窓を囲うように取り付けた遮光部材の先端部を観察対象又は観察対象の載置面に突き当てることにより、暗室の形成と同時に、観察対象の位置を撮像部のフォーカス位置に合わせることができる。

また、遮光部材として、本体部が基端部から先端部に向かって内部空間の断面積が拡大するようにテーパ形状をなす遮光部材を用いてもよい。この場合、遮光部材の壁部で撮像部の視野が遮られてしまうことを防止できる。

また、遮光部材として、本体部の内面及び外面の少なくとも一方が黒色となっている遮光部材を用いてもよい。この場合、本体部の内面及び外面の少なくとも一方によって背景光を吸収できるので、暗室による外乱光の排除効果を更に高められる。

また、遮光部材として、先端部に観察対象の形状に応じた湾曲部を有する遮光部材を用いてもよい。このような湾曲部の形成により、遮光部材の先端部を観察対象の形状に沿わせて密着させることが可能となる。したがって、観察対象の形状に応じた暗室の形成が容易となる。

また、蛍光撮像ステップは、撮像部の観察窓を除く部分を覆うように滅菌カバーを撮像部に取り付ける第１取付ステップと、滅菌カバーにおける撮像部との取付部に対して遮光部材の基端部を着脱自在に取り付ける第２取付ステップと、を更に含んでもよい。この場合、撮像部自体を滅菌しなくとも、清潔な状態で観察対象からの蛍光を撮像できる。また、滅菌カバーを取り付けた状態の撮像部に対して遮光部材を容易に着脱できる。

また、蛍光観察方法は、観察対象に蛍光試薬を付与する試薬付与ステップを更に備え、蛍光撮像ステップにおいて、観察対象に励起光を照射し、励起光の照射に応じて観察対象で生じた蛍光を撮像部によって撮像してもよい。この場合、蛍光試薬により選択的に観察対象から蛍光が生じることを利用して、観察対象の識別を精度良く行うことができる。

本発明の一側面に係る蛍光観察装置は、観察対象からの蛍光を撮像する撮像部と、撮像部の観察窓を囲う筒状の本体部を有する遮光部材と、を備え、遮光部材の本体部は、撮像部に対して着脱自在に取り付けられる基端部と、観察対象又は観察対象の載置面に突き当てられる先端部と、を有し、本体部の軸方向に沿う長さは、基端部を撮像部に取り付けたときに先端部を含む面が撮像部のフォーカス調整範囲に含まれる長さとなっている。

この蛍光観察装置は、撮像部の観察窓を囲う筒状の本体部を有する遮光部材を備える。この遮光部材の先端部を観察対象又は観察対象の載置面に突き当てることにより、観察対象と観察窓との間に暗室が形成される。これにより、背景光などの外乱光を撮像空間から排除することが可能となり、十分なＳ／Ｎ比を有する蛍光像を撮像部で取得できる。したがって、観察対象の識別を精度良く実施できる。また、遮光部材の先端部を観察対象又は観察対象の載置面に突き当てることで、暗室の形成と同時に、観察窓から観察対象の位置までの距離を遮光部材の本体部の軸方向に沿う長さにすることができる。したがって、蛍光像の定量的な評価を簡便に実施できる。

本体部は、基端部から先端部に向かって内部空間の断面積が拡大するようにテーパ形状をなしていてもよい。この場合、遮光部材の壁部で撮像部の視野が遮られてしまうことを防止できる。

本体部の内面及び外面の少なくとも一方は、黒色となっていてもよい。この場合、本体部の内面及び外面の少なくとも一方によって背景光を吸収できるので、暗室による外乱光の排除効果を更に高められる。

先端部には、観察対象の形状に応じた湾曲部が設けられていてもよい。このような湾曲部の形成により、遮光部材の先端部を観察対象の形状に沿わせて密着させることが可能となる。したがって、観察対象の形状に応じた暗室の形成が容易となる。

撮像部には、観察窓を除く部分を覆うように滅菌カバーが取り付けられ、基端部には、滅菌カバーにおける撮像部との取付部に対して着脱自在に取り付けられる着脱部が設けられていてもよい。この場合、撮像部自体を滅菌しなくとも、清潔な状態で観察対象からの蛍光を撮像できる。また、滅菌カバーを取り付けた状態の撮像部に対して遮光部材を容易に着脱できる。

本発明の一側面に係る遮光部材は、観察対象からの蛍光を撮像する撮像部の観察窓を囲うように構成された筒状の本体部を備え、本体部は、撮像部に対して着脱自在に取り付けられる基端部と、観察対象又は観察対象の載置面に突き当てられる先端部と、を有し、本体部の軸方向に沿う長さは、基端部を撮像部に取り付けたときに先端部を含む面が撮像部のフォーカス調整範囲に含まれる長さとなっている。

この遮光部材は、撮像部の観察窓を囲うように構成された筒状の本体部を備える。この遮光部材の先端部を観察対象又は観察対象の載置面に突き当てることにより、観察対象と観察窓との間に暗室が形成される。これにより、背景光などの外乱光を撮像空間から排除することが可能となり、十分なＳ／Ｎ比を有する蛍光像を撮像部で取得できる。したがって、観察対象の識別を精度良く実施できる。また、遮光部材の先端部を観察対象又は観察対象の載置面に突き当てることで、暗室の形成と同時に、観察窓から観察対象の位置までの距離を遮光部材の本体部の軸方向に沿う長さにすることができる。したがって、蛍光像の定量的な評価を簡便に実施できる。

本体部は、基端部から先端部に向かって内部空間の断面積が拡大するようにテーパ形状をなしていてもよい。この場合、遮光部材の壁部で撮像部の視野が遮られてしまうことを防止できる。

本体部の内面及び外面の少なくとも一方は、黒色となっていてもよい。この場合、本体部の内面及び外面の少なくとも一方によって背景光を吸収できるので、暗室による外乱光の排除効果を更に高められる。

先端部には、観察対象の形状に応じた湾曲部が設けられていてもよい。このような湾曲部の形成により、遮光部材の先端部を観察対象の形状に沿わせて密着させることが可能となる。したがって、観察対象の形状に応じた暗室の形成が容易となる。

基端部には、撮像部の観察窓を除く部分を覆うように取り付けられる滅菌カバーにおける撮像部との取付部に対して着脱自在に取り付け可能な着脱部が設けられていてもよい。この場合、撮像部自体を滅菌しなくとも、清潔な状態で観察対象からの蛍光を撮像できる。また、滅菌カバーを取り付けた状態の撮像部に対して遮光部材を容易に着脱できる。

本発明によれば、蛍光像の定量的な評価を簡便に実施でき、かつ観察対象を精度良く識別できる蛍光観察方法、蛍光観察装置、及び遮光部材を提供することが可能となる。

図１は、蛍光観察装置の一実施形態を示すブロック図である。 図２は、図１の蛍光観察装置の撮像ユニットの斜視図である。 図３は、図１の蛍光観察装置の撮像ユニットの断面図である。 図４は、滅菌カバー及び遮光部材を取り付けた状態で示す蛍光観察装置の断面図である。 図５は、遮光部材の一例を示す斜視図である。 図６は、図４の蛍光観察装置において実行される蛍光観察方法を示すフローチャートである。 図７は、図６の蛍光観察方法における蛍光撮像ステップを示すフローチャートである。 図８の（ａ）及び（ｂ）は、蛍光観察方法における試薬付与ステップの一例を示す図である。 図９の（ａ）及び（ｂ）は、蛍光観察方法における第１取付ステップの一例を示す図である。 図１０の（ａ）は、蛍光観察方法における第２取付ステップの一例を示す図である。図１０の（ｂ）は、蛍光観察方法における暗室化ステップの一例を示す図である。 図１１は、変形例に係る遮光部材の斜視図である。 図１２は、図１１の遮光部材を備える蛍光観察装置において実行される蛍光観察方法の暗室化ステップを説明するための図である。 図１３は、他の変形例に係る遮光部材を備える蛍光観察装置において実行される蛍光観察方法の暗室化ステップを説明するための図である。

以下、図面を参照しながら、本発明に係る蛍光観察装置及び蛍光観察方法の好適な実施形態について詳細に説明する。

図１は、本発明の一実施形態に係る蛍光観察装置を示すブロック図である。蛍光観察装置１は、観察対象Ｐにおける特定の状態の識別に用いられる装置であり、観察対象Ｐからの蛍光を撮像して得られた蛍光像を表示する機能を有している。以下の説明では、観察対象Ｐは、例えば人間、動物等の生体から切除された生体組織であり、当該生体組織におけるがん細胞の有無を識別する場合を例示する。

蛍光像の観察においては、例えば予め観察対象Ｐに蛍光試薬等の試薬が付与される。試薬としては、例えば励起ピーク波長（励起波長）が３００ｎｍ〜８１０ｎｍの範囲内にあり、がん細胞に結合することで蛍光を発する蛍光試薬が用いられる。試薬には、インドシアニングリーンやインドシアニンブルー、５ＡＬＡ、フルオレセイン、パテントブルー、インジコカルミンなどの蛍光色素や、メチレンブルー、レザフリン、フォトフリンなどの光増感剤、Ｑｄｏｔ（登録商標）などのバイオマーカー等が含まれている。蛍光試薬の具体例としては、例えばＰＲＯＴＥＯ ＧＲＥＥＮ（登録商標）−ｇＧｌｕが挙げられる。この蛍光試薬は、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−glutamyltranspeptidase（ＧＧＴ））活性を持つがん細胞に反応して蛍光を発する。励起ピーク波長は、約４９６ｎｍとなっており、蛍光ピーク波長は、約５２５ｎｍとなっている。

蛍光観察装置１は、例えば蛍光像の撮像を行うハンディタイプの撮像ユニット（撮像部）１０と、撮像ユニット１０の動作の制御及び蛍光像の画像処理を実行するコントローラ２０と、蛍光像の表示を行う表示装置３０とを含んで構成されている。撮像ユニット１０は、通信ケーブルＣを介してコントローラ２０に対して相互に情報通信可能に接続されている。また、表示装置３０は、通信ケーブル（不図示）を介してコントローラ２０に対して相互に情報通信可能に接続されている。なお、撮像ユニット１０は、無線によってコントローラ２０に対して相互に情報通信可能に接続されてもよい。

図２は、図１の蛍光観察装置の撮像ユニットの斜視図である。図３は、図１の蛍光観察装置の撮像ユニットの断面図である。図２及び図３に示されるように、撮像ユニット１０は、筐体１１と、励起光源１２と、撮像カメラ１３とによって構成されている。この撮像ユニット１０は、観察対象Ｐに対して所定波長の励起光を照射し、これに応じて観察対象Ｐから発せられる蛍光像を観察することによって、組織表面又は組織中の画像を取得する装置として構成されている。

筐体１１は、例えばアルミ、銅、マグネシウム、鉄などの金属部材によって略円筒形状に形成されている。筐体１１の先端部１１ａは、後端部１１ｂに比べて大径となっており、その先端には円形の開口部１１ｃが設けられている。また、開口部１１ｃを覆うように、透明な窓部材１１ｄが取り付けられている。筐体１１の後端部１１ｂからは、上述した通信ケーブルＣが伸びている。先端部１１ａは、後端部１１ｂ側に設けられた固定部１１ｓと、先端側に設けられた回転部１１ｔと、を有する。固定部１１ｓ及び回転部１１ｔは、開口部１１ｃの中心軸を回転軸として互いに回転可能となっている。先端部１１ａは、固定部１１ｓに対して回転部１１ｔが回転することで、撮像カメラ１３のフォーカスレンズ（後述）がその光軸方向に移動されるように構成されている。固定部１１ｓは、後端部１１ｂに対して固定されていてもよい。

筐体１１は、励起光源１２を配置するための台座１１ｅを有している。台座１１ｅは、筐体１１と同様に、例えば金属部材によって形成されている。台座１１ｅは、略円盤状の支持体１１ｆと、円筒状の遮光壁１１ｇとを有している。遮光壁１１ｇは、支持体１１ｆの縁部に形成されている。台座１１ｅの中心には、観察対象Ｐからの蛍光像を撮像カメラ１３に向けて通過させるための円形の開口部１１ｈが形成されている。筐体１１では、窓部材１１ｄにおける開口部１１ｈに対応する部分は、撮像ユニット１０において観察対象Ｐからの蛍光が通過するする観察窓Ｒとして機能する。

励起光源１２は、蛍光を励起するための励起光を照射する部分である。励起光源１２としては、例えば発光ダイオード（ＬＥＤ）や半導体レーザ（ＬＤ）等が用いられる。例えば蛍光試薬としてＰＲＯＴＥＯ ＧＲＥＥＮ−ｇＧｌｕを用いる場合、励起光源１２から照射される励起光の波長は、３００ｎｍ〜６５０ｎｍであることが好ましい。また、例えば蛍光試薬としてインドシアニングリーンを用いる場合、励起光源１２から照射される励起光の波長は、７００ｎｍ〜８１０ｎｍであることが好ましい。ただし、インドシアニングリーンの蛍光の波長が８３０ｎｍ程度であることから、当該蛍光と励起光とを分離する必要がある場合、励起光源１２から照射される励起光の波長は、７６０ｎｍ程度であることが好ましい。

励起光源１２は、台座１１ｅにそれぞれ複数個が面実装され、観察窓Ｒ周りに環状に配置されている。撮像カメラ１３は、筐体１１の内部に配置され、撮像カメラ１３の光軸は、台座１１ｅにおける開口部１１ｈの中心軸Ｌと一致している。この撮像カメラ１３は、撮像カメラ１３のフォーカスレンズの焦点位置（以下、単に「フォーカス位置」ともいう）を調整するフォーカスレンズを含んで構成されている。フォーカスレンズには、例えばレンズマウント等の駆動手段が設けられている。この駆動手段によって撮像カメラ１３のフォーカスレンズがその光軸に沿う方向に駆動されることにより、フォーカス位置を調整することができる。フォーカス位置を調整できるため、撮像カメラ１３の観察窓Ｒからフォーカス位置までの距離である観察距離を変更することができる。撮像ユニット１０の先端部１１ａにおいて、回転部１１ｔは、駆動手段と連動して回転される。駆動手段によって固定部１１ｓに対して回転部１１ｔが回転されることで、フォーカスレンズをその光軸方向に移動させることができる。これにより、撮像カメラ１３は、フォーカス調整範囲内で観察距離を変更することができる。フォーカス調整範囲は、例えば、５０ｍｍ〜３００ｍｍの範囲である。つまり、撮像カメラ１３は、５０ｍｍ〜３００ｍｍの範囲で観察距離を変更することができる。また、撮像カメラ１３は、観察距離が遮光部材５０の筒状の本体部５１の長さＨとなるように、そのフォーカス位置を調整することができる。この観察距離の調整は、観察距離が本体部５１の長さＨとなるような自動的な調整であってもよいし、観察距離が本体部５１の長さＨとなるような蛍光観察装置１のユーザによる手動の調整であってもよい。観察距離の調整が手動の調整である場合、例えば、蛍光観察装置１のユーザは、先端部１１ａの回転部１１ｔに設けられた目印１１ｐを先端部１１ａの固定部１１ｓに設けられた目印１１ｐに合わせることで観察距離の調整を実現してもよい。また、回転部１１ｔに対して固定部１１ｓを回転させてもよい。

励起光源１２は、コントローラ２０からの制御を受けて励起光の照射のＯＮ／ＯＦＦが切り替えられる。なお、励起光の照射のＯＮとは、例えば励起光源１２を点灯させた状態であり、励起光の照射のＯＦＦとは、例えば励起光源１２を消灯させた状態である。また、励起光の照射のＯＦＦには、励起光の照射を完全に停止する場合のみに限られず、励起光の強度をＯＮの場合に比べて小さくすることを含む。

撮像カメラ１３は、蛍光像を撮像する部分である。撮像カメラ１３は、励起光波長域の光をカットすると共に蛍光波長域の光を透過させる分光フィルタと、分光フィルタを通して蛍光像を撮像する撮像素子とを含んで構成されている。撮像素子としては、例えば２次元画像を取得可能なＣＣＤイメージセンサ、或いはＣＭＯＳイメージセンサといったエリアイメージセンサが用いられる。また、撮像素子としては、蛍光像の波長帯域に対して高い感度を有する素子を用いることが好ましい。撮像カメラ１３は、取得した蛍光像の画像データをコントローラ２０に送信する。撮像カメラ１３によるシャッター動作は、コントローラ２０によって制御される。

コントローラ２０は、物理的には、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリ、及びＣＰＵ等のプロセッサ（演算回路）を内蔵するコンピュータシステムや、ＦＰＧＡ（Ｆｉｌｄ−Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｇａｔｅ Ａｒｒａｙ）やディジタル回路等で構成されるハードウェアシステムである。コントローラ２０は、図１に示すように、機能的な構成要素として、画像処理部２１と、制御部２２と、を有する。コントローラ２０では、メモリに格納されるプログラムをＣＰＵが実行することにより、画像処理部２１及び制御部２２での処理が実行される。

画像処理部２１は、撮像カメラ１３から送信された画像データに基づいて画像処理を実行して観察画像を生成する。画像処理部２１は、励起光の照射のＯＦＦ時に取得された画像データと、励起光の照射のＯＮ時に取得された画像データと、に基づいて、観察対象Ｐの背景像の画像である背景画像及び観察対象Ｐの蛍光像の画像である蛍光画像を生成する。また、画像処理部２１は、背景像と蛍光像とを含む観察画像を生成し、観察画像における背景像と蛍光像の輝度（画素値）を調整する。画像処理部２１は、例えば得られた蛍光画像データに対して黒レベル調整及びゲイン調整などを実行する。画像処理部２１は、画像処理によって得られた観察画像を表示装置３０に出力する。画像処理部２１で生成される観察画像は、動画及び静止画のいずれであってもよい。

制御部２２は、例えば励起光源１２による励起光の出力開始の指示や、フレームレートやコントラストといった画像取得条件の入力などを入力部（不図示）から受け、励起光源１２及び撮像カメラ１３の動作を制御する。制御部２２は、励起光源１２による励起光の照射と、撮像カメラ１３によるシャッター動作とを制御する。

表示装置３０は、画像処理部２１によって生成された観察画像を表示する装置である。表示装置３０としては、例えばＣＲＴモニタや、撮像カメラ１３に取り付けられた液晶ディスプレイ等を用いることができる。蛍光観察装置１には、表示装置３０以外の画像出力装置を設けてもよく、表示装置３０を設ける代わりに、得られた観察画像の画像データを外部装置に出力する構成としてもよい。

以上のような蛍光観察装置１を用いて観察対象Ｐの観察を行う場合、蛍光観察装置１に対して滅菌カバー４０と、遮光部材５０とを取り付ける。図４は、滅菌カバー及び遮光部材を取り付けた状態で示す蛍光観察装置の断面図である。滅菌カバー４０は、撮像ユニット１０周りを清浄な状態に維持するための部材である。滅菌カバー４０は、図４に示すように、撮像ユニット１０の先端部１１ａの外側に嵌め込まれる取付部４１と、取付部４１の基端側に設けられた袋部４２と、取付部４１の先端側に設けられた窓部材４３とを備える。

取付部４１は、中心軸Ｌと同軸となる円環状の筒部４１ａと、筒部４１ａの先端側において内向きに設けられたフランジ部４１ｂとを有している。筒部４１ａ及びフランジ部４１ｂは、例えばゴムなどの樹脂によって一体成型されている。筒部４１ａの内径は、撮像ユニット１０の先端部１１ａの外径と等しくなっている。筒部４１ａの外周面には、遮光部材５０の着脱に用いるネジ部４１ｃが形成されている。フランジ部４１ｂは、筒部４１ａの先端側において、撮像ユニット１０における先端部１１ａの筐体厚み程度の突出長を有している。

袋部４２は、例えば可視光に対する透明性を有するプラスチックフィルムなどによって形成されている。袋部４２は、撮像ユニット１０及び通信ケーブルＣを包み込むために十分な長さを有しており、初期状態では取付部４１の基端側において折り畳まれた状態で収納されている。窓部材４３は、例えば励起光及び蛍光に対する透明性を有するプラスチック板である。窓部材４３は、撮像ユニット１０における窓部材１１ｄと同等の面積の円板状をなし、窓部材４３の厚さは、フランジ部４１ｂの厚さと同程度となっている。窓部材４３は、フランジ部４１ｂと面一となるように、フランジ部４１ｂで画成される筒部４１ａの開口部分に嵌め込まれている。

取付部４１、袋部４２、及び窓部材４３は、いずれも滅菌処理によって滅菌された状態となっている。滅菌カバー４０を撮像ユニット１０に取り付ける際には、まず、折り畳まれた状態となっている袋部４２を通しながら、撮像ユニット１０の先端部１１ａに取付部４１を嵌合し、撮像ユニット１０の窓部材１１ｄを窓部材４３の内側面に当接させる。撮像ユニット１０に取付部４１を嵌合した後、袋部４２を撮像ユニット１０の後端部１１ｂ及び通信ケーブルＣ側に引き出す。これにより、撮像ユニット１０及び通信ケーブルＣが滅菌カバー４０によって覆われ、撮像ユニット１０周りの構成が清浄な状態に維持される。

遮光部材５０は、観察対象Ｐと観察窓Ｒとの間の空間を暗室にするための部材である。遮光部材５０は、図４及び図５に示されるように、滅菌カバー４０を介して撮像ユニット１０に対して取り付けられる基端部５１ａと、観察対象又は観察対象の載置面に突き当てられる先端部５１ｂと、を含む本体部５１を備えている。また、基端部５１ａには、遮光部材５０を撮像ユニット１０に対して着脱自在に取り付けるための着脱部５２が設けられている。本体部５１は、全体として略円錐台状をなし、壁部５１ｗ内に内部空間Ｓを有している。本体部５１の構成材料は、特に限定されないが、材料費や製造の容易さ等の観点から、例えばポリプロピレンまたはポリスチレン、ポリ塩化ビニール、ポリエチレンなどの樹脂であることが好ましい。

本体部５１は、壁部５１ｗによって撮像カメラ１３の視野が遮られてしまうことが無いように、例えば基端部５１ａから先端部５１ｂに向かって内部空間Ｓの断面積が拡大するようにテーパ形状をなしている。基端部５１ａ側の開口径は、撮像ユニット１０の窓部材１１ｄの径と同等若しくは僅かに大きくなっている。また、先端部５１ｂ側の開口径は、基端部５１ａ側の開口よりも大きくなっている。また、本体部５１のテーパ角θについても、壁部５１ｗによって撮像カメラ１３の視野が遮られることが無いように、例えば４０°〜９０°程度に設定されている。本体部５１のテーパ角θは、例えば、４５°〜８５°に設定されてもよい。

本体部５１の内面５１ｃ及び外面５１ｄの少なくとも一方は、全面にわたって黒色となっている。本体部５１を黒色とする手法は、特に限定はされないが、黒色塗料の塗布であってもよく、黒色の紙類・樹脂シート類等の貼り付けであってもよい。また、本体部５１の長さ（本体部５１の中心軸Ｍの方向に沿う基端部５１ａの端（観察窓Ｒに相当する位置）から先端部５１ｂの端までの長さ）は、撮像カメラ１３のフォーカス調整範囲（観察距離の調整が可能な範囲）に含まれるようになっている。すなわち、本体部５１の長さは、着脱部５２によって遮光部材５０を撮像ユニット１０に取り付けた状態において、撮像カメラ１３のフォーカス位置が先端部５１ｂを含む面の位置となるように調整可能なように設定されている。撮像カメラ１３のフォーカス位置は、観察対象Ｐの種類に応じて変更する必要があるため、観察対象Ｐに応じて、本体部５１の長さが異なる遮光部材５０を撮像ユニット１０に対して取り付けてもよい。

着脱部５２は、本体部５１の基端部５１ａから径方向外側に突出する段差部５２ａと、段差部５２ａの外縁に中心軸Ｍと同軸に設けられた円環状の筒部５２ｂとを有している。着脱部５２は、本体部５１と同材料で本体部５１と一体成型されていてもよく、本体部５１とは別体で成型され、本体部５１の基端部５１ａとして接合されていてもよい。また、着脱部５２の構成材料は、本体部５１の構成材料とは異なる樹脂であってもよい。

段差部５２ａは、径方向内側において、本体部５１の内部空間Ｓと連通する開口部５２ｃを有している。開口部５２ｃは、撮像ユニット１０の開口部１１ｃの径と略等しい径となっている。また、筒部５２ｂの内径は、滅菌カバー４０における取付部４１の筒部４１ａの外径と略等しくなっている。段差部５２ａの内周面には、取付部４１のネジ部４１ｃと螺合するネジ部５２ｄが形成されている。着脱部５２のネジ部５２ｄを取付部４１のネジ部４１ｃに螺合することにより、遮光部材５０が撮像ユニット１０に対して着脱自在に取り付けられ、撮像ユニット１０の観察窓Ｒが本体部５１によって囲われた状態となる。

以上のように構成された蛍光観察装置１を用いて実行される蛍光観察方法について、図６〜図１０を参照して説明する。

図６に示されるように、この蛍光観察方法では、始めに試薬付与ステップを実施する（Ｓ０１）。試薬付与ステップＳ０１では、観察対象Ｐを準備して、観察対象Ｐの表面に蛍光試薬を付与する。具体的には、試薬付与ステップＳ０１では、図８の（ａ）に示されるように、観察対象Ｐとして、人間、動物等の生体から切除された生体組織を準備して載置面１００に載置する。そして、図８の（ｂ）に示されるように、載置面１００に観察対象Ｐを載置した状態で、観察対象Ｐに蛍光試薬を付与する。図８の（ｂ）の例では、噴射装置ＳＰにより、観察対象Ｐの表面に向けて所定量の蛍光試薬を噴射している。これにより、観察対象Ｐの表面に最適な量の蛍光試薬が付与される。

続いて、観察対象Ｐからの蛍光を撮像ユニット１０によって撮像する蛍光撮像ステップを実施する（Ｓ０２）。蛍光撮像ステップＳ０２の後、蛍光撮像ステップＳ０２で得た観察画像を、表示装置３０によって表示する表示ステップを実施する（Ｓ０３）。蛍光撮像ステップＳ０２は、図７に示されるように、第１取付ステップ（Ｓ２１）、第２取付ステップ（Ｓ２２）、フォーカス調整ステップ（Ｓ２３）、暗室化ステップ（Ｓ２４）、励起光照射ステップ（Ｓ２５）、及び撮像ステップ（Ｓ２６）を含む。

第１取付ステップＳ２１では、撮像ユニット１０の観察窓Ｒを除く部分を覆うように滅菌カバー４０を撮像ユニット１０に取り付ける。まず、図９の（ａ）に示されるように、折り畳まれた状態となっている袋部４２を通しながら、撮像ユニット１０の先端部１１ａに取付部４１を嵌合し、撮像ユニット１０の窓部材１１ｄを窓部材４３の内側面に当接させる。その後、図９の（ｂ）に示されるように、撮像ユニット１０に取付部４１を嵌合した後、袋部４２を撮像ユニット１０の後端部１１ｂ及び通信ケーブルＣ側に引き出す。これにより、撮像ユニット１０及び通信ケーブルＣが滅菌カバー４０によって覆われ、撮像ユニット１０周りの構成が清浄な状態に維持される。

第２取付ステップＳ２２（図７参照）では、図１０の（ａ）に示されるように、滅菌カバー４０の取付部４１に着脱部５２を嵌合し、着脱部５２のネジ部５２ｄを取付部４１のネジ部４１ｃに螺合することにより、滅菌カバー４０の取付部４１に対して遮光部材５０を取り付ける。これにより、撮像ユニット１０の観察窓Ｒが本体部５１によって囲われた状態となる。

フォーカス調整ステップＳ２３（図７参照）では、撮像カメラ１３の観察距離が遮光部材５０の筒状の本体部５１の長さＨとなるように、撮像カメラ１３のフォーカス位置を調整する。なお、このフォーカス調整ステップＳ２３は、第２取付ステップＳ２２の前に行われてもよいし、後述する暗室化ステップＳ２４の後に行われてもよい。

暗室化ステップＳ２４では、図１０の（ｂ）に示されるように、観察対象Ｐの載置面１００に遮光部材５０の先端部５１ｂを突き当てる。このとき、上述したように、遮光部材５０の本体部の内面５１ｃ及び外面５１ｄの少なくとも一方は、黒色となっており、撮像カメラ１３の観察距離は、本体部５１の長さに対応するように設定されている。したがって、観察対象Ｐの載置面１００に遮光部材５０の先端部５１ｂを突き当てることで、観察対象Ｐと観察窓Ｒとの間の空間（内部空間Ｓ）を暗室にすると共に、観察対象Ｐの位置を撮像カメラ１３の観察距離に合わせることができる。なお、観察対象Ｐの大きさや形状等によっては、遮光部材５０の先端部５１ｂを載置面１００に突き当てるだけでは、撮像カメラ１３のフォーカス位置が観察対象Ｐの位置に合わない場合がある。そこで、更に撮像カメラ１３のフォーカス位置を調整することによって、撮像カメラ１３のフォーカス位置と観察対象Ｐの位置とを合わせてもよい。

励起光照射ステップＳ２５（図７参照）では、上述した暗室の形成及び観察対象Ｐと撮像カメラ１３のフォーカス位置との位置合わせの後、観察対象Ｐに励起光を照射する。そして、撮像ステップＳ２６では、励起光の照射に応じて観察対象Ｐで生じた蛍光を撮像ユニット１０によって撮像し、蛍光像の画像処理によって観察画像を得る。

以上説明したように、蛍光観察装置１、蛍光観察装置１において実行される蛍光観察方法、及び遮光部材５０によれば、観察窓Ｒを囲うように取り付けた遮光部材５０の先端部５１ｂを観察対象Ｐの載置面１００に突き当てることにより、観察対象Ｐと観察窓Ｒとの間に暗室が形成される。これにより、背景光などの外乱光を撮像空間（内部空間Ｓ）から排除することが可能となり、十分なＳ／Ｎ比を有する蛍光像を撮像ユニット１０で取得できる。したがって、観察対象Ｐの識別を精度良く実施できる。また、暗室化ステップＳ２４の前にフォーカス調整ステップＳ２３を行うことにより、遮光部材５０の先端部５１ｂを観察対象Ｐの載置面１００に突き当てることで、暗室の形成と同時に、遮光部材５０の筒状の本体部５１の長さＨに基づいて観察対象Ｐの位置を撮像カメラ１３のフォーカス位置に合わせることができる。したがって、蛍光像の定量的な評価を簡便に実施できる。

本実施形態では、蛍光撮像ステップＳ０２は、撮像ユニット１０の観察窓Ｒを除く部分を覆うように滅菌カバー４０を撮像ユニット１０に取り付ける第１取付ステップＳ２１と、滅菌カバー４０における撮像ユニット１０との取付部４１に対して遮光部材５０の基端部５１ａを着脱自在に取り付ける第２取付ステップＳ２２と、を更に含んでいる。これにより、撮像ユニット１０自体を滅菌しなくとも、清潔な状態で観察対象Ｐからの蛍光を撮像できる。また、滅菌カバー４０を取り付けた状態の撮像ユニット１０に対して遮光部材５０を容易に着脱できる。

本実施形態では、観察対象Ｐに蛍光試薬を付与する試薬付与ステップＳ０１を更に備え、蛍光撮像ステップＳ０２において、観察対象Ｐに励起光を照射し、励起光の照射に応じて観察対象Ｐで生じた蛍光を撮像カメラ１３によって撮像している。これにより、蛍光試薬により選択的に観察対象Ｐから蛍光が生じることを利用して、観察対象Ｐの識別を精度良く行うことができる。

また、本実施形態では、遮光部材５０の本体部５１が基端部５１ａから先端部５１ｂに向かって内部空間Ｓの断面積が拡大するようにテーパ形状をなしている。これにより、遮光部材５０の壁部５１ｗで撮像カメラ１３の視野が遮られてしまうことを防止できる。

また、本実施形態では、遮光部材５０における本体部５１の内面５１ｃ及び外面５１ｄの少なくとも一方が黒色となっている。これにより、内面５１ｃ及び外面５１ｄの少なくとも一方によって背景光を吸収できるので、暗室による外乱光の排除効果を更に高められる。

また、本実施形態では、蛍光観察装置１によって観察対象Ｐの観察を行うにあたって、撮像ユニット１０に滅菌カバー４０が取り付けられ、遮光部材５０は、滅菌カバー４０における撮像ユニット１０との取付部４１に対して着脱自在に取り付けられる。これにより、撮像ユニット１０自体を滅菌しなくとも、清潔な状態で観察対象Ｐからの蛍光を撮像できる。また、滅菌カバー４０を取り付けた状態の撮像ユニット１０に対して遮光部材５０を容易に着脱できる。

本発明は、上述した実施形態に限定されるものではない。

例えば上記実施形態では、観察対象Ｐが生体から切除された生体組織であり、当該観察対象Ｐが載置面１００に載置されている場合を例示したが、観察対象Ｐが人体等の一部であり、観察対象Ｐを直接観察する形態であってもよい。この場合、遮光部材５０の先端部５１ｂには、観察対象の形状に応じた湾曲部が設けられていてもよい。図１１は、人体の腕部を観察対象Ｐとする場合の遮光部材の変形例である。同図に示す遮光部材５０Ａでは、先端部５１ｂに一対の湾曲部５３が設けられている。湾曲部５３では、腕部の断面形状に応じて壁部５１ｗが基端部５１ａに向かって凹状に切り欠かれた状態となっている。

また、湾曲部５３の縁部には、弾性部材５４が設けられている。湾曲部５３の縁部にのみ弾性部材５４を配置することで、観察対象Ｐに遮光部材５０を突き当てる際の圧力の緩和、及び観察対象Ｐに対する追従性の確保が図られるほか、遮光部材５０Ａの保形性も十分に担保できる。弾性部材５４としては、例えば黒色のスポンジを用いることが好適である。この場合、遮光部材５０Ａによる暗室の形成効果が阻害されることもない。このような遮光部材５０Ａを用いる場合、図１２に示されるように、載置面１００に置いた腕部に湾曲部５３が宛がわれるようにして、遮光部材５０Ａの先端部５１ｂを載置面１００に突き当てればよい。また、観察対象Ｐが人体の胸部の場合、図１３に示されるように、湾曲部５３の形状を図１２の場合に比べて緩やかな曲線とする。そして、湾曲部５３を含めた遮光部材５０Ａの先端部５１ｂを胸部に突き当てればよい。

また、上記実施形態では、本体部５１は、全体として略円錐台状をなしていたが、本体部５１の形状は、これに限定されない。例えば、本体部５１は、略角錐台状をなしていてもよい。この場合、基端部５１ａ側の開口は、撮像ユニット１０の窓部材１１ｄにおける観察窓Ｒの大きさと同等若しくは僅かに大きくなっている。また、先端部５１ｂ側の開口は、基端部５１ａ側の開口よりも大きくなっている。

また、上記実施形態では、本体部５１は、基端部５１ａから先端部５１ｂに向かって内部空間Ｓの断面積が拡大するようにテーパ形状をなしていたが、本体部５１の形状は、これに限定されない。例えば、本体部５１は、円筒状或いは角筒状であってもよい。この場合、先端部５１ｂ側において壁部５１ｗによって撮像カメラ１３の視野が遮られてしまうことが無いように、内部空間Ｓの断面積が設定されている。

また、上記実施形態では、本体部５１の内面５１ｃ及び外面５１ｄの少なくとも一方は、全面にわたって黒色となっていたが、本体部５１の内面５１ｃ及び外面５１ｄの少なくとも一方に付与する色は、黒色以外の色であってもよい。暗室による外乱光の排除効果を高めるためには、背景光を吸収できる濃色の色が好ましい。例えば、濃紺、焦げ茶色、濃灰色といった、観察対象Ｐからの蛍光の波長に近い波長を有する外乱光の反射率が比較的低い色であればよい。

また、上記実施形態では、蛍光像の観察において予め観察対象Ｐに蛍光試薬等の試薬が付与されていたが、観察対象Ｐに試薬を付与せずに蛍光試薬の付与に依拠しない蛍光（例えば、自家蛍光）を観察してもよい。この場合においても、蛍光観察装置１、蛍光観察装置１において実行される蛍光観察方法、及び遮光部材５０によれば、暗室の形成と同時に、観察対象Ｐの位置を撮像カメラ１３のフォーカス位置に合わせることができることから、観察すべき蛍光のＳ／Ｎ比が高まり、蛍光像の観察により観察対象の識別を精度良く行うことができる。

１…蛍光観察装置、１０…撮像ユニット（撮像部）、１１ａ…先端部、１１ｂ…後端部、４０…滅菌カバー、４１…取付部、５０，５０Ａ…遮光部材、５１…本体部、５１ａ…基端部、５１ｂ…先端部、５１ｃ…内面、５１ｄ…外面、５２…着脱部、５３…湾曲部、１００…載置面、Ｈ…長さ、Ｐ…観察対象、Ｒ…観察窓、Ｓ…内部空間。

Claims (13)

1. 観察対象からの蛍光を撮像部によって撮像する蛍光撮像ステップを備え、
   前記蛍光撮像ステップは、前記撮像部の観察窓を囲うように筒状の本体部を有する遮光部材の基端部を前記撮像部に取り付けた状態で、前記観察対象又は前記観察対象の載置面に前記遮光部材の先端部を突き当てることにより、前記観察対象と前記観察窓との間の空間を暗室にする暗室化ステップと、前記撮像部のフォーカス位置が前記遮光部材の前記先端部を含む面の位置となるように前記撮像部の前記フォーカス位置を調整するフォーカス調整ステップと、を含む蛍光観察方法。
2. 前記フォーカス調整ステップは、前記暗室化ステップよりも前に行われる、請求項１記載の蛍光観察方法。
3. 前記遮光部材として、前記本体部が前記基端部から前記先端部に向かって内部空間の断面積が拡大するようにテーパ形状をなす遮光部材を用いる請求項１又は２記載の蛍光観察方法。
4. 前記遮光部材として、前記本体部の内面及び外面の少なくとも一方が黒色となっている遮光部材を用いる請求項１〜３のいずれか一項記載の蛍光観察方法。
5. 前記遮光部材として、前記先端部に前記観察対象の形状に応じた湾曲部を有する遮光部材を用いる請求項１〜４のいずれか一項記載の蛍光観察方法。
6. 前記蛍光撮像ステップは、前記撮像部の前記観察窓を除く部分を覆うように滅菌カバーを前記撮像部に取り付ける第１取付ステップと、前記滅菌カバーにおける前記撮像部との取付部に対して前記遮光部材の前記基端部を着脱自在に取り付ける第２取付ステップと、を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項記載の蛍光観察方法。
7. 前記観察対象に蛍光試薬を付与する試薬付与ステップを更に備え、
   前記蛍光撮像ステップにおいて、前記観察対象に励起光を照射し、前記励起光の照射に応じて前記観察対象で生じた蛍光を前記撮像部によって撮像する請求項１〜６のいずれか一項記載の蛍光観察方法。
8. 観察対象からの蛍光を撮像する撮像部と、
   前記撮像部の観察窓を囲う筒状の本体部を有する遮光部材と、を備え、
   前記遮光部材の前記本体部は、
   前記撮像部に対して着脱自在に取り付けられる基端部と、
   前記観察対象又は前記観察対象の載置面に突き当てられる先端部と、を有し、
   前記本体部の軸方向に沿う長さは、前記基端部を前記撮像部に取り付けたときに前記撮像部のフォーカス位置が前記遮光部材の前記先端部を含む面の位置となる、蛍光観察装置。
9. 前記本体部は、前記基端部から前記先端部に向かって内部空間の断面積が拡大するようにテーパ形状をなしている請求項８記載の蛍光観察装置。
10. 前記本体部の内面及び外面の少なくとも一方は、黒色となっている請求項８又は９記載の蛍光観察装置。
11. 前記先端部には、前記観察対象の形状に応じた湾曲部が設けられている請求項８〜１０のいずれか一項記載の蛍光観察装置。
12. 前記撮像部には、前記観察窓を除く部分を覆うように滅菌カバーが取り付けられ、
    前記基端部には、前記滅菌カバーにおける前記撮像部との取付部に対して着脱自在に取り付けられる着脱部が設けられている請求項８〜１１のいずれか一項記載の蛍光観察装置。
13. 観察対象からの蛍光を撮像する撮像部の観察窓を囲うように構成された筒状の本体部を備え、
    前記本体部は、
    前記撮像部に対して着脱自在に取り付けられる基端部と、前記観察対象又は前記観察対象の載置面に突き当てられる先端部と、を有し、
    前記本体部の軸方向に沿う長さは、前記基端部を前記撮像部に取り付けたときに前記撮像部のフォーカス位置が前記先端部を含む面の位置となる、遮光部材。

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