JP6629749B2 - アシル−ａｃｐチオエステラーゼを用いた脂質の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを用いた脂質の製造方法に関する。また、本発明は当該方法に用いるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、これをコードする遺伝子、及び該遺伝子を導入した形質転換体に関する。

脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとのエステル結合により生成するトリアシルグリセロール等の脂質を構成する。また、多くの動植物において脂肪酸はエネルギー源として貯蔵され利用される物質でもある。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質は、食用又は工業用として広く利用されている。
例えば、炭素数１２〜１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として利用されている。また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として利用されている。そしてこれらの界面活性剤は、いずれも洗浄剤又は殺菌剤に利用されている。同じ高級アルコールの誘導体としてアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アミン塩は、繊維処理剤や毛髪リンス剤又は殺菌剤等に日常的に利用されている。また、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤として日常的に利用されている。さらに、炭素数１８前後の高級アルコールは植物の成長促進剤としても有用である。

このように脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたり、そのため植物等において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みが行われている。さらに、脂肪酸の用途や有用性はその炭素数に依存するため、脂肪酸の炭素数、即ち鎖長を制御する試みも行われている。
例えば、ゲッケイジュ（Umbellularia californica（California bay））由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの導入により炭素数１２の脂肪酸を蓄積させる方法（特許文献１、非特許文献１）等が提案されている。

近年、バイオ燃料生産に有用であるとして、藻類が注目を集めている。藻類は、バイオディーゼル燃料として利用可能な脂質を光合成によって生産でき、しかも食料と競合しないことから、次世代のバイオマス資源として注目されている。また、藻類は、植物に比べ、高い脂質生産・蓄積能力を有するとの報告もある。
藻類の脂質合成メカニズムやそれを応用した生産技術について研究が始まってはいるが、未解明な部分も多い。例えば、上述のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼについても、現在のところ、藻類由来のものはほとんど報告されておらず、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属等でわずかに報告例があるのみである（例えば、特許文献２）。

国際公開第９２／２０２３６号 国際公開第２０１４／１０３９３０号

Voelker TA，et al.，Science，1992，vol．257(5066)，p．72-74

本発明は、宿主に下記タンパク質(A)〜(C)のいずれか１つをコードする遺伝子が導入されている形質転換体を培養し、培養物から脂質を採取する、脂質の製造方法に関する。
(A)配列番号１の９１位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)配列番号１の９１位〜３４８位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
(C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。

また、本発明は、前記タンパク質(A)〜(C)（以下、本発明のタンパク質又はアシル−ＡＣＰチオエステラーゼともいう。）に関する。
また、本発明は、前記タンパク質(A)〜(C)のいずれか１つをコードする遺伝子（以下、本発明の遺伝子ともいう。）に関する。
また、本発明は、前記タンパク質(A)〜(C)のいずれか１つをコードする遺伝子を宿主に導入してなる形質転換体に関する。

本発明の上記及び他の特徴及び利点は、下記の記載からより明らかになるであろう。

本発明は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、藻類由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを用いた脂質の製造方法の提供に関する。
また、本発明は、前記方法に好適に用いることができる、藻類由来の新規アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、及びこれをコードする遺伝子の提供に関する。
また、本発明は、前記遺伝子の発現を促進させ、脂質の生産性又は脂肪酸組成が変化した形質転換体の提供に関する。

本発明者は、藻類由来の新たなアシル−ＡＣＰチオエステラーゼについて研究を行った。その結果、ナンノクロロプシス属に属する藻類から、新規のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びこれをコードするアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を見出した。そして、当該アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を用いて形質転換を行った結果、形質転換体において、脂質中の総脂肪酸成分における特定の脂肪酸の含有率が有意に向上することを見出した。
本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。

本発明によれば、新規アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、これをコードする遺伝子、及び当該遺伝子が導入されている形質転換体を提供することができる。当該形質転換体を用いた本発明の製造方法は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性に優れる。特に、本発明の製造方法は、炭素数が８〜１６、好ましくは炭素数が１２〜１６、より好ましくは炭素数が１２〜１４、より好ましくは炭素数が１２及び１４、より好ましくは炭素数が１４の脂肪酸、又はこれらを構成成分とする脂質の生産性に優れる。
本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、これをコードする遺伝子、形質転換体、及び製造方法は、脂肪酸又は脂質の工業的生産に好適に用いることができる。

本発明において「脂質」には、単純脂質、複合脂質及び誘導脂質が含まれ、具体的には、脂肪酸、脂肪族アルコール類、炭化水素類（アルカン等）、中性脂質（トリアシルグリセロール等）、ろう、セラミド、リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等が含まれる。
また本明細書において、脂肪酸や脂肪酸を構成するアシル基の表記において「Ｃｘ：ｙ」とあるのは、炭素原子数がｘで二重結合の数がｙであることを表す。「Ｃｘ」は炭素原子数ｘの脂肪酸やアシル基を表す。
さらに本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science，1985，vol．227，p．1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
また本明細書において「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook，David W．Russell.，Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
また、本明細書において、「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。
さらに本明細書において「中鎖」とは、脂肪酸又は脂肪酸残基の炭素数が８以上１６以下であることをいう。
以下、本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、これを用いた形質転換体及び脂質の製造方法について順に説明する。

１．アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ
本発明のタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列中の少なくとも９１位〜３４８位までのアミノ酸配列を有するタンパク質、及び当該タンパク質と機能的に均等なタンパク質である。
アシル−ＡＣＰ（アシルキャリヤープロテイン）チオエステラーゼは、脂肪酸やその誘導体（トリアシルグリセロール（トリグリセリド）等）の生合成系に関与する酵素である。当該酵素は、植物体や藻類では葉緑体等の色素体内において、細菌・真菌や動物体では細胞質内において、脂肪酸生合成過程の中間体であるアシル−ＡＣＰ（脂肪酸残基であるアシル基とアシルキャリヤープロテインとからなる複合体）のチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する。アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの作用によって、ＡＣＰ上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸はトリアシルグリセロール等の合成に供される。
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼには、基質であるアシル−ＡＣＰを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応特異性を示す複数のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼが存在していることが知られている。よってアシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、生体内での脂肪酸組成を決める重要なファクターであると考えられている。
本発明において、「アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性」とは、アシル−ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解する活性をいう。

本発明のタンパク質として、具体的には以下のタンパク質(A)〜(C)が挙げられる。
(A)配列番号１の９１位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)配列番号１の９１位〜３４８位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
(C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。

配列番号１は、ナンノクロロプシス属に属する藻類であるナンノクロロプシス・オキュラータ（Nannochloropsis oculata）由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（以下、NoTE2とも略記する）のアミノ酸配列である。
本発明者は、配列番号１のアミノ酸配列中、９１位〜３４８位の領域がアシル−ＡＣＰチオエステラーゼとして機能するために重要で、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を示すために十分な領域であることを見出した。すなわち、配列番号１の９１位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質、及び当該配列を含むアミノ酸配列からなるタンパク質は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有する。
タンパク質(A)は、このアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性にとって十分な領域を有し、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼとして機能する。

タンパク質(B)は、配列番号１の９１位〜３４８位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有する。
一般に、酵素タンパク質をコードしているアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければ酵素活性を示さないというものではなく、アミノ酸配列が変化しても酵素活性に影響を与えない領域も存在することが知られている。このような酵素活性に必須でない領域においては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加といった変異が導入されても酵素本来の活性を維持することができる。本発明においても、このようにアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性が保持され、かつアミノ酸配列が一部変異したタンパク質を用いることができる。
タンパク質(B)において、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性の点から、配列番号１の９１位〜３４８位のアミノ酸配列との同一性は、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９６％以上がよりさらに好ましく、９７％以上がよりさらに好ましく、９８％以上がよりさらに好ましく、９９％以上がよりさらに好ましい。

また、タンパク質(B)において、配列番号１の９１位〜３４８位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列としては、配列番号１の９１位〜３４８位のアミノ酸配列において１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、よりさらに好ましくは１個以上１０個以下、よりさらに好ましくは１個以上８個以下、よりさらに好ましくは１個以上５個以下、よりさらに好ましくは１個以上４個以下、よりさらに好ましくは１個以上３個以下、よりさらに好ましくは１又は２個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列が挙げられる。
なお、アミノ酸配列に欠失、置換、挿入、付加等の変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。塩基配列に変異を導入する方法については、後述する。

タンパク質(C)は、そのアミノ酸配列の一部として前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を含み、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を示す。タンパク質(C)は、前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列以外の配列を含んでいてもよい。
タンパク質(C)を構成するアミノ酸配列中、前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列以外の配列としては、例えば、配列番号１のうちの９１位〜３４８位以外の任意のアミノ酸配列、配列番号１のうちの９１位〜３４８位以外の任意のアミノ酸配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９６％以上、よりさらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列、又はこれらの配列に１若しくは数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１若しくは２個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列、等が挙げられる。これらの配列は、前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列のＮ末端側に付加されることが好ましい。
また、タンパク質(C)として、前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列にタンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチドが付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質も好ましい。シグナルペプチドの付加の例としては、葉緑体移行シグナルペプチドのＮ末端への付加等が挙げられる。

前記タンパク質(C)として、配列番号１の１〜９０位の任意の位置でＮ末端側のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。
さらに、特定の脂肪酸、例えば中鎖脂肪酸、具体的には炭素数が１２又は１４の脂肪酸、の生産性の点からは、タンパク質(C)としては、下記タンパク質(C1)〜(C7)が好ましい。
(C1)配列番号１の１位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C2)配列番号１の６１位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C3)配列番号１の７１位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C4)配列番号１の７４位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C5)配列番号１の８１位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C6)前記タンパク質(C1)〜(C5)のいずれか１つのアミノ酸配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９６％以上、よりさらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
(C7)前記タンパク質(C1)〜(C5)のいずれか１つのアミノ酸配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１又は２個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
なお、前記タンパク質(C1)〜(C5)がアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有することは、本発明者により確認されている。

タンパク質がアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有することは、例えば、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を連結したＤＮＡを脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析することにより、確認することができる。
また、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を連結したＤＮＡを宿主細胞へ導入し、導入したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、Yuanらの方法（Yuan L，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1995，vol．92(23)，p．10639-10643）によって調製した各種アシル−ＡＣＰを基質とした反応を行うことにより、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を測定することができる。

本発明のタンパク質の取得方法については特に制限はなく、通常行われる化学的或いは遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、化学合成によりタンパク質合成を行ってもよく、遺伝子組み換え技術により組換えタンパク質を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を用いることができる。
また、ナンノクロロプシス・オキュラータ等のナンノクロロプシス属に属する藻類は、私的又は公的な研究所等の保存機関より入手することもできる。例えば、The culture collection of algae at University of Texas at Austin（UTEX）、独立行政法人国立環境研究所（NIES）、National Center for Marine Algae and Microbiota（NCMA：旧CCMP)、Culture Collection of Algae and Protozoa（CCAP）、Australian National Algae Culture Collection（CSIRO）等から入手できる。

２．アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子
本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子は、前記タンパク質(A)〜(C)のいずれか１つをコードする遺伝子である。
タンパク質(A)〜(C)のいずれか１つをコードする遺伝子の例として、配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。配列番号２に示す塩基配列は、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子の塩基配列の一例であり、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする。そして配列番号２の２７１位〜１０４４位の塩基配列は、配列番号１の９１位〜３４８位のアミノ酸配列をコードする。なお、配列番号２の１０４５位〜１０４７位の塩基配列は終止コドンであり、アミノ酸には対応していない。

前記タンパク質(A)〜(C)のいずれか１つをコードする遺伝子の具体例として、下記ＤＮＡ(a)〜(c)のいずれか１つからなる遺伝子が例示できる。しかし、本発明はこれらに限定されるものではない。
(a)配列番号２の２７１位〜１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(b)配列番号２の２７１位〜１０４７位の塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(c)前記ＤＮＡ(a)又は(b)の塩基配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

ＤＮＡ(b)において、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性の点から、配列番号２の２７１位〜１０４７位の塩基配列との同一性は、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９６％以上がよりさらに好ましく、９７％以上がよりさらに好ましく、９８％以上がよりさらに好ましく、９９％以上がよりさらに好ましい。

また、ＤＮＡ(b)において、配列番号２の２７１位〜１０４７位の塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列としては、配列番号２の２７１位〜１０４７位の塩基配列において１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１又は２個、の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列が挙げられる。
塩基配列に欠失、置換、挿入、付加等の変異を導入する方法としては、例えば、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing overlap extension（SOE）PCR（Horton et al.，Gene，1989，vol．77，p．61-68）を利用した方法、ＯＤＡ法（Hashimoto-Gotoh et al.，Gene，1995，vol．152，p．271-276）、Kunkel法（Kunkel，T．A.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1985，vol．82，p．488）等が挙げられる。また、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。

さらにＤＮＡ(b)として、ＤＮＡ(a)と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。

ＤＮＡ(c)は、その塩基配列の一部として前記ＤＮＡ(a)又は(b)の塩基配列を含み、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする。ＤＮＡ(c)は、前記ＤＮＡ(a)又は(b)の塩基配列以外の配列を含んでいてもよい。
ＤＮＡ(c)の塩基配列中、前記ＤＮＡ(a)又は(b)の塩基配列以外の配列としては、例えば、配列番号２のうちの２７１位〜１０４７位以外の任意の塩基配列、配列番号２のうちの２７１位〜１０４７位以外の任意の塩基配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９６％以上、よりさらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、の塩基配列、又は配列番号２のうちの２７１位〜１０４７位以外の任意の塩基配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１若しくは２個、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列、等が挙げられる。
また、前記ＤＮＡ(a)又は(b)の塩基配列以外の配列としては、タンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチドをコードする塩基配列も好ましい。シグナルペプチドとしては、前記タンパク質(C)で述べたものが挙げられる。
これらの配列は、前記ＤＮＡ(a)又は(b)の塩基配列の5'末端側に付加されることが好ましい。

前記ＤＮＡ(c)として、配列番号２の１〜２７０位の任意の位置で5'末端側が欠失した塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。
さらに、特定の脂肪酸、例えば中鎖脂肪酸、具体的には炭素数が１２又は１４の脂肪酸、の生産性の点からは、ＤＮＡ(c)としては、下記ＤＮＡ(c1)〜(c7)が好ましい。
(c1)配列番号２の１位〜１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c2)配列番号２の１８１位〜１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c3)配列番号２の２１１位〜１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c4)配列番号２の２２０位〜１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c5)配列番号２の２４１位〜１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c6)前記ＤＮＡ(c1)〜(c5)のいずれか１つの塩基配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９６％以上、よりさらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(c7)前記ＤＮＡ(c1)〜(c5)のいずれか１つの塩基配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１又は２個、の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
なお、前記ＤＮＡ(c1)〜(c5)のいずれか１つからなる遺伝子がアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードしていることは、本発明者により確認されている。

本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の取得方法としては、特に制限されず、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列又は配列番号２に示す塩基配列に基づいて、人工合成により遺伝子を取得することができる。遺伝子の人工合成は、例えば、ユーロフィンジェノミクス社等のサービスを利用することができる。また、ナンノクロロプシス・オキュラータからクローニングによって取得することもでき、例えば、Molecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook，David W. Russell，Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。

３．形質転換体
（１）第１の態様
本発明の形質転換体の第１の態様は、前記タンパク質(A)〜(C)のいずれか１つをコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体である。
当該形質転換体では、脂質の生産能、特に炭素数が１２〜１６の中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産能（中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産量、生産される全脂肪酸に占める中鎖脂肪酸の割合、生産される全脂質に占める中鎖脂肪酸を構成成分とする脂質の割合）が有意に向上する。また、当該形質転換体では、宿主と比べ、脂質中の脂肪酸組成（生産される全脂肪酸に対する特定の脂肪酸の割合、生産される全脂質に占める特定の脂肪酸を構成成分とする脂質の割合）が変化する。そのため、当該形質転換体を用いた本発明は、特定の脂質、特に中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、好ましくは炭素数８以上１６以下の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素数１２以上１６以下の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素数が１２以上１４以下の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、よりさらに好ましくは炭素数が１２及び１４の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、よりさらに好ましくは炭素数が１４の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、の生産に好適に用いることができる。
さらに、本態様の形質転換体は、宿主自体に比べ、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が有意に向上する。そのため、当該形質転換体を用いた本発明は、脂質の生産に好適に用いることができる。
なお、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの脂肪酸又は脂質の生産能については、実施例で用いた方法により測定することができる。また本明細書において、目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させたものを「形質転換体」ともいい、目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させていないものを「宿主」又は「野生株」ともいう。

アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の発現を促進させる方法としては、常法より適宜選択することができる。例えば、前記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を宿主に導入する方法、前記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子をゲノム上に有する宿主において、当該遺伝子の発現調節領域（プロモーター、ターミネーター等）を改変する方法、などが挙げられる。

アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を宿主に導入して前記遺伝子の発現を促進させる方法について説明する。
本発明で好ましく用いることができる形質転換体は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を、通常の遺伝子工学的方法によって宿主に導入することで得られる。具体的には、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる発現ベクターや遺伝子発現カセットを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。

形質転換体の宿主としては特に限定されず、通常用いられるものより適宜選択することができる。例えば、微生物（藻類や微細藻類を含む）、植物体、又は動物体を用いることができる。製造効率及び得られた脂質の利用性の点から、宿主は微生物又は植物体であることが好ましく、微生物であることがより好ましい。
前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよく、エシェリキア（Escherichia）属に属する微生物、バシラス（Bacillus）属に属する微生物、シネコシスティス（Synechocystis）属の微生物、シネココッカス（Synechococcus）属の微生物等の原核生物、又は酵母や糸状菌等の真核微生物を用いることができる。なかでも、脂質生産性の観点から、エシェリキア属に属する微生物である大腸菌（Escherichia coli）、バシラス属に属する微生物である枯草菌（Bacillus subtilis）、酵母に属する微生物である赤色酵母（Rhodosporidium toruloides）、又は糸状菌に属する微生物であるモルチエレラ・エスピー（Mortierella sp．）が好ましく、大腸菌がより好ましい。
前記藻類や微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Chlamydomonas）属に属する藻類、クロレラ（Chlorella）属に属する藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属に属する藻類、又はナンノクロロプシス属に属する藻類が好ましく、ナンノクロロプシス属に属する藻類がより好ましい。ナンノクロロプシス属に属する藻類として具体的には、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Nannochloropsis gaditana）、ナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis salina）、ナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis oceanica）、ナンノクロロプシス・アトムス（Nannochloropsis atomus）、ナンノクロロプシス・マキュラタ（Nannochloropsis maculata）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ（Nannochloropsis granulata）、ナンノクロロプシス・エスピー（Nannochloropsis sp．）、等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、ナンノクロロプシス・オキュラータ、又はナンノクロロプシス・ガディタナが好ましく、ナンノクロロプシス・オキュラータがより好ましい。
前記植物体としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ナタネ、ココヤシ、パーム、クフェア、又はヤトロファが好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。

遺伝子発現用プラスミドベクター又は遺伝子発現カセットの母体となるベクター（プラスミド）としては、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で当該遺伝子を発現させることができるベクターであればよい。例えば、導入する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
具体的なベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript（pBS） II SK(-)（Stratagene社製）、pSTV系ベクター（タカラバイオ社製）、pUC系ベクター（宝酒造社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（Mckenzie，T．et al.,（1986），Plasmid 15（2）；p．93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、又はpMW218/219（ニッポンジーン社製）が挙げられる。特に、宿主が大腸菌の場合は、pBluescript II SK(-)、又はpMW218/219が好ましく用いられる。
藻類を宿主とする場合には、例えば、pUC19（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas Center）、P-322（Chlamydomonas Center）、pPha-T1（Yangmin Gong，et al.，Journal of Basic Microbiology，2011，vol．51，p．666-672参照）、又はpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合は、pUC19、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。また、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合には、Oliver Kilian, et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，vol．108(52)記載の方法を参考にして、本発明の遺伝子、プロモーター及びターミネーターからなるＤＮＡ断片（遺伝子発現カセット）を用いて宿主を形質転換することもできる。このＤＮＡ断片としては、例えば、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片や制限酵素切断ＤＮＡ断片が挙げられる。
植物細胞を宿主とする場合には、例えば、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、又はIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。特に、宿主がシロイヌナズナの場合は、pRI系ベクター又はpBI系ベクターが好ましく用いられる。

また、前記に組み込んだ目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調整するプロモーターやターミネーターの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができるプロモーターとしては、例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導可能な誘導体に関するプロモーター、Rubiscoオペロン（rbc）、PSI反応中心タンパク質（psaAB）、PSIIのD1タンパク質（psbA）、カリフラワーモザイクウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、ナタネ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、ナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質ＶＣＰ１遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）（Oliver Kilian，et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，vol．108(52)）、又はナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクＬＤＳＰ（lipid droplet surface protein）遺伝子のプロモーター（Astrid Vieler，et al.，PLOS Genetics，2012;8(11):e1003064．doi：10.1371）が挙げられる。
また、目的のタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたことを確認するための選択マーカーの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、又はハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することも可能である。

目的のタンパク質をコードする遺伝子の前記ベクターへの導入は、制限酵素処理やライゲーション等の通常の手法によって行うことができる。また、発現ベクターを構築する際には、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子に加え、当該遺伝子の翻訳に有用な配列、例えば開始コドンや終止コドンに相当する配列等を適宜補うことができる。
形質転換方法としては、宿主に目的遺伝子を導入しうる方法であれば特に限定されるものではない。例えば、カルシウムイオンを用いる方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法（J．Bacterial．93，1925（1967））、プロトプラスト形質転換法（Mol．Gen．Genet．168，111（1979））、エレクトロポレーション法（FEMS Microbiol．Lett．55，135（1990））又はLP形質転換方法（T．Akamatsu，et al.，Archives of Microbiology，1987，146，p.353-357；T．Akamatsu，et al.，Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2001，65，4，p.823-829）等を用いることができる。宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合、Randor Radakovits，et al.，Nature Communications，DOI:10.1038/ncomms1688，2012、に記載のエレクトロポレーション法を用いて形質転換を行うこともできる。

目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、ベクター由来の薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的ＤＮＡ断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法等によって、目的ＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。

アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子をゲノム上に有する宿主において、当該遺伝子の発現調節領域を改変して、前記遺伝子の発現を促進させる方法について説明する。
「発現調節領域」とは、プロモーターやターミネーターを示し、これらの配列は一般に隣接する遺伝子の発現量（転写量、翻訳量）の調節に関与している。ゲノム上に前述のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を有する宿主においては、当該遺伝子の発現調節領域を改変して前記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の発現を促進させることで、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させることができる。

発現調節領域の改変方法としては、例えばプロモーターの入れ替えが挙げられる。ゲノム上に前述のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を有する宿主において、当該遺伝子のプロモーター（以下、「アシル−ＡＣＰチオエステラーゼプロモーター」ともいう）を、より転写活性の高いプロモーターに入れ替えることで、前記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の発現を促進させることができる。例えば、ゲノム上にアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を有する宿主の１つであるナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株においては、配列番号３７に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列の直下にアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が存在しており、配列番号３７に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列中にプロモーター領域が存在している。この配列番号３７に示す塩基配列からなるＤＮＡ配列の一部又は全部をより転写活性の高いプロモーターに入れ替えることで、前記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の発現を促進させることができる。

アシル−ＡＣＰチオエステラーゼプロモーターの入れ替えに用いるプロモーターとしては特に限定されず、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼプロモーターよりも転写活性が高く、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産に適したものから適宜選択することができる。
宿主としてナンノクロロプシスを用いる場合には、チューブリンプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、上述のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）、及びナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクＬＤＳＰ遺伝子のプロモーターを好ましく用いることができる。中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性向上の観点から、ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター及びＬＤＳＰ遺伝子のプロモーターがより好ましい。

前述のプロモーターの改変は、相同組換えなどの常法に従い行うことができる。具体的には、標的とするプロモーターの上流、下流領域を含み、標的プロモーターに代えて別のプロモーターを含む直鎖状のDNA断片を構築し、これを宿主細胞に取り込ませ、宿主ゲノムの標的プロモーターの上流側と下流側とで２回交差の相同組換えを起こす。その結果、ゲノム上の標的プロモーターが別のプロモーター断片と置換され、プロモーターを改変することができる。
このような相同組換えによる標的プロモーターの改変方法は、例えば、Besher et al.，Methods in molecular biology，1995，vol．47，p．291-302等の文献を参考に行うことができる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合、Oliver Kilian，et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，vol．108(52)等の文献を参考にして、相同組換え法によりゲノム中の特定の領域を改変することができる。

（２）第２の態様
本発明の形質転換体の第２の態様は、本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を有する宿主において、当該遺伝子が欠失、変異又は発現抑制された形質転換体である。当該形質転換体（以下、「第２の態様の形質転換体」ともいう）は、宿主中の前記タンパク質(A)〜(C)のいずれか１つをコードする遺伝子を、欠失、変異又は発現抑制することで得られる。

第２の態様の形質転換体の宿主としては、本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を有するものであればよく、微生物、植物体、又は動物体を用いることができる。なかでも、脂質の製造効率の点から、微生物が好ましく、大腸菌又は微細藻類がより好ましい。
前記微細藻類としては、脂質生産性の観点から、ナンノクロロプシス属に属する藻類が好ましい。ナンノクロロプシス属に属する藻類として具体的には、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、ナンノクロロプシス・サリナ、ナンノクロロプシス・オセアニカ、ナンノクロロプシス・アトムス、ナンノクロロプシス・マキュラタ、ナンノクロロプシス・グラニュラータ、又はナンノクロロプシス・エスピー、等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、ナンノクロロプシス・オキュラータ、又はナンノクロロプシス・ガディタナが好ましく、ナンノクロロプシス・オキュラータがより好ましい。

宿主ゲノムから本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を欠失、変異又は発現抑制する方法としては、標的遺伝子の一部若しくは全部をゲノム中から除去する又は他の遺伝子と置き換える、当該遺伝子中に他のＤＮＡ断片を挿入する、当該遺伝子の活性部位・基質結合部位又は転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によって行うことができる。

上記の欠失・変異・発現抑制方法は、例えば、相同組換えを用いて行うことができる。具体的には、標的遺伝子の上流、下流領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のＤＮＡ断片をＰＣＲ等の方法によって構築し、これを宿主細胞内に取り込ませて宿主ゲノムの標的遺伝子上流側、下流側で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を欠失あるいは他の遺伝子断片と置換させることができる。また、塩基置換や塩基挿入等の変異を導入した標的遺伝子をＰＣＲ等の方法によって構築し、これを宿主細胞内に取り込ませて宿主ゲノムの標的遺伝子内の変異箇所の外側の２ヶ所で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子の機能を低下又は消失させることができる。また、標的遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを宿主細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって宿主ゲノム上の標的遺伝子を分断して、その機能を低下又は消失させることができる。

このような相同組換えによる標的遺伝子の欠失・変異・発現抑制方法は、例えば、Besher et al., Methods in molecular biology，1995，vol．47，p.291-302等の文献を参考に行うことができる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合、Oliver Kilian，et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，108(52)等の文献を参考にして、相同組換え法によりゲノム中の特定の遺伝子を欠失又は破壊することができる。

目的遺伝子が欠失等した形質転換体の選択は、形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出して、目的遺伝子部位を含む領域を対象としてＰＣＲを行う方法、又は目的遺伝子領域に結合するＤＮＡプローブを用いたサザンブロッティング法、等により行うことができる。

第２の態様の形質転換体は、本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が機能しないため、産出される脂質の脂肪酸組成が宿主本来の組成から変化すると考えられる。すなわち、当該形質転換体は、脂質中の脂肪酸組成が改変された脂質を生産することができる。

４．脂質の製造方法
本発明の第１の態様の形質転換体は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が、宿主と比較して向上している。したがって、本発明の形質転換体を適切な条件で培養し、次いで得られた培養物から中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を回収すれば、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を効率よく製造することができる。
本発明の脂質の製造方法は、脂質の生産性向上の観点から、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換体を適切な条件にて培養して培養物を得る工程、及び得られた培養物から脂質を採取する工程を含むことが好ましい。
なお、本発明において形質転換体を培養するとは、微生物、藻類、植物体、動物体、及びそれらの細胞や組織を培養、生育することをいい、植物体を土壌等で栽培することも含まれる。ここで「培養物」とは、培養液の他に、培養等した後の形質転換体そのものも含まれる。

培養条件は、形質転換体の宿主に応じて適宜選択することができ、その宿主に対して通常用いられる培養条件を使用できる。
また、脂質の生産効率の点から、培地中に、例えばアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの基質或いは脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はマロン酸等を添加してもよい。

一例として、大腸菌を宿主として用いた形質転換体の場合、ＬＢ培地又はOvernight Express Instant TB Medium（Novagen社）で、３０〜３７℃、０．５〜１日間培養を行うことが挙げられる。
また、シロイヌナズナを宿主として用いた形質転換体の場合、土壌で温度条件２０〜２５℃、白色光を連続照射又は明期１６時間・暗期８時間等の光条件下で１〜２か月間栽培を行うことが挙げられる。

形質転換の宿主が藻類の場合、培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培養培地を使用してもよい。具体的な培地としては、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地、等を挙げることができる。なかでも、脂質の生産性向上及び栄養成分濃度の観点から、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、又はダイゴＩＭＫ培地が好ましく、ｆ／２培地、又はダイゴＩＭＫ培地がより好ましく、ｆ／２培地がさらに好ましい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。培地に接種する藻類の量は特に限定されないが、生育性の点から、培地当り１〜５０％（vol/vol）が好ましく、１〜１０％（vol/vol）がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５〜４０℃の範囲である。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、好ましくは１０〜３５℃であり、より好ましくは１５〜３０℃である。
また、藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の照度としては、藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から、好ましくは１００〜５００００ルクスの範囲、より好ましくは３００〜１００００ルクスの範囲、さらに好ましくは１０００〜６０００ルクスの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、２４時間のうち明期が好ましくは８〜２４時間、より好ましくは１０〜１８時間、さらに好ましくは１２時間である。
また、藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０３（大気条件と同程度）〜１０％が好ましく、より好ましくは０．０５〜５％、さらに好ましくは０．１〜３％、よりさらに好ましくは０．３〜１％である。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０１〜５質量％が好ましく、より好ましくは０．０５〜２質量％、さらに好ましくは０．１〜１質量％である。
培養時間は特に限定されず、脂質を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖できるように、長期間（例えば１５０日程度）行なってもよい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、培養期間は、好ましくは３〜９０日間、より好ましくは３〜３０日間、さらに好ましくは７〜３０日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、通気攪拌培養が好ましい。

形質転換体において産生された脂質を採取する方法としては、通常生体内の脂質成分等を単離する際に用いられる方法、例えば、前述の培養物や形質転換体から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収する方法が挙げられる。より大規模な場合は、培養物や形質転換体より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。

本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、中鎖アシル−ＡＣＰ、さらにはＣ１２〜Ｃ１６アシル−ＡＣＰ、特にＣ１２とＣ１４アシル−ＡＣＰに対する特異性が高い。本発明の第１の態様の形質転換体では、総脂肪酸成分における炭素数８〜１６の脂肪酸、好ましくは炭素数１２〜１６の脂肪酸の含有率、より好ましくは炭素数１２〜１４の脂肪酸、より好ましくは炭素数１２と１４の脂肪酸、より好ましくは炭素数１４の脂肪酸、の含有率が増加する。そのため、当該形質転換体を用いた本発明の製造方法は、脂質生産、特に中鎖脂肪酸、好ましくは炭素数８〜１６の脂肪酸、より好ましくは炭素数１２〜１６の脂肪酸、より好ましくは炭素数１２〜１４の脂肪酸、より好ましくは炭素数１２及び１４の脂肪酸、より好ましくは炭素数１４の脂肪酸、又はこれを構成成分とする脂質の生産に好適に用いることができる。
本発明の製造方法において製造される脂質は、その利用性の点から、脂肪酸又は脂肪酸化合物を含んでいることが好ましく、脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含んでいることがさらに好ましい。具体的には本発明の製造方法において製造される脂質は、好ましくは炭素数が８以上１６以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数が１２以上１６以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数が１２以上１４以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数が１２及び１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数が１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含む。脂質中に含まれる脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物は、界面活性剤等への利用性から炭素数８〜１６の脂肪酸又はその脂肪酸エステルが好ましく、炭素数１２〜１６の脂肪酸又はその脂肪酸エステルがより好ましく、炭素数１２〜１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましく、炭素数１２及び炭素数１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましく、炭素数１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましい。
脂肪酸エステル化合物は、生産性の点から、単純脂質又は複合脂質が好ましく、単純脂質がさらに好ましく、トリアシルグリセロールがさらにより好ましい。

本発明の製造方法、形質転換体により得られる脂肪酸や脂質は、食用として用いる他、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。

上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の方法、形質転換体、タンパク質、遺伝子を開示する。

＜１＞ 宿主に下記タンパク質(A)〜(C)のいずれか１つをコードする遺伝子が導入されている形質転換体を培養し、培養物から脂質を採取する、脂質の製造方法。
(A)配列番号１の９１位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)配列番号１の９１位〜３４８位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
(C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。

＜２＞ 宿主に前記タンパク質(A)〜(C)のいずれか１つをコードする遺伝子を導入する工程を含む、形質転換体の細胞内で生産される脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる方法。
＜３＞ 前記脂質が中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質である、前記＜２＞記載の方法。
＜４＞ 宿主に前記タンパク質(A)〜(C)のいずれか１つをコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程を含む、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸又は全脂質中の脂肪酸又は脂質の組成を改変する、脂質の組成の改変方法。

＜５＞ 前記タンパク質(A)〜(C)のいずれか１つをコードする遺伝子の発現が促進されている形質転換体を培養し、培養物から脂質を採取する、脂質の製造方法。
＜６＞ 前記タンパク質(A)〜(C)のいずれか１つをコードする遺伝子の発現を促進させる工程を含む、形質転換体の細胞内で生産される脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる方法。
＜７＞ 前記脂質が中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質である、前記＜６＞記載の方法。
＜８＞ 前記タンパク質(A)〜(C)のいずれか１つをコードする遺伝子の発現を促進させて、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸又は全脂質中の脂肪酸又は脂質の組成を改変する、脂質の組成の改変方法。
＜９＞ 前記タンパク質(A)〜(C)のいずれか１つをコードする遺伝子を宿主に導入して前記遺伝子の発現を促進させる、前記＜５＞〜＜９＞のいずれか１項記載の方法。

＜１０＞ 前記タンパク質(B)において、配列番号１の９１位〜３４８位のアミノ酸配列との同一性が８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上である、前記＜１＞〜＜９＞のいずれか１項記載の方法。
＜１１＞ 前記タンパク質(B)が、配列番号１の９１位〜３４８位のアミノ酸配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、よりさらに好ましくは１又は２個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である、前記＜１＞〜＜１０＞のいずれか１項記載の方法。

＜１２＞ 前記タンパク質(C)が、配列番号１の１〜９０位の任意の位置でＮ末端側のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなる、前記＜１＞〜＜９＞のいずれか１項記載の方法。
＜１３＞ 前記タンパク質(C)が下記タンパク質(C1)〜(C7)のいずれか１つである、前記＜１＞〜＜９＞のいずれか１項記載の方法。
(C1)配列番号１の１位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C2)配列番号１の６１位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C3)配列番号１の７１位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C4)配列番号１の７４位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C5)配列番号１の８１位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C6)前記タンパク質(C1)〜(C5)のいずれか１つのアミノ酸配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
(C7)前記タンパク質(C1)〜(C5)のいずれか１つのアミノ酸配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１又は２個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。

＜１４＞ 前記タンパク質(A)〜(C)のいずれか１つをコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ(a)〜(c)のいずれか１つからなる遺伝子である、前記＜１＞〜＜１３＞のいずれか１項記載の方法。
(a)配列番号２の２７１位〜１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(b)配列番号２の２７１位〜１０４７位の塩基配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(c)前記ＤＮＡ(a)又は(b)の塩基配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜１５＞ 前記ＤＮＡ(b)が、前記ＤＮＡ(a)の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１若しくは２個、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ(a)と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、である、前記＜１４＞項記載の方法。
＜１６＞ 前記ＤＮＡ(c)が、配列番号２の１〜２７０位の任意の位置で5'末端側が欠失した塩基配列からなる、前記＜１４＞項記載の方法。
＜１７＞ 前記ＤＮＡ(c)が、下記ＤＮＡ(c1)〜(c7)のいずれか１つである、前記＜１４＞項記載の方法。
(c1)配列番号２の１位〜１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c2)配列番号２の１８１位〜１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c3)配列番号２の２１１位〜１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c4)配列番号２の２２０位〜１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c5)配列番号２の２４１位〜１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c6)前記ＤＮＡ(c1)〜(c5)のいずれか１つの塩基配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９６％以上、よりさらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(c7)前記ＤＮＡ(c1)〜(c5)のいずれか１つの塩基配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１又は２個、の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

＜１８＞ 前記形質転換体の宿主が微生物である、前記＜１＞〜＜１７＞のいずれか１項記載の方法。
＜１９＞ 前記微生物が大腸菌である、前記＜１８＞項記載の方法。
＜２０＞ 前記微生物が微細藻類である、前記＜１８＞項記載の方法。
＜２１＞ 前記微細藻類がナンノクロロプシス属に属する藻類、好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ、である、前記＜２０＞項記載の方法。
＜２２＞ 前記脂質が、中鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素数が８以上１６以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは１２以上１６以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数が１２以上１４以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数が１２及び１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、よりさらに好ましくは炭素数１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含む、前記＜１＞〜＜２１＞のいずれか１項記載の方法。

＜２３＞ 前記＜１＞〜＜２２＞のいずれか１項で規定した、タンパク質(A)〜(C)。
＜２４＞ 前記＜２３＞項記載のタンパク質をコードする遺伝子。
＜２５＞ 前記＜１＞〜＜２２＞のいずれか１項で規定した、ＤＮＡ(a)〜(c)のいずれか１つからなる遺伝子。
＜２６＞ 前記＜２４＞又は＜２５＞項記載の遺伝子を含有する組換えベクター。

＜２７＞ 前記＜２４＞若しくは＜２５＞項記載の遺伝子、又は前記＜２６＞項記載の組換えベクターを、宿主に導入してなる形質転換体。
＜２８＞ 前記＜２４＞若しくは＜２５＞項記載の遺伝子、又は前記＜２６＞項記載の組換えベクターを宿主に導入する、形質転換体の作製方法。
＜２９＞ 前記＜２４＞又は＜２５＞項記載の遺伝子の発現を促進させた形質転換体。
＜３０＞ 前記形質転換体の宿主が微生物である、前記＜２７＞〜＜２９＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３１＞ 前記微生物が大腸菌である、前記＜３０＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３２＞ 前記微生物が微細藻類である、前記＜３０＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３３＞ 前記微細藻類がナンノクロロプシス属に属する藻類、好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ、である、前記＜３２＞項記載の形質転換体又はその作製方法。

＜３４＞ 脂質を製造するための、前記＜２３＞〜＜３３＞のいずれか１項記載のタンパク質、遺伝子、組換えベクター、形質転換体、又は形質転換体の作製方法により得られた形質転換体の使用。
＜３５＞ 前記脂質が、中鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素数が８以上１６以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル、より好ましくは炭素数が１２以上１６以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数が１２以上１４以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数が１２及び１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、よりさらに好ましくは炭素数１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、を含む、前記＜３４＞項記載の使用。
＜３６＞ 前記＜２４＞又は＜２５＞項記載の遺伝子を有する宿主から、当該遺伝子を欠失、変異又は発現抑制する工程を含む、脂質中の脂肪酸組成を改変する方法。

以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。ここで、本実施例で用いるプライマーの塩基配列を表１及び２に示す。

実施例１ アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の取得、大腸菌の形質転換、及び形質転換体による脂質の製造
（１）ナンノクロロプシス・オキュラータ由来アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の取得
ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株（独立行政法人国立環境研究所(NIES)より入手）の全ＲＮＡを抽出し、SuperScript（商標） III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR（invitrogen社製）を用いて逆転写を行ってｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡを鋳型として、表１に示すプライマー番号３及びプライマー番号４のプライマー対を用いたＰＣＲにより、配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子断片を取得した。以下、この遺伝子をNoTE2遺伝子といい、当該遺伝子がコードするタンパク質をNoTE2（配列番号１）という。
また、プラスミドベクターpBluescriptII SK(-)（Stratagene社製）を鋳型として、表１に示すプライマー番号５及びプライマー番号６のプライマー対を用いたＰＣＲによりpBluescriptII SK(-)を増幅し、制限酵素DpnI（東洋紡株式会社製）処理により鋳型の消化を行った。
これら２つの断片を、High Pure PCR Product Purification Kit（Roche Applied Science社製）を用いて精製した後に、In-Fusion HD Cloning Kit（Clontech社製）を用いて融合し、常法に従い大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセル（タカラバイオ社製）への形質転換、プラスミド抽出、及びクローニング断片の塩基配列確認を行い、NoTE2遺伝子の全長をクローニングしたプラスミドを作製した。

（２）NoTE2遺伝子発現プラスミドの構築
配列番号１に示すNoTE2のアミノ酸配列において、Ｎ末端１〜７３位付近は葉緑体移行シグナル配列と推定された。そこで、推定葉緑体移行シグナル配列を含むＮ末端領域を種々の長さで削除した複数のNoTE2遺伝子発現プラスミドを構築した。
前記プラスミドを鋳型とし、表１に示すプライマー番号７〜１２のいずれか１つと、プライマー番号５のプライマーとのプライマー対を用いてＰＣＲを行い、得られた遺伝子断片を前記の方法と同様にして精製・融合し、NoTE2遺伝子発現用プラスミドNoTE2_61、NoTE2_71、NoTE2_74、NoTE2_81、NoTE2_91、及びNoTE2_101をそれぞれ構築した。
ここで、プラスミドNoTE2_61は、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端側１〜６０位のアミノ酸配列を除去するように構築され、NoTE2遺伝子として、配列番号１の６１位〜３４８位のアミノ酸配列に相当する塩基配列及び終止コドンに対応する配列番号２の１８１位〜１０４７位の塩基配列を有する。同様に、プラスミドNoTE2_71、プラスミドNoTE2_74、プラスミドNoTE2_81、プラスミドNoTE2_91、及びプラスミドNoTE2_101は、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端側１〜７０位、１〜７３位、１〜８０位、１〜９０位、又は１〜１００位のアミノ酸配列をそれぞれ除去するように構築した。さらに、これらのプラスミドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端側を除去した部位の上流に、プラスミドベクターpBluescriptII SK(-)由来のLacZタンパク質のＮ末端側１位〜２９位のアミノ酸配列が融合したタンパク質を発現させるように構築した。

（３）NoTE2遺伝子発現プラスミドの大腸菌への導入
前記の各種NoTE2遺伝子発現プラスミドを用いて、大腸菌突然変異株であるK27株（fadD88）（Overath et al，Eur．J．Biochem．7，559-574，1969）をコンピテントセル形質転換法により形質転換した。形質転換処理をした大腸菌K27株を50μg/mLアンピシリンナトリウム含有ＬＢ寒天培地（Bacto Trypton 1%、Yeast Extract 0.5%、NaCl 1%、Agar 1.5%）に播種して30℃で一晩静置した。得られたコロニーを、2mLのOvernight Express Instant TB Medium（Novagen社）（アンピシリンナトリウム50μg/mL含有）に接種し、30℃で振とう培養（160rpm）した。培養２４時間後、培養液に含まれる脂質成分を、下記方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpBluescriptII SK(-)で形質転換した大腸菌K27株についても同様に実験を行った。

（４）培養液中の脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
培養液1mLに、内部標準として1mg/mLの7-ペンタデカノン（メタノール溶液）50μLを添加後、クロロホルム0.5mL及びメタノール1mLを培養液に添加して激しく攪拌し、10分間以上静置した。その後さらに、クロロホルム0.5mL及び1.5%KCl 0.5mLを添加して攪拌し、3,000rpmにて5分間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。
得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、0.5N水酸化カリウム／メタノール溶液0.7mLを添加し、80℃で30分間恒温した。続いて14%三フッ化ホウ素のメタノール溶液（SIGMA社製）1mLを添加し、80℃にて10分間恒温した。その後、ヘキサン及び飽和食塩水を各0.5mL添加し激しく撹拌し、室温にて10分間以上静置後、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸メチルエステルを得た。

下記に示す測定条件下で、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。
＜ガスクロマトグラフィー条件＞
キャピラリーカラム：DB-1 MS（30m×200μm×0.25μm、J＆W Scientific社製）
移動相：高純度ヘリウム
カラム内流量：1.0mL/分
昇温プログラム：100℃（1分間）→10℃／分→300℃（5分間）
平衡化時間：1分間
注入口：スプリット注入（スプリット比：100:1）
圧力：14.49psi，104mL/分
注入量：1μL
洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム
検出器温度：300℃

また、脂肪酸メチルエステルの同定は、同サンプルを同条件でガスクロマトグラフ質量分析解析に供することにより行った。
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準である7-ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養液1Lあたりの各脂肪酸量を算出した。さらに、各脂肪酸量の総和を総脂肪酸量とし、総脂肪酸量に占める各脂肪酸量の割合を算出した。
結果を表３に示す。なお下記の表において、「ＴＦＡ」は総脂肪酸量を、「脂肪酸組成（％ＴＦＡ）」は総脂肪酸の重量に対する各脂肪酸の重量の割合（重量パーセント）を示す。また「Ｃｘ：ｙ」とあるのは、炭素原子数ｘで二重結合数がｙの脂肪酸を表し、「Ｃ１７：０Δ」及び「Ｃ１９：０Δ」はそれぞれ、cis-9,10-メチレンヘキサデカン酸（cis-9,10-Methylen-hexadecanoic acid）及びcis-11,12-メチレンオクタデカン酸（cis-11,12-Methylen-octadecanoic acid）を表す。

表３から明らかなように、NoTE2遺伝子発現プラスミドNoTE2_61、NoTE2_71、NoTE2_74、NoTE2_81、又はNoTE2_91導入株では、陰性対照であるプラスミドベクターpBluescriptII SK(-)導入株（表中「pBS」）と比べ、総脂肪酸に占めるＣ１２：０脂肪酸、Ｃ１４：１脂肪酸、Ｃ１４：０脂肪酸、Ｃ１６：１脂肪酸の割合が大きく増加した。特に、Ｃ１４脂肪酸（Ｃ１４：１脂肪酸、Ｃ１４：０脂肪酸）の割合が顕著に増加した。さらに、これらNoTE2遺伝子発現プラスミドの導入株では、総脂肪酸量（ＴＦＡ）も増加していた。これらの結果から、プラスミドNoTE2_61、NoTE2_71、NoTE2_74、NoTE2_81、又はNoTE2_91に導入した遺伝子がコードするタンパク質は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有することが確認された。また、これらのタンパク質はＣ１２脂肪酸及びＣ１４脂肪酸の割合及び生産量を顕著に増加させたことから、Ｃ１２脂肪酸やＣ１４脂肪酸、特にＣ１４脂肪酸に高い特異性を持つアシル−ＡＣＰチオエステラーゼであると考えられる。
一方、プラスミドNoTE2_101導入株では、陰性対照と比べても、脂肪酸組成がほとんど変化せず、総脂肪酸量も増加しなかった。このことから、プラスミドNoTE2_101に導入した遺伝子がコードするタンパク質は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性をほぼ有しないと考えられる。
以上の結果から、配列番号１で示されるアミノ酸配列中、少なくとも９１位〜３４８位の領域を有するタンパク質は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を示すと認められる。

実施例２ ナンノクロロプシス・オキュラータ由来アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子によるナンノクロロプシス・オキュラータの形質転換、及び形質転換体による脂質の製造
（１）ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築
ゼオシン耐性遺伝子（配列番号１３）、及び文献（Randor Radakovits，et al.，Nature Communications，DOI:10.1038/ncomms1688，2012）記載のナンノクロロプシス・ガディタナCCMP526株由来チューブリンプロモーター配列（配列番号１４）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表２に示すプライマー番号１５及びプライマー番号１６のプライマー対、並びにプライマー番号１７及びプライマー番号１８のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ゼオシン耐性遺伝子及びチューブリンプロモーター配列をそれぞれ増幅した。
また、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のゲノムを鋳型として、表２に示すプライマー番号１９及びプライマー番号２０のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ヒートショックプロテインターミネーター配列（配列番号２１）を増幅した。
さらに、プラスミドベクターpUC19（タカラバイオ社製）を鋳型として、表２に示すプライマー番号２２及びプライマー番号２３のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、プラスミドベクターpUC19を増幅した。

これら４つの増幅断片をそれぞれ制限酵素DpnI（東洋紡社製）にて処理し、High Pure PCR Product Purification Kit（Roche Applied Science社製）を用いて精製した。その後、得られた４つの断片をIn-Fusion HD Cloning Kit（Clontech社製）を用いて融合し、ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを構築した。
なお、本プラスミドは、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。

（２）NoTE2遺伝子発現用プラスミドの構築
実施例１で調製したナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のｃＤＮＡを鋳型として、表２に示すプライマー番号２４及びプライマー番号２５のプライマー対を用いたＰＣＲにより、配列番号２の塩基配列からなる遺伝子断片を取得した。
また、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のゲノムを鋳型として、表２に示すプライマー番号２６及びプライマー番号２７のプライマー対、並びにプライマー番号２８及びプライマー番号２９のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、LDSPプロモーター配列（配列番号３０）及びVCP1ターミネーター配列（配列番号３１）を取得した。
さらに、前述のゼオシン耐性遺伝子発現プラスミドを鋳型として、表２に示すプライマー番号３２及びプライマー番号２３のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット（チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列）及びpUC19配列からなる断片を増幅した。

これら４つの増幅断片を、前述の方法と同様の方法にて融合し、NoTE2遺伝子発現用プラスミド（NoTE2-Nanno）を構築した。
なお、本プラスミドはLDSPプロモーター配列、NoTE2遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。

さらに、前記NoTE2遺伝子発現用プラスミド（NoTE2-Nanno）を鋳型とし、表２に示すプライマー番号３３及びプライマー番号２７のプライマー対を用いたＰＣＲにより、遺伝子断片を取得した。
また、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のｃＤＮＡを鋳型として、表２に示すプライマー番号３４及びプライマー番号３５のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、VCP1葉緑体移行シグナル（配列番号３６）を取得した。
これらの断片を前述の方法と同様の方法にて融合し、NoTE2遺伝子のナンノクロロプシス発現用プラスミド（NoTE2_74-Nanno）を構築した。
なお、本プラスミドはLDSPプロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナルを配列番号１に示すアミノ酸配列の７４〜３４８位をコードする塩基配列の５’末端側に連結させたNoTE2遺伝子（以下、「NoTE2_74遺伝子」ともいう）、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。

（３）NoTE2遺伝子発現カセットのナンノクロロプシス・オキュラータへの導入
前述のNoTE2遺伝子発現用プラスミド（NoTE2-Nanno及びNoTE2_74-Nanno）をそれぞれ鋳型として、表２に示すプライマー番号２０及びプライマー番号２６のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、NoTE2遺伝子発現カセット（LDSPプロモーター配列、NoTE2遺伝子若しくはNoTE2_74遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるDNA断片）を増幅した。
増幅したDNA断片を、High Pure PCR Product Purification Kit（Roche Applied Science社製）を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。

約1×10⁹細胞のナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株を、384mMのソルビトール溶液で洗浄して塩を完全に除去し、形質転換の宿主細胞として用いた。上記で増幅したNoTE2遺伝子発現カセット約500ngを宿主細胞と混和し、50μF、500Ω、2,200v/2mmの条件でエレクトロポレーションを行った。
ｆ／２液体培地（NaNO₃ 75mg、NaH₂PO₄・2H₂O 6mg、ビタミンB12 0.5μg、ビオチン 0.5μg、チアミン 100μg、Na₂SiO₃・9H₂O 10mg、Na₂EDTA・2H₂O 4.4mg、FeCl₃・6H₂O 3.16mg、FeCl₃・6H₂O 12μg、ZnSO₄・7H₂O 21μg、MnCl₂・4H₂O 180μg、CuSO₄・5H₂O 7μg、Na₂MoO₄・2H₂O 7μg／人工海水1L）にて２４時間回復培養を行った。その後に、2μg/mLのゼオシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、25℃、0.3%CO₂雰囲気下、12h/12h明暗条件にて2〜3週間培養した。得られたコロニーの中から、NoTE2遺伝子発現カセットを含むものをＰＣＲにより選抜した。

（４）培養液中の脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
選抜した株を、ｆ／２培地の窒素濃度を15倍、リン濃度を5倍に増強した培地（以下、「Ｎ１５Ｐ５培地」という）20mLに播種し、25℃、0.3%CO₂雰囲気下、12h/12h明暗条件にて4週間振盪培養し、種培養液とした。種培養液2mLを、Ｎ１５Ｐ５培地18mLに植継ぎ、25℃、0.3%CO₂雰囲気下、12h/12h明暗条件にて１週間振盪培養し、前培養液１とした。前培養液１ 2mLを、Ｎ１５Ｐ５培地18mLに植継ぎ、25℃、0.3%CO₂雰囲気下、12h/12h明暗条件にて１週間培養し、前培養液２とした。前培養液２ 2mLを、海水培地（ダイゴ人工海水SP、和光純薬社製）18mLに植継ぎ、25℃、0.3%CO₂雰囲気下、12h/12h明暗条件にて12日間振盪培養した。
なお、陰性対照として、野生株であるナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株（WT）についても同様に実験を行った。
培養液の濁度（OD660nm）を測定した後に、下記に示す脂質の抽出と、構成脂肪酸の分析を行った。

培養液1mLに、内部標準として1mg/mLの7-ペンタデカノン（メタノール溶液）を50μL添加後、クロロホルム0.5mL及びメタノール1mLを培養液に添加して激しく攪拌し、10分間放置した。その後さらに、クロロホルム0.5mL及び1.5%KCl 0.5mLを添加して攪拌し、3,000rpmにて5分間間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。
得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、0.5N水酸化カリウム／メタノール溶液0.7mLを添加し、80℃で30分間恒温した。続いて14%三フッ化ホウ素メタノール溶液（SIGMA社製）1mLを添加し、80℃にて10分間恒温した。その後、ヘキサン0.5mL、及び飽和食塩水1mLを添加し激しく撹拌し、室温にて10分間放置し、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸メチルエステルを得た。

下記に示す測定条件下で、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。
＜ガスクロマトグラフィー条件＞
分析装置：7890A（Agilent technology社製）
キャピラリーカラム：DB-1 MS（30m×200μm×0.25μm、J＆W Scientific社製）
移動層：高純度ヘリウム
オーブン温度：150℃ 保持0.5分→150〜220℃（40℃/min昇温）→220〜320℃（20℃/min昇温）→320℃ 保持2分（ポストラン2分）
注入口温度：300℃
注入方法：スプリット注入（スプリット比：75:1）
注入量：1μL
洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム
検出方法：ＦＩＤ
検出器温度：300℃

脂肪酸メチルエステルの同定及び定量は、実施例１と同様の方法で行った。その結果を表４に示す。
なお、表４において「ｎ」は０〜５の整数を示し、例えば「Ｃ１８：ｎ」と記載した場合には、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ１８：４及びＣ１８：５の脂肪酸の総和を表す。
さらに、培養液の濁度当たりの総脂肪酸量（TFA/OD660nm）も併せて算出し、結果を表４に示した。

表４から明らかなように、NoTE2遺伝子を導入した形質転換体（表４中の「NoTE2-Nanno」）では、野生株（表４中の「WT」）と比べ、Ｃ１２：０脂肪酸とＣ１４：０脂肪酸の割合が有意に増加し、これらの脂肪酸の生産量が増加していた。また、この形質転換体では、培養液の濁度当たりの総脂肪酸量（TFA/OD660nm）が野生株と比べて増加しており、細胞当たりの脂肪酸生産性が向上していることが示唆された。

さらに、NoTE2_74遺伝子を導入した形質転換体（表４中の「NoTE2_74-Nanno」）においても、野生株と比べ、Ｃ１２：０脂肪酸とＣ１４：０脂肪酸の割合が有意に増加し、これらの脂肪酸の生産量が増加していた。さらに、この形質転換体でも、培養液の濁度当たりの総脂肪酸量が野生株と比べて増加しており、細胞当たりの脂肪酸生産性が向上していることが示唆された。この結果から、配列番号１で示されるアミノ酸配列中、配列番号１に示すアミノ酸配列の１〜７３位のアミノ酸は、酵素活性に必須ではないことが分かった。さらに、配列番号１に示すアミノ酸配列のN末端側には、葉緑体への局在に必要な葉緑体移行シグナル配列が存在していることが示唆された。

以上のように、本発明で規定するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の発現を促進させることで、中鎖脂肪酸の生産性及び生産される全脂肪酸の生産性を向上させた形質転換体を作製することができる。そしてこの形質転換体を培養することで、中鎖脂肪酸の生産性を向上させることができる。

本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。

本願は、2014年11月14日に日本国で特許出願された特願2014-231355に基づく優先権を主張するものであり、これはここに参照してその内容を本明細書の記載の一部として取り込む。

Claims (19)

1. 宿主に下記タンパク質(A)〜(C)のいずれか１つをコードする遺伝子が導入されている形質転換体を培養し、培養物から脂質を採取する、脂質の製造方法。
   (A)配列番号１の９１位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
   (B)配列番号１の９１位〜３４８位のアミノ酸配列との同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
   (C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
2. 宿主に下記タンパク質(A)〜(C)のいずれか１つをコードする遺伝子を導入する工程を含む、形質転換体の細胞内で生産される脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる方法。
   (A)配列番号１の９１位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
   (B)配列番号１の９１位〜３４８位のアミノ酸配列との同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
   (C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
3. 宿主に下記タンパク質(A)〜(C)のいずれか１つをコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程を含む、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸又は全脂質中の脂肪酸又は脂質の組成を改変する、脂質の組成の改変方法。
   (A)配列番号１の９１位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
   (B)配列番号１の９１位〜３４８位のアミノ酸配列との同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
   (C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
4. 前記タンパク質(C)が下記タンパク質(C1)〜(C7)のいずれか１つである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
   (C1)配列番号１の１位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
   (C2)配列番号１の６１位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
   (C3)配列番号１の７１位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
   (C4)配列番号１の７４位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
   (C5)配列番号１の８１位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
   (C6)前記タンパク質(C1)〜(C5)のいずれか１つのアミノ酸配列との同一性が９０％以上からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
   (C7)前記タンパク質(C1)〜(C5)のいずれか１つのアミノ酸配列に１個以上２０個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
5. 前記タンパク質(A)〜(C)のいずれか１つをコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ(a)〜(c)のいずれか１つからなる遺伝子である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
   (a)配列番号２の２７１位〜１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
   (b)配列番号２の２７１位〜１０４７位の塩基配列との同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
   (c)前記ＤＮＡ(a)又は(b)の塩基配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
6. 前記宿主が微生物である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
7. 前記微生物が大腸菌である、請求項６記載の方法。
8. 前記微生物が微細藻類である、請求項６記載の方法。
9. 前記微細藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、請求項８記載の方法。
10. 前記脂質が炭素数１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
11. 下記タンパク質(A)〜(C)。
    (A)配列番号１の９１位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (B)配列番号１の９１位〜３４８位のアミノ酸配列との同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    (C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
12. 前記タンパク質(C)が下記タンパク質(C1)〜(C7)のいずれか１つである、請求項１１記載のタンパク質。
    (C1)配列番号１の１位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C2)配列番号１の６１位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C3)配列番号１の７１位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C4)配列番号１の７４位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C5)配列番号１の８１位〜３４８位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C6)前記タンパク質(C1)〜(C5)のいずれか１つのアミノ酸配列との同一性が９０％以上からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    (C7)前記タンパク質(C1)〜(C5)のいずれか１つのアミノ酸配列に１個以上２０個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
13. 請求項１１又は１２記載のタンパク質をコードする遺伝子。
14. 下記ＤＮＡ(a)〜(c)のいずれか１つからなる遺伝子。
    (a)配列番号２の２７１位〜１０４７位の塩基配列からなるＤＮＡ。
    (b)配列番号２の２７１位〜１０４７位の塩基配列との同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
    (c)前記ＤＮＡ(a)又は(b)の塩基配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
15. 請求項１３又は１４記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
16. 請求項１３若しくは１４記載の遺伝子、又は請求項１５記載の組換えベクターを、宿主である微生物又は植物体に導入してなる形質転換体。
17. 前記微生物が大腸菌である、請求項１６記載の形質転換体。
18. 前記微生物が微細藻類である、請求項１６記載の形質転換体。
19. 前記微細藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、請求項１８記載の形質転換体。