JP6619361B2 - ＩｇＡ腎症を治療するためのジンセノサイドＭ１の使用 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１４年１１月３日に出願された米国仮出願第６２／０７４，２４７号に対する優先権を主張する。

本発明は、ＩｇＡ腎症（ＩｇＡＮ）を治療するためのジンセノサイドＭ１の新規使用に関する。

ＩｇＡ腎症（ＩｇＡＮ）は、世界的に糸球体腎炎（ＧＮ）の最も一般的な形態である。ＩｇＡＮの発症は上気道感染と関連する可能性がある［１、２］。頻繁に、Ｃ３および他のクラスの免疫グロブリン沈着がＩｇＡと同様のパターンで検出される。最も一般的な組織病理学的変化には、増殖細胞および細胞外マトリックスによるメサンギウム領域の巣状またはびまん性の拡大が含まれる［３］。さらに、びまん性の毛管内増殖、分節状硬化、分節状壊死、および細胞性半月体形成を含む、より重度の病変を有する患者では、多種多様な病変が見られる可能性がある［４、５］。そして、活性酸素種（ＲＯＳ）は、ＩｇＡＮを含む広範囲のヒトおよび実験的糸球体障害の発症において主要な病因的役割を果たすことが報告されている［６−８］。ＩｇＡＮはＩｇＡ免疫複合体（ＩｇＡ−ＩＣ）糸球体損傷に起因する免疫複合体疾患と考えられているが、この疾患の原因およびこの疾患を伝播する病原性メカニズムは知られていない。

グルココルチコイドステロイドはＩｇＡＮ患者の一部を治療するために使用されているが、ＩｇＡＮにおける腎機能の低下を維持するそれらの有効性は、依然として大部分が不明であり、これらの薬物の長期間の使用は、潜在的な制御不能な免疫抑制効果のために重度の有害な副作用を引き起こす可能性がある［９−１１］。

ニンジン（ｇｉｎｓｅｎｇ）の主要な活性成分であるジンセノサイドは、種々の薬理活性、例えば抗腫瘍活性、抗糖尿病活性、抗疲労（ａｎｔｉｆａｔｉｑｕｅ）、抗アレルギー活性および抗酸化活性を有することが知られている。ジンセノサイドは、１７個の炭素原子が４つの環に配置されたゴナンステロイド核からなる基本的な構造を共有する。ジンセノサイドは体内で金属化され、いくつかの最近の研究からは、ジンセノサイド代謝物が、天然に存在するジンセノサイドよりむしろ体内で吸収されやすく、活性成分として働くことが示唆される。中でも、ジンセノサイドＭ１は、ヒト腸内細菌によるギペノサイド経路を経たプロトパナキサジオール系ジンセノサイドの代謝物の１つとして知られている。これまで、ＩｇＡＮの治療におけるジンセノサイドＭ１の作用を報告した従来技術の参考文献はない。

本発明において、ジンセノサイドＭ１がＩｇＡ腎症（ＩｇＡＮ）の症状を軽減させるのに有効であることが予想外に見出された。したがって、本発明は対象におけるＩｇＡＮを治療するための新規手法を提供する。

特に、本発明は、対象を治療するのに有効な量でジンセノサイドＭ１を対象に投与することを含む、ＩｇＡＮに罹患している対象を治療するための方法を提供する。

具体的には、本発明の方法は、対象の（１）糸球体における、メサンギウム細胞増殖を含む固有細胞増殖、半月体形成、好中球浸潤および分節状硬化、ならびに（２）尿細管間質区画における、間質性（特に糸球体周辺）単核白血球炎症、線維症、およびタンパク円柱を伴う尿細管萎縮からなる群から選択される、対象におけるＩｇＡＮの１つまたは複数の症状を低減させるのに有効である。また、本発明の方法は、対象において、タンパク尿もしくは血尿を減少させるか、または血清尿素窒素レベルもしくは血清クレアチニンレベルを低下させるのに有効である。

いくつかの実施形態において、ジンセノサイドＭ１は、非経口または経腸により投与される。

いくつかの実施形態において、ジンセノサイドＭ１は、限定されないが、コルチコステロイド（例えばプレドニゾロン）、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、細胞障害性薬（例えばシクロホスファミド、クロラムブシル、およびアザチオプリン）、免疫抑制剤（例えばシクロスポリンおよびミコフェノール酸モフェチル）、および血管拡張剤（例えばアンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥ阻害剤））を含む、当該技術分野において公知のＩｇＡＮを治療するための１種以上の治療剤と組み合わせて投与される。

本発明はまた、必要とする対象におけるＩｇＡＮを治療するための医薬の製造におけるジンセノサイドＭ１の使用を提供する。

本発明の一実施形態または複数の実施形態の詳細は、以下の説明に記載される。本発明の他の特徴または利点は、いくつかの実施形態の以下の詳細な説明、およびさらに添付の特許請求の範囲から明らかになる。

本発明を説明するため、実施形態を図に示す。しかしながら、本発明は、示された好ましい実施形態に限定されるものではないことを理解すべきである。

図１は、尿タンパク質に対するＬＣＨＫ１６８の効果を示す。尿タンパク質レベル（クレアチニン［Ｃｒ］に対する尿タンパク質の割合）の経時変化研究。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００５。 図２は、ＬＣＨＫ１６８による治療がＩｇＡ腎症（ＩｇＡＮ）のマウスモデルにおいて腎機能を改善することを示す。（Ａ）血清尿素窒素（ＢＵＮ）レベル。（Ｂ）血清クレアチニン（Ｃｒ）レベル。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００５。 図３は、ＬＣＨＫ１６８による治療が、ＩｇＡ腎症（ＩｇＡＮ）のマウスモデルにおける重篤な腎組織病理学的特徴を改善することを示す。（Ａ）Ｈ＆Ｅ染色による腎組織病理学的評価。元の倍率は４００倍である。（Ｂ）示されたパラメータによって影響を受ける糸球体のパーセンテージのスコア。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００５、^＃検出不能。 図４は、Ｔ細胞浸潤に対するＬＣＨＫ１６８の効果を示す。ビヒクル処置した疾患対照および正常対照と比較して、ＬＣＨＫ１６８で処置したＩｇＡＮを有するマウスにおいて。（Ａ）ＣＤ３＋Ｔ細胞に対する腎組織の染色。（Ｂ）糸球体および糸球体周辺における染色細胞のスコア。元の倍率は４００倍である。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００５、^＃検出不能。 図５は、単球／マクロファージ浸潤に対するＬＣＨＫ１６８の効果を示す。ビヒクル処置した疾患対照および正常対照と比較して、ＬＣＨＫ１６８で処置したＩｇＡＮを有するマウスにおいて。（Ａ）Ｆ４／８０^＋単球／マクロファージに対する腎組織の染色。（Ｂ）糸球体および糸球体周辺における染色細胞のスコア。元の倍率は４００倍である。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００５、^＃検出不能。 図６は、Ｔｈ細胞浸潤に対するＬＣＨＫ１６８の効果を示す。ビヒクル処置した疾患対照および正常対照と比較して、ＬＣＨＫ１６８で処置したＩｇＡＮを有するマウスにおいて。（Ａ）ＣＤ４＋Ｔ細胞に対する腎組織の染色。（Ｂ）糸球体および糸球体周辺における染色細胞のスコア。元の倍率は４００倍である。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００５、^＃検出不能。 図７は、Ｔｃ細胞浸潤に対するＬＣＨＫ１６８の効果を示す。ビヒクル処置した疾患対照および正常対照と比較して、ＬＣＨＫ１６８で処置したＩｇＡＮを有するマウスにおいて。（Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する腎組織の染色。（Ｂ）糸球体および糸球体周辺における染色細胞のスコア。元の倍率は４００倍である。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００５、^＃検出不能。 図８は、樹状細胞浸潤に対するＬＣＨＫ１６８の効果を示す。ビヒクル処置した疾患対照および正常対照と比較して、ＬＣＨＫ１６８で処置したＩｇＡＮを有するマウスにおいて。（Ａ）ＣＤ１１ｃ＋Ｔ細胞に対する腎組織の染色。（Ｂ）糸球体および糸球体周辺における染色細胞のスコア。元の倍率は４００倍である。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００５、^＃検出不能。 図９は、ＬＣＨＫ１６８腎線維症関連遺伝子発現の効果を示す。ビヒクル処置した疾患対照および正常対照と比較して、ＬＣＨＫ１６８で処置したＩｇＡＮを有するマウスにおいて。（Ａ）コラーゲンＩＶは、処置の１４日および２８日に腎臓組織の免疫組織化学的染色によって検出された。（Ｂ）糸球体および糸球体周辺における染色細胞のスコア。元の倍率は４００倍である。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００５。 図１０は、ＬＣＨＫ１６８が、ＩｇＡ腎症（ＩｇＡＮ）を有するマウスの腎臓における活性酸素種（ＲＯＳ）産生を予防することを示す。ビヒクル処置した疾患対照および正常対照と比較して、ＬＣＨＫ１６８で処置したＩｇＡＮを有するマウスの腎臓からの組織を、スーパーオキシドアニオンレベル（反応性発光単位［ＲＬＵ］／１５分／乾燥重量ｍｇとして評価した）について処置の１４および２８日に評価した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００５。 図１１は、ＬＣＨＫ１６８による処置がＩｇＡ腎症（ＩｇＡＮ）を有するマウスにおける細胞性免疫を調節する、フローサイトメトリー分析を示す。ビヒクル処置した疾患対照および正常対照と比較して、ＬＣＨＫ１６８で処置したＩｇＡＮを有するマウスでは、処置の１４日および２８日の免疫応答を記憶ＣＤ４^＋Ｔ細胞活性化の程度として評価した。^＊ｐ＜０．０５。 図１２は、ＬＣＨＫ１６８での処置がＩｇＡ腎症（ＩｇＡＮ）における腎ＴＬＲ２ ｍＲＮＡレベルを低下させることを示す。ビヒクル処置した疾患対照および正常対照と比較して、ＬＣＨＫ１６８で処置したＩｇＡＮを有するマウスでは、ＴＬＲ２のｍＲＮＡレベル（ＧＡＰＤＨと比較して）は、腎組織のリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって決定された。^＊ｐ＜０．０５。 図１３は、ＬＣＨＫ１６８がＩｇＡ免疫複合体（ＩｇＡ−ＩＣ）ＤＣの成熟を減衰させたことを示す。ＩｇＡ−ＩＣおよび偽と比較して、ＬＣＨＫ１６８で処置したＩｇＡ−ＩＣを有するＤＣにおいて、（Ａ）ＣＤ４０；（Ｂ）ＣＤ８０；および（Ｃ）ＣＤ８６の発現レベルをフローサイトメトリーによって決定した。（Ｄ）ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６樹状細胞を有する細胞集団のパーセンテージ。 図１４は、ＩｇＡ−ＩＣにより刺激したＤＣにおけるＮＬＲＰ３の活性化がＬＣＨＫ１６８によって減少したことを示す。ＩｇＡ−ＩＣおよび偽と比較して、ＬＣＨＫ１６８で処置したＩｇＡ−ＩＣを有するＤＣにおいて。（Ａ）ローディングコントロールとしてβ−アクチンを用いたＮＬＲＰ３についての代表的なウェスタンブロットおよび（Ｂ）ＮＬＲＰ３についての半定量的分析。

他に記載がない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解している意味を有する。本明細書で使用する場合、以下の用語は、他に記載がない限り、それらに準ずる意味を有する。

本明細書では冠詞「１つの（「ａ」および「ａｎ」）」は、冠詞の文法上の目的語の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）をいうのに使用される。例として、「１つのエレメント（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は１つのエレメントまたは２つ以上のエレメントを意味する。

本発明において、ジンセノサイドＭ１が、それをＩｇＡＮマウスに投与することによってＩｇＡＮの発症を予防できることが予想外に見出された。特に、ＩｇＡＮを有する動物は、（１）糸球体における、メサンギウム細胞増殖を含む固有細胞増殖、半月体形成、好中球浸潤および分節状硬化、ならびに（２）尿細管間質区画における、間質性（特に糸球体周辺）単核白血球炎症、線維症、およびタンパク円柱を伴う尿細管萎縮、またはタンパク尿もしくは血尿、または上昇した血清尿素窒素レベルもしくは血清クレアチニンレベルを含む様々な症状を示すことが見出されている。

したがって、本発明は、対象を治療するのに有効な量のジンセノサイドＭ１を対象に投与することを含む、ＩｇＡＮに罹患している対象を治療する方法を提供する。本発明はまた、それを必要とする対象におけるＩｇＡＮを治療するための医薬を製造するためのジンセノサイドＭ１の使用を提供する。

本発明の方法は、ＩｇＡＮを有する患者におけるこれらの症状のいずれか１つを改善するのに有効である。

ジンセノサイドＭ１、２０−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールは、当該技術分野において公知のサポニン代謝物の１つである。ジンセノサイドＭ１の化学構造は、以下の通りである。

ジンセノサイドＭ１は、ヒト腸内細菌によるギペノサイド経路を経たプロトパナキサジオール系ジンセノサイドの代謝物の１つとして知られている。ジンセノサイドＭ１は、摂取後に血液中または尿中で見出され得る。ジンセノサイドＭ１は、その全内容を本明細書に参照により組み込む台湾特許出願第０９４１１６００５（Ｉ２８０９８２）号および米国特許第７，９３２，０５７号などの当該技術分野において公知の方法により、真菌発酵を介してニンジン植物から調製することができる。ある種の実施形態では、ジンセノサイドＭ１を調製するためのニンジン植物は、ウコギ（Ａｒａｌｉａｃｅａｅ）科、トチバニンジン（Ｐａｎａｘ）属、例えばチョウセンニンジン（Ｐ．ｇｉｎｓｅｎｇ）およびトチバニンジン（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏ−ｇｉｎｓｅｎｇ）（サンシチ（Ｓａｎｑｉ）とも呼ばれる）を含む。一般に、ジンセノサイドＭ１の調製方法は、（ａ）ニンジン植物材料（例えば葉または茎）の粉末を用意するステップ；（ｂ）ニンジン植物材料を発酵させるための真菌を用意するステップであって、発酵温度は２０〜５０℃にわたり、発酵湿度は７０〜１００％にわたり、ｐＨ値は４．０〜６．０にわたり、発酵期間は５〜１５日にわたるステップ；（ｃ）発酵産物を抽出および採取するステップ；および（ｄ）発酵産物から２０−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールを単離するステップを含む。

本発明ではジンセノサイドＭ１を「単離された」または「精製された」と記載する場合、完全に単離されたまたは精製されたのではなく、比較的に単離されたまたは精製されたものと理解すべきである。例えば、精製されたジンセノサイドＭ１とは、その天然に存在する形態と比較してより精製されたものをいう。一実施形態では、精製されたジンセノサイドＭ１を含む調製物は、全調製物の５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超または１００％（ｗ／ｗ）の量でジンセノサイドＭ１を含み得る。本明細書で比率または投与量を示すのに特定の数字を使用する場合、前記数字は一般に、その数字より１０％超および未満の範囲内、またはさらに詳しくは５％超および未満の範囲内のものを含むことを理解すべきである。

本明細書に使用される「個体」または「被検体」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物、例えばコンパニオンアニマル（イヌ、ネコおよび同種のものなど）、農用動物（雌ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマおよび同種のものなど）、または実験動物（ラット、マウス、モルモットおよび同種のものなど）を含む。具体的には、対象はＩｇＡＮに罹患しているものである。

「治療すること」という用語は、本明細書で使用する場合、障害、障害の症状もしくは状態、障害により引き起こされた身体障害、または障害の進行を治癒させる、癒やす、軽減する、緩和する、変化させる、改善する、寛解させる、好転させる、またはそれらに作用することを目的として、１種または複数種の活性剤を含む組成物を、障害、障害の症状もしくは状態、または障害の進行に悩む対象に外用または投与することをいう。

本明細書に使用される「治療有効量」という用語は、治療される対象に治療効果を与える活性成分の量をいう。例えば、ＩｇＡＮを治療するための有効量は、ＩｇＡＮを有する対象の（１）糸球体における、メサンギウム細胞増殖を含む固有細胞増殖、半月体形成、好中球浸潤および分節状硬化、ならびに（２）尿細管間質区画における、間質性（特に糸球体周辺）単核白血球炎症、線維症、およびタンパク円柱を伴う尿細管萎縮、またはタンパク尿もしくは血尿、または上昇した血清尿素窒素レベルもしくは血清クレアチニンレベルなどの１つまたは複数の症状または状態を防止する、改善する、軽減するまたは減少させることができる量である。これらの症状は、例えば尿タンパク質、血中尿素窒素または血清クレアチニンの量を解析することにより、または腎臓切片を解析することにより、様々な疾患進行関連指標に基づき、当該技術分野において公知の方法を使用して判定および評価することができる。治療有効量は、投与の経路および頻度、前記薬剤を投与される個体の体重および種、ならびに投与の目的など様々な理由に応じて変化してもよい。当業者は、それぞれの場合に本明細書の開示内容、確立された方法、および当業者自身の経験に基づき投与量を決定してもよい。例えば、特定の実施形態では、本発明に使用されるジンセノサイドＭ１の経口投与量は、１日１０〜１，０００ｍｇ／ｋｇである。いくつかの例では、本発明に使用されるジンセノサイドＭ１の経口投与量は、１日１００〜３００ｍｇ／ｋｇ、１日５０〜１５０ｍｇ／ｋｇ、１日２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、１日１０〜５０ｍｇ／ｋｇ、または１日５〜３０ｍｇ／ｋｇである。さらに、本発明のいくつかの実施形態では、ジンセノサイドＭ１は、一定期間定期的に投与され、例えば、少なくとも１５日間、１ヶ月間または２ヶ月間以上連日投与される。

本発明によれば、ジンセノサイドＭ１は、ＩｇＡＮを治療するための活性成分として使用することができる。一実施形態では、治療有効量の活性成分は、送達および吸収を目的として、薬学的に許容される担体と共に適切な形態の医薬組成物に製剤化してもよい。投与様式に応じて、本発明の医薬組成物は好ましくは約０．１重量％〜約１００重量％の活性成分を含み、重量パーセントは全組成物の重量に基づき計算される。

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」は、担体が組成物中の活性成分との適合性があり、好ましくは前記活性成分を安定化でき、治療を受ける個体に安全であることを意味する。前記担体は、活性成分に対する希釈剤、ビヒクル、賦形剤またはマトリックスであってもよい。適切な賦形剤の一部の例として、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルボース、マンノース、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、トラガントガム、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップおよびメチルセルロースが挙げられる。組成物は、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油など滑沢剤；湿潤剤；乳化剤および懸濁化剤；メチルおよびプロピルヒドロキシベンゾエートなどの防腐剤；甘味料；ならびに着香剤をさらに含んでもよい。本発明の組成物は、患者への投与後の活性成分の迅速放出、持続放出または遅延放出の作用を持たせてもよい。

本発明によれば、前記組成物の形態は、錠剤、丸剤、散剤、ロゼンジ、パケット（ｐａｃｋｅｔ）剤、トローチ、エリキシル剤（ｅｌｉｘｅｒｓ）、懸濁剤、ローション、溶液剤、シロップ、軟質および硬質ゼラチンカプセル、坐剤、滅菌注射液、ならびに分包散剤であってもよい。

本発明の組成物は、経口法、非経口法（筋肉内、静脈内、皮下および腹腔内など）、経皮法、坐剤法および経鼻法などの任意の生理学的に許容される経路により送達することができる。非経口投与については、本発明の組成物は好ましくは、溶液を血液に対して等張にするのに十分な塩またはグルコースなどの他の物質を含んでもよい滅菌水溶液の形態で使用される。水溶液は、必要に応じて（好ましくは３〜９のｐＨ値で）適切に緩衝化してもよい。滅菌条件下での適切な非経口組成物の調製は、当業者によく知られている標準的な薬理学的技法を用いて達成することができ、追加の創造的労力は必要としない。

本発明によれば、ジンセノサイドＭ１またはジンセノサイドＭ１を活性成分として含む組成物は、ＩｇＡＮを有する個体を治療するのに使用してもよい。具体的には、ジンセノサイドＭ１またはジンセノサイドＭ１を活性成分として含む組成物は、疾患の発症を予防するため、または症状を改善させるため、または症状の悪化を遅延させるためＩｇＡＮを有する個体またはＩｇＡＮに罹患するリスクがある個体に投与してもよい。

さらに、本発明によれば、ジンセノサイドＭ１またはジンセノサイドＭ１を活性成分として含む組成物は、既存の治療方法または医薬、例えば、薬物治療、以下に限定されるものではないが、コルチコステロイド（プレドニゾロンなど）、非ステロイド性（ｎｏｎ−ｓｔｅｒｉｏｄａｌ）抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、細胞傷害性薬（シクロホスファミド、クロラムブシルおよびアザチオプリンなど）、免疫抑制剤（シクロスポリンおよびミコフェノール酸モフェチルなど）、および血管拡張薬（アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥ阻害剤など））と組み合わせて使用してもよい。一実施形態において、組み合わせて使用される薬物または治療方法は、同時に（並行）使用しても、あるいは連続的に使用してもよい。医薬が組み合わせて使用される場合、医薬は同じ処方中で混合しても、あるいは別のカプセル、丸剤、錠剤および注射薬など異なる処方に別々に組み込んでもよい。

本発明について、限定ではなく実証を目的として提供する以下の例によりさらに説明する。

１．材料および方法
１．１ 動物モデルおよび実験プロトコル
Ｂ細胞欠損マウスは、Ａｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ（Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｊｏｈｎ Ｔ．Ｋｕｎｇ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、台北、台湾）から得、国防医療センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｆｅｎｓｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）（台北、台湾）の動物センターで維持した。ＩｇＡＮは、精製したＩｇＡ抗ホスホリルコリン抗体および肺炎球菌Ｃ−多糖類抗原（ＰｎＣ）の連日注射によって誘導した［１４］。全ての動物実験は、国防医療センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｆｅｎｓｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認を得て行われ、実験動物のケアおよび使用のためのＮＩＨのガイドラインと一致していた。

１．２ ジンセノサイドＭ１
台湾特許出願第０９４１１６００５（Ｉ２８０９８２）号および米国特許第７，９３２，０５７号に記載されているような当該技術分野で公知の方法により、ジンセノサイドＭ１である、２０−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール（以下、ＬＣＨＫ１６８と称する）を調製した。実験の間の全体を通して、マウスを強制経口投与によって６０ｍｇ／ｋｇのＬＣＨＫ１６８またはビヒクルで毎日処置し、最初の用量は疾患誘導の２日前に与えた。

１．３ 尿タンパク質および腎機能の分析
体重を毎週測定した。尿試料を毎週代謝ケージにおいて採取し、尿タンパク質を測定した。血清試料を１４および２８日に採取して、血液尿素窒素（ＢＵＮ）およびクレアチニン（Ｃｒ）の血清レベルを測定した。腎臓の組織病理に関して、組織を１０％の緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、次いで切片（３μｍ）を調製し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。増殖、好中球浸潤、硬化症、または糸球体周辺炎症を示す糸球体のパーセンテージを、無作為にサンプリングした糸球体５０個を光学顕微鏡によって４００倍の倍率で計数することによって決定した。

１．４ 病理学的評価
ＩＨＣに関して、ホルマリン固定およびパラフィン包埋した組織切片または凍結切片を、ＤＡＫＯ抗体希釈緩衝液（ＤＡＫＯ）で希釈した、ＣＤ３、Ｆ４／８０、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、コラーゲンＩＶに対する抗体で４℃にて一晩インキュベートし、次いで同じ緩衝液中の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合２次抗体（ＤＡＫＯ）と室温にて１時間インキュベートした。ＨＲＰ結合抗体の場合、ＤＡＢ（ＤＡＫＯ）も添加した。ヘマトキシリンを使用して核を対比染色した。陽性細胞は、Ｐａｘ−Ｉｔ定量的画像分析ソフトウェアにより４００倍の倍率で、２０個の連続した糸球体において、または皮質領域における尿細管間質区画の２０個のランダムに選択した視野において計数した。

１．５ 活性酸素種（ＲＯＳ）の測定
腎組織中のＲＯＳレベルを測定するために、試料を、基質として１．２５ｍＭのルシゲニン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を含有するＫｒｅｂｓ−Ｈｅｐｅｓ緩衝液と室温にてインキュベートし、マルチラベルマイクロプレートリーダー（Ｈｉｄｅｘ）上で１５秒間隔にて２連で発光数を測定した。ＲＯＳ活性は、相対発光単位（ＲＬＵ）／１５分／器官乾燥重量ｍｇ（すなわち、ＲＬＵ／１５分／ｍｇ）またはＲＬＵ／１５分／ｍｌとして表した。

１．６ フローサイトメトリー
マウス由来の脾細胞をトリス緩衝化塩化アンモニウムで処理して赤血球を除去し、洗浄し、１０％のウシ胎仔血清、Ｈｅｐｅｓ緩衝液、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁した。細胞を、ＦＩＴＣ結合抗マウスＣＤ４４、フィコエリトリン結合抗マウスＣＤ６２抗体、およびアロフィコシアニン結合抗マウスＣＤ４を使用して活性化Ｔ細胞サブタイプについて三重染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを使用して分析した。

樹状細胞（ＤＣ）成熟を共刺激分子発現の上方制御によって決定した。細胞をＩｇＡ−ＩＣ、ＬＣＨＫ１６８（１．２μＭ）で処理し、マウスＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６に特異的なｍＡｂで染色し、次いでフローサイトメトリーにより分析した。

１．７ リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
製造業者の指示書に従ってＴＲＩｚｏｌ試薬を使用して腎皮質ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを使用してＴＬＲ２遺伝子発現を測定した。以下のプライマー：ＴＬＲ２について、５’−ＧＴＣＴＣＴＧＣＧＡＣＣＴＡＧＡＡＧＴＧＧＡ−３’（配列番号１）および５’−ＣＧＧＡＧＧＧＡＡＴＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＧＡ−３’（配列番号２）、ならびにＧＡＰＤＨについて、５’−ＴＣＣＧＣＣＣＣＴＴＣＴＧＣＣＧＡＴＧ−３’（配列番号３）および５’−ＡＣＧＧＡＡＧＧＣＣＡＴＧＣＣＡＧＴＧＡ−３’（配列番号４）を使用した。製造業者の指示書に従ってＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを使用してリアルタイム定量を実施した。増幅は、２^−ΔＣｔ法を使用してＧＡＰＤＨについての値に正規化した。

１．８ ウェスタンブロット分析
各タンパク質試料を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に流し、タンパク質をポリビニリデンジフルオリド膜上にエレクトロブロットし、次いでブロッキング緩衝液（５％スキムミルクを含有するトリス緩衝生理食塩水）中で室温にて１時間、次いで４℃にて一晩、ＮＬＲＰ３またはβ−アクチンに対するウサギ抗体とインキュベートした。洗浄後、膜を、同じ緩衝液中のＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と室温にて１時間インキュベートし、次いでＵＶＰ Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｕｍを使用して結合した抗体を検出した。

１．９ 統計的解析
値は平均±ＳＥである。２つの群間の比較はスチューデントのｔ検定を使用して実施した。Ｐ値＞０．０５は統計的に有意であるとみなした。

２．結果
２．１ ジンセノサイドＭ１によるＩｇＡマウスにおけるタンパク尿および血尿の有意な減少ならびに腎機能の保護
疾患対照マウス、すなわち、ビヒクルで処置したＩｇＡＮマウス（対照ＩｇＡＮマウス）は、疾患誘導の１４日から尿タンパク質レベルが増加し、これらは２８日目の研究終了まで上昇した（図１）。この作用はＬＣＨＫ１６８（ＩｇＡＮ＋ＬＣＨＫ１６８）によって顕著に阻害されたが、マウスは依然として正常な未処置の対照と比較して軽度のタンパク尿を示した。さらに、２８日目にＢＵＮ（図２Ａ）およびＣｒ（図２Ｂ）の血清レベルが有意に増加したことを示している疾患対照マウスと比較して、ＩｇＡＮ＋ＬＣＨＫ１６８マウスは、より良好な腎機能を示した。１４日目に、ＢＵＮおよびＣｒの血清レベルは、疾患対照、ＩｇＡＮ＋ＬＣＨＫ１６８、および正常対照マウスの間に有意な差はなかった。

２．２ ＬＣＨＫ１６８で処置したマウスにおける重度の腎臓の組織病理学的特徴の予防
図３に示すように、２８日目に、疾患対照ＩｇＡＮマウスは、病巣に関連したびまん性増殖であるが、典型的な半月体；糸球体における分節状硬化および／または好中球浸潤、尿細管間質区間における激しい糸球体周辺単核白血球浸潤、およびタンパク円柱を伴う散在性尿細管萎縮を示したが、この腎障害はＬＣＨＫ１６８の投与によって有意に阻害された。

２．３ ＬＣＨＫ１６８で処置したマウスにおける腎炎症および線維症の阻害
さらに、ＩＨＣを実施してマウスにおける腎臓に浸潤した単核白血球の表現型および分布を評価した。ＣＤ３^＋Ｔ細胞（図４）、Ｆ４／８０^＋単球／マクロファージ（図５）、ＣＤ４^＋Ｔ細胞（図６）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（図７）、ＣＤ１１ｃ^＋樹状細胞（図８）およびコラーゲンＩＶ（図９）に関して、局所的であるが、強い染色が、正常対照と比較して２８日目に疾患対照マウスにおける腎間質組織、大部分は糸球体周辺パターンにおいて見られたが、１４日目に腎臓において炎症細胞および線維症はほとんど見られなかった。対照的に、ＩｇＡＮ＋ＬＣＨＫ１６８マウスは、２８日目の疾患対照マウスと比較して、これらの炎症細胞の浸潤および腎臓における線維症の有意な減少を示した（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００５）。

２．４ ＬＣＨＫ１６８によるＲＯＳ産生の阻害
ＲＯＳは、ＩｇＡＮを含む様々な種類の腎障害における加速および進行を導く主要な有害因子であると考えられている。したがって、腎臓組織におけるＲＯＳレベルを全身的に測定した。疾患対照マウスは、正常対照と比較して２８日目に腎組織において上昇したＲＯＳレベルを示した（図１０）。ＬＣＨＫ１６８投与は、疾患対照マウスと比較して、１４日目の腎組織のＲＯＳレベルの増加を大きく阻害し、２８日目の腎組織におけるＲＯＳレベルの増加を実質的に阻害した（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００５）。

２．５ ＬＣＨＫ１６８による全身性免疫の調節
細胞性免疫はＩｇＡＮの病因に長く関係しているので、フローサイトメトリーによって脾細胞におけるＴ細胞活性化を調べた。図１１に示すように、正常対照と比較して、疾患対照マウスにおいて記憶ＣＤ４^＋Ｔ細胞の明らかな増加が観察された。ＬＣＨＫ１６８投与は、疾患対照マウスと比較して、記憶ＣＤ４^＋Ｔ細胞の有意な減少を誘導した。（^＊ｐ＜０．０５）。

２．６ ＬＣＨＫ１６８によるＴＬＲ２発現の阻害
研究者らは、ＴＬＲ２の発現レベルがＩｇＡＮにおける腎炎症および線維症と相関することを実証した。したがって、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって腎臓におけるＴＬＲ２ ｍＲＮＡレベルを測定した（図１２）。２８日目に有意に増加したＴＬＲ２ ｍＲＮＡレベルを示したＩｇＡＮ対照マウスと比較して、ＩｇＡＮ＋ＬＣＨＫ１６８群のマウスはＴＬＲ２ ｍＲＮＡレベルを有意に低下させたが、１４日での差は統計的に有意ではなかった（^＊ｐ＜０．０５）。

２．７ ＬＣＨＫ１６８によるＤＣ成熟の阻害
成熟は、免疫応答のＤＣにより媒介される調節における重要な段階である。ＤＣ成熟に対するＬＣＨＫ１６８の効果を調べるために、フローサイトメトリーによってＤＣにおけるＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現レベルを調べた。そして、ウェスタンブロットによってＮＬＲＰ３インフラマソーム発現を検出した。偽と比較したＩｇＡ−ＩＣ刺激により、ＤＣにおけるＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６の発現が増大した。対照的に、ＬＣＨＫ１６８処置により、これらの分子の発現レベルは有意に低下した（図１３）。さらに、ＬＣＨＫ１６８で処置したＤＣにより、ＮＬＲＰ３タンパク質発現の有意な減少が示された（図１４）。

要約すると、本発明者らの研究により、ジンセノサイドＭ１がＩｇＡＮの処置およびＩｇＡＮの発症を予防するのに有効であることが示される。特に、その結果は、（１）腎臓の組織病理学的特徴の減少、（２）Ｔ細胞および単球／マクロファージの浸潤の予防、（３）腎間質組織における線維症およびコラーゲン沈着の予防、（４）活性酸素種の産生の阻害、（５）全身性記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞の減少、（６）樹状細胞の成熟の阻害、および（７）ジンセノサイドＭ１での治療によるＮＬＲＰ３インフラマソーム発現の阻害を示す。これらの見解の全てにより、ジンセノサイドＭが、ＩｇＡＮの治療または予防のための候補新規薬物にさらに開発できることを示唆している。

本発明が属する技術分野の当業者は、さらに詳細な説明を必要とせずに、本発明を本明細書の説明に基づいて利用することができると考えられる。したがって、提供される説明および特許請求の範囲は、本発明の範囲を決して制限するものではなく、例示的な目的として理解されるべきである。

参考文献

Claims (12)

1. 治療に有効な量のジンセノサイドＭ１を含む、必要とする対象におけるＩｇＡ腎症（ＩｇＡＮ）を治療するための組成物。
2. 前記対象の（１）糸球体における、メサンギウム細胞増殖を含む固有細胞増殖、半月体形成、好中球浸潤および分節状硬化、ならびに（２）尿細管間質区画における、間質性（特に糸球体周辺）単核白血球炎症、線維症、およびタンパク円柱を伴う尿細管萎縮からなる群から選択されるＩｇＡＮの１つまたは複数の症状を低減または軽減させるのに有効である、請求項１に記載の組成物。
3. 前記対象の腎組織において、活性酸素種（ＲＯＳ）レベルを減少させ、全身性記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞を減少させ、樹状細胞の成熟を阻害し、および／またはＮＬＲＰ３インフラマソーム発現を阻害するのに有効である、請求項１に記載の組成物。
4. 前記対象において、タンパク尿もしくは血尿を減少させるか、または血清尿素窒素レベルもしくは血清クレアチニンレベルを低下させるのに有効である、請求項１に記載の組成物。
5. 前記ジンセノサイドＭ１は、非経口または経腸により投与される、請求項１に記載の組成物。
6. 前記ジンセノサイドＭ１は、コルチコステロイド、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、細胞障害性薬、免疫抑制剤、および血管拡張剤からなる群から選択される、ＩｇＡＮを治療するための１種以上の治療剤と組み合わせて投与される、請求項１に記載の組成物。
7. 必要とする対象におけるＩｇＡ腎症（ＩｇＡＮ）を治療するための医薬を製造するためのジンセノサイドＭ１の使用。
8. 前記医薬は、前記対象の（１）糸球体における、メサンギウム細胞増殖を含む固有細胞増殖、半月体形成、好中球浸潤および分節状硬化、ならびに（２）尿細管間質区画における、間質性（特に糸球体周辺）単核白血球炎症、線維症、およびタンパク円柱を伴う尿細管萎縮からなる群から選択されるＩｇＡＮの１つまたは複数の症状を低減または軽減させるのに有効である、請求項７に記載の使用。
9. 前記医薬は、前記対象の腎組織において、活性酸素種（ＲＯＳ）レベルを減少させ、全身性記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞を減少させ、樹状細胞の成熟を阻害し、および／またはＮＬＲＰ３インフラマソーム発現を阻害するのに有効である、請求項７に記載の使用。
10. 前記医薬は、前記対象において、タンパク尿もしくは血尿を減少させるか、または血清尿素窒素レベルもしくは血清クレアチニンレベルを低下させるのに有効である、請求項７に記載の使用。
11. 前記ジンセノサイドＭ１は、非経口または経腸により投与される、請求項７に記載の使用。
12. 前記ジンセノサイドＭ１は、コルチコステロイド、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、細胞障害性薬、免疫抑制剤、および血管拡張剤からなる群から選択される、ＩｇＡＮを治療するための１種以上の治療剤と組み合わせて投与される、請求項７に記載の使用。