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JP6693868B2 - 抗癌化学療法剤用のケージ化された白金ナノクラスタ - Google Patents

抗癌化学療法剤用のケージ化された白金ナノクラスタ Download PDF

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Description

本発明は抗癌化学療法剤に関する。
水によって単純に活性化されるシスプラチンの毒性とは異なり、Ｐｔは、王水（ＨＮＯ３／ＨＣｌ）等の高い腐食性の作用物質にのみ溶解し得る貴金属と考えられる。この王水は、初めにＰｔを酸化させた後に溶解させて、Ｐｔ塩化物複合体を形成する。近年、Ｐｔサイズを小さくすることで表面積対体積比（surface-to-volume ratio）が増大した結果、酸素を吸着させるとともに、水の酸化を促すことによって、酸化度を著しく増大させて、表面を腐食させ得ることが分かっている。
しかしながら、Ｐｔを効率的に小さくする方法の発見には課題が残っている。
一態様において、本発明は、（ａ）デンドリマーと、（ｂ）酸化白金を含み、デンドリマーの内部に閉じ込められる白金ナノクラスタと、（ｃ）デンドリマーの表面を被覆するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とを含む二重ケージ化された白金ナノクラスタ複合体（double-caged platinum nanocluster complex）に関する。デンドリマーはアミン終端デンドリマーであってもよい。
別の態様において、本発明は、（ａ）アミン終端デンドリマーと、（ｂ）酸化白金を含むと共に０．２２ｎｍの標準偏差を伴う０．９３ｎｍの平均直径を有し、アミン終端デンドリマーの内部に閉じ込められる白金ナノクラスタとを含むケージ化された白金ナノクラスタ複合体に関する。
さらに、別の態様において、本発明は、上述のケージ化された白金ナノクラスタ複合体を合成する方法であって、
（ａ）八面体のヘキサクロロ白金酸アニオンを含む第１の溶液を、アミン終端デンドリマー又はヒドロキシル終端デンドリマーを含む第２の溶液と混和して、ＰｔＣｌ６ ２−アニオン／デンドリマー複合体を含む混合物を形成する工程と、
（ｂ）ＰｔＣｌ６ ２−アニオン／デンドリマー複合体を含む混合物を所定時間インキュベートする工程と、
（ｃ）ＰｔＣｌ６ ２−アニオン／デンドリマー複合体中のＰｔＣｌ６ ２−アニオンを還元して、デンドリマーでケージ化された白金ナノクラスタ複合体を含む混合物を形成する工程と、
（ｄ）デンドリマーでケージ化された白金ナノクラスタ複合体を含む混合物をフィルタに通過させて、デンドリマーでケージ化された白金ナノクラスタ複合体を含む濾液を取得する工程と、
（ｅ）濾液を凍結乾燥して、デンドリマーでケージ化された白金ナノクラスタ複合体を取得する工程とを含むケージ化された白金ナノクラスタ複合体を合成する方法に関する。
さらに、別の態様において、本発明は、二重ケージ化された白金ナノクラスタ複合体を合成する方法であって、
（ｉ）溶媒に、
（ａ）アミン終端デンドリマー又はヒドロキシル終端デンドリマーと、
（ｂ）酸化白金を含み、アミン終端デンドリマー又はヒドロキシル終端デンドリマーの内部に閉じ込められる白金ナノクラスタと、
を含む上述のデンドリマーでケージ化された白金ナノクラスタ複合体を溶解させて溶液を形成し、
（ｉｉ）デンドリマーがアミンで終端された条件でＰＥＧアルデヒドを溶液中に添加、又は、デンドリマーがヒドロキシル終端された条件でＰＥＧ−ＮＨ２を溶液中に添加し、
（ｉｉｉ）ＰＥＧアルデヒドをアミン終端デンドリマーの第一級アミンと反応させる、又は、ＰＥＧ−ＮＨ２をヒドロキシル終端デンドリマーと反応させて、二重ケージ化された白金ナノクラスタ複合体を取得する、二重ケージ化された白金ナノクラスタ複合体を合成する方法に関する。
さらに、別の態様において、本発明は、それを必要とする対象（subject）の腫瘍細胞の成長を抑制する医薬品の製造における、上述のケージ化された白金ナノクラスタ複合体、又は二重ケージ化された白金ナノクラスタ複合体の使用に関する。また、本発明は、それを必要とする対象の腫瘍細胞の成長を抑制するために使用される、上述のケージ化された白金ナノクラスタ複合体、又は二重ケージ化された白金ナノクラスタ複合体に関する。
また、別の態様において、本発明は、
（ａ）治療に有効な量の上述の複合体と、
（ｂ）医薬上許容される担体と、
を含む、医薬組成物に関する。
これら及び他の態様は、添付の図面と照らして、好ましい実施形態の以下の説明から明らかとなるであろう。添付の図面は、本発明の１つ又は複数の実施形態を示し、明細書の記載と併せて、本発明の原理を説明することを助けるものである。可能な限り、全ての図面を通じて実施形態の同じ又は同様の要素を指すものに同じ参照符号を用いている。
図１Ａは、ＰＮの形成にかかるアニオンの幾何学的形状の調整に基づく新規戦略の概略図である。経路（ｉ）及び（ｉｉ）は、Ｇ２ＮＨ２の外部及び内部がそれぞれ、平面四角形のＰｔＣｌ４ ２−及び八面体のＰｔＣｌ６ ２−と選択的に結びつくことを示している。図１Ｂは、ケージ化されたＰＮを腫瘍浸透ペプチドと混合させて、腫瘍を標的化するとともに、外側のＰＥＧコロナを取って腫瘍内活性化を作用させることにより悪性細胞を死滅させる概略図である。抗癌効率において重要な点は、ＰＮがその固有な不活性を失うことで（赤色の長方形の挿入図）、弱酸性の細胞小器官においてその溶解を示すことである。 図２Ａ及び図２Ｂは、上述の複合体によるＮ−Ｐｔ−Ｎ配位を示す、ＰｔＣｌ４ ２−／Ｇ２ＮＨ２複合体（Ａ）及びＰｔＣｌ６ ２−／Ｇ２ＮＨ２複合体（Ｂ）のラマンスペクトルである。図２Ｃ及び図２Ｄは、還元前のＰｔＣｌ４ ２−／Ｇ２ＮＨ２複合体（Ｃ）及び還元前のＰｔＣｌ６ ２−／Ｇ２ＮＨ２複合体（Ｄ）のＨＲＴＥＭ画像である。図２Ｅ及び図２Ｆは、（Ｃ）及び（Ｄ）の複合体が還元されている間に、ＰＮが、Ｇ２ＮＨ２の外部（Ｅ）及び内部（Ｆ）でケージ化されたことを示す図である。全てのＴＥＭサンプルは、測定の２日前に調製した新鮮なものであり、調製したサンプルは自然乾燥させた。測定値は全て逆染色法を用いることなく得られたものである。 図３Ａは、ＣＰＮのＩＣ５０が、シスプラチン及びカルボプラチンの両方のＩＣ５０よりも高かったことを示す図である。拡大挿入図は、より低い濃度である０μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬの範囲を示すものである。図３Ｂは、細胞死の経路を観察するための顕微鏡画像である。未処理又は約５０μｇ／ｍＬのＣＰＮで種々の時間処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びＰＩで二重染色した。上のパネルは左から右へそれぞれ、未処理の細胞及びＣＰＮで５時間処理した細胞を示す。下のパネルはそれぞれ、ＣＰＮで１０時間及び２４時間処理した細胞を示す。スケールバー：３０μｍ。 図４Ａ及び図４Ｂは、Ｐｔ（Ａ）及び酸素（Ｂ）の結合エネルギーを示すＸＰＳスペクトルであり、（Ａ）で特に表されるものは、ＣＰＮとＰｔナノ粒子のＰｔ（４ｆ７／２）領域とＰｔ（４ｆ５／２）領域である。アスタリスクは、ＣＰＮの結合エネルギーが７３．４ｅＶへシフトしたことを示している。結合エネルギーは、内標準物質として基体上に堆積させた金薄膜のＡｕ ４ｆ７／２（８３．７ｅＶ）ピークによって較正した。図４Ｃは、ＣＰＮの内部移行経路を確認するために、細胞取込み中に使用される様々なエンドサイトーシス阻害剤を示す図である。図４Ｄは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上のＣＰＮの細胞取込み挙動の共焦点顕微鏡検査を示す図である。ＣＰＮは、可視化用のＦＩＴＣ（緑）及びリソソームトラッカー（赤）でラベル化し、ＣＰＮとリソソームトラッカーとの共局在部分は黄色となった。細胞形態はＣＰＮの毒性に起因して変化した。図４Ｅは、ＩＣＰ−ＭＳによって求められる、エンドソームを模倣する環境下で本発明のＣＰＮからイオン形態へＰｔが溶解されたことを示す図である。対照としてＣＰＮを王水（３：１ ＨＣｌ／ＨＮＯ３）に溶解させた。 図５Ａ〜図５Ｆは、それぞれ、ＩＴ注射後及びＩＶ注射後に評価したＣＰＮ（Ａ〜Ｃ）及びＤＣＰＮ（Ｄ〜Ｆ）の抗癌治療効果を示す図である。Ａ）及びＥ）は一連の腫瘍体積、Ｂ）は各群のエンドポイントにおける腫瘍サイズの代表的な画像、Ｃ）はＴＵＮＥＬアッセイ（スケールバー：２０μｍ）を用いて観察したアポトーシス細胞死、Ｄ）は腫瘍標的、及びＦ）は体重の記録である。腫瘍を有するヌードマウスのサイズは、ＩＴ注射及びＩＶ注射についてそれぞれ約６０ｍｍ３及び１５０ｍｍ３に達した。動物モデルは、ＩＴ注射（ＰＢＳ、Ｇ２ＮＨ２、ＣＰＮ及びシスプラチン）及びＩＶ注射（ＰＢＳ、Ｇ２ＮＨ２、ｉＲＧＤ、ＤＣＰＮ及びシスプラチン）を含む２セットの処理剤で処理した。ＩＴにおけるＧ２ＮＨ２及びＩＶにおけるｉＲＧＤ単独のプロファイルは、グラフの複雑化を避けるために省略した。腫瘍体積及びマウスの体重は、指定日に測定した。各データ点は、薬物注射後の平均腫瘍体積の相対変化を表すものであり（ｎ＝５、Ｐ＜０．０５、及び、ｎ．ｓ．は統計的有意性がないことを示す）、誤差棒はＳＤを表す。注射時間には黒い矢印で印をつけた。 図６は、ＣＰＮのＥＤＳスペクトルである。アスタリスクはＰｔシグナルを表している。 図７Ａ〜図７Ｃは、ＣＰＮ及びＰＮ集合体（assembly）の特性の比較を示す図である。これらの材料はアニオンの幾何学的形状を調整することによって生成した。Ａ）は溶解性を示す。Ｂ）は細胞毒性の評価である。Ｃ）は細胞内取込みの有効性を示す。 図８Ａ〜図８Ｄは、シスプラチンにより誘導される細胞死及びＣＰＮにより誘導される細胞死の経路を比較する顕微鏡画像である。未処理又は３０μｇ／ｍＬのシスプラチンで種々の時間処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びＰＩで二重染色した。上のパネルは左から右へそれぞれ、未処理の細胞（Ａ）とシスプラチンで５時間処理した細胞（Ｂ）とを示す。下のパネルはそれぞれ、ＣＰＮで１０時間（Ｃ）及び２４時間（Ｄ）処理した細胞を示す。スケールバー：５０μｍ。 図９は、ＣＰＮのＲＯＳ生成を示す図である。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株は、ＲＰＭＩ １６４０培地において（培地には１０％ウシ胎児血清を添加した）、５％ＣＯ２雰囲気の下、３７℃で培養した。細胞は、６ウェル細胞培養プレートに、１ウェル当たり１×１０５細胞を播種し、３７℃で２４時間培養した。その後、培養培地は、培養培地中にＧ２ＮＨ２単独、ＣＰＮ、シスプラチン及び０．０３％のＨ２Ｏ２を含む様々な処理剤を存在させることにより変化させた。試験は培地を変えずに３時間実施した。細胞培養培地の上清を除去した後、細胞を単離して、INVITROGEN（商標）によるＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡを用いたＲＯＳアッセイにかけた。 図１０Ａは、ＢＡの安全な推定投与量及び処理時間を示す図である。注目すべきは、ＢＡも、ミトコンドリアの機能を低下させることによってＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞死を容易に引き起こすことが知られていることである。それ故、ＢＡの濃度及び処理時間をそれぞれ、最小限に抑えるとともに小さくして、阻害剤とＣＰＮとの相乗効果による細胞死を防ぐことで、ＣＰＮ処理中におけるＢＡの存在下と非存在下とで著しい違いが生じないようにしなければならない。図１０Ｂは、ＣＰＮ細胞毒性に対するエンドソーム／リソソームのｐＨ上昇効果を示す図である。 図１１は、活性カスパーゼ−３の免疫染色によって観察される、ＣＰＮにより誘導されるアポトーシス細胞死を示す図である。スケールバー：２０μｍ。 図１２Ａ〜図１２Ｃは、ＤＣＰＮ及びその前駆体の１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。 図１３は、エンドポイント後のＣＰＮのバイオクリアランス（bio-clearance）を示す図である。 図１４は、開裂性のＰＥＧで被覆されるＧ２ＮＨ２の腫瘍標的化学療法剤及び抗癌化学療法剤における相対的効力を示す図である。腫瘍抑制における有効な効力は検出されなかった。エンドポイントにおける腫瘤が、初期点におけるものよりも著しく大きくなっている。 図１５は、記録したマウスの摂餌量を示す図である。各データ点は、薬物注射後の各ケージ内（ｎ＝５）の摂餌量の総量を表す。 図１６Ａ〜図１６Ｄは、切除した腫瘍における組織学的Ｈ＆Ｅ染色の比較を示す図である。画像Ａ）〜Ｄ）は、ＰＢＳ、Ｇ２ＮＨ２、ＤＣＰＮ及びシスプラチンを含む様々な処理剤のものであり、倍率が４００倍である。
実施例中の多数の変更形態及び変形形態が当業者に明らかであることから、例示を目的とするにすぎない以下の実施例で本発明をより詳細に説明する。ここでは、本発明の様々な実施形態を詳細に説明する。図面に関して、同様の数字は、全ての図面を通じて同様の成分を指し示している。本明細書中で使用される場合、また添付の特許請求の範囲全体を通じて、文脈にはっきりと指示されていない限り、数量が特定されていないものの意味には、複数が包含される（the meaning of "a", "an", and "the" includes plural reference）。また、本明細書中で使用される場合、また添付の特許請求の範囲全体を通じて、文脈にはっきりと指示されていない限り、「における（in）」の意味には、「内における（in）」及び「上における（on）」が包含される。さらには、読み手の便宜上、表題又は副題を明細書中に使用することがあるが、これは本発明の範囲に影響を与えるものではない。加えて、本明細書中に使用される幾つかの用語をより具体的に以下に定義する。
定義
本明細書中に使用される用語は概して、本発明の文脈において、また各々の用語が使用される特定の文脈において、当該技術分野におけるそれらの通常の意味を有するものである。本発明を記載するために使用される特定の用語は、以下、又は本明細書中の他の部分で論じられ、本発明の記載に関わる実務者に付加的な手引きを提供するものである。便宜上、幾つかの用語を強調することもあり、例えば、イタリック及び／又は引用符を使用することもある。強調を使用しても用語の範囲及び意味に影響を与えることはなく、それが強調されるにせよされないにせよ、同様の文脈において用語の範囲及び意味は同じである。同じ事項を、２つ以上の方法で述べることがあることを理解されたい。したがって、ここで論じられる用語のいずれか１つ又は複数に、代替的な用語及び同義語を使用してもよく、また、用語がここで補足説明されるか又は述べられるかにせよされないにせよ、それに特殊な意義が課されることもない。幾つかの用語に対して同義語を提示している。１つ又は複数の同義語の詳説は、他の同義語の使用を排除するものではない。ここに述べられるあらゆる用語の用例を含む本明細書全体での用例の使用は、例示を目的とするにすぎず、本発明又は例を挙げた全ての用語の範囲及び意味を限定するものではない。同様に、本発明は本明細書中に与えられる様々な実施形態に限定されるものでもない。
特に定義しない限り、ここに使用される全ての技術的及び科学的な用語は、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者（当業者）が共通して理解する意味と同じ意味を有するものである。矛盾が生じる場合には、定義を含む本明細書を照合するものとする。
本明細書中で使用される場合、「略」、「約」又は「およそ」は概して、所与の値又は範囲の２０パーセント以内、好ましくは１０パーセント以内、より好ましくは５パーセント以内を意味するものとする。ここで与えられる数量は、近似値であり、「略」、「約」又は「およそ」という用語は、明確に記述されていない場合にも推論し得ることを意味するものである。
本明細書中で使用される場合、「ナノクラスタ」という用語は、２ｎｍより小さい直径を有するか又は１００個未満の原子から構成される粒子を指すものである。
ヘキサクロロ白金酸アニオンは化学式［ＰｔＣｌ６］２−を有する。
デンドリマーは繰り返し分枝した分子である。デンドリマーは典型的にコアを取り囲むように対称であり、多くの場合、球状の三次元形態をとるものである。デンドリマーはまた、世代（generation）によって分類され、これは、その合成中に繰り返された分枝サイクルの数を指す。例えば、収束的合成によってデンドリマーを生成し、分枝反応がコア分子上で３回行われた場合、得られるデンドリマーは第３世代デンドリマーとみなされる。後続の各世代は、前の世代の約２倍の分子重量のデンドリマーをもたらす。第１世代デンドリマー、第２世代デンドリマー及び第３世代デンドリマーは、それぞれ、世代−１（Ｇ−１）、世代−２（Ｇ−２）及び世代−３（Ｇ−３）デンドリマーと表される。
「ケージ化される」という用語は、ケージ内に入れられるか若しくは閉じ込められるか、又はあたかもケージに入っているような状態を指すものである。
「シッフ塩基」という用語はイミン官能基を指すものである。シッフ塩基は、アミン基と、アルデヒド又はケトンのカルボニル基との縮合により形成される。
「溶解性」という用語は、破壊、崩壊又は溶解することを指す。
「閉じ込められる」、「捕捉される」、「ケージ化された」及び「封入される（entrapped）」という用語は全て交換可能である。
濾液は、フィルタを通過して濾過プロセス後に回収缶へと入る流体／液体である。
また、デンドリマーの末端基は概して、デンドリマーの「終端基」又は「表面基（surface group）」とも称される。アミン末端基を有するデンドリマーは「アミノ終端デンドリマー」と呼ばれる。
ｉＲＧＤは、癌性腫瘍を特異的に識別するとともにそれに浸透するものの、正常組織を識別することも浸透することもないペプチド（アミノ酸の鎖）である。このペプチドはまた、診断用粒子及び薬剤を腫瘍に送達することが分かっている。ｉＲＧＤは劇的に、癌の検出及び処置をともに向上させることができた。ｉＲＧＤは、同時投与される薬物を腫瘍組織に深く浸透させることを助ける。ペプチドは、ヒト乳癌、マウスにおける前立腺癌及び膵臓癌に対する治効を大幅に増大させ、薬物ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）の３分の１の量でその通常の投与量と同じ治療効果に至ることが示された。
「処置する」又は「処置」という用語は、疾患、その症状又はそれに対する素因を、治癒する、緩和する、軽減する、治療する、寛解させる又は予防する目的のため、それを必要とする対象に有効な量の治療薬を投与することを指すものである。このような対象は、任意の適切な診断方法による結果に基づき、医療従事者によって識別することができる。
「有効な量」とは、処置対象に治療効果をもたらすのに必要とされる有効薬剤（active agent）の量を意味する。有効用量は、当業者によって認識されるように、投与の経路、賦形剤の使用、及び他の治療処置との併用の可能性に応じて様々な値をとると考えられる。
遊離型Ｐｔを算出するために、ＣＰＮ中の遊離型Ｐｔの量＝１４．４μｍｏｌ／ｋｇ×３５原子／１ｎｍとなる。それ故、５０４μｍｏｌ／ｋｇの遊離型ＰｔがＩＴ投与される。ＤＣＰＮ中の遊離型Ｐｔの量＝１６．６μｍｏｌ／ｋｇ×３５原子／１ｎｍとなる。それ故、５８１μｍｏｌ／ｋｇの遊離型ＰｔがＩＶ投与される。
米国保健福祉省の食品医薬品局（U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration）により出版されている「健康な成人志願者における治療薬に関する臨床試験の安全な初期投与量を推定する産業及び査閲者のための手引き（Guidance for Industry and Reviewers Estimating the Safe Starting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers）」は、「ヒト等価用量（a human equivalent dose）」を下記式：
ＨＥＤ＝動物の投与量（ｍｇ／ｋｇ）×（動物の体重（ｋｇ）／ヒトの体重（ｋｇ））０．３３
による計算によって得ることができることを開示している。ＨＥＤは、投与の経路等の他の因子に応じて様々な値をとることができる。例えばＤＣＰＮのｉ．ｖ．投与では、マウス（２０グラムＢＷ）の投与量が１６．６μｍｏｌ／ｋｇであれば、その際、ＨＥＤは１６．６μｍｏｌ／ｋｇ×（０．０２／患者の体重）０．３３と算出することができる。ＣＰＮのＩＴ注射では、マウスの投与量が７．５ｍｇ／ｋｇであれば、その際、ＨＥＤは７．５ｍｇ／ｋｇ×（０．０２／患者の体重）０．３３となる。
腐食性ＰＮは化学反応（図１、赤色の長方形）に従って急速に生成され、続いて腐食性ＰＮを溶解させることができる。溶解速度は、塩化物イオンによって速めることができる。本発明者らは、細胞内酸性の細胞小器官（すなわち、エンドソーム及びリソソーム）が、プロトン源及び塩化物イオンを有するため、腐食性ＰＮの溶解が引き起こされて、ＤＮＡの白金化（platination）がもたらされると仮定した。しかしながら、Ｐｔを効率的に小さくする方法を発見することは依然として課題を有している。本発明者らは、低世代のアミンで終端されているデンドリマー（Ｇ２ＮＨ２）をケージとして使用して、特異的な幾何学的形状を有する（specifically geometric）アニオンを捕捉することによりケージ化されたＰＮ（ＣＰＮ、図１Ａ）を形成するシンプルな戦略を開発した。この腐食性（corrodibility）を前提として、ＣＰＮが、追加される開裂性のＰＥＧコロナ、及びｉＲＧＤ等の標的可能な（targetable）分子で改変されることによって、腫瘍を標的化するとともに、外側のＰＥＧコロナを取って抗癌化学療法剤にかかる腫瘍内活性化を作用させて悪性細胞に対して毒素を放出することができる（図１Ｂ）（Chien et al.、「腐食性を示して抗癌化学療法剤にかかる腫瘍内活性化を作用させる、ケージ化されたＰｔナノクラスタ（Caged Pt Nanoclusters Exhibiting Corrodibility to Exert Tumor-Inside Activation for Anticancer Chemotherapeutics）」、Advanced Materials, 2013, 25, 5067-5073）。
一態様において、本発明は、（ａ）デンドリマーと、（ｂ）酸化白金を含み、デンドリマーの内部に閉じ込められた白金ナノクラスタと、（ｃ）デンドリマーの表面を被覆するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とを含む二重ケージ化された白金ナノクラスタ複合体に関する。デンドリマーはアミン終端デンドリマーであってもよい。
別の態様において、本発明は、（ａ）アミン終端デンドリマーと、（ｂ）酸化白金を含むと共に０．２２ｎｍの標準偏差を伴う０．９３ｎｍの平均直径を有し、アミン終端デンドリマーの内部に閉じ込められた白金ナノクラスタとを含むケージ化された白金ナノクラスタ複合体に関する。
本発明の一実施形態において、酸化白金は、ＰｔＯ、ＰｔＯＨ、ＰｔＯ２、ＰｔｘＯｙ、及びそれらの任意の組合せ（式中、ｘ、ｙはそれぞれ０より大きい整数である）からなる群から選択される。上述の複合体は、デンドリマー凝集体を含むことなく、癌細胞に対する細胞毒性を示すものである。
本発明の別の実施態様では、ＰＥＧが、シッフ塩基を通じてアミン終端デンドリマーの第一級アミンと結合する。二重ケージ化された白金ナノクラスタ複合体の表面がｐＨ応答性結合、すなわちｐＨ感受性結合（二重結合等）を含む。ｐＨ応答性結合は酸性条件下で崩壊及び溶解を示し、これにより一重ケージ化された白金ナノクラスタ複合体（すなわち、表面がＰＥＧで被覆されていない、アミン終端デンドリマーでケージ化された白金ナノクラスタ複合体）がもたらされる。
本発明の別の実施形態では、二重ケージ化された白金ナノクラスタ複合体が、目の形の外観を示す。
本発明の別の実施形態では、二重ケージ化された白金ナノクラスタ複合体が、ｐＨ５．０未満の条件下でＰｔ２＋イオン、ＰｔＣｌ４ ２−イオン及び／又はＰｔＣｌ６ ２−イオンを放出させる特徴を示す。白金ナノクラスタは、ｐＨ５．０未満の条件下で溶解性を示す。
さらに、本発明の別の実施形態では、ナノクラスタが２ｎｍ未満の直径を有する。代替的に、ナノクラスタは、３ｎｍ未満の直径を有する球形状を有する。
さらに、本発明の別の実施形態では、デンドリマーがポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーである。上述の複合体は、デンドリマーの表面上に吸収される腫瘍浸透ペプチドを更に含んでいてもよい。ペプチドはｉＲＧＤ（ＣＲＧＤＫＧＰＤＣ；配列番号１）であってもよい。
さらに、本発明の別の実施形態では、デンドリマーが、世代−０（Ｇ−０）、世代−１（Ｇ−１）、世代−２（Ｇ−２）及び世代−３（Ｇ−３）デンドリマーからなる群から選択される。
さらに、本発明の別の実施形態では、上述の複合体が、ヘキサクロロ白金酸アニオン及び／又はテトラクロロ白金酸アニオンを含まない。
さらに、本発明の別の実施形態では、アミン終端デンドリマーの表面又は外側に白金ナノクラスタを含まない。
さらに、本発明の別の実施形態では、ケージ化された白金ナノクラスタ複合体が、
（ａ）アミン終端デンドリマーと、
（ｂ）酸化白金を含み、アミン終端デンドリマーの内部（内側）に閉じ込められる白金ナノクラスタと、
から本質的になるか又はそれらからなる。
別の態様において、本発明は、それを必要とする対象における腫瘍細胞の成長を抑制する医薬品の製造における、上述のケージ化された又は二重ケージ化された白金ナノクラスタ複合体の使用に関する。代替的に、本発明は、それを必要とする対象における腫瘍細胞の成長を抑制するのに使用される、上述のケージ化された又は二重ケージ化された白金ナノクラスタ複合体に関する。腫瘍細胞の成長を抑制するのに使用される場合、有効な量の上述の複合体を対象に投与する。腫瘍細胞は乳癌細胞であってもよく、又は対象は乳癌を患うものであってもよい。
さらに、別の態様において、本発明は、
（ａ）治療に有効な量の上述の複合体と、
（ｂ）医薬上許容される担体と、
を含む、医薬組成物に関する。
さらに、別の態様において、本発明は、上述のケージ化された白金ナノクラスタ複合体を合成する方法であって、
（ａ）八面体のヘキサクロロ白金酸アニオンを含む第１の溶液を、アミン終端デンドリマー又はヒドロキシル終端デンドリマーを含む第２の溶液と混和して、ＰｔＣｌ６ ２−アニオン／デンドリマー複合体を含む混合物を形成する工程と、
（ｂ）ＰｔＣｌ６ ２−アニオン／デンドリマー複合体を含む混合物を所定時間インキュベートする工程と、
（ｃ）ＰｔＣｌ６ ２−アニオン／デンドリマー複合体中のＰｔＣｌ６ ２−アニオンを還元して、デンドリマーでケージ化された白金ナノクラスタ複合体を含む混合物を形成する工程と、
（ｄ）デンドリマーでケージ化された白金ナノクラスタ複合体を含む混合物をフィルタに通過させて、デンドリマーでケージ化された白金ナノクラスタ複合体を含む濾液を取得する工程と、
（ｅ）濾液を凍結乾燥して、デンドリマーでケージ化された白金ナノクラスタ複合体を取得する工程と、
を含む、上述のケージ化された白金ナノクラスタ複合体を合成する方法に関する。
また、別の態様において、本発明は、二重ケージ化された白金ナノクラスタ複合体を合成する方法であって、
（ｉ）溶媒に、
（ａ）アミン終端デンドリマー又はヒドロキシル終端デンドリマーと、
（ｂ）アミン終端デンドリマー又はヒドロキシル終端デンドリマーの内部に閉じ込められた酸化白金を含む白金ナノクラスタと、
を含む上述のデンドリマーでケージ化された白金ナノクラスタ複合体を溶解して溶液を形成する工程と、
（ｉｉ）複合体がアミン終端デンドリマーを含む条件でＰＥＧアルデヒドを溶液中に添加する、又は、複合体がヒドロキシル終端デンドリマーを含む条件でＰＥＧ−ＮＨ２を溶液中に添加する工程と、
（ｉｉｉ）ＰＥＧアルデヒドを、アミン終端デンドリマーの第一級アミンと反応させる、又は、ＰＥＧ−ＮＨ２をヒドロキシル終端デンドリマーと反応させて、二重ケージ化された白金ナノクラスタ複合体を取得する工程と、
を含む、二重ケージ化された白金ナノクラスタ複合体を合成する方法に関する。
工程（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に挙げる混合物には、銀イオン、硝酸銀又はＮａＢＨ４が入っていない、すなわち、それらを含まない。
複合体を合成する上述の方法は、余分なＰｔＣｌ６ ２−を除去することによって、デンドリマーでケージ化された白金ナノクラスタ複合体を精製する工程を更に含み得る。
本発明の一実施形態において、還元工程はマイクロ波による照射によって実施される。
本発明の別の実施形態では、インキュベートする工程が室温で一晩行われる。
本発明の範囲を限定することを意図することなく、本発明の実施形態による例示的な計器、装置、方法及びそれらに関連する結果を以下に挙げる。ここで留意すべきは、読み手の便宜上、実施例中に表題又は副題を使用することがあるが、これは決して本発明の範囲を限定するものではないことである。さらには、幾つかの理論をここで提案及び開示するが、正しかろうと間違っていようと、作用の特有の理論又はスキームを何ら問わない発明に従って本発明を実行する限り、それらの理論によって本発明の範囲が限定されることは決してないものとする。
方法：
ＣＰＮの合成及び特性解析。Ｈ２ＰｔＣｌ６（Acros、２００μＬ、３０μｍｏｌ、１５０ｍＭ）及びＫ２ＰｔＣｌ４（UniRegion Bio-Tech、２００μＬ、３０μｍｏｌ、１５０ｍＭ）をそれぞれ、Ｇ２ＮＨ２又はＧ２ＯＨ又はＧ２ＣＯＯＨ（Aldrich、９４．７μＬ、５μｍｏｌ、２０ｗｔ％メタノール溶液）を含有する２０ｍＬの脱イオン水に添加した。マイクロ波によって照射（CEM、Ｄｉｓｃｏｖｅｒ ＬａｂＭａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ、３００Ｗ／１２０℃及び３０分間）する前に、Ｇ２ＮＨ２又はＧ２ＯＨ又はＧ２ＣＯＯＨと、Ｈ２ＰｔＣｌ６又はＫ２ＰｔＣｌ４との混合物を室温で一晩インキュベートした。還元後、０．２２μｍメンブレンフィルタ（Millipore、ＰＥＳ膜、白金ナノクラスタ用）に通して沈殿した大きい白金ナノ粒子を濾過した。溶液を凍結乾燥させた後、約１ｍＬの水に溶解させて、更に精製する必要がある。過剰なアニオン（ＰｔＣｌ６ ２−及びＰｔＣｌ４ ２−）を更に除去するために、アニオン交換クロマトグラフィ（Merck、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＴＭＡＥ Ｈｉｃａｐ）を使用し、精製されたＣＰＮとＰＮの凝集物（aggregations）が得られた。高分解能透過型電子顕微鏡（ＨＲＴＥＭ、ＪＥＯＬ−２０１０）を用いて、ＣＰＮとＰＮの集合体のサイズを特定した。
ＭＰＥＧ２０００に結合したベンズアルデヒドの合成。Ｐ−ホルミル安息香酸（TCI、１０当量、５ｍｍｏｌ、７５１ｍｇ）を、室温でジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解し、ＤＣＣ（Acros、Ｎ，Ｎ’−ジクロロヘキシルカルボジイミド、１０当量、５ｍｍｏｌ、１ｇ）、ＭＰＥＧ２０００（aldrich、０．５ｍｍｏｌ、１ｇ）及びＤＭＡＰ（Alfa、４−ジメチルアミノピリジン、２．５当量、１．２５ｍｍｏｌ、１５０ｍｇ）を順次添加した。反応混合物は室温で２４時間撹拌した。この塩を濾過により取り除き、濾液を濃縮し、イソプロパノール（２０ｍＬ）に溶解し、０℃で２時間冷却させた。得られる結晶を濾過によって回収し、酢酸エチルで洗浄した。粗生成物をテトラヒドロフランに溶解し、ジエチルエーテルに滴加した。沈殿をジエチルエーテルによって２回洗浄し、減圧下における蒸発によってＭＰＥＧ２０００−ベンズアルデヒドを白色粉末として回収した。ＭＰＥＧ２０００−ベンズアルデヒドの１Ｈ ＮＭＲ（Varian、４００ＭＨｚ）（ＣＤＣｌ３）：ｄ ３．６４（ＭＰＥＧ２０００のプロトン）、７．９６（ｄ，２Ｈ）、８．２２（ｄ，２Ｈ）、１０．１１（アルデヒド，ｓ，１Ｈ）。
ＤＣＰＮの合成。ＣＰＮ（５μｍｏｌ）がＤＭＳＯ（１５ｍＬ）に溶解され、そのＣＰＮを含む溶液にＭＰＥＧ２０００−ベンズアルデヒド（４０μｍｏｌ、８６ｍｇ、上述の工程によって調製）又はＭＰＥＧ２０００−ＮＨ２（４０μｍｏｌ、８６ｍｇ、市販）を添加して、Ｇ２ＮＨ２とＧ２ＯＨによってそれぞれ３７℃で４時間ケージ化される。ここで留意すべきは、Ｇ２ＯＨ及びＧ２ＣＯＯＨに由来するＣＰＮでは、ヒドロキシル／カルボキシレート終端基が、シッフ塩基を介するＭＰＥＧ２０００−ＮＨ２の反応にかかるアルデヒド終端基へと一部変換される可能性があることである。その後、ＤＭＳＯを除去し、溶離液としてメタノールを使用してＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ−１０カラムによって粗化合物を精製した。ＤＣＰＮは減圧下で蒸発させることで青色粉末として回収された。ＤＣＰＮの１Ｈ ＮＭＲ（Varian、４００ＭＨｚ）（ｄ−ＤＭＳＯ）：ｄ ３．５０及び３．６０（ＭＰＥＧ２０００のプロトン）、６．７６（ｄ，ｂｒ，２Ｈ）、７．２９（ｄ，ｂｒ，２Ｈ）、８．４７（イミン，ｓ，１Ｈ）。
標識用ｃｙ５．５を含むＤＣＰＮの合成。ＣＰＮ（５μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１５ｍＬ）に溶解し、ＤＭＳＯ（１０ｍｇ／ｍＬ、５μｍｏｌ、５６４μＬ）にストックされたＣｙ５．５−ＮＨＳ（GE healthcare）を添加した。反応混合物を３７℃で１６時間撹拌した後、ＭＰＥＧ２０００−ベンズアルデヒド（４０μｍｏｌ、８６ｍｇ）を添加して同じ条件下で溶液を更に４時間撹拌した。その後、ＤＭＳＯを除去して、溶離液としてメタノールを使用してＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ−１０カラムによって粗化合物を精製した。ＤＣＰＮは、減圧下で蒸発させることで青色粉末として回収された。標識用Ｃｙ５．５を含むＤＣＰＮの１Ｈ ＮＭＲ（Varian、４００ＭＨｚ）（ｄ−ＤＭＳＯ）：ｄ ３．３８及び３．４９（ＭＰＥＧ２０００のプロトン）、６．６６（ｄ，ｂｒ，２Ｈ）、７．２３（ｄ，ｂｒ，２Ｈ）、８．４９（イミン，ｓ，１Ｈ）。
細胞毒性。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１株（Bioresource Collection and Research Center（Taiwan））の細胞を、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気の下で、１０％ウシ胎児血清が添加されたＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。２４ウェル細胞培養プレートに１×１０５細胞／ウェルで播種し、３７℃で２４時間維持した。培養培地は、種々の処理剤（Ｇ２ＮＨ２単独、カルボプラチン、シスプラチン及びＣＰＮ）の培養培地中濃度が様々なものとなるように変えた（３つの複製試料）。試験は、培地を変えずに３日間実施した。上側を覆う（overlaying）細胞培養培地を取り除いた後、細胞を３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ、Sigma（MO, USA））で３７℃１時間インキュベートした。処理後、ＭＴＴからホルマザン生成物をＤＭＳＯに溶解し、標準的なＥＬＩＳＡリーダーを用いて５７０ｎｍで定量化した。較正のため、ブランク試験を２４ウェルプレートにおいて同じ条件下で実施した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏレベルにおける溶解を確認するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の細胞生存率研究は、ＣＰＮと、液胞型Ｈ＋−ＡＴＰアーゼの強力な阻害剤であるバフィロマイシンＡ１（ＢＡ）とで共に処理することによって実施した。２４ウェル細胞培養プレートに１×１０４細胞／ウェルで播種し、３７℃で２４時間維持した。ＢＡは、ミトコンドリアの機能を損なわせることによってＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞死を容易に引き起こすこともよく知られている。それ故、低濃度のＢＡ（≦０．２μＭ）を、エンドソーム／リソソームのｐＨを徐々に変えるとともに、処理時間を６時間に短くすることで対応した。細胞を、３７℃において６時間０．１μＭ又は０．２μＭのＢＡ及びＣＰＮ（４５μｇ／ｍＬ）でインキュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。ＷＳＴ１試薬を各ウェル（２５μＬ／ウェル）に添加し、混合物を測定前に２時間反応させた。
細胞アポトーシスアッセイ。アポトーシスキット（INVITROGEN（商標））を使用して、アポトーシスを起こす細胞の数を評価した。蛍光顕微鏡検査のために、細胞を３５ｍｍのμ−Ｄｉｓｈ（ibidi）内においてＳＰＮＰを含有する培地で種々の時間培養し、アポトーシス細胞をアネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）キットを用いて製造業者の取扱説明書に従って蛍光色素で染色した。染色した細胞は共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０ｉ）により観察した。
細胞取込み経路の分析。ＭＤＡ−Ｂ−２３１細胞が６ウェル細胞培養プレートに１×１０５細胞／ウェルで入れられ、３７℃で２４時間培養した。培地をエンドサイトーシス特異的阻害剤（クロルプロマジン１０μｇ／ｍＬ又はアミロライド１ｍＭ又はナイスタチン２５μｇ／ｍＬ）を含有する培地と交換し、１５分間プレインキュベートした。培地をその後除去し、ＣＰＮと阻害剤とを含有する培地を添加した。対照群にはＣＰＮのみ与えた。２時間後に培地を除去し、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄した。トリプシン処理後、細胞を採取し、氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、遠心分離（２０００ｇ、４℃、５分）にかけ、分析まで−２０℃で保存した。細胞の白金含有量を求めるために、細胞ペレットをＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液（１％ｗ／ｗ）中にホモジナイズさせ、希釈して、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）による白金分析にかけた。３つの実験の平均を結果として算出した。
ＴＵＮＥＬアッセイ。末端デオキシヌクレオチド転移酵素を媒介するｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイを使用して、アポトーシス細胞死のｉｎ ｓｉｔｕ検出を行った。腫瘍組織の凍結切片（４μｍ厚）は室温まで温めた。スライドをＰＢＳで３回洗浄して、ＯＣＴ（凍結組織用腫瘍包埋培地（tumor’s embedded medium for frozen tissues）の１つ）を除去した。標識手順は、このキットの標準的なプロトコルに従って行った。これらのスライドを３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、Thermo、Ｓ２１０２４−２）で染色した後、ヘマトキシリンで対比染色し、光学顕微鏡でモニタリングする前にカバーガラスに載せた。
免疫組織化学。腫瘍組織の凍結切片（４μｍ厚）を室温まで温め、ＰＢＳで３回洗浄し（５分／１回）、新たにＰＢＳで調製した４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定した。固定切片を抗マウス活性カスパーゼ−３ポリクローナルウサギ抗体（Abcam inc.、ａｂ２３０２、ＰＢＳの１０％ＢＳＡ中５μｇ／ｍＬ、５０μＬ／サンプル）に４℃で一晩浸し、続いて、ＰＢＳで洗浄し（３回、１５分／１回）、ペルオキシダーゼ結合抗ウサギポリクローナルヤギ抗体（Abcam inc.、ａｂ６７２１−２００、ＰＢＳ中１：５００（ｖ／ｖ）、１００μＬ／サンプル）で室温において２時間インキュベートした。これらのスライドを初めにＤＡＢで染色し、引き続きヘマトキシリンで対比染色し、光学顕微鏡でモニタリングする前にカバーガラスに載せた。
動物モデル及び腫瘍抑制。７週齢の雌のＢａｌｂ／ｃヌードマウス（１６ｇ〜２０ｇ）を、水及び食料に自由にアクセスできる状態で、２４±２℃及び５０±１０％相対湿度において１２時間の明／１２時間の暗周期で保持した。それらに２×１０６細胞／マウスを皮下注射し、胸部腫瘍モデルを作成した。腫瘍は、各腫瘍の最長直径（ａ）及び最短直径（ｂ）をデジタルノギスで測定し、腫瘍体積（Ｖ）は式Ｖ＝０．５ａ×ｂ２によって算出した。腫瘍サイズがおよそ６０ｍｍ３及び１５０ｍｍ３に達したら、ＣＰＮ及びＤＣＰＮをそれぞれＩＴ注射及びＩＶ注射によってマウスに投与した。腫瘍抑制における比較効力の調査を実施した。マウスは、１週間に１度で計３週間、ＩＴ注射によりＣＰＮで処理された。同様に、ＤＣＰＮをＩＶで４週間に１度投与した。注入量は５μＬ／ｇ体重とし、腫瘍サイズは２日〜３日毎に算出した。マウスを屠殺した後、腫瘍及び血液を回収し、ＥＤＴＡガラス管に入れた。
結果
本発明者らは、低世代のアミン終端デンドリマー（Ｇ２ＮＨ２）をケージとして使用し、特異的な幾何学的形状を有するアニオンを捕捉することにより、ケージ化されたＰＮ（ＣＰＮ、図１Ａ、経路ｉｉ）を形成した。ＣＰＮは、追加される開裂性のＰＥＧコロナ及びｉＲＧＤ（ＣＲＧＤＫＧＰＤＣ；配列番号１）等の標的可能な分子で更に改変されることで、腫瘍を標的化するとともに、外側のＰＥＧコロナを取って抗癌化学療法剤にかかる腫瘍内活性化を作用させて悪性細胞に対して毒素を放出することができた（図１Ｂ）。
バイオセーフティに関する懸念が少ないＧ２ＮＨ２をケージとして選び、原子レベルのＰＮサイズを閉じ込めるとともに、エンドソームの取込みをもたらした。しかしながら、星形構造及び周囲アミン基を有するＧ２ＮＨ２は、小さいナノクラスタよりも大きいナノ粒子を形成することを好み、かつ周囲アミンと金属アニオンとの配位相互作用を通じてデンドリマーの凝集をもたらすことから、ケージとしての課題を有する。これらの制限を克服するために、異なる幾何学的形状である四角形平面（ＰｔＣｌ４ ２−）及び八面体（ＰｔＣｌ６ ２−）を有する２つのアニオンを使用することによって、それぞれＧ２ＮＨ２の外部及び内部と自発的に結びつけることができた。ＰｔＣｌ４ ２−は、Ｇ２ＮＨ２の周囲アミンによる置換反応を容易に受けることができる。このＰｔＣｌ４ ２−の求核性置換は、Ｇ２ＮＨ２との架橋をもたらし、したがって、アニオンがＧ２ＮＨ２の空隙に入ることを阻止することができる（図１Ａ，経路ｉ）。還元後、周囲Ｐｔイオンは、好金属性の誘引を通じてデンドリマーの外部にＰＮを形成する傾向にある。対照的に、立体障害を伴う八面体のアニオン（ＰｔＣｌ６ ２−）は、周囲アミンと結合する置換反応を徐々に受けることによって、第三級アミンとＰｔＣｌ６ ２−との静電相互作用を通じてＧ２ＮＨ２の内部捕捉、及びその後のＰＮの形成を促すことができる（図１Ａ、経路ｉｉ）。
ラマン分光法を使用して、置換反応が引き起こされた複合体を検証した。図２Ａ及び図２Ｂに示されるように、ＰｔＣｌ４ ２−／Ｇ２ＮＨ２複合体による２５０ｃｍ−１に現れる顕著なバンドが、Ｎ−Ｐｔ−Ｎ曲げ振動（bending vibration）に対応づけられることから、ＰｔＣｌ４ ２−の配位子は置換活性を有し、Ｇ２ＮＨ２の周囲アミンの置換を可能とする。対照的に、ＰｔＣｌ６ ２−／Ｇ２ＮＨ２複合体では２５０ｃｍ−１に注目すべきピークが観察されなかったので、ＰｔＣｌ６ ２−の立体効果がＧ２ＮＨ２による配位子の置換を妨害することが示唆された。加えて、ＴＥＭ測定結果から、２つの複合体（すなわち、ＰｔＣｌ４ ２−／Ｇ２ＮＨ２及びＰｔＣｌ６ ２−／Ｇ２ＮＨ２）における配位の違いを確認する直接的証拠が示される。明らかに、平面四角形のアニオン（ＰｔＣｌ４ ２−）が、Ｇ２ＮＨ２の架橋を誘導して、還元前に様々な直径を有するデンドリマー凝集物（aggregation）を形成することが明確に見て取れる（図２Ｃ）。ＰｔＣｌ４ ２−／Ｇ２ＮＨ２複合体をマイクロ波によって還元すると、ＰＮがデンドリマー凝集物の周囲の傍らに生成及び構築されることが見出された（図２Ｅ、白色の四角形及び矢印）。対照的に、ＴＥＭ画像における小さなナノ粒子（およそ５ｎｍ）（図２Ｄ）がＰｔＣｌ６ ２−／Ｇ２ＮＨ２複合体内に観察された。このスケールがＧ２ＮＨ２単独よりも幾らか大きいことから、アニオンの反発力によってＧ２ＮＨ２の空隙の膨張がもたらされることが示される。驚くべきことに、本発明者らは、ＰｔＣｌ６ ２−／Ｇ２ＮＨ２複合体が還元している間に、ＴＥＭ画像に幾つかの目のようなナノクラスタを見出した（図２Ｆ）。言うまでもなく、ＰＮは、Ｇ２ＮＨ２内にケージ化されて、約４ｎｍの直径を有する目のような構造体を形成している。加えて、内部ナノクラスタは、直径０．９３±０．２２ｎｍであると概算された。結果として、本発明者らは、図１Ａ（経路ｉｉ）で予想したように、ＰＮが、Ｇ２ＮＨ２内にケージ化されたと結論づけた。ＣＰＮは、アニオン交換クロマトグラフィを用いて過剰なアニオンを除去した後、エネルギー分散型Ｘ線分光法（ＥＤＳ）によって測定した。図５は、Ｐｔ元素による特徴的なピークを示すものであり、これによってＰＮの存在が再確認された。
それらの水への溶解度を調べた。デンドリマー凝集物の周りのＰＮ集合体は、ＣＰＮと比較して低い水溶性を示した（図７Ａ）。察するに、ＰＮを構築させることによって周囲アミンがブロックされて溶解度が減少したためである。図７Ｂは、ＣＰＮがＰＮ集合体よりも癌細胞に対してより高い毒性を有したことを示しており、ＣＰＮが癌細胞の細胞内取込みを最大とする優れた溶解度を有するという事実と相関関係にあると考えられる。２４時間後にＣＰＮで処理した細胞は、ＰＮ集合体で処理した細胞よりも高いＰｔ蓄積を有する（図７Ｃ）。
ヒト乳癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１を使用して、ＣＰＮが癌細胞をなぜ死滅させることができたのかを調査した。ＣＰＮのＩＣ５０値は約３７μｇ／ｍＬであり、これは、シスプラチンのもの（７μｇ／ｍＬ）よりも大きく、カルボプラチンのもの（３５μｇ／ｍＬ）よりも幾らか大きかった（図３Ａ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＣＰＮ及びシスプラチンでそれぞれ処理した後、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（アポトーシスに関する緑の色素）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ、ネクローシスに関する赤の色素）で二重染色し、時間依存性のアポトーシス及びネクローシスを観察した（図３Ｂ）。未処理の対照において顕著な蛍光（左上のパネル）は観察されなかった。処理の初期にはアネキシンＶ−ＦＩＴＣによる緑の蛍光（右上のパネル）がわずかに観察され、これによって、ＣＰＮによる処理後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるアポトーシスの誘導が示される。陽性ＰＩ染色（下のパネル）は、長時間のインキュベーション時間後に観察されたものであり、これによって死細胞の増大が示される。図８は、シスプラチンにより誘導される細胞死による同様の結果を示している。ＣＰＮにより誘導される細胞死の表現型は、シスプラチンにより処理された細胞のものと類似していることが示され、このメカニズムはＤＮＡ切断であると知られるものである。
図９は、ＣＰＮ及びシスプラチンによる顕著なＲＯＳの増大又は減少を示しており、これによって、ＲＯＳ生成が細胞死に関与しないことが示される。次に、ＣＰＮがバルクＰｔのように不活性であれば、毒性イオンを溶解させることはできない。それ故、本発明者らは、およそ１ｎｍのサイズを有するＣＰＮを酸化させることで、腐食性ＰＮを形成して更には溶解すると推測した。この可能性を確認するために、本発明者らは、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）によって表面酸化度を調べた。図４Ａは、ＣＰＮによる７３．４ｅＶで現れるＰｔ（４ｆ７／２）の主ピークを示すものであり、これはＰｔナノ粒子のもの（＞１ｎｍ、およそ７１．２ｅＶ）よりも大きい。比較的大きい結合エネルギー（すなわち、７３．４ｅＶ）がＰｔ酸化物により示唆されており、おそらくＰＮがＰｔＯを形成すると考えられる。また、ＸＰＳを使用して、Ｏ（１ｓ）スペクトルを調べ、ＣＰＮの酸素量を概算した。５３１．８ｅＶに現れるＯ（１ｓ）ピークの結合エネルギーは、ＣＰＮがデンドリマー内にケージ化されてＯ（１ｓ）の結合エネルギーが変わっているため、先の研究による値を参照することができない。しかしながら、Ｇ２ＮＨ２単独のものと比較して、ＣＰＮのＯ（１ｓ）ピークの顕著な増大が見られ（図４Ｂ）、これによって、ＣＰＮが酸化されたことが示されている。この酸化状態であれば、本発明者らのＣＰＮが酸性の細胞小器官内へと細胞内移行する際に、低ｐＨ及び塩化物イオンによってＣＰＮの溶解が促進され得る。
本発明者らは、インキュベーション温度を調節することによって、また様々な特異的阻害剤を用いてＣＰＮの内部移行経路について検討した。初めに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、対照として３７℃においてＣＰＮで処理し（図４Ｃ、柱１）、次に、処理温度を４℃にそれぞれ事後冷却及び事前冷却すると、ＣＰＮの取込みを約５０％（柱２）及び約１０％（柱３）まで劇的に低減させることができるため、エンドソーム経路等のエネルギー依存性経路が影響を受けたことが示される。最後に、細胞をエンドサイトーシスの様々な阻害剤とともにインキュベートした。クラスリン依存性エンドサイトーシスに関する阻害剤であるクロルプロマジン（柱４）は単独で、アミロライド（柱５）及びナイスタチン（柱６）等の他の阻害剤と比較して、細胞内におけるＣＰＮ蓄積を著しく抑制し得る。本発明者らは、クラスリン依存性エンドサイトーシスを通じてＣＰＮを細胞内に取り込むことができ、これはＰＡＭＡＭデンドリマー単独の内部移行経路と一致するものであると結論づけた。本発明者らはまた、ＣＰＮの細胞内分布がリソソームトラッカーと共局在化し得ることを見出した（図４Ｄ）。これは、ＣＰＮが、溶解を可能とするように、これらの酸性エンドソーム／リソソームに入り得ることを示している。Ｐｔイオンの量を求めるために、陽性対照として、ＣＰＮを王水（３：１ ＨＣｌ：ＨＮＯ３）に完全に溶解させた（図４Ｅ、柱１）。ＣＰＮはまた、水（柱２）、約ｐＨ５の酸性溶液（柱３）、及び８０ｍＭのＮａＣｌを含有する約ｐＨ５の酸性溶液（柱４）で処理された。Ｐｔイオンの量は、８０ｍＭのＮａＣｌを含有する約ｐＨ５の酸性溶液で著しく上がることが見出されるため、ＣＰＮがｐＨ感受性の溶解をもたらすことが示された。ｉｎ ｖｉｔｒｏレベルの溶解を確認するために、ＭＡＤ−ＭＢ−２３１細胞を０．１μＭ又は０．２μＭのバフィロマイシンＡ１（ＢＡ、液胞型Ｈ＋−ＡＴＰアーゼの強力な阻害剤）とＣＰＮとで共に処理した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のエンドソーム／リソソームｐＨは、ＢＡ処理後にわずかに増大することがあり、これはＢＡの存在下におけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の低耐性に起因するものである（図１０Ａに示される安全な推定投与量）。図１０Ｂは、ＣＰＮにより誘導される細胞死が短時間のうちに著しく逆転し得ることを示している。これは、エンドソーム／リソソームの酸性化の低下によって、Ｐｔの放出が損なわれることを示している。指摘しておくと（Taking the indication）、ＣＰＮは生物学的環境により早期相互作用を防止して、全身毒性を最小限に抑えることができる。
マウスにおける、皮下乳癌異種移植を用いたＣＰＮの治効を、腫瘍内（ＩＴ）注射によって評価した。ＣＰＮ及びシスプラチン等の様々な薬物の最大耐用量（ＭＴＤ）は、表１に記載した。ＩＴ注射後、ＣＰＮ及びシスプラチンは、２つの対照群（ＰＢＳ及びＧ２ＮＨ２）と比較して、腫瘍抑制において特に有効であることが見出された（図５Ａ及び図５Ｂ）。加えて、切断されたＤＮＡ鎖はＴＵＮＥＬアッセイによって検出することができ（図５Ｃ）、褐色の核（ＴＵＮＥＬ陽性染色）が、対照群の青色の核（ＴＵＮＥＬ陰性細胞）と比較して、ＣＰＮ及びシスプラチンの４８時間の処理後に観察されている。本発明者らはまた、免疫組織化学的分析を使用して活性カスパーゼ−３を検出することで、ＣＰＮが死滅させる癌細胞及びシスプラチンが死滅させる癌細胞が、実際にアポトーシスを引き起こし得ることを更に確認した（図１１）。それ故、ＣＰＮで処理した細胞のプログラム死経路は、シスプラチンで処理した細胞のものと同様であると考えられる。本発明者らは、ＣＰＮを血管に注射して、抗癌化学療法剤にかかる腫瘍内活性化を作用させることができるかを検証した。それ故、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後のタンパク質の接着を防止するために、ＣＰＮを開裂性のＰＥＧ層にて追加で被覆することで二重ケージ化されたＰＮ（ＤＣＰＮ）が形成された。ＤＣＰＮの特徴を図１２に示し、ＰＥＧコロナが、腫瘍模倣ｐＨ（ｐＨ６．８）でＤＣＰＮから開裂することを証明した。標的化機能を有するＤＣＰＮを提供するために、乳癌の皮下異種移植ヌードマウスに、ＩＶ投与によってｉＲＧＤ腫瘍浸透ペプチドをＤＣＰＮと共に投与した。各マウスの腫瘍サイズは、ＤＣＰＮ送達を容易にするように約１５０ｍｍ３に成長したものとした。加えて、ＤＣＰＮ及び対照群のうちの１つ（ＰＥＧコロナで被覆されるＧ２ＮＨ２）を、ＮＩＲ色素であるｃｙ５．５と事前に結合させて、投与後のリアルタイム追跡を行った。比較のために、ＰＢＳ、Ｇ２ＮＨ２、ＤＣＰＮ及びシスプラチンを含む全ての群にも、ｉＲＧＤと共に４週間静脈内に注射した。図５Ｄは、処理後の腫瘍内における顕著なｃｙ５．５シグナルを示しており、これによりＤＣＰＮの腫瘍標的化が示される。腫瘍内のシグナルは、注射後４時間及び１日でプラトーに達し、ＣＰＮのペグ化によって血液循環を長くして、腫瘍への取込みを増大させ得ることが明らかとなった。肝臓及び脾臓におけるｃｙ５．５シグナルは、肺及び心臓におけるものと比較してかなり弱いため、肝臓においてもＰＥＧ被膜（mantle）がＤＣＰＮ蓄積を減少させ得ることが示される。より低世代のデンドリマー（ＧｎＮＨ２、ｎ＜５）の方が尿排泄によって容易に排除され得ることがよく知られている。ここで、腫瘍及び他の器官におけるシグナルは、１４日目に徐々に減少した後、腎臓に集中し得る。３１日目に、腎臓におけるシグナルが劇的に減少し得るため、ＤＣＰＮが排泄され得ることが示される。図１３は、様々な器官（脳、心臓、肺、肝臓、脾臓及び腎臓）における残留Ｐｔが１５％未満（表２）となったことを示しており、これによりＤＣＰＮの排泄が示される。中７日置いて／１週間における（at 7-day intervals/week）ＩＶ注射による全材料の投与量が同じであれば（１６．６μｍｏｌ／ｋｇ）、図５Ｅは、ＤＣＰＮ及びシスプラチンが実際に２つの対照群（ＰＢＳ及びＧ２ＮＨ２）の腫瘍と比較して腫瘍を小さくし得ることを示している。開裂性のＰＥＧコロナで被覆されるＧ２ＮＨ２単独でも、重大な腫瘍標的化を示した（図１４）。ＤＣＰＮを投与したマウスの場合とは異なり、ＰＮの非存在下では腫瘍の成長を抑制することはできない。さらには、本発明者らは、ＤＣＰＮを与えたマウスにおける悪影響をチェックし、シスプラチンを与えたものと比較して、重大な体重損失がなく（図５Ｆ）、摂餌量の減少もない（図１５）ことを見出した。対照、シスプラチン、Ｇ２ＮＨ２及びＤＣＰＮの群を含む４つの群による一連の組織切片を、エンドポイントにおけるヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色によって組織学的に検査し、独立した病理学者によってスライドを評価した（図１６）。ＤＣＰＮは、処理後に腫瘍細胞のネクローシスももたらすことができ、これはシスプラチンの効果と同様のものであった。表１及び表２はそれぞれ、ｉｎ ｖｉｖｏ実験に使用されるＰｔナノクラスタの投与量、及びＤＣＰＮの遊離型Ｐｔの推定される排泄を示している。
要約すると、本明細書中には、特別に設計されたＰＮ（すなわちＣＰＮ）が開示されており、これは、全身毒性を最小限に抑える抗癌化学療法剤にかかる腫瘍内活性化を有するものである。Ｐｔのサイズを原子レベルに留めることによって（直径０．９３±０．２２ｎｍ）、プロドラッグとしてのナノメディシン用途のための魅力ある特性が備えられ得る。特に、ＰＮは容易に酸化されて、その固有の化学不活性を低下させると共に、エンドソーム及びリソソーム等の弱酸性の細胞小器官における更なる溶解にむけた表面腐食性を得ることにより、ＤＮＡ白金化のための毒性Ｐｔイオンを放出することができる。このアプローチの重要な点は、ＰＮのサイズを制御することにあるため、特異的な幾何学的形状を有するアニオンをＧ２ＮＨ２内部にケージ化させることに基づく新規な合成戦略を開発した。腫瘍内活性化を作用させる上でのＣＰＮの実現可能性は、ｐＨによって開裂性のＰＥＧコロナを事後改変させるとともに腫瘍ホーミングペプチドを混合することにより腫瘍の成長における顕著な抑制がもたらされたことで、ｉｎ ｖｉｖｏで確認された。

Claims (20)

  1. （ａ）デンドリマーと、
    （ｂ）酸化白金を含み、前記デンドリマーの内部に閉じ込められる白金ナノクラスタと、
    （ｃ）前記デンドリマーの表面を被覆するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と、
    を含む二重ケージ化された白金ナノクラスタ複合体。
  2. 前記酸化白金が、ＰｔＯ、ＰｔＯＨ、ＰｔＯ２、ＰｔｘＯｙ、及びそれらの任意の組合せ（式中、ｘ、ｙはそれぞれ０より大きい整数である）からなる群から選択される請求項１に記載の複合体。
  3. 前記デンドリマーがアミン終端デンドリマーである請求項１に記載の複合体。
  4. 前記ＰＥＧがシッフ塩基を通じて前記アミン終端デンドリマーの第一級アミンと結合する、請求項３に記載の複合体。
  5. 表面にｐＨ応答性結合を含む請求項１に記載の複合体。
  6. 前記デンドリマーの表面上に吸収される腫瘍浸透ペプチドを更に含む請求項１に記載の複合体。
  7. ｐＨ５．０未満の条件下で、Ｐｔ２＋イオン、ＰｔＣｌ４ ２−イオン及び／又はＰｔＣｌ６ ２−イオンを放出する請求項１に記載の複合体。
  8. 前記白金ナノクラスタが、ｐＨ５．０未満の条件下で溶解性を示す請求項３に記載の複合体。
  9. 前記ナノクラスタが１．３ｎｍ未満の平均サイズを有する請求項１に記載の複合体。
  10. 前記デンドリマーが、世代−０（Ｇ−０）、世代−１（Ｇ−１）、世代−２（Ｇ−２）及び世代−３（Ｇ−３）デンドリマーからなる群から選択される請求項１に記載の複合体。
  11. 腫瘍細胞の成長を抑制する医薬品の製造における、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二重ケージ化された白金ナノクラスタ複合体の使用。
  12. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二重ケージ化された白金ナノクラスタ複合体を合成する方法であって、
    （ａ）八面体のヘキサクロロ白金酸アニオンを含む第１の溶液を、アミン終端デンドリマー又はヒドロキシル終端デンドリマーを含む第２の溶液と混和して、ＰｔＣｌ６ ２−アニオン／デンドリマー複合体を含む混合物を形成し、
    （ｂ）前記ＰｔＣｌ６ ２−アニオン／デンドリマー複合体を含む前記混合物を所定時間インキュベートし、
    （ｃ）前記ＰｔＣｌ６ ２−アニオン／デンドリマー複合体中のＰｔＣｌ６ ２−アニオンを還元して、デンドリマーでケージ化された白金ナノクラスタ複合体を含む混合物を形成し、
    （ｄ）前記デンドリマーでケージ化された白金ナノクラスタ複合体を含む前記混合物をフィルタに通過させて、前記デンドリマーでケージ化された白金ナノクラスタ複合体を含む濾液を取得し、
    （ｅ）前記濾液を凍結乾燥して前記デンドリマーでケージ化された白金ナノクラスタ複合体を取得し、
    （ｆ）前記デンドリマーでケージ化された白金ナノクラスタ複合体を溶媒に溶解して溶液を形成し、
    （ｇ）前記デンドリマーがアミン終端された条件でＰＥＧアルデヒドを前記溶液中に添加、又は、前記デンドリマーがヒドロキシル終端された条件でＰＥＧ−ＮＨ２を前記溶液中に添加し、
    （ｈ）前記ＰＥＧアルデヒドを前記アミン終端デンドリマーの第一級アミンと反応させる、又は、前記ＰＥＧ−ＮＨ２を前記ヒドロキシル終端デンドリマーと反応させて、二重ケージ化された白金ナノクラスタ複合体を取得する、二重ケージ化された白金ナノクラスタ複合体を合成する方法。
  13. （ａ）アミン終端デンドリマーと、
    （ｂ）酸化白金を含むと共に０．２２ｎｍの標準偏差を伴う０．９３ｎｍの平均直径を有し、前記アミン終端デンドリマーの内部に閉じ込められる白金ナノクラスタと、
    を含むケージ化された白金ナノクラスタ複合体。
  14. 請求項１３に記載の複合体を合成する方法であって、
    （ａ）八面体のヘキサクロロ白金酸アニオンを含む第１の溶液を、アミン終端デンドリマーを含む第２の溶液と混和して、ＰｔＣｌ６ ２−アニオン／デンドリマー複合体を含む混合物を形成し、
    （ｂ）前記ＰｔＣｌ６ ２−アニオン／デンドリマー複合体を含む前記混合物を所定時間インキュベートし、
    （ｃ）前記ＰｔＣｌ６ ２−アニオン／デンドリマー複合体中のＰｔＣｌ６ ２−アニオンを還元して、デンドリマーでケージ化された白金ナノクラスタ複合体を含む混合物を形成し、
    （ｄ）前記デンドリマーでケージ化された白金ナノクラスタ複合体を含む前記混合物をフィルタに通過させて、前記デンドリマーでケージ化された白金ナノクラスタ複合体を含む濾液を取得し、
    （ｅ）前記濾液を凍結乾燥して、前記デンドリマーでケージ化された白金ナノクラスタ複合体を取得する、複合体を合成する方法。
  15. 前記還元する工程は、マイクロ波を照射して行う請求項１２又は１４に記載の方法。
  16. 前記インキュベートする工程は、室温で一晩行う請求項１２又は１４に記載の方法。
  17. 工程（ｅ）は、余分なＰｔＣｌ６ ２−を除去することによって、前記デンドリマーでケージ化された白金ナノクラスタ複合体を精製することを更に含む請求項１２又は１４に記載の方法。
  18. 前記デンドリマーは、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーである請求項１〜１０及び１３のいずれか一項に記載の複合体。
  19. ヘキサクロロ白金酸アニオン及び／又はテトラクロロ白金酸アニオンを含まない請求項１〜１０及び１３のいずれか一項に記載の複合体。
  20. 癌細胞に対する細胞毒性を示す請求項１〜１０及び１３のいずれか一項に記載の複合体。
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