JP6684875B2 - 分光分析装置 - Google Patents

Description

本発明は、入力光に含まれる波長成分のうちの任意の波長成分を出力光として抽出することのできる分光分析装置に関する。

近時、体性幹細胞や胚性幹細胞（ＥＳ細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ））、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ））を用いた再生医療技術及び創薬の研究開発が勃興している。この種の研究開発においては、必要となる目的細胞や組織を効率よく量産できることが極めて重要となる。

患者の傷ついた組織や臓器を補う再生医療の目的で用いる細胞集合体に不良のまたは不要な細胞が混交していると、本来の効用を発揮できないおそれがあるだけでなく、腫瘍化その他の患者の健康に悪影響を及ぼすことにもなりかねない。しかしながら、不要細胞が混入している培養容器を丸ごと廃棄することは、目的細胞または組織の収率（歩留まり）の低下につながり、再生医療のコストを高騰させる。目的細胞または組織の収率を改善するには、培養容器内に存在する不要細胞を死滅させて除去し、残りの細胞を無駄にせず利用することが望ましい。

そこで、集光性に優れたレーザ光により、増殖した細胞中の不要細胞のみを選択的に死滅させることが行われるようになった（下記特許文献１を参照）。

細胞培養容器内に存在する生細胞の集合体のうちのどの細胞が目的細胞であり、どの細胞が不要細胞であるかを分別するために、従来は顕微鏡を使用して観察、また画像を撮影して解析を行っていた。だが、個々の細胞の素性を確実にかつ速やかに判定することは容易ではない。

細胞の素性を判別する手法として、スーパーコンティニューム（ｓｕｐｅｒｃｏｎｔｉｎｕｕｍ）光を用いたコヒーレントアンチストークスラマン散乱（ｃｏｈｅｒｅｎｔ ａｎｔｉ−Ｓｔｏｋｅｓ Ｒａｍａｎ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）を利用し、遺伝子発現により合成されたタンパク質の種類等を知得することが有力視されている。ＳＣ光は、高強度かつ広帯域のいわば「白色」のレーザ光である。このＳＣ光をストークス光としてポンプ光に重畳して対象の細胞に照射し、得られるＣＡＲＳ光を回折格子分光器により分光してそのスペクトルを分析することにより、細胞内の分子種や分子構造を同定できるのみならず、細胞の生命活性をも選択的にモニタできることが明らかとなってきている（下記非特許文献１を参照）。

ＣＡＲＳ光の分光分析を実行する場合、回折格子分光器から出力される回折光をＣＣＤやＣＭＯＳ等のイメージセンサに入力する。イメージセンサ上の受光素子であるフォトダイオードの位置がＣＡＲＳ光に含まれるスペクトルの波長に対応し、そのフォトダイオードが受光した光の強度が当該波長成分の強さということになる。

このような回折格子分光器を使用する方法では、１μｍ幅程度の狭小なスポット範囲を調査することはできても、二次元的に拡張した平面領域を一度に観察することはできない。平面領域のイメージングを行うためには、光軸に対して相対的に試料を移動させながら、多数回の分光分析を反復して実行しなければならない。従って、例えば細胞培養ディッシュ内で増殖させた細胞集合体の全体像を獲得するまでに長い時間を要することとなり、実用面で難がある。

特許第６０９０８９１号公報

加納 英明、"スーパーコンティニューム光を用いたコヒーレントラマン分光"、［ｏｎｌｉｎｅ］、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＳＣＩＥＮＣＥ（分子科学会学会誌）、［平成３０年９月１日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：http://j-molsci.jp/article/2007#1/A0005.pdf＞

本発明は、回折格子分光器を使用せず、任意の波長成分を含む出力光を得ることができ、しかもその波長成分を速やかに変化させることができる分光分析装置を提供しようとするものである。

本発明では、試料に臨み、当該試料に光を照射した結果二次元的に拡張した平面領域で生ずる応答光を入射させる対物レンズと、前記対物レンズを通過した応答光を入射させこれをｐ偏光成分とｓ偏光成分とに分離する第一の偏光ビームスプリッタと、入射する光のうちの一部の波長成分のみを透過させるものであり、前記第一の偏光ビームスプリッタから出射した一方の光を入射させるとともに、その光の光軸に対して交わる角度を操作可能な第一の多層膜フィルタと、入射する光のうちの一部の波長成分のみを透過させるものであり、前記第二の偏光ビームスプリッタから出射した他方の光を入射させるとともに、その光の光軸に対して交わる角度を操作可能な第二の多層膜フィルタと、前記第一の多層膜フィルタを透過した光及び前記第二の多層膜フィルタを透過した光をそれぞれ入射させて両者を重畳した出力光を得る第二の偏光ビームスプリッタと、前記第二の偏光ビームスプリッタから出射した出力光を入射させる結像レンズと、前記結像レンズを通過した出力光を受光することにより前記平面領域の画像を一度に獲得するイメージセンサとを具備する分光分析装置を構成した。

前記第二の多層膜フィルタとして、前記第一の多層膜フィルタと同等の特性を有するフィルタを用いる場合、前記第二の多層膜フィルタの姿勢及び当該第二の多層膜フィルタの回転軸の向きを、同フィルタを通過する光の光軸回りに、前記第一の多層膜フィルタの姿勢及び当該第一の多層膜フィルタに対して９０°変位させる。

前記対物レンズから前記イメージセンサまでの間に回折格子分光器が存在しなくとも、各多層膜フィルタを透過した波長成分を含む出力光による平面領域の画像を一時に獲得することができる。

前記応答光は、例えば、光を照射した対象の試料から発生するラマン散乱光である。特に、前記応答光は、ポンプ光及びストークス光であるスーパーコンティニューム光を対象の試料に照射した結果発生する、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光であることがある。

対象の試料が生細胞その他の生体試料であるとき、前記第一の多層膜フィルタ及び前記第二の多層膜フィルタはそれぞれ、例えば入射する光の入射角が４５°またはその近傍の角度のときに近赤外光を透過させるように設計したものとする。

本発明によれば、回折格子分光器を使用せず、任意の波長成分を含む出力光を得られ、しかもその波長成分を速やかに変化させることのできる分光分析装置を実現することが可能である。

本発明の一実施形態の分光分析装置の構成を示す図。 同実施形態の分光分析装置における多層膜フィルタの入射光の入射角と透過光の波長との関係を例示する図。

本発明の一実施形態を、図面を参照して説明する。図１に、本実施形態の分光装置の構成を示している。本分光装置は、光１０１を照射した試料０から発せられる応答光１０２に含まれる波長スペクトルの分光分析を行うためのものである。

応答光１０２は、試料０に光１０１を照射した結果試料０から放たれるラマン散乱光である。特に、本実施形態では、ＣＡＲＳを利用して生体試料０の調査、判別を行うことを趣旨としている。故に、試料０に照射する光１０１はポンプ光にストークス光を重畳したものであり、応答光１０２はＣＡＲＳ光である。

ポンプ光及びストークス光１０１はそれぞれ、ピコ秒レーザやフェムト秒レーザといった超短パルスレーザである。ポンプ光には、近赤外光、例えば波長１０６４ｎｍのレーザを用いる。ストークス光には、様々な波長成分を万遍なく含んだＳＣ光を用いる。ＳＣ光の発生には、フォトニック結晶ファイバ（ｐｈｏｔｏｎｉｃ ｃｒｙｓｔａｌ ｆｉｂｅｒ）と呼ばれる非線形光ファイバや、テーパ状ファイバと呼ばれる通常の光ファイバを伸延してコアを極細に変形させたものを使用する。本実施形態では、ポンプ光用のレーザ光源が発振するレーザをビームスプリッタ等により複数に分割し、一方をそのままポンプ光とし、他方をＰＣＦまたはテーパ状ファイバに入射させてＳＣ光を得、それらを重畳した上で試料０に照射する。

本実施形態の分光装置は、試料０に臨む対物レンズ１と、対物レンズ１を通過した応答光１０２を入力光としてこれを入射させる第一の偏光ビームスプリッタ２と、第一の偏光ビームスプリッタ２から出射する入力光１０２のｐ偏光成分１０３を入射させる第一の多層膜フィルタ３と、第一の偏光ビームスプリッタ２から出射する入力光１０２のｓ偏光成分１０４を入射させる第二の多層膜フィルタ４と、第一の多層膜フィルタ３を透過した光１０５及び第二の多層膜フィルタ４を透過した光１０６をそれぞれ入射させて両者を重畳した出力光１０７を得る第二の偏光ビームスプリッタ７と、第二の偏光ビームスプリッタ７から出射する出力光１０７を入射させる結像レンズ８と、結像レンズ８を通過した出力光１０７を受光して撮像を行うイメージセンサ９とを具備する。

第一の多層膜フィルタ３及び第二の多層膜フィルタ４はそれぞれ、これに入射する光１０３、１０４に含まれる一部の波長成分１０５、１０６のみを透過させるものである。各フィルタ３、４は、典型的にはバンドパスフィルタとして機能する干渉フィルタである。尤も、多層膜フィルタ３、４として、干渉フィルタ以外のフィルタ、例えばダイクロイックフィルタを採用することを妨げるものではない。一般的な多層膜フィルタ３、４は、透明基板の表面に誘電体光学薄膜を多層に重ねた構造をなし、入射光が多層膜を通過する過程での膜内多重反射による干渉現象により、所定の波長を選択的に透過させ、それ以外の波長を透過させない、そして極めて急峻な分光透過率変化を達成している。

多層膜フィルタ３、４の特徴として、これに入射する光１０３、１０４の光軸と交わる角度が変化することで、当該フィルタ３、４を透過する光１０５、１０６の波長及び透過しない光の波長が変化することが挙げられる。傾向としては、光１０３、１０４が入射するフィルタ３、４の境界面の法線と入射光１０３、１０４の光軸とがなす角度である入射角が大きくなるほど、当該フィルタ３、４を透過できる光１０５、１０６の波長が短くなる。これは、入射角により光学薄膜内での光路長が伸縮して干渉条件が変化し、その帰結として分光透過率特性が変動するからである。

本実施形態では、入射光１０３、１０４の入射角が０°よりも大きく９０°よりも小さい中間的な所定角度、例えば４５°であるときに、近赤外光に属する所定波長の光１０５、１０６を透過させ、それ以外の波長の光を透過させないように設計したバンドパスフィルタ３、４を用いる。近赤外光の定義は波長が約７００ｎｍないし約２５００ｎｍの光であるが、入射角４５°またはその近傍の入射角におけるバンドパスフィルタ３、４の透過光１０５、１０６の中心波長は、約９００ｎｍないし約１３００ｎｍの範囲内の値であることが好ましい。図２に、バンドパスフィルタ３に対するｐ偏光の入射光１０３の入射角と、当該バンドパスフィルタ３を透過する光１０５の中心波長及びバンド幅、並びにｐ偏光成分の透過率の一例を示している。図示例では、入射角４５°またはその近傍の入射角における透過光１０５の中心波長が、ポンプ光の波長に等しいか略等しい１０６４ｎｍとなっている。また、透過光１０５のバンド幅は、数ｎｍ以下である。

このような多層膜フィルタ３、４を、例えばガルバノスキャナモータ等の回転駆動装置により回転軸３１、４１を中心に回転させ、当該フィルタ３、４に入射する光１０３、１０４の入射角を増減させることにより、当該フィルタ３、４を透過する光１０５、１０６の波長を変化させることが可能である。生体試料０に対するＣＡＲＳ分光分析を行う場合、透過光１０５、１０６の波長を近赤外光に属する範囲内で、特に約９００ｎｍないし約１３００ｎｍの範囲内で変化させ得ることが好ましい。一方で、波長が９００ｎｍを下回る短波長の透過光１０５、１０６は、必ずしも必要とされない。

本実施形態にあって、第一の多層膜フィルタ３の特性と、第二の多層膜フィルタ４の特性とは同等である。ここに言う「同等の特性」とは、双方のフィルタ３、４の特性の間に個体差のような微少な差が存在することを含んでいるのは勿論である。

但し、多層膜フィルタ３、４に入射する光１０３、１０４の入射角と、これを透過する光１０５、１０６の波長との関係は、入射光１０３、１０４の偏光方向による影響を受ける。第二の多層膜フィルタ４として、第一の多層膜フィルタ３と同等の特性を有するフィルタを用いる場合、第一の偏光ビームスプリッタ２により二分された光１０３、１０４の偏光方向が相異なることを考慮に入れなければならない。本実施形態では、第二の多層膜フィルタ４の姿勢及び回転軸４１を、第一の多層膜フィルタ３の姿勢及び回転軸３１に対して相対的に、第二の多層膜フィルタ４に入射し透過する光１０４、１０６の光軸回りに、９０°回転させている。例えば、入射光１０３、１０４の光軸を含む仮想的な平面（図１の紙面）に対して、第一の多層膜フィルタ３の回転軸３１が直交しているとき、第二の多層膜フィルタ４の回転軸４１は当該平面と平行となっている。これにより、入力光１０２のｐ偏光成分１０３が入射する第一の多層膜フィルタ３及び当該フィルタ３を回転駆動する制御系と、ｓ偏光成分１０４が入射する第二の多層膜フィルタ４及び当該フィルタ４を回転駆動する制御系とを共通化できる。

第二の多層膜フィルタ４を透過した光１０６は、複数枚の全反射ミラー５、６により反射されて、第一の多層膜フィルタ３を透過した光１０５と直交または略直交する。各ミラー５、６は、位置や角度の調節が可能となっている。また、ミラー５、６間に、焦点調整用のレンズやビームエキスパンダ等を介在させることを妨げない。

第二の偏光ビームスプリッタ７は、第一の多層膜フィルタ３を透過した光１０５の光軸と、第二の多層膜フィルタ４を透過した光１０６の光軸とが交わる位置に所在する。そして、それらの光１０５、１０６の入射を受け、両者を重畳した出力光１０７を出射する。

出力光１０７は、結像レンズ８を経てＣＣＤまたはＣＭＯＳ等のイメージセンサ９に入射する。イメージセンサ９は、その出力光１０７を受光して撮像する。なお、必要に応じて、試料０に照射する光１０１の波長成分その他の不要な光を遮断するためのノッチフィルタまたはバンドストップフィルタを、イメージセンサ９の上流に配置してよい。

本実施形態の受光装置の特長は、対象の試料０における、ポンプ光及びＳＣ光１０１の照射を受けて励起した平面領域を一時にイメージングできる点にある。その撮像領域の大きさは、対物レンズ１と結像レンズ８の焦点距離やイメージセンサ９の視野サイズ及び画素分解能等にも依存するが、数十μｍ四方ないし２ｍｍ四方程度の領域の撮像が可能である。撮影画像の限界分解能は、１μｍ以下を実現できる。

既に述べた通り、出力光１０７に含まれる波長、即ちＣＡＲＳ光１０２から抽出される波長は、多層膜フィルタ３、４の入射角によって決定される。多層膜フィルタ３、４の入射角は、人手によらず自動で、かつ高速に変化させることが可能である。多層膜フィルタ３、４の入射角を徐変させる制御を実行しつつ、イメージセンサ９により出力光１０７を受光し撮像する処理を反復すれば、ＣＡＲＳ光１０２に含まれ得る様々な波長について、平面領域の画像を獲得できる。つまり、平面領域内の各箇所で発生した応答光１０２の波長スペクトルを短時間で調査することができる。ひいては、平面領域内の各箇所に存在する分子種や分子構造の同定、各箇所に存在する細胞の判別、生命活性のモニタ等を、実用的な所要時間で遂行できる。

対象の試料０の大きさが一度に撮像可能な平面領域の大きさを超えているならば、試料０を照射光１０１及び応答光１０２の光軸に対して相対的に変位させながら撮像を繰り返せばよいことは言うまでもない。

本実施形態では、入射する入力光１０２をｐ偏光成分１０３とｓ偏光成分１０４とに分離する第一の偏光ビームスプリッタ２と、入射する光１０３のうちの一部の波長成分１０５のみを透過させるものであり、前記第一の偏光ビームスプリッタ２から出射した一方の光１０３を入射させるとともに、その光１０３の光軸に対して交わる角度を操作可能な第一の多層膜フィルタ３と、入射する光１０４のうちの一部の波長成分１０６のみを透過させるものであり、前記第一の偏光ビームスプリッタ２から出射した他方の光１０４を入射させるとともに、その光１０４の光軸に対して交わる角度を操作可能な第二の多層膜フィルタ４と、前記第一の多層膜フィルタ３を透過した光１０５及び前記第二の多層膜フィルタ４を透過した光１０６をそれぞれ入射させて両者を重畳した出力光１０７を得る第二の偏光ビームスプリッタ７とを具備する分光装置を構成した。

多層膜フィルタの入射角を変化させることを通じて当該フィルタを透過する波長成分を選好しようとすると、当該フィルタに入射する光の偏光方向によって透過する光の波長が影響を受ける。だが、本実施形態のように、入力光１０２を一旦ｐ偏光成分１０３とｓ偏光成分１０４とに分離し、それらを別々に多層膜フィルタ３、４に入射させ、その透過光１０５、１０６を再度重畳する構造としたことにより、偏光方向の影響を排除した精確な出力光１０７を抽出することが可能となる。

本実施形態によれば、回折格子分光器を使用せず、任意の波長成分を含む出力光１０７を得られ、しかもその波長成分を速やかに変化させることのできる分光装置を実現できる。

なお、本発明は以上に詳述した実施形態に限られるものではない。特に、本発明の実用上の用途は、ＣＡＲＳ分光分析には限定されない。本発明は、ＣＡＲＳではないラマン分光分析にも当然に適用することができる。その場合、応答光である入力光１０２は励起光１０１を試料０に照射することで発生するラマン散乱光であり、出力光１０７はラマン散乱光１０２に含まれる任意の波長成分である。

さらに、本発明は、ラマン分光以外の用途、例えば赤外分光分析にも適用することが可能である。その場合、応答光である入力光１０２は赤外光１０１を試料０に照射した結果試料０に吸収されなかった（試料０を透過または試料０が反射した）光であり、出力光１０７はその光１０２に含まれる任意の波長成分である。

本発明は、ダイレクトイメージング、即ち平面的に拡張する領域を一度に結像させる光学系を実現できるものであるが、小さなスポット領域を走査する形でイメージングを行う用途に用いることも可能である。

その他、各部の具体的構成は、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々変形が可能である。

０…試料
２…第一の偏光ビームスプリッタ
３…第一の多層膜フィルタ
４…第二の多層膜フィルタ
７…第二の偏光ビームスプリッタ
９…イメージセンサ
１０１…試料に照射する光
１０２…入力光（ラマン散乱光、ＣＡＲＳ光）
１０３…ｐ偏光成分
１０４…ｓ偏光成分
１０５…透過光
１０６…透過光
１０７…出力光

Claims (6)

1. 試料に臨み、当該試料に光を照射した結果二次元的に拡張した平面領域で生ずる応答光を入射させる対物レンズと、
   前記対物レンズを通過した応答光を入射させこれをｐ偏光成分とｓ偏光成分とに分離する第一の偏光ビームスプリッタと、
   入射する光のうちの一部の波長成分のみを透過させるものであり、前記第一の偏光ビームスプリッタから出射した一方の光を入射させるとともに、その光の光軸に対して交わる角度を操作可能な第一の多層膜フィルタと、
   入射する光のうちの一部の波長成分のみを透過させるものであり、前記第二の偏光ビームスプリッタから出射した他方の光を入射させるとともに、その光の光軸に対して交わる角度を操作可能な第二の多層膜フィルタと、
   前記第一の多層膜フィルタを透過した光及び前記第二の多層膜フィルタを透過した光をそれぞれ入射させて両者を重畳した出力光を得る第二の偏光ビームスプリッタと、
   前記第二の偏光ビームスプリッタから出射した出力光を入射させる結像レンズと、
   前記結像レンズを通過した出力光を受光することにより前記平面領域の画像を一度に獲得するイメージセンサと
   を具備する分光分析装置。
2. 前記第二の多層膜フィルタとして、前記第一の多層膜フィルタと同等の特性を有するフィルタを用いることとし、
   前記第二の多層膜フィルタの姿勢及び当該第二の多層膜フィルタの回転軸の向きを、同フィルタを通過する光の光軸回りに、前記第一の多層膜フィルタの姿勢及び当該第一の多層膜フィルタに対して９０°変位させる請求項１記載の分光分析装置。
3. 前記対物レンズから前記イメージセンサまでの間に回折格子分光器が存在しない請求項１または２記載の分光分析装置。
4. 前記応答光が、光を照射した対象の試料から発生するラマン散乱光である請求項１、２または３記載の分光分析装置。
5. 前記応答光が、ポンプ光及びストークス光であるスーパーコンティニューム光を対象の試料に照射した結果発生する、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光である請求項４記載の分光分析装置。
6. 前記第一の多層膜フィルタ及び前記第二の多層膜フィルタがそれぞれ、入射する光の入射角が４５°またはその近傍の角度のときに近赤外光を透過させるものである請求項５記載の分光分析装置。

Images