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JP6666855B2 - デヒドロコール酸化合物の生体触媒ホールセル還元のための新規方法、新規７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ変異体、およびウルソデオキシコール酸を産生するための改良された生体触媒法 - Google Patents

デヒドロコール酸化合物の生体触媒ホールセル還元のための新規方法、新規７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ変異体、およびウルソデオキシコール酸を産生するための改良された生体触媒法 Download PDF

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Description

本発明は、デヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）化合物のホールセル還元を含む新規な生体触媒プロセス、新規７−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ変異体、これらの酵素変異体をコードする配列、酵素変異体の産生法および、コール酸化合物（胆汁酸誘導体）の酵素的変換における、および特にウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の製造におけるそれらの使用に関し；また本発明の主題は、酵素変異体を用いたＵＤＣＡの合成のための新規方法、および特に組換えホールセル生体触媒を用いたＵＤＣＡの製造のためのさらに改良された方法である。
胆石問題の薬物療法には、胆汁酸塩活性物質ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＳまたはＵＤＣＡ）および対応するジアステレオマーであるケノデオキシコール酸（ＣＤＣＳまたはＣＤＣＡ）がとりわけ、長年にわたり使用されてきた。この２つの化合物は、７位のＣ原子におけるヒドロキシ基の配位のみが異なる（ＵＤＣＡ：β−配位、ＣＤＣＡ：α−配位）。先行技術では、ＵＤＣＡの製造のための種々の方法が記載されており、それらは純粋に化学的に行なわれるか、または化学的プロセス工程と酵素的プロセス工程との組合せからなる。各々の場合において、出発点はコール酸（ＣＡもしくはＣＡ）かまたはコール酸から製造されたＣＤＣＡである。
したがって、ＵＤＣＡ産生のための古典的な化学的方法は、以下のように概略的に表現できる：
ＣＡＳ→ＣＡメチルエステル→３，７−ジアセチル−ＣＡメチルエステル→１２−ケト−３，７−ジアセチル−ＣＡメチルエステル→ＣＤＣＡ→７−ケト−ＬＣＡ→ＵＤＣＡ
とりわけ、重大な欠点は以下の通りである：化学的酸化は選択的でないため、カルボキシ基と３αおよび７α−ヒドロキシ基とが、エステル化により保護されねばならない。
酵素１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１２α−ＨＳＤＨ）の使用に基づく代替えの化学的／酵素的方法は、以下のように表現でき、かつ例えば本出願者による特許文献１に記載されている。
ＣＡ→１２−ケト−ＣＤＣＡ→ＣＤＣＡ→７−ケト−ＬＣＡ→ＵＤＣＡ
ここで、１２α−ＨＳＤＨはＣＡを１２−ケト−ＣＤＣＡへ選択的に酸化する。結果として、古典的な化学的方法によって必要とされる２つの保護工程が不要となる。
さらに、代替えの化学的／酵素的方法は、Ｍｏｎｔｉ, Ｄら（非特許文献１）により記載され、これは以下のように概略的に表される：
ＣＡ→７，１２−ジケト−ＬＣＡ→１２−ケト−ＵＤＣＡ→ＵＤＣＡ
ＣＡは、まず、Ｂｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ＡＣＴＴ ２５２８５（非特許文献２）由来の７α−ＨＳＤＨと、および１２α−ＨＳＤＨとにより、７，１２−ジケト−ＬＣＡへ酸化される。これら２つの酵素は、双方ともＮＡＤＨ依存性である。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｂｓｏｎｕｍ ＡＴＣＣ ２７５５５（ＤＳＭ５９９）（非特許文献３）由来の７β−ＨＳＤＨ（ＮＡＤＰＨ依存性）による還元後、１２−ケト−ＵＤＣＡが生成される。最終産物は、Ｗｏｌｆｆ−Ｋｉｓｈｎｅｒ還元により得られる。この方法においては、触媒反応の平衡位置が原因で完全な変換が不可能であること、および変換の最初の段階では２つの異なる酵素を使用しなければならず、このことが操作コストを増加させるという欠点がある。補因子再生には、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ；ＮＡＤ＋の再生用）およびグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧｌｃＤＨまたはＧＤＨ；ＮＡＤＰＨの再生用）が使用される。そこで用いる補因子再生における不都合は、産生された同時反応物を反応混合物から除去することが非常に困難であり、そのため反応平衡を都合よく作用させることができず、そのことが抽出物の不完全な変換を生じる結果となることである。
Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ ２５９８６（ＤＳＭ ３９７９；以前はＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）株由来の７β−ＨＳＤＨは、ＨｉｒａｎｏおよびＭａｓｕｄａにより１９８２年に記載された（非特許文献４）。この酵素の配列情報は、開示されていない。ゲル濾過により測定された分子量は、４５，０００Ｄａであった（Ｈｉｒａｎｏ、１０５９頁、左欄参照）。さらに、７−オキソ基の７β−ヒドロキシ基への還元は、この酵素についてそこでは観察できなかった（Ｈｉｒａｎｏ、１０６１頁、議論第１パラグラフ参照）。したがって当業者には、Ｈｉｒａｎｏらにより記載された酵素が、デヒドロコール酸（ＤＨＣＡまたはＤＨＣＡ）の７位における３，１２−ジケト−ＵＤＣＡへの還元の触媒には適当でないことが理解される。
本発明者らは出願者の特許文献２においては、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ ２５９８６由来の新規な７β−ＨＳＤＨが記載されており、これはとりわけ約２８−３２ｋＤａの分子量（ＳＤＳゲル電気泳動で）、約５３から６０ｋＤａの分子量（特にＳＤＳ無しなどの非変性条件下でのゲル濾過で）を有し、かつ７−ケトＬＣＡの７−カルボニル基の７β−ヒドロキシ基への立体選択的還元をもたらす能力を有する。
これとは別に、特許文献２では、ＵＤＣＡ産生が提供され、これは以下のように概略的に表される：
ＣＡ→ＤＨＣＡ→１２−ケトＵＤＣＡ→ＵＤＣＡ
ここでは、ＣＡの酸化は単純に古典的な経路によって起こる。ＤＨＣＡは、酵素ペア７β−ＨＳＤＨおよび３α−ＨＳＤＨにより、個別に連続して、またはワンポットで、１２−ケト−ＵＤＣＡへ還元される。それ故、Ｗｏｌｆｆ−Ｋｉｓｈｎｅｒ還元と組合せて、ＵＤＣＡはＣＡからわずか３工程で合成され得る。７β−ＨＳＤＨは補因子ＮＡＤＰＨに依存するのに対し、３α−ＨＳＤＨは補助因子ＮＡＤＨを必要とする。同じ補因子に対する依存性、または拡張された依存性（例えば、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対する）をもつ酵素ペアを利用可能性は、それにより補因子再生が単純化できるため有利となる。
出願者の特許文献３では、とりわけ、デヒドロコール酸化合物（ＤＨＣＡ）の生体触媒還元のためのホールセル法、および特に、７β−ＨＳＤＨと３α−ＨＳＤＨとを発現する組換えホールセル触媒を用いるＵＤＣＡ産生のための新規方法であって、これにおいて、補因子再生のための酵素的還元工程が、補因子再生酵素、例えば適当なグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）と組合される、該新規方法が記載される。
酵素的合成の効率についての基準は、必要な酵素が使用される様式である。これにおいて、ホールセル生体触媒は実証されたアプローチである。ここでは、全体が生体触媒として使用されるため、宿主生物および細胞内でしばしば異種の酵素が過剰発現される。特許文献３からの具体的なホールセル生体触媒は、例えばＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ由来のＮＡＤＰＨ依存性、７β−ＨＳＤＨ、例えばＣｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ由来のＮＡＤＨ依存性３α−ＨＳＤＨ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの双方を利用するＧＤＨを発現し、ＤＨＣＡの１２−ケトウルソデオキシコール酸（１２−ケト−ＵＤＣＡ）への還元のためのホールセル生体触媒として使用される。ここでは、例えば１７．７ｇＢＤＭ Ｌ−１の生体触媒が、１００ｍＭ ＤＨＣＡを９８％、１２−ケト−ＵＤＣＡへ変換するのに使用される。この産生工程では生体触媒が主なコストファクタであることから、現在の技術的挑戦は、例えば、別の物質による生体触媒の部分的置き換えにより、プロセスコストが低減できる技術的解決の発見にある。
それ故第１の目的は、ＤＨＣＡを介したＵＤＣＡの還元的製造における、特に、高いコスト効率によって特徴づけられる、新規な生体触媒プロセスを供給することにある。
本発明の更なる目的は、さらに改良された７β−ＨＳＤＨの供給である。特に、７位におけるＤＨＣＡの立体特異的還元による、ＵＤＣＡの酵素的または微生物（生体触媒）的製造のために、さらにより有利に使用でき、かつ特に、修飾された補因子使用（とりわけ、改善されたＮＡＤＨ特異性）をもつ酵素変異体が提供されるべきである。
PCT/EP2009/002190 WO2011/064404 WO2012/080504
Monti, D., et al.,（One-Pot Multienzymatic Synthesis of 12-ketoursodeoxycholic Acid: Subtle Cofactor Specificities Rule the Reaction Equilibria of Five Biocatalysts Working in a Row. Advanced Synthesis & Catalysis, 2009). Zhu, D., et al., Enzymatic enantioselective reduction of keto esters by a thermostable 7-hydroxysteroid dehydrogenase from Bacteroides fragilis. Tetrahedron, 2006. 62(18): p. 4535-4539. MacDonald, I.A. and P.D. Roach, Bile induction of 7 alpha- and 7 beta-hydroxysteroid dehydrogenases in Clostridium absonum. Biochim Biophys Acta, 1981. 665(2): p. 262-9. Hirano, S. and N. Masuda, Characterization of NADP-dependent 7 beta-hydroxysteroid dehydrogenases from Peptostreptococcus productus and Eubacterium aerofaciens. Appl Environ Microbiol, 1982. 43(5): p. 1057-63).
上記の第１の問題は、驚いたことに、ＤＨＣＡ化合物の生体触媒還元のための新規なホールセル法によって解決され、該方法では、ホールセル触媒に必要なバイオマス（生物体量）が、補因子ＮＡＤおよび／またはＮＡＤＰの添加により部分的に置き換えできることから低減され得る。これにおいては、ＮＡＤもしくはＮＡＤＰ、または、ＮＡＤおよびＮＡＤＰ、のいずれかが反応混合物へ添加され得る。
特に、上記の第１の問題は、改良された生体触媒的（微生物的または酵素的）プロセス、とりわけ、同時かまたは任意の順序で時間的に分けて１２−ケト−ＵＤＣＡへ進行する、７β−ＨＳＤＨおよび３α−ＨＳＤＨによりそれぞれ触媒される２つの還元性の成分工程と、双方の還元性の成分工程からの使用ずみの補因子を再生するグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）酵素の使用による補因子再生とを介する、ＤＨＣＡの酵素的変換を含むホールセルプロセスの供給により解決された。
上記の第２の問題は、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ属の好気性細菌、とりわけＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ株に由来する、改良されたＮＡＤＨ特異性をもつ７β−ＨＳＤＨの変異体であって、これにおいて、該変異体がまた、特にホールセルプロセスに関連して、とりわけＵＤＣＡの製造におけるコール酸化合物の（酵素的または微生物的）変換において有利に使用される、該変異体の作成および特性評価によって解決できた。
Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ由来の７β−ＨＳＤＨのアミノ酸配列を示す図である。 図１ａのアミノ酸配列をコードする核酸配列を示す図である。 Ｃｏｍａｎｏｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ由来の３α−ＨＳＤＨのアミノ酸配列を示す図である。 図１ｃのアミノ酸配列をコードする核酸配列を示す図である。 ７β−ＨＳＤＨ野生型（ＷＴ）および種々の変異体：７β−ＨＳＤＨ Ｄ、７β−ＨＳＤＨ ＤＦ、７β−ＨＳＤＨ ＤＦＫ、および７β−ＨＳＤＨ ＤＦＫＧのアミノ酸配列を比較して示す図である。 ホールセル生体触媒を用いた、デヒドロコール酸の１２−ケトＵＤＣＡへの２段階の酵素的還元を概略的に表す図であり、これにおいて、還元の成分工程は、７β−ＨＳＤＨおよび３α−ＨＳＤＨにより触媒される。用いた補因子（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）は、グルコースの消費（グルコノ−１，５−ラクトン）とともにホールセル触媒ＧＤＨによって発現されるＧＤＨによっても再生される。 発現プラスミドｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧ（配列番号１８）、ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧ−Ｋ（配列番号１９）、およびｐ７（Ａ）Ｔ３ＴＧ（配列番号２０）のベクターマップを示す図である。 １ｇＢＤＭＬ−１の生体触媒、０．０５ｍＭ ＮＡＤ、および０．０１ｍＭ ＮＡＤＰを使用した、ホールセル生体触媒Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ΔｈｄｈＡ ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧ−Ｋ、およびＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐ７（Ａ）Ｔ３ＴＧを用いた生体触媒反応の経過を示す図である（Ｘ＝６７）。 ３．５ｇＢＤＭＬ−１の生体触媒および０．０２５ｍＭ ＮＡＤを使用した、ホールセル生体触媒Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧを用いた生体触媒反応の経過を示す図である（Ｘ＝１４７．５）。 １．７５ｇＢＤＭＬ−１の生体触媒、０．０２５ｍＭ ＮＡＤ、および０．０１ｍＭ ＮＡＤＰを使用した、ホールセル生体触媒Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧを用いた生体触媒反応の経過を示す図である（Ｘ＝８９．５）。 １ｇＢＤＭＬ−１の生体触媒、０．０４ｍＭ ＮＡＤ、および０．００７５ｍＭ ＮＡＤＰを使用した、ホールセル生体触媒Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ΔｈｄｈＡ ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧ−Ｋを用いた生体触媒反応の経過を示す図である（Ｘ＝６１）。 先行技術から公知の未修飾７β−ＨＳＤＨ、酵素変異体７β−ＨＳＤＨ Ｇ３９Ｄ、および７β−ＨＳＤＨ Ｇ３９Ｄ Ｒ４０Ｉと、本発明による具体的な酵素変異体とのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。元の配列からずれている位置は下線で示されている。 本発明による７β−ＨＳＤＨ変異体の酵素動態研究を示す図である。一定の補因子濃度０．５ｍＭ ＮＡＤＨで用いる、種々の基質濃度（ＤＨＣＡ／ＤＨＣＡ）に対する特異的酵素活性のプロット。 本発明による７β−ＨＳＤＨ変異体の酵素動態研究を示す図である。１０ｍＭ ＤＨＣＡ／ＤＨＣＡの一定の基質濃度で用いる、種々の補因子濃度に対する特異的酵素活性のプロット。 −２０℃および室温／４℃で保存したホールセル生体触媒Ｅ．ｃｏｌｏＢＬＬｉｕ Ｐ７（Ａ）Ｔ３ＴＧ−Ｋの細胞によるホールセル生体内変化を示す図である。上記２つの調製は、標準的な条件下で実施された：７０ｍＭ ＤＨＣＡ、３５０ｍＭ グルコース、ＯＤ ２細胞、５０μＭ ＮＡＤ、１０μＭ ＮＡＤＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＰｉ緩衝液（ｐＨ７．０）、および３０℃。低い方の調製では、他の条件は変えずにＮＡＤ濃度を１００μＭに倍化した。ｐＨは、手作業により半時間ごとにＮａＯＨ溶液（５Ｍ）を用いて最初の値に調整した。三重のランからの平均値が示され、標準偏差はエラーインジケータにより表される。 ＮＡＤＨ依存性７β−ＨＳＤＨ変異体Ｄ、ＤＦ、ＤＦＫ、およびＤＫＦＧの、野生型（ＷＴ）酵素との比較を示す図である。それぞれの場合の反応条件は、０．２ｍｇ ｍＬ−１７β−ＨＳＤＨ、１０Ｕ ｍＬ−１ＧＤＨ、０．５ｍＭ ＮＡＤ、５０ｍＭ ＤＨＣＡ、２００ｍＭ グルコース、５００ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ８．０、および３０℃であった。反応は、振盪式ディープウェルプレート内で、強力に緩衝された系においてｐＨ調節なしに実施した。三重のランの標準偏差は、エラーインジケータにより表される。 ＮＡＤＨ依存性７β−ＨＳＤＨ変異体ＤＦＫおよびＤＦＫＧを用いた、２段階のバイオトランスフォーメイションの反応経過を示す図である。それぞれの場合の反応条件は、０．２ｍｇ ｍＬ−１７β−ＨＳＤＨ、１Ｕ ｍＬ−１３α−ＨＳＤＨ、１０Ｕ ｍＬ−１ＧＤＨ、０．５ｍＭ ＮＡＤ、５０ｍＭ ＤＨＣＡ、２００ｍＭ グルコース、５００ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ８．０、および３０℃であった。反応は、振盪式ディープウェルプレート内で、強力に緩衝された系においてｐＨ調節なしに実施した。三重のランの標準偏差は、エラーインジケータにより表される。
本発明は、とりわけ以下の具体的な実施形態に関する：
１． 生体触媒性還元のための方法、とりわけ一般式３：
［式中、Ｒは、アルキル、Ｈ、アルカリ金属イオン、またはＮ（Ｒ３）４ ＋を表し、ここで、残基Ｒ３は、同じかまたは異なり、かつＨまたはアルキルを表し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置き換えられ、ここで、Ｒ１およびＲ２は、互いに独立してアルキル残基を表す］のデヒドロコール酸化合物（ＤＨＣＡ）の；
式（５）：
［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で、上記に定義されたように置き換えられる］の対応する１２−ケト−ウルソデオキシコール酸化合物（１２−ケト−ＵＤＣＡ）へのホールセル還元のための方法であって、
これにおいて、１つ以上の同じかまたは異なるホールセル生体触媒、とりわけ１つのホールセル生体触媒が、液体反応媒体中に、変換に必要な酵素の補因子特異性に依存して、ＮＡＤ（Ｈ）および／またはＮＡＤＰ（Ｈ）、グルコース、および任意でさらなる添加剤を含み、かつ、少なくとも１つの式（３）の基質が、ホールセル生体触媒と接触せられ、かつ任意に反応生成物が反応媒体から分離され；これにおいて、反応が、７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７β−ＨＳＤＨ）（ＮＡＤ（Ｈ）−および／またはＮＡＤＰ（Ｈ）−依存性、とりわけＮＡＤＰ（Ｈ）−依存性）；３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α−ＨＳＤＨ）（ＮＡＤ（Ｈ）−および／またはＮＡＤＰ（Ｈ）−依存性、とりわけＮＡＤ（Ｈ）−依存性）、およびグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）（ＮＡＤ（Ｈ）−および／またはＮＡＤＰ（Ｈ）−依存性；とりわけ補因子非特異的、すなわちＮＡＤ（Ｈ）−およびＮＡＤＰ（Ｈ）−利用）の存在下に起こり、ここで、必要な酵素の補因子特異性に依存してＮＡＤ（Ｈ）および／またはＮＡＤＰ（Ｈ）と、グルコースと、任意に更なる添加剤と、および少なくとも１つの式（３）の基質とは、本質的に生体触媒の内在性成分ではないが、液体、特に水性の反応媒体へ添加され；
かつここで、ホールセル生体触媒が（または種々のホールセル生体触媒が一緒に）、同時に以下の酵素活性：
（１）７β−ＨＳＤＨおよび
（２）３α−ＨＳＤＨ、および任意に
（３）ＧＤＨが液体反応媒体へ添加されていない場合は、ＧＨＤを発現し、
かつここで、反応混合物中のホールセル生体触媒、ＮＡＤ（Ｈ）、ＮＡＤＰ（Ｈ）、および式（３）の基質の濃度が、以下の数学的関係：
Ｘ＜Ｙ・２００ またはＸ＜Ｙ・１７５、例えば特にＸ＜Ｙ・１５０
であり、同時に
Ｙ＝ＣＤＨＣＡ／７０
であり、かつ
Ｘ＝ＣＣａｔ・４０＋ＣＮＡＤ（Ｈ）・３００＋ＣＮＡＤＰ（Ｈ）・１２００
［式中、パラメータは以下の通りである：
ＣＤＨＣＡ＝式（３）の化合物の基質初濃度［ｍＭ］
ＣＣａｔ＝ホールセル生体触媒濃度［ｇＢＤＭ Ｌ−１］
ＣＮＡＤ（Ｈ）＝ＮＡＤ（Ｈ）濃度［ｍＭ］
ＣＮＡＤＰ（Ｈ）＝ＮＡＤＰ（Ｈ）濃度［ｍＭ］］にある、該方法。
ここで、上記に述べたパラメータについては、以下の好ましい意味が、とりわけ単独で、または全体として該当する；
ａ）ＣＣａｔは、０．０５〜５０、０．１〜１０、とりわけ０．５〜５ｇＢＤＭ Ｌ−１の範囲内であり、ここで「ＢＤＭ」は細菌の乾燥質量を表す；
ｂ）ＣＮＡＤ（Ｈ）およびＣＮＡＤＰ（Ｈ）は、同時に０を表すことはない；特に、双方の値は０より大きく、すなわちＮＡＤ（Ｈ）−およびまたＮＡＤＰ（Ｈ）の双方に依存性の工程が生体触媒法の一部である、
ｃ）ＣＮＡＤ（Ｈ）＋ＣＮＡＤＰ（Ｈ）の合計は、少なくとも１０μＭ、とりわけ少なくとも２０μＭ、例えば１０〜１０００ｍＭ、または１５〜５００ｍＭ、または２０〜２５０ｍＭ、または２５〜１００ｍＭである。
ｄ）ＣＮＡＤ（Ｈ）およびＣＮＡＤＰ（Ｈ）はそれぞれ、ＮＡＤ（Ｈ）およびＮＡＤＰ（Ｈ）の各々の飽和濃度よりも低く、例えば、それぞれの場合で１〜５００ｍＭ、５〜２００ｍＭ、または１０〜１５０ｍＭ、または１５〜１００ｍＭなどであり、かつ
ｅ）ＣＤＨＣＡは、約０．１〜５００ｍＭ、とりわけ１〜２００ｍＭ、または１０〜１００ｍＭの範囲内にある。
例えば、少なくとも条件ａ）、ｂ）、およびｃ）、またはａ）、ｂ）、ｃ）、およびｄ）、あるいは、またはａ）〜ｅ）が、上記の定義に従って同時に設定されるべきである。
好ましい構成は、ホールセル生体触媒を液体反応媒体において含み；これにおいて、反応は、７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７β−ＨＳＤＨ）、（ＮＡＤＰ（Ｈ）依存性）；３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α−ＨＳＤＨ）（ＮＡＤ（Ｈ）依存性）、およびグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）（非特異的補因子、すなわちＮＡＤ（Ｈ）−およびＮＡＤＰ（Ｈ）−利用）の存在下で起こる。
さらに好ましい構成は、上記の好ましい補因子特異性をもつ以下の：
（１）７β−ＨＳＤＨ
（２）３α−ＨＳＤＨおよび
（３）ＧＤＨ、
の酵素活性を同時に発現するホールセル生体触媒を含む。
特に、本発明の教示に従うことにより、当業者は、上記の濃度値を、＞９５％、＞９８％、９９％、または＞９９．５％の変換が４〜２４時間、とりわけ６〜１２時間、または７〜８時間の時間間隔で、例えば＞９８％が６〜１２、または７〜８時間以内に達成され；あるいは＞９９．５％が４〜２４時間、または６〜１２時間以内に起こる、というように選択できる。特に好ましいのは、１０時間未満、例えば特に３〜９．５時間、または４〜９時間、５〜９時間、６〜９時間、７〜９時間、および約８時間を超える全ての反応時間内での＞９９％の変換である。これらの変換は、例えば標準的な試験法（ＩＰＣ法）により、ＤＨＣＡの１２−ケト−ＵＤＣＡへの変換が測定される以下の実験のセクションにおいてより詳細に説明される通り測定できる。
２． ホールセル生体触媒が組換え微生物である、実施形態１に記載の方法。
３． 生体触媒が、１つ以上の、特に１つもしくは２つの、プラスミド、または特にゲノムインテグレートされたプラスミド上に発現された、７β−ＨＳＤＨ、３α−ＨＳＤＨ、およびＧＤＨの酵素活性のためのコーディング配列をもつ、先行する実施形態の１つに記載の方法。例えば、プラスミド：
ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧ ＝ ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧ−Ａ ＝ｐＥＴ２２ｂ ７ベータ−ＨＳＤＨ （Ｇ３９Ａ） Ｔ７Ｐ ３アルファ−ＨＳＤＨ ｒｂｓ ｂｓＧＤＨ （配列番号１８）；
ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧ−Ｋ ＝ ｐＥＴ２８ａ ７ベータ−ＨＳＤＨ（Ｇ３９Ａ） Ｔ７Ｐ ３アルファ−ＨＳＤＨ ｒｂｓ ｂｓＧＤＨ （配列番号１９）；
ｐ７（Ａ）Ｔ３ＴＧ ＝ ｐ７（Ａ）Ｔ３ＴＧ−Ａ ＝ ｐＥＴ２２ｂ ７ベータ−ＨＳＤＨ（Ｇ３９Ａ） Ｔ７Ｐ ３アルファ−ＨＳＤＨ Ｔ７Ｐ ｂｓＧＤＨ （配列番号２０）；
ｐ７（Ａ）Ｔ３ＴＧ−Ｋ ＝ ｐＥＴ２８ａ ７ベータ−ＨＳＤＨ（Ｇ３９Ａ） Ｔ７Ｐ ３アルファ−ＨＳＤＨ Ｔ７Ｐ ｂｓＧＤＨ （配列番号２１）が挙げられるべきであり；
またそれらに由来する、１つ以上の酵素コーディング配列が含有されたプラスミドは、酵素変異体をコードする配列により置換され、例えば、７ベータ−ＨＳＤＨ（Ｇ３９Ａ）コーティング配列は、別の７β−ＨＳＤＨ変異体配列、例えば配列番号９、１０、１１、１２、または１３による変異体あるいは本明細書に記載されたかまたは先行技術から公知の別の変異体をコードする配列により置き換えられ得る。
４． 生体触媒が何ら７α−ＨＳＤＨ酵素活性を発現しない（とりわけ、配列番号６によるものがない）、先行する実施形態の１つに記載の方法。
５． ７β−ＨＳＤＨ、３α−ＨＳＤＨ、およびＧＤＨが、外来性に発現された酵素活性であり、すなわち組換え微生物の内在性成分ではない（ホールセル生体触媒）、先行する実施形態の１つに記載の方法。
６． ７β−ＨＳＤＨ、３α−ＨＳＤＨ、および／またはＧＤＨが、野生型酵素または遺伝的に修飾された酵素（酵素変異体）である、先行する実施形態の１つに記載の方法。
７． 先行する実施形態の１つに記載の方法であって、これにおいて：
ａ）７β−ＨＳＤＨが、配列番号２のアミノ酸配列、またはこの配列に対し少なくとも６０％、例えば少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、または９０％、例えば少なくとも９１，９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または９９．５％の
配列同一性をもってそれから派生したアミノ酸配列；例えば本出願者のＷＯ２０１２／０８０５０４から公知の変異体、例えば単一変異体：Ｇ３９Ａ、Ｇ３９Ｓ、Ｇ３９Ｄ、Ｇ３９Ｖ、Ｇ３９Ｔ、Ｇ３９Ｐ、Ｇ３９Ｎ、Ｇ３９Ｅ、Ｇ３９Ｑ、Ｇ３９Ｈ、Ｇ３９Ｒ、Ｇ３９ＫおよびＧ３９Ｗ、ならびにＲ４０Ｄ、Ｒ４０Ｅ、Ｒ４０Ｉ、Ｒ４０Ｖ、Ｒ４０Ｌ、Ｒ４０Ｇ、およびＲ４０Ａ
二重変異体：（Ｇ３９Ｄ，Ｒ４０Ｉ）、（Ｇ３９Ｄ，Ｒ４０Ｌ）、（Ｇ３９Ｄ，Ｒ４０Ｖ）、（Ｒ４０Ｄ，Ｒ４１Ｉ）、（Ｒ４０Ｄ，Ｒ４１Ｌ）、（Ｒ４０Ｄ，Ｒ４１Ｖ）、（Ｒ４０Ｉ，Ｒ４１Ｉ）、（Ｒ４０Ｖ，Ｒ４１Ｉ）および（Ｒ４０Ｌ，Ｒ４１Ｉ）、または
三重変異体（Ｇ３９Ｄ，Ｒ４０Ｉ，Ｒ４１Ｎ）、または
以下の実施形態２０〜２４で本明細書において新規に記載された多重変異体から選択される酵素変異体、に由来する配列を有し；
ｂ）３α−ＨＳＤＨが、配列番号４のアミノ酸配列、またはこの配列に対し少なくとも６０％、例えば少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、または９０％、例えば少なくとも９１，９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または９９．５％の
配列同一性をもってそれから派生したアミノ酸配列を有し；および／または
ｃ）ＧＤＨが、配列番号８によるアミノ酸配列、またはこの配列に対し少なくとも６０％、例えば少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、または９０％、例えば少なくとも９１，９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または９９．５％の配列同一性をもってそれから派生したアミノ酸配列を有する。
８． 生体触媒がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、特にＥ．ｃｏｌｉ株の微生物の組換え株である、先行する実施形態の１つに記載の方法。
９． ７β−ＨＳＤＨ、３α−ＨＳＤＨ、およびＧＤＨが、ＮＡＤ（Ｈ）およびＮＡＤＰ（Ｈ）から選択される同じかまたは異なる補因子を利用し；例えば、７β−ＨＳＤＨがＮＡＤＰ（Ｈ）を、３α−ＨＳＤＨがＮＡＤ（Ｈ）を、そしてＧＤＨがＮＡＤ（Ｈ）およびＮＡＤＰ（Ｈ）を利用する、先行する実施形態の１つに記載の方法。
１０． ＧＤＨが、７β−ＨＳＤＨによりかつ３α−ＨＳＤＨにより触媒される部分反応において消費される、補因子（ＮＡＤ（Ｈ）および／またはＮＡＤＰ（Ｈ）、とりわけＮＡＤ（Ｈ）およびＮＡＤＰ（Ｈ）の、少なくとも一部、とりわけ完全な再生ができる、先行する実施形態の１つに記載の方法。
１１． 反応が、緩衝された水性反応媒体中で、ｐＨ６〜８において行なわれる、先行する実施形態の１つに記載の方法。
１２． グルコースが、１０ｍＭ〜３０００ｍＭ、例えば１００〜１０００ｍＭの初濃度において使用される、先行する実施形態の１つに記載の方法。
１３． 反応が、連続的または不連続的に行なわれる、先行する実施形態の１つに記載の方法。
１４． 生体触媒が固定されていないか、または不活性な担体物質上に固定されている、先行する実施形態の１つに記載の方法。
１５． 反応媒体が、さらなる添加剤、例えばアルカリまたはアルカリ土類金属塩、低分子量多価アルコール、および／または緩衝剤を含有する、先行する実施形態の１つに記載の方法。とりわけ、１つ以上の添加剤、例えばアルカリまたはアルカリ土類金属塩、例えばＭｇＣｌ２（例えば、０〜２０、特に１〜１０ｍＭ）、および／または低分子量多価アルコール、例えばグリセリン０〜３０、特に１〜２０％（ｖ／ｖ）が、反応媒体へ添加され得る。さらに、緩衝物質、例えばトリス、酢酸塩、またはリン酸緩衝剤が１０〜５００ｍＭ、とりわけ２０〜１５０、または２５〜１００ｍＭの範囲内で、例えばリン酸ナトリウム緩衝剤もしくは特にリン酸カリウム酸緩剤が添加され得る。ここでｐＨは、５．５〜９、とりわけ６〜８、例えば７〜７．５に調整され得る。
１６． ホールセル生体触媒が、任意に、用いた反応媒体中ではもはや増殖できない、先行する実施形態の１つに記載の方法。
１７． ホールセル生体触媒が、反応媒体へそれが添加される前に、その細胞膜を破壊することによりそれを活性化することで得られる、実施形態１６に記載の方法。
ホールセル生体触媒の「活性化」には、いくつかの可能性がある。原則的には、膜のみが、例えば凍結融解によるか、または室温もしくは４℃での貯蔵によるか、または細胞膜を化学的もしくは機械的に穿孔することにより破壊されるべきである。
１８． 式（１）：
［式中、Ｒは、アルキル、Ｈ、アルカリ金属イオン、またはＮ（Ｒ３）４ ＋を表し、ここで、残基Ｒ３は、同じかまたは異なり、かつＨまたはアルキルを表し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置き換えられ、ここで、Ｒ１およびＲ２は、互いに独立してアルキル残基を表す］
のウルソデオキシコール酸化合物（ＵＤＣＡ）を産生するための方法であり、
これにおいて、
ａ）任意に、式（２）：
［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で、上記に定義されたように置き換えられる］のコール酸（ＣＡ）が、例えば化学的または酵素的に、とりわけ化学的に、式（３）：
［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で、上記に定義されたように置き換えられる］
のデヒドロコール酸化合物（ＤＨＣＡ）へ酸化され；
ｂ）ＤＨＣＡは、先行する実施形態の１つに記載されたような生体触媒法により、式（５）：
［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で、上記に定義されたように置き換えられる］
の対応する１２−ケト−ウルソデオキシコール酸化合物（１２−ケト−ＵＤＣＡ）へ還元され、次いで、
ｃ）式（５）の１２−ケト−ＵＤＣＡは、化学的にＵＤＣＡ化合物へ還元され；かつ
ｄ）反応生成物は、任意にさらに精製される。
１９． 酵素活性が、反応混合物中に以下の濃度範囲：
（１）７β−ＨＳＤＨ：１００〜３０００、例えば１００〜１５００、例えば５００〜１０００ Ｕ／ｇＢＤＭ
（２）３α−ＨＳＤＨ：５０〜５００、例えば１０〜３００ Ｕ／ｇＢＤＭ
（３）ＧＤＨ：１００〜２０００、例えば２００〜１０００ Ｕ／ｇＢＤＭ
において含有され、これにおいてＣＣａｔが０．０５〜５０、０．１〜１０、特に０．５〜５ｇＢＤＭＬ−１の範囲である、先行する実施形態の１つに記載の方法。
２０． ７−ケトステロイドの対応する７−ヒドロキシステロイドへの少なくとも立体特異的酵素的還元を触媒する、７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７β−ＨＳＤＨ）であり、これにおいて該酵素が、配列番号２の位置Ｇ３９およびＲ４０のそれぞれにおいて、および任意に配列番号２の位置Ｒ４１および／または任意に位置Ｋ４４において、あるいは配列番号２と少なくとも８０％の、例えば少なくとも８５または９０の、例えばこの配列に対し少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または９９．５％の配列同一性をもってそれから派生したアミノ酸配列の、それぞれの対応する配列位置において変異を含む、該酵素。
２１． 二重変異Ｇ３９Ｄ／Ｒ４０Ｆを含む、実施形態２０に記載の７β−ＨＳＤＨ。
２２． 三重変異Ｇ３９Ｄ／Ｒ４０Ｆ／Ｒ４１Ｘ１を含み、これにおいて、Ｘ１は、任意の他のアミノ酸残基、特にタンパク質構成アミノ酸配列残基、とりわけＮＡＤＨ特異性を増す残基、特にＫ、Ｑ、Ｓ、またはＲ、および中でもＫを表す、実施形態２０または２１に記載の７β−ＨＳＤＨ。
２３． 四重変異Ｇ３９Ｄ／Ｒ４０Ｆ／Ｒ４１Ｘ１，／Ｋ４４Ｘ２［式中、Ｘ１は、任意の他のアミノ酸残基、特にタンパク質構成アミノ酸配列残基、とりわけＮＡＤＨ特異性を増す残基、特にＫ、Ｑ、Ｓ、またはＲ、および中でもＫを表し、またＸ２は、任意の他のアミノ酸残基、特にタンパク質構成アミノ酸配列残基、とりわけＮＡＤＨ特異性を増す残基、特にＧ、Ｎ、またはＱ、および中でもＧを表す］を含む、実施形態２０〜２２の１つに記載の７β−ＨＳＤＨ。
２４． 配列番号２の７β−ＨＳＤＨに比較して、以下の特性プロフィール：
ａ）ＮＡＤＨを補因子として用いる、ＤＨＣＡの酵素的還元において、ＮＡＤＨに対し増大された比活性（Ｖｍａｘ ［Ｕ／ｍｇ］）；および任意に
ｂ）ＮＡＤＨを補因子として用いる、７−ケトステロイド（特に、ステロイド環の位置Ｃ７にケト基をもつ胆汁酸塩）の酵素的還元において、ＮＡＤＨに対し増大された比活性（Ｖｍａｘ ［Ｕ／ｍｇ］）
を示す、実施形態２０〜２３の１つに記載の７β−ＨＳＤＨ。
２５． 実施形態２０〜２４の１つに記載の７β−ＨＳＤＨをコードするヌクレオチド配列。
２６． 少なくとも１つの調節配列の制御下にある実施形態２５に記載の少なくとも１つのヌクレオチド配列と、任意に、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、とりわけ３α−ＨＳＤＨ、および補因子再生に適したデヒドロゲナーゼ、例えばＦＤＨ、ＧＤＨ、ＡＤＨ、Ｇ−６−ＰＤＨ、またはＰＤＨから選択される少なくとも１つ（例えば１つ、２つ、または３つ）のさらなる酵素のためのコーディング配列とを含む、発現カセット。とりわけ、発現カセットに含有される酵素は、異なるがしかし好ましくは同一の補因子ペア、例えばＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ、またはＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ補因子ペアを利用し得る。
２７． 実施形態２６に記載の少なくとも１つの発現カセットを含む発現ベクター。
２８． 実施形態２５に記載の少なくとも１つのヌクレオチド配列、または実施形態２６に記載の少なくとも１つの発現カセット、または実施形態２７に記載の少なくとも１つの発現ベクターをもつ、組換え微生物。
２９． 加えて、任意に、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＨＳＤＨ）および補因子再生に適するデヒドロゲナーゼから選択される、少なくとも１つのさらなる酵素をコードするための配列をもつ、実施形態２８に記載の組換え微生物。
３０． さらなるＨＳＤＨが３α−ＨＳＤＨから選択され；かつデヒドロゲナーゼがＮＡＤＨ−再生酵素、例えばＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、およびＮＡＤＨ再生ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）、およびグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ−６−ＰＤＨ）、または亜リン酸デヒドロゲナーゼ（ＰｔＤＨ）、およびＮＡＤＨ再生グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）から選択される、実施形態２９に記載の組換え微生物。
３１． ７α−ＨＳＤＨノックアウト株である、実施形態２８〜３０の１つに記載の組換え微生物。
３２． 実施形態２８〜３０の１つに記載の微生物を用いて実施される、実施形態１〜１９の１つに記載の方法。
３３． ７β−ヒドロキシステロイドの酵素的または微生物的合成のための方法であって、これにおいて、対応する７−ケト−ステロイドが、実施形態２０〜２４の１つにおける定義による７β−ＨＳＤＨの存在下に、または実施形態２８〜３２の１つに記載のこの７β−ＨＳＤＨを発現する組換え微生物の存在下に還元され、かつ任意に、生成された少なくとも１つの還元産物が反応混合物から分離される、該方法。
３４． ７−ケトステロイドが、
デヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）、
７−ケト−リトコール酸（７−ケト−ＬＣＡ）、
７，１２−ジケト−リトコール酸（７，１２−ジケト−ＬＣＡ）、および
それらの誘導体、例えばとりわけ該酸の塩、アミド、またはアルキルエステル、
から選択される、実施形態３３に記載の方法。
３５． 還元が、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＰＨの存在下で、および特にＮＡＤＨおよび／またはＮＡＰＨの消費により；とりわけＮＡＤＨの消費によって起こる、実施形態３３または３４に記載の方法。
３６． 使用されたＮＡＤＨが、ＮＡＤＨ再生酵素と組合せることにより再生され、これにおいて、該酵素がとりわけ、ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、およびＮＡＤＨ再生ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）、およびＮＡＤＨ再生グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）から選択され、ここで、該ＮＡＤＨ再生酵素が任意に組換え微生物により発現され；
および／または、これにおいて、使用されたＮＡＤＰＨが、ＮＡＤＰＨ再生酵素と組合せることにより再生され、これにおいて、該酵素がとりわけ、ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰＨ再生ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）、ＮＡＤＰＨ再生アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、ＮＡＤＰＨ再生グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、ＮＡＤＨ再生亜リン酸デヒドロゲナーゼ（ＰｔＤＨ）、およびＮＡＤＰＨ再生グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）から選択され、ここで、該ＮＡＤＰＨ再生酵素が任意に組換え微生物により発現される、実施形態３５に記載の方法。
３７． ＮＡＤＰＨ再生酵素がＧＤＨから選択される、実施形態３６に記載の方法。
３８． 式（１）：
［式中、Ｒは、アルキル、Ｈ、アルカリ金属イオン、またはＮ（Ｒ３）４ ＋を表し、ここで、残基Ｒ３は、同じかまたは異なり、かつＨまたはアルキルを表し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置き換えられ、ここで、Ｒ１およびＲ２は、互いに独立してアルキル残基を表す］
のウルソデオキシコール酸化合物（ＵＤＣＡ）を産生するための方法であり、
これにおいて、
ａ）任意に、式（２）：
［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で、上記に定義されたように置き換えられる］のコール酸（ＣＡ）が、例えば化学的または酵素的に、とりわけ化学的に、式（３）：
［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で、上記に定義されたように置き換えられる］
のデヒドロコール酸化合物（ＤＨＣＡ）へ酸化され；
ｂ）ＤＨＣＡは、実施形態２０〜２４の１つにおける定義による少なくとも１つの７β−ＨＳＤＨ変異体の存在下に、および少なくとも１つの３α−ＨＳＤＨの存在下に、式（５）：
［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で、上記に定義されたように置き換えられる］
の対応する１２−ケト−ウルソデオキシコール酸（１２−ケト−ＵＤＣＡ）へ、特にＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの存在下およびＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨ消費により還元され、次いで、
ｃ）式（５）の１２−ケト−ＵＤＣＡが、化学的にＵＤＣＡへ還元され；そして
ｄ）反応生成物は、任意にさらに精製される。
３９． 少なくとも１つの工程ｂ）が、実施形態２８〜３２の１つに記載されたような組換え微生物の存在下に実施される、実施形態３９に記載の方法。
４０． 工程ｂ）が、同じかまたは異なる補因子再生系と組合される、実施形態３８または３９に記載の方法。
４１． 式（１）：
［式中、Ｒは、アルキル、ＮＲ１Ｒ２、Ｈ、アルカリ金属イオン、またはＮ（Ｒ３）４ ＋を表し、ここで、残基Ｒ３は、同じかまたは異なり、かつＨまたはアルキルを表し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で、上記に定義されたように置き換えられる］
のＵＤＣＡを産生するための方法であり、
これにおいて、
ａ）任意に、式（２）：
［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で、上記に定義されたように置き換えられる］のＣＡが、例えば化学的または酵素的に、とりわけ化学的に、式（３）：
［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で、上記に定義されたように置き換えられる］
のＤＨＣＡへ酸化され；
ｂ）ＤＨＣＡは、少なくとも１つの７β−ＨＳＤＨの存在下、および少なくとも１つの３α−ＨＳＤＨの存在下に、式（５）：
［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で、上記に定義されたように置き換えられる］
の対応する１２−ケト−ＵＤＣＡへ、特にＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの存在下およびＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの消費により還元され、次いで、
ｃ）式（５）の１２−ケト−ＵＤＣＡが、化学的にＵＤＣＡへ還元され；そして
ｄ）反応生成物は、任意にさらに精製され；
これにおいて、工程ｂ）の変換が、実施形態２８〜３２の１つに記載されたような組換え微生物の存在下に起こる。
本発明は、本明細書に記載された具体的な実施形態に限定されない。むしろ、本発明の教示を介し、当業者には本発明のさらなる構成を、受け入れ難い努力なし提供することが可能となる。したがって例えば、当業者はさらなる酵素変異体を意図的に発生させ、所望の特性プロフィール（改良された補因子依存性および／または安定性、低減された基質阻害）のためにこれらを選別および最適化し；あるいは、さらに適した野生型酵素（７β−および３α−ＨＳＤＨ、ＦＤＨ、ＧＤＨ、ＡＤＨなど）を分離して、本発明に従って使用することも可能である。さらに、例えば用いたＨＳＤＨ、例えば特に７β−ＨＳＤＨおよび３α−ＨＳＤＨ、またはそれらの変異体の、特性プロフィールに基づき、当業者は使用できるデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ、ＦＨＤ、ＡＤＨなど）、および補因子再生に適したその変異体を選択し、かつ選択された酵素を１つ以上の発現構築物またはベクター上に分布させ、それにより、必要であれば１つ以上の組換え微生物を作成でき、それが次に最適化されたホールセルベースの産生法を可能にする。
本発明のさらなる構成
１．一般的な定義および用いた略語
「ホールセル生体触媒」は、生存できる（任意の増殖段階において増殖できる）微生物、およびもはや生存できない微生物の双方、特に、発現された形態において、本発明の方法を実施するのに必要な酵素活性を完全に、または少なくとも部分的に含有する組換え微生物を含む。ここで、ホールセル生体触媒はさらに、周囲の反応媒体との物質（とりわけ基質、生成物、補因子）の交換をさらに促進する目的で、化学的、機械的、または他の作用（温度、貯蔵）により穿孔された細胞壁を有しうる。
別に指定しない限り、用語「７β−ＨＳＤＨ」は、ＤＨＣＡまたは７，１２−ジケト−ＵＤＣＡ（７，１２−ジケト−ＬＣＡ）の３，１２−ジケト−ＵＤＣＡまたは１２−ケト−ＵＤＣＡへの、特にＮＡＤＰＨの化学量論的消費による、少なくとも立体特異的および／または位置特異的還元、および任意に、対応する逆反応を触媒するデヒドロゲナーゼ酵素を示す。ここで、酵素は、天然かまたは組換えにより産生される酵素であってよい。酵素は原則的に、細胞性の、例えばタンパク質不純物と混合されていてもよいが、純粋な形態であることが好ましい。適切な検出法は、例えば以下の実験のセクションにおいて記載されるか、または文献から公知である（例えば、Characterization of NADP-dependent 7 beta-hydroxysteroid dehydrogenases from Peptostreptococcus productus and Eubacterium aerofaciens. S Hirano and N Masuda. Appl Environ Microbiol. 1982）。この活性をもつ酵素は、ＥＣ番号１．１．１．２０１に分類される。
別に指定しない限り、用語「３α−ＨＳＤＨ」は、３，１２−ジケト−ＵＤＣＡまたはＤＨＣＡの、１２−ケト−ＵＤＣＡまたは７，１２−ジケト−ＵＤＣＡ（７，１２−ジケト−ＬＣＡ）への、特にＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの化学量論的消費による、少なくとも立体特異的および／または位置特異的還元、および任意に、対応する逆反応を触媒するデヒドロゲナーゼ酵素を示す。適切な検出法は、例えば以下の実験のセクションにおいて記載されるか、または文献から公知である。適切な酵素は、例えばＣｏｍａｎｏｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ（例えばＡＴＣＣ１１９９６）から得ることが可能である。ＮＡＤＰＨ依存性３α−ＨＳＤＨは、例えばげっ歯類由来のものが公知であり、これもまた使用可能である。（Cloning and sequencing of the cDNA for rat liver 3 alpha-hydroxysteroid/dihydrodiol dehydrogenase, J E Pawlowski, M Huizinga and T M Penning, May 15, 1991 The Journal of Biological Chemistry, 266, 8820-8825）。この活性をもつ酵素は、ＥＣ番号１．１．１．５０に分類される。
別に指定しない限り、用語「ＧＤＨ」は、β−Ｄ−グルコースのＤ−グルコース−１，５−ラクトンへの、ＮＡＤ＋および／またはＮＡＤＰ＋の化学量論的消費による、少なくとも１つの酸化、および任意に、対応する逆反応を触媒するデヒドロゲナーゼ酵素を示す。適切な酵素は、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍから得ることが可能である。この活性をもつ酵素は、ＥＣ番号１．１．１．４７に分類される。
別に指定しない限り、用語「ＦＤＨ」は、ギ酸（または対応するギ酸塩）の二酸化炭素への、ＮＡＤ＋および／またはＮＡＤＰ＋の化学量論的消費による、少なくとも酸化、および任意に、対応する逆反応を触媒するデヒドロゲナーゼ酵素を示す。適切な検出方法は、例えば、以下の実験のセクションにおいて記載されるか、または文献から公知である。適切な酵素は、例えばＣａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ、またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｃｃａｅから得ることが可能である。この活性をもつ酵素は、ＥＣ番号１．２．１．２に分類される。
「純粋な形態」または「純粋」もしくは「本質的に純粋」な酵素は、本発明によれば、通常のタンパク質測定法、例えばビウレット法またはＬｏｗｒｙらによるタンパク質測定（R.K. Scopes, Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin (1982)における記載を参照）により測定された全タンパク質含量に基づき、８０ｗｔ．％を超え、好ましくは９０ｗｔ．％を超え、特に９５ｗｔ．％を超え、中でも９９ｗｔ．％を超える純度をもつ酵素を意味するものと理解される。
「レドックス等価物」は、電子供与体または電子受容体として使用可能な低分子量有機化合物、例えばニコチンアミド誘導体、例えばＮＡＤ＋およびＮＡＤＨ＋、またはそれぞれその還元型であるＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨを意味するものと理解される。「レドックス等価物」および「補因子」は、本発明に関しては同義語として使用される。したがって、本発明の意味における「補因子」は、また「レドックス対応因子」、すなわち還元型および酸化型で存在できる補因子としても記載され得る。
「消費された」補因子は、基質の所定の還元または酸化反応の過程において、それぞれ対応する酸化型または還元型へ変換される、還元型または酸化型の補因子を意味するものと理解される。反応において産生された酸化または還元された補因子型は、再生により、それぞれ還元または酸化された出発型へ戻し変換されるため、これが再び基質の変換に利用可能となる。
「修飾された補因子使用」は、本発明に関しては、基準との比較における定性的または定量的変化を意味するものと理解される。特に、アミノ酸配列の変異の実施を介した修飾された補因子使用が、観察されることとなる。この修飾は次に、未変異の出発酵素との比較において観察可能となる。ここで、特定の補因子に関する活性は、変異の実施により増大もしくは低減されるか、または完全に阻止され得る。しかしながら、修飾された補因子使用はまた、単一の補因子に対する特異性に代わり、もはや第１の補因子とは異なる少なくとも１つのさらなる第２の補因子が使用可能なようにする、タイプの変更も含む（すなわち、拡張された補因子使用が存在する）。しかしながら逆に、元から存在する２つの異なる補因子の利用能はまた、これらの補因子の１つだけについて特異性が増大されるか、あるいは１つの補因子について低減されるかまたは完全に除去されるように変更されることも可能である。したがって例えば、補因子ＮＡＤ（ＮＡＤＨ）に依存性である酵素が、補因子使用の変更の結果として、ＮＡＤ（ＮＡＤＨ）およびまた補因子ＮＡＤＰ（ＮＡＤＰＨ）の双方に依存するか、または元のＮＡＤ（ＮＡＤＨ）に対する依存性が完全にＮＡＤＰ（ＮＡＤＰＨ）に対する依存性に変更されるか、またその逆も可能である。
本発明によれば、別に指定しない限り、用語「ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ依存性」および「ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ依存性」は、幅広く解釈されるべきである。これらの用語は、双方の「特異的」な依存性、すなわち、それぞれＮＡＤ＋／ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨにのみに対する専用の依存性と、およびまた本発明により使用される酵素の双方の補因子、すなわちＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨに対する依存性とを含む。
同じことが、用いた用語「ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ受容性」および「ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ受容性」についてもそれぞれ適用される。
本発明によれば、別に指定しない限り、用語「ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ再生」および「ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ再生」は、広範囲に解釈される。これらの用語は、「特異的」、すなわち消費された補因子ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを専用に再生する能力と、およびまた双方の補因子、すなわちＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを再生する能力とを含む。
「タンパク質構成」アミノ酸は、とくに（一文字コード）：Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｐ、Ｍ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、およびＨを含む。
「固定化」は、本発明によれば、本発明により使用される生体触媒、例えば７β−ＨＳＤＨの、固体、すなわち周囲の液体媒体には本質的に不溶性の担体物質への、共有または非共有結合を意味する。したがって、本発明によれば、本発明により使用される組換え微生物などのホールセルもまた、かかる担体によって固定化され得る。
「未変異酵素に比較して低減された基質阻害」は、特定の基質に対し未変異酵素により観察される基質阻害剤が、もはや観察されないこと、すなわち、もはや本質的に測定できないか、またはより高い基質濃度、すなわち増大されたＫｉ値においてのみ起こることを意味する。
「コール酸化合物」は、本発明によれば、基本炭素骨格、特に、コール酸のステロイド構造をもち、かつ環の位置７および任意に環の位置３および／または１２に、ケトおよび／またはヒドロキシまたはアシルオキシ基が存在する化合物を意味する。
特別なタイプの化合物、例えば「コール酸化合物」または「ウルソデオキシコール酸化合物」は、特にまた、基礎となる出発化合物（例えばコール酸またはウルソデオキシコール酸）の誘導体も意味するものと理解される。
かかる誘導体は、「塩」、例えば化合物のアルカリ金属塩、例えばリチウム、ナトリウム、およびカリウム塩、およびアンモニウム塩を含み、ここでアンモニウム塩とは、ＮＨ４ ＋塩、および少なくとも１つの水素原子がＣ１−Ｃ６アルキル残基で置き換えられ得るアンモニウム塩を含む。典型的なアルキル残基は、特に、メチル、エチル、ｎ−またはｉ−プロピル、ｎ−、ｓｅｃ−、またはｔｅｒｔ−ブチルなどのＣ１−Ｃ４アルキル残基、およびｎ−ペンチルおよびｎ−ヘキシル、ならびにそれらの一回または複数回の分枝類似体である。
本発明の化合物の「アルキルエステル」は、特に低級アルキルエステル、例えばＣ１−Ｃ６アルキルエステルである。限定しない例としては、メチル、エチル、ｎ−もしくはｉ−プロピル、ｎ−、ｓｅｃ−、もしくはｔｅｒｔ−ブチルエステル、またはより長鎖のエステル、例えばｎ−ペンチルおよびｎ−ヘキシルエステル、ならびにそれらの一回または複数回の分枝類似体が挙げられる。
「アミド」は、特に、本発明による酸と、アンモニアまたは一級もしくは二級モノアミンとの変換産物である。かかるアミンは、例えばモノ−またはジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルモノアミンであり、これにおいて、アルキル残基は互いに独立して、例えばカルボキシ、ヒドロキシ、ハロゲン（例えばＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、ニトロ、およびスルホネート基により任意にさらに置換され得る。
本発明による「アルキル基」は、特に、２〜４個の炭素原子をもつ非芳香族基、例えばアセチル、プロピオニル、およびブチリル、ならびに任意に置換された単核芳香環をもつ芳香族基であり、これにおいて、適切な置換基は、例えばヒドロキシ、ハロゲン（例えばＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、ニトロ、およびＣ１−Ｃ６アルキル基、例えばベンゾイルまたはトルオイルから選択される。
本発明により使用されるかまたは産生されるヒドロキシステロイド化合物、例えばコール酸、ウルソデオキシコール酸、１２−ケト−ケノデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、および７−ケト−リトコール酸は、本発明の方法において、立体異性的に純粋な純粋形態か、または他の立体異性体と混合されて使用されるか、またはそれらから得られ得る。しかしながら好ましくは、使用される化合物または産生される化合物は、本質的に立体異性的に純粋な形態で使用されるかまたは単離される。
ここで用いた同義語は、ＣＤＣＳとＣＤＣＡ；ＵＤＣＳとＵＤＣＡ；ＤＨＣＳとＤＨＣＡ；ＮＡＤとＮＡＤ＋；ＮＡＤＰとＮＡＤＰ＋である。
「ＢＤＭ」は、細菌の乾燥質量を表す
以下の表１においては、基本的な化学化合物の構造式、その化学名、および略語が表形式で要約されている：
３，１２−ジケト−７−ベータ−コール酸は、３，１２−ジケト−ウルソデオキシコール酸（３，１２−ジケト−ＵＤＣＡ）の同義語である。
７，１２−ジケト−リトコール酸は、７，１２−ジケト−ウルソデオキシコール酸（７，１２−ジケト−ＵＤＣＡ）の同義語である。
２．タンパク質
本発明は、本明細書において具体的に開示された、特に７β−ＨＳＤＨ、ＦＤＨ、ＧＤＨ、または３α−ＨＳＤＨ活性をもつタンパク質および酵素、ならびにそれらの変異体に限定されず、むしろそれらの機能的等価物にも及ぶ。
本発明に関連して、具体的に開示された酵素の「機能的等価物」または類似体とは、例えば７β−ＨＳＤＨ活性などの所望の生物活性をさらにもつ、種々のポリペプチドである。
したがって例えば、「機能的等価物」は、７β−ＨＳＤＨ、ＦＤＨ、ＧＤＨ、または３α−ＨＳＤＨ活性に用いられる試験において、本明細書に定義されるアミノ酸配列を含む出発酵素よりも、少なくとも１％、例えば少なくとも１０％または２０％、例えば少なくとも５０％または７５％または９０％高いか低い活性を示す酵素であると理解される。
さらに、機能的等価物は、好ましくはｐＨ４〜１１の間で安定であり、かつ有利にはｐＨ６〜１０、とりわけ８．５〜９．５の範囲内に最適ｐＨを、また１５℃〜８０℃、または２０℃〜７０℃、例えば約４５〜６０℃、または約５０〜５５℃の範囲内に最適温度をもつ。
７β−ＨＳＤＨ活性は、種々の公知の試験により測定できる。これらに限定されるものではないが、実験のセクションにおいて記載されるような標準的な条件下で、参考基質、例えばＣＡまたはＤＨＣＡを用いる試験が挙げられる。
ＦＨＤ、ＧＤＨ、または３α−ＨＳＤＨ活性を測定するための試験もまた、それ自体が公知である。
「機能的等価物」は、本発明によればまた特に、前述のアミノ酸配列の少なくとも１つの配列位置において、具体的に言及されたもの以外のアミノ酸をもつにもかかわらず、前述の生物活性の１つをもつ「変異体」を意味するものと理解される。それ故、「機能的等価物」は、１つ以上の、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸の付加、置換、欠失、および／または逆位によって得られた変異体を含み、これにおいて、それらが本発明の特性プロフィールをもつ変異体をもたらす限り、前記修飾は任意の配列位置において起こりうる。機能的等価物は、特にまた、変異体と未修飾ポリペプチドとの間で反応性のパターンが定性的に一致する場合、すなわち、例えば同じ基質が異なる速度で変換される場合にも存在する。適切なアミノ酸置換の例は、以下の表２に要約される：
上記の意味での「機能的等価物」はまた、記載されたポリペプチドの「前駆体」、ならびにポリペプチドの「機能的誘導体」および「塩」でもある。
ここで「前駆体」は、所望の生物活性をもつかまたはもたない、ポリペプチドの天然または合成の前駆体である。
「塩」という表現は、本発明のタンパク質分子の、カルボキシル基の塩と、およびまたアミノ基の酸付加塩との双方を意味するものと理解される。カルボキシル基の塩は、それ自体が公知の方法で産生可能であり、また無機塩、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄、および亜鉛の塩、ならびに有機塩基、例えばアミン、例えばトリエタノールアミン、アルギニン、リジン、ピペリジンなどとの塩を含む。酸付加塩、例えば、塩酸または硫酸などの無機酸との塩、および、酢酸およびシュウ酸などの有機酸との塩もまた、本発明の対象である。
本発明のポリペプチドの「機能性誘導体」はまた、公知の技術により、機能性アミノ酸側基上に、またはＮ−もしくはＣ−末端に産生され得る。かかる誘導体は、例えばカルボン酸基の脂肪族エステル、アンモニアまたは第一級もしくは第二級アミン基との反応によって取得可能な、カルボン酸基のアミド；アシル基との反応により産生される、遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体；またはアシル基との反応により産生される、遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体を含む。
「機能的等価物」は、当然、他の生物体から利用可能なポリペプチド、および天然産の変異体も含む。例えば、相同配列領域の範囲は、配列比較により同定でき、同等の酵素が本発明の具体的な条件に基づき規定される。
「機能的等価物」はまた、例えば所望の生物学的機能をもつ、本発明のポリペプチドのフラグメント、好ましくは個々のドメイン、または配列モチーフも含む。
これとは別に、「機能的等価物」は融合タンパク質であり、これは、前記のポリペプチド配列の１つまたはそれに由来する機能的等価物、およびそれとは機能的に異なる少なくとも１つのさらなる異種配列を、機能性Ｎ−またはＣ−末端結合において有する（すなわち、融合タンパク質部分の有意な相互の機能的障害がない）。かかる異種配列の非限定的例は、例えばシグナルペプチド、ヒスチジンアンカー、または酵素である。
本発明による「機能的等価物」にはまた、具体的に開示されたタンパク質の相同体も含まれる。これらは、具体的に開示されたアミノ酸配列の１つに対し、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448.のアルゴリズムに従って計算された、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、とりわけ少なくとも８５％、例えば９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の相同性（または同一性）をもつ。本発明による相同ポリペプチドのパーセント相同性または同一性は、特に、本明細書において具体的に記載されたアミノ酸配列の１つの全長に対する、アミノ酸残基のパーセント同一性を意味する。
パーセント同一性の値はまた、ＢＬＡＳＴアラインメント、アルゴリズムｂｌａｓｔｐ（タンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ）に基づき、または以下に述べたｃｌｕｓｔａｌ設定を使用しても決定できる。
タンパク質のグリコシル化の可能性がある場合、本発明による「機能的等価物」は、上記記載のタイプのタンパク質の脱グリコシル化またはグリコシル化型、およびグリコシル化パターンの修飾により得られた修飾型を含む。
本発明によるタンパク質またはポリペプチドの相同体は、突然変異誘発により、例えば点突然変異、タンパク質の延長またはトランケーションにより作成され得る。
本発明によるタンパク質の相同体は、トランケーション変異体などの、変異体のコンビナトリアルバンクのスクリーニングにより同定され得る。例えば、タンパク質変異体の変化に富むバンクが、核酸レベルでのコンビナトリアルな突然変異誘発により、例えば合成オリゴヌクレオチド混合物の酵素的連結により作成され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から可能性のある相同体のバンクを生成するために使用可能な、数多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成は、ＤＮＡシンセサイザにおいて実施され得、また合成遺伝子は次に、適切な発現ベクター内へ連結され得る。縮重遺伝子セットの使用により、可能性のあるタンパク質配列の所望のセットをコードする、全ての配列を１つの混合中に提供することが可能となる。縮重オリゴヌクレオチドの合成法は、当業者に周知である（例えば、Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477）。
先行技術においては、点突然変異またはトランケーションにより生成されたコンビナトリアルバンクの遺伝子産物のスクリーニングのための、また選択された特性をもつ遺伝子産物用のｃＤＮＡバンクのスクリーニングのためのいくつかの技術が知られている。これらの技術は、本発明による相同体のコンビナトリアル突然変異誘発により作成された遺伝子バンクの、迅速なスクリーニングに適用され得る。ハイスループットを用いた分析に供される、大きい遺伝子バンクのスクリーニングに最も頻繁に使用される技術は、複製可能な発現ベクターにおける遺伝子バンクのクローニングと、得られたベクターバンクによる適切な細胞の形質転換と、および、その下での所望の活性の検出がその産物が検出された遺伝子をコードするベクターの分離を促進する条件下での、コンビナトリアル遺伝子の発現とを含む。バンク中の機能的変異体の頻度を拡大する技術、すなわち再帰的アンサンブル突然変異誘発（ＲＥＭ）を、スクリーニングテストと組合せて相同体を同定するために使用できる（Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331）。
本発明はさらに、本明細書において明確に参照される、本出願者による以前の国際特許出願であるWO2011/064404 （PCT/EP2010/068576）に記載されたような、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ ２５９８６由来の７β−ＨＳＤＨ野生型の使用も含む。
３．核酸および構築物
３．１ 核酸
本発明の対象はまた、本明細書に記載された７β−ＨＳＤＨ、ＦＤＨ、ＧＤＨ、および／または３α−ＨＳＤＨ活性をもつ酵素ならびにそれらの変異体をコードする、核酸配列も対象とする。
本発明はまた、本明細書に記載された具体的な配列に対し一定程度の同一性をもつ核酸にも関する。
２つの核酸間の「同一性」は、個々の全核酸長にわたるヌクレオチドの同一性、特にＩｎｆｏｒｍａｘ社（ＵＳ）からのＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｓｕｉｔｅ ７．１ Ｓｏｆｔｗａｒｅにより、ｃｌｕｓｔａｌ法（Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2):151-1）を使用し、以下のパラメータを設定して比較することにより計算される同一性を意味するものと理解される：
マルチプルアラインメントパラメータ：
ギャップオープニングパラメータ １０
ギャップエクステンションペナルティ １０
ギャップセパレーションペナルティ範囲 ８
ギャップセパレーションペナルティ オフ
アラインメント遅延のための％同一性 ４０
残基特異的ギャップ オフ
親水性残基ギャップ オフ
トランジション重み付け ０
ペアワイズアラインメントパラメータ：
ＦＡＳＴアルゴリズム オン
ｋ−ｔｕｐｌｅサイズ １
ギャップペナルティ ３
ウィンドウサイズ ５
ベストダイアゴナル数 ５
これに代えて、同一性はまた、Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Koike, Tadashi, Lopez, Rodrigo, Gibson, Toby J, Higgins, Desmond G, Thompson, Julie D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. (2003) Nucleic Acids Res 31 (13):3497-500, インターネットアドレス: http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#
に従い、かつ以下のパラメータを用いて決定できる：
ＤＮＡギャップオープンペナルティ １５．０
ＤＮＡギャップエクステンションペナルティ ６．６６
ＤＮＡマトリックス アイデンティティ
タンパク質ギャップオープンペナルティ １０．０
タンパク質ギャップエクステンションペナルティ ０．２
タンパク質マトリックス Ｇｏｎｎｅｔ
タンパク質／ＤＮＡ ＥＮＤＧＡＰ −１
タンパク質／ＤＮＡ ＧＡＰＤＩＳＴ ４
本明細書に述べられた全ての核酸配列（例えばｃＤＮＡおよびｍＲＮＡなどの、一本鎖および二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ配列）は、ヌクレオチド構成単位からの化学合成により、例えば二重らせんの個々の重複する相補的核酸構成単位のフラグメント縮合により、それ自体が公知の方法で産生できる。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えば、ホスホアミド法（Voet, Voet, 2nd Edition, Wiley Press New York, pages 896-897）により、公知の方法で実施され得る。合成オリゴヌクレオチドの付加、およびＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントによるギャップ充填、および連結反応、および一般クローニング法は、Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。
本発明の対象はまた、上記のポリペプチド配列およびそれらの機能的等価物の１つをコードする核酸配列（例えばｃＤＮＡおよびｍＲＮＡなどの、一本鎖および二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ配列）であり、これらは例えば人工のヌクレオチド類似体を用いて入手可能である。
本発明は、本発明のポリペプチドもしくはタンパク質、またはその生物活性セグメントをコードする単離された核酸分子と、およびまた、例えば本発明のコード核酸の同定もしくは増幅のためのハイブリダイゼーションプローブもしくはプライマーとして使用され得る核酸フラグメントとの双方に関する。
本発明の核酸分子はさらに、コード遺伝子領域の３’および／または５’末端からの非翻訳配列を含有し得る。
本発明はさらに、具体的に記載された核酸配列またはそのセグメントに対し、相補性である核酸分子を含む。
本発明のヌクレオチド配列は、他の細胞タイプおよび生物体における相同配列の同定および／またはクローニングのために使用可能なプローブおよびプライマーの作成を可能にする。かかるプローブおよびプライマーは、通常、「ストリンジェント」な条件下（以下を参照）で、本発明の核酸配列のセンス鎖の、または対応するアンチセンス鎖の、少なくとも約１２、好ましくは少なくとも約２５、例えば約４０、５０、または７５の連続するヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
「単離された」核酸分子は、該核酸の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離され、またさらに、それが組換え技術により産生される場合には、他の細胞性物質もしくは培地を本質的に含まないか、またはそれが化学合成される場合には、化学的前駆体または他の化学物質を含まないことができる。
本発明の核酸分子は、標準的な分子生物学の技術と、および本発明により提供された配列情報とにより単離できる。例えばｃＤＮＡは、具体的に開示された完全な配列またはそのセグメントの１つをハイブリダイゼーションプローブとして、また標準的なハイブリダイゼーション技術（例えば、Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edn., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されたような）を用いて適当なｃＤＮＡバンクから単離できる。さらに、開示された配列またはそのセグメントの１つを含む核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応により単離でき、これにおいて、この配列に基づき確立されたオリゴヌクレオチドプライマーが使用される。かくて増幅された核酸は、適当なベクター内へクローン化され、ＤＮＡ配列分析により特徴づけられる。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、標準的な合成法により、例えば自動ＤＮＡシンセサイザを用いて産生できる。
本発明の核酸配列またはその誘導体、相同体、またはこれらの配列の一部は、例えば、通常のハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ技術により、他の細菌から、例えばゲノムまたはｃＤＮＡバンクを介して単離できる。これらのＤＮＡ配列は、標準的な条件下で、本発明の配列とハイブリダイズする。
「ハイブリダイズ」は、ポリ−またはオリゴヌクレオチドが、標準的な条件下で、ほぼ完全に相補的な配列に結合する能力を意味するが、これらの条件下では、非相補的な相手との間の非特異的結合は起こらない。このためには、配列は９０〜１００％の相補性であり得る。相補的配列が互いに特異的に結合する特性は、例えば、ノーザンもしくはサザンブロット技術において、またはＰＣＲもしくはＲＴ−ＰＣＲにおけるプライマー結合において利用される。
ハイブリダイゼーションには、保存領域の短いオリゴヌクレオチドが有利に使用される。しかしながら、本発明の核酸のより長いフラグメントまたは完全配列は、ハイブリダイゼーションに使用できる。用いる核酸（オリゴヌクレオチド、より長いフラグメント、または完全配列）に依存して、あるいはどの核酸種、ＤＮＡまたはＲＮＡ、がハイブリダイゼーションに使用されるかに依存して、これらの標準的な条件は異なる。それ故例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの融点は、同じ長さのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのものよりも約１０℃低い。
標準的な条件は、例えば核酸に依存して、０．１〜５ｘＳＳＣ（１ Ｘ ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）の間の濃度の緩衝水溶液中では４２〜５８℃の間、またはさらに、５０％ホルムアミドの存在下では、例えば５ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド中では４２℃の温度を意味するものと理解されるべきである。有利には、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、０．１ｘＳＳＣ、および約２０℃〜４５℃の間の温度であり、好ましくは約３０℃〜４５℃の間である。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドについては、ハイブリダイゼーション条件は、有利には０．１ｘＳＳＣ、および約３０℃〜５５℃の間の温度であり、好ましくは約４５℃〜５５℃の間である。ハイブリダイゼーションについてこれらの示された温度は、ホルムアミド不在下で、約１００ヌクレオチド長と、５０％のＧ＋Ｃ含量とをもつ核酸について計算された融点である。ＤＮＡハイブリダイゼーションのための実験条件は、関連する遺伝学の教科書、例えばSambrook et al., “Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989に記載されており、また当業者に公知の式に従い、例えば核酸の長さ、ハイブリッドの特性、またはＧ＋Ｃ含量に依存して計算され得る。当業者は、ハイブリダイゼーションについてのさらなる情報を以下の教科書から得ることができる：Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
「ハイブリダイゼーション」は、とりわけストリンジェントな条件下で起こり得る。かかるハイブリダイゼーション条件は、例えばSambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57、または Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.に記載されている。
「ストリンジェント」なハイブリダイゼーション条件は、特に：５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０ｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での、４２℃で一晩のインキュベーションと、それに続く０．１ｘＳＳＣを用いた６５℃におけるフィルタの洗浄工程であることが理解される。
本発明の対象はまた、具体的に開示されたかまたは誘導可能な核酸配列の誘導体である。
それ故、本発明のさらなる核酸配列は、例えば、配列番号１、３、または７から誘導され得、それらとは単一または数個のヌクレオチドの付加、置換、挿入、または欠失により異なるが、なお所望の特性プロフィールをもつポリペプチドをコードする。
また本発明により、いわゆるサイレント変異を含むか、または、特定の供給源もしくは宿主生物体のコドン利用により、例えばそのスプライス変異体もしくはアレル変異体などの天然産変異体と同様に、具体的に挙げた配列との比較において改変された核酸配列も含まれる。
また、対象は、保存的ヌクレオチド置換（すなわち、関係するアミノ酸が、同じ電荷、サイズ、極性および／または溶解度のアミノ酸により置き換えられる）により得られる配列でもある。
本発明の対象はまた、具体的に開示された核酸から配列多型により誘導された分子でもある。これらの遺伝的多型は、自然変動のために集団内の個体間に存在し得る。これらの自然変動は、通常、遺伝子のヌクレオチド配列中に１〜５％の変動を引き起こす。
本発明の核酸配列の誘導体は、例えば、誘導されたアミノ酸レベルにおいて、少なくとも６０％相同性、好ましくは少なくとも８０％相同性、非常に特別に好ましくは少なくとも９０％相同性を、全配列領域にわたり示すアレル変異体を意味するものと理解されるべきである（アミノ酸レベルにおける相同性についはポリペプチドに関する上記の説明を参照）。配列の部分領域にわたり、有利には相同性はより高くなり得る。
さらに、誘導体はまた、本発明の核酸配列の相同体、例えば真菌もしくは細菌相同体、トランケートされた配列、またはコードおよび非コードＤＮＡ配列の一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡを意味するものと理解されるべきである。したがって例えば、相同体は、ＤＮＡレベルにおいて、示した全ＤＮＡ領域にわたり、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、特に好ましくは少なくとも７０％、非常に特別に好ましくは少なくとも８０％の相同性をもつ。
さらに、誘導体はまた、プロモーターとの融合体も意味するものと理解されるべきである。示したヌクレオチド配列の上流に結合されるプロモーターは、少なくとも１つのヌクレオチド置き換え、少なくとも１つの挿入、逆位、および／または欠失により修飾され得るが、しかしプロモーターの機能性および有効性が損なわれることはない。さらに、プロモーターの有効性は、それらの配列における修飾により増大され得、あるいはそれらはまた他種の生物体のより有効なプロモーターにより完全に置き換えられ得る。
さらに、機能性変異体を作成するための方法は、当業者には公知である。
用いた技術に依存して、当業者は、完全にランダムかまたはより標的化された変異を、遺伝子または非コード核酸領域（例えば発現の調節に重要であるもの）内へ導入して、遺伝子バンクを生じ得る。これに必要な分子生物学的方法は、当業者には公知であり、例えば、Sambrook and Russell, Molecular Cloning. 3rdEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001に記載されている。
遺伝子の修飾と、およびそれ故これらによりコードされたタンパク質の修飾のための方法は、当業者には長年にわたり熟知されており、例えば以下の通りである：
−遺伝子の単一または数個のヌクレオチドが交換される、部位特異的突然変異誘発（Trower MK (Publ.) 1996; In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey）、
−遺伝子の任意の部位において任意のアミノ酸のためのコドンが交換または付加される、飽和突然変異（Kegler-Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22:1593; Barettino D, Feigenbutz M, Valcarel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22:541; Barik S (1995) Mol Biotechnol 3:1）、
−不適切に動作するＤＮＡポリメラーゼによりヌクレオチド配列が変異される、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応（エラープローンＰＣＲ）（Eckert KA, Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18:3739）、
−例えば、欠陥のあるＤＮＡ修復メカニズムによりヌクレオチド配列の変異率の増加が起こる、突然変異誘発株における遺伝子の継代（Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain. In: Trower MK (Publ.) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey）、または
−密に関連した遺伝子のプールが形成および消化されて、フラグメントがポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として使用され、これにおいて、反復する鎖分離および再接近により、完全長のモザイク遺伝子が最終的に作成される、ＤＮＡシャフリング（Stemmer WPC (1994) Nature 370:389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:10747）。
いわゆる定向進化（特に、Reetz MT and Jaeger K-E (1999), Topics Curr Chem 200:31; Zhao H, Moore JC, Volkov AA, Arnold FH (1999), Methods for optimizing industrial enzymes by directed evolution, In: Demain AL, Davies JE (Publ.) Manual of industrial microbiology and biotechnology. American Society for Microbiologyに記載）を用いて、当業者はまた機能性変異体を、標的化された方法でかつまた大規模に作成できる。これにおいては、最初の工程において、該当するタンパク質の遺伝子バンクが作成され、ここで、例えば上記記載の方法が使用できる。遺伝子バンクは、適当な方法で、例えば、細菌によるかまたはファージディスプレイシステムにより発現される。
所望の特性に大部分一致する特性をもつ機能性変異を発現する、宿主生物体の関連遺伝子は、さらなる突然変異のラウンドに供され得る。突然変異および選別もしくはスクリーニングの工程は、存在する機能性変異体が所望の特性を充分な程度もつまで、相互作用的に反復され得る。この相互作用的様式の操作により。限られた数の突然変異、例えば１〜５個の突然変異が段階的に実施され、該当する酵素特性に対するそれらの影響について評価および選別され得る。選別された変異体は、次に同じ方法で更なる突然変異工程に供され得る。この方法で、試験されるべき個々の変異体の数を著しく減らし得る。
本発明による結果は、所望の修飾された特性をもつさらなる酵素を計画的に発生させるために必要な、関連酵素の構造および配列について、重要な情報をもたらす。特に、いわゆる「ホットスポット」、すなわち標的化された突然変異の導入により酵素特性を修飾するのに潜在的に適した配列セグメント、を規定できる。
３．２ 構築物
本発明の対象はまた、調節核酸配列の遺伝子制御下にある本発明の少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸配列を含有する発現構築物、およびこれらの発現構築物の少なくとも１つを含むベクターである。
本発明によれば、「発現ユニット」は、発現活性をもつ核酸を意味するものと理解され、これは、本明細書で定義されたような、また発現されるべき核酸または遺伝子との機能的連結の後、発現、すなわちこの核酸または遺伝子の転写および翻訳を調節する、プロモーターを含む。それ故これに関連して、これは、「調節核酸配列」とも記載される。プロモーターに加えて、例えばエンハンサーなどのさらなる調節エレメントも含まれ得る。
本発明によれば、「発現カセット」または「発現構築物」は、発現されるべき核酸または発現されるべき遺伝子に、機能的に連結された発現ユニットを意味するものと理解される。それ故発現ユニットとは対照的に、発現カセットは転写および翻訳を調節する核酸配列のみならず、転写および翻訳の結果、タンパク質として発現されるべき核酸配列も含む。
本発明に関しては、用語「発現」または「過剰発現」は、対応するＤＮＡによりコードされた１つ以上の酵素の、微生物体における産生または細胞内活性の増大を記述する。このためには、例えば遺伝子が生物体内へ導入されるか、既存の遺伝子が異なる遺伝子で置き換えられるか、遺伝子もしくは複数の遺伝子のコピー数が増大されるか、強力なプロモーターが使用されるか、または高い活性をもつ対応する酵素をコードする遺伝子の使用が可能であり、かつこれらの方策を任意に組合せてもよい。
好ましくは、本発明によるかかる構築物は、特定のコード配列から５’上流にプロモーター、および３’下流にターミネーター配列を、また任意にさらなる通常の調節エレメントを含み、これらはそれぞれコード配列に動作的に連結されている。
本発明によれば、「プロモーター」、「プロモーター活性をもつ核酸」、または「プロモーター配列」は、転写されるべき核酸との機能的連結において、この核酸の転写を調節する核酸を意味するものと理解される。
これに関連して、「機能的」または「動作的」な連結は、例えば、プロモーター活性をもつ核酸の１つと、転写されるべき核酸配列と、および任意にさらなる調節エレメント、例えば核酸の転写を保証する核酸配列、および例えばターミネーター配列とが、それぞれの調節エレメントが核酸配列の転写においてその機能を果たし得るような様式で、連続的配置されることを意味するものと理解される。このためには、化学的意味での直接的な結合が絶対に必要というわけではない。例えばエンハンサーなどの遺伝子調節配列はまた、標的配列に対するそれらの機能をより遠い位置から、または別のＤＮＡ分子からでも及ぼし得る。転写されるべき核酸配列がプロモーター配列の後ろに（すなわち３’末端に）位置して、２つの配列が互いに共有結合されるようにする配列が好ましい。ここで、プロモーター配列と、遺伝子導入的に発現されるべき核酸配列との間の距離は、２００塩基対未満、または１００塩基対未満、または５０塩基対未満でよい。
プロモーターおよびターミネーターと同様、さらなる調節エレメントとして、標的化配列、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー、増幅シグナル、複製開始点などが挙げられるべきである。適当な調節配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。
本発明による核酸構築物は、配列番号１、３、または７、あるいはその誘導体および相同体、およびそれらに由来する核酸配列を含み、これらは有利には、遺伝子発現を制御、例えば増大するための１つ以上の調節シグナルと、動作的または機能的に連結される。
これらの調節配列に加えて、これらの配列の天然の調節がなお、実際の構造遺伝子の前に存在し、かつ任意に遺伝的に改変され、天然の調節がサイレント化されて遺伝子の発現が増大されるようにし得る。しかしながら核酸構築物はまた、より単純に組込まれることも可能であり、すなわち、コード配列の前には何ら追加の調節シグナルは挿入されず、かつ天然のプロモーターはその調節とともに除去されることはなかった。この代わりに、天然の調節配列は、調節がもはや起こらず、遺伝子発現が増大するように突然変異される。
好ましい核酸構築物は、有利にはまた、プロモーターと機能的に連結された１つ以上の既に述べた「エンハンサー」配列を含み、これにより、核酸配列の増大された発現が可能となる。また、ＤＮＡ配列の３’末端では、さらなる調節エレメント、またはターミネーターなどの、さらなる有利な配列が挿入され得る。本発明の核酸は、構築物中に１つ以上のコピーで含有され得る。なおさらなるマーカー、例えば抗生物質耐性または栄養要求性を補充する遺伝子が、任意に構築物を選択するために構築物中に含有されてもよい。
適切な調節配列の例は、グラム陰性菌において有利に使用される、ｃｏｓ−、ｔａｃ−、ｔｒｐ−、ｔｅｔ−、ｔｒｐ−ｔｅｔ−、ｌｐｐ−、ｌａｃ−、ｌｐｐ−ｌａｃ−、ｌａｃＩｑ−、Ｔ７−、Ｔ５−、Ｔ３−、ｇａｌ−、ｔｒｃ−、ａｒａ−、ｒｈａＰ （ｒｈａＰＢＡＤ）ＳＰ６−、ラムダ−ＰＲ−などのプロモーター中に、またはラムダ−ＰＬ プロモーター中に含有される。さらなる有利な調節配列は、例えばグラム陽性菌プロモーター、ａｍｙおよび ＳＰＯ２中に、また酵母または真菌プロモーター ＡＤＣ１、 ＭＦａｌｐｈａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８ およびＡＤＨ中に含有される。人工的なプロモーターもまた、調節に使用され得る。
宿主生物体における発現のためには、核酸構築物は有利には、宿主における遺伝子の最適な発現を可能にする、プラスミドまたはファージなどのベクター内へ挿入される。プラスミドおよびベクターとは別に、ベクターはまた当業者には公知の全ての他のベクター、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルス、およびアデノウィルスなどのウイルス、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミド、および直鎖もしくは環状ＤＮＡなどを意味するものと理解されるべきである。これらのベクターは、宿主生物体内で自律的に複製するか、または染色体的に複製され得る。これらのベクターは、本発明のさらなる構成を表す。
適当なプラスミドは、例えばＥ. ｃｏｌｉ におけるｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１, λｇｔ１１、または ｐＢｄＣＩ；ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓにおけるｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２、またはｐＩＪ３６１；ＢａｃｉｌｌｕｓにおけるｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４ 、またはｐＢＤ２１４；ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍにおけるｐＳＡ７７、またはｐＡＪ６６７；真菌における ｐＡＬＳ１、ｐＩＬ２、または ｐＢＢ１１６、酵母における２ａｌｐｈａＭ、ｐＡＧ−１、ＹＥｐ６、ＹＥｐ１３、またはｐＥＭＢＬＹｅ２３、あるいは植物におけるｐＬＧＶ２３、ｐＧＨｌａｃ＋、ｐＢＩＮ１９、ｐＡＫ２００４、または ｐＤＨ５１である。前記プラスミドは、可能なプラスミドを小規模に選んだものである。さらなるプラスミドが当業者には周知であり、例えば、書籍Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ （Ｅｄｓ. Ｐｏｕｗｅｌｓ Ｐ. Ｈ. ｅｔ ａｌ. Ｅｌｓｅｖｉｅｒ, Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ, １９８５, ＩＳＢＮ ０ ４４４ ９０４０１８）から選択できる。
ベクターのさらなる構成においては、本発明の核酸構築物、または本発明の核酸を含有するベクターはまた、有利には、直鎖ＤＮＡの形態で微生物内へ導入され、かつ異種組換えまたは同種組換えにより、宿主ゲノム内へインテグレートされ得る。この直鎖ＤＮＡは、直鎖化されたベクター、例えばプラスミドから、または単に本発明の核酸構築物もしくは核酸のみから構成され得る。
生物体における異種遺伝子の最適の発現には、該生物体において使用される特異的な「コドン使用」に従って核酸配列を修飾することが有利である。「コドン使用」は、該当する生物体の他の既知の遺伝子のコンピュータ評価に基づき容易に決定できる。
本発明による発現カセットの産生は、適当なプロモーターの、適当なコードヌクレオチド配列と、およびターミネーターまたはポリアデニル化シグナルとの融合により行なわれる。標準的な組換えおよびクローニング技術が、このために使用され、例えば、T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) において、および T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) において、および Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) において記載されている。
適当な宿主生物体における発現には、組換え核酸構築物または遺伝子構築物は、有利には、宿主における遺伝子の最適発現を可能にする宿主特異的ベクター内へ挿入される。ベクターは、当業者に周知であり、例えば、”Cloning Vectors” (Pouwels P. H. et al., Eds., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) から選択可能である。
４． 微生物
状況に応じて、用語「微生物」は、出発微生物（野生型）、もしくは遺伝的に改変された組換え微生物、または双方を意味するものと理解できる。
本発明のベクターにより、組換え微生物を産生可能であり、これらは例えば、本発明の少なくとも１つのベクターを用いて形質転換され、かつ本発明のポリペプチドの産生のために使用され得る。有利には、上記記載の組換え構築物は、適当な宿主系内へ導入され、かつ発現される。これにおいて、当業者には公知の標準的なクローニングおよびトランスフェクション法、例えば共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどが、好ましくは、前記核酸を特定の発現系における発現へ導くのに使用される。適当な系は、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Publ., Wiley Interscience, New York 1997, または Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edn., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 に記載されている。タンパク質の異種発現のための細菌の発現系についての概説は、例えば、Terpe, K. Appl. Microbiol. Biotechnol. (2006) 72: 211-222 により提供されている。
本発明の核酸または核酸構築物のための組換え宿主生物体としては、原則的には全ての原核生物または真核生物が可能である。有利には、細菌、真菌、または酵母などの微生物が、宿主生物体として使用される。有利には、グラム陽性またはグラム陰性細菌、好ましくは、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、またはＮｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ科の細菌、特に好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、 Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、または Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌が使用される。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの属および種が、非常に特に好ましい。さらなる有利な細菌が、αプロテオバクテリア、またはベータプロテオバクテリア、またはガンマプロテオバクテリアの群においてさらに見いだされる。
本発明の宿主生物体、または複数の宿主生物体は、ここでは、好ましくは、上記の定義に従って７β−ＨＳＤＨ活性をもつ酵素をコードする、少なくとも１つの核酸配列、核酸構築物、またはベクターを含む。
本発明の方法において使用される生物体は、宿主生物体に依存して、当業者に公知の方法で増殖または培養される。微生物は、原則として、主として糖の形態にある炭素源、主として酵母エキスなどの有機窒素源または硫酸アンモニウムなどの塩の形態にある窒素源、鉄、マンガン、およびマグネシウム塩などの微量元素、および任意にビタミンを含有する液体培地中で、０℃と１００℃の間、好ましくは１０℃と６０℃の間の温度において、酸素を通気して増殖される。この間に、栄養液のｐＨは固定値に保持され、言い換えれば培養中に調節してもしなくてもよい。培養は、「バッチ法」、「半バッチ法」、または連続的に実施され得る。栄養物は、発酵開始時に与えられるか、またはさらに半連続的または連続的に与えられてもよい。
それらを使用するまで、本発明による生物体は適切に、例えば−２０℃で凍結された状態で；あるいはまた凍結乾燥物として保存してもよい。使用には、凍結された培養物は室温にされ、任意に１回以上の凍結／融解サイクルを実施するのもよい。凍結乾燥された標品は、さらなる使用に向けて、緩衝溶液などの適当な液体媒体中で溶解／懸濁され得る。
５．ＵＤＣＡの産生
第１工程：ＣＡのＤＨＣＡへの化学的変換
ＣＡのヒドロキシ基は、クロム酸または酸性溶液（例えばＨ２ＳＯ４）中のクロム酸塩を用いて、古典的な化学的経路により、それ自体が公知の方法でカルボニル基へ酸化される。結果としてＤＨＣＡが生成される。
第２工程：ＤＨＣＡの１２−ケト−ＵＤＣＡへの酵素的または微生物的変換
水溶液中では、ＤＨＣＡは、３α−ＨＳＤＨおよび７β−ＨＳＤＨまたはそれらの変異体により、それぞれＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの存在下に、１２−ケト−ＵＤＣＡへ特異的に還元される。補因子ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨは、ＡＤＨまたはＦＤＨまたはＧＤＨまたはその変異体により、イソプロパノールまたはギ酸ナトリウムまたはグルコースから再生され得る。反応は穏やかな条件下で進行する。例えば、反応はｐＨ６〜９、とりわけ約ｐＨ＝８において、また約１０〜３０、１５〜２５、または約２３℃において行なわれ得る。
微生物変換工程の場合、必要な酵素活性を発現する組換え微生物は、変換されるべき基質（ＤＨＣＡ）の存在下に、適当な液体培地中で、嫌気的または好気的に培養され得る。適当な培養条件は、それ自体当業者には公知である。それらは、例えば５〜１０、６〜９のｐＨ範囲、１０〜６０、または１５〜４５、または２５〜４０の温度範囲、または３７℃における変換を含む。適当な培地は、例えば、以下に記載されるＬＢおよびＴＢ培地を含む。ここでの変換期間は、例えばバッチ式もしくは連続式で、または他の通常の方法の変形（上記記載）で行なわれ得る。変換期間は、例えば、数分から数時間または数日の範囲内であり、また例えば１時間〜４８時間であり得る。酵素活性が連続的に発現されない場合には、任意に、標的細胞密度が例えば約ＯＤ６００＝０．５〜１．０に達した後に、適当なインデューサーを添加することによりこれを開始してもよい。
発酵の操作、培地への添加、酵素固定化、および価値ある物質の分離に関する、微生物産生法のさらなる可能な適切な改変は、「酵素および変異体の産生」に関する以下のセクションからも選択できる。
第３工程：１２−ケト−ＵＤＣＡのＵＤＣＡへの化学的変換
１２−ケト−ＵＤＣＡの１２−カルボニル基は、Ｗｏｌｆｆ−Ｋｉｓｈｎｅｒ還元により、それ自体公知の方法で除去され、結果として１２−ケト−ＵＤＣＡからＵＤＣＡが生成される。この反応において、カルボニル基はまずヒドラジンを用いてヒドラゾンへ変換される。次に、ヒドラゾンは塩基（例えばＫＯＨ）の存在下で２００℃に加熱され、これにより窒素が除去されてＵＤＣＡが生成される。
６．酵素および変異体の組換え体産生
本発明の対象はまた、本発明のポリペプチド、またはその機能的、生物学的な活性フラグメントの組換え体産生のための方法であり、これにおいて、ポリペプチド産生微生物が培養され、任意にポリペプチドの発現が誘導され、そしてこれらが培養物から単離される。それ故ポリペプチドはまた、所望であれば大工業規模で製造され得る。
本発明により産生される微生物は、連続的に、あるいはバッチ法または流加培養もしくは反復流加培養において非連続的に培養され得る。公知の方法の要約は、Ｃｈｍｉｅｌによる教科書（Bioprozeβtechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1. Introduction to Bioprocess Technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)）またはＳｔｏｒｈａｓによる教科書（Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and Peripheral Equipment] (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)）に見出し得る。
用いるべき培地は、特定の株の要求性を適切に満たさねばならない。種々の微生物のための培地の記載は、American Society for Bacteriology manual "Manual of Methods for General Bacteriology" (Washington D. C., USA, 1981) に含まれている。
本発明に従って使用可能なこれらの培地は、通常、１つ以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン、および／または微量元素を含む。
好ましい炭素源は、単糖、二糖、または多糖類などの糖である。非常に良好な炭素源は、例えばグルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、サッカロース、ラフィノース、デンプン、またはセルロースである。糖はまた、糖蜜、または精糖の他の副産物などの、複合化合物を通して培地へ添加してもよい。種々の炭素源の混合物を添加することもまた有利であり得る。他の可能な炭素源は、例えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油、およびヤシ油などの油脂、パルミチン酸、ステアリン酸、またはリノール酸などの脂肪酸、例えばグリセリン、メタノール、またはエタノールなどのアルコール、例えば酢酸、または乳酸などの有機酸である。
窒素源は、通常、有機もしくは無機窒素化合物、またはこれらの化合物を含む物質である。窒素源の例は、アンモニアガス、または硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、もしくは硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸塩、尿素、アミノ酸、または、コーンスティープリカー、大豆粉、大豆タンパク質、酵母エキス、肉エキスなどの複合窒素源を含む。窒素源は、単独で、または混合物として使用できる。
培地中に含有され得る無機塩化合物は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅、および鉄の、塩化物、リン酸塩、または硫酸塩を含む。
硫黄源としては、例えば硫酸塩、亜硫酸塩、ジチオナイト、テトラチオナイト、チオ硫酸塩、硫化物などの無機硫黄含有化合物が、しかしまたメルカプタンおよびチオールなどの有機硫黄化合物もまた使用できる。
リン源としては、リン酸、リン酸二水素カリウム、もしくはリン酸水素二カリウム、または対応するナトリウム含有塩が使用できる。
キレート剤は、溶液中に金属イオンを保持する目的で、培地に添加され得る。特に適したキレート剤は、カテコールまたはプロトカテキュエートなどのジヒドロキシフェノール、またはクエン酸などの有機酸を含む。
本発明に従って使用される発酵培地は、通常、ビタミンまたは増殖プロモーターなどの他の増殖因子を含有し、これらは例えばビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸、およびピリドキシンを含む。増殖因子および塩は、酵母エキス、糖蜜、コーンスティープリカーなどの複合培地成分からしばしば誘導される。さらに、適当な前駆体を培地に添加してもよい。培地化合物の正確な組成は、特定の実験に強く依存し、それぞれの特定の事例のために個々に決定される。培地の最適化についての情報は、教科書"Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Publ. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp.53-73, ISBN 0 19 963577 3) から得ることが可能である。増殖培地はまた、商用供給業者から得ることもでき、例えばＳｔａｎｄａｒｄ １（Ｍｅｒｋ）またはＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ，ＤＩＦＣＯ）などである。
全ての培地成分は、熱（１．５ｂａｒおよび１２１℃で２０分間）によるか、または濾過滅菌により滅菌される。成分は一緒に、または必要であれば別個に滅菌されてもよい。全ての培地成分は、培養の開始時に存在してもよく、または任意に、連続的にもしくはバッチ式に添加してもよい。
培養の温度は、通常１５℃と４５℃の間、好ましくは２５℃〜４０℃であり、実験の間一定に保持されるか、または変更されてもよい。培地のｐＨは、５〜８．５の範囲にあり、好ましくは７．０前後にあるべきである。培養のためのｐＨは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、もしくはアンモニア水などの塩基性化合物、またはリン酸もしくは硫酸などの酸性化合物の添加により、培養中にコントロールされ得る。発砲をコントロールするため、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤が使用できる。プラスミドの安定性を維持するため、例えば抗生物質などの選択的に作用する物質を培地に添加してもよい。好気性の条件を維持する目的で、酸素または酸素含有ガス混合物、例えば周囲の空気が培養物へ導入される。培養温度は、通常、２０℃から４５℃である。培養は、所望の産物が最大に生成されるまで継続される。この目標は、通常１０時間から１６０時間の間に達成される。
発酵ブロスは、その後さらに処理される。必要に応じ、バイオマスが、例えば遠心分離、濾過、デカンテーション、またはこれらの方法の組合せなどの分離法により、完全にまたは部分的に発酵ブロスから除去されるか、あるいはその中に完全に放置されてもよい。
ポリペプチドが培地中に分泌されない場合には、細胞はまた破壊され、生成物はライセートから公知のタンパク質単離法により取得できる。細胞は、任意に、高周波超音波により、例えばフレンチプレス内などの高圧により、オスモリシスにより、界面活性剤、溶解酵素、もしくは有機溶媒の作用により、ホモジナイザーにより、または示した方法のいくつかの組合せにより破壊され得る。
ポリペプチドの精製は、Ｑセファロースクロマトグラフィーなどの分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性クロマトグラフィーなどの、既知のクロマトグラフ法、および限外濾過、結晶化、塩析、透析、および未変性ゲル電気泳動などの、他の通常の方法を用いて達成され得る。適当な方法は、例えば、Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden [Biochemical Work Methods], Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York、または、Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlinに記載されている。
組換えタンパク質の単離には、既定のヌクレオチド配列によりｃＤＮＡを延長し、したがって、例えばより簡単な精製に役立つ修飾されたポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする、ベクター系またはオリゴヌクレオチドを使用することが有利であり得る。かかる適当な修飾は、例えば、アンカーとして機能するいわゆる「タグ」、例えばヘキサヒスチジンアンカー、または抗体により抗原として認識され得るエピトープである（例えば、Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Pressに記載）。これらのアンカーは、例えばクロマトグラフィーカラム内に充填可能な、またはマイクロタイタープレート上もしくは別の支持体上で使用可能な、ポリマーマトリックスなどの固体担体上への、タンパク質の付着に役立ち得る。
同時に、これらのアンカーはまた、タンパク質の認識にも使用できる。タンパク質の認識のためには、これとは別に、蛍光色素などの通常のマーカー、基質との反応後に検出可能な反応産物を生成する酵素マーカー、または放射性マーカーが、単独で、またはアンカーと組合せて、タンパク質の誘導体化に使用できる。
７．酵素固定
本発明の酵素は、本明細書に記載の方法において、遊離で、または固定して使用できる。固定された酵素とは、不活性な担体上に固定された酵素を意味するものと理解される。適当な担体材料、およびその上に固定された酵素は、ＥＰ−Ａ−１１４９８４９、ＥＰ−Ａ−１ ０６９ １８３および ＤＥ−ＯＳ １００１９３７７３、およびそれらに引用された参考文献から公知である。この点に関しては、これらの明細書の開示全体が参照される。適当な担体材料は、例えば粘土、カオリナイトなどの粘土鉱物、珪藻土、パーライト、二酸化ケイ素、酸化アルミニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロース粉末、陰イオン交換物質、および、ポリスチレンなどの合成ポリマー、アクリル樹脂、フェノールホルムアルデヒド樹脂、ポリウレタン、ならびにポオリエチレンおよびポリプロピレンなどのポリオレフィンを含む。担体材料は、通常、担持された酵素の産生のために、微粉化された粒子の形態で使用され、多孔性の形態であることが好ましい。担体材料の粒径は、通常、５ｍｍ以下、とりわけ２ｍｍ以下である（粒度曲線）。同様に、デヒドロゲナーゼをホールセル触媒として使って、遊離または固定された形態を選択できる。担体材料は、例えばアルギン酸Ｃａ、およびカラギーナンである。酵素、およびまた細胞も、グルタールアルデヒドにより直接架橋され得る（ＣＬＥＡを生じる架橋）。同様にまたさらに、固定化法は、例えば、J. Lalonde and A. Margolin “Immobilization of enzymes” in K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol.III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim に記載されている。
実験のセクション：
Ａ． 一般的情報
１． 材料：
Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ ３９７９のゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ ２５９８６、以前の名称Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）は、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＤＳＭＺ）から入手した。ＵＤＣＡおよび７−ケト−ＬＣＡは、それ自体が公知の出発化合物であり、文献に記載されている。全ての他の化学物質および酵素は、様々な製造業者の市販の製品であった。
２． 微生物およびベクター：
２．１ 微生物
E. coli BL21(DE3) F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB -mB -)_(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])
E. coli BL49 F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB -mB -)_(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) hdhA::KanR
E. coli BLLiu F- ompT gal dcm lon
(=E. coli BL21ΔhdhA) hsdSB(rB -mB -) _(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) _hdhA
E. coli NovaBlue(DE3) endA1 hsdR17(rK12 - mK12 +) supE44 thi-1recA1 gyrA96 relA1lac [F’ proA+B+ lacIqZ M15::Tn10(TcR)]
E. coli NB13 endA1 hsdR17(rK12 - mK12 +) supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1lac [F’ proA+B+lacIqZ M15::Tn10(TcR)] hdhA::KanR
２．２ 発現ベクターおよびベクター構築物
発現プラスミド（図３参照）
p7(A)T3rG ( = p7(A)T3rG-A) (WO2012/080504参照)
p7(A)T3rG-K および
p7(A)T3TG (=p7(A)T3TG-A)
各々は、その中に７β−ＨＳＤＨ、３α−ＨＳＤＨ、およびＧＤＨがコードされた遺伝子がある発現カセットをもつが、異なる発現カセット構造をもち、異なる抗生物質抵抗性をもつ。これらのプラスミドは、任意に、宿主株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９、またはＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１、ΔｈｄｈＡ（双方とも本出願人のＷＯ ２０１２／０８０５０４またはＷＯ ２０１１／１４７９５７から公知）において使用された。
かくて修飾された以下の株が使用された：
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧ、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ΔｈｄｈＡ ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧ−Ｋ
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐ７（Ａ）Ｔ３ＴＧ
３． 微生物学的方法
別に指定しない限り、分子生物学的操作は、例えば、Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edn., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990) に記載された、確立された方法に基づき実施される。
３．１ シェーカーフラスコ内でのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの培養
組換えタンパク質の発現には、まず、適当な抗生物質を加えた５ｍＬのＬＢ培地に、細菌コロニーまたは凍結培養物を接種し、次に３０℃および２００ｒｐｍで一夜インキュベートした。翌日、適当な抗生物質を加えた１００〜２００ｍＬのＴＢ培地に、１〜５ｍＬの一夜培養物を接種し、３７℃および２５０ｒｐｍでインキュベートした。０．６〜０．８のＯＤ６００の達成時に、組換えタンパク質の発現を１ｍＭ ＩＰＴＧの添加により誘導し、培養物を２５℃および１６０ｒｐｍでさらに２１時間インキュベートした。
３．２ ７．５Ｌの攪拌槽型反応器でのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの培養
ホールセル生体触媒のリットルスケールでの培養は、Ｉｎｆｏｒｓ ＡＧ（Infors 3, Bottmingen, Switzerland）製の攪拌槽型反応器（Ｖ＝７．５Ｌ）内で行なわれた。反応器には、温度、ｐＨ、およびｐＯ２のためのプローブが具備され、これらのパラメータがコントロールユニットによりオンラインで読み取られ、かつ任意に調節可能なようにした。反応器は、コントロールユニットへ接続されたダブルジャケットにより温度コントロールされた。通気は、浸漬管により、または徹底した混合は、３つの６ブレードインペラにより行い、これらをリアクターカバー上のモータにより駆動した。加えて、基質および塩基（水酸化アンモニウム溶液、２５％（ｗ／ｖ））は、フィードポンプによりリアクタへ供給できた。
前培養
７．５Ｌの攪拌槽型反応器での培養には、合計２回の前培養段階を適用した。最初の前培養は、試験管内で、適当な抗生物質を加えた５ｍＬのＬＢ培地を用いて行なった。朝には、これに１００μＬの凍結培養物を接種し、３０℃および２００ｒｐｍで６〜１０時間、目に見える濁りが現れるまで培養した。次に、５００〜１００μＬの最初の前培養物を、Wilms et al. (2001)にならい、２００ｍＬの最小培地で満たした１Ｌの細首円錐フラスコ内へ移し、これを３７℃、２５０ｒｐｍで一夜インキュベートした（偏心距離５ｃｍ）。
バッチ相
攪拌槽型培養には、２．８〜３．８Ｌの最小培地と、１．５ｍＬの消泡剤（Antifoam 204, Sigma-Aldrich, Munich）とを満たした無菌の攪拌槽型反応器を使用し、そのプローブを培養開始の前に標準的な方法でキャリブレートした。これをバッチグルコース（終濃度２ｇＬ−１）および適当な抗生物質で処理し、次いで２００ｍＬの第２段階の前培養物を接種した。通気は、２Ｌ ｍｉｎ−１の圧縮空気を用いて開始時に行い、開始時の培養物のスターラー回転速度は２００ｒｐｍであった。ｐＯ２が３０％の閾値より下に低下すれば、スターラー回転速度を、１１００ｒｐｍの理論的最大値まで５ｒｐｍずつ追加的に上昇させた。ｐＨは、塩基（２５％ 水酸化アンモニウム、ｗ／ｖ）の添加により一方向的に７．０に調節するとともに、温度は３７℃に保持した。ｐＯ２の急激な上昇により特定されるバッチグルコースの消費後、基質制限供給期への移行が行なわれた。
基質制限増殖期
供給期の開始時に、圧縮空気による通気を５Ｌ ｍｉｎ−１に増大し、温度を３０℃に下げ、追加的なスターラー回転速度上昇のための閾値を２０％ｐＯ２に下げた。基質供給の計量は、特定の増殖率μ＝０．１５ｈｒｓ−１に基づき行なわれた。その供給培地は５００ｇＬ−１のグルコース、および９９ｇＬ−１のリン酸水素二アンモニウムを含有していた。
バイオマス収量は、０．４５ｇＢＤＭｇＧｌｃ −１と推定された。
基質制限増殖期の継続時間は、１９時間であった。この期の終了１時間前に、温度を２０℃に下げ、さらに、それぞれＶ０に基づき、３ｍＬ Ｌ−１の微量元素溶液、および２ｍＬ Ｌ−１の硫酸マグネシウム溶液（１Ｍ）を添加した。選択抗生物質としてアンピシリンを使用する場合、５０ｍｇ Ｌ−１アンピシリンも開始時に、また基質制限増殖期終了の１時間前にも添加した。
発現期
基質制限増殖期の終了後、発現期の開始時に、０．５ｍＭ ＩＰＴＧ（Ｖ０に基づく）の添加を行った。温度を２０℃に保ち、あらかじめ設定された増殖速度をμ＝０．０６ｈｒｓ−１に低下させた。さもなければｐＯ２≧２０％の酸素飽和を確保できないので１８時間後、フィード体積流量を最後の調整値において一定に保持した。３ｍＬ Ｌ−１の微量元素溶液、２ｍＬ Ｌ−１の硫酸マグネシウム溶液（１Ｍ）、および任意で５０ｍｇＬ−１のアンピシリンのさらなる添加を、発現期開始の８時間後に行なった。細胞は発現期開始の２４時間後に収穫し、任意で３０％グリセリン（ｖ／ｖ）で処理して、−２０℃に保存した。
３．３ ディープウェルプレート内でのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉライブラリの培養
ディープウェルプレート内でのＥ．ｃｏｌｉの培養には、まず、無菌の９６ウェルマイクロタイタープレート内で前培養を調製した。このため、１５０μＬの前培養培地（５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯで処理したＴＢ培地）を各ウェルに入れた。次いでこのウェルに、寒天平板から無菌の爪楊枝によりコロニーを接種した。マイクロタイタープレートを次に無菌の通気性フィルム（Breathe-Easy, Diversified Biotech, USA）で密閉し、３７℃で一夜、２００〜２５０ｒｐｍで一夜インキュベートした。インキュベーション後、マイクロタイタープレートを−８０℃においてストックプレートとして無菌保存した。タンパク質発現は、２．２ｍＬのウェル容積の９６ウェルと、方形のウェル開口とを備えた無菌のディープウェルプレートにおいて行なった。これには、適当な抗生物質を加えた６００μＬの無菌のＴＢ培地を、各ウェルに移し入れ、次いで各ウェルに、ストックプレートから１０μＬの前培養物を接種した。ディープウェルプレートを無菌の通気性フィルムで密閉し、３７℃で９時間、２００〜２５０ｒｐｍでインキュベートした。９時間のインキュベーション後、培養物をそれぞれ１００μＬの誘導溶液で処理した。次に、ディープウェルプレートを無菌の通気性フィルムで密閉し、３０℃でさらに２１時間、２００〜２５０ｒｐｍでインキュベートした。細胞を遠心分離（３０分間、３０００ｇ）により収穫した。細胞ペレットをさらなる使用まで−８０℃に保存した。
３．４ 系統維持
Ｅ．ｃｏｌｉの短期および中期の系統維持は、適当な選択抗生物質を加えたＬＢ寒天平板上で、４℃において行なった。長期の系統維持には、Ｅ．ｃｏｌｉ培養物をＬＢ培地中で増殖させること、およびそれらを対数増殖期（ＯＤ≦０．８）に２０％の無菌グリセリン（ｖ／ｖ）で処理することにより凍結培養物を調製し、１．５ｍＬの無菌の反応容器中に−８０℃で保存した。
３．５ 振動ミルでのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞破壊
振動ミルでのＥ．ｃｏｌｉの細胞破壊は、２ｍＬの反応容器内で行なった。これには、１ｍＬのガラスビーズ（直径０．２５〜０．５ｍｍ、Carl Roth, Karlsruhe）および１ｍＬの破壊されるべき細菌懸濁液を、各反応容器に入れ、これを次に振動ミル（MM 200, Retsch, Haan）内に取付け、３０Ｈｚで６分間振動させた。次いで、容器を４℃および１７８８０ｇにおいて１０分間ベンチ遠心分離機（Biofuge Stratos, Thermo Fischer Scientific, Waltham, USA）で遠心分離した。上清は、さらなる用途に向けて使用できた。
３．６ 高圧式ホモジナイザーでのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの細胞破壊
バイオリアクターでの培養物からの細胞を、高圧式ホモジナイザー（Ariete, GEA Niro Soavi, Lubeck）で破壊した。これには、細胞懸濁液をまず、５０Ｌのリン酸カリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）を充填した２００Ｌのステンレス鋼タンクに移し入れ、４℃に冷却した。破壊は、９５０ｂａｒの圧力および３００〜３５０Ｌ ｈｒ−１の体積流量で行ない、これを１５〜２０分後に１５０Ｌ ｈｒ−１に絞った。最初のパッセージの後、細胞ブロスを、４℃に冷却された第２の２００Ｌのステンレス鋼タンクに収集して２０℃未満に冷却し、５０Ｌのリン酸カリウム緩衝液を充填しかつ４℃に冷却した第３の２００Ｌのステンレス鋼タンクに移し入れた。次に、高圧式ホモジナイザーによる２回目のパッセージを上記記載のように実施した。
この方法は、高圧式ホモジナイザーによる１回のパッセージが培地を１０〜１５℃まで加熱することから、破壊中の細胞ブロスの温度が３５℃を超えないことを確認するべきである。第１の工程での細胞破壊に続き、細胞破壊片をディスク型遠心分離機（CAA 08, GEA Westphalia, Oelde）により分離した。これを、１００Ｌ ｈｒ−１の体積流量、０〜３ｂａｒのバックプレッシャー、および９９９秒の固体排出物の部分排出間隔において操作した。清澄な細胞ブロスを、１０Ｌのプラスチックキャニスターに分取して、さらなる使用に向けて−２０℃に保存した。
３．７ リゾチームを用いたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの細胞破壊
リゾチームを用いた酵素的細胞破壊には、ペレット化された細胞をディープウェルプレート内で、６００μＬの破壊緩衝液（５０ｍＭ ＫＰｉ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、７００００Ｕ ｍＬ−１のリゾチーム、５０Ｕ ｍＬ−１のＤＮＡｓｅＩ）中に再懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。次に、細胞破壊片をフロアスタンド遠心分離機（Rotixa 50 RS, Hettich, Tuttlingen）における遠心分離（３０分間、３０００ ｇ、４℃）により分離した。上清をさらなる検査に使用した。
４．分子生物学的方法
４．１ プラスミドＤＮＡの単離
プラスミドＤＮＡの単離は、ＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Sigma-Aldrich, Munich）を用いて実施した。これには、５ｍＬのＥ．ｃｏｌｉのＬＢ一夜培養物を、製造業者の指示に従って処理した。単離されたプラスミドＤＮＡの溶出には、７０℃に温度調節された１００μＬの無菌の再蒸留水を用いた。
４．２ ポリメラーゼ連鎖反応
ＤＮＡフラグメントの分離用増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、
Saiki R. K. et al. Science, 239:487-491, 1988の方法により実施した。反応混合物は、１〜２．５μＬの鋳型ＤＮＡ、０．５μＭの各オリゴヌクレオチド、０．２ｍＭの各デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、および０．０２ＵμＬ−１のＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼから構成した。ＤＮＡ増幅のための温度プログラムは、ポリメラーゼ製造業者からのデータ、およびオリゴヌクレオチドの融解温度を基にした。
４．３ 分析および分離用アガロースゲル電気泳動
ＤＮＡ分子の分離には、１％アガロース（ｗ／ｖ）濃度のアガロースゲルを使用した。これにおいて、１ｇのアガロースを沸騰により１００ｍＬの１ｘ ＴＡＥ緩衝液中に溶解し、５μＬの臭化エチジウム（≧９８％）、またはこれに代えて５μＬのＲｏｔｉ（登録商標）ＧｅｌＳｔａｉｎ（Carl Roth, Karlsruhe）で処理し、次いでゲルチャンバ（C.B.S. Scientific, San Diego, USA）へ注入した。適用に先立ち、分離されるべきＤＮＡを、５ｘアガロースゲルローディング緩衝液でSambrook & Russell (2001)に従って処理しゲルにアプライした。１００ｂｐの拡張ＤＮＡラダー（Carl Roth, Karlsruhe）を、長さの標準として用いた。電気泳動は１ｘ ＴＡＥ緩衝液中で、１２０Ｖの定電圧において行なった。
４．４ ゲル抽出によるＤＮＡフラグメントの精製
アガロースゲルからのＤＮＡフラグメントの精製には、ＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Sigma-Aldrich, Munich）を用いた。これは、製造業者の指示に従って実施した。単離されたＤＮＡフラグメントの溶出には、７０℃に温度調節された５０μＬの無菌の再蒸留水を用いた。
４．５ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｋｉｔを用いたＤＮＡフラグメントの精製
ＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｋｉｔ（Sigma-Aldrich, Munich）を用いたＤＮＡフラグメントの精製は、製造業者の指示に従って実施した。精製されたＤＮＡフラグメントの溶出には、７０℃に温度調節された５０μＬの無菌の再蒸留水を用いた。
４．６ エンドヌクレアーゼによる制限
ＤＮＡの制限には、４０〜４５μＬの切断されるべきＤＮＡを、１０〜２０Ｕの該当する制限酵素で処理し、そして製造業者により推奨される適当な添加剤を加えた反応緩衝液中で、３７℃で２時間インキュベートした。次にフラグメントを、アガロースゲル電気泳動とそれに続くゲル抽出か、またはＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｋｉｔの使用のいずれかにより精製した。
４．７ ＤＮＡフラグメントの連結
ＤＮＡフラグメントの連結には、予め制限ずみでかつ精製されたＤＮＡフラグメントを使用した。連結は、１２μＬの切断されたベクターＤＮＡ、４μＬの切断されたインサートＤＮＡ、および２０Ｕ ｍＬ−１のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs, Frankfurt）を用いて、このために製造業者から提供された緩衝液中の０．５ｍＭのＡＴＰを加えて１６℃で行なった。別法として、連結は、Ｑｕｉｃｋ ＬｉｇａｔｉｏｎＴＭ Ｋｉｔ（New England Biolabs, Frankfurt）を用いて、製造業者の指示に従って実施した。これにおいて、６μＬの切断されたベクターＤＮＡ、および３μＬの切断されたインサートＤＮＡを使用した。
４．８ 部位特異的突然変異誘発
プラスミドＤＮＡ上での部位特異的突然変異誘発は、Sanchis et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 81(2):387-97, 2008 または Liu, H. & Naismith, J. H., BMC Biotechnol., 8:91, 2008による方法を用いて選択的に実施した。飽和突然変異誘発が実施される場合、縮重コドンを用いてプライマーを使用した。Sanchis et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 81(2):387-97, 2008による方法の場合、反応混合物は０．４μＬの鋳型ＤＮＡ、０．１μＭの各オリゴヌクレオチド、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、および０．０２ＵμＬ−１のＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼから構成した。ＤＮＡ増幅のための温度プログラムは、公開された方法に基づいており、かつポリメラーゼ製造業者からの情報およびオリゴヌクレオチドの融解温度に従って適合したに過ぎない。
Liu & Naismith (2008)の方法において、反応混合物は０．２μＬの鋳型ＤＮＡ、１μＭの各オリゴヌクレオチド、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、および０．０２ＵμＬ−１のＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼから構成された。ＤＮＡ増幅のための温度プログラムは、公開された方法に基づいており、かつポリメラーゼ製造業者からの情報およびオリゴヌクレオチドの融解温度に従って適合したに過ぎない。突然変異誘発ＰＣＲに続き、親のＤＮＡは、各回０．５ＵμＬ−１のＤｐｎＩを連続して２回添加すること、、および次に３７℃で１時間インキュベートすることにより制限された。
４．９ ケミカルコンピテント細胞の産生および形質転換
ケミカルコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞の産生には、対数増殖期にある１００ｍＬのＬＢ液体培養物（ＯＤ ０．５）を、５０ｍＬの反応容器に移し入れ、遠心分離（３２２０ｇ、４℃、１０分間）によりペレット化した。次いで上清を捨て、細胞ペレットを４０ｍＬの氷冷ＴＦＢ１培地中に再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートした。この後、細胞を再度遠心分離（３２２０ ｇ、４℃、１０分間）によりペレット化し、上清を捨て、細胞を４ｍＬの氷冷ＴＦＢ２培地で再懸濁し、氷上でさらに１５分間インキュベートした。次に、２００μＬのアリコートを無菌の１．５ｍＬの反応容器内に入れ、−８０℃で凍結した。形質転換には、場合ごとにアリコートを解凍し、１〜１０μＬのＤＮＡ溶液で処理し、氷上で４５分間インキュベートした。Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（RiO, QUANTIFOIL Instruments, Jena）中での熱ショック（４２℃、１：３０分）の後、細胞を再度氷上に１〜２分間保持した。次いで、６００μＬの無菌のＬＢ培地を添加し、混合物をＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ中で、３７℃および６００ｒｐｍでさらに４５分間インキュベートした。穏やかな遠心分離（３０００ｒｐｍ、１分間）の後、５０〜１００μＬを除いて上清を捨て、ペレットを残っている上清中に再懸濁し、適当な寒天平板上に播種した。これを次にインキュベーター内で、３７℃で一夜インキュベートした。
４．１０ エレクトロコンピテント細胞の産生および形質転換
エレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞の産生には、対数増殖期にある２００ｍＬのＬＢ液体培養物（ＯＤ ０．５）を、氷冷された５０ｍＬの反応容器に移し入れ、氷上で２０分間インキュベートし、遠心分離（４０００ ｇ、４℃、１５分間）によりペレット化した。細胞を次に、連続的に２００ｍＬ、１００ｍＬ、および８ｍＬの氷冷１０％グリセリン（ｖ／ｖ）溶液中にペレットを懸濁すること、および遠心分離（６０００ ｇ、４℃、１５分間）により再度ペレット化することにより洗浄した。次いで細胞を、氷冷１０％グリセリン（ｖ／ｖ）を用いて、全体積０．４〜０．８ｍＬに懸濁し、氷冷された無菌の１．５ｍＬの反応容器に２０μＬのアリコートで充填して、−８０℃で凍結した。
形質転換には、細胞を２〜１０μＬの脱イオンされたＤＮＡ溶液で処理し、１〜２ｍｍの電極ギャップを備えたエレクトロポレーションキュベットにおいて、エレクトロポレーターの製造業者のプロトコール（Gene Pulser XcellTM, Bio-Rad, Munich.）に従って電気穿孔した。次に、１ｍＬのＬＢ培地を直ちに細胞へ添加し、次いで懸濁液を無菌の１．５ｍＬの反応容器へ移し入れ、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ (RiO, QUANTIFOIL Instruments, Jena)において、３７℃および６００ｒｐｍで６０分間インキュベートした。穏やかな遠心分離（３０００ｒｐｍ、１分間）の後、５０〜１００μＬを除いて上清を捨て、残りの上清中にペレットを再懸濁し、適当な寒天平板上に播種した。これを次にインキュベーター内で、３７℃で一夜インキュベートした。
４．１１ コロニーポリメラーゼ連鎖反応
分離用のコロニーポリメラーゼ連鎖反応（コロニーＰＣＲ）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓからグルコースデヒドロゲナーゼの遺伝子を単離するために実施した。方法は、セクション４．２に述べたものと一致するが、鋳型ＤＮＡの代わりに、寒天平板上で培養された単一コロニーからの細菌スワブを反応混合物へ添加するという修正を行った。分析的なコロニーＰＣＲを用いて、正しい連結についてチェックした。ここでもまた、単一コロニーからの細菌スワブを鋳型として用いた。コロニーＰＣＲ用のプライマーを選択して、これらが挿入部位のフランキング領域をもつ標的ＤＮＡにハイブリダイズして、増幅産物の長さに基づき挿入が成功したかどうかを推定できるようにした。反応混合物は、０．５μＭの各オリゴヌクレオチド、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、および０．０５ＵμＬ−１のＴａｇ ＤＮＡポリメラーゼから構成した。ＤＮＡ増幅のための温度プログラムは、ポリメラーゼ製造業者の指示、およびオリゴヌクレオチドの融解温度を基にした。
４．１２ 染色体遺伝子の特異的サイレンシング
Ｅ．ｃｏｌｉの染色体の７α−ＨＳＤＨの特異的なサイレンシングは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｕｎｉｃｈ）からのキット、ＴａｒｇｅＴｒｏｎＴＭ Ｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｙｓｔｅｍにより行なった。サイレンシングに必要なプラスミドｐＭＢ１３は、Braun, M., PhD thesis, Technische Universitat Munich, 2011に記載されている。このプラスミドは、ケミカルコンピテントなＥ．ｃｏｌｉへ形質転換され、標的遺伝子のサイレンシングが製造業者の指示に従って実施された。カナマイシンを用いたＬＢ寒天平板上での選択、およびコロニーＰＣＲにより、好首尾のサイレンシングが検出できた。細菌中に残留するプラスミドを除去するため、細胞を、カナマイシン（５０ｍｇＬ−１）およびノボビオシン（６２ｍｇＬ−１）を加えたＬＢ培地中で、３７℃で一夜培養した。次に培養物を、カナマイシンを加えたＬＢ寒天平板上に播種し、３７℃で一夜培養した。除去されるべきプラスミドの存在は、クロラムフェニコール感受性について個々のコロニーを検査することにより試験した。このことは、ＬＢ培地中で３７℃での平行した一夜培養において、一度は３３ｍｇＬ−１のクロラムフェニコールを添加して、また一度はそれらの添加なしに行われた。
５． タンパク質化学的方法
５．１ ｍＬスケールでのタンパク質の精製
ｍＬスケールでのタンパク質の精製は、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）の原理により行なった。分離原理は、マトリックスに結合された金属リガンドと、精製されるべき標的タンパク質上のヒスチジン残基との特異的相互作用に基づく。この目的のため、標的タンパク質の発現中に、Ｈｉｓ６アンカーがＮ−またはＣ−末端のいずれかに融合される。高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）ユニットでの精製には、そのアガロースマトリックスにＮｉ２＋イオンがロードされたＨｉｓＴｒａｐカラム（カラム容積１ｍＬまたは５ｍＬ）を使用した。移動相の流量は、それぞれの場合に１分間あたり１カラム容積（ＣＶ）に設定した。この間に、溶出物流中のタンパク質濃度を２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によってモニターできた。まず、カラムを少なくとも５ＣＶの結合緩衝液で平衡化し、次いで試料をアプライした。この後、カラムを結合緩衝液で洗浄して、非特異的に結合する外来タンパク質を除去した。洗浄は、ＵＶシグナルのベースラインに再度達するまで実施した。標的タンパク質の溶出は、０％から１００％まで２０分間にわたり直線的に上昇する溶出緩衝液勾配により達成され、この間に、それぞれ２ＣＶの溶出物分画が収集された。標的タンパク質を含有する分画は、ＵＶシグナルにより同定できる。次に、カラムを再度１０ＣＶの溶出緩衝液で洗浄した。次いで標的タンパク質を含有する分画を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心濃縮器（排除サイズ １０ｋＤａ）で濃縮し、標的緩衝液を充填することにより緩衝液を交換して３回濃縮した。原則として標的緩衝液は、タンパク質のさらなる使用に必要な反応緩衝液に相当する。
遠心分離ユニットを用いた精製には、ベッドボリュームが３ｍＬの、
ＨｉｓＰｕｒＴＭＮｉ−ＮＴＡ Ｒｅｓｉｎ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ (Thermo Fischer Scientific, Waltham, USA) が使用される。このための方法は、製造業者の指示に対応する。濃度及び緩衝液交換は、既に記載された方法に一致する。
５．２ Ｌスケールでのタンパク質の精製
Ｌスケールでのタンパク質の精製もまた、ＩＭＡＣに基づき行われた。このためには、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（GE Healthcare Life Science, Uppsala, Sweden）を充填した、容積６００ｍＬ、および直径５０ｍｍのクロマトグラフィーカラムを使用した。充填に先立ち、２０％エタノール中に保存されたカラム充填剤を、三重のデカンテーション、水の再充填、スラリー化、および沈降により洗浄した。次に、スラリー化された充填媒体を、空のカラム内に入れ、最大流量１５０ｍＬ ｍｉｎ−１、および最大圧力１．５ｂａｒにおいてカラム充填した。完了した充填カラムを、次に、１．２ｂａｒの最大圧力において、５ＣＶの結合緩衝液で平衡化した。解凍後、アプライされるべき試料をまず５００ｍＭのＮａＣｌで処理し、１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整した。次に、試料を透明にするため、連続的に結合された無菌のフィルタを備えた、２つのＳａｒｔｏｃｏｎ（登録商標） Ｓｌｉｃｅ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ（登録商標）フィルターカセット（それぞれ、排出サイズ０．２ μｍ、フィルタ面積０．１ ｍ２、 Sartorius Stedim Biotech, Gottingen）を用いて、クロスフロー濾過を実施した。試料を次に、流出方向に対し１．２ｂａｒの最大圧力でカラム上にアプライした。次いで、カラムを結合緩衝液で、溶出物流のＵＶシグナルが再びベースラインを示すまで、溶出方向に洗浄した。タンパク質の溶出は、０％から１００％まで１８０分間にわたり直線的に上昇する溶出緩衝液勾配により行われ、この間に、それぞれ２Ｌの分画が収集された。標的タンパク質を含有する分画は、検出器のＵＶシグナルにより同定できた。次いでこれらの分画を、まず、２つのＳａｒｔｏｃｏｎ（登録商標） Ｓｌｉｃｅ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ（登録商標）フィルターカセット（それぞれ、排出サイズ１０ｋＤａ、フィルタ面積０．１ ｍ２、 Sartorius Stedim Biotech, Gottingen）を用いて、クロスフロー濾過により濃縮し、そして次に標的緩衝液の５〜１０倍の交換体積を用いた透析濾過により再度緩衝した。
５．３ ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
タンパク質混合の分析的分離は、不連続ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、１２．５％分離ゲルおよび３％収集ゲル（Laemmli, U. K., Nature, 227 (5259); 680-5, 1970; Fling, S. P. & Gregerson, D. S., Anal. Biochem., 155(1):83-8, 1986.）を用いて行なった。分離ゲル用には、１７．５ｍＬの蒸留水を、１０ｍＬの分離ゲル緩衝液（４ｘ）および１２．５ｍＬのアクリルアミド（４０％）と混合し、そして重合を、１００μＬの過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ、１０％）および１０μＬのテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）で開始した。収集ゲルの組成は、１５ｍＬの蒸留水、２０ｍＬの収集ゲル緩衝液（２ｘ）、５ｍＬのアクリルアミド（４０％）、１００μＬのＡＰＳ、および１０μＬのＴＥＭＥＤからなる。使用に先立ち、タンパク質を変性するため、タンパク質試料をＬａｅｍｍｌｉ緩衝液で処理し、９５℃で５分間インキュベートした。次に、これらをゲル上にアプライし、Roti（登録商標） -Mark standard (１４−２１２ ｋＤａ, Carl Roth, Karlsruhe)をサイズ標準として使用した。電気泳動は、電気泳動チャンバ（PEQLAB, Erlangen）において、Rotiphorese（登録商標） SDS-PAGE (Carl Roth, Karlsruhe)を移動相として、ゲルあたり３０ｍＡの定電流で行なった。タンパク質バンドの染色には、Roti（登録商標）-Blue色素溶液 (Carl Roth, Karlsruhe)を、製造業者の指示に従って使用した。
５．４ ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡアッセイ）によるタンパク質濃度測定
全タンパク質濃度は、PierceTM BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Rockford, USA)を用いて、製造業者の指示に従って測定した。タンパク質標準として、キットに含まれるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用した。
５．５ マイクロタイタープレート光度計における酵素活性の測定
酵素活性測定は、３０℃のマイクロタイタープレート光度計において、２５０μＬの試料体積を用いて３０℃で実施し、これにおいて、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ濃度（ε３４０＝６．２２ｍＬ μｍｏｌ−１ｃｍ−１）をλ＝３４０ｎｍの波長においてモニターした。ここで活性は、反応が直線的に進行する部分における線形回帰により測定された。このため、検査されるべき試料を、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）で適切に希釈して、基質および補因子で処理した。基質および補因子の最終濃度は、７β−ＨＳＤＨ用には１０ｍＭ ＤＨＣＡおよび１００μＭ ＮＡＤＰＨであり、３α−ＨＳＤＨ用には１０ｍＭ ＤＨＣＡおよび１００μＭ ＮＡＤＨであり、またＧＤＨ用には２００ｍＭグルコースおよび１０００μＭ ＮＡＤ（Ｐ）であった。
全ての基質および補因子は、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）中に溶解した。測定は全て三重に行い、次いで平均値を測定した。ＤＨＣＡの１２−ケト−ＵＤＣＡへの多酵素還元の機械的モデリングのための人為的単位（ＡＵ）の測定においては、酵素活性測定のためのプロトコールが修正された。これにおいて、反応緩衝液としては、２０％（ｖ／ｖ）グリセリン、０．６％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、および０．００６％（ｖ／ｖ）Ａｎｔｉｆｏａｍ ２０４（Sigma-Aldrich, Munich）がそれに混合ずみの、リン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）が使用された。基質および補因子の濃度は、３α−ＨＳＤＨ用には５００μＭ ＤＨＣＡおよび２００μＭ ＮＡＤＨであり、７β−ＨＳＤＨ用には５００μＭ ＤＨＣＡおよび２００μＭ ＮＡＤＰＨであり、またＧＤＨ用には２００ｍＭグルコースおよび１０００μＭ ＮＡＤであった。酵素は、測定される最初の吸光度変化が、ＧＤＨについて０．０００５〜０．００２０ ｓ−１、およびＨＳＤＨについて０．０００２５〜０．００１００ ｓ−１の範囲である希釈において使用した。測定は全て八重に実施し、２５％トランケートした平均値を測定した。ここでＡＵは、これらの指定された反応条件下で１μｍｏｌの基質または補因子の１分間以内の変換を触媒する活性酵素の量として定義される。
６．分析法
６．１ 細菌懸濁液の光学密度の測定
Ｅ．ｃｏｌｉ懸濁液の光学密度は、キュベット光度計において、層厚１ｃｍのキュベットで、λ＝６００ｎｍの波長において測定した。細菌懸濁液は、任意に適当な培地もしくは緩衝液で希釈して、測定された吸光度が０．５を超えないようにした。
６．２ 細菌懸濁液の乾燥バイオマス濃度の測定
別に指定しない限り、乾燥バイオマス濃度は重量測定法により測定した。これには、１ｍＬの該当する細菌懸濁液を、予め乾燥されかつ予め秤量された１．５ｍＬの反応容器に入れ、次いで細胞をベンチ遠心分離機で、１３０００ｒｐｍで１０分間、室温においてペレット化し、上清を捨てた。この後、容器を定重量まで乾燥させ、再度秤量した。そこで乾燥バイオマス濃度を、以下の等式により計算できた。
ＣＸ＝（ｍｆｕｌｌ−ｍｅｍｐｔｙ）／Ｖ
［式中、
ＣＸ＝乾燥バイオマス濃度、ｇＢＤＭ Ｌ−１
ｍｆｕｌｌ＝乾燥後の試料物質で満たした反応容器の質量、ｇ
ｍｅｍｐｔｙ＝乾燥後の空の反応容器の質量、ｇ
Ｖ＝沈降前の細胞懸濁液の体積、Ｌ］
６．３ 補因子濃度の光度測定
ＮＡＤ（Ｐ）およびＮＡＤＰ（Ｈ）の濃度は、キュベット光度計において、Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｂｅｅｒの法則に従って測光法により測定した。これには、層厚１ｃｍの石英キュベット（Hellma Analytics, Mulheim）を用い、これを１ｍＬの試料で満たした。ＮＡＤ（Ｐ）濃度の測定は、λ＝２５９ｎｍの波長において実施し、これにおいてモル吸光係数はε２５９ｎｍ＝１６．９ｍＬ μｍｏｌ−１ｃｍ−１であった。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの濃度は、λ＝３４０ｎｍの波長において測定し、かつここでモル吸光係数はε３４０ｎｍ＝６．２２ｍＬ μｍｏｌ−１ｃｍ−１であった。
６．４ 高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
胆汁酸塩の定性的及び定量的分析は、ＨＰＬＣによる物質の分離によって行なった。これには、タイプＨｉｂａｒ（登録商標）１２５−４ ＲＰ−１８ｅ （５ μｍ） (Merck, Darmstadt)の逆相クロマトグラフィーカラムを備えたＨＰＬＣシステム、Finnigan Surveyor Plus (Thermo Fischer Scientific, Waltham, USA)を使用した。移動相として、リン酸水溶液（ｐＨ２．６）とアセトニトリルとの移動相混合物を用い、分離には、移動相勾配を用いた。移動相の流量は、１ｍＬ ｍｉｎ−１であり、各場合に２０μＬの試料を注入した。胆汁酸塩は、λ＝２００ｎｍにおけるＵＶ吸光度により検出した。この方法は、標準法により参考物質を用いてキャリブレートした。
勾配プロフィールは以下の通りであった：
０〜３ｍｉｎ：３５％（ｖ／ｖ）の一定したアセトニトリル含量、３〜７ｍｉｎ：３９％（ｖ／ｖ）までのアセトニトリル含量の直線的増加；７〜８ｍｉｎ：７０％（ｖ／ｖ）までのアセトニトリル含量の直線的増加、８〜９．５ｍｉｎ：７０％（ｖ／ｖ）の一定したアセトニトリル含量、９．５〜１０．５ｍｉｎ：３５％（ｖ／ｖ）までのアセトニトリル含量の直線的減少；１０．５〜１４ｍｉｎ：３５％（ｖ／ｖ）の一定したアセトニトリル含量。
６．５ フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）
フローサイトメトリー（蛍光活性化細胞選別、ＦＡＣＳ）を用いて、ホールセル生体触媒の細胞完全性を調べた。これには、細胞を約１０９ ｍＬ−１の粒子密度に希釈し、これは１ｍＬ ｓ−１の流量での１０００シグナルｓ−１に相当する。これらの細胞を、細胞膜の脱分極に打ち勝って細胞内タンパク質および膜への結合により蛍光を発生する、０．７５ｍＭの色素ビス−（１，３−ジブチルバルビツール酸）−トリメチン−オキソノール（Ｄｉｂａｃ４［３］）で処理した。Ｄｉｂａｃ４［３］媒介性の蛍光を、粒子サイズの指標である粒子の光散乱に対してプロットすることにより、細胞完全性について推論を引き出すことが可能であった（Suller, M. T.& Lloyd D., Cytometry, 35(3):235-41, 1999; Langemann et al., Bioeng. Bugs, 1(5):326-36, 2010）。
６．６ ＤＨＣＡの１２−ケト−ＵＤＣＡへの酵素的変換の決定のための標準的検査法（ＩＰＣ法）
ａ．設備
装置：ＵＶ検出器とオートサンプラーとを備えたＨＰＬＣ（Merck Hitachi, LaChrom Elite (high pressure gradient system) または同等のもの）；
カラム：Merck, Purospher（登録商標） STAR RP-18e, 125 mm X 4,0 mm, 5 μm, Art. #5I0 036；または同等のもの
ｂ．勾配作成に適した試薬
アセトニトリル Merck LiChroSolv（登録商標）
水 超純水
Ｈ３ＰＯ４ オルトリン酸８５．０％；Merck
メタノール Merck LiChroSolv（登録商標）
ｃ．ＨＰＬＣパラメータ
流量 １．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度 ２５℃
注入体積 ２０μｌ
検出 ＵＶ２００ｎｍ
ランタイム ３６．０ｍｉｎ
洗浄 メタノール／水：９／１（ｖ／ｖ）
ｄ．溶液および試料の調製
移動相Ａ Ｈ２Ｏ（Ｈ３ＰＯ４（８５％）でｐＨ２．６に調整）
移動相Ｂ アセトニトリル
ブランク 希釈液：メタノール／水：９／１（ｖ／ｖ）
システム適合溶液（ＳＳＴ） １０．０ｍｌの希釈液中、５．００ｍｇ ＤＨＣＡ、５．００ｍｇ １２−ケト−ＵＤＣＡ、５．００ｍｇ ３，１２−ジケト−ＵＤＣＡ、および５．００ｍｇ ７，１２−ジケト−ＣＡ（それぞれ正確に秤量）
試験溶液 ９ｍｌの希釈液で希釈された１ｍｌの反応溶液；室温で超音波処理され、１０分間遠心分離された。
ｅ．手順
分析順序：
−ブランク １ｘ注入
−システム適合溶液（ＳＳＴ） １ｘ注入
−試験溶液 ２ｘ注入
−ブランク １ｘ注入
再生：
それぞれの分析順序の後、メタノール／水（４／６〜９／１（ｖ／ｖ））でカラムを再生する。その後、カラムをアセトニトリル／水（４／６（ｖ／ｖ））ですすぐ。
ｆ．評価
ＳＳＴ試料の分析からの化合物の保持時間（ＲＴ）の測定
以下の％領域分析
・ＤＨＣＡ（抽出物）
・１２−ケト−ＵＤＣＡ（生成物）
・３，１２−ジケト−ＵＤＣＡ（中間体）
・７，１２−ジケトＣＡ（中間体）
ＲＴ：保持時間
ＲＲＴ：相対的保持時間
７．デヒドロコール酸の立体選択的還元
７．１ ２ｍＬスケールでのバッチ還元
２ｍＬスケールでのバッチ還元は、ＤＨＣＡの１２−ケト−ＵＤＣＡへの多酵素還元の機構モデルのための検証実験として実施した。これには、ウェル当たり２．０ｍＬの規格容積をもつ、方形のウェル開口およびＶ型底を備えたディープウェルプレートを使用した。完全に混合するため、ディープウェルプレートをラボ用シェイカーにて、５００ｒｐｍで振盪した。一定温度を確保するため、装置全体を３０℃に温度調節されたインキュベーションキャビネット内に設置した。ＤＨＣＡ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、３α−ＨＳＤＨ、７β−ＨＳＤＨ、およびＧＤＨからなる反応混合物は、０．６％（（Ｗ）／ｖ）ＢＳＡを加えたリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）中にあり、直接ウェルに配置した。反応は、グルコース溶液の添加により開始され、続いてディープウェルプレートを３回反転した。セクション５．２に従って精製された酵素が使用された。サンプリングは半時間ごとに、１００μＬの反応混合物を抜取ることにより行なわれ、これを９００μＬのメタノール（７７％ｖ／ｖ）で直接処理した。メタノール処理された試料は次に、ボルテックスにより混合され、ベンチ遠心分離機において１３０００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離された。上清を次にＨＰＬＣにより分析した。全ての反応は、三重に実施された。
７．２ ２０ｍＬスケールでのバッチ還元
２０ｍＬスケールでのＤＨＣＡの立体選択的還元は、５０ｍＬの規格容積、内径４１ｍｍ、およびＧＬ３２スクリューキャップスレッドを備えた細首スクリューキャップボトル（DURAN Group, Wertheim/Main）中で行なった。完全な混合は、マルチスターラープレート（Variomag Multipoint, Thermo Scientific, Waltham, USA）により駆動された、４５０ｒｐｍでの十字形マグネチックスターラーにより提供された。一定温度を確保するため、装置全体を温度調節されたインキュベーションキャビネット内に設置した。反応混合物用には、基質ＤＨＣＡをまず、等モル量のＮａＯＨで予め溶解した。ＤＨＣＡ、補基質（グルコースまたはギ酸塩）、および任意でさらなる添加剤、例えばＮＡＤ（Ｐ）、グリセリン、およびＭｇＣｌ２からなる反応混合物を、反応の開始前に一緒に混合した。リン酸カリウム（５０ｍＭ）を緩衝液として用い、必要に応じて水酸化ナトリウム溶液、リン酸、またはギ酸（各５Ｍ）を用いてｐＨを所望の値に調整した。反応は、ホールセル生体触媒の添加により開始した。反応の間、ｐＨを手動のｐＨメータ（pH-Tester Checker（登録商標）, Carl Roth, Karlsruhe）を用いて３０分間隔で測定し、必要に応じて水酸化ナトリウム溶液、リン酸、またはギ酸（各５Ｍ）を用いてｐＨを出発値に調整した。サンプリングは３０または６０分間隔で、３００μＬの反応混合物を抜取ることにより行ない、これを７００μＬのメタノール（≧９９％）と混合した。次に、試料−メタノール混合物を７０％メタノール（ｖ／ｖ）で３：１０に希釈し、ベンチ遠心分離機において１３０００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離した。試料は上清から採り、７０％メタノール（ｖ／ｖ）で希釈し（１：１０）、試験管に入れて、ＨＰＬＣにより分析した。全ての反応は、三重に実施された。
７．３ １Ｌスケールでのバッチ還元
１ＬスケールでのＤＨＣＡの立体選択的還元は、バッフルのない、Ｉｎｆｏｒｓ ＡＧ (Infors 3, Bottmingen, Schweiz）からの１．５Ｌの攪拌槽型反応器において実施した。反応器は、温度およびｐＨ用のセンサーを具備し、これらのパラメータがコントロールユニットからオンラインで読み取られ、かつ任意に調節できるようにした。反応器は、コントロールユニットへ接続されたダブルジャケットにより温度コントロールされ、完全な混合は、２つの６ブレードインペラにより５００〜１０００ｒｐｍにおいて行い、これらをリアクターカバー上のモータにより駆動した。さらに、ｐＨ調節には、酸（リン酸、５Ｍ）または塩基（水酸化ナトリウム溶液、５Ｍ）が、フィードポンプにより反応器内へ供給可能であった。基質ＤＨＣＡは、等モルの水酸化ナトリウム溶液中に予め溶解されるか、あるいはまた粉末形態の遊離酸として直接添加された。他の全ての成分もまた、固体として、またはストック溶液としてのいずれかで添加された。適当な体積まで充填し、かつ所望のｐＨを設定した後、反応をホールセル生体触媒の添加により開始した。試料は、３０または６０分間隔で、セクション７．２に記載されたように採取した。
７．４ 酸沈殿による胆汁酸塩の単離
胆汁酸塩の単離は、酸性ｐＨにおける、そのプロトン化された形態にある胆汁酸塩の低い溶解度に基づく。これには、攪拌された状態の、溶解された胆汁酸塩を用いた混合物が、塩酸（６Ｍ）を用いてｐＨ≦２．０まで滴下により滴定される。この間に、溶解された胆汁酸塩はほぼ完全に、固体として析出される。これを次に、濾紙（直径約１５０ｍｍ、保持範囲≧４μｍ）を挿入したＢｕｃｈｎｅｒ漏斗により、残留溶液から分離する。必要であれば、胆汁酸塩を超純水中に入れること、およびそれを水酸化ナトリウム溶液（５Ｍ）でｐＨ８〜９に滴定すること、Ｂｕｃｈｎｅｒ漏斗によりろ過すること、および次に再び酸沈殿により単離することにより、それを洗浄することが可能であった。７，１２−ジケト−ＵＤＣＡおよび１２−ケト−ＵＤＣＡの調製には、２回の洗浄が行なわれ、３，１２−ジケト−ＵＤＣＡの調製には、洗浄法は１回行なわれた。次に、単離された胆汁酸塩を６０℃で定重量まで乾燥した。
８． ホールセル生体触媒（３α−ＨＳＤＨ、７β−ＨＳＤＨ、およびＧＤＨ活性をもつ）を用いた、デヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）の１２−ケト−ウルソデオキシコール酸（１２−ケト−ＵＤＣＡ）への変換のための標準化された試験法
８．１ 試薬
Ｋ２ＨＰＯ４ ＊ ３ Ｈ２ｏ （≧９９％, ｐ.ａ.）； Ｒｏｔｈ
ＫＨ２ＰＯ４ （結晶質、ｐｕｒｉｓｓ.）； Ｍｅｒｃｋ
Ｃ６Ｈ１２ｏ６ ＊ Ｈ２ｏ （≧９９．５％, Ｐｈ. Ｅｕｒ.）； Ｒｏｔｈ
ＭｇＣｌ２ ＊ ６ Ｈ２ｏ （≧９％, ｐ.ａ.）； Ｒｏｔｈ
ＤＨＣＡ： ＰｈａｒｍａＺｅｌｌ
β−ＮＡＤ： Ｒｏｔｈ
β−ＮＡＤＰ−Ｎａ２： Ｍｅｒｃｋ,
ホールセル生体触媒 （３α−ＨＳＤＨ、７β−ＨＳＤＨ、およびＧＤＨ活性をもつ）−２０℃に保存）
ＨＣｌ （３７％）
ＮａＯＨ （１０％）
８．２ 緩衝溶液（ストック溶液）の産生
緩衝ストック溶液の産生には、２．５４ｇのリン酸水素二カリウム三水和物および０．１８ｇのリン酸二水素カリウムを、連続して秤量し、１０００ｍｌの脱イオン水中に溶解する；溶液のｐＨ：２５℃で７．８。
８．３ ＮＡＤ／ＮＡＤＰ溶液（ストック溶液）の産生
ＮＡＤ／ＮＡＤＰストック溶液の産生には、１５８ｍｇのβ−ＮＡＤＰ−Ｎａ２、および６６３ｍｇのβ−ＮＡＤを連続的に、１０００ｍｌのメスフラスコに秤量し、脱イオン水で体積に合わせ、そして溶解させる。
８．４ ホールセル触媒試料調製（細胞懸濁液）
細胞懸濁液の取出しに先立ち、試料を室温（ＲＴ）に加温する必要がある。加温時間は約３０分間〜約３時間。
８．５ 反応混合物（ホールセル変換およびＤＨＣＡから１２−ケト−ＵＤＣＡ）
１８０ｍｌの前記緩衝ストック溶液を、三角フラスコ内で２６〜２８℃に予熱し、次に２５０ｍｌの三ツ口フラスコ内の１３．８７ｇ（０．０７ｍｏｌ）のα−Ｄ（＋）−グルコース一水和物を、予熱された緩衝液の体積の約２／３で溶解する。５．６４ｇ（０．０１４ｍｏｌ）のデヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）を残りの緩衝液と一緒にグルコース緩衝溶液中で懸濁し、ウォーターバス上で２６〜２８℃に加温し、この間に、ｐＨは既に低下しており、６．８に調整される。遅延なく、３６ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）の塩化マグネシウム六水和物、１０ｍｌのＮＡＤ／ＮＡＤＰストック溶液、及び５ｍｌの融解された細胞懸濁物を、連続的に懸濁液に添加する。
反応懸濁液を、ウォーターバス上で８時間攪拌する（２６〜２８℃）。ｐＨメータおよび手作業によるｐＨ調節（１０％ＮａＯＨ溶液による滴定）の使用により、懸濁液のｐＨを常に６．７０と６．９０の間にするべきである。ｐＨ−スタットの代替え使用では、ｐＨを常に６．８にするべきである。
８．６ ＨＰＬＣ分析
０．５時間、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、および８時間の反応時間後、反応をモニタリングするための試料（体積１ｍｌ）を反応懸濁液からピペットで抜取り、ＨＰＬＣにより分析する（上記ＩＰＣ法参照）：
これには、１ｍｌの試料体積を、２０ｍｌのスナップリッドバイアル中で、メタノール／Ｈ２Ｏ（９：１；ｖ／ｖ）の溶媒混合物９ｍｌを用いて希釈し、充分に混合する。スナップリッドバイアルを密閉する。ＨＰＬＣカラムへのインジェクションの前には、混濁した、希釈された溶液を遠心分離する必要がある。次に透明な上清を採り、インジェクション用の体積をそこから抜取る。
適当な時間の後、例えば７〜１０時間、例えば８時間後に、反応を終了する。これには、混濁した反応溶液を、約４〜５ｍｌの濃ＨＣｌを用いて酸性化し（ｐＨ≦１．５）、さらに３０分間攪拌する。
８．７ 評価
反応動態の測定：
反応モニタリング／反応動態は、（分析されない）出発点「０時間」（ＤＨＣＡ：１００％面積、全ての他の分析物：０％面積）と、および例えば１１のさらなる測定点／ＨＰＬＣ分析（例えば、０．５時間、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、および８時間の反応時間後）とで構成される。
現時の（時点：ｘ時間の反応時間における）サンプリングにおける分析物の組成が測定されることになる。これには、分析物であるＤＨＣＡ（抽出物）、１２−ケト−ＵＤＣＡ（最終産物）、３，１２−ジケト−ウルソデオキシコール酸（３，１２−ジケト−ＵＤＣＡ；中間体）、及び７，１２−ジケト−コール酸（７，１２−ジケト−ＣＡ；中間体）について、ＨＰＬＣ−ＵＶクロマトグラムにおける％面積のデータが評価されかつ記録される。
Ｂ． ホールセル還元
実施例Ｂ．１： ３つの異なるホールセル生体触媒によるＤＨＣＡの２段階ホールセル還元（Ｘ＝６７）
変換には、生体触媒株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ΔｈｄｈＡ ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧ−Ｋ、およびＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐ７（Ａ）Ｔ３ＴＧを用いた。プラスミド ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧ、ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧ−Ｋ、およびｐ７（Ａ）Ｔ３ＴＧは、それぞれ、その中に遺伝子７β−ＨＳＤＨ、３α−ＨＳＤＨ、およびＧＤＨがコードされている発現カセットをもつが、発現カセット構造は異なり、かつ抗生物質抵抗性が異なる。これらのプラスミドは、所望のように、宿主株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９またはＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ΔｈｄｈＡ（双方ともWO 2012/080504 および本出願者の WO 2011/147957から公知）に形質転換されるが、これらは異なるノックアウト株であり、その各々において、ゲノムの７α−ＨＳＤＨがノックアウトされている。発現プラスミドは、図３に示されている。
前記の生体触媒を用いて、変換を１Ｌスケールで実施した。各場合に、１ｇＢＤＭ Ｌ−１の生体触媒、０．０５ｍＭ ＮＡＤ、および０．０１ｍＭ ＮＡＤＰを使用し、したがって全３標品についてＸ＝６７であった。さらなる変換条件は：７０ｍＭ ＤＨＣＡ、３５０ｍＭ グルコース、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７、および３０℃であった。変換の評価にとり極めて重要であるのは、反応混合物中の生成された産物（１２−ケト−ＵＤＣＡ）の量である。基質ＤＨＣＡ、中間体３，１２−ジケト−ＵＤＣＡおよび７，１２−ジケト−ＵＤＣＡの、ならびに反応混合物中の生成物１２−ケト−ＵＤＣＡの濃度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定できる。
反応の経過は、図４に示される。全ての標品で、５〜６時間後に＞９９％の変換が達成可能であった。したがって、全３酵素、７β−ＨＳＤＨ、３α−ＨＳＤＨ、およびＧＤＨが発現される限り、種々のホールセル生体触媒株について配合が妥当であることは明らかである。
実施例Ｂ．２ ３．５ｇＢＤＭ Ｌ−１の生体触媒および０．０２５ｍＭ ＮＡＤを用いたＤＨＣＡの２段階ホールセル還元（Ｘ＝１４７．５）
変換には、生体触媒株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧを使用した。これにおいて、３．５ｇＢＤＭ Ｌ−１の生体触媒、０．０２５ｍＭ ＮＡＤを使用し、ＮＡＤＰは使用せず、したがってこの標品については、Ｘ＝１４７．５であった。さらなる変換条件は：７０ｍＭ ＤＨＣＡ、３５０ｍＭ グルコース、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７、３０℃、および２０ｍＬの反応体積であった。
反応の経過は、図５に示される。この標品で、２４時間後に＞９９％の変換が達成可能であった。したがって、このアプローチについて配合は妥当である。さらに、ＮＡＤおよびＮＡＤＰが添加されることが絶対に必要というわけではなく、基質の１つの添加でも充分であり得ることが示されている。
実施例Ｂ．３ １．７５ｇＢＤＭ Ｌ−１の生体触媒、０．０２５ｍＭ ＮＡＤ、および０．０１ｍＭ ＮＡＤＰを用いたＤＨＣＡの２段階ホールセル還元（Ｘ＝８９．５）
変換には、生体触媒株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ４９ ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧを使用した。これにおいて、１．７５ｇＢＤＭ Ｌ−１の生体触媒、０．０２５ｍＭ ＮＡＤ、および０．０１ｍＭ ＮＡＤＰを使用し、したがってこの標品については、Ｘ＝８９．５であった。さらなる変換条件は：７０ｍＭ ＤＨＣＡ、３５０ｍＭ グルコース、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７、３０℃、および２０ｍＬの反応体積であった。
反応の経過は、図６に示される。このアプローチで、２４時間後に＞９８％の変換が達成可能であった。したがって、このアプローチについて配合は妥当である。
実施例Ｂ．４ １ｇＢＤＭ Ｌ−１の生体触媒、０．０４ｍＭ ＮＡＤ、および０．００７５ｍＭ ＮＡＤＰを用いたＤＨＣＡの２段階ホールセル還元（Ｘ＝６１）
変換には、生体触媒株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ΔｈｄｈＡ ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧ−Ｋを使用した。これにおいて、１ｇＢＤＭ Ｌ−１の生体触媒、０．０４ｍＭ ＮＡＤ、および０．００７５ｍＭ ＮＡＤＰを使用し、したがってこの標品については、Ｘ＝６１であった。さらなる変換条件は：７０ｍＭ ＤＨＣＡ、２００ｍＭ グルコース、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、４％（ｖ／ｖ）グリセリン、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７、３０℃、および２０ｍＬの反応体積であった。
反応の経過は、図７に示される。このアプローチで、２４時間後に＞９９％の変換が達成可能であった。したがって、このアプローチについて配合は妥当である。
実施例Ｂ．５ ホールセル生体触媒Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬＬｉｕ ｐ７（Ａ）Ｔ３ＴＧ−Ｋを用いたＤＨＣＡの２段階ホールセル還元
増大されたＧＤＨ発現をもつ、カナマイシン抵抗性のホールセル生体触媒株が産生された。これにおいては、プラスミドｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧ−Ｋが、付加的なＴ７プロモーターがＧＤＨの前の発現カセット内に挿入ずみであるという程度に改変されている。得られたプラスミドは、ｐ７（Ａ）Ｔ３ＴＧ−Ｋという名称をもち、宿主株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬＬｉｕに形質転換された。得られたホールセル生体触媒は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬＬｉｕ ｐ７（Ａ）Ｔ３ＴＧ−Ｋという名称をもつ。
ａ）ホールセル生体触媒Ｅ．ｃｏｌｉ ＢｕＬＬｉｕ ｐ７（Ａ）Ｔ３ＴＧ−Ｋの培養
株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢｕＬＬｉｕ ｐ７（Ａ）Ｔ３ＴＧ−Ｋは、攪拌槽型反応器中で、標準的なプロトコールに従って培養され、増殖および発現挙動について関連する株と比較された。
これには、株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢｕＬＬｉｕ ｐ７（Ａ）Ｔ３ＴＧ−Ｋを、攪拌槽型反応器中で、２５℃の発現温度において、標準的なプロトコールに従って培養した。収穫の時点で存在する細胞濃度および酵素活性は、以下の表３に示されている。これと対比されるのは、元のカナマイシン抵抗性株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢｕＬＬｉｕ ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧ−Ｋのデータと、これもまた増大されたＧＤＨ活性をもつアンピシリン抵抗性株ＢＬ４９ ｐ７（Ａ）Ｔ３ＴＧのデータとである。
表から、新規な株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢｕＬＬｉｕ ｐ７（Ａ）Ｔ３ＴＧ−Ｋが個別に比較される株よりも著しく高い７β−ＨＳＤＨ活性をもつことが見て取れる（２．４〜２．７倍）。３α−ＨＳＤＨ活性は、比較された株の中で最も高いレベルにある。一方、ＧＤＨ活性は、カナマイシン抵抗性株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢｕＬＬｉｕ ｐ７（Ａ）Ｔ３ｒＧ−Ｋのそれよりも４〜１０倍高いが、しかしアンピシリン抵抗性株ＢＬ４９ ｐ７（Ａ）Ｔ３ＴＧのＧＤＨ活性の７０％にすぎない。収穫の時点で得られた細胞濃度は、比較株よりも一貫して高かった。
ｂ）ホールセル生体触媒Ｅ．ｃｏｌｉ ＢｕＬＬｉｕ ｐ７（Ａ）Ｔ３ＴＧ−Ｋの生体内変化
攪拌槽型反応器中で培養された新規な株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢｕＬＬｉｕ ｐ７（Ａ）Ｔ３ＴＧ−Ｋを、ホールセル生体触媒性能について調べた。
ホールセル生体触媒性能の評価には、−２０℃で保存された細胞、およびまた室温および４℃で保存された細胞の双方を用いた。先の株とは異なり、この株では室温での１日の保存期間は、細胞の完全な活性を得るには不充分であった。このことから、室温での１日の保存、および４℃で３日の保存の後、株を再度室温で３日間保存し、次いで生体内変化のために使用した。
ホールセル生体内変化のための反応条件は：７０ｍＭ ＤＨＣＡ、３５０ｍＭ グルコース、ＯＤ２ 細胞、５０μＭ ＮＡＤ、１０μＭ ＮＡＤＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＰｉ緩衝液（ｐＨ７．０）、および３０℃であった。加えて、室温で保存した細胞では、実験は二倍のＮＡＤ濃度、１００μＭを用いて実施した。ｐＨは、手作業により、ＮａＯＨ溶液（５Ｍ）を用いて半時間ごとに出発値に調整した。生体内変化の経過は、図１１に示されている。
標準的なＮＡＤ濃度（５０μＭ）での生体内変化の比較では、反応は４時間後（−２０℃で保存された細胞で）および４．５時間後（ＲＴ／４℃で保存された細胞で）に完了していた。したがって生体内変化の継続時間は、他の生体触媒株で達成された時間（４．５時間〜６時間）の範囲内か、またはわずかに下回る。しかしながら、一様ではない副産物生成が認められる。双方の標品において、７β−ＨＳＤＨの中間体生成物（３，１２−ジケト−ＵＤＣＡ）は、３α−ＨＳＤＨの中間体生成物よりもより強く蓄積する。このことは、他のホールセル生体触媒株に比較して著しく増大された、この株の７β−ＨＳＤＨ活性に起因し得る。もしＮＡＤ濃度−およびしたがって３α−ＨＳＤＨ用の補因子濃度が増大されれば、このことは、これら２つの中間体生成物の等しい生成において認められるべき、２つのＨＳＤＨの反応速度が等しくなる結果をもたらす。さらに、生体内変化の継続時間が４．５時間から４時間に低減される。
Ｃ． ７β−ＨＳＤＨ変異体
実施例Ｃ．１ ＮＡＤ特異性をもつ７β−ＨＳＤＨ変異体の産生
本明細書では、タンパク質工学により産生され、かつ補因子としてＮＡＤＰＨの代わりにＮＡＤＨを受け入れる、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ由来の７β−ＨＳＤＨの酵素変異体が記載される。
本発明による７β−ＨＳＤＨ変異体は、公開された天然酵素の配列とは位置３９、４０、４１、および／または４４において、また公知の７β−ＨＳＤＨ変異体とは位置４０、４１、および４４において、アミノ酸配列が異なる。
変異体７β−ＨＳＤＨ ＤＦは、野生型配列に比較してアミノ酸置換Ｇ３９Ｄ Ｒ４０Ｆを含み、変異体７β−ＨＳＤＨ ＤＦＫは、野生型配列に比較してアミノ酸置換Ｇ３９Ｄ Ｒ４０Ｆ Ｒ４１Ｋを含み、また変異体７β−ＨＳＤＨ ＤＦＫＧは、野生型配列に比較してアミノ酸置換Ｇ３９Ｄ Ｒ４０Ｆ、Ｒ４１Ｋ、Ｋ４４Ｇを含む（図８参照）。
Ｃ．１．２ ＮＡＤＨ−依存性単一変異体Ｇ３９Ｄの産生
７β−ＨＳＤＨのＧ３９Ｄ変異体は、ＷＯ ２０１２／０８０５０４に記載されたように産生された。タンパク質は、Ｎ−末端Ｈｉｓタグを用いて発現され、ＩＭＡＣにより精製された。第１の活性アッセイは、非常にわずかなＮＡＤＰＨ活性のみを示した（１０ｍＭ ＤＨＣＡ、０．５ｍＭ ＮＡＤＰＨ、およびｐＨ８．０で、０．０４０±０．００５ Ｕｍｇ−１）。一方、著しいＮＡＤＨ活性が観察された。
Ｃ．１．３ ＮＡＤＨ依存性７β−ＨＳＤＨの定向進化
ａ）変異体ライブラリのための宿主株の産生
さらなる突然変異誘発は、反復飽和突然変異誘発（Reetz et al., Mol. Biosyst., 5(2):115-22, 2009）の原理に従ってなる。これには、変異体ライブラリの産生のため、高い形質転換効率をもつと同時に、細胞ライセートを用いたスクリーニングに充分適するＥ．ｃｏｌｉ宿主株が必要である。Ｅ．ｃｏｌｉは、スクリーニングにおいて副反応を触媒するゲノム的にコードされた７β−ＨＳＤＨをもち、したがって測定データを偽る可能性があることから、この遺伝子がサイレンス化されている宿主株に対し援助が行なわれたはずである。しかしながら、既存の２つのノックアウト株ＢＬ４９およびＢＬＬｉｕは、双方とも、低い形質転換効率をもつＥ．ｃｏｌｉ−ＢＬ２１（ＤＥ３）誘導体である。したがって、ゲノムの７α−ＨＳＤＨがサイレンス化されている適当な宿主株を産生することが第１に必要であった。
ノックアウトのための出発株として、高い形質転換効率をもつＫ−１２派生株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）が選ばれた。同時に、ＤＥ３カセットは、Ｔ７発現系を用いて外来タンパク質の発現を可能にし、そのことによりこれはＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αとは異なる。７α−ＨＳＤＨのための遺伝子の好首尾のサイレンシング、およびその後のノックアウトプラスミドの分泌は、適当な選択的抗生物質上での培養、ＰＣＲ、およびシーケンシングにより確認される。この株は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＢ１３という名称をもつ。
ｂ）変異されるべき位置の選択
ＮＡＤＰＨ−結合ＳＤＲ（短鎖デヒドロゲナーゼレダクターゼ）中の保存領域は、主として、補因子結合ポケットの塩基性アミノ酸残基を含み、これらは、ＮＡＤＰ（Ｈ）のアデノシンリボース上の２’−リン酸との酸−塩基相互作用により、ＮＡＤＰ（Ｈ）結合を安定化する（Carugo, O. & Argos, P., Proteins, 28(1):10-28, , 1997a + Proteins, 28(1): 29-40, 1997b; Woodyer et al., Biochemistry, 42(40):11604-14, 2003）。
中でも、位置３９に隣接する位置４０が考慮されるべきであり、ここには原則として、ＮＡＤＰＨ結合性ＳＤＲのアルギニンまたはリジンが位置している（Bellamacina, C. R., FASEB J., 10(11):1257-69, 1996; Kallberg et al., Eur. J. Biochem., 269(18):4409-4417, 2002; Persson, B., Chem. Biol. Interact., 143-144:271-278, 2003）。
７β−ＨＳＤＨでは、Ｒ４０について、塩基性アミノ酸がまた３９に隣接する位置に存在する。さらに、Ｒ４１およびＫ４４とともに、２つのさらなる塩基性アミノ酸が、結合ポケットに直接近接して同定された。これらの３つの位置が、反復飽和突然変異誘発の標的位置として定義された。
ｃ）定向進化の実施
使用したプライマー：
7β-HSDH G39D R40F (DF).
7beta mut G39D R40F fwd:
CGTCGTCATGGTCGACTTTCGCGAGG (配列番号１４)
AntiMid rev:
CCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCC (配列番号１５)

7β-HSDH G39D R40F R41K (DFK)
7beta DF mut R41K fwd:
CGTCGTCATGGTCGACTTTAAAGAGGAGAAGCTG (配列番号１６)
AntiMid rev:
CCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCC (配列番号１５)

7β-HSDH G39D R40F R41K K44G (DFKG)
7beta DFK mut K44NDT fwd:
GTCGACTTTAAAGAGGAGNDTCTGAACGTGCTC (配列番号１７)
このプライマーは、縮重コドンを含有するため、Ｇ以外の他のアミノ酸もまた、位置４４に生じ得る。
AntiMid rev:
CCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCC (配列番号１５)
定向進化は、突然変異の３つのラウンドにおいて実施され、その各々において、１つの位置が変異される。スクリーニングにおいて最も高いＮＡＤＨ活性を示した、各ラウンドの変異体をシーケンスして変異を同定し、次のラウンドにおける出発変異体として役立てた。突然変異誘発は、７β−ＨＳＤＨ Ｇ３９Ｄ（Ｄ）から、まず位置Ｒ４０において出発した。これにおける最良の変異体は７β−ＨＳＤＨ Ｇ３９Ｄ Ｒ４０Ｆ（ＤＦ）であった。次に、位置Ｒ４１において突然変異誘発を行い、７β−ＨＳＤＨ Ｇ３９Ｄ Ｒ４０Ｆ Ｒ４１Ｋ（ＤＦＫ）を最良の変異体とし、そして最後に位置Ｋ４４において、７β−ＨＳＤＨ Ｇ３９Ｄ Ｒ４０Ｆ Ｒ４１Ｋ Ｋ４４Ｇ（ＤＦＫＧ）を最良の変異体とした。
実施例Ｃ．２ ＮＡＤＨ特異性をもつ７β−ＨＳＤＨ変異体の酵素動態研究
作成された変異体は、酵素動態研究により評価された。ＤＨＣＡ動態の研究には、０．５ｍＭ ＮＡＤＨを補因子として使用し（図９）、一方ＮＡＤＨ動態の研究には、１０ｍＭ ＤＨＣＡを基質として使用した（図１０）。ＤＨＣＡ動態のプロットから、ミカエリス−メンテンの動態の特徴的な曲線形が７β−ＨＳＤＨ変異体について認められ、また基質阻害は何ら観察されなかった。したがって、古典的なミカエリス−メンテンモデル（等式１）が、動態パラメータの評価に使用された。一方ＮＡＤＨ動態は、直線的な経過を示し、補因子濃度に何ら飽和を示さず、それ故これについて何ら動態パラメータは測定できなかった。
等式１：ミカエリス−メンテン式
［式中、
ＥＡＸ：特異的酵素活性、Ｕｍｇ−１＝μｍｏｌ ｍｉｎ−１ｍｇ−１
Ｖｍａｘ：最大特異的酵素活性、Ｕｍｇ−１＝μｍｏｌ ｍｉｎ−１ｍｇ−１
ｃｓ：基質または補因子濃度、ｍｏｌ Ｌ−１
Ｋｍ：半飽和濃度、ｍｏｌ Ｌ−１］
新たな７β−ＨＳＤＨ変異体について測定された動態パラメータが表４に示され、該表はさらに、先に報告されている変異体Ｇ３９ＤおよびＧ３９Ｄ Ｒ４０Ｉについての比較値を含む。これにおいて、それぞれ５．９１±０．２３Ｕｍｇ−１、および５．７２±０．１９Ｕｍｇ−１をもつ、新たな変異体７β−ＨＳＤＨ ＤＦＫおよび７β−ＨＳＤＨ ＤＦＫＧが、先の最も活性のある変異体Ｇ３９Ｄ Ｒ４０Ｉよりも２３〜２７％高い最大特異的酵素活性を示すことが見て取れる。
実施例Ｃ．３ ＮＡＤＨ依存性７β−ＨＳＤＨ変異体を用いた一段階の生体内変化
ＮＡＤＨ依存性７β−ＨＳＤＨの比較のため、５０ｍＭ ＤＨＣＡの３，１２−ジケト−ＵＤＣＡへの一段階生体内変化を、２ｍＬスケールで三重に実施した。
これにおいて、精製された酵素を使用し、補因子としてＮＡＤのみを添加した。補因子再生には、ＧＤＨを用いた。調べた７β−ＨＳＤＨ（野生型（ＷＴ）および変異体：Ｄ、ＤＦ、ＤＦＫ、およびＤＫＦＧ）の、０．２ｍｇ ｍＬ−１の酵素を各場合に使用した。他の反応条件は：１０ ＵｍＬ−１ ＧＤＨ、０．５ｍＭ ＮＡＤ、５０ｍＭ ＤＨＣＡ、２００ｍＭ グルコース、５００ｍＭ リン酸カリウム、およびｐＨ８．０であった。反応は、３０℃の振盪式ディープウェルプレート内で、強力に緩衝された系においてｐＨ調節なしのバッチプロセスとして、三重に実施した。
生体内変化の結果が図１２に示されている。全てのＮＡＤＨ依存性変異体で、野生型酵素を用いるよりも多くの３，１２−ジケト−ＵＤＣＡを生成できた。変異体ＤＦＫＧでは、１６時間後にＤＨＣＡの３，１２−ジケト−ＵＤＣＡへの完全な変換が達成できた。
実施例Ｃ．４ ＮＡＤＨ依存性７β−ＨＳＤＨ変異体を用いた二段階の生体内変化
さらに、ＮＡＤＨ依存性７β−ＨＳＤＨ変異体ＤＦＫおよびＤＦＫＧを用いて、５０ｍＭ ＤＨＣＡの１２−ジケト−ＵＤＣＡへの二段階生体内変化を、２ｍＬスケールで三重に実施した。
これにおいて、精製された酵素を使用し、補因子としてＮＡＤのみを添加した。７β−ＨＳＤＨだけでなく、Ｃｏｍｏｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ由来の３α−ＨＳＤＨ、及び補因子再生用のＧＤＨを使用した。調べた７β−ＨＳＤＨ変異体の、０．２ｍｇ ｍＬ−１の酵素を各場合に使用した。他の反応条件は：１ ＵｍＬ−１ ３α−ＨＳＤＨ、１０ ＵｍＬ−１ ＧＤＨ、０．５ｍＭ ＮＡＤ、５０ｍＭ ＤＨＣＡ、２００ｍＭ グルコース、５００ｍＭ リン酸カリウム、およびｐＨ８．０であった。反応は、３０℃の振盪式ディープウェルプレート内で、強力に緩衝された系においてｐＨ調節なしのバッチプロセスとして、三重に実施した。
各標品の反応曲線が図１３に示されている。双方の７β−ＨＳＤＨ変異体で、ＤＨＣＡの１２−ジケト−ＵＤＣＡへの完全な変換が、ＮＡＤＰの添加なしに達成できた。
本明細書に述べた刊行物の開示が特に参照される。

Claims (22)

  1. 一般式３：

    ［式中、Ｒは、アルキル、Ｈ、アルカリ金属イオン、またはＮ（Ｒ３）４ ＋を表し、ここで、残基Ｒ３は、同じかまたは異なり、かつＨまたはアルキルを表し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置き換えられ、ここで、Ｒ１およびＲ２は、互いに独立してアルキル残基を表す］のデヒドロコール酸化合物（ＤＨＣＡ）の；
    式（５）：

    ［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で、上記に定義されたように置き換えられる］の対応する１２−ケト−ウルソデオキシコール酸化合物（１２−ケトＵＤＣＡ）への生体触媒還元のための方法であって、これにおいて、１つ以上の同じかまたは異なるホールセル生体触媒が、液体反応媒体中に、ＮＡＤ（Ｈ）および／またはＮＡＤＰ（Ｈ）、グルコース、および任意でさらなる添加剤を含み、かつ、少なくとも１つの式（３）の基質が、前記ホールセル生体触媒と接触せられ、かつ任意に反応生成物が反応媒体から分離され；これにおいて、反応が、７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７β−ＨＳＤＨ）（ＮＡＤＨ−および／またはＮＡＤＰＨ−依存性）；３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α−ＨＳＤＨ）（ＮＡＤＨ−および／またはＮＡＤＰＨ−依存性）、およびグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）（ＮＡＤＨ−および／またはＮＡＤＰＨ−依存性）の存在下に起こり；かつここで、
    ホールセル生体触媒または種々のホールセル生体触媒が一緒に、同時に以下の酵素活性を発現し：
    （１）７β−ＨＳＤＨおよび
    （２）３α−ＨＳＤＨ、および任意に
    （３）ＧＤＨが液体反応媒体へ添加されていない場合は、ＧＤＨ、
    かつここで、反応混合物中のホールセル生体触媒、ＮＡＤ（Ｈ）、ＮＡＤＰ（Ｈ）、および式（３）の基質の濃度が、以下の数学的関係：
    Ｘ＜Ｙ・２００
    であり、同時に
    Ｙ＝ＣＤＨＣＡ／７０
    であり、かつ
    Ｘ＝ＣＣａｔ・４０＋ＣＮＡＤ（Ｈ）・３００＋ＣＮＡＤＰ（Ｈ）・１２００
    ［式中、パラメータは以下の通りである：
    ＣＤＨＣＡ＝式（３）の化合物の基質初期濃度［ｍＭ］
    ＣＣａｔ＝ホールセル生体触媒濃度［ｇＢＤＭ Ｌ−１］
    ＣＮＡＤ（Ｈ）＝ＮＡＤ（Ｈ）濃度［ｍＭ］
    ＣＮＡＤＰ（Ｈ）＝ＮＡＤＰ（Ｈ）濃度［ｍＭ］］にあり、
    ホールセル触媒が細菌、真菌類および酵母類から選択される、該方法。
  2. 前記ホールセル生体触媒が組換え微生物である、請求項１に記載の方法。
  3. 請求項１または２のいずれか１項に記載の方法であって、これにおいて：
    ａ）７β−ＨＳＤＨが、配列番号２のアミノ酸配列、または少なくとも９０％の配列同一性をもってそれから派生したアミノ酸配列を有し；
    ｂ）３α−ＨＳＤＨが、配列番号４のアミノ酸配列、または少なくとも９０％の配列同一性をもってそれから派生したアミノ酸配列を有し；および／または
    ｃ）ＧＤＨが、配列番号６のアミノ酸配列、または少なくとも９０％の配列同一性をもってそれから派生したアミノ酸配列を有する、該方法。
  4. 前記生体触媒がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、特にＥ．ｃｏｌｉ株の微生物の組換え株である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. ７β−ＨＳＤＨ、３α−ＨＳＤＨ、およびＧＤＨが、ＮＡＤ（Ｈ）およびＮＡＤＰ（Ｈ）から選択される同じかまたは異なる補因子を利用する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記反応が、緩衝された水性反応媒体中で、ｐＨ６〜８において行なわれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. グルコースが、１０ｍＭ〜３０００ｍＭの初期濃度において使用される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 式（１）：

    ［式中、Ｒは、アルキル、Ｈ、アルカリ金属イオン、またはＮ（Ｒ３）４ ＋を表し、ここで、残基Ｒ３は、同じかまたは異なり、かつＨまたはアルキルを表し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置き換えられ、ここで、Ｒ１およびＲ２は、互いに独立してアルキル残基を表す］のウルソデオキシコール酸化合物（ＵＤＣＡ）を調製するための方法であり、
    これにおいて、
    ａ）任意に、式（２）：

    ［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で、上記に定義されたように置き換えられる］のコール酸（ＣＡ）が、式（３）：

    ［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で、上記に定義されたように置き換えられる］のデヒドロコール酸化合物（ＤＨＣＡ）へ酸化され；
    ｂ）ＤＨＣＡが、請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体触媒法により、式（５）：

    ［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で、上記に定義されたように置き換えられる］の対応する１２−ケト−ウルソデオキシコール酸化合物（１２−ケト−ＵＤＣＡ）へ還元され、次いで、
    ｃ）式（５）の１２−ケト−ＵＤＣＡが、化学的にＵＤＣＡ化合物へ還元され；かつ
    ｄ）反応生成物が、任意にさらに精製される、該方法。
  9. 前記酵素活性が、以下の濃度範囲：
    （１）７β−ＨＳＤＨ：１００〜１５００ Ｕ／ｇＢＤＭ
    （２）３α−ＨＳＤＨ：５０〜５００ Ｕ／ｇＢＤＭ
    （３）ＧＤＨ：１００〜２０００ Ｕ／ｇＢＤＭ
    において含有される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. ７−ケトステロイドの対応する７−ヒドロキシステロイドへの少なくとも立体特異的酵素的還元を触媒する、７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７β−ＨＳＤＨ）であって、これにおいて前記酵素が、配列番号２の位置Ｇ３９およびＲ４０のそれぞれにおいて、あるいは配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性をもってそれから派生したアミノ酸配列において変異を有し、二重変異Ｇ３９Ｄ／Ｒ４０Ｆを含む、７β−ＨＳＤＨ。
  11. ７−ケトステロイドの対応する７−ヒドロキシステロイドへの少なくとも立体特異的酵素的還元を触媒する、７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７β−ＨＳＤＨ）であって、これにおいて前記酵素が、配列番号２の位置Ｇ３９およびＲ４０のそれぞれにおいて、および任意に配列番号２の位置Ｒ４１および／または位置Ｋ４４において、あるいは配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性をもってそれから派生したアミノ酸配列において変異を有し、
    ａ）三重変異Ｇ３９Ｄ／Ｒ４０Ｆ／Ｒ４１Ｘ１［式中、Ｘ１が、任意の他のアミノ酸残基、特にＫ、Ｑ、Ｓ、またはＲ、および中でもＫを表す］
    または
    ｂ）四重変異Ｇ３９Ｄ／Ｒ４０Ｆ／Ｒ４１Ｘ１／Ｋ４４Ｘ２［式中、Ｘ１は、任意の他のアミノ酸残基、特にＫ、Ｑ、Ｓ、またはＲ、および中でもＫを表し、かつＸ２は、任意の他のアミノ酸残基、特にＧ、Ｎ、またはＱ、および中でもＧを表す］
    を含む、７β−ＨＳＤＨ。
  12. 三重変異Ｇ３９Ｄ／Ｒ４０Ｆ／Ｒ４１Ｋを含む、請求項１１に記載の７β−ＨＳＤＨ。
  13. 四重変異Ｇ３９Ｄ／Ｒ４０Ｆ／Ｒ４１Ｋ／Ｋ４４Ｇを含む、請求項１１に記載の７β−ＨＳＤＨ。
  14. 請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の７β−ＨＳＤＨをコードする、ポリヌクレオチド。
  15. 少なくとも１つの調節配列の制御下にある請求項１４に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、発現カセット。
  16. 請求項１５に記載の少なくとも１つの発現カセットを含む、発現ベクター。
  17. 請求項１４に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド、または請求項１５に記載の少なくとも１つの発現カセット、または請求項１６に記載の少なくとも１つの発現ベクターをもつ、組換え微生物。
  18. 請求項１７に記載の組換え微生物であり、加えて、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＨＳＤＨ）および補因子再生に適するデヒドロゲナーゼから選択される、少なくとも１つのさらなる酵素をコードするためのポリヌクレオチドをもつ、該組換え微生物。
  19. 請求項１８に記載の組換え微生物であり、これにおいて、さらなるＨＳＤＨが３α−ＨＳＤＨから選択され；かつデヒドロゲナーゼがＮＡＤＨ−再生酵素、例えばＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、およびＮＡＤＨ再生ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）、およびグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ−６−ＰＤＨ）、または亜リン酸デヒドロゲナーゼ（ＰｔＤＨ）、またはおよびＮＡＤＨ再生グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）から選択される、該組換え微生物。
  20. ７α−ＨＳＤＨノックアウト株である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の組換え微生物。
  21. 式（１）：

    ［式中、Ｒは、アルキル、Ｈ、アルカリ金属イオン、またはＮ（Ｒ３）４ ＋を表し、ここで、残基Ｒ３は、同じかまたは異なり、かつＨまたはアルキルを表し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置き換えられ、ここで、Ｒ１およびＲ２は、互いに独立してアルキル残基を表す］のウルソデオキシコール酸化合物（ＵＤＣＡ）を産生するための方法であり、
    これにおいて、
    ａ）任意に、式（２）：

    ［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で、上記に定義されたように置き換えられる］のコール酸（ＣＡ）が、とりわけ化学的に、式（３）：

    ［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で、上記に定義されたように置き換えられる］のデヒドロコール酸化合物（ＤＨＣＡ）へ酸化され；
    ｂ）ＤＨＣＡが、請求項１０〜１３の１つに記載の少なくとも１つの７β−ＨＳＤＨの存在下に、および少なくとも１つの３α−ＨＳＤＨの存在下に、式（５）：

    ［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で、上記に定義されたように置き換えられる］の対応する１２−ケト−ウルソデオキシコール酸化合物（１２−ケト−ＵＤＣＡ）へ、特にＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの存在下およびＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの消費により還元され、次いで、
    ｃ）式（５）の１２−ケト−ＵＤＣＡが、化学的にＵＤＣＡへ還元され；そして
    ｄ）反応生成物が、任意にさらに精製される、該方法。
  22. 式（１）：

    ［式中、Ｒは、アルキル、ＮＲ１Ｒ２、Ｈ、アルカリ金属イオン、またはＮ（Ｒ３）４ ＋を表し、ここで、残基Ｒ３は、同じかまたは異なり、かつＨまたはアルキルを表し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で、上記に定義されたように置き換えられる］
    のＵＤＣＡを産生するための方法であり、
    これにおいて、
    ａ）任意に、式（２）：

    ［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で、上記に定義されたように置き換えられる］のＣＡが、とりわけ化学的に、式（３）：

    ［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で、上記に定義されたように置き換えられる］のＤＨＣＡへ酸化され；
    ｂ）ＤＨＣＡが、少なくとも１つの７β−ＨＳＤＨの存在下、および少なくとも１つの３α−ＨＳＤＨの存在下に、式（５）：

    ［式中、Ｒは、上記に示した意味を有し、あるいは基−ＣＯ２Ｒは、酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で、上記に定義されたように置き換えられる］の対応する１２−ケト−ＵＤＣＡへ、特にＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの存在下およびＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの消費により還元され、次いで、
    ｃ）式（５）の１２−ケト−ＵＤＣＡが、化学的にＵＤＣＡへ還元され；そして
    ｄ）反応生成物が、任意にさらに精製され；
    これにおいて、工程ｂ）の変換が、請求項１７〜２０の１つに記載の組換え微生物の存在下に起こる、該方法。
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